Autorzy

Sophia Bałdysz, Jakub Barylski, Justyna Broniarczyk, Julia Durzyńska*, Anna Goździcka-Józefiak,

Oskar Musidlak, Robert Nawrot, Elżbieta Poręba*, Alicja Warowicka, Martyna Węglewska

Autorzy są aktualnymi lub byłymi* pracownikami Zakładu Wirusologii Molekularnej Wydziału Biologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu

Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Polesnoy, Robertax/Dreamstime

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta Małgorzata Nawrot

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej

w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło.

A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2019, 2022

ISBN 978-83-01-22272-7

DOI: https://doi.org/10.53271/2022.055

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2022r. (Wydanie II)

Warszawa 2022

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Bezpłatny fragment

PRZEDMOWA DO WYDANIA DRUGIEGO

PRZEDMOWA

WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W TEKŚCIE

1. NATURA WIRUSÓW - Anna Goździcka-Józefiak

1.1. Budowa cząstki wirusowej

1.1.1. Kapsyd

1.1.2. Symetria wirionów

1.1.3. Wiriony osłonięte

1.2. Genomy wirusów

1.3. Wirusy atakujące komórki eukariotyczne

1.3.1. Genomy wirusów typu DNA

1.3.2. Genomy wirusów typu ssRNA

1.4. Strategie kodowania i ekspresji wirusowych genów

1.4.1. (+)ssRNA

1.4.2. (–)ssRNA

1.4.3. Genomy ambisensowne

1.4.4. dsRNA

1.4.5. (+)ssRNA replikowane z udziałem odwrotnej transkryptazy

1.4.6. Białka wirusów atakujących komórki eukariotyczne

1.4.7. Transkrypcja i translacja u wirusów bakteryjnych (bakteriofagów)

1.5. Klasyfikacja wirusów według Davida Baltimore’a

1.6. Etapy replikacji wirusowej cząstki

1.7. Wnikanie wirusów do komórki - Justyna Broniarczyk

1.7.1. Adsorpcja wirusów do komórki

1.7.2. Penetracja – wnikanie wirusów do komórki

1.8. Wewnątrzkomórkowy transport wirusów

1.9. Składanie i uwalnianie wirionów potomnych z komórki

1.10. Przebieg cykli replikacyjnych wirusów - Anna Goździcka-Józefiak, Jakub Barylski

1.11. Przebieg zakażeń wirusowych u organizmów wielokomórkowych - Anna Goździcka-Józefiak

1.12. Sposoby przenoszenia wirusów

2. KLASYFIKACJA WIRUSÓW - Jakub Barylski

3. CHARAKTERYSTYKA NAJWAŻNIEJSZYCH RODZIN WIRUSÓW ZWIERZĘCYCH

3.1. Herpeswirusy - Alicja Warowicka

3.2. Adenowirusy - Martyna Węglewska

3.3. Parwowirusy - Martyna Węglewska

3.4. Poliomawirusy - Alicja Warowicka

3.5. Papillomawirusy - Alicja Warowicka

3.6. Pikornawirusy - Robert Nawrot

3.7. Rabdowirusy - Robert Nawrot

3.8. Paramyksowirusy - Julia Durzyńska

3.8.1. Wirus Nipah - Anna Goździcka-Józefiak

3.9. Ortomyksowirusy - Justyna Broniarczyk

3.10. Koronawirusy - Martyna Węglewska

3.11. Reowirusy - Robert Nawrot

3.12. Retrowirusy - Elżbieta Poręba

3.13. Poxwirusy - Julia Durzyńska

3.14. Wirusy owadzie - Anna Goździcka-Józefiak

3.14.1. Bakulowirusy (Baculoviridae)

4. CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH GRUP WIRUSÓW ZGODNIE Z PODZIAŁEM KLINICZNY

4.1. Wirusy hepatotropowe - Justyna Broniarczyk

4.2. Wirusy krwotoczne - Alicja Warowicka

4.3. Wirusy neurotropowe - Anna Goździcka-Józefiak

Pismiennictwo

4.4. Teratogenne wirusy zwierzęce - Anna Goździcka-Józefiak

4.5. Wirusy onkogenne - Julia Durzyńska

4.5.1. Retrowirusy onkogenne

4.5.2. Wirusy DNA

4.5.3. Onkogenne wirusy zapalenia wątroby

5. WIRUSY ROŚLINNE - Oskar Musidlak, Robert Nawrot

5.1. Wprowadzenie

5.2. Sposoby rozprzestrzeniania się wirusów pomiędzy roślinami

5.3. Przemieszczanie się wirusów w roślinie

5.3.1. Przemieszczanie z wykorzystaniem plazmodesm – transport krótkodystansowy

5.3.2. Przemieszczanie z wykorzystaniem wiązek przewodzących – transport długodystansowy

5.4. Charakterystyka wybranych grup wirusów roślinnych

5.4.1. Genomy w formie (+)ssRNA

5.4.2. Genomy w formie (–)ssRNA

5.4.3. Genomy w formie dsRNA

5.4.4. Genomy w formie DNA

5.5. Objawy zakażeń wirusowych roślin

5.5.1. Objawy makroskopowe

5.5.2. Objawy mikroskopowe

5.6. Subwirusowe czynniki infekcyjne

5.6.1. Wiroidy

5.6.2. Wirusy satelitarne i satelitarne RNA – satelity

5.6.3. Defektywne RNA – D RNA

6. WIRUSY GIGANTY, WIRUSY GRZYBÓW I GLONÓW

6.1. Jądrowo-cytoplazmatyczne wielkie wirusy DNA (NCLDV) - Julia Durzyńska

6.2. Wirusy zakażające algi - Robert Nawrot

6.3. Wirusy zakażające grzyby

7. WIRUSY PROKARYOTA - Jakub Barylski

7.1. Replikacja fagów

7.2. Cykle replikacyjne wybranych fagów

7.3. Rola wirusów Prokaryota w naturalnych ekosystemach

7.4. Rola fagów w ewolucji mikroorganizmów

7.5. Rola fagów w gospodarce człowieka

8. ODPOWIEDŹ ORGANIZMU NA ZAKAŻENIE WIRUSOWE

8.1. Odpowiedź komórek i organizmów zwierzęcych na zakażenia wirusowe - Julia Durzyńska

8.1.1. Molekularne mechanizmy przeciwwirusowej wewnętrznej odpowiedzi komórki - Elżbieta Poręba

8.1.2. Wrodzona odpowiedź układu odpornościowego - Julia Durzyńska

8.1.3. Nabyta odpowiedź układu odpornościowego

8.1.4. Ucieczka wirusów przez odpowiedzią układu odpornościowego

8.1.5. Wirusy a apoptoza - Anna Goździcka-Józefiak

8.1.6. Wirusy a autofagia - Anna Goździcka-Józefiak

8.2. Odpowiedź komórki roślinnej na zakażenie wirusowe - Robert Nawrot

8.3. Odpowiedź komórki prokariotycznej na zakażenie wirusem - Jakub Barylski

9. POCHODZENIE I EWOLUCJA WIRUSÓW - Julia Durzyńska

10. ZOONOZY – CHOROBY ODZWIERZĘCE - Oskar Musidlak

10.1. Wprowadzenie

10.2. Przykłady zoonoz wirusowych

10.3. Zakażenia wirusowe i ich transmisja

10.3.1. Transmisja wirusów zwierzęcych

10.3.2. Miejsca wnikania wirusów do organizmu człowieka – drogi zakażenia

10.3.3. Objawy zakażeń wirusowych

11. EPIDEMIE I PANDEMIE CHORÓB WIRUSOWYCH - Martyna Węglewska

11.1. Podstawowe pojęcia związane z epidemiologią chorób wirusowych

11.2. Największe epidemie chorób wirusowych w XX i XXI w.

12. LEKI PRZECIWWIRUSOWE - Oskar Musidlak

12.1. Wprowadzenie

12.2. Rodzaje leków przeciwwirusowych

12.3. Oporność lekowa

12.4. Monitorowanie bezpieczeństwa leków przeciwwirusowych

12.5. Perspektywy badawcze i nowe technologie w projektowaniu leków przeciwwirusowych

13. SZCZEPIONKI PRZECIWWIRUSOWE - Martyna Węglewska

13.1. Wstęp

13.2. Elementy składowe szczepionek

13.3. Typy szczepionek

13.4. Kryteria stawiane szczepionkom dopuszczonym do użytku

13.5. Skuteczność szczepień

13.6. Historia szczepień

13.7. Wirusy jako broń biologiczna - Anna Goździcka-Józefiak

14. WYKORZYSTANIE WIRUSÓW W BIOTECHNOLOGII, BIOLOGII MOLEKULARNEJ I INŻYNIERII GENETYCZNEJ - Elżbieta Poręba, Jakub Barylski

14.1. Enzymy wirusowe

14.2. Wektory wirusowe i wirusowe elementy genetyczne wykorzystywane w wektorach

14.3. Wykorzystanie bakteriofagów do detekcji i identyfikacji bakterii

15. WIRUSOTERAPIA

15.1. Fagoterapia - Jakub Barylski

15.2. Wirusy onkolityczne - Julia Durzyńska

16. PRIONY - Alicja Warowicka

17. ZMIENNOŚĆ WIRUSÓW A WIROM CZŁOWIEKA - Anna Goździcka-Józefiak

18. WYBRANE METODY BADAWCZE STOSOWANE W WIRUSOLOGII

18.1. Wstęp - Anna Goździcka-Józefiak

18.2. Pobieranie materiału do badań - Martyna Węglewska

18.3. Namnażanie i izolacja wirusowych cząstek - Alicja Warowicka

18.4. Efekty cytopatyczne - Oskar Musidlak

18.5. Metoda „łysinkowa”

18.6. Analiza żywotności komórek

18.7. Określanie zjadliwości wirusów

18.8. Techniki mikroskopowe w wirusologii - Alicja Warowicka

18.9. Metody pośrednie rozpoznania zakażenia wirusowego - Anna Goździcka-Józefiak

18.10. Metody identyfikacji wirusów oparte na interakcji antygen-przeciwciało

18.10.1. Metoda precypitacji w żelu (immunodyfuzja)

18.10.2. Identyfikacja wirusowych antygenów

18.10.3. Odczyn immunoperoksydazy

18.10.4. TEST CTF – odczyn wiązania dopełniacza

18.10.5. Ocena odpowiedzi T komórkowej na zakażenie wirusowe

18.11. Wybrane techniki stosowane do identyfikacji i badań wirusowych kwasów nukleinowych - Robert Nawrot

18.11.1. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

18.11.2. PCR w czasie rzeczywistym

18.11.3. PCR multipleksowy

18.11.4. Metody hybrydyzacji kwasów nukleinowych

18.11.5. Wykorzystanie nowoczesnych metod sekwencjonowania kwasów nukleinowych w wirusologii - Jakub Barylski

18.11.6. Amplifikacja DNA w warunkach izotermicznych (technika LAMP) - Anna Goździcka-Józefiak

18.12. Wykorzystanie metod izolacji i identyfikacji białek w badaniach wirusologicznych - Martyna Węglewska

18.12.1. Jak otrzymać materiał do badań

18.12.2. Drożdżowy system dwuhybrydowy

18.12.3. Metody oparte na chromatografii powinowactwa

18.12.4. Metody mikroskopowe

18.12.5. Ligacja zbliżeniowa in situ

18.12.6. Metody screeningu wysokoprzepustowego

18.12.7. Weryfikacja zidentyfikowanych oddziaływań białko-białko oraz badanie funkcji białek w kompleksach z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej

18.12.8. EMSA

18.12.9. Badania proteomiczne w wirusologii - Robert Nawrot

18.13. Przygotowanie szczepionek przeciwwirusowych - Martyna Węglewska

18.13.1. Faza badawcza i przedkliniczna

18.13.2. Faza testów klinicznych

18.13.3. Weryfikacja i dopuszczanie do użytku nowych preparatów

18.14. Syntetyczne cząstki wirusowe - Justyna Broniarczyk

18.15. Cytometria i wirometria przepływowa - Anna Goździcka-Józefiak

18.16. Dezynfekcja i sterylizacja

19. ANEKS: TAKSONOMIA WIRUSÓW I SUBWIRUSOWYCH CZYNNIKÓW ZAKAŹNYCH - Sophia Bałdysz, Jakub Barylski

1. Dziedzina Monodnaviria

1.1. Królestwo Loebvirae

1.2. Królestwo Sangervirae

1.3. Królestwo Shotokuvirae

1.4. Królestwo Trapavirae

2. Dziedzina Duplodnaviria

2.1. Królestwo Heunggongvirae

3. Dziedzina Varidnaviria

3.1. Królestwo Bamfordvirae

3.2. Królestwo Helvetiavirae

4. Dziedzina Adnaviria

4.1. Królestwo Zilligvirae

5. Dziedzina Riboviria

5.1. Królestwo Orthornavirae

5.2. Królestwo Pararnavirae

6. Rodziny niesklasyfikowane

7. Satelitarne RNA – dziedzina Ribozyviria

8. Satelitarne DNA

9. Wiroidy

SŁOWNICZEK

PRZYPISY

Przedmowa do wydania drugiego

Wirusologia jest jedną z dziedzin biologii, bardzo intensywnie rozwijającą się w ostatnich dziesięcioleciach.

Szczególny postęp w tej dziedzinie stał się możliwy w związku z rozwojem technik biologii molekularnej, pozwalających na szybką detekcję nowych wirusów, jak również ich charakterystyki, z wykorzystaniem technik mikroskopowych, hodowli komórkowych, metod sekwencjonowania kwasów nukleinowych, badań proteomicznych i metod immunologicznych. Skłania to do wprowadzania do podręczników nowych, aktualnych danych. Z tego względu wydanie drugie Wirusologii zostało uzupełnione o nowy rozdział, w którym opisano wybrane najnowsze metody stosowane w wirusologii do detekcji wirusów, ich charakterystyki oraz badania oddziaływania wirusów z czynnikami komórkowymi.

