Elementy enzymologii i biochemii białek. Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii

Spis treści ebooka

Spis treści

 

Przedmowa / 9

Wykaz stosowanych oznaczeń / 11

Zasady bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązujące w Pracowni biochemii białek / 13

 

1. Izolacja i oczyszczanie enzymu / 15

1.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej / 15

1.1.1. WPROWADZENIE / 15

1.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 18

1.1.3. WYKONANIE / 19

1.1.3.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2 / 19

1.1.3.2. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej / 21

1.1.3.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda / 22

1.1.3.3.1. Przygotowanie krzywej wzorcowej / 22

1.1.3.3.2. Oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym / 23

1.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 23

1.2. Wyznaczanie mas cząsteczkowych białek metodą sączenia żelowego oraz oczyszczanie białek metodą chromatografii jonowymiennej / 24

1.2.1. WPROWADZENIE / 24

1.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 25

1.2.3. WYKONANIE / 26

1.2.3.1. Wyznaczenie masy cząsteczkowej 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą sączenia żelowego / 26

1.2.3.2. Oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą chromatografii jonowymiennej / 28

1.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 29

1.3. Elektroforeza dwuwymiarowa 2-DE białek / 30

1.3.1. WPROWADZENIE / 30

1.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 32

1.3.3. WYKONANIE / 32

1.3.3.1. Przygotowanie surowej frakcji enzymatycznej do elektroforezy 2-DE / 32

1.3.3.2. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczania stężenia białka metodą Bradforda w obecności buforu do przygotowywania próbek 2-DE / 33

1.3.3.3. Rehydratacja pasków IPG / 34

1.3.3.4. Izoogniskowanie białek z zastosowaniem pasków IPG / 34

1.3.3.5. Przygotowanie pasków do drugiego kierunku SDS-PAGE i rozdział elektroforetyczny / 35

1.3.3.6. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue / 36

1.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 36

1.4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących / 36

1.4.1. WPROWADZENIE / 36

1.4.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 38

1.4.3. WYKONANIE / 38

1.4.3.1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek / 38

1.4.3.2. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue oraz metodą srebrową / 39

1.4.4. OPRACOWANIE I DOKUMNETACJA WYNIKÓW / 40

1.5. Literatura / 40

 

2. Kinetyka reakcji enzymatycznej katalizowanej przez 1,2-dioksygenazę katecholową / 43

2.1. Wyznaczanie optymalnych warunków reakcji enzymatycznej / 43

2.1.1. WPROWADZENIE / 43

2.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 44

2.1.3. WYKONANIE / 45

2.1.3.1. Badanie wpływu temperatury na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 45

2.1.3.2. Badanie wpływu pH na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 46

2.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 47

2.2. Wyznaczanie stałych kinetycznych reakcji enzymatycznej / 48

2.2.1. WPROWADZENIE / 48

2.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 51

2.2.3. WYKONANIE / 52

2.2.3.1. Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 52

2.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 53

2.3. Inhibicja reakcji enzymatycznych / 54

2.3.1. WPROWADZENIE / 54

2.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 55

2.3.3. WYKONANIE / 56

2.3.3.1. Badanie wpływu 2,4-dichlorofenolu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 56

2.3.3.2. Badanie wpływu jonów niklu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 57

2.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 58

2.4. Literatura / 59

 

3. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61

3.1. Wpływ immobilizacji na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61

3.1.1. WPROWADZENIE / 61

3.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 62

3.1.3. WYKONANIE / 63

3.1.3.1. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 63

3.1.3.2. Oznaczanie stężenia białka w kulkach alginianowych / 63

3.1.3.2.1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej dla oznaczania stężenia białka metodą Bradforda

w obecności KOH / 63

3.1.3.2.2. Oznaczanie stężenia białkach w kulkach alginianowych metodą Bradforda w obecności

KOH / 64

3.1.3.3. Oznaczanie aktywności immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 64

3.1.3.4. Wpływ czasu przechowywania na aktywność wolnego i immobilizowanego enzymu / 65

3.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 66

3.2. Badanie właściwości immobilizowanego enzymu / 67

3.2.1. WPROWADZENIE / 67

3.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 68

3.2.3. WYKONANIE / 69

3.2.3.1. Badanie wpływu pH na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 69

3.2.3.2. Badanie wpływu temperatury na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 70

3.2.3.3. Badanie wpływu jonów metali oraz związków fenolowych na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 71

3.2.3.4. Oznaczanie stężenia białka w surowej frakcji enzymatycznej i w kulkach alginianowych / 72

3.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 73

3.3. Literatura / 74

pokaż cały spis treści

ukryj recenzje