Strony tytułowe Dział Graficzny PWN

Fotografie barwne na wkładce pochodzą ze zbiorów dydaktycznych Katedry Fitopatologii SGGW w Warszawie lub z dokumentacji badań naukowych prowadzonych w Katedrze

Wydanie publikacji częściowo dofinansowane przez Polskie Towarzystwo Fitopatologiczne

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2010

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2010 r., (wyd. I)

Warszawa 2020

ISBN 978-83-01-21076-2

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: mobisfera.pl

Spis treści

1. Wprowadzenie

1.1. Informacje wstępne

1.2. Trochę historii

1.3. Czym są wirusy?

2. Budowa cząstek wirusów

2.1. Izolowanie i oczyszczanie wirusów

2.2. Typy cząstek wirusów

2.3. Składniki cząstek wirusów, ich właściwości i funkcje

2.3.1. Kwasy nukleinowe wirusów roślin

2.3.2. Białka wirusów roślin

3. Namnażanie i zmienność wirusów oraz patogeneza wirusowych chorób roślin na poziomie komórki

3.1. Wprowadzenie. Schemat namnażania wirusa o genomie ssRNA

3.2. Genomy wirusów i strategie ich ekspresji

3.3. Montaż pełnych cząstek wirusa

3.4. Zmienność wirusów roślin

3.5. Patogeneza wirusowych chorób roślin na poziomie komórki roślinnej

3.5.1. Wirusy jako patogeny systemu translacyjnego

3.5.2. Zmiany cytopatologiczne wywołane przez wirusy

3.5.3. Molekularne i genetyczne podstawy patogenezy wiroz oraz odporności roślin na wirusy

4. Transport i rozmieszczenie wirusów w obrębie chorych roślin

4.1. Informacje wprowadzające

4.2. Krótkodystansowy transport wirusów z komórki do komórki

4.3. Długodystansowy transport wirusów w roślinach

4.4. Rozmieszczenie wirusów w roślinach

5. Objawy wirusowych chorób roślin i ich podłoże fizjologiczne

5.1. Zmiany fizjologiczne wywoływane w roślinach przez wirusy

5.2. Objawy wirusowych chorób roślin

6. Przenoszenie wirusów na nowe rośliny i szerzenie się chorób wirusowych w uprawach roślin

6.1. Wstępne informacje o przenoszeniu wirusów i epidemiologii wiroz

6.2. Przenoszenie wirusów w organach używanych do wegetatywnego rozmnażania roślin

6.3. Przenoszenie wirusów z nasionami i z pyłkiem roślin

6.4. Mechaniczne przenoszenie wirusów roślin

6.5. Przenoszenie wirusów w wodzie i w powietrzu

6.6. Przenoszenie wirusów przez wektory

6.6.1. Przenoszenie wirusów w glebie przez pierwotniaki, grzyby i nicienie

6.6.2. Przenoszenie wirusów przez owady i roztocze

7. Epidemiologia wirusowych chorób roślin i ekologia wirusów roślin

7.1. Ogólne informacje o epidemiach wirusowych chorób roślin

7.2. Źródła pierwotnej infekcji i ich znaczenie dla rozwoju epidemii

7.3. Rozmieszczenie chorych roślin w przestrzeni i powiększanie zasięgu choroby

7.4. Przyrosty epidemii wirusowych chorób roślin w czasie

7.5. Modelowanie epidemii chorób wirusowych

8. Ochrona roślin przed chorobami wirusowymi

8.1. Straty powodowane przez wirusowe choroby roślin

8.2. Ogólne zasady ochrony roślin przed chorobami wirusowymi

8.3. Ochrona produkcyjnych upraw roślin przed chorobami wirusowymi

8.4. Ochrona plantacji nasiennych i upraw matecznych przed wirozami

8.4.1. Organizacja i prowadzenie upraw matecznych wolnych od wirusów

8.4.2. Metody wykrywania wirusów w roślinach

8.5. Szczególne zabiegi ochrony roślin przed wirusami

8.6. Uwalnianie roślin od wirusów

9. Wiroidy jako patogeny roślin

10. Nazewnictwo i taksonomia wirusów roślin

10.1. Zasady nazewnictwa i taksonomii wirusów

10.2. Ogólne informacje o przyjętym systemie klasyfikacji wirusów

10.3. Przegląd wybranych taksonów wirusów

10.4. Pochodzenie i ewolucja wirusów i wiroidów

11. Aneksy

Literatura

Przedmowa

Książka, której ambicją było objąć całość wiedzy o wirusach roślin, napisana przez polskiego autora i po polsku ukazała się ponad ćwierć wieku temu (Aniela Kozłowska Wirusy roślinne. PWN, Warszawa 1980). Profesor Aniela Kozłowska, przez lata z powodzeniem kierująca dwoma doskonałymi krakowskimi zespołami badawczymi zajmującymi się wirusami roślin, nie zdołała niestety doprowadzić tekstu do postaci nadającej się do publikacji. Na szczęście, wydawca nie zrezygnował z publikacji, ale spróbował znaleźć specjalistę, który podjąłby się zadania aktualizacji i naukowej redakcji tekstu. Tak się złożyło, że to mnie powierzono to zaszczytne zadanie. Kiedy pracowałem nad tym tekstem, przychodziło mi czasem do głowy, że wspaniale byłoby kiedyś napisać taką własną książkę. Oto, po wielu latach nauki i kilku latach pracy, książka taka powstała.

Wiedza o wirusach, w tym o wirusach roślin, wzbogaciła się przez ten czas niezmiernie. Stała się też przedmiotem nauczania na polskich uczelniach wyższych. Oczywiście, o wirusach roślin nauczano już od dawna w ramach przedmiotu „Fitopatologia”, czyli nauka o chorobach roślin. Wirusy traktowano tam jednak jako jedną i to na ogół mniej ważną od grzybów, a nawet od bakterii grupę patogenów roślin. Dopiero rozbudowanie specjalizacji „Ochrona roślin” w latach 80. XX wieku pozwoliło na wprowadzenie odrębnych zajęć z wirusologii w kilku polskich uczelniach rolniczych, a odrębny przedmiot o nazwie „Wirusologia roślinna” lub „Podstawy wirusologii roślinnej” pojawił się w latach 90. w Szkole Głównej Gospodarstwa Wiejskiego na kierunkach „Biotechnologia” i „Biologia”, a także jako „Wirusologia roślinna” lub „Wirusowe choroby roślin” w Akademii Rolniczej w Poznaniu. Tymczasem, na przykład, na wielu uniwersytetach amerykańskich i europejskich przedmiot taki jest prowadzony od kilkudziesięciu lat. Przypadło mi w udziale opracowanie programu wykładów i wykładanie tego przedmiotu, a także, wraz z kolegami, ułożenie programu i prowadzenie ćwiczeń z wirusologii roślinnej. Dzięki temu mogłem po latach wrócić do myśli napisania książki o wirusach roślin. Myśl stała się zamiarem, a zamiar ten został zrealizowany.

Przez cały czas pisania tej książki posługiwałem się roboczym tytułem Wirusologia dla fitopatologów. Tytuł ten wydawał mi się właściwy, bo sygnalizował precyzyjnie, że zakres książki jest ograniczony do wiadomości o wirusach roślin. Oczywiście, można się było posłużyć tytułem Wirusy roślin, ale taki tytuł sugerowałby, że czytelnik znajdzie w książce opisy poszczególnych wirusów roślin, a nie było to moim zamiarem. Książka podaje ogólną wiedzę o wirusach roślin, a więc jest to wirusologia. Zwrócono mi uwagę, że zamierzony przeze mnie tytuł Wirusologia dla fitopatologów może przyczynić się do zawężenia kręgu odbiorców. Zdecydowałem się więc ostatecznie na tytuł Wirusologia roślinna, zdając sobie w pełni sprawę z zastrzeżeń, jakie tytuł ten może budzić u znawców języka polskiego. Nie będę tu próbował rozwijać długiego wywodu w obronie koncepcji tytułu książki. Powiem tylko jedno. Jest to chyba najlepsze tłumaczenie angielskiego Plant virology, a taki tytuł nosi kilka znanych mi, doskonałych podręczników.

Mam nadzieję, że książka okaże się interesująca i pożyteczna jako źródło informacji nie tylko dla fitopatologów, ale dla specjalistów z wielu innych dziedzin – biologii, biotechnologii, genetyki, ochrony środowiska, rolnictwa i ogrodnictwa. Starałem się ją pisać tak, by ewentualni czytelnicy bez specjalistycznego przygotowania też byli w stanie skorzystać z zawartych w niej podstawowych informacji z zakresu wirusologii roślinnej odnoszących się niekiedy do różnych aspektów życia codziennego. W tym zakresie książka ta dostarczy niespecjalistom bardziej rzetelnych informacji, niż media próbujące wszystko udramatyzować.

Na koniec chciałbym podziękować wszystkim, którzy przyczynili się do tego, że byłem w stanie tę książkę napisać.

Wdzięczny jestem moim Rodzicom, dzięki którym w ogóle istnieję i którzy bez natrętnej dosłowności zawsze dopingowali mnie do uczenia się.

Wdzięczny jestem mojej koleżance z lat studiów i z początków pracy naukowej, Ance Kowalskiej, której przykład zachęcił mnie do wybrania wirusologii jako nowej dziedziny zainteresowań, kiedy przyszło mi zmieniać moje początkowe zainteresowania innymi dziedzinami fitopatologii. Wdzięczny jestem nieżyjącemu już niestety doktorowi Dirkowi Noordamowi z Uniwersytetu Rolniczego w Wageningen w Holandii, mojemu pierwszemu i doskonałemu nauczycielowi wirusologii roślinnej. Profesor A. Watson Dimock, również już nieobecny wśród żywych, z Department of Plant Pathology Cornell University w Ithaca umożliwił mi odbycie rocznego stażu w USA. W czasie tego stażu z jednej strony postawił mi ambitne zadania, a z drugiej zapewnił doskonałe warunki pracy i dostęp do bogatej biblioteki. Na staż ten mogłem wyjechać dzięki organizowanym przez lata przez Profesora Szczepana A. Pieniążka (również niedawno zmarłego) wyjazdom młodych polskich naukowców – rolników do USA. W latach, w których kontakty z Zachodem sugerowały zdradę, Profesor Pieniążek potrafił przekonać odpowiednich decydentów o pożytkach, jakie z tych kontaktów możemy wynieść. Wreszcie wdzięczny jestem Profesorowi Zbigniewowi Boreckiemu, który po objęciu kierownictwa Katedry Fitopatologii SGGW stworzył w niej atmosferę zachęcającą do pracy i rozwoju.

Szczególne wyrazy wdzięczności należą się mojej żonie Annie, która dzielnie towarzyszyła mi w laboratorium, w szklarni i na polu przez długie lata pracy, pomagając w rozwiązywaniu wielu problemów technicznych, a także w gromadzeniu i porządkowaniu fachowej literatury. Moje trzy córki i moje wnuki muszę przeprosić za to, że interesując się intensywnie wirusologią, poświęcałem im zbyt mało uwagi.

Grodzisk Mazowiecki, marzec 2009

Autor

1Wprowadzenie

1.1. Informacje wstępne

Badacze oraz lekarze, weterynarze i rolnicy zwrócili uwagę na wirusy jako czynniki chorobotwórcze ludzi, zwierząt i roślin. Dziś wiemy, że wirusy są zdolne do bytowania w komórkach wszystkich znanych organizmów żywych i nie ma żadnej grupy taksonomicznej, u której nie opisano by jakiegoś wirusa. Kłopoty powodowane przez wirusy są czasem bardzo poważne, czego doskonałym przykładem może być choćby HIV (Human immunodeficiency virus) zaliczany do rodzaju Lentivirus w obrębie rodziny Retroviridae. Dopiero później wirusy, ze względu na stosunkowo prostą budowę genomu, stały się obiektem zainteresowania biologii i genetyki molekularnej. Nastąpiło to w momencie, w którym stan rozwoju technik badawczych pozwolił na szczegółowe badania nad strukturą genomu i mechanizmami jego ekspresji oraz nad budową i funkcjami białek kodowanych przez poszczególne fragmenty genomu wirusa.

Historia poznawania właściwości wirusów roślin jest więc odzwierciedleniem historii rozwoju technik badawczych. Zaczęła się ona w momencie poznania infekcyjnego charakteru choroby tytoniu zwanej mozaiką, choć na przykład objawy pstrości tulipana były znacznie wcześniej malowane przez flamandzkich mistrzów pędzla, a opisy objawów chorób wywołanych najprawdopodobniej przez wirusy można znaleźć w notatkach dotyczących materiałów zielnikowych, a nawet w literaturze pięknej pochodzącej z bardzo dawnych czasów. W 1886 roku Niemiec Mayer opisał doświadczenie, w którym wykazał, że sok z roślin tytoniu wykazujących objawy mozaiki wywołuje takie same objawy po przeniesieniu na rośliny zdrowe. Kolejny krok uczynił Rosjanin Iwanowski (1892), który wykazał, że sok ten pozostaje infekcyjny po przesączeniu przez filtry nieprzepuszczające bakterii, co zostało potraktowane jako dowód, że czynnik infekcyjny wywołujący mozaikę tytoniu jest czymś mniejszym od bakterii. Czynnik ten został hipotetycznie określony jako contagium vivum fluidum (jad żywy, płynny, jak to tłumaczono w starszych polskich podręcznikach; dziś powiedzielibyśmy raczej: zarazek żywy płynny). Doświadczenie to, z analogicznym wynikiem, powtórzył Holender Beijerinck (1898), który nazwał ten czynnik wirusem. Określenie to było wprawdzie wówczas używane jako uniwersalne określenie zarazka (czynnika zakaźnego), jednak, kiedy opisano kilka innych patogenów roślin o właściwościach podobnych do sprawcy mozaiki tytoniu, zaczęto używać nazwy „przesączalny wirus”, która przekształciła się w określenie „wirus” przyjmując obecne swoje znaczenie.