Ponadto, podręcznik ten został także uzupełniony o podrozdziały, w których przedstawiamy nowe dane odnośnie do badań epidemiologicznych, sposobów pozyskiwania szczepionek przeciwwirusowych nowych generacji oraz otrzymywania i wykorzystania syntetycznych wirusowych cząstek w badaniach wirusologicznych. Dodano także nowe podrozdziały dotyczące roli autofagi w cyklu życiowym wirusów, sposobów transmisji wirusów, dane na temat możliwości wykorzystania wirusów jako broni biologicznej oraz najnowszą klasyfikację wirusów.

Przygotowując wydanie drugie Wirusologii, jesteśmy świadomi pewnych niedoskonałości podczas selekcji danych. Mamy jednak nadzieję, że książka ta będzie pomocna w poznaniu podstaw wirusologii oraz metod stosowanych w badaniach wirusologicznych.

Wydanie drugie Wirusologii stało się możliwe dzięki Pani redaktor Katarzynie Włodarczyk-Gil, Pani redaktor Małgorzacie Nawrot oraz Pani redaktor Renacie Ziółkowskiej, które udzieliły nam niezbędnej pomocy podczas prac redakcyjnych i technicznych, za co wyrażamy serdeczne podziękowanie. Szczególne wyrazy wdzięczności składamy także osobom odpowiedzialnym za szatę graficzną podręcznika.

Autorzy

Poznań, maj 2022 r.

Przedmowa

Choroby wirusowe ludzi, zwierząt i roślin stanowiły od dawna przedmiot zainteresowania licznych badaczy, jakkolwiek naturę czynników je wywołujących poznano stosunkowo niedawno. Stało się to dzięki wykrystalizowaniu cząstek wirusa mozaiki tytoniu w 1935 roku przez Wendella Stanleya, a następnie wprowadzeniu mikroskopii elektronowej i hodowli komórkowych do badań wirusologicznych. Wtedy to Salvador Luria i Max Delbrück – uznawani za twórców współczesnej wirusologii molekularnej – stwierdzili, że wirusy zbudowane są z co najmniej dwóch elementów: kwasu nukleinowego i białka, a wirusowy materiał genetyczny można uznać za zespół genów.

Od tego momentu nastąpił intensywny rozwój badań mających na celu poznanie właściwości wirusów. Zainteresowania nimi dotyczyły nie tylko natury tych czynników, ale także mechanizmów ich współdziałania z czynnikami komórkowymi. Wirusologia od tego czasu jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin biologii, z ogromną literaturą przedmiotu, za którą nawet specjalistom trudno na bieżąco podążać. Dzięki badaniom wirusologicznym możliwy stał się także rozwój biologii molekularnej i biotechnologii oraz lepiej poznano przyczyny zmian patologicznych zachodzących w komórce.

Szereg odkryć dokonanych w wirusologii nagrodzono Nagrodą Nobla.

W podręczniku tym przedstawiamy Czytelnikom naturę wirusów, strategie ich namnażania się w komórce, ich chorobotwórczość oraz zapobieganie, jak również leczenie zakażeń wirusowych. Opierając się na najnowszych odkryciach wirusologicznych, w niniejszej publikacji omawiane są również teorie dotyczące pochodzenia wirusów i możliwości ich wykorzystania w różnych rodzajach terapii klinicznej, biologii molekularnej i biotechnologii. Mamy nadzieję, że ta publikacja zainteresuje szerokie grono Czytelników i będzie pomocna nie tylko w poznaniu podstaw wirusologii, ale jednocześnie wzbudzi w nich ciekawość odnośnie tej dziedziny wiedzy.

Książka ta nie wyczerpuje wszystkich zagadnień z zakresu wirusologii. Przedstawiliśmy w niej treści, które uważamy za najciekawsze i ważne.

Zespół autorów pragnie bardzo serdeczne podziękować pani red. Katarzynie Włodarczyk-Gil, pani red. Małgorzacie Nawrot oraz pani red. Renacie Ziółkowskiej za wzbudzenie zapału twórczego do pisania tej książki, jak również pomoc podczas prac redakcyjnych i technicznych.

Autorzy

Poznań, styczeń 2019 r.

WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W TEKŚCIE

ABA (ang. abscisic acid) – kwas abscysynowy

ACE2 (ang. angiotensin-converting enzyme 2) – konwertaza 2 angiotensyny

ADAR (ang. adenosine deaminases acting on RNA) – deaminazy adenozyny modyfikujące RNA

AFM (ang. atomic force microscopy) – mikroskopia sił atomowych

AIDS (ang. acquired immunodeficiency syndrome) – zespół nabytego niedoboru odporności

APC (ang. antigen presenting cell) – komórka prezentująca antygen

APOBEC3G (ang. apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G) – enzym redagujący mRNA apolipoproteiny B

ASO (ang. antisense oligonucleotides) – antysensowne oligonukleotydy

ATP (ang. adenosine triphosphate) – adenozyno-5′-trifosforan

attB (ang. attachment site – bacterial) – miejsce rekombinacji w genomie bakterii wykorzystywane podczas integracji genomu fagowego

attP (ang. attachment site – phage) – miejsce rekombinacji w genomie faga wykorzystywane podczas jego integracji do genomu gospodarza

AZT azydotymidyna

Bax (ang. Bcl-associated protein X) – białko regulujące apoptozę związane z Bcl2

Bcl2 (ang. B-cell lymphoma 2) – białko regulujące śmierć komórki/apoptozę

BCR (ang. B-cell receptor) – receptory komórek B

BER (ang. base excision repair) – naprawa DNA przez wycięcie zasady

BiFC (ang. bimolecular fluorescence complementation) – dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji

BSL (ang. biosafety level) – poziom bezpieczeństwa biologicznego

Car (ang. Coxackievirus and adenovirus receptor) – receptor dla wirusa Coxsackie i adenowirusa

Cas (ang. CRISPR-associated proteins/genes) – geny lub białka związane z elementami CRISPR

CCR5 (ang. C-C chemokine receptor type 5) – receptor C-C chemokin typu 5

CD (ang. cluster of differentiation) – antygen różnicowania komórkowego, kompleks różnicowania

CD4 (ang. cluster of differentation) – antygen różnicowania komórkowego występujący na powierzchni limfocytów T pomocniczych, monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych

CDC (ang. Centers for Disease Control and Prevention) – Centra Kontroli i Prewencji Chorób

CIN (1–3) (ang. cervical intraepithelial neoplasia) – śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy

CoIP (ang. Coimmunoprecypitation) – koimmunoprecypitacja

CP (ang. capsid protein) – białko kapsydu

CPE (ang. cytopathic effect) – efekt cytopatyczny

CREB (ang. cAMP response element-binding protein) – czynnik transkrypcyjny, białko wiążące się z sekwencją CRE, pośredniczącą w działaniu cAMP

CRISPR (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – skupione, regularnie oddzielone krótkie powtórzenia palindromowe

CTL (ang. cytotoxic T lymphocytes) – cytotoksyczne limfocyty T

CXCR4 (ang. C-X-C chemokine receptor type 4) – receptor chemokiny C-X-C typu 4

DC-SIGN (ang. dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin) – nieintegryna swoista dla komórek dendrytycznych wychwytująca ICAM3 (czasteczkę adhezji międzykomórkowej 3)

DDR (ang. discoidin domain receptor) – receptor dla domeny diskoidyny, receptor z grupy kinaz tyrozynowych

2-DE (ang. two-dimensional electrophoresis) – elektroforeza dwukierunkowa

D RNA (ang. defective RNA) – defektywny RNA

DI RNA (ang. defective interfering RNA) – defektywny interferujący RNA

dsDNA (ang. double stranded DNA) – dwuniciowy DNA

ECDC (ang. European Centre for Disease Prevention and Control) – Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób

EBNA (ang. Epstein-Barr nuclear antigen) – jądrowy antygen wirusa Epsteina-Barr

ED_50 (ang. effective dose) – dawka wywołująca określony skutek w połowie badanej populacji

EEV (ang. extracellular enveloped virion) – zewnątrzkomórkowa forma wirionu z otoczką

EGF (ang. epidermal growth factor) – epidermalny czynnik wzrostu

EGFP (ang. enhanced green fluorescent protein) – białko zielonej fluorescencji

EGFR (ang. epidermal growth factor receptor) – receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu

EHEC (ang. enterohemorrhagic Escherichia coli) – enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli

eIF (ang. eukaryotic initiation factor) – eukariotyczny czynnik inicjacyjny

Env (ang. envelope) – prekursor glikoprotein otoczki retrowirusów

EMA (ang. European Medicines Agency) – Europejska Agencja Leków

EMSA (ang. electrophoretic mobility shift assay) – technika opóźnienia migracji fragmentów DNA w żelu poliakrylamidowym

Erk (ang. extracellular signal-regulating kinases) – kinazy regulujące sygnały pozakomórkowe

ERV (ang. endogenous retroviruses) – endogenne elementy retrowirusowe

ESI (ang. electrospray ionisation) – jonizacja przez elektrorozpylanie

ET etylen

ETI (ang. effector-triggered immunity) – odporność indukowana przez efektory

ETS (ang. effector-triggered susceptibility) – wrażliwość związana z efektorami

FDA (ang. Food and Drug Administration) – Agencja Żywności i Leków

FMD (ang. Foot and mouth disease) – pryszczyca

GAG (ang. glycosaminoglycans) – glikozaminoglikany

Gag (ang. group-specific antigen) – antygen grupowy

GAS (ang. gamma interferon activation site) – miejsce aktywowane przez IFNγ

gp glikoproteina

GTP guanozyno-5′-trifosforan

H (ang. hemaglutinin) – hemaglutynina

HAART (ang. highly active antiretroviral therapy) – wysoce aktywna terapia przeciwretrowirusowa

HAM/TSP (ang. HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis) – mielopatia/tropikalna parapareza spastyczna związana z HTLV-I

HCC (ang. hepatocellular carcinoma) – rak wątrobowokomórkowy

HDAC (ang. histone deacetylase) – deacetylaza białek histonowych

HERV (ang. human endogenous retrovirus) – endogenne retrowirusy obecne w ludzkim genomie

HGT (ang. horizontal gene transfer) – horyzontalny transfer genów

HLA (ang. human leukocyte antygen) – ludzkie antygeny leukocytów, grupa genów kodujących układ zgodności tkankowej

HN (ang. hemaglutinin-neuraminidase) – hemaglutynina-neuraminidaza

HR (ang. hypersensitive response) – reakcja nadwrażliwości

HRTEM (ang. high-resolution transmission electron microscopy) – wysokorozdzielcza mikroskopia elektronowa

HSIL (ang. high-grade squamous intraepithelial lesion) – śródnabłonkowe zmiany dysplastyczne dużego stopnia – odpowiednik CIN II i CIN III

HVEM (ang. herpes virus entry mediator) – receptor uczestniczący we wnikaniu herpeswirusów

IC_50 (ang. 50 percent inhibitory concentration) – stężenie hamujące w 50% namnażanie wirusa

ICTV (ang. International Committee on Taxonomy of Viruses) – Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów

ID_50 (ang. infectivity dose 50) – dawka zakaźna dla 50%

IEM (ang. immune EM) – technika immunoelektronomikroskopowa

IFN (ang. interferon) – interferon

IFNAR (ang. interferon-α receptor) – receptor dla IFNα

IFNGR (ang. interferon-γ receptor) – receptor dla IFNγ

IgG (ang. immounoglobulin G) przeciwciała, immunoglobuliny typu G

IL (ang. interleukin) – interleukina

IMV (ang. intracellular mature virion) – wewnątrzkomórkowa dojrzała forma wirionu

IP (ang. Immunoprecypitation) – immunoprecypitacja

IRES (ang. internal ribosome entry site) – wewnętrzne miejsce wejścia do rybosomu

IRF-9 (ang. interferon regulatory factor 9) – czynnik 9 regulujący IFN

ISR (ang. induced systemic resistance) – indukowana odporność nabyta

ISRE (ang. interferon-stimulated response element) – element odpowiedzi stymulowany przez IFN

IT (ang. therapeutic index) – indeks terapeutyczny

ITR (ang. inverted terminal repeat) – odwrócone powtórzenie końcowe

JA (ang. jasmonic acid) – kwas jasmonowy

JAK (ang. Janus-activated kinases) – kinazy janusowe

JAM (ang. junctional adhesion molecule) – białka adhezji komórkowej

kDa kilodalton

krioTEM (ang. electron cryomicroscopy) – mikroskopia krioelektronowa

KS (ang. Kaposi’s sarcoma) – mięsak Kaposiego

LANA (ang. latency-associated nuclear antigen) – jądrowy antygen warunkujący latencję

LC (ang. liquid chromatography) – chromatografia cieczowa

LD_50 (ang. lethal dose 50) – dawka śmiertelna dla połowy badanej populacji

LRR-RLK (ang. leucine-rich repeat receptor-like kinase) – bogata w leucynę kinaza podobna do receptora

L-SIGN (ang. liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing integrin) – lektyna typu C, homolog DC-SIGN

LSIL (ang. low-grade squamous intraepithelial lesion) – śródnabłonkowe zmiany dysplastyczne małego stopnia – odpowiednik CIN I

LTR (ang. long terminal repeats) – długie zakończenia na końcu cząsteczki w niektórych genomach wirusowych

LUCA (ang. last universal common ancestor) – ostatni uniwersalny wspólny przodek

MALDI (ang. matrix-assisted laser desorption/ionisation) – desporpcja laserowa z udziałem matrycy

MGE (ang. mobile genetic elements) – mobilne elementy genetyczne

MHC (ang. major histocompatibility complex) – białka głównego układu zgodności tkankowej

miRNA mikro RNA

MP (ang. movement protein) – białko transportowe

mRNA (ang. messenger RNA) – informacyjny, matrycowy RNA

MS (ang. mass spectrometry) – spektrometria mas

MS/MS tandemowa spektrometria mas

mTOR (ang. mammalian target of rapamycin) – ssaczy cel rapamycyny

Myc (ang. myelocytomatosis) – onkogen odpowiedzialny za rozwój mielocytomatozy

N (ang. neuraminidase) – neuraminidaza

NCAM (ang. neural cell adhesion molecules) – neuronalne cząsteczki adhezyjne

ND10 (ang. nuclear domain 10 bodies) – domeny jądrowe 10, synonim dla ciałek PML

NEC (ang. necrotizing enterocolitis) – martwicze zapalenie jelit

Nef (ang. negative factor) – białko retrowirusowe zasocjowane z błoną, pełniące wiele funkcji w cyklu replikacyjnym wirusa

NER (ang. nucleotide excision repair) – naprawa DNA przez wycięcie nukleotydu

NK (ang. natural killer) – naturalni zabójcy

NKT (ang. natural killer lymphocyte T) – limfocyt T naturalny zabójca

NP (ang. nucleoprotein) – nukleoproteina

NTCP (ang. N-glycosylation of the Na+Taurocholate Cotransporting Polypeptide) – kotransporter Na+/kwasy żółciowe

OiE (ang. World Organistion for Animal Health) – Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt

ORF (ang. open reading frame) – otwarta ramka odczytu

PAM (ang. protospacer adjacent motif) – motyw przylegający (oskrzydlający) do „protospacer”

PAMP (ang. pathogen-associated molecular pattern) – wzorzec molekularny związany z patogenami

PARP (ang. poly(ADP-ribose) polymerase) – polimeraza poli(ADP-rybozy)

PCD (ang. programmed cell death) – programowana śmierć komórki

PCR (ang. polymerase chain reaction) – reakcja łańcuchowa polimerazy

PDZ domena wspólna występująca u białek takich jak: PSD-95, Discs Large i Zona Occludens 1

PEG glikol polietylenowy

Pfu (ang. plaque forming unit) – jednostka tworząca łysinkę

PILR-α (ang. paired immunoglobulin like receptor α) – receptor dla wirusa HSV

PML (ang. promyelocytic leukemia protein) – białko białaczki promielocytowej

PR (ang. pathogenesis-related proteins) – białka związane z patogenezą

PRR (ang. pattern recognition receptor) – receptor rozpoznawania wzorców

PTGS (ang. post-transcriptional gene silencing) – potranskrypcyjne wyciszanie genów

PTI (ang. PAMP-triggered immunity) – odporność wyzwalana przez PAMPs

Ras (ang. rat sarcoma) – onkogen odpowiedzialny za rozwój mięsaka u szczura

RdRp (ang. RNA-dependent RNA polymerase) – polimeraza RNA zależna od RNA

Rev (ang. regulator of expression of virion proteins) – regulator syntezy białek wirionu

RI (ang. replicative intermediate) – forma pośrednicząca w replikacji, zbudowana z dwóch nici (+) oraz (–)ssRNA

RmVR (ang. RNA-mediated virus resistance) – odporność na wirusa zależna od RNA

RNAi (ang. RNA interference) – zjawisko interferencji RNA

RNP (ang. ribonucleoprotein) – kompleks rybonukleoproteinowy

ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu

SA (ang. salicylic acid) – kwas salicylowy

SAR (ang. systemic acquired resistance) – nabyta odporność systemiczna

SAS (ang. systemic acquired silencing) – wyciszanie systemiczne

SEM (ang. scanning electron microscopy) – skaningowa mikroskopia elektronowa

sgRNA (ang. subgenomic RNA) – subgenomowy RNA

SI (ang. selectivity index) – współczynnik selektywności

SIDS (ang. sudden infant death syndrome) – zespół nagłej śmierci dziecka

siRNA (ang. small interfering RNA) – małe interferujące RNA

SR-B1 (ang. scavenger receptor class B type I) – receptor zmiatający klasy B typu I

ssDNA (ang. single stranded DNA) – jednoniciowy DNA

ssRNA (ang. single stranded RNA) – jednoniciowy RNA

SSV1 (ang. Sulfolobus spindle-shaped virus-1) – wrzecionowaty wirus nr 1 Sulfolobus

STAT (ang. signal transducer and activator of transcription) – przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji

TAP (ang. tandem affinity purification) – tandemowa chromatografia powinowactwa

Tat (ang. trans-activator of transcription) – transaktywator transkrypcji obecny u wirusa HIV-1

TCID_50 (ang. tissue culture infectious dose) – dawka zakaźna dla 50% hodowli tkankowych

TCR (ang. T-cell receptor) – receptor komórek T

TEM (ang. transmission electron microscopy) – transmisyjna mikroskopia elektronowa

TERT (ang. telomerase reverse transcriptase) – odwrotna transkryptaza telomerazy

TGF (ang. transforming growth factor) – transformujący czynnik wzrostu

TLR (ang. toll-like receptors) – receptory typu Toll

TNF (ang. tumor necrosis factor) – czynnik martwicy nowotworów

TOF (ang. time-of-flight) – analizator czasu przelotu

tpz tysiąc par zasad

TRUC (ang. things resisting uncompleted classification) – twory wymykające się niepełnej klasyfikacji

TYK2 (ang. non-receptor tyrosine-protein kinase) – kinaza tyrozynowa 2

UTR (ang. untranslated region) – rejon nie podlegający translacji

VETF (ang. viral early transcription factor) – wczesny wirusowy czynnik transkrypcyjny

VIGS (ang. virus-induced gene silencing) – wyciszanie genów indukowane przez wirusa

VITF (ang. viral intermediate transcription factor) – pośredni wirusowy czynnik transkrypcyjny

VLTF (ang. viral late transcription factor) – późny wirusowy czynnik transkrypcyjny

VF (ang. viral factory) – fabryka wirusowa

VPg (ang. virus protein, genome linked) – białko VPg

Vpr (ang. viral protein R) – wirusowe białko R

Vpu (ang. virus protein U) – retrowirusowe białko U

VTM (ang. viral transport medium) – medium transportowe

WHO (ang. World Health Organization) – Światowa Organizacja Zdrowia

Y2H (ang. yeast two-hybrid) – drożdżowy system dwuhybrydowy

1

Natura wirusów

Anna Goździcka-Józefiak

Wirusy są to niewielkie cząstki zakaźne, infekujące wszystkie komórkowe formy życia. Twory te są niezdolne do namnażania się poza komórką. Cząstkę wirusa nazywamy wirionem. Salvador Luria wirusy określa jako „twory, których genom jest zbudowany z jednego rodzaju kwasu nukleinowego, odtwarzającego się w żywych komórkach, z wykorzystaniem komórkowego aparatu metabolicznego. W wyniku powielania wirusów, w komórce powstają wyspecjalizowane cząstki, zwane wirionami”. Podobną definicję przedstawił Andre Lwoff, który uważa wirusa za „czynnik potencjalnie chorobotwórczy, zdolny do wytworzenia formy zakaźnej wyłącznie we wnętrzu zakażonej komórki. Wirus zawiera jeden rodzaj kwasu nukleinowego (RNA lub DNA), replikuje się w postaci swoistego materiału genetycznego, wykazuje ciągłość genetyczną i jest niezdolny do bezpośredniego podziału oraz wzrostu, ponieważ nie ma układu enzymatycznego dostarczającego energii”.

Najprostsze wirusy zbudowane są z kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), który jest wirusowym genomem, oraz otaczającego go płaszcza białkowego, zwanego kapsydem (rys. 1.1).

Rys. 1.1. Struktura wirusowych cząstek. A – wirusa mozaiki tytoniu. B – wirusa herpes. C – wirusa HIV

[Na podstawie: A – Goździcka-Józefiak A., Wirusologia molekularna. Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań 2004. B – Amen M.A., Griffiths A., Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics 2, 81, 2011. https//doi.org/:10.3389/fgene.2011.00081; C – zmodyfikowany wg https://www.projectinform.org/glossary/hiv-structure-function/]

W wirionach niektórych wirusów występują dodatkowe białka, np. takie enzymy jak: proteaza, odwrotna transkryptaza, replikaza, czynniki transkrypcyjne, białka interferujące z odpowiedzią odpornościową gospodarza oraz startery do replikacji wirusowych kwasów nukleinowych. Do wirionów mogą być włączane także: tRNA (obecne w wirionach retrowirusów), poliaminy, kationy Na+, K+, Zn2+, Mg2+. Wiriony nie są komórkami i nie mają organelli komórkowych. Wyjątek stanowią arenawirusy zawierające komórkowe rybosomy, które zostały spakowane do wirionu podczas składania wirusowej cząstki. Wirusy nie są zaliczane do organizmów, lecz do wewnątrzkomórkowych pasożytów, które mogą powielić swoje cząstki wyłącznie w komórce odpowiedniego gospodarza, korzystając z komórkowych aminokwasów i nukleotydów, rybosomów oraz energii. Zdaniem Patricka Forterre „wirus jest żywym tworem tylko podczas jego wewnątrzkomórkowego cyklu życiowego”. W wirusowym genomie zapisana jest informacja, niezbędna do wytworzenia cząstek potomnych w komórce gospodarza. Gospodarzem dla wirusa mogą być komórki prokariotyczne (bakterii i archeonów) lub komórki eukariotyczne (ludzkie, roślinne, zwierzęce oraz grzybów). Potomne cząstki wirusów powstają w kilkuetapowym procesie, który obejmuje syntezę składników wirusowej cząstki, a następnie ich składanie do dojrzałych cząstek potomnych.

1.1. BUDOWA CZĄSTKI WIRUSOWEJ

1.1.1. Kapsyd

Wirusowy genom jest stabilizowany i chroniony przed działaniem niekorzystnych czynników przez otaczający go płaszcz białkowy – kapsyd. Białka kapsydu biorą udział w rozpoznaniu komórki gospodarza oraz penetracji wirusa lub jego genomu do komórki. Z tego względu muszą one być wystarczająco stabilne w środowisku, ale równocześnie elastyczne i zdolne do zmian konformacyjnych. Kompleks wirusowego kwasu nukleinowego wraz z zasocjowanymi z nimi białkami nosi nazwę nukleokapsydu. Kapsyd jest zbudowany z identycznych podjednostek białkowych, zwanych kapsomerami (rys. 1.2). U niektórych wirusów o mniejszych genomach kapsomery potrafią samodzielnie składać się do kapsydów. Proces składania białka kapsydu wokół wirusowego genomu nosi nazwę enkapsydacji. U większości wirusów jest on bardziej złożony i biorą w nim udział inne dodatkowe białka tworzące swoiste rusztowanie, które jest usuwane na ostatnim etapie formowania wirusowej cząstki. Kapsomery mogą być zbudowane z jednego lub kilku rodzajów podjednostek białkowych (rys. 1.2).

Rys. 1.2. Podjednostki białkowe kapsydów. A – wirion o symetrii ikozaedralnej zawierający kapsyd zbudowany z identycznych podjednostek białkowych. B – wirion o symetrii ikozaedralnej zawierającej kapsyd zbudowany z dwóch rodzajów podjednostek białkowych, 1–5 podjednostek tworzy pentamer. C – wirion o symetrii ikozaedralnej zawierający w kapsomerach 4 rodzaje podjednostek białkowych (1–4). D – wirion o symetrii helikalnej zawierający kapsyd zbudowany z identycznych podjednostek białkowych

[Na podstawie: Albert F.G., Fox J.M., Young M.J., Virion Swelling Is Not Required for Cotranslational Disassembly of Cowpea Chlorotic Mottle Virus In Vitro. Journal of Virology 71, 6:4296–4299, 1997]

1.1.2. Symetria wirionów

W kapsydach białkowe podjednostki ułożone są w symetrii helikalnej lub kubicznej – ikozaedralnej (rys. 1.3). Budowa kapsydu o symetrii helikalnej prowadzi do powstania wirusów o kształcie pałeczkowatym, wydłużonym, a w przypadku składania kapsydów o symetrii ikozaedralnej – do tworzenia wirusów o kształcie kulistym. Najprostsze wirusy o symetrii ikozaedralnej mają kapsydy zbudowane z 60 identycznych podjednostek. Trzy podjednostki budują pojedynczy kapsomer w kształcie trójkąta równobocznego. Bardziej złożone wiriony mają większą liczbę podjednostek białkowych, która stanowi wielokrotność liczby 60, oraz składają się z więcej niż jednego typu podjednostek białkowych. Na przykład, kapsyd wirusa mozaiki groszku składa się z dwóch różnych białek. Jedno białko tworzy zgrupowane pentametry, zlokalizowane na wierzchołkach ikozaedronu, drugie – heksamery wypełniające jego powierzchnię (rys. 1.2C). W celu wyjaśnienia struktury tak skomplikowanych wielościanów, Klug i Caspar opracowali (1962 r.) teorię ekwiwalencji, zgodnie z którą cząsteczki kapsydu o podobnej konformacji tworzą podobne wiązania z cząsteczkami sąsiednimi. Pozwala to na budowanie bardziej skomplikowanej struktury wielościanu. Każdą z krawędzi podstawowego trójkąta wielościanu można w tym przypadku podzielić na krótsze odcinki o równej długości i w ten sposób zbudować bardziej skomplikowaną strukturę, którą opisuje liczba triangulacyjna T. Obliczamy ją według wzoru:

T= f^2xP,

gdzie: f oznacza liczbę równych odcinków dzielących poszczególne krawędzie, a P=h^2+hk+k^2, gdzie h i k są liczbami koordynacyjnymi. W związku z tym możliwy jest następujący ciąg liczb T: 1, 3 ,4, 9, 13, itd.