Infekcyjność soku z chorych roślin albo możliwość przeniesienia czynnika chorobotwórczego przez szczepienie (Beijerinck, 1898; Baur, 1904) lub przez owady (Boncquet i Hartung, 1915; Kunkel, 1922) przez długi czas były podstawą stwierdzenia, że diagnozowana choroba wywołana jest przez wirus, jeśli nie znajdowano innego, łatwiejszego do zaobserwowania i rozpoznania patogena (grzyb, bakteria). To z tego właśnie powodu choroby powodowane przez fitoplazmy były niegdyś uznawane za choroby wirusowe. Dopiero znalezienie w chorych roślinach organizmów podobnych do mykoplazm (Doi i in., 1967) dało początek badaniom nad nową grupą patogenów roślin nazywanych początkowo organizmami mykoplazmopodobnymi (OMP) – w języku angielskim mycoplasma-like organisms (MLO), a później – fitoplazmami. Podobnie, znalezienie w chorych roślinach czynnika chorobotwórczego o innej niż wirusy budowie i innych właściwościach (Diener, 1971) pozwoliło wyodrębnić spośród chorób wirusowych pewną grupę chorób wywoływanych przez wiroidy. O ile jednak fitoplazmy są zupełnie odrębną grupą patogenów roślin i są po prostu dość specyficzną grupą bakterii, o tyle o wiroidach mówi się w wielu opracowaniach zajmujących się w zasadzie wirusami (Matthews, 1991; Murphy i in., 1995; van Regenmortel i in., 2000). Dlatego w tej książce wiroidy również znajdą swoje miejsce. Nie bez znaczenia jest to, że autor tej książki poświęcił wiele lat pracy badaniom nad wiroidami (zob. Kryczyński, 1992).

Z tytułu tego opracowania wynika natomiast, że zamiarem autora jest ograniczenie pola zainteresowań do tych wirusów i wiroidów, które są sprawcami chorób roślin, to znaczy są patogenami roślin. Co więcej, autor czuje się bardziej kompetentny na polu znajomości wirusów i wiroidów właśnie jako patogenów roślin, a mniej zna zagadnienia wirusologii molekularnej i dlatego chce uprzedzić czytelników, że książka ta jest przeznaczona przede wszystkim dla osób pragnących wzbogacić swą wiedzę o wirusach i wiroidach jako patogenach roślin. W niewielkim zakresie uwzględniono tu także wirusy bytujące w komórkach grzybów. Nie dlatego, że niegdyś grzyby były zaliczane do roślin, ale dlatego, że grzyby, podobnie jak wirusy, są sprawcami chorób roślin i wirusy patogeniczne dla grzybów mogą być przedmiotem rozważań jako czynniki biologicznej ochrony roślin przed chorobami powodowanymi przez grzyby. Nie bez znaczenia jest też to, że niektóre grzyby albo pierwotniaki zaliczane niegdyś do grzybów są ważnymi przenosicielami wirusów roślin.

1.2. Trochę historii

Już w pierwszych doniesieniach o badaniach nad mozaiką tytoniu zaznacza się widoczna w całej historii wirusologii tendencja do stałego wzbogacania wiedzy. Mayer (1886) uznał, że czynnik sprawczy tej choroby musi mieć coś wspólnego ze światem istot żywych, ponieważ był inaktywowany przez kilkugodzinne podgrzewanie soku z chorych roślin do temperatury 80°C. Iwanowski (1892) stwierdził, że czynnik chorobotwórczy mozaiki tytoniu przesącza się przez podwójną warstwę bibuły filtracyjnej oraz przez filtr zatrzymujący bakterie, zwany świecą Chamberlanda i postawił hipotezę, że choroba jest powodowana przez jakąś toksynę bakteryjną. Beijerinck (1898) odkrył, że ów „jad” (contagium vivum fluidum) ulega reprodukcji w żywych roślinach, wnika do tkanek roślin, penetruje je i przemieszcza się w systemie przewodzącym roślin, a także przenosi się przez szczepienie i może się dostawać do roślin przez korzenie.

Po tych pierwszych pracach pojawiły się w literaturze naukowej liczne doniesienia o wirusach, a raczej o chorobach wirusowych roślin, o samych wirusach bowiem nic prawie nie było wiadomo, poza tym, że są one bardzo małe i nie da się ich zobaczyć pod mikroskopem. Niemniej jednak niektóre z dokonanych wówczas (1900–1935) obserwacji i odkryć przyczyniły się znacząco do późniejszego rozwoju wirusologii roślin. W Japonii (Hashimoto, Fukushi) i na Hawajach (Kunkel) pojawiły się prace o przenoszeniu wirusów z rośliny na roślinę przez owady (zob. Corbett, 1964; Matthews, 1991). Opublikowano też pierwsze doniesienia wskazujące na istnienie różnych szczepów wirusów (Carsner, 1925; McKinney, 1929) i podjęto pierwsze próby stosowania fizykochemicznych metod w badaniach nad wirusami – precypitowanie wirusa siarczanem(VI) glinu, alkoholem etylowym lub siarczanem(VI) amonu (Vinson, 1927) albo dzięki doprowadzaniu pH do punktu izoelektrycznego (Mulvania, 1926). Dokonano również pierwszych odkryć dotyczących antygenicznych właściwości wirusów. Stwierdzono, na przykład, że antygeniczne właściwości soku z porażonych wirusami roślin ziemniaka różnią się od właściwości soku ze zdrowych roślin (Dvorak, 1927), a później, że surowica wytworzona w reakcji na sok z roślin zawirusowanych zawiera przeciwciała specyficznie reagujące z tym wirusem (Purdy, 1928; 1929). Takahashi i Rawlins (1932), dzięki pomysłowemu zastosowaniu metody podwójnej refrakcji światła, uzyskali pierwsze informacje świadczące o tym, że cząstki wirusa mozaiki tytoniu mają pałeczkowaty kształt (literatura – zob. Corbett, 1964; Matthews, 1991).

Jednym z najważniejszych odkryć tego okresu było stwierdzenie, że liczba plamek lokalnych uzyskanych na liściu rośliny po inokulacji wirusem może być wskaźnikiem ilości wirusa w inokulum i, wobec tego, liczenie plamek lokalnych może być metodą ilościowych badań wirusów (Holmes, 1929). Przydatność tej metody porównywano do przydatności powszechnie wówczas używanej techniki posiewów kolejnych rozcieńczeń bakterii na pożywkach. Reakcja roślin Nicotiana glutinosa na infekcję wirusem mozaiki tytoniu oraz podobne do niej reakcje innych roślin na inne wirusy służą z powodzeniem do dziś jako metody pomiaru liczby cząstek wirusów w inokulum.

Rok 1935 jest uważany za przełomowy w badaniach nad wirusami roślin, ponieważ to właśnie wtedy udało się uzyskać wirus mozaiki tytoniu w stanie krystalicznym (Stanley, 1935) dzięki frakcjonowaniu soku z chorych roślin tytoniu siarczanem(VI) amonu. Ponieważ infekcyjność towarzyszyła kryształom białkowym, uznano, że wirus ten jest swoistym autokatalitycznym białkiem, które jest w stanie się namnażać w żywych komórkach roślin. Dopiero w następnym roku wykryto (Bawden i in., 1936) obecność kwasu rybonukleinowego w krystalicznych cząstkach wirusa mozaiki tytoniu, a w 5 lat później wykazano, że cząstka tego wirusa ma kształt pałeczki zbudowanej z powtarzających się podjednostek ułożonych w zorganizowany sposób (zob. Corbett, 1964). Potwierdziło to wyniki pierwszych obserwacji cząstek tego wirusa w mikroskopie elektronowym (Kausche i in., 1939).

Mikroskop elektronowy okazał się narzędziem bardzo przydatnym w badaniach nad wirusami, zwłaszcza po opracowaniu zasad metody napylania metalami (Williams i Wycoff, 1944) pozwalającej uzyskać lepszy kontrast między cząstkami wirusów a tłem, na które cząstki te nakładano, to znaczy błonką podtrzymującą preparat w oczkach siatek. Stosowanie tej techniki pozwoliło dobrze rozpoznać kształty cząstek wirusów oraz ich wymiary, natomiast dopiero 10–15 lat później weszło w użycie barwienie negatywowe solami kwasu fosforowolframowego (Kassanis i Nixon, 1961; Hitchborn i Hills, 1965; Finlay i Teakle, 1969) lub octanem uranylu (Close i in., 1966), co pozwoliło zdobyć elementarną wiedzę o strukturze cząstek wirusów. Mikroskop elektronowy, a nawet mikroskop optyczny umożliwiły obserwacje i opis patologicznych zmian wywoływanych w komórkach roślin zasiedlonych przez wirusy. Dzięki nim poznano różnego rodzaju inkluzje, ciała wtrętowe oraz specyficzne struktury (np. tzw. wiroplazmy) i inne zmiany cytopatologiczne (Christie i Edwardson, 1977; Maramorosch, 1977; Francki i in., 1985; Lesemann, 1995; Szyndel, 1997).

Uwagę badaczy przyciągało najpierw białko jako część struktury wirusa z tego prostego powodu, że dobrze znano już wówczas naturę i funkcję enzymów, natomiast prawie nic nie było wiadomo o budowie i funkcjach kwasów nukleinowych, nie mówiąc o tym, że udział białka w ogólnej masie cząstki wirusa jest większy, a najczęściej znacznie większy niż udział kwasu nukleinowego. Dość szybko ustalono (Markham, 1951), że białko stanowi zewnętrzną okrywę cząstek wirusa. Stwierdzono też, że okrywa ta jest zbudowana z określonej liczby powtarzających się, identycznych podjednostek białkowych (Caspar i Klug, 1962), a nawet ustalono, że w skład takiej podjednostki w cząstce wirusa mozaiki tytoniu wchodzi 158 cząsteczek aminokwasów (Anderer i in., 1960; Tsugita i in., 1960). Pierwsze sygnały o fundamentalnym znaczeniu kwasu nukleinowego dla infekcyjności wirusów pochodziły z badań nad wirusem żółtej mozaiki rzepy (Markham i Smith, 1949 wg Corbett i Sisler, 1964) i wirusem mozaiki tytoniu (Harris i Knight, 1952 wg Corbett i Sisler, 1964). Dopiero jednak klasyczne eksperymenty Gierera i Schramma (1956), a także Fraenkel-Conrata (1956) oraz Fraenkel-Conrata i Wiliamsa (1955) pozwoliły ostatecznie ustalić, że kwas nukleinowy odpowiada za infekcyjność wirusa mozaiki tytoniu, a białko stanowi jego okrywę.

Wszystkie te odkrycia były możliwe dzięki postępowi w opracowywaniu metod badawczych służących poznawaniu wirusów i ich składników. Podstawowe znaczenie miało opracowanie efektywnych technik oczyszczania wirusów, czyli uzyskiwania cząstek wirusa wolnych od zanieczyszczeń pochodzących z komórek roślin. Technikami takimi było wirowanie różnicujące (Steere, 1959; Noordam, 1973) oraz jeszcze bardziej precyzyjne wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy (Brakke, 1951, 1953). Ta ostatnia metoda umożliwiła wykrycie i poznanie zróżnicowania cząstek tego samego wirusa pod względem właściwości sedymentacyjnych, co odzwierciedla, z kolei, zróżnicowanie pod względem budowy i masy cząstek. Dzięki niej wykryto pierwsze wirusy o podzielonym genomie (Lister, 1966, 1968; Fulton, 1980) i otwarto drogę do poznania roli poszczególnych fragmentów genomu oraz subgenomowych kwasów nukleinowych, a także poznano tzw. wirusy wspomagające (ang. helper viruses). To, z kolei, pozwoliło na rozwinięcie badań w dziedzinie genetyki molekularnej wirusów (van Vloten-Doting i in., 1968). Poznanie funkcji poszczególnych fragmentów genomu wirusa stało się łatwiejsze z chwilą wprowadzenia technik amplifikacji kwasów nukleinowych w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i analogicznej reakcji, ale użytkującej odwrotną transkryptazę (RT-PCR), co pozwala uzyskać dużą ilość materiału do różnego rodzaju analiz i manipulacji (Saiki i in., 1988). Pozwoliło to, po opracowaniu technik przenoszenia genów przez odpowiednie wektory, na wykorzystanie genów wirusów do genetycznej transformacji roślin w kierunku uzyskiwania roślin odpornych na choroby wirusowe (Powell-Abel i in., 1986; Fitchen i Beachy, 1993).

Amplifikacja kwasów nukleinowych wiroidów i wirusów jest używana też jako etap pośredni w procedurach wykrywania tych kwasów metodami elektroforetycznymi (Kryczyński i Paduch-Cichal, 1991b) albo przez hybrydyzację z sondą molekularną znakowaną radioaktywnym izotopem (Owens i Diener, 1981), albo biotyną lub digoksygeniną (Wełnicki i Hiruki, 1992). W praktyce jednak do wykrywania wirusów szerzej były używane zawsze metody serologiczne, zwłaszcza od czasu adaptowania do celów wykrywania wirusów roślin metody ELISA (Voller i in., 1976; Clark i Adams, 1977). Techniki serologiczne z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych, to znaczy przeciwciał klonowanych w genetycznie jednorodnych liniach hybrydom limfocytów B z komórkami tumorowymi (Prabhakar i in., 1984; Halk i De Boer, 1985), nadają się, z kolei, doskonale do identyfikacji wirusów ze względu na dużą specyficzność w stosunku do określonych determinant antygenowych.

Różne techniki wykrywania wirusów odegrały istotną rolę w uzyskiwaniu roślinnego materiału rozmnożeniowego wolnego od wirusów, co jest podstawową zasadą ochrony roślin przed chorobami wirusowymi (Spiegel i in., 1993; Kryczyński, 1996). W wielu przypadkach udało się też uzyskać formy roślin odporne na wirusy. W ostatnich latach odporność taką coraz częściej uzyskuje się dzięki stosowaniu metod inżynierii genetycznej (Fitchen i Beachy, 1993; Hammond i Rosner, 1994). Ciągle też pracuje się nad znanymi od dawna metodami uwalniania roślin od wirusów i wiroidów przez termoterapię i hodowlę stożków wzrostu (Hollings, 1965; Nyland i Goheen, 1969; Quak, 1972; Paduch-Cichal i Kryczyński, 1987; Spiegel i in., 1993).