Rys. 1.3. Symetrie wirionów. A – wirion o symetrii helikalnej. B – wirion o symetrii ikozaedralnej z zaznaczonymi osiami symetrii: dwu-, trzy- i pięciokrotnej. C – wirion „bliźniaczy” geminiwirusów. D – wirion złożony bakteriofaga z grupy T

[Na podstawie: Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998]

Znane są struktury wielościenne wirionów o następujących liczbach: T=1, 3, 4, 7, 13, 16, 25, 189–217. Całkowitą liczbę podjednostek o strukturze wielościanu można obliczyć, mnożąc liczbę T przez 60, czyli dla T=3, liczba podjednostek wynosi 180.

U niektórych wirusów z wierzchołków ikozaedronu wystają dodatkowe włókienka białkowe, które biorą udział w rozpoznawaniu i przyłączeniu się wirionu do komórki gospodarza. W kapsydach o wirionach ikozaedralnych można przeprowadzić 2, 3, lub 5 osi symetrii (rys. 1.3). Wielkość średnicy ikozaedralnego kapsydu waha się od 17 nm (np. wirus satelitarny mozaiki tytoniu) do 400 nm (u mimiwirusa). Niektóre wirusowe kapsydy nie mają idealnego kształtu kolistego – są wydłużone, zaś u geminiwirusów – formowane z dwóch połączonych ikozaedralnych kapsydów (rys. 1.3). Cząstki niektórych fagów buduje ikozaedralna główka i połączony z nią przez konektor helikalny ogonek o różnej długości, a ponadto w wirionie występują dodatkowe włókienka, płytka podstawna, kołnierzyk (rys. 1.3).

1.1.3. Wiriony osłonięte

Wirusowe cząstki mogą być okryte lipidowymi osłonkami (zwane także otoczkami) pochodzącymi z komórki gospodarza i zawierają zasocjowane z nimi białka wirusowe (rys. 1.4).

Takie wiriony spotyka się najczęściej u wirusów atakujących komórki zwierzęce. Rzadziej występują one u wirusów roślinnych i bardzo rzadko u wirusów, dla których gospodarzem są komórki prokariotyczne. Białka wirusowe, będące ich składnikami, często są glikozylowane, przezbłonowe oraz zawierają rejony hydrofilowe zwykle w miejscach, gdzie dołączone są cukrowce oraz rejony hydrofobowe, które mogą brać udział w fuzji błon podczas zakażenia komórki. Poza tym, białka te mogą występować w formie monomerów lub polimerów (hemaglutynina w osłonce wirusa grypy jest trimerem, a neuraminidaza tetramerem). Wirusowe osłonki zawierają także na powierzchni białka, które zazwyczaj mają silne właściwości immunogenne (antygenowe). Składnikami wirusowych osłonek lipidowych są: sfingomieliny, fosfatydylocholiny, fosfatydyloinozytol, cholesterol. Skład lipidów osłonki wirusów może różnić się u wirusów, które replikują się w komórkach różnych typów. Przestrzeń pomiędzy osłonką a nukleokapsydem u licznych wirusów jest wypełniona białkami, zwanymi białkami macierzy. Znane są także wirusy, które osłonki białkowo-lipidowe mają wewnątrz wirionu, a nie na jego powierzchni (rys. 1.4). Niektóre wirusy owadzie (np. bakulowirusy) otaczają wiriony dodatkowo białkiem okludowanym (poliedryną lub granuliną), które chroni wiriony przed działaniem niekorzystnych czynników środowiskowych (rys. 1.5).

Wielkość wirusowej cząstki jest bardzo zróżnicowana i waha się od ok. 20 nm (cząstka parwowirusa) do 1,5 µm (pithowirus) (rys. 1.6).

Rys. 1.4. Wiriony okryte lipidowo-białkowymi osłonkami. A – wirion grypy osłonięty lipidowo-białkową osłonką. B – wirion irydowirusa

[Na podstawie: A – https://www.crick.ac.uk/research/worldwide-influenza-centre/. B – Darcy-Tripier F., Nermut M.V., Braunwald J., Williams L., The organization of frog virus 3 as revealed by freeze-etching. Virology 138(2):287–299, 1984]

Rys. 1.5. Wiriony bakulowirusów. A – wirion wirusa jądrowej poliedrozy. B – wirus granulozy

[Źródło: rysunek autorski]

Rys. 1.6. Wielkość wirusowej cząstki w porównaniu z komórką prokariotyczną i eukariotyczną

[Na podstawie: https://www.quantamagazine.org/tag/viruses/Hints of Life’s Start Found in a Giant Virus by Arnold C.]

1.2. GENOMY WIRUSÓW

Genomy wirusów zbudowane są z jednego rodzaju kwasu nukleinowego, którym może być: dwuniciowy DNA (dsDNA), jednoniciowy DNA (ssDNA) (rys. 1.7) oraz dwuniciowy RNA (dsRNA) i jednoniciowy RNA (ssRNA) o polarności dodatniej (+)ssRNA lub ujemnej (–)ssRNA (rys. 1.8).

Rys. 1.7. Wirusowe genomy typu DNA. 1 – jednoniciowy DNA w formie liniowej, 2 – jednoniciowy DNA w formie cyrkularnej, 3 – dwuniciowy DNA(L) w formie liniowej, 4 – dwuniciowy DNA z brakującymi nukleotydami, 5 – dwuniciowy DNA z końcami cyrkularnie zamkniętymi, 6 – dwuniciowy DNA cyrkularny, otwarty (OC) i skręcony (SCC)

[Na podstawie: Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998]

Rys. 1.8. Wirusowe genomy typu RNA. 1 – liniowy RNA jednoniciowy o polarności dodatniej, 2 – liniowy RNA jednoniciowy o polarności ujemnej, 3 – liniowy RNA jednoniciowy, podzielony o polarności dodatniej, 4 – liniowy RNA, podzielony o polarności ujemnej, 5 – dwuniciowy RNA podzielony, 6 – genom retrowirusów, jednoniciowy RNA

[Na podstawie: Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998]

Geny w genomie wirusów są bardzo ściśle upakowane, a sekwencje niektórych z nich mogą się pokrywać. Organizacja genów w genomach wirusów oraz elementów odpowiedzialnych za regulację ich transkrypcji jest podobna jak w genomach komórki gospodarza, a wirusowe transkrypty mają strukturę podobną do transkryptów w komórce gospodarza. Zróżnicowana jest także pojemność genomów wirusów (np. od czterech genów do przeszło tysiąca). W genomie wirusów geny można podzielić na dwie grupy: geny wczesne E (ang. early) i geny późne L (ang. late). Niekiedy są one dzielone dodatkowo, np. na bardzo wczesne, średnio- czy późnowczesne, co wskazuje na kolejność ich ekspresji. Produktami genów E są białka enzymatyczne i regulatorowe syntetyzowane na wczesnych etapach infekcji, natomiast genów L – białka strukturalne wirusa.

Generalnie, wirusy zawierające genom w formie DNA powielają swój materiał wprost do DNA, natomiast wirusy typu RNA – do RNA. Inicjacja replikacji licznych wirusów typu ssRNA rozpoczyna się w miejscu, w którym pierwszy nukleotyd nowej nici RNA może połączyć się z nukleotydem na nici wirusowego RNA. Do inicjacji replikacji niektórych wirusów typu DNA, jak też RNA, wymagany jest swoisty starter. Stanowi go krótki fragment RNA o sekwencji komplementarnej do powielanej nici genomowej. Niektóre wirusy do syntezy starterów wykorzystują primazy komórkowe (np. poliomawirusy), natomiast inne – proces ten prowadzą z udziałem primazy wirusowej (wirus herpes). Starterami dla retrowirusów są transferowe RNA. Znane są także wirusy wykorzystujące jako startery grupy OH seryny lub tyrozyny w białku związanym z nicią DNA (np. adenowirusy) lub RNA (wirusy pikorna, luteowirusy). Replikacja DNA jest generalnie bardzo poprawna; błędnie wbudowane nukleotydy są usuwane dzięki mechanizmowi naprawczemu (ang. proofreading) i wstawiane prawidłowe. Mechanizm ten nie zachodzi podczas syntezy RNA, co prowadzi do powstania licznych mutacji.

Sposób odczytu informacji genetycznej u wirusów przeczy powszechnie przyjętemu w biologii dogmatowi, że DNA ulega replikacji do DNA i transkrypcji do RNA. U wirusów typu RNA materiał genetyczny może ulegać powieleniu do RNA lub DNA, odpowiednio z udziałem wirusowych enzymów RNA replikazy zależnej od RNA i odwrotnej transkryptazy (rys. 1.9).

Rys. 1.9. Schemat replikacji wirusowego (+)ssRNA retrowirusów

[Źródło: rysunek autorski]

1.3. WIRUSY ATAKUJĄCE KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE

1.3.1. Genomy wirusów typu DNA

Genomy wirusów typu DNA występują w formie liniowej lub cyrkularnej, powstałej w wyniki tworzenia wiązań pomiędzy komplementarnymi zasadami zlokalizowanymi na końcach nici. Niekiedy do końca 5’ jest przyłączone białko (np. u adenowirusów). W niektórych genomach wirusów występują sekwencje powtórzone wprost lub odwrotnie, zlokalizowane na końcach nici, jak również w elementach wirusowych (promotorach, enhancerach) odpowiedzialnych za kontrolę replikacji wirusów (rys. 1.10).

Rys. 1.10. Sekwencje końcowe występujące w genomach wirusów. a-a’ nukleotydy komplementarne, 1 – sekwencje odwrotnie powtórzone na nici ssDNA, 2, 3 – sekwencje powtórzone na nici dsDNA, 4 – sekwencje ułożone na nici dsDNA zgodnie z permutacją kołową, 5 – „lepkie” końce na nici dsDNA, 6 – formy DNA tworzone poprzez „lepkie” końce

[Na podstawie: Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998]

W związku z przyjmowaniem przez genom formy liniowej lub cyrkularnej geny mogą być ułożone zgodnie z permutacją kołową (rys. 1.11).

Rys. 1.11. Ułożenie genów wirusowych zgodnie z permutacją kołową. A – nić genomowa. Jedna ze zreplikowanych nici w formie liniowej (2) i cyrkularnej (3). B – zreplikowane nici DNA z różnym ułożeniem genów (1) po rekombinacji tworzą długie odcinki DNA, zawierające kilka kopii genomów wirusów (konkatamery), w których kolejność ułożenia genów jest taka sama

[Na podstawie: Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998]

Z kwasami nukleinowymi wirusów eukariotycznych mogą być związane niekowalencyjnie dodatkowe białka, bogate w reszty aminokwasów zasadowych, np. białka histonowe. Cząsteczki mRNA wirusów typu dsDNA ulegają transkrypcji z nici DNA przez polimerazę RNA zależną od DNA. Na niciach dsDNA u wirusów, u których kopiowanie genomu zachodzi z udziałem odwrotnej transkrypcji, są przerwy spowodowane brakiem nukleotydów na jednej z nici DNA (wirus zapalenia wątroby typu B, wirus mozaiki kalafiora). Brakujące nukleotydy muszą być uzupełnione przed przystąpieniem do syntezy mRNA. Proces ten zachodzi w jądrze komórkowym komórki gospodarza, z udziałem enzymów komórkowych. Komórkowa polimeraza RNA transkrybuje tylko pełny dsDNA. Wśród genomów wirusów typu DNA występują także genomy jednoniciowe ssDNA (Circoviridae, Parvoviridae). W takim przypadku synteza wirusowego mRNA jest poprzedzona syntezą nici komplementarnej do nici genomowej ssDNA. Wirusowy mRNA oraz potomne nici genomowe są syntetyzowane na matrycy nici komplementarnej (wyjątek stanowią geminiwirusy). U geminiwirusów geny kodowane są zarówno na nici genomowej (geny V), jak również na nici do niej komplementarnej (geny C). Wirusy typu DNA transkrybują swoje geny do mRNA z udziałem polimerazy RNA zależnej od DNA. Wirusy namnażające się w jądrze komórkowym korzystają z polimerazy RNA II. Wirusy typu DNA replikujące się w cytoplazmie komórki korzystają z enzymów wirusowych. W większości promotorów w komórkach eukariotycznych, jak i genów wirusów, ok. 30 pz od miejsca startu transkrypcji występuje sekwencja TATAA/TAA/TA/G. Promotory te zawierają także podobne sekwencje regulatorowe, jak w genomie komórki gospodarza. Transkrypcja genów wirusów jest regulowana przez komórkowe, jak i wirusowe czynniki transkrypcyjne. Niekiedy w procesie tym biorą udział czynniki transkrypcyjne występujące tylko w komórkach niektórych tkanek, co sprawia, że komórki te są w pełni permisywne tylko dla określonych wirusów. Liczne z nich występują we wszystkich komórkach, np. czynnik TFIID. Do komórkowych czynników regulujących transkrypcję zaliczamy białko AP-1 i AP-2 (ang. activator protein), SP1 (ang. stymulatory protein 1), NFkB (ang. nuclear factor kB). U większości wirusów eukariotycznych tuż po zsyntetyzowaniu wirusowego mRNA w jądrze komórkowym do końca 5’ nici jest dołączana 7’ metyloguanozyna (kap lub czapeczka) z udziałem enzymów komórkowych lub wirusowych (guanylotransferazy, metylotransferazy). Modyfikacja ta chroni wirusowy mRNA przed degradacją przez komórkowe nukleazy, bierze udział w transporcie cząsteczki mRNA z jądra komórkowego do cytoplazmy oraz w inicjacji translacji. Do wirusowych transkryptów do końca nici 3’może być dołączany „ogon” poli(A) (rys. 1.12).

Rys. 1.12. Schemat organizacji jednostki transkrypcyjnej wirusa herpes. P – promotor, L – sekwencja regulatorowa

[Na podstawie: Dulbecco R., Ginsberg H.S., Virology, ed. 2. JD Lippincott Company, Philadelphia 1980]

„Ogon” ten jest dodawany do nowo zsyntetyzowanej nici po jej odcięciu od matrycy, w miejscu stanowiącym sygnał dla poliadenylacji. Jest to sekwencja AATAAA (TATAAA u ludzkich wirusów wątrobowych), zlokalizowana od 10 do 30 zasad przed tym miejscem. „Ogon” poli(A) jest budowany poprzez przyłączanie kolejnych adenin przez kompleks białek zawierających polimerazę poli(A). Replikacja genomów wirusów typu dsDNA przebiega podobnie jak DNA komórkowego. Większość wirusów o genomie typu dsDNA korzysta z systemu replikującego DNA komórki gospodarza. Inne wirusy kodują większość białek lub wszystkie niezbędne im do replikacji we własnym genomie. Proces replikacji DNA jest poprzedzony utworzeniem widełek replikacyjnych. Następnie każda nić stanowi matrycę do syntezy nici komplementarnej (rys. 1.13). Po replikacji dochodzi do rekombinacji pomiędzy powstałymi cząsteczkami dsDNA. W wyniku tego procesu powstają długie nici zawierające zwielokrotnione genomy wirusów – konkatamery (rys. 1.11). Pojedyncze genomy wirusów są z nich wycinane podczas pakowania do wirionu.

Rys. 1.13. Schemat replikacji dsDNA. A – nici DNA stanowiące matryce w replikacji. B – powielone nici DNA. Na niebiesko zaznaczona nić macierzysta

[Źródło: rysunek autorski]

Obydwie nici są syntetyzowane w kierunku od 5’ do 3’, dlatego tylko jedna z nich może być syntetyzowana natychmiast po utworzeniu widełek replikacyjnych, natomiast kopiowanie nici drugiej jest poprzedzone syntezą krótkich fragmentów RNA, pełniących rolę starterów (fragmenty Okazaki). Po zakończeniu syntezy nici startery są usuwane, a nici DNA łączone z udziałem DNA ligazy. Replikacja DNA u niektórych wirusów zachodzi po rozdzieleniu nici i połączeniu końców każdej z nich oddzielnie poprzez komplementarne nukleotydy występujące na końcach 5’ i 3’, co prowadzi do uformowania struktury typu „paletki”. W genomach takich wirusów do końca 5’ nici dołączone jest kowalencyjnie białko poprzez deoksycytozynę (rys. 1.14).

Rys. 1.14. Struktury formowane podczas replikacji adenowirusów. 1 – genomowy DNA. Na końcach obu nici występują sekwencje względem siebie komplementarne, 2 – każda z nici dsDNA może stanowić matrycę do syntezy drugiej nici, 3 – jednoniciowe DNA może przyjmować strukturę cyrkularną (Model A) lub „paletkową” (Model B), które mogą brać również udział w replikacji wirusowego DNA

[Na podstawie: Ackermann H.W., Berthiaume L., Tremblay M., Virus Life in Diagrams. CRC Press, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington 1998]

Białko to służy jako starter dla polimerazy do syntezy nici komplementarnej. Synteza dsDNA innych wirusów o genomie cyrkularnym rozpoczyna się w miejscu ori (ang. origin of replication) i jest prowadzona na obu niciach z wykorzystaniem starterów RNA. W tym przypadku obie nici ulegają elongacji od miejsca ori w przeciwnych kierunkach (rys. 1.15).

Rys. 1.15. Schemat replikacji wirusów zawierających genom w formie ssDNA. A: 1– nić genomowa ssDNA, 2 – nić genomowa z dobudowaną nicią komplementarną = dsDNA – forma RF, ori, 3 – powielone nici dsDNA, 4 – przecięcie RF w miejscu ori przez specyficzną nukleazę, z wytworzeniem wolnej grupy OH służącej jako starter. Białko nacinające pozostaje na końcu 5’ przeciętej nici, 5 – synteza nici genomowej na matrycy dosyntetyzowanej wcześniej nici komplementarnej, 6 – po zakończeniu syntezy uwolniona zostaje potomna nić genomowa, synteza jest kontynuowana. Powstała forma ds. ulega nacięciu i cały cykl się powtarza. B: a, b – struktury formowane na końcach nici ssDNA w wyniku parowania komplementarnych zasad, biorące udział w replikacji DNA. Zygzakiem zaznaczono nić syntetyzowaną na matrycy genomowego DNA

[Na podstawie: A – Ducani C., Bernardinelli G., Hogberg B., Rolling circle replication requires single-stranded DNA binding protein to avoid termination and production of double-stranded DNA. Nucleic Acids Research 42, 16, 2014. doi: 10.1093/nar/gku737. B – Ni J.T., Zhou X., McCarty D.M., In Vitro Replication of Adeno-Associated Virus DNA. Virology of Journal, 68(2):1128–1138, 1994]

Replikacja wirusów zawierających genom w formie ssDNA poprzedzona jest utworzeniem formy dsDNA – formy replikacyjnej (RF), która stanowi matrycę do syntezy nici potomnej. Dobudowywanie nici komplementarnej do nici genomowej rozpoczyna się w miejscu cząsteczki, gdzie pomiędzy nukleotydami dochodzi do parowania zasad. Prawidłową konformację nici ssDNA zapewniają białka wiążące się z nicią ssDNA. W miejscu sparowanych zasad syntetyzowany jest krótki odcinek RNA stanowiący starter dla polimerazy. U niektórych wirusów typu ssDNA ważną rolę w inicjacji replikacji pełnią sekwencje na końcu genomu, tworzące struktury typu T z wolną grupą OH. Schemat replikacji dsDNA przedstawiono na rysunku 1.16.

Rys. 1.16. Schemat replikacji genomu wirusów typu dsDNA w formie cyrkularnej. A: 1 – DNA w formie cyrkularnej, 2 – nacięcie nici dsDNA w miejscu ori, 3 – koniec 3’ przeciętej nici służy jak starter dla DNA polimerazy, która rozpoczyna syntezę nici komplementarnej do drugiej nici w dsDNA, wolny koniec 3’ jest wydłużany przez polimerazę DNA, 4 – powstająca cząsteczka jednoniciowego DNA jest połączona kowalencyjnie z nicią macierzystą i stanowi matrycę do syntezy nici do niej komplementarnej, syntetyzowanej przez fragmenty Okazaki. B: replikacja theta lub w formie powiększającego się „oczka”: 1 – dsDNA, 2 – w miejscu ori dochodzi do rozplecenia nici i utworzenia widełek replikacyjnych. Każda z nici służy jako matryca do syntezy nici komplementarnej, 3 – syntetyzowane nici potomne, 4 – nici potomne

[Na podstawie: Rivika B., Replication and Synthesis of Nucleic Acids, Macromolecules. http://www.biologydiscussion.com/acids/nucleic-acid/replication-and-synthesis-of-nucleic-acids-macromolecules/35872]

Znane są także wirusy typu DNA w formie cyrkularnej, które replikują swój materiał genetyczny za pośrednictwem RNA (wirus zapalenia wątroby typu B) (rys. 1.17).

Rys. 1.17. Schemat replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV). Na matrycy DNA jest syntetyzowany RNA komplememtarny do pełnej nici genomowej (cRNA). cRNA jest przepisywany na genomowy dsDNA przy udziale odwrotnej transkryptazy

[Źródło: rysunek autorski]

1.3.2. Genomy wirusów typu ssRNA

Genomy wirusów typu ssRNA są zazwyczaj zbudowane z ok. 5–10 tysięcy zasad (tz) (wyjątek stanowią koronawirusy – 33 tz). Najmniejszy wirus typu RNA zawiera 1,7 tz (wirus zapalenia wątroby typu D). Cząsteczka ssRNA może mieć polarność dodatnią (+)ssRNA lub ujemną (–)ssRNA. W wyniku parowania zasad w obrębie pojedynczej nici wirusowego genomu mogą być tworzone struktury typu pętli, węzła, które pełnią rolę regulatorową podczas replikacji, transkrypcji i translacji wirusowego materiału genetycznego (rys. 1.18).

Rys. 1.18. Struktura i organizacja nici genomowej wirusów ssRNA. 1–3 – nić wirusów typu (+)ssRNA z zaznaczonymi na końcach nici elementami regulatorowymi (k – kap, t –struktura tRNA podobna, ORF – otwarte ramki odczytu), 4 – nić typu (–)ssRNA: 1–5 – sekwencje kodujące wirusowe białka, 6 – sekwencja regulatorowa – „liderowa” na końcu 3’ nici, 7 – rejony regulatorowe międzygenowe

[Na podstawie: 1, 2 – Hull R., Mathews Plant Virology, ed. 4. Academic Press, San Diego 2002. 3 – Semler B.L., Poliovirus proves IRES-istible in vivo. J Clin Invest 113(12):1678–1681, 2004. https://doi.org/10.1172/JCI22139. 4. Dulbecco R., Ginsberg H.S., Virology, ed. 2. JD Lippincott Company, Philadelphia 1980]

Ważną rolę w procesie regulacji replikacji i ekspresji wirusowego genomu pełnią także sekwencje niekodujące UTR (ang. untranslated regions), zlokalizowane na obu końcach nici RNA. Na przykład, elementy strukturalne zlokalizowane w rejonie niekodującym 5’ UTR stanowią miejsce wiązania rybosomu IRES (ang. internal ribosome entry site). Ponadto, IRES jest odpowiedzialny za regulację procesu translacji materiału genetycznego wirusa, pośredniczy w niezależnej od struktury kap inicjacji translacji, odpowiada za rekrutację białek wirusowych i komórkowych, w tym czynników inicjujących (eIF2 i eIF3), oraz formowanie stabilnego kompleksu preinicjatorowego przez związanie podjednostki rybosomowej 40S (rys. 1.19). Genomy niektórych wirusów eukariotycznych na końcu 3’(+)ssRNA mają sekwencje poli(A) lub podobne do tRNA (wirusy roślinne).

Rys. 1.19. Sekwencje niekodujące na niciach wirusowego ssRNA. A – rejon IRES na nici ssRNA, I–VI struktury formowane w wyniku parowania zasad. B – elementy strukturalne tworzone na nici ssRNA biorące udział w wiązaniu się nici RNA z rybosomem (rybosom zaznaczono kolorem zielonym, a kolorami niebieskim i czarnym czynniki biorące udział w inicjacji translacji). C – struktury pętli i pseudowęzła tworzone na nici ssRNA

[Na podstawie: A – Semler B.L., Poliovirus proves IRES-istible in vivo. J Clin Invest 113(12):1678–1681, 2004. https://doi.org/10.1172/JCI22139. B, C – Martinez-Salas E., Francisco-Velilla R., Fernandez-Chamorro J., Embarek A.M., Insights into Structural and Mechanistic Features of Viral IRES Elements. Front Microbiol 2018. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02629]

Genomy kilku wirusów typu RNA są podzielone i zlokalizowane w pojedynczym wirionie (np. u wirusa grypy) lub w kilku wirionach (bromowirusy) (rys. 1.20).

Rys. 1.20. Wiriony zawierające materiał genetyczny typu ssRNA podzielony i niepodzielony. A – genom podzielony bromowirusów, materiał genetyczny wirusa jest zlokalizowany w trzech wirionach. B – wirus grypy, materiał genetyczny wirusa jest umieszczony w 8 fragmentach RNA, w jednym wirionie

[Na podstawie: Grant J., Chen L., Quiñones-Parra S., Pang K., Kedzierska K., Chen W., T-Cell Immunity to Influenza A Viruses. Critical Reviews™ in Immunology 34(1):15–39, 2014. https://www.researchgate.net/publication/260440310]

Wirusowy ssRNA o polarności dodatniej ma na końcu 5’ strukturę kap (m7GpppN) lub białko VPg (ang. virus protein, genome linked) i może funkcjonować w komórce jak mRNA, natomiast (–)ssRNA dopiero po przepisaniu na (+)ssRNA przez swoistą wirusową polimerazę RNA zależną od RNA. Stąd nić genomowa (–)ssRNA nie zawiera na końcu 5’ modyfikacji typu kap, natomiast na końcu 3’ nie ma „ogona” poli(A). Białko VPg jest niewielkim białkiem o masie cząsteczkowej ok. 7 kD, kodowanym w genomie wirusowym, które bierze udział w inicjacji replikacji wirusowego genomu. Białko to poprzez resztę tyrozyny, na końcu N cząsteczki, jest połączone kowalencyjnie z resztą U na końcu 5’RNA (NH_2-Gly-Ala-Tyr-0-pUpUp[RNA....). Na końcach nici ssRNA zlokalizowane są krótkie sekwencje regulatorowe, biorące udział w replikacji i transkrypcji genomu wirusa. Wirusy RNA wymagają polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) do transkrypcji i replikacji wirusowych genów.

Wszystkie wirusy typu (–)ssRNA mają w wirionie własną replikazę, a pozbawione tego enzymu są nieinfekcyjne. Wirusy typu (+)ssRNA syntetyzują to białko zaraz po wniknięciu do komórki. W komórce nie ma enzymów transkrybujących nić ssRNA. U większości wirusów typu RNA te same replikazy biorą udział w replikacji i transkrypcji wirusowego RNA. Generalnie, replikacja wirusów typu ssRNA polega na uformowaniu na nici RNA rybonukleoproteinowego kompleksu (RNP), stanowiącego formę pośrednią w replikacji, zwanego RI-1 (ang. replicative intermediate). W kompleksie tym wirionowy RNA (zwany także vRNA lub gRNA) służy jako matryca do syntezy nici RNA o sekwencji komplementarnej do nici genomowej (zwanej także antygenomową, cRNA lub antysensowną do nici genomowej). Nowo syntetyzowane nici RNA stanowią matrycę do syntezy nici RNA w drugim kompleksie replikacyjnym (RI-2). Mają one taką samą polarność jak nić genomowa (rys. 1.21).