Coraz lepsze poznanie właściwości coraz większej liczby wirusów pozwalało doskonalić ich system klasyfikacyjny. Wirusami, w tym wirusami patogenicznymi dla roślin, zajmowali się reprezentanci nauk biologicznych, a więc ludzie odczuwający potrzebę systematyzowania. Pierwsze próby porządkowania świata wirusów podjęto bardzo wcześnie (Johnson i Hoggan, 1935), a opublikowano również historyczny przegląd tych prób (Francki, 1981; Kryczyński, 1997a). Zgodzono się w końcu na przyjęcie określonych zasad i jednolitego systemu klasyfikacyjnego wszystkich wirusów żyjących w komórkach różnych organizmów począwszy od bakterii, a skończywszy na człowieku (Murphy i in., 1995). Szczegółowe informacje o wirusach patogenicznych dla roślin, w tym i obowiązujący system klasyfikacyjny wirusów (van Regenmortel i in., 2000; Fauquet i in., 2005), zostaną przedstawione w odpowiednich rozdziałach tej książki.

Dymitr Iwanowski, jeden z pionierów badań nad wirusem mozaiki tytoniu pracował przez kilka lat na Uniwersytecie Warszawskim, a więc w placówce naukowej działającej na terenie Polski i publikował nawet w tym czasie prace dotyczące mozaiki tytoniu (Iwanowski, 1902). Naprawdę jednak badania nad chorobami wirusowymi w Polsce zostały zapoczątkowane w dwudziestoleciu międzywojennym (zob. Fiedorow, 1973). W pierwszych polskich podręcznikach fitopatologii – Choroby roślin rolniczych Ludwika Garbowskiego (1925) i Choroby roślin Józefa Trzebińskiego (1930) – można znaleźć pewne dane o chorobach degeneracyjnych ziemniaka powodowanych przez wirusy. Wirusowy charakter tych chorób potwierdzano także eksperymentalnie (Zaleski i Tychanowicz, 1937). W 1930 roku została zorganizowana pierwsza chyba w Polsce placówka naukowa zajmująca się specjalistycznie tymi chorobami. Była to utworzona w Skierniewicach przez prof. Edmunda Malinowskiego w ramach Zakładu Hodowli Roślin SGGW pracownia chorób degeneracyjnych ziemniaka. Od tego też mniej więcej czasu choroby te stały się trwałym obiektem zainteresowania polskiej fitopatologii i zaczęto je poprawnie określać jako choroby wirusowe (Fiedorow, 1973). Największe zasługi na polu badań chorób wirusowych w Polsce w tym okresie mają jednak pracownicy Wydziału Chorób Roślin PINGW w Bydgoszczy kierowanego przez Ludwika Garbowskiego. Prace te znalazły podsumowanie w wartościowym opracowaniu podręcznikowym tego autora zatytułowanym Choroby wirusowe ziemniaków opublikowanym w Bydgoszczy w 1938 roku jako 18 zeszyt tzw. Biblioteki Puławskiej. Propagatorem metod zwalczania wirusowych chorób ziemniaka opracowanych w USA, w Niemczech i w Holandii był prof. Karol Zaleski pracujący na Uniwersytecie Poznańskim. Poza ziemniakiem choroby wirusowe zostały w tym czasie w Polsce rozpoznane u roślin buraka, tytoniu, pomidora i ogórka (zob. Fiedorow, 1973).

Po II wojnie światowej prace nad chorobami wirusowymi roślin zostały najwcześniej podjęte w dwóch ośrodkach – krakowskim i poznańskim. Liderem grupy krakowskiej była prof. Aniela Kozłowska, nestorka polskiej wirusologii roślin i autorka cennego podręcznika z zakresu tej problematyki (Kozłowska, 1980). Uruchomiła ona w 1947 roku Stację Badań Wirusologicznych, a potem kierowała dwoma zespołami badawczymi – Pracownią Wirusologii w Zakładzie Fizjologii Roślin PAN i Katedrą Botaniki Akademii Rolniczej im. Hugona Kołłątaja (początkowo Wyższa Szkoła Rolnicza). Zespoły te ściśle ze sobą współpracowały, a ich osiągnięcia do końca lat 60. XX wieku w zakresie badań nad naturą wirusów, biochemicznymi, fizjologicznymi i cytologicznymi skutkami ich namnażania w roślinach oraz w zakresie ekologii wirusów i epidemiologii wirusowych chorób roślin podsumowała Wajda (1973). W ścisłych kontaktach z tymi zespołami pozostawali wirusolodzy z Centralnego Laboratorium Przemysłu Tytoniowego w Krakowie zajmujący się chorobami tytoniu wywoływanymi przez wirus Y ziemniaka i wirus brązowej plamistości pomidora (Jankowski, 1973). W późniejszych latach czołową postacią w krakowskim środowisku wirusologów roślin był prof. Kazimierz Miczyński, a prace koncentrowały się głównie na chorobach wirusowych pomidora i roślin ozdobnych (Kobyłko, 2005).

W Poznaniu prace nad chorobami wirusowymi ziemniaka wznowił prof. Karol Zaleski, który utworzył również Katedrę Fitopatologii (1957) w powołanej do życia Wyższej Szkole Rolniczej (później Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego, a obecnie Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu). Katedrą tą kierował później prof. Władysław Błaszczak specjalizujący się w dziedzinie wirusologii roślin. Prowadzono tam badania nad wirozami ziemniaka, a później głównie nad wirusowymi chorobami roślin motylkowych (Błaszczak 1973). Prace w zakresie hodowli zachowawczej ziemniaka nakierowanej na pozyskiwanie sadzeniaków wolnych od wirusów były prowadzone również w innej katedrze Akademii Rolniczej w Poznaniu (Piechowiak i Sobiech, 1973). Problematyką wiroz roślin motylkowych zajmowała się natomiast dr Czesława Kowalska w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. Tradycja prowadzenia prac nad wirusami roślin trwa w tej placówce do dziś, a rozwinęła ją w swoim czasie prof. Irena Frencel. Dorobek poznańskiego ośrodka naukowego w zakresie badań nad wirusami roślin w latach 1971–2000 podsumowała Fiedorow (2005).

W 1950 roku został powołany do życia w Poznaniu Instytut Ochrony Roślin, specjalistyczna placówka badawcza resortu rolnictwa. Działa w nim Pracownia Wirusologiczna kierowana kolejno przez doc. Tadeusza Grelę, doc. Bartłomieja Micińskiego i prof. Henryka Pospiesznego. W pierwszych dwudziestu latach działalności prowadzono tam badania nad wirozami ziemniaka, buraka, rzepaku, motylkowych pastewnych, warzyw, chmielu i zbóż (Grela, 1973). Placówka ta dość wcześnie została wyposażona w mikroskop elektronowy, co pozwoliło na prowadzenie obserwacji cytopatologicznych. Dalsze prace w IOR zostały opisane przez Pospiesznego (2005).

Wirusy ziemniaka doczekały się w Polsce, podobnie jak i w wielu innych krajach, licznych opracowań. W 1966 roku powołano do życia Instytut Ziemniaka w Boninie (pod Koszalinem), jako badawczy instytut resortu rolnictwa. Do Instytutu włączono niektóre terenowe oddziały wcześniej powstałych instytutów rolniczych – IHAR (Młochów) i IUNG (Jadwisin). Instytut Ziemniaka ma znaczący dorobek w pracach nad identyfikacją i wykrywaniem wirusów ziemniaka (prof. Mirosława Chrzanowska i doc. Anna Kowalska), epidemiologią wirusowych chorób ziemniaka (prof. Wojciech Gabriel) oraz odpornością różnych form roślin ziemniaka na wirusy (prof. Kazimierz Świeżyński i doc. Maria Dziewońska). Wczesny okres pracy Instytutu scharakteryzowali Gabriel i Cieślewicz (1973), a późniejszy Kryczyński i Chrzanowska (2005). Instytut Ziemniaka został później włączony do Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, która to placówka badawcza ma własny dorobek w zakresie badań nad wirusami buraka (Szymczak-Nowak, 2005).

Wcześniej, bo w 1951 roku powstał w Skierniewicach Instytut Sadownictwa, przekształcony później (1972) w Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa. Doc. Władysław Basak i doc. Barbara Zawadzka rozpoczęli w Pracowni Wirusologicznej prace nad wirusami malin, wiśni i śliw oraz zakładali mateczne uprawy wolne od wirusów (Zawadzka, 1973). W późniejszym okresie prof. Maria Kamińska rozwinęła badania nad wirusami roślin ozdobnych, a dr Tadeusz Malinowski opracował wiele nowoczesnych technik wykrywania różnych wirusów opartych na najnowszych osiągnięciach wirusologii molekularnej. W Instytucie Warzywnictwa, powstałym również w Skierniewicach na bazie istniejącego wcześniej Zakładu Warzywnictwa IUNG, badania nad wirusami roślin warzywnych, głównie pomidora, prowadził dr Władysław Macias (Zawadzka, 2005).

Prof. Józef Kochman, kierownik najstarszej w Polsce Katedry Fitopatologii działającej w SGGW w Warszawie, doceniał znaczenie wirusów jako patogenów roślin i starał się rozwijać ten kierunek badawczy (Kochman, 1973). Doc. Danuta Książek, wychowanka prof. Kochmana, pracująca w Zakładzie Ekologii PAN ma spory dorobek w pracach nad wirusami łubinu, ziemniaka i buraka (Książek, 1973). W samej Katedrze Fitopatologii SGGW poważniejsze prace wirusologiczne rozpoczęła jednak dopiero dr Anna Kowalska, a zespół wirusologiczny prowadzący wielokierunkowe badania nad wirusami i wiroidami zorganizował dopiero autor tej książki na przełomie lat 70. i 80. (Kryczyński, 1997b; 2005d). Zasługą tego zespołu jest rozwinięcie w Polsce badań nad wiroidami oraz zapoczątkowanie i rozwinięcie nurtu badań nad technikami immunoelektrono-mikroskopowymi. Natomiast w Katedrze Botaniki SGGW pod kierunkiem prof. Władysława Golinowskiego uzyskano bardzo cenne i interesujące obserwacje nad zmianami cytopatologicznymi wywoływanymi przez różne wirusy w komórkach różnych roślin (Golinowski, 2005).

Prawie wszystkie wspomniane dotychczas polskie placówki naukowe reprezentują instytucje związane z rolnictwem. Z natury rzeczy prowadzone w tych placówkach badania nad wirusowymi chorobami roślin były nastawione raczej na rozwiązywanie praktycznych problemów powodowanych przez te choroby w uprawach roślin. Podstawowe badania wirusologiczne (budowa wirusów, mechanizmy replikacji, genetyka molekularna wirusów, genetyczne podstawy transformowania roślin z użyciem materiału genetycznego wirusów) były prowadzone m.in. w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w zespołach kierowanych przez prof. Włodzimierza Zagórskiego i prof. Danutę Hulanicką (Hulanicka i Zagórski-Ostoja, 2005). Zespoły działające w IBB współpracowały dość blisko z francuskimi wirusologami z INRA (Institut National de la Recherche Agronomique). Prace takie podejmował również niewielki zespół w Instytucie Biologii Molekularnej i Biotechnologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu (Fiedorow, 2005).

W 1963 roku z inicjatywy prof. Józefa Kochmana, członka Komitetu Ochrony Roślin przy Wydziale V Nauk Rolniczych i Leśnych PAN została powołana Grupa Robocza Wirusowych Chorób Roślin Komitetu Ochrony Roślin PAN. Pracami Grupy kierowała początkowo prof. Aniela Kozłowska z Krakowa, a od roku 1969 do końca swego życia, to znaczy do 1985 roku Grupę prowadził bardzo efektywnie prof. Władysław Błaszczak z Poznania. Od 1986 do 2006 roku pracami Grupy kierował autor tej książki, przy czym od 1991 roku zespół ten działa jednocześnie jako Sekcja Wirusologiczna Polskiego Towarzystwa Fitopatologicznego. Corocznie, z niewielkimi przerwami, Grupa (Sekcja) odbywa z reguły dwudniowe konferencje naukowe, na których są prezentowane i dyskutowane osiągnięcia poszczególnych zespołów badawczych zajmujących się wirusami roślin i wirusowymi chorobami roślin. Sesje te miały z reguły charakter spotkań krajowych, choć czasem zapraszano na nie gości zagranicznych. Wyjątkiem były dwie sesje – w 1968 roku w Krakowie i w 1980 roku w Błażejewku pod Poznaniem, które miały charakter konferencji międzynarodowych. Materiały z tych sesji były publikowane początkowo w kolejnych numerach pisma „Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych”, a później w czasopiśmie Polskiego Towarzystwa Fitopatologicznego – „Phytopathologia Polonica” (zob. Kryczyński, 2005c).