Rys. 1.21. Schemat replikacji wirusów (–)RNA. Nici (+)ssRNA służą jako matryce do syntezy wirusowych białek oraz do syntezy genomowego RNA

[Źródło: rysunek autorski]

W trakcie syntezy nici RNA częstość popełnianych błędów jest znacznie wyższa niż podczas syntezy DNA, ponieważ RdRp nie mają systemu korygującego błędy tzw. proofreading. Ponadto, podczas replikacji RNA może dochodzić do przeskoku polimerazy na nić sąsiednią, jak również do rekombinacji nici (rys. 1.22). Prowadzi to do powstania różnej populacji wirusów (ang. quasi-species), których sekwencje genomu różnią się od sekwencji nici macierzystej. Zmiany takie mogą powodować powstawanie nowych szczepów wirusa o innych właściwościach antygenowych. Stanowi to jeden z mechanizmów ochronnych przed działaniem układu odpornościowego gospodarza.

Rys. 1.22. Rekombinacja nici RNA podczas replikacji. A – nić akceptorowa. D – nić donorowa. Fragment RNA syntetyzowany na nici donorowej (zaznaczony kolorem pomarańczowym) wraz z polimerazą przyłącza się do innej nici RNA (A), na matrycy której kontynuowana jest synteza RNA. C – powstała nić potomna

[Źródło: rysunek autorski]

1.4. STRATEGIE KODOWANIA I EKSPRESJI WIRUSOWYCH GENÓW

1.4.1. (+)ssRNA

Pierwszym etapem w cyklu replikacyjnym wirusów (+)ssRNA jest translacja na matrycy genomowego RNA wirusowej polimerazy RNA zależnej od RNA. Proces ten przebiega na rybosomach cytoplazmatycznych komórki gospodarza. Do replikacji większości wirusów (+)ssRNA poza polimerazą RdRp niezbędne są takie wirusowe enzymy jak: helikaza, enzymy biorące udział w kapowaniu RNA, NTPaza oraz białka nieenzymatyczne wchodzące w skład wirusowego kompleksu replikacyjnego. W replikacji (+)ssRNA ważną rolę pełnią białka komórkowe oraz błony wewnątrzkomórkowe stanowiące miejsca kotwiczenia dla kompleksu replikacyjnego. U większości wirusów RdRp do replikacji wymaga startera, którym może być białko VPg. Różnice w cyklu replikacyjnym wirusów (+)ssRNA wynikają z różnicy lokalizacji w genomie otwartych ramek odczytu, zapisanej w nich informacji genetycznej oraz sposobu ich ekspresji.

Większość mRNA wirusów eukariotycznych nie jest monocistronowa, ale zawiera informacje z kilku ramek odczytu (ORF) lub z pojedynczej ramki odczytu, w której jest zakodowanych kilka białek. Takie policistronowe cząsteczki mRNA w komórce eukariotycznej zachowują się funkcjonalnie jak monocistronowe. Wirusy w tym celu wykorzystują kilka różnych strategii, jak np.: supresję kodonu stop, syntezę subgenomowych mRNA, syntezę poliproteiny i następnie jej przecinanie do pojedynczych białek funkcjonalnych, przesunięcie ramki odczytu (rys. 1.23).

Dla większości wirusów o genomie typu RNA mechanizm inicjacji replikacji jest słabo poznany.

Rys. 1.23. Strategie kodowania i ekspresji wirusowych genów na nici (+)ssRNA. 1 – na nici RNA kodowane są dwie ramki odczytu. Białko a jest syntetyzowane na nici genomowej; b – z subgenomowego RNA; 2 – genom jest podzielony i każda z nici koduje inne białko; 3 – informacja genetyczna jest kodowana w jednej ramce odczytu, w wyniku translacji nici genomowej powstaje poliproteina, która jest cięta przez proteazy do białek funkcjonalnych; 4 – strategia supresji kodonu stop. Na matrycy nici RNA powstaje białko a i b. Białko b ma taki sam koniec N, jak a i powstaje w wyniku supresji kodonu stop w ORF1; 5 – odczytywanie informacji genetycznej rozpoczyna się w innym miejscu nici, co prowadzi do syntezy białek o odmiennym składzie aminokwasowym (1A, 2A, 3A i 1′A, 2′A)

[Na podstawie: Hull R., Mathews Plant Virology, ed. 4. Academic Press, San Diego, USA 2002]

1.4.2. (–)ssRNA

Wirusowy genom (–)ssRNA tworzy w wirionie rybonukleinowy kompleks, w skład którego wchodzi polimeraza RNA zależna od RNA oraz białka dodatkowe (np. NP). Kompleks taki jest bardzo stabilny i odporny na działanie RNaz. W przypadku wirusa grypy każdy jego segment tworzy rybonukleinowy kompleks z dołączonymi do nici RNA licznymi nukleoproteinami (NP) oraz heterotrimeryczną polimerazą (PA, PB1 i PB2), związaną z zachowawczym końcem nici vRNA. W nukleokapsydzie nić (–)ssRNA jest przepisywana na nić komplementarną, która bierze udział w pierwszej transkrypcji oraz replikacji wirusowego RNA. Nowo syntetyzowany wirusowy RNA (vRNA), jak również formy pośrednie cRNA są stabilizowane przez białka wirusowe natychmiast po zakończeniu syntezy. Zapobiega to parowaniu zasad pomiędzy matrycą a jej produktem, co umożliwia ich wykorzystanie w dalszej syntezie. Skład kompleksów replikujących nici wirusów o genomie segmentowanym i niesegmentowanym (–)ssRNA różni się.

U wirusów (–)ssRNA z genomem segmentowanym rybonukleinowy kompleks jest związany z każdą nicią genomowego RNA. Wirusy te nie potrafią syntetyzować struktury kap. Kap wraz z krótkim odcinkiem nukleotydowym od 10–20 nukleotydów jest odcinany od końca 5’ nici komórkowego mRNA. W procesie tym bierze udział wirusowy kompleks transkrypcyjno-replikacyjny, który ma również aktywność endonukleolityczną. Kap, z krótkim odcinkiem nukleotydowym jest przyłączany do końca 3’ nici wirusowego RNA i służy jako starter dla polimerazy w procesie transkrypcji wirusowego mRNA. Nić mRNA wirusów (–)ssRNA jest na obu końcach modyfikowana (koniec 5’ ma kap, 3’ poli(A) i nie ulega składaniu do RNP). Podczas zmiany transkrypcji wirusowego RNA na replikację dochodzi do zahamowania procesów modyfikacji i poliadenylacji nici RNA. Ważną rolę w replikacji wirusowego RNA pełni białko NP. Może ono oddziaływać z polimerazą zmieniając jej aktywność oraz zapobiegać degradacji cRNA tworząc rybonukleinowy kompleks (patrz rozdz. 3.8). Każdy genomowy segment ulega niezależnej replikacji i transkrypcji.

U wirusów (–)ssRNA o genomie niesegmentowanym genomowy (–)ssRNA jest transkrybowany do mRNA na wczesnym etapie infekcji. Transkrypcja rozpoczyna się na końcu 3’ nici genomowej RNA i jest prowadzona przez wirusową polimerazę aż do miejsc poliadenylacji. Podczas transkrypcji (kotranskrypcyjnie) syntetyzowana jest struktura kap na końcu 5’ nici. Proces modyfikacji cząsteczek mRNA, a następnie ich odłączenie od kompleksu replikacyjnego zachodzi sukcesywnie w rejonach międzygenowych nici (–)ssRNA. Każdy powstały mRNA zawiera kap (koniec 5’) i sekwencje poli(A) na końcu 3’. Kiedy wzrasta stężenie białka nukleokapsydu NP, dochodzi do zahamowania poliadenylacji i odłączania poszczególnych mRNA, powstaje wówczas nić (+)ssRNA, komplementarna do genomu wirusa, która stanowi matrycę do syntezy (–)ssRNA. Potomne nici genomowe są stabilizowane przez wirusowe białka. Replikacja wirusów (–)ssRNA o genomie niesegmentowanym wymaga współdziałania wirusowej nukleoproteiny NP z wielobiałkowym kompleksem białka L (patrz rozdz. 3.7).

Proces ten jest najlepiej poznany u wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej –VSV (ang. Vesicular stomatitis virus) i wydaje się, że podobnie przebiega u innych wirusów mających genom w formie jednoniciowej, (–)ssRNA.

1.4.3. Genomy ambisensowne

Genomy niektórych wirusów (–)ssRNA, jak również ssDNA (geminiwirusów) są ambisensowne. Znaczy to, że część genomu ma polarność (+), a część (–) (rys. 1.24).

Rys. 1.24. Struktura i organizacja nici genomowej wirusów o polarności ambisensownej. 1 – nić genomowa o różnej polarności, 2 – matrycą do syntezy mRNA jest bezpośrednio nić genomowa, 3 – nić genomowa jest przepisywana na nić komplementarną – antygenomową, 4 – syntetyzowany na nici antygenomowej mRNA

[Na podstawie: Ackermann H.W., Berthiaume L., Tremblay M., Virus Life in Diagrams. CRC Press, Boca Raton, Boston, London New York, Washington 1998]

1.4.4. dsRNA

Replikacja wirusów zawierających dsRNA zachodzi w rdzeniu wirusowej cząstki. Wirusy zawierające dsRNA mają genom w 10 do 12 segmentach (rys. 1.25). Nić mRNA jest kapowana, ale nie zawiera poli(A). Kap jest syntetyzowany z udziałem enzymów wirusowych (polimerazy, helikazy, trifosfatazy RNA, guanylotransferazy, dwóch różnych metylotransferaz). Każdy segment wirusowego dsRNA jest związany z wirusową polimerazą. Aktywność polimerazy jest regulowana przez białka kapsydu. Nić kapowaną w dsRNA stanowi nić (+)RNA, która ulega translacji, natomiast nić (–) genomowego dsRNA jest kopiowana do nici mRNA przez wirusową polimerazę RNA zależną od RNA. Nowo syntetyzowane mRNA ulegają kapsydacji i wewnątrz kapsydu do nici tej jest dobudowywana nić komplementarna (–)ssRNA i formowane są dsRNA (rys. 1.26).

Rys. 1.25. Struktura i organizacja wirusowych genomów typu dsRNA. A – wirusowy materiał genetyczny jest zlokalizowany w 10–12 ORF, z których każda koduje zazwyczaj jedno białko o różnej liczbie aminokwasów – aa. B – struktura i organizacja segmentu dsRNA: 1 – rejon niekodujący (9–48nt), 2 – sekwencja wzmacniająca z końca 5’ nici (–)RNA, 3 – rejon niekodujący, 4 – sekwencje wzmacniające, 5 – promotor i elementy wzmacniające

[Na podstawie: Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., Fundamental Virology, ed. 3. Lippincott-Raven, New York 1996]

Rys. 1.26. Schemat replikacji dsRNA. 1 – nić genomowa, 2 – mRNA [nić (+) z dsRNA] służy jako matryca do translacji białka, nici te w toku replikacji powstają na matrycy nici (–)ssRNA, 3 – do nici (+)RNA dobudowywana jest druga nić podczas procesu replikacji

[Na podstawie: Ackermann H.W., Berthiaume L., Tremblay M., Virus Life in Diagrams. CRC Press, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington 1998]

1.4.5. (+)ssRNA replikowane z udziałem odwrotnej transkryptazy

Osobną grupą wirusów są retrowirusy, które mają genom w formie (+)ssRNA i przepisują go do dsDNA w cytoplazmie, z udziałem wirusowej odwrotnej transkryptazy, a DNA po integracji z genomem komórkowym transkrybują do RNA w jądrze komórkowym. Transkrypcja z DNA do RNA zachodzi z udziałem komórkowej RNA polimerazy II (patrz rys. 1.9).

1.4.6. Białka wirusów atakujących komórki eukariotyczne

Białka wirusowe często podlegają takim modyfikacjom, jak: glikozylacja, acylacja, czy fosforylacja. Synteza białek N-glikozylowanych zachodzi na rybosomach związanych z retikulum endoplazmatycznym. Białka te są następnie transportowane w pęcherzykach formowanych w aparacie Golgiego do błony komórkowej oraz innych miejsc w komórce. Białka wirusów replikujących się w jądrze komórki zawierają sygnał lokalizacji jądrowej (PKKKRKV). Jest to krótka sekwencja aminokwasowa bogata w lizynę (K) i argininę (R). Sygnał ten umożliwia białkom wirusowym wiązanie się z komórkowymi białkami importynami i ich transport przez pory jądrowe. Niektóre białka uczestniczą także w transporcie mRNA z jądra komórkowego do cytoplazmy i poza sygnałem lokalizacji jądrowej zawierają sygnały umożliwiające ich transport z jądra do cytoplazmy.

1.4.7. Transkrypcja i translacja u wirusów bakteryjnych (bakteriofagów)

Mechanizm transkrypcji i translacji u wirusów prokariotycznych różni się od eukariotycznego. Typowe baktoriofagowe cząsteczki mRNA są policistronowe i nie mają struktury kap na końcu 5’, jak również poli(A) na końcu 3’. Niektóre fagi wykorzystują do transkrypcji komórkową polimerazę RNA zależną od DNA, inne korzystają z własnych enzymów. Procesy transkrypcji i translacji przebiegają prawie równocześnie, co umożliwia brak jądra komórkowego w komórce bakteryjnej. Proces translacji zachodzi na rybosomach komórkowych i jest inicjowany, jak w komórce prokariotycznej przez tRNA metioninowy, który jest formylowany. Niektóre wirusowe geny mogą się częściowo pokrywać. Powstałe transkrypty, podobnie jak w komórce eukariotycznej, ulegają translacji poprzez supresję, lub brak kodon stop, lub w wyniku przesunięcia ramek odczytu (patrz rozdz. 7.2).