Wspomniano już o bliskiej współpracy polskich środowisk wirusologicznych z wirusologami francuskimi. Poza stażami polskich wirusologów we Francji i wspólnymi z francuskimi kolegami publikacjami naukowymi zorganizowano polsko-francuskie (1988) i francusko-polskie (1992) seminaria wirusologiczne, w toku których grupa francuskich wirusologów zwiedzała polskie ośrodki badawcze (1988) i odwrotnie – polska grupa odwiedziła kilka placówek INRA we Francji (1992). W sierpniu 1986 roku w SGGW w Warszawie odbyło się Międzynarodowe Seminarium pod hasłem „Viroids of plants and their detection” (Kryczyński i in., 1988b). Wzięło w nim udział kilku światowej sławy badaczy, a jego wynikiem było powołanie, z polskiej inicjatywy, Międzynarodowej Grupy Roboczej Wiroidów Roślin (International Plant Viroid Working Group). Ograniczyliśmy się tu do wspomnienia najważniejszych faktów z historii polskich badań nad wirusowymi chorobami roślin. Szerzej kwestie te omawia Kryczyński (2005c). Inne szczegółowe dane będzie można znaleźć w dalszych rozdziałach tej książki traktujących o różnych aspektach badań nad wirusami roślin. Polscy badacze wnieśli bowiem swój wkład we wszystkie te dziedziny. Podobnie zresztą zostały potraktowane informacje o historii rozwoju wirusologii roślin na świecie. Kończąc ten rozdział trzeba wspomnieć nazwiska wirusologów polskiego pochodzenia, którzy wnieśli tak znaczący wkład w rozwój badań nad wirusami roślin, że stali się postaciami powszechnie znanymi w świecie. Profesor Richard I.B. Francki pracował w Australii, a konkretnie w Glenn Osmond w University of Adelaide. Był synem komandora Wojciecha Franckiego, który w czasie II wojny światowej dowodził jednym z polskich niszczycieli walczących w szeregach Royal Navy – ORP „Burza”. Po wojnie rodzina Ryszarda Franckiego pozostała w Nowej Zelandii. Profesor Francki kilkakrotnie odwiedzał Polskę i utrzymywał żywe kontakty z polskimi placówkami wirusologicznymi, dostarczając im wielu cennych materiałów naukowych. Profesor Karl Maramorosch urodzony w Wiedniu, ale dorastający w Kołomyi ukończył studia w Szkole Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Losy wojenne rzuciły go na Zachód. Przez znaczną część swego aktywnego życia zawodowego pracował w Rutgers University w stanie New Jersey w USA. Był entomologiem i wirusologiem, autorem licznych prac o wirusach przenoszonych przez owady oraz o owadach jako wektorach wirusów. Profesor Eduard Kurstak był, z kolei, absolwentem Akademii Rolniczej w Poznaniu. Wyemigrował do Kanady i tam pracował na Uniwersytecie w Montrealu. Znany jest głównie jako redaktor książki Handbook of plant virus infections. Comparative diagnosis. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w opracowaniu Kryczyńskiego (2005c).

1.3. Czym są wirusy?

Definiowanie czegokolwiek w obszarze nauk biologicznych jest zadaniem niezwykle trudnym. Jest to skutek ewolucyjnego rozwoju świata istot żywych, którego rezultatem jest istnienie różnych form nietypowych lub form pośrednich. Wirusy trudno zresztą jest jednoznacznie zaliczyć do świata istot żywych, ponieważ ich cechy są raczej zbliżone do cech pewnych elementów komórek niż do cech organizmów w pełnym tego słowa znaczeniu. Niemniej jednak, istnieją pewne formy organizmów komórkowych (fitoplazmy, riketsje i chlamydie) tak uproszczone, że niewiele różnią się od najbardziej złożonych wirusów. Tak się składa, że są to z reguły organizmy pasożytnicze, których tryb życia pozwala na takie daleko idące uproszczenia budowy i funkcji. Sprawia to pewien kłopot w odróżnianiu tych organizmów od wirusów, które też są pasożytami. Z drugiej strony niektóre przynajmniej wirusy niewiele się różnią od tzw. ruchomych elementów genetycznych (ogólnie zwanych transpozonami), które mogą być przenoszone między różnymi osobnikami. Istnieje więc potrzeba sformułowania jeśli nie definicji, to przynajmniej określenia zakresu pojęcia „wirus”, choćby dlatego, by było wiadomo, czym będziemy się zajmować w tej książce.

W jedynym dotychczas napisanym przez polskiego autora podręczniku wirusologii roślinnej (Kozłowska, 1980) trudno byłoby się doszukać takiego określenia. Próbę taką podjęto natomiast w innym polskim opracowaniu (Chroboczek i Zagórski, 1983) traktującym o wirusach w ich molekularnym aspekcie. W książce tej, w podrozdziale 1.2 „Definicja wirusa” podano historyczne definicje formułowane przez różnych badaczy i przyjęto w końcu, że najlepszą definicją będzie wyliczenie cech wirusa, podobnie jak to zrobił Matthews (1991) oraz autor najnowszego polskiego podręcznika wirusologii molekularnej Piekarowicz (2004).

Wirusy bytują jako pasożyty w komórkach różnych organizmów żywych (są więc endobiontami), w tym również roślin, choć pasożytnictwo to ma szczególny i dość zróżnicowany charakter. Budując swoje cząstki, korzystają z substratów zawartych w komórkach, z zasobów energetycznych tych komórek oraz z układów translacyjnych funkcjonujących w tych komórkach, a przeznaczonych do biosyntezy białek. Wirusy nie mają własnych układów biosyntezy białek. Pasożytowanie wirusów prowadzi czasem do śmierci komórek (nekroza, liza), czasem jednak zaatakowane komórki przeżywają, a nawet dość sprawnie funkcjonują. Istnieją również wirusy (np. rodzaje Alphacryptovirus i Betacryptovirus wśród wirusów roślin), które nie wywołują z zasady żadnych widocznych zmian patologicznych. Wirusy nie wytwarzają struktur o charakterze błon oddzielających ich cząstki od zawartości komórek, w których się rozwijają. Wirusy nie rozmnażają się w takim znaczeniu, w jakim robią to organizmy żywe, u których najprostszą formą rozmnażania jest podział komórki na dwie komórki potomne. Wirusy namnażają się (replikują się) przez odrębną syntezę swoich poszczególnych składników, z których montują później swoje pełne cząstki (wiriony). Składnikami tymi są kwas nukleinowy stanowiący genom (genetyczny zapis właściwości wirusa), kapsyd (otoczka białkowa, płaszcz białkowy) oraz, u niektórych wirusów, dodatkowa osłona (otoczka, koperta) lipoproteinowa, z którą związane mogą być nawet pewne enzymy służące przede wszystkim replikacji kwasu nukleinowego wirusa. Kapsyd i ewentualna dodatkowa osłona służą z reguły do ochrony genomu wirusa przed różnymi szkodliwymi czynnikami, z jakimi wirus może się zetknąć, przebywając poza komórką żywiciela, a czasem również ułatwiają wirusowi dostanie się do tej komórki, przemieszczanie się w organizmie żywiciela lub przenoszenie z osobników chorych na inne osobniki. W cząstce wirusa występuje albo RNA, albo DNA, w komórkach organizmów żywych są zaś obecne obie formy kwasów nukleinowych. Kwas nukleinowy wirusa może być jednolub dwuniciową strukturą. Jeśli jest on jednoniciowy, jest to na ogół nić plusowa (sensowna), choć genom niektórych wirusów stanowi nić minusowa (antysensowna). Nić plusowa (sensowna) to taka, która jest zdolna do translacji, to znaczy może być bezpośrednio użyta jako informacyjny RNA (mRNA) w procesie syntezy białka. Genom wirusa może się składać z większej niż jedna liczby cząsteczek kwasu nukleinowego. Wszystkie te cząsteczki mogą występować razem w jednej cząstce wirusa (wirionie) albo każda z nich może występować w osobnej cząstce (wirusy wielocząsteczkowe). Genomy wirusów są różnej wielkości. Genomy wirusów roślin są stosunkowo małe i mogą kodować od jednego do 12 białek. Materiał genetyczny wirusa może podlegać zmienności w wyniku mutacji punktowych albo procesów rekombinacji i innych procesów prowadzących do zmian w materiale genetycznym wirusa.

Uwzględniając wszystkie te cechy, podjęto próbę sformułowania następującej definicji wirusa (Matthews, 1991): wirus jest zbiorem (zestawem, kompletem) jednej lub większej liczby matrycowych cząsteczek kwasu nukleinowego, zazwyczaj zamkniętym w ochronnym płaszczu lub płaszczach białkowym bądź lipoproteinowym, który jest zdolny zorganizować własną replikację tylko w komórkach odpowiedniego żywiciela. Namnażanie wirusa w takiej komórce jest: 1) zależne od układu syntetyzującego białko w komórkach żywiciela, 2) odbywa się w postaci łączenia potrzebnych elementów, a nie w postaci podziału na osobniki potomne, 3) odbywa się w określonych miejscach komórki żywiciela nieoddzielonych dwuwarstwową błoną lipoproteinową, 4) stale prowadzi do pojawiania się nowych wariantów powstających w wyniku różnorodnych zmian w kwasie nukleinowym wirusa.

Rzecz okazałaby się jeszcze bardziej skomplikowana, gdybyśmy próbowali objąć tą samą definicją wirusy i wiroidy, które, jak już wcześniej powiedziano, nie są wirusami. Dlatego omówienie podstawowych cech wiroidów odłożymy do odpowiedniego rozdziału tej książki (rozdz. 9).

2 Budowa cząstek wirusów

2.1. Izolowanie i oczyszczanie wirusów

Wirusy roślin bytują wewnątrz komórek roślinnych i zanim zaczniemy pracę zmierzającą w kierunku poznania wirusa znalezionego w jakiejś roślinie, musimy ten wirus z tej rośliny wydostać, to znaczy wyizolować go. Zazwyczaj można to zrobić jednym z dwóch sposobów: 1) rozdrobnić materiał roślinny zawierający wirus (liście, części kwiatów, owoce, a czasem nawet taki materiał jak łyko) do tego stopnia, by uzyskać dość płynną, na oko homogenną pulpę zwaną „sokiem”, która zawiera wirus; konieczne jest oczywiście zniszczenie ścian komórkowych; 2) znaleźć owada czy inny organizm przenoszący ten wirus, czyli tzw. wektora wirusa (zob. podrozdz. 6.6 i 6.7) i stworzyć sytuację, w której organizm ten pobierze wirus. Następnie tym sokiem albo z użyciem wektora trzeba zakazić jakąś odpowiednią roślinę, która będzie służyć do prowadzenia „hodowli” badanego wirusa w laboratorium. W wyjątkowych przypadkach, kiedy wirus nie przenosi się przez sok ani przez jakiegokolwiek wektora, można się uciec do przenoszenia przez szczepienie. Posługiwanie się w czasie badań rośliną stanowiącą oryginalne źródło wirusa i rosnącą w polu, w sadzie, w ogrodzie czy w jakimś stanowisku naturalnym jest niewygodne (odległość) i niewskazane (nie jesteśmy w stanie kontrolować ani warunków wzrostu tej rośliny, ani stanu jej zdrowotności, a może ona też być niewydajnym źródłem wirusa). Wiele informacji na temat postępowania w toku izolowania wirusa, prowadzenia jego kultur oraz późniejszego oczyszczania można znaleźć w opracowaniach pomyślanych jako praktikum wirusologiczne (np. Noordam, 1973; Dijkstra i de Jager, 1998; Kryczyński, 2005b).

Oczywiście, kiedy przystępujemy do badań tego wirusa, nie wiemy o nim prawie nic i nie wiemy, na przykład, jaka roślina będzie odpowiednia do prowadzenia jego hodowli. Często trzeba więc sprawdzić wiele różnych roślin jako potencjalnych żywicieli wirusa. Czasem możemy się posłużyć tym samym gatunkiem, na którym wirus został znaleziony, czasem jakimś gatunkiem pokrewnym. Czasem wybieramy któryś z gatunków znanych jako dobrzy żywiciele licznych wirusów roślin. Do takich roślin należą różne gatunki z rodzin Solanaceae, Cucurbitaceae czy Fabaceae.

Procedury przygotowania soku oraz inokulacji mechanicznej roślin opisano szczegółowo w podrozdziale 6.4. Hodowlę wirusa w laboratorium, a właściwie w szklarni, prowadzi się przez kolejne przenoszenie go mechaniczne lub przez odpowiednie wektory na nowe egzemplarze roślin stanowiących dobrych żywicieli wirusa i dobre jego źródło. Oczywiście, rośliny te muszą mieć zapewnione odpowiednie warunki wzrostu i rozwoju oraz muszą być dobrze zabezpieczone przed niekontrolowanym zakażeniem przez inne wirusy lub inne patogeny. Pasażując wielokrotnie mechanicznie wirus, który w naturze jest przenoszony przez wektory, należy się liczyć z możliwością utraty zdolności przenoszenia go przez te wektory. Przez pewien czas kulturę wirusa można utrzymać w wysuszonym materiale roślinnym umieszczonym w eksykatorze nad chlorkiem wapnia albo w materiale zamrożonym. Najlepszym sposobem przechowywania kultur wirusów zapewniającym żywotność wirusom przez najdłuższy czas jest przetrzymywanie w zliofilizowanej tkance roślinnej.

Produktem rozdrabniania materiału roślinnego w toku izolowania wirusa z rośliny jest tzw. sok, czyli zawiesina różnych fragmentów komórek roślinnych i różnych organelli w roztworze rozpuszczalnych treści komórek. Cząstki wirusa występują tam w stanie wolnym albo są związane z innymi składnikami tej zawiesiny. Oczyszczanie wirusa, czyli dążenie do uzyskania preparatu wirusa w miarę możliwości wolnego od zanieczyszczeń, a jednocześnie zawierającego możliwie dużą ilość wirusa, musi uwzględniać jedną z dwóch możliwości: 1) próbujemy usunąć z zawiesiny wszystkie jej składniki niebędące cząstkami wirusa i wszystkie związki rozpuszczalne, starając się, by jak największa liczba cząstek wirusa pozostała w wodzie lub w roztworze o znanym składzie i właściwościach; 2) podejmujemy próbę wytrącenia z zawiesiny samych cząstek wirusa i sporządzamy z nich czystą zawiesinę w wodzie lub roztworze o znanym składzie i właściwościach. W praktyce procedury oczyszczania wirusów są wieloetapowe i na poszczególnych etapach są wykorzystywane różne podejścia i różne metody (Steere, 1959, 1964).

Jeśli mamy możliwość wyboru, do oczyszczania powinniśmy wybrać szczep (izolat) wirusa dobrze namnażający się i uzyskujący wysoką koncentrację w roślinie źródłowej. Pożądane jest, by wybrany izolat wywoływał wyraźne objawy na dogodnej roślinie wskaźnikowej (zob. podrozdz. 8.4.2). Powinien być także stabilny chemicznie i genetycznie. Roślina źródłowa musi być wolna od innych wirusów. Powinna być łatwa w uprawie i łatwa do inokulacji. Nie powinna zawierać inhibitorów wirusa ani ciemnych barwników i nie powinna mieć zbyt dużo tkanki mechanicznej. Powinna być dobrym środowiskiem do namnażania wirusa i zapewniać jego wysoki „plon” w możliwie krótkim czasie.

W niektórych przypadkach już w czasie ekstrakcji wirusa z tkanki roślinnej odpowiednimi buforami jest wskazane dodanie enzymów pektolitycznych i celulolitycznych w celu ułatwienia uwolnienia wirusa z tkanki. Jest to szczególnie wskazane w przypadku wirusów zlokalizowanych we floemie i stanowiących bardzo małą część masy tkanki (Takanami i Kubo, 1979). Z reguły ekstrakcję wirusa staramy się przeprowadzić mieszaniną buforów z rozpuszczalnikami organicznymi (butanol, pentanol, oktanol, chloroform). Emulsja taka łatwo się rozwarstwia. Po rozdzieleniu faz (np. przez wirowanie niskoobrotowe) różne fragmenty komórek roślinnych pozostają w fazie rozpuszczalnika organicznego, a wirus pozostaje w zawiesinie wodnej. Z zawiesiny tej można wytrącić wirus przez wysalanie np. siarczanem(VI) amonu albo przez doprowadzenie pH środowiska do punktu izoelektrycznego dla białka wirusa (np. przez zakwaszanie kwasem octowym). W tych warunkach wirus można strącić przez niskoobrotowe wirowanie (do 10 tys. g). Niepożądane substancje rozpuszczalne można usunąć przez dializę. Dalsze doczyszczanie wirusa można prowadzić przez wirowanie naprzemienne. Składa się ono z kilku cykli wirowania na przemian w zwykłej, niskoobrotowej wirówce (do 10 000 g) i w ultrawirówce (> 30 000 g). W czasie wirowania niskoobrotowego usuwamy resztki większych zanieczyszczeń, a wirowanie w ultrawirówce pozwala strącić (zatężyć) wirus.

Wirowanie w gradiencie gęstości (ang. density gradient centrifugation) sacharozy lub soli cezu pozwala uzyskać preparat wirusa o dużej czystości. W probówce wirówkowej sporządzamy roztwór sacharozy o malejących stężeniach (np. 40, 30, 20 i 10%) albo roztwór o tzw. gradiencie liniowym, w którym stężenie sacharozy zmienia się stopniowo ku górze probówki od 40 do 10% (zob. Noordam, 1973). Na tak przygotowany roztwór nakładamy preparat wstępnie oczyszczonego wirusa i rozpoczynamy wirowanie w rotorze uchylnym (około 25 000 g), przy którym probówka uzyskuje pozycję poziomą w czasie wirowania. Na cząsteczki sacharozy działa siła odśrodkowa przesuwająca je w kierunku dna probówki, podczas gdy przeciwdziałają jej siły dyfuzji „wypychające” cząsteczki sacharozy z niżej położonych warstw gradientu o większych stężeniach do wyższych, mniej gęstych stref gradientu. Przy dostatecznie długim wirowaniu początkowy gradient „schodkowy” automatycznie zmieni się w gradient liniowy. Niekiedy jednak wirowanie przerywamy po np. dwóch godzinach. Cząstki wirusa zawędrują w tym czasie tak daleko w głąb gradientu, jak na to pozwolą im przeciwdziałające sobie siły. Można je odzyskać ze strefy gradientu, w której się znalazły. Jest to zwykłe wirowanie w gradiencie gęstości (ang. rate-zonal density gradient centrifugation). Czasem jednak wirowanie kontynuuje się tak długo (np. 1 dobę), aż roztwór znajdzie się w równowadze, to znaczy wytworzy się gradient liniowy, w którym siła odśrodkowa nie pozwoli na dyfuzję cząsteczek sacharozy ku strefom o mniejszym stężeniu, ale nie będzie już w stanie przemieścić dalszych cząsteczek sacharozy do zbyt zagęszczonych stref gradientu. Cząstki wirusa osiągną pozycję w gradiencie, w której ich gęstość będzie równa gęstości roztworu. Jest to tzw. równoważne wirowanie w gradiencie gęstości (ang. equilibrium density gradient centrifugation). Po zaprzestaniu wirowania należy jak najszybciej rozdzielić poszczególne strefy gradientu, zanim wymieszają się one w wyniku swobodnej dyfuzji.

Sączenie molekularne na kolumnach Sephadeksu lub agarozy czy sefarozy doprowadza do rozdzielania cząstek w zależności od ich wielkości. Najszybciej przez kolumnę przeciekają największe cząstki, które są zbyt duże, by penetrować granulki żelu i przemieszczają się dość szybko między nimi pod wpływem siły ciężkości. Mniejsze cząstki penetrują granulki żelu w różnym stopniu, co wpływa na szybkość ich wędrówki. Po określonym czasie kolumnę przemywa się odpowiednio dobranym rozpuszczalnikiem i zbiera kolejne frakcje wypływające z kolumny.

Największy stopień czystości jest wymagany dla preparatów przeznaczonych do badań biochemicznych, fizykochemicznych i molekularnych. Preparat, którego chcemy użyć jako antygenu do wyprodukowania surowicy (zob. podrozdz. 2.3.2), może już nie być aż tak czysty. Musi być jednak wolny od resztek roślinnych i makromolekuł, a zwłaszcza białek innych niż białko wirusa. Preparaty przeznaczone do oglądania w mikroskopie elektronowym nie muszą być nawet tak czyste.

Czystość uzyskanego preparatu możemy wstępnie ocenić optycznie. Dopóki preparat ma jakąkolwiek barwę, nie jest czysty. Zawiesina wirusa powinna być bezbarwna. Jakiekolwiek widoczne zmętnienia również świadczą o niedostatecznej czystości. Preparat o zadowalającej czystości oglądany w świetle przechodzącym może lekko opalizować. Przejrzenie preparatu pod mikroskopem elektronowym pozwala względnie szybko i prosto ocenić czystość preparatu oraz rodzaj i stopień zanieczyszczeń. Dobrą metodą oceny czystości preparatu jest również pomiar spektrofotometryczny. Pomiar absorbancji (A) promieni UV o długości charakterystycznej dla białka (260 nm) i dla kwasów nukleinowych (280 nm) pozwala wyliczyć stosunek A260/280 i porównać go z charakterystyczną dla oczyszczanego wirusa wartością tego stosunku zależną od proporcji między ilością białka a ilością kwasu nukleinowego w cząstkach wirusa. Do oceny strat wirusa na różnych etapach procedury oczyszczania nadaje się szczególnie test biologiczny z użyciem rośliny reagującej plamkami lokalnymi (zob. podrozdz. 5.2). Liczba uzyskanych plamek jest w takim przypadku wykładnikiem liczby infekcyjnych cząstek wirusa w inokulum (Noordam, 1973; Dijkstra i de Jager, 1998; Kryczyński, 2005b). Również oznaczenie ilości wirusa w preparacie metodami serologicznymi (oznaczenie miana wirusa wobec określonego stężenia surowicy) może służyć do oceny strat wirusa na poszczególnych etapach procedury oczyszczania (Noordam, 1973; Kryczyński, 2005b).

Procedury oczyszczania różnych wirusów są w miarę szczegółowo opisane w wydawnictwie CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses (zob. podrozdz. 8.4.2) oraz, na przykład, w książce opracowanej przez wielu autorów (Brunt in., 2002), będącej przedrukiem bazy danych o wirusach, a także, oczywiście, w licznych specjalistycznych publikacjach naukowych.

2.2. Typy cząstek wirusów

Według Piekarowicza (2004) istnieją dwa podstawowe typy cząstek wirusów – cząstki o strukturze helikalnej oraz cząstki o strukturze ikosaedralnej, dla uproszczenia zwane czasem cząstkami kulistymi. W obu typach istnieją jednak pewne warianty. Tak więc,

wśród cząstek o strukturze helikalnej można wyróżnić cząstki pałeczkowate, nitkowate i bacilokształtne (ryc. 1). Cząstki ikosaedralne (kuliste albo izometryczne) mogą być różnej wielkości i mogą też tworzyć struktury podwójne (ryc. 1).

Ryc. 1. Kwasy nukleinowe stanowiące genomy oraz kształty cząstek wirusów roślin zaliczanych do poszczególnych rodzin i rodzajów (z C.M. Fauquet i in. (red.), 2005 za uprzejmą zgodą wydawnictwa Elsevier Ltd.)

Spośród wirusów roślin najlepiej poznano budowę wirusa mozaiki tytoniu, który jest typowym wirusem pałeczkowatym. Spiralnie skręcony kwas rybonukleinowy zbudowany z 6400 nukleotydów jest obudowany cegiełkami podjednostek białkowych. Każda z tych podjednostek składa się ze 158 aminokwasów (Caspar i Klug, 1962), których sekwencja jest zakodowana przez odpowiedni fragment (gen, cistron) kwasu nukleinowego wirusa (podrozdz. 2.3). Pojemność kodowa kwasu nukleinowego wirusa mozaiki tytoniu (i innych wirusów) wystarcza na zakodowanie tylko takiej liczby aminokwasów. Z drugiej strony tak niewielkie białko nie jest w stanie zapewnić odpowiedniej osłony kwasowi nukleinowemu. Problem ten wirusy rozwiązały w ten sposób, że okrywa białkowa cząstki wirusa składa się z wielu takich podjednostek. W przypadku wirusa mozaiki tytoniu jest ich 2130. Podjednostki te tworzą strukturalne formy zwane dyskami, zbudowane z dwóch warstw podjednostek przesuniętych wobec siebie o określony kąt. Dzięki temu warstwy te nie są równo ułożone jedna na drugiej, ale tworzą fragment struktury spiralnej (helikalnej) przypominającej kręcone schody (ryc. 2).

Ryc. 2. Fragmenty modeli pałeczkowatej cząstki wirusa mozaiki tytoniu. Pokazano ułożenie spirali RNA oraz podjednostek białkowych kapsydu (wg. A. Klug i D.L.D. Caspar, 1960)

Poszczególne dyski zaczynają się i kończą uskokiem dopasowanym do uskoku w kolejnym dysku. W czasie montażu cząstek wirusa (podrozdz. 3.3) dyski te „nakręcają się” na spiralę kwasu nukleinowego, a uskoki dopasowują się do siebie zamykając się tak, jak zamyka się wieczko słoika typu twist. Poszczególne podjednostki białkowe dość ciasno przylegają do siebie, tworząc sztywną, pałeczkowatą strukturę. Cząstka wirusa mozaiki tytoniu ma długość 300 nm, a jej średnica wynosi około 15–18 nm. Wewnętrzny kanał centralny ma średnicę 2,3 nm. Kwas nukleinowy nie jest zwinięty w tym kanale. Jego spirala przebiega między wewnętrznymi częściami podjednostek białkowych.

Nitkowate cząstki wirusów są zbudowane podobnie, choć są giętkie i wobec tego mogą być mniej lub bardziej powyginane. Ta giętkość jest, być może, wynikiem większego udziału struktury harmonijki β w porównaniu z helisą α (podstawowe formy konformacji białek) w podjednostkach białkowych tych wirusów. Cząstki nitkowate są na ogół cieńsze od pałeczkowatych i mają średnicę około 12 nm. Długość ich bywa bardzo różna – od 500 do 600 nm u potexwirusów do 2000 nm u closterowirusów.

Cząstki bacilokształtne (ang. bacilliform) mają zupełnie inne proporcje długości do średnicy. U wirusa mozaiki tytoniu stosunek ten wynosi 15:1, natomiast u typowych wirusów bacilokształtnych (np. rhabdowirusów) stosunek ten wynosi 4:1–5:1. Cząstki tych wirusów to krótkie i grube pałeczki o wymiarach 20–30 × 80–120 nm. Ich końce nie są kolistymi płaszczyznami prostopadłymi do osi cząstek, ale są wypukłe i kopulasto zaokrąglone. Wirusy o takich cząstkach zawsze mają dodatkową otoczkę lipoproteinową (podrozdz. 2.3). Szczegóły ich budowy są przedstawione w podrozdziale 10.3 przy omawianiu rodzajów charakteryzujących się taką właśnie budową.

Cząstki kuliste zostały tak nazwane, ponieważ pierwsze obserwacje w mikroskopie elektronowym sugerowały, że taki właśnie mają one kształt. Postęp technik obserwacyjnych pozwolił stwierdzić, że są to jednak wielościany, a konkretnie dwudziestościany foremne (ikosaedry), których ściany są trójkątami równobocznymi. W sumie, cząstki te rzeczywiście przypominają kule o średnicy 25–30 nm. Przy dokładnym oglądaniu można zauważyć regularne struktury morfologiczne złożone z 6 (heksamery) lub 5 (pentamery) podjednostek. Struktury te były nazywane kapsomerami (Caspar i Klug, 1962). Heksamery rozmieszczone są na powierzchniach poszczególnych ścian ikosaedru, zaś pentamery tworzą jego wierzchołki (ryc. 3). Kwas nukleinowy zwinięty w skomplikowany kłębek wypełnia wnętrze tych cząstek i, podobnie jak u wirusów o strukturze helikalnej, jest związany z wewnętrznymi częściami podjednostek białkowych. U geminiwirusów dwie takie izometryczne cząstki są połączone i tworzą typową bliźniaczą cząstkę (zob. ryc. 1). Okrągłe, ale znacznie większe (średnica około 80 nm) są cząstki tospowirusów (zob. ryc. 1). Mają one, podobnie jak wirusy bacilokształtne, dodatkową otoczkę lipoproteinową. Szczegóły ich budowy zostaną przedstawione w podrozdziale 10.3.