1.5. KLASYFIKACJA WIRUSÓW WEDŁUG DAVIDA BALTIMORE’A

David Baltimore podzielił wirusy na VII grup, biorąc pod uwagę typ wirusowego genomu i sposób jego transkrypcji (rys. 1.27). Nici wirusowych genomów są oznaczane jako (+) lub (– ), co odnosi się do wirusowego mRNA. Wirusowy mRNA ma taką samą sekwencję jak genom (+), jednak tyminę w DNA zastępuje uracyl w RNA, natomiast nić (–) ma sekwencję komplementarną do mRNA. Powielenie nici ssDNA jest poprzedzone utworzeniem dsDNA.

Rys. 1.27. Schemat replikacji wirusowego materiału genetycznego. I – wirusy dsDNA replikują się generalnie jak DNA organizmów. Transkrypcja mRNA zachodzi z dsDNA; II – ssDNA, formą replikacyjną wirusów jest dwuniciowy DNA, z którego zachodzi także transkrypcja mRNA; III – dsRNA, nić genomowa (+), służy do replikacji wirusa oraz stanowi matrycę do syntezy białek; IV – (+)ssRNA nić genomowa jest syntetyzowana na matrycy nici (–)RNA, jak również mRNA; V – nić (–)RNA jest matrycą do syntezy nici (+)RNA oraz do syntezy mRNA; VI – wirusy zawierające materiał genetyczny w formie (+)ssRNA, które replikują się za pośrednictwem DNA. DNA jest syntetyzowany na matrycy RNA przy udziale odwrotnej transkryptazy. mRNA są transkrybowane z DNA; VII – wirusy zawierające dsDNA, który ulega replikacji na matrycy RNA przy udziale odwrotnej transkryptazy (RT). mRNA jest transkrybowany z DNA

[Na podstawie: Carter J.B., Saunders V.A., Virology: Principles and Application, ed. 3. John Wiley & Sons, Chichester 2011]

Transkrypcja genów wirusów, jak również replikacja materiału genetycznego wirusów prokariotycznych zachodzi w cytoplazmie komórki gospodarza, natomiast wirusów eukariotycznych może przebiegać w jądrze komórkowym lub cytoplazmie. Generalnie, wirusy o materiale genetycznym typu RNA replikują się w cytoplazmie (wyjątek stanowi np. wirus grypy), natomiast wirusy o genomie typu DNA – w jądrze komórkowym (wyjątkiem jest np. wirus ospy prawdziwej). Wirusy replikujące się w cytoplazmie wykorzystują do replikacji i transkrypcji wirusowego materiału genetycznego własne enzymy, zaś wirusy replikujące się w jądrze komórkowym korzystają najczęściej z enzymów komórkowych. Zarówno wirusy RNA, jak i DNA replikujące się w cytoplazmie tworzą miejsca zwane wiroplazmą lub fabrykami wirusowymi, w których składane są wirusowe cząstki potomne. Miejsca takie znajdują się często w pobliżu błony komórkowej, do której są transportowane białka wirusowe. Z takich fragmentów błony budowane są osłonki wirusów, pobierane podczas procesu pączkowania wirusa z komórki. Z błonami komórkowymi wiążą się także często wirusowe kompleksy replikacyjne (RC). Replikacja wirusów w cytoplazmie wpływa na zmianę lokalizacji organelli komórkowych, reorganizację retikulum endoplazmatycznego, aparatu Golgiego, endosomów, lizosomów, mitochondriów, jak również rozmieszczenie i dynamikę cytoszkieletu komórkowego. Duże zmiany zachodzą również w jądrze komórkowym. Obejmują one reorganizację i rozluźnienie chromatyny oraz takich jej składników, jak: PML (ang. promyelocytic leukemia protein), ciałek jądrowych – PML-NB (ang. nuclear bodies), ciałek Cajal – CBs (ang. Cajal bodies), jąderka oraz granuli wewnątrzchromatynowych – IG (ang. internal granule). W wyniku zakażenia wirusowego komórki dochodzi także do zmian w jej morfologii; zmienia się kształt komórki, przyczepność i adhezja, przepuszczalność błony komórkowej. Niekiedy może dochodzić do fuzji błon i tworzenia syncytium, czyli powstawania komórek wielojądrowych w wyniku połączenia komórek jednojądrowych. W niektórych komórkach obserwuje się charakterystyczne ciałka wtrętowe (ciałka inkluzyjne) oraz całkowicie zmienia się profil białek i kwasów nukleinowych. Pod wpływem zakażenia w komórkach indukowana lub hamowana jest apoptoza lub dochodzi do lizy komórki. Zespół zmian morfologicznych i degeneracyjnych zachodzących w wyniku zakażenia wirusowego komórki nosi nazwę efektu cytopatycznego – CPE (ang. cytopathic effect).

1.6. ETAPY REPLIKACJI WIRUSOWEJ CZĄSTKI

Niezależnie od typu genomu wirusów, cykl powielania wirusów przebiega etapowo i rozpoczyna się od rozpoznania odpowiedniej komórki gospodarza, a kończy uwolnieniem z komórki wirusów potomnych (rys. 1.28). Zakażenie komórki wirusem, które kończy się wytworzeniem wirusowych cząstek potomnych nosi nazwę infekcji produktywnej. Poszczególne etapy cyklu mogą się różnić, co jest spowodowane typem komórki, która jest gospodarzem wirusa oraz różnicami w organizacji i ekspresji wirusowych genów. Namnażanie wirusów nie zachodzi w wyniku podziału ich cząstki jak komórek, ale jest to cykl kolejno następujących po sobie przemian prowadzących do powstania poszczególnych elementów wirionu i ich złożenia do dojrzałej cząstki potomnej (rys. 1.29).

Podczas składania nukleokapsydów i wirionów o symetrii ikozaedralnej tworzony jest najczęściej „pusty” kapsyd pozbawiony wirusowego genomu – prokapsyd lub progłówka u bakteriofagów o wirionach złożonych, do którego pakowany jest genom wirusa. Proces ten bywa często łączony z modyfikacjami białek i powstaniem dojrzałych kapsydów.

Rys. 1.28. Schemat cyklu replikacyjnego wirusów typu DNA; zaznaczono poszczególne etapu cyklu replikacyjnego wirusowej cząstki

[Na podstawie: Ackermann H.W., Berthiaume L., Tremblay M., Virus Life in Diagrams. CRC Press, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington 1998]

Rys. 1.29. Składanie cząstki potomnej bakteriofaga. Synteza i składanie poszczególnych elementów cząstki faga zachodzi niezależnie. 1 – składanie płytki podstawnej, 2 – składanie główki faga, 3 – pakowanie materiału genetycznego faga do niepełnej główki – progłówki, 4 – synteza włókienek, 5 – dojrzała cząstka faga

[Na podstawie: Cann A.J., Principles of Molecular Virology, ed. 5. Academic Press, San Diego, London 2012]

1.7. WNIKANIE WIRUSÓW DO KOMÓRKI

Justyna Broniarczyk

Wirus, aby wniknąć do komórki, musi pokonać bariery oddzielające komórkę od środowiska zewnętrznego, takie jak: błona komórkowa czy dodatkowo ściana komórkowa w przypadku bakteriofagów i wirusów roślinnych. Wnikanie wirusa do komórki to skomplikowany i złożony proces, w skład którego wchodzą powiązane ze sobą i następujące po sobie etapy. Mechanizmy molekularne tego procesu są najlepiej poznane u wirusów zwierzęcych.

1.7.1. Adsorpcja wirusów do komórki

Pierwszym etapem cyklu replikacyjnego wirusa jest adsorpcja – rozpoznanie i przyłączenie wirusowych cząstek do powierzchni określonych komórek. W procesie tym ważną rolę odgrywają czynniki umożliwiające adsorpcję wirusa do komórki (ang. attachment factors) i receptory wirusowe (ang. viral receptors).

Czynniki przyłączające wirusa do komórki rekrutują i zatrzymują cząstki wirusa na powierzchni komórki, ułatwiając tym samym jego adsorpcję i późniejsze oddziaływanie z receptorem. Wykazują się one niską specyficznością i są zdolne do wiązania się z różnymi typami wirusów. Na powierzchni komórek zwierzęcych są to najczęściej polisacharydy z grupy glikozaminoglikanów (GAG). Jednym z takich czynników jest siarczan heparanu, do którego przyłączają się m.in.: wirusy związane z adenowirusami (AAV, ang. Adeno-assiociated viruses), ludzkie wirusy brodawczaka (HPV, ang. Human papillomaviruses), wirusy opryszczki pospolitej (HSV, ang. Herpex simplex virus), czy poxwirusy, np. wirus krowianki (VACV, ang. Vaccinia virus). Innym przykładem czynnika adsorpcyjnego jest kwas sjalowy wykorzystywany m.in. przez wirusy grypy (IAV, ang. Influenza A virus).

Receptory wirusowe w przeciwieństwie do czynników adsorpcyjnych charakteryzują się dużo wyższą swoistością i określają tropizm wirusa do komórki. Tym samym obecność receptora w danej komórce może być wyznacznikiem podatności na zakażenie określonym wirusem. W oddziaływaniach wirus-receptor biorą udział: wiązania jonowe, wodorowe i siły van der Waalsa. Jeden typ wirusa może wiązać wiele różnych receptorów, a dany receptor może być specyficzny dla różnych wirusów. Na przykład wirusy Coxsackie (ang. Coxsackieviruses) z rodziny pikornawirusów wykorzystują ten sam receptor co adenowirusy.

Niekiedy jednak, aby wirus mógł wniknąć do komórki poza receptorem potrzebny jest jeszcze koreceptor. Tak jest m.in. w przypadku ludzkiego wirusa niedoboru odporności – (HIV, ang. Human immunodeficiency virus), który oprócz receptora CD4 wymaga jeszcze dodatkowych koreceptorów – CCR5 lub CXCR4 (receptory chemokin).

W ciągu ostatnich 30 lat zidentyfikowano receptory dla prawie wszystkich ludzkich wirusów patogennych. Molekularny charakter wirusowych receptorów jest dość zróżnicowany i obejmuje białka powierzchniowe komórek, węglowodany i lipidy. Wirusy jako receptory wykorzystują cząsteczki pełniące w komórce ważne funkcje fizjologiczne jak: receptory wiążące ligand LDL (lipoproteina o niskiej gęstości), EGFR (receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu), glikoproteiny, kanały jonowe, gangliozydy, węglowodany, proteoglikany i integryny. Na rysunku 1.30 i w tabeli 1.1 przedstawiono przykłady receptorów i czynników umożliwiających adsorpcje wirusa do komórki.

Rys. 1.30. Przykłady czynników adsorpcyjnych i receptorów umożliwiających wnikanie wirusa do komórki. HSV (ang. Herpes simplex virus) – wirus opryszczki pospolitej; SV40 (ang. Simian virus 40) – małpi wirus 40; HHV-8 (ang. Human herpesvirus 8) – ludzki herpeswirus typu 8; FDMV (ang. Food and mouth disease virus) – wirus pryszczycy; HIV-1 (ang. Human immunodeficiency virus) – ludzki wirus niedoboru odporności; LDL-R (ang. low-density lipoprotein receptor) – receptor wiążący ligand LDL (lipoproteina o niskiej gęstości); DC-SIGN (ang. dendric-cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin) – receptor dla wirusa herpes na powierzchni komórek dendrytycznych; CD4 (ang. cluster of differentiation 4) – cząsteczka różnicowania; CCR5 (ang. C-C chemokine receptor type 5) – receptor chemokin typu 5; CXCR4 (ang. C-X-C chemokine receptor type 4) – receptor chemokin typu 4, Car – (ang. Coxsackievirus and adenovirus receptor) – receptor dla wirusa Coxsackie i adenowirusa

[Na podstawie: Yamauchi Y., Helenius A., Virus entry at a glance. J Cell Sci 126, 6:1289–1295, 2013. Flint J., Racaniello V., Rall G., Skalka A.M., Principles of Virology, vol. 1. Molecular Biology, ed. 4. ASM Press, Washington 2015]

Tabela 1.1. Wybrane receptory i czynniki umożliwiające adsorpcję wirusa do komórki

Wirus

Rodzina

Receptor/ /(Koreceptor)

Czynniki adsorpcyjne

Białko wirusowe

Wirusy DNA

AAV

Parvoviridae

siarczan heparanu/(EGFR, integryny)

siarczan heparanu

CAP

SV40

Polyomaviridae

GM1-gangliozydy

–

VP1

Ad5

Adenoviridae

integryny, Car

–

białko włókienka

HSV

Herpesviridae

nektyna-1, HVEM, PILR-α

siarczan heparanu

gD, gB

CMV

Herpesviridae

EGFR

siarczan heparanu

–

EBV

Herpesviridae

CD21

siarczan heparanu

gp350

Wirusy RNA

Wirus polio

Picornaviridae

PVR/CD155

–

VP1, VP2, VP3

Wirus Coxsackie

Picornaviridae

Car

–

Rhinowirus

Picornaviridae

ICAM-1

DC-SIGN,

L-SIGN,

LDL receptor

VP1, VP2, VP3

HCV

Flaviviridae

CD81,

klaudyna (CLDN1), okludyna (OCLN)

SR-B1,

LDL receptor

E2

Wirus SARS

Coronaviridae

ACE2

–

białko S

Wirus grypy

Othomyxoviridae

–

kwas sjalowy

HA

Wirus wścieklizny

Rhabdoviridae

NCAM-1/CD56

–

białko G

Reowirus

Rhabdoviridae

JAM-A

–

S1

Wirusy RT

HBV

Hepadnaviridae

NTCP

siarczan heparanu

Pre-S1

HIV

Retroviridae

CD4 (CXCR4 lub CCR5)

DC-SIGN,

L-SIGN

gp120

Objaśnienia skrótów znajdują się na początku książki w Wykazie skrótów używanych w tekście.

Każdy wirus ma kilka miejsc, które umożliwiają mu rozpoznanie specyficznych receptorów na powierzchni komórki. W przypadku wirusów mających osłonkę białkowo-lipidową funkcję tę często pełnią glikoproteiny, np. gp120 u wirusa HIV wiąże się z cząsteczką CD4 limfocytów T pomocniczych lub makrofagów. U wirusów, które nie mają osłonki, bezpośrednio z receptorem mogą wiązać się białka kapsydu, np. białko włókienka adenowirusa wiąże się z receptorem Car5.

Rozpoznanie przez danego wirusa specyficznego receptora lub receptorów na powierzchni komórki umożliwia inicjację kolejnego etapu, związanego z penetracją wirusa do wnętrza komórki. Receptory często tworzą w błonie komórkowej skupiska – mikrodomeny. Wiązanie w tych miejscach wirusa, indukuje sygnalizację komórkową, prowadzi do zmiany struktury błony komórkowej i tym samym aktywnie inicjuje endocytozę i wnikanie wirusa do wnętrza infekowanej komórki.

Wyjątkiem są wirusy roślinne oraz grzybów i drożdży, które nie wymagają receptora i dostają się do wnętrza komórki, gdy nastąpi mechaniczne uszkodzenie ściany komórkowej przy pomocy wektorów, takich jak np. owady (więcej w rozdz. 5). Sposób zakażania przez wirusy komórek bakteryjnych jest opisany w rozdziale 7.

W procesie wnikania wirusów istotną rolę odgrywają również konwertazy probiałkowe (PC, ang. proprotein convertases), do których należą m.in.: furyna, PC1/3, PC2, PACE4, PC4, PC5/6, PC7, PCSK9 i SKI-1. Enzymy te mają zdolność rozszczepienia i aktywowania nie tylko białek komórkowych, ale również wirusowych. Wiele wirusów wykorzystuje furynę i inne konwertazy probiałkowe (PC) w regulacji mechanizmu ich wnikania do komórek i zakaźności. W procesie tym „cięciu” i aktywacji ulegają najczęściej glikoproteiny osłonki wirusów, np. białko S koronowirusów, H (hemaglutynina) wirusa grypy lub w przypadku wirusów bezosłonkowych, białka kapsydów, np. L1 wirusa HPV. Obróbka proteolityczna przez konwertazy probiałkowe promuje wiązanie i fuzję cząsteczek wirusa z komórkami docelowymi, a także zwiększa ich zakaźność i patogenność.

1.7.2. Penetracja – wnikanie wirusów do komórki

Wirus może wniknąć do komórki na dwa sposoby: przez bezpośrednią fuzję osłonki wirusa z błoną komórkową lub na drodze endocytozy. Wyjątkiem są niektóre pikornawirusy, które mają zdolność formowania porów w błonie komórkowej, przez które wprowadzają swój materiał genetyczny do wnętrza komórki (rys. 1.31).

Rys. 1.31. Sposoby wnikania wirusów do komórki. Po związaniu z odpowiednim receptorem lub/i czynnikiem adsorpcyjnym na powierzchni komórki, wirus może wniknąć do wnętrza komórki wykorzystując różne mechanizmy, takie jak np. fuzja błon czy endocytoza. Wirusy nie mające otoczki mogą wprowadzać swój materiał genetyczny bezpośrednio, tworząc pory w błonie komórkowej (1) lub na drodze endocytozy (2, 3), natomiast wirusy mające otoczkę, wnikają na drodze endocytozy (4) lub fuzji (5). Mechanizm uwalniania wirusów z endosomów również zależy od tego czy dany wirus ma otoczkę białkowo-lipidową, czy nie. W przypadku wirusów, które nie mają otoczki, oprócz niskiego pH ważną rolę odgrywa liza pęcherzyka endocytarnego lub tworzenie porów w błonie endosomów. Wirusy zawierające osłonkę, najczęściej uwalniają do cytoplazmy kapsyd na drodze fuzji, do której dochodzi między otoczką wirusową a błoną endosomalną wyzwalanej przez niskie pH wewnątrz endosomów

[Na podstawie: Harper D., Viruses: Biology, Applications and Control. Garland Science, London 2011]

Na drodze fuzji wnikają np. retrowirusy (HIV) i herpeswirusy. Większość wirusów wykorzystuje jednak mechanizmy komórkowe i wnika do komórki na drodze endocytozy. Związanie wirusa z odpowiednim receptorem na powierzchni komórki indukuje sygnalizację komórkową, co prowadzi do powstania wgłębienia w błonie komórkowej i utworzenie pęcherzyka endocytarnego, który wewnątrz komórki przekształca się w endosom. W endosomach często dochodzi do odpłaszczenia cząstek wirusowych, a następnie nukleokapsyd wirusa lub jego materiał genetyczny są uwalniane do cytoplazmy. Mechanizm tego procesu również zależy od tego czy wirus ma otoczkę białkowo-lipidową czy nie. Wirusy mające osłonkę, najczęściej uwalniają do cytoplazmy nukleokapsyd wirusa na drodze fuzji, do której dochodzi pomiędzy osłonką wirusową a błoną endosomalną wyzwalaną przez niskie pH wewnątrz endosomów. W procesie tym ważną rolę odgrywają peptydy fuzyjne występujące w glikoproteinach osłonki, których aktywność jest indukowana w wyniku zmian konformacyjnych pod wpływem niskiego pH w endosomie. W przypadku uwalniania z endosomów wirusów, które nie mają osłonki, oprócz niskiego pH ważną rolę odgrywa liza pęcherzyka endocytarnego lub tworzenie porów w błonie endosomów. Niskiego pH do penetracji nie wymagają m.in. pikornawirusy (takie jak wirus polio) i wirusy polioma (rys. 1.31).

Wirusy mogą korzystać nie z jednego, ale z wielu szlaków endocytarnych, aby efektywnie infekować komórki. Ze względu na różnice w wielkości pęcherzyków endocytarnych, w mechanizmie ich powstawania oraz rodzaju pobieranych cząstek można wyróżnić kilka rodzajów endocytozy: endocytozę zależną od klatryny, endocytozę zależną od kaweolin, makropinocytozę i fagocytozę. Najnowsze badania wykazały, że wirusy mogą wnikać również na drodze endocytozy niezależnej ani od klatryn, ani od kaweoli, np. wirus HPV16 (rys. 1.32).

Rys. 1.32. Różne szlaki endocytarne wykorzystywane przez wirusy, aby wniknąć do komórki

[Na podstawie: Słońska A., Cymerys J., Bańbura M.W., Mechanisms of endocytosis utilized by viruses during infection. Post Hig Med Dośw (online) 1,70:572–580, 2016]

W endocytozie zależnej od klatryn – CME (ang. clathrin-mediated endocytosis) niezbędna jest obecność klatryny – białka opłaszczającego i uczestniczącego w tworzeniu pęcherzyków endocytarnych – CCV (ang. clathrin-coated vesicles). W procesie tym wyróżniamy dwa etapy – błonowy oraz wewnątrzkomórkowy. W pierwszym etapie dochodzi do związania wirusa z odpowiednim receptorem na powierzchni komórki. Po utworzeniu kompleksów wirus-receptor następuje ich przegrupowanie i zagęszczenie w odpowiednich miejscach na błonie komórkowej, gdzie dochodzi również do nagromadzenia klatryny od strony cytoplazmy. W tych miejscach błona komórkowa ulega wpukleniu, które otacza kosz klatrynowy. Do powstania pęcherzyka opłaszczonego klatrynami niezbędna jest obecność transglutaminazy wspomagającej tworzenie agregatów kompleksów ligand-receptor, białek adapterowych (AP180, AP1-4, AP2), które są ważnymi elementami płaszcza klatrynowego oraz aktyny, dynaminy GTPazy kontrolujących wpuklenie błony i uwolnienie pęcherzyka do cytoplazmy. Na etapie wewnątrzkomórkowym zachodzi właściwa endocytoza. Uwolniony do cytoplazmy pęcherzyk ma średnicę 120 nm. Wewnątrz komórki dochodzi do rozpadu kosza klatrynowego i uwolnienia klatryny oraz białek adaptorowych. Pęcherzyk staje się endosomem wczesnym, za którego dalszy transport są odpowiedzialne mikrotubule, wzdłuż których przenoszony jest do aparatu Golgiego, skąd dalej jest transportowany do innych organelli komórkowych.

Endocytoza zależna od klatryny jest wykorzystywana m.in. przez: adenowirusy (AdV2, AdV5, ang. Adenovirus 2 i 5), wirusa grypy typu A (IAV, ang. Influenza A virus), wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV, ang. Vesicular stomatitis virus), wirusa gorączki lasu Semliki (SFV, ang. Semliki Forest virus).

Innym sposobem wnikania wirusów do komórki jest endocytoza zależna od kaweolin (ang. caveolin-mediated endocytosis). Kaweole to wpuklenia błony komórkowej o kształcie przypominającym kolby o średnicy 50 nm, zawierające cholesterol, glikosfingolipidy, transportery błonowe oraz cząsteczki sygnałowe. Ważną rolę w ich tworzeniu odgrywa niskocząsteczkowe białko kaweolina, która tworzy płaszcz wokół wpuklenia od strony cytoplazmy, stabilizuje je oraz determinuje ich wielkość i kształt. Bierze także udział w regulacji procesów sygnalizacji za pomocą jonów wapnia Ca2+. Endocytoza zależna od kaweolin ma związek z reorganizacją cytoszkieletu aktynowego oraz działaniem GTPazy, zwanej dynaminą. Współdziałanie szkieletu aktynowego oraz dynaminy powoduje powstanie małych pęcherzyków o średnicy 50–80 nm, które mogą się łączyć z endosomami wczesnymi i formować lizosomy lub ulegać fuzji tworząc kaweosomy dalej transportowane za pośrednictwem mikrotubul do miejsc przeznaczenia. W wyniku endocytozy zależnej od kaweolin do komórki wnikają wirusy bezotoczkowe, takie jak małpi wirus 40 (SV40, ang. Simian virus 40), enterowirusy: wirus Coxsackie B (ang. Coxsackie B virus) i wirus ECHO 1 (ang. Enteric cytopatic human orphan 1 virus) oraz poliomawirusy.

Makropinocytoza jest to nieswoisty sposób wchłaniania wewnątrzkomórkowego za pośrednictwem makropinosomów, w który aktywnie zaangażowany jest cytoszkielet aktynowy. W odróżnieniu od pinocytozy, w makropinocytozie pęcherzyki transportujące – makropinosomy są większe i mają średnicę od 100 nm nawet do 1 μm. Skład błony makropinosomu jest bardzo podobny do składu błony komórkowej, z tym że jest on dodatkowo wzbogacony swoistymi polifosfatydyloinozytolami i markerami tratw lipidowych. Poza aktyną, w formowaniu makropinosomów bierze udział Rho GTPaza, kinaza fosfatydyloinozytolu (PI3K), czynnik uczestniczący w ADP-rybozylacji białek (Arf6), białkowa kinaza serynowo-treoninowa (PAK1) i białka Rab (Rab5, Rab34), które aktywują białka składające filamenty aktynowe oraz wspomagające tworzenie wpuklenia w błonie komórkowej, w miejscu gdzie doszło do lokalnego zagęszczenia cząsteczek. Po uformowaniu makropinosomu jest on dalej transportowany z udziałem mikrotubul do wnętrza komórki.

Za pośrednictwem makropinocytozy do komórek wnikają: wirus krowianki (VACV, ang. Vaccinia virus), wirus Ebola (EBOV, ang. Ebola virus), ludzki wirus niedoboru odporności (HIV, ang. Human immunodeficiency virus) oraz adenowirus 3 (AdV3, ang. Adenovirus 3).

Mechanizmem, który wykorzystują wirusy, aby wniknąć do komórki jest również fagocytoza. Jest to proces polegający na wchłanianiu dużych nierozpuszczalnych cząstek o średnicy większej niż 0,5–1,0 μm. U ssaków, fagocytoza pełni główną rolę w nieswoistej (wrodzonej) odpowiedzi immunologicznej i zachodzi głównie w makrofagach, monocytach, komórkach dendrytycznych oraz neutrofilach w celu eliminacji komórek bakterii, grzybów czy pierwotniaków. Fagocytoza jest złożonym procesem wchłaniania składającym się z kilku etapów. W pierwszym etapie dochodzi do połączenia powierzchniowych receptorów komórki, zwanych receptorami rozpoznającymi wzorce patogena (PRRs, ang. pattern recognition receptors) z odpowiednimi ligandami (czynnikami zakaźnymi, komórkami czy cząsteczkami). Do PRRs należą m.in.: receptor Fc, CR3 (CD11b/CD18), receptor mannozy czy receptory typu Toll (ang. Toll like), dzięki którym możliwe jest rozpoznanie struktur – bakteryjnych (lipopolisacharydów, peptydoglikanu lub flageliny) oraz całych komórek bakterii nieopłaszczonych, jak i opłaszczonych przez np. przeciwciała. Po utworzeniu kompleksu receptor-ligand dalsze wnikanie zależy od cytoszkieletu aktynowego i wymaga aktywności białek wiążących aktynę (Arp2/3, dynaminy 2), białek regulujących wchłanianie (białek z rodziny Rho/GTPazy), kinaz (PI3K, Hck) oraz fosfolipazy C i cholesterolu. Zostaje uformowany pęcherzyk – fagosom, który następnie łączy się z lizosomem formując tym samym fagolizosom, w którym dochodzi do trawienia pobranych cząsteczek/mikroorganizmów.

Fagocytoza jest wykorzystywana przez wirusa opryszczki pospolitej (HSV, ang. Herpes simplex virus) i mimiwirusa pełzaka Acanathamoeba