Ryc. 3. Model pozornie kulistej cząstki wirusa. Podjednostki białkowe są zebrane w pentamery lub heksamery tworzące regularny dwudziestościan (ikosaedr) (wg J.T. Finch i A. Klug, 1966)

2.3. Składniki cząstek wirusów, ich właściwości i funkcje

W skład cząstek wszystkich wirusów, w tym i wirusów roślin, wchodzą dwa główne elementy: kwas nukleinowy i białko. Kwas nukleinowy jest genomem, czyli genetycznym zapisem cech wirusa i decyduje o jego identyczności oraz podstawowych właściwościach. Stanowi on od 1,0% masy cząstki wirusa (u dużych wirusów z rodziny Rhabdoviridae) do 42–46% tej masy (u małych izometrycznych wirusów z rodzaju Nepovirus). Istotne jest, że w każdej cząstce wirusa występuje albo RNA, albo DNA, a nie oba te typy kwasów nukleinowych. Białko spełnia przede wszystkim funkcję ochronną, choć może wpływać również na przejawianie się niektórych cech wirusa, o czym będzie jeszcze mowa później. Ze względu na tę podstawową funkcję białka w cząstce wirusa często używa się określenia okrywa białkowa lub płaszcz białkowy. Prawidłową natomiast nazwą tego składnika cząstki wirusa jest kapsyd. U większości wirusów roślin genom i kapsyd tworzą razem kompletną cząstkę wirusa, czyli tzw. wirion. U niektórych wirusów (np. rodziny Bunyaviridae i Rhabdoviridae) w skład wirionu wchodzi jeszcze dodatkowa otoczka lipoproteinowa stanowiąca zewnętrzną warstwę kapsydową. Białkowe struktury kapsydu bezpośrednio związane z kwasem nukleinowym są nazywane w takich przypadkach nukleokapsydem. Nazwy te są od dawna przyjęte (Caspar i in., 1962) i powszechnie używane w opisach budowy wirusów, aczkolwiek bogactwo form budowy jest tak duże, że nie zawsze konkretne struktury odpowiadają niegdyś ustalonym normom i pojęciom (Matthews, 1991).

W cząstkach niektórych wirusów zidentyfikowano również inne substancje. Z kwasem nukleinowym wirusa żółtej mozaiki rzepy związane są poliaminy – spermidyna stanowiąca do 1,0% masy cząstek wirusa i spermina w ilości do 0,04% masy (Beer i Kosuge, 1970). Lipidy obecne w dodatkowej otoczce lipoproteinowej mogą stanowić nawet do 20% masy cząstek wirusa (Best i Katekar, 1964). Analiza składu lipidów u Sonchus yellow net virus należącego do rodzaju Rhabdovirus dała wyniki (62% fosfolipidów, 31% steroli i 7% triglicerydów) sugerujące, iż substancje te pochodzą z błon komórek żywiciela (Selstam i Jackson, 1983). Od dawna spotyka się w literaturze doniesienia o obecności jonów metali w czystych preparatach wirusów. W niektórych przypadkach wynika to zapewne z obecności tych jonów w różnych odczynnikach używanych w toku procedur oczyszczania, a nawet w wodzie destylowanej (zob. Matthews, 1991). W innych jednak przypadkach jony wodorowe [H]+ w niektórych aminokwasach struktur białkowych są zastępowane jonami wapnia [Ca]2+ pełniącymi ważne funkcje w procesie uwalniania kwasu nukleinowego z otoczki białkowej (Durham i in., 1977). Również w innych przypadkach potwierdzono ważną dla stabilności wirusów funkcję dwuwartościowych kationów (Abdel-Meguid i in., 1981; Olson i in., 1983). Cynk, z kolei, odgrywa istotną rolę w budowie tzw. palców cynkowych (ang. zinc fingers), czyli trzeciorzędowych struktur białkowych aktywnie wiążących kwas nukleinowy w toku montażu cząstek wirusów z rodzajów Ilarvirus i Alfamovirus (Sehnke i in., 1989). Wreszcie, cząstki wirusów ulegają zjawisku hydratacji, aczkolwiek ilość zawartej w nich wody jest trudna do określenia ze względu na różnice w wynikach pomiarów uzyskanych różnymi metodami. Można przyjąć, że cząstki wirusów z dodatkową otoczką lipoproteinową zawierają ilość wody porównywalną do tej, jaka występuje w komórkach organizmów prokariotycznych, to znaczy około 3–4 cm^3 wody na 1 gram suchej masy (Matthews, 1975), a cząstki małych wirusów izometrycznych zawierają około 1 cm^3 wody na 1 g suchej masy (zob. Matthews, 1991). Woda ta jest związana z białkową częścią wirionu, natomiast cząstki wirusów z dodatkową okrywą lipoproteinową funkcjonującą jak osmotycznie czynna dwuwarstwowa błona mogą zatrzymywać wodę w taki sposób, w jaki zatrzymują ją komórki organizmów żywych.

2.3.1. Kwasy nukleinowe wirusów roślin

Poliaminy, lipidy, jony metali i woda pełnią w strukturze i funkcjonowaniu cząstek wirusów szczególne role. Podstawowymi składnikami tych cząstek są jednak kwasy nukleinowe i białka. Omówienie funkcji kwasów nukleinowych wymaga pewnego komentarza terminologicznego. Ucząc się genetyki, a zwłaszcza genetyki molekularnej, przyzwyczajamy się do postrzegania funkcji kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) jako genomu, podczas gdy funkcje kwasu rybonukleinowego (RNA) widzimy jako funkcje pośrednika przenoszącego informacje genetyczne zawarte w DNA na białko w procesie translacji (informacyjny RNA, mRNA) czy też funkcje dostarczyciela surowców (aminokwasów) do budowy polipeptydów w polisomach (transportujący RNA, tRNA). Dlatego też, myśląc o odcinkach DNA kodujących określone białka chętnie mówimy geny, natomiast o cząsteczkach RNA powstałych z transkrypcji określonych genów i ulegających swobodnej translacji do określonych białek mówimy raczej otwarte ramki odczytu (ang. open reading frame, ORF). Tymczasem genom wirusa może stanowić RNA, a więc odcinek RNA może być genem, a zarazem otwartą ramką odczytu. Najkrócej mówiąc, w literaturze wirusologicznej oba te pojęcia bywają używane zamiennie i bez rozróżnień; nie ma chyba innego wyjścia, ponieważ pewne fragmenty genomu różnych wirusów ulegają bezpośrednio translacji do odpowiednich białek, bez pośrednictwa mRNA, inne zaś ulegają najpierw transkrypcji do subgenomowego RNA (sgRNA), który jest dopiero właściwą otwartą ramką odczytu i przenosi informację o budowie odpowiedniego białka, pełniąc funkcje informacyjnego mRNA. Najliczniej wśród wirusów roślin są reprezentowane wirusy, których genomem jest pojedyncza, sensowna (plusowa) nić RNA – (+)ssRNA, od anglojęzycznego określenia single stranded RNA. Nić sensowna, to znaczy taka, która może być wykorzystana jako informacyjny RNA (mRNA) w procesie translacji, czyli inaczej mówiąc, może być przetłumaczona bezpośrednio na odpowiednie białko. Jeszcze inaczej mówiąc, jest to kwas rybonukleinowy, którego początkiem jest koniec 5' nici (ryboza ma wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego węgiel w pozycji 5'), a zakończeniem jest koniec 3' nici (ryboza, która ma wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego węgiel w pozycji 3'). Zgodnie z jedną z reguł procesu translacji, proces ten postępuje zawsze od końca 5' w kierunku końca 3', a zgodnie z europejską tradycją zapisu mowy, zdania, a więc i kod genetyczny zapisujemy od strony lewej ku stronie prawej (Berg i Singer, 1997). Pierwszą trójką (triplet, kodon) nukleotydów jest kodon początkujący (kodon startowy) AUG kodujący równocześnie metioninę jako aminokwas montowany w łańcuchu polipeptydowym. Jedna z trzech możliwych trójek nukleotydów – UAG, UAA lub UGA stanowi kodon kończący, czyli tzw. kodon stop. Kodony stop nie kodują żadnych aminokwasów, lecz stanowią wyłącznie sygnał zakończenia translacji otwartej ramki odczytu do określonego polipeptydu. Liczba i sekwencja nukleotydów, a właściwie ich trójek w ssRNA, stanowią o tożsamości każdego wirusa i są wobec tego względnie stałe. Genomy wirusów roślin są stosunkowo niewielkie i liczą sobie z reguły od 10^4 do 10^5 nukleotydów, zaś genomy np. zwierząt mają od 10^9 do 10^10 par nukleotydów, a genomy roślin są jeszcze większe i liczą od 10^10 do 10^11 par nukleotydów. Zgodnie z powszechnie przyjętą terminologią liczbę nukleotydów podaje się na ogół w tysiącach (przedrostek kilo-) i wyraża się ją jako liczbę wbudowanych zasad purynowych lub pirymidynowych (ang. kilobase, kb) lub par tych zasad (ang. kilobase pairs, kbp) Typowa masa genomu wirusa roślinnego mieści się w granicach od 4,0 × 10^5 do 4,6 × 10^6 daltonów (dalton [Da] jest to bezwzględna masa jednego atomu wodoru). Masa pojedynczego nukleotydu wynosi około 330 Da, z czego wynika, że masa 1 kb wynosi około 330 kDa.

Oczywiście, nie jest tak, że wszystkie cząsteczki kwasu nukleinowego określonego gatunku wirusa są całkowicie identyczne. Po pierwsze, wśród wirusów jest wiele takich, których kompletny genom jest zapisany na paru (2–4) różnych cząsteczkach RNA (prawie 20% spośród wszystkich rodzajów wirusów roślin uznanych oficjalnie przez ICTV). Poszczególne fragmenty genomu tych wirusów o wielosegmentowym genomie różnią się od siebie wielkością i sekwencją nukleotydów, i wreszcie treścią zapisu genetycznego (zob. podrozdz. 3.2). Ale i w przypadku wirusów o jednosegmentowym genomie lub w przypadku tego samego segmentu genomu wirusa o wielosegmentowym genomie, poszczególne cząsteczki kwasu nukleinowego nie są identyczne z powodu ciągle zdarzających się błędów w replikacji tego kwasu. Zagadnienia te zostaną szczegółowo przedstawione w podrozdziale 3.4 omawiającym zmienność wirusów. Różnice w wynikach pomiarów dotyczących wielkości i sekwencji ssRNA wirusowego mogą być rezultatem innych jeszcze zdarzeń:

• RNA może ulec uszkodzeniu w trakcie izolowania go z materiału roślinnego,

• RNA wirusowy ulega czasem samorzutnej częściowej degradacji w komórkach roślin w nienaruszonych cząstkach wirusa,

• opłaszczeniu białkiem może ulec niepełna kopia RNA wirusa, np. jego subgenomowy fragment (Palukaitis, 1984),

• opłaszczeniu białkiem wirusa może ulec któryś z RNA żywiciela i cząstki takie mogą być mylnie poczytane za cząstki wirusa – dane takie uzyskano w badaniach nad wirusami z rodzaju Tymovirus, w których cząstkach znaleziono prawdopodobnie tRNA roślinny (Bouley i in., 1976) i Tobamovirus (Siegel, 1971),

• w badanym preparacie może być obecny RNA wirusa satelitarnego, niestanowiący genomu badanego wirusa,

• w trakcie replikacji RNA powstają czasem jego ułomne formy (rozdz. 3), które mogą być obecne w preparacie,

• rozbieżności w pomiarach mogą być wynikiem tworzenia przez RNA w roztworze drugorzędowych, a nawet trzeciorzędowych struktur; powstają w ten sposób różne konformacyjnie cząsteczki RNA, które mogą ulec rozdzieleniu w toku dostatecznie precyzyjnej elektroforezy lub np. wirowania w gradiencie gęstości (Dickerson i Trim, 1978),

• w pewnych warunkach RNA wirusowy może tworzyć dimery (Asselin i Zaitlin, 1978).

Dość ważną cechą RNA, w tym również RNA wirusów roślin, jest absorpcja promieniowania UV w zakresie od 230 do 290 nm. Skład RNA wirusów roślin, a zwłaszcza proporcje nukleotydów zawierających zasady purynowe i pirymidynowe decyduje o tym, że maksimum absorpcji (wierzchołek krzywej absorpcji) leży zazwyczaj w okolicy 260 nm. Pomiar absorpcji promieni UV tej właśnie długości bywa używany nawet do oznaczania zawartości wirusa w przygotowywanych preparatach (Noordam, 1973). Na przykład A260 dla 1 mg/ml RNA wirusa mozaiki tytoniu w roztworze fizjologicznym wynosi około 29, a dla RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy w tych samych warunkach około 23 (Matthews, 1991).

Przestrzenne ułożenie (konformacja) RNA w cząstce wirusa zależy głównie od jego powiązań z białkiem wirusa. Wolny RNA wirusowy, uwolniony z okrywy białkowej nie przybiera, jak można by się spodziewać, struktury liniowej, tzn. nić RNA nie rozciąga się swobodnie na całą długość. W normalnych warunkach (temperatura pokojowa, pH około 7,0 i molowość roztworu odpowiadająca 0,1 M NaCl) na nici RNA występują liczne, krótkie odcinki helikalne przedzielone odcinkami rozwiniętej pojedynczej nici RNA, co nadaje cząsteczce kwasu nukleinowego dość zwartą strukturę. Liczba i długość tych sparowanych (połączonych w pary) odcinków zależy, oczywiście, od składu nukleotydowego RNA, a konkretnie od liczby i długości komplementarnych odcinków mogących ulec sparowaniu. Zależy to jednak również od warunków zewnętrznych, a przede wszystkim od temperatury, pH roztworu i zawartości kationów. Całkowita lub częściowa denaturacja może nastąpić w wyniku zmiany tych warunków. Warto zauważyć, że zmienia to również fizyczne właściwości RNA, np. absorpcję UV. Należy to brać pod uwagę przy oznaczaniu właściwości fizycznych RNA wirusa (Ehresmann i in., 1987).

Poszczególne rodzaje kwasów nukleinowych różnią się między sobą znacząco cechą, która nazywa się gęstością pławalną (ang. buoyant density) w roztworach soli cezu. Kiedy stężone roztwory chlorku lub siarczanu(VI) cezu poddaje się wirowaniu w odpowiednich warunkach, ciężkie jony cezu tworzą gradient gęstości. Jeśli w roztworze takim znajdzie się kwas nukleinowy, lokalizuje się on po wirowaniu w postaci prążka w tej warstwie gradientu, która odpowiada gęstością gęstości tego kwasu. RNA osadza się na dnie gradientu CsCl, a np. dwuniciowy DNA zatrzymuje się tam w postaci prążka w pozycji odpowiadającej gęstości pławalnej równej około 1,69–1,71 g/cm^3. Gęstość pławalna DNA oznaczona w gradiencie chlorku cezu zależy od zawartości nukleotydów G+C i, dzięki temu, wirowanie w gradiencie gęstości może być użyte w celu określenia składu nukleotydowego takiego DNA. Gęstość pławalną różnych rodzajów kwasów nukleinowych w gradiencie gęstości Cs2SO4 podano w tabeli 1.

Tabela 1. Gęstość pławalna różnych rodzajów kwasów nukleinowych wyznaczona przez wirowanie w gradiencie gęstości siarczanu(VI) cezu 1,56 g/cm3 (wg Matthewsa, 1991)

Rodzaj kwasu nukleinowego

Gęstość pławalna w g/cm3

dsDNA

1,42–1,44

ssDNA

1,49

dsRNA

1,60

ssRNA

1,65

U pewnych wirusów zostały zidentyfikowane charakterystyczne struktury zakończeń nici RNA. Jedną z takich struktur jest tzw. czapeczka (ang. cap) występująca na końcu 5' u wirusów z rodzajów Alfamovirus, Bromovirus, Cucumovirus, Carmovirus, Furovirus, Hordeivirus, Potexvirus, Tobamovirus, Tobravirus i Tymovirus. Jest to struktura charakterystyczna dla informacyjnego RNA występującego w komórkach ssaków oraz u wirusów zwierząt (siedem kolejnych nukleozydów guaninowych związanych z nicią RNA trzema kolejnymi resztami kwasu ortofosforowego; ryboza w ostatnim nukleozydzie jest podstawiona grupą metylową w pozycji 5'). U innych wirusów roślin z końcem 5' nici RNA jest związane tzw. białko VPg (ang. virus protein genome linked). Są to białka o stosunkowo małej masie cząsteczkowej (3500–24000) kodowane przez fragment genomu wirusa, u którego występują. Gen kodujący VPg został u niektórych wirusów rozpoznany – np. u wirusa mozaiki wspięgi należącego do rodzaju Comovirus (Jaegle i in., 1987). Białka takie poznano również u wirusów należących do rodzajów Luteovirus, Nepovirus, Potyvirus i Sobemovirus (Daubert i Bruening, 1984). Wirusy o podzielonych (segmentowych) genomach mają te same białka VPg na końcach 5' wszystkich fragmentów genomu.

Z kolei, na końcu 3' RNA niektórych wirusów roślin występują długie łańcuchy poliadeninowe – tzw. łańcuchy poli(A) charakterystyczne dla informacyjnych RNA (mRNA) z komórek organizmów eukariotycznych. Łańcuchy te mogą się składać z 25 nawet do 370 kolejnych adenonukleotydów (Ahlquist i Kaesberg, 1979). Struktury takie zostały zidentyfikowane u wirusów roślin, których RNA funkcjonuje jako mRNA, np. u wirusów należących do rodzajów Capillovirus, Comovirus, Furovirus, Nepovirus, Potexvirus i Potyvirus. Inną formą końca 3' łańcucha (+)ssRNA wirusowego jest koniec wykazujący aktywność podobną do aktywności tRNA, tzn. wiążący aminokwasy, a wykryty najpierw u wirusów z rodzaju Tymovirus (Pinck i in., 1975). Analogiczną strukturę końca 3' RNA wykryto też u wirusów z rodzaju Cucumovirus (Kohl i Hall, 1974), Bromovirus i Hordeivirus (Loesch-Fries i Hall, 1982) oraz Tobamovirus (Garcia-Arenal, 1988). Model pierwszoi drugorzędowej struktury końca 3' RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy zaproponowali Dumas i inni, 1987. Jest to tzw. nibywęzeł (ang. pseudoknot), którego istotną częścią są sekwencje trzech par zasad GC w pętlach oraz kolejna trójka nukleotydów cytydynowych w jednoniciowej części struktury między pętlami.

W efekcie powstaje końcowe ramię złożone z 12 par nukleotydów identycznych jak w klasycznym tRNA (ryc. 4) zdolne do specyficznego wiązania aminokwasów.

Inną formą genomu u wirusów roślin jest dwuniciowy RNA (dsRNA). U wirusów z rodzaju Reovirus składa się on z 10 do 12 segmentów dsRNA (Hibi i in., 1984), a u zbadanych pod tym względem wirusów z rodzaju Alphacryptovirus zidentyfikowano tylko dwa takie segmenty (Accotto i Boccardo, 1986). Masa genomu sięga 16–19 × 10^6 daltonów. Tego rodzaju struktura zapewnia odporność na RNazę (rybonukleazę). Denaturacja zachodzi albo w środowisku o słabej sile jonowej, albo w środowisku o ekstremalnie niskich lub wysokich wartościach pH, albo pod wpływem temperatury. Krzywa denaturacji termicznej jest dość stroma. Denaturacja dsRNA wirusa karłowatości ryżu zaczyna się np. przy temperaturze około 70°C, a pełna denaturacja następuje już w warunkach temperatury 80°C (Miura i in., 1966).

Ryc. 4. Podobieństwa końcowej części RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy (A, B) i klasycznego tRNA z drożdży (C, D) (wg P. Dumas i in., 1987): A, C – drugorzędowa struktura końcowego fragmentu RNA; B, D – modele przestrzenne struktury obu RNA

Pierwszym wirusem roślinnym, u którego stwierdzono genom inny niż ssRNA, był wirus mozaiki kalafiora; jego genom to dwuniciowy dsDNA (Shepherd i in., 1968, 1970). Obecnie wiadomo, że taki właśnie genom mają wszystkie wirusy z rodziny Caulimoviridae. Podwójna nić DNA tworzy zazwyczaj kolistą, otwartą strukturę, choć często konformacja tego DNA bywa bardziej złożona przez dodatkowe skręcanie się i tworzenie węzłów. Nić α, czyli nić minusowa, jest otwarta w jednym miejscu, natomiast w nici plusowej (kodującej) występują dwie przerwy. Powstałe w ten sposób trzy nici DNA są nazywane kolejnymi literami alfabetu greckiego – β, γ i δ. Nić α jest taka sama u wszystkich caulimowirusów, natomiast różne gatunki i szczepy wirusów z tej rodziny różnią się pozycjami, w których występują przerwy w drugiej nici, a zatem długością nici β, γ i δ. Z końcem 5' poszczególnych nici DNA tworzących genom caulimowirusów są związane często pojedyncze nukleotydy lub krótkie łańcuchy nukleotydów będących składnikami RNA. Uważa się, że grają one pewną rolę w inicjacji replikacji DNA caulimowirusów (Guilley i in., 1983).

Genom w postaci jednoniciowego ssDNA mają wirusy z rodziny Geminiviridae. Pierwszych informacji na ten temat dostarczyły prace Goodmana (1977a, b) oraz Harrisona i innych (1977). Opisywane wcześniej u niektórych geminiwirusów podwójne nici DNA lub podwojone formy ssDNA (zob. Matthews, 1991) są zapewne formami replikacyjnymi tych wirusów (Lazarowitz, 1988).

Wszystkie opisane dotychczas formy kwasów nukleinowych tworzących genomy różnych wirusów roślin mają tę wspólną właściwość, że są infekcyjne, podobnie jak pełne wiriony. Oznacza to, że taki kwas nukleinowy, wyizolowany z cząstki wirusa, może być wprowadzony do komórki roślinnej i będzie tam się namnażał. Inaczej pod tym względem zachowują się jednoniciowe RNA stanowiące genomy wirusów roślin zaliczanych do rodzin Rhabdoviridae (rodzaje Cytorhabdovirus i Nucleorhabdovirus) i Bunyaviridae (rodzaj Tospovirus). Są to jednoniciowe RNA, ale o antysensownej orientacji (–)ssRNA – od końca 3' do końca 5' (wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego pozostaje węgiel w pierścieniu, w pozycji 3'). Ze względu na tę antysensowną orientację te kwasy nukleinowe nie mogą ulegać translacji w komórkach roślin i wobec tego nie namnażają się, kiedy są wprowadzone do tych komórek samodzielnie, po wyizolowaniu z cząstek wirusa. W pełnych cząstkach tych wirusów zawarta jest gotowa już polimeraza RNA, co umożliwia syntezę sensownej, zdolnej do translacji nici RNA, co z kolei zapoczątkowuje proces namnażania takiego wirusa w komórce roślinnej.

Oczywiście, od momentu poznania natury genomu wirusa i natury kodu genetycznego interesowano się sekwencją nukleotydów w kwasach nukleinowych wirusów. Początkowo, ze względu na trudności metodyczne, ograniczono się do oznaczania sekwencji końców 5' i 3' jako ważnych funkcjonalnie (zob. Matthews, 1991). Pierwszym wirusem rośliny, u którego rozpoznano pełną sekwencję DNA, był wirus mozaiki kalafiora (Franck i in., 1980). Dopiero opanowanie techniki tworzenia bibliotek cDNA (sekwencji kwasu deoksyrybonukleinowego komplementarnych do określonego RNA) pozwoliło na uzyskanie pełnej sekwencji nukleotydów w genomie wirusa mającego RNA. Oczywiście, był to wirus mozaiki tytoniu (Goelet i in., 1982). Warto zaznaczyć, że wcześniej była poznana sekwencja nukleotydów w RNA wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (Gross i in., 1978). Lata 80. i 90. XX wieku to okres, w którym szybko przybywało danych o sekwencjach genomów poszczególnych wirusów roślin. Zawdzięczamy to gwałtownemu postępowi w rozwoju technik sekwencjonowania kwasów nukleinowych (Ausubel i in., 1987, 1988). Równocześnie upowszechniało się stosowanie komputerów zarówno jako narzędzi badawczych, jak i środków łączności (Internet) oraz gromadzenia i wymiany informacji. Aktualnie istnieje kilka baz danych, w których można znaleźć dane o sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych poznanych pod tym względem wirusów roślin. Baza danych ICTV (ICTVdB) jest dostępna na niżej podanych stronach internetowych:

http://life.anu.edu.au/viruses/welcome.htm (Grupa Bioinformatyczna Australian National University, Canberra);

http://www.ncbi.ncm.nlm.nih.gov/ICTVdB/welcome.htm (NCBI Bethesda, USDA);

http://www.res.bbsrc.ac.uk/mirror/auz/welcome.htm (IACR, Rothamsted, UK).

Podstawowa baza danych o wirusach roślin (Virus Identifiction Data Exchange – VIDE database) jest dostępna na stronie http://biology.anu.edu.au.

Olbrzymią rolę w poznaniu sekwencji kwasów nukleinowych odegrały enzymy restrykcyjne albo tzw. endonukleazy restrykcyjne. Uzyskiwane są one z komórek różnych bakterii lub innych organizmów prokariotycznych i służą do rozcinania (hydroliza wiązań fosfodiestrowych) długich sekwencji kwasów nukleinowych w ściśle określonych miejscach. Uzyskane fragmenty kwasów nukleinowych (około 1 kbp), tzw. fragmenty restrykcyjne można poddawać elektroforezie na żelach poliakryloamidowych albo, jeśli są dłuższe (około 20 kbp), na żelach agarozowych o większych porach. Po rozdzieleniu tych fragmentów można je albo barwić bezpośrednio (zob. rozdz. 9), albo, po zdenaturowaniu w celu uzyskania łańcucha jednoniciowego, wykonuje się ich odcisk na błonie nitrocelulozowej (filtr nitrocelulozowy). Po hybrydyzacji z odpowiednią sondą molekularną (zob. rozdz. 9) znakowaną izotopem 32P wykonuje się autoradiogram, na którym prążki są bardzo dobrze widoczne. Można, dzięki temu, zlokalizować konkretny, poszukiwany fragment DNA. Metoda ta została opracowana przez E.M. Southerna i nazywa się Southern blotting. Opracowana nieco później analogiczna technika poszukiwania fragmentów restrykcyjnych RNA została, dla kontrastu, nazwana Northern blotting.

Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych, to znaczy miejsc cięcia łańcuchów kwasu nukleinowego przez enzymy restrykcyjne, powodują zmiany w długości fragmentów restrykcyjnych, czyli tzw. polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragments length polymorphism, RFLP). Elektroforetyczna analiza fragmentów restrykcyjnych z użyciem wzorców o znanych, standardowych długościach może dostarczyć informacji o tej zmienności.

W 1984 roku Kary Mullis opisał i opatentował (zob. rozdz. 9) metodę wielokrotnego powielania określonych odcinków DNA, czyli amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), najlepiej chyba objaśnioną przez Saiki i innych (1988). Jeśli chcemy powielać pewien konkretny fragment DNA, musimy znać flankujące ten fragment sekwencje (około 20 nukleotydów) sąsiadujących z nim fragmentów tego kwasu. Trzeba wyprodukować odcinki starterowe (tzw. primery) DNA o sekwencjach komplementarnych do tych sekwencji flankujących. Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja termiczna (95°C) wyjściowej cząsteczki DNA pozwalająca uzyskać formę jednoniciową. W drugim etapie (ang. annealing) primery są przyłączane przez hybrydyzację do komplementarnych sekwencji flankujących fragment, który chcemy powielać. Ten etap reakcji przebiega w temperaturze 54°C. Trzeci, zasadniczy etap, to synteza DNA z obecnych w środowisku reakcji trifosforanów wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów (dNTP) prowadzona w dość wysokiej temperaturze (72°C) przez polimerazę Taq. Jest to polimeraza DNA pochodząca z termofilnych bakterii Thermus aquaticus żyjących w gorących źródłach. Obie sekwencje starterowe wydłużają się w kierunku sekwencji docelowej. W ten sposób uzyskuje się kopie obu nici naszej docelowej sekwencji DNA. W kolejnym cyklu mogą już służyć one za matryce. W ten sposób liczebność tych matryc zwiększa się wykładniczo z cyklu na cykl i dzięki temu bardzo szybko uzyskujemy bardzo dużą liczbę kopii (10^6 w czasie 30 cykli, czyli około 120–150 min) interesującego nas fragmentu DNA. Istotą metody jest zastosowanie aparatu (termocykler) szybko zmieniającego temperaturę oraz użycie polimerazy zdolnej do funkcjonowania w podwyższonej temperaturze.

Większość wirusów roślin ma genom w postaci RNA, którego nie da się zamplifikować w ten sposób. Wystarczy jednak używając odwrotnej transkryptazy uzyskać komplementarny DNA, który można już amplifikować. Metoda ta nazywa się RT-PCR (ang. reverse transcription-polymerase chain reaction). Amplifikacja kwasów nukleinowych metodą PCR lub RT-PCR dostarcza dużej ilości materiału do wszelkiego rodzaju badań (sekwencjonowanie, porównywanie różnych wariantów wirusów, wykrywanie wirusów przy zbyt małej ilości wyjściowej w materiale roślinnym). Dość szczególną metodą jest metoda RAPD (ang. random amplified polymorphic DNA). Stosuje się tu pojedyncze, losowo wybrane startery (primery), które przyłączają się do powtarzających się, komplementarnych sekwencji w niciach DNA. Po amplifikacji uzyskujemy więc fragmenty, których długość odpowiada odległości między sekwencjami komplementarnymi do primerów. Długość tych fragmentów odczytuje się po analizie elektroforetycznej i porównaniu ze standardami.

2.3.2. Białka wirusów roślin

Białka występujące w cząstkach wirusów są pod względem składu aminokwasowego identyczne z białkami występującymi w żywych organizmach. W ich skład wchodzą cząsteczki 20 pospolitych aminokwasów, przy czym stosunkowo rzadko występują cysteina, histydyna, metionina, tryptofan i tyrozyna. Aminokwasy te tworzą strukturalne podjednostki białkowe liczące po paręset cząsteczek aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Cały kapsyd składa się z kilkuset (u niektórych wirusów izometrycznych) do kilku tysięcy (u niektórych wirusów wydłużonych) takich podjednostek. Umożliwia to upakowanie całego genomu wirusa, którego stosunkowo niewielka pojemność informacyjna nie pozwala na kodowanie większych białek. Kodowana jest tylko sekwencja aminokwasów w pojedynczej podjednostce. U znakomitej większości wirusów roślin, to znaczy prawie u wszystkich wirusów roślin o genomie typu (+)ssRNA, występuje tylko jeden rodzaj takich podjednostek i wszystkie podjednostki białka wirusa są identyczne. Wyjątkiem są wirusy z rodzaju Comovirus, u których występują dwa rodzaje podjednostek. Wirusy z rodzin Caulimoviridae i Reoviridae, a także wirusy roślin mające dodatkową otoczkę lipoproteinową mają po kilka różnych białek, w tym przynajmniej jedno jest białkiem enzymatycznym. Często używa się określeń białka strukturalne i białka niestrukturalne. Te pierwsze stanowią składniki budulcowe cząstek wirusów i są w wirionach obecne w stanie ich spoczynku, te drugie zaś pełnią różne funkcje związane, na przykład, z namnażaniem lub transportem wirusów w roślinach i pojawiają się tylko w toku realizowania tych funkcji.

Różne metody izolowania białka wirusowego z zakażonego materiału roślinnego albo z czystych już preparatów wirusa mogą doprowadzić do uzyskania tego białka w różnych postaciach. Czasami, zwłaszcza w przypadkach wirusów tworzących w komórkach roślin dużą liczbę pustych kapsydów (ang. viral protein shell) można uzyskać pełne okrywy białkowe. Preparaty takie uzyskuje się łatwo w przypadku, na przykład, wirusa żółtej mozaiki rzepy (Turnip yellow mosaic virus, TYMV). Częściej jednak uzyskuje się preparaty podjednostek białkowych albo pojedynczych, albo w różnym stopniu zagregowanych. Są one połączone ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi, ale nie mostkami siarkowymi charakterystycznymi dla dwusiarczków (wiązanie przez grupy tiolowe –SH). Tworzenie mostków siarkowych, najczęściej między cząsteczkami cysteiny, prowadzi do powstawania nieodwracalnie zdenaturowanych agregatów białkowych (zob. Matthews, 1991). Zastosowanie fenolu do izolowania białka doprowadza na ogół do denaturacji tego białka. Można je jednak zrenaturować przez wytrącenie metanolem i podgrzanie do 60°C przy pH 7,0–7,5.

Obok białek kapsydu w cząstkach niektórych wirusów wykryto także inne białka, przede wszystkim funkcjonujące w procesie replikacji genomu wirusa. U wirusa mozaiki kalafiora rozpoznano polimerazę DNA zależną od DNA (Ménissier i in., 1984), a u innych wirusów polimerazę RNA zależną od RNA – np. u wirusów roślin z rodziny Reoviridae (Uyeda i in., 1987) i Rhabdoviridae (Francki i Randles, 1972; Toriyama i Peters, 1981) oraz u wirusów z rodzajów Tospovirus (de Haan i in., 1991), Tenuivirus (Toriyama, 1986) i Alphacryptovirus (Marzachi i in., 1988).

Tabela 2. Podstawowe aminokwasy, ich oznaczenia i kodujące je trójki nukleotydów

Aminokwas

Symbol 3*

Symbol 1**

Kodujące trójki nukleotydów

Alanina

Ala

A

GCU GCC GCA GCG

Arginina

Arg

R

CGU CGC CGA CGG

Asparagina

Asn

N

AAU AAC

Kwas asparaginowy

Asp

D

GAU GAC

Cysteina

Cys

C

UGU UGC

Fenyloalanina

Phe

F

UUU UUC

Glicyna

Gly

G

GGU GGC GGA GGG

Glutamina

Gln

Q

CAA CAG

Kwas glutaminowy

Glu

E

GAA GAG

Histydyna

His

H

CAU CAC

Izoleucyna

Ile

I

AUU AUC AUA

Leucyna

Leu

L

CUU CUC CUA CUG

Lizyna

Lys

K

AAA AAG

Metionina

Met

M

AUG

Prolina

Pro

P

CGU CCC CCA CCG

Seryna

Ser

S

UCU UCC UCA UCG

Treonina

Thr

T

ACU ACC ACA ACG

Tryptofan

Trp

W

UGG

Tyrozyna

Tyr

Y

UAU UAC

Walina

Val

V

GUU GUC GUA GUG

* – symbole trzyliterowe; ** – symbole jednoliterowe

Kolejne trójki nukleotydów w genomie wirusa kodują odpowiednie aminokwasy (tab. 2). W ten sposób jest determinowana sekwencja aminokwasów w białkach strukturalnych i w innych białkach syntetyzowanych w czasie cyklu życiowego wirusa. Sekwencja aminokwasów decyduje o najważniejszych właściwościach powstałego białka, w tym również o jego konformacji. Białka podjednostek białkowych kapsydu, w wyniku skomplikowanych procesów fałdowania białka, tworzą bardzo złożone struktury. Z pewnych względów zajmiemy się w tym miejscu strukturą zewnętrznej powierzchni tego białka. Pofałdowania i wystające krótkie łańcuchy aminokwasowe tworzą w podjednostkach białkowych każdego wirusa jedyny i niepowtarzalny wzór. Poszczególne elementy tego wzoru, czyli tzw. epitopy, są odczytywane przez system immunologiczny ssaka, do którego krwi białko takie zostało wprowadzone. System ten, jako system obronny, odpowiada wytworzeniem specyficznych przeciwciał (ang. antibodies), które zawsze rozpoznają antygen (w tym przypadku białko podjednostek kapsydu wirusa) wywołujący ich produkcję i zawsze starają się go zneutralizować. Właściwość ta została wykorzystana w immunologicznych (serologicznych) metodach badania wirusów (Van Regenmortel, 1982). Przeciwciała (immunogammaglobuliny, IgG) są również białkami, a konkretnie niewielkimi białkami z grupy gammaglobulin o charakterystycznej budowie (ryc. 5). Pojedyncza gammaglobulina przypomina literę Y. Składają się na nią dwa polipeptydy połączone mostkami siarkowymi z grup tiolowych. Podstawa (trzonek) jest nazywana fragmentem Fc i nie jest istotna dla specyficznej reakcji przeciwciał z antygenem. Dwa jej ramiona, nazywane fragmentem Fab, odgrywają zasadniczą rolę, wiążąc się specyficznie z antygenem, przeciwko któremu zostały wytworzone. Każde z tych ramion tworzące tzw. ciężki łańcuch peptydowy, jest połączone mostkiem siarkowym z mniejszym (łańcuch lekki) polipeptydem i to w sumie tworzy istotny dla reakcji serologicznej fragment Fab. Ponieważ fragment Fc nie odgrywa żadnej roli, w różnych procedurach serologicznych używa się spreparowanych przeciwciał trawionych papainą, która oddziela aktywną część Fab. Trawienie pepsyną powoduje, że uzyskuje się nieco większy fragment określany jako F(ab')2 często stosowany aktualnie w różnych badaniach serologicznych.

Bardzo dobrymi producentami przeciwciał są króliki, przy czym w hodowlach zwierząt laboratoryjnych utrzymuje się specjalne rasy królików o sprawdzonej, dobrej odpowiedzi immunologicznej. Króliki są z jednej strony dobrymi producentami przeciwciał, a z drugiej zwierzętami łatwymi w hodowli i w wykorzystaniu, to znaczy szybko się rozmnażają, nie są za duże i nie sprawiają kłopotów ani w samej hodowli, ani w czasie wykonywania zabiegów immunizacji (uczulania) i pobierania krwi. Do produkcji dużej ilości surowic można używać większych zwierząt, mających więcej krwi (np. konie), ale ich utrzymanie jest dużo bardziej kosztowne i kłopotliwe. Do produkcji bardzo małych ilości surowicy (np. przy wytwarzaniu przeciwciał monoklonalnych) używa się drobnych zwierząt laboratoryjnych, np. myszy. Specjalne techniki serologiczne, tzw. techniki pośrednie (zob. podrozdz. 8.4.2) wymagają użycia dwóch rodzajów przeciwciał – pierwsze uczulone na białko wirusowe, drugie uczulone na gammaglobuliny pierwszych przeciwciał. Z reguły producentami tych pierwszych są króliki, a tych drugich – kozy, również zwierzęta mało wymagające, jeśli chodzi o utrzymanie.

Ryc. 5. Elementy budowy gammaglobuliny przeciwciała

Immunizacji (uczulenia na antygen) królika dokonujemy, wstrzykując mu dożylnie (do zewnętrznej, brzeżnej żyły w uchu) porcję 1–2 ml oczyszczonego antygenu w fizjologicznym roztworze soli. Wirus pełniący rolę antygenu musi być bardzo dobrze oczyszczony. Obecność innego białka spowoduje wytworzenie przeciwciał na to białko i, w konsekwencji, złą jakość surowicy. Można antygen wstrzykiwać również domięśniowo, ale wówczas na ogół dodaje się (1:1) tzw. adiuwant Freunda (olej parafinowy zawierający mannidooleinian) do preparatu wirusa. Zastrzyki trzeba powtarzać (2–3 zastrzyki co 3–4 dni). Układ limfatyczny królika wytwarza przeciwciała, które są uwalniane do krwiobiegu. Maksymalny poziom zawartości przeciwciał we krwi zwierzęcia uzyskuje się z reguły po 2–3 tygodniach. Pobieramy wówczas krew i przetrzymujemy ją przez kilka godzin w warunkach temperatury pokojowej w celu skoagulowania krwinek. Następnie krew odwirowujemy (np. 15–20 min przy 5–10 tys. obr./min), strącając w ten sposób skoagulowane krwinki. Pozostaje czyste osocze (surowica, serum) z zawiesiną przeciwciał. Ponieważ surowica ta zawiera przeciwciała specyficzne w stosunku do wprowadzonego do krwi zwierzęcia antygenu, nazywamy ją surowicą uczuloną na dany antygen albo antysurowicą (antyserum) przeciw temu antygenowi. Podstawową cechą surowicy jest zawartość w niej specyficznych przeciwciał. Liczbę tych przeciwciał można wyrazić, określając miano surowicy. Jest to największe rozcieńczenie w szeregu dwójkowym (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 … itd.), które reaguje w widoczny sposób z wirusem np. w reakcji mikroprecypitacji (podrozdz. 8.4.2). Surowicę taką można, zwłaszcza po dodaniu azydku sodu (0,01%), przechowywać bezpiecznie w zatopionych ampułkach. Można ją też zliofilizować, co znakomicie wydłuża czas bezpiecznego przechowywania. W tej postaci surowice uczulone na różne wirusy są produkowane i sprzedawane przez specjalistyczne laboratoria. Reakcje serologiczne, to znaczy reakcje przeciwciał ze specyficznym dla nich antygenem, są przeprowadzane w różny sposób i na różnych podłożach. Różny jest też sposób obserwowania tych reakcji, albo bezpośrednio, albo dzięki znakowaniu surowicy różnymi metodami. Te różne sposoby nazywane są różnymi technikami serologicznymi. Niektóre z nich zostaną opisane w podrozdziale 8.4.2, inne są omówione w wielu podręcznikach i innych opracowaniach (van Regenmortel, 1982; Matthews, 1991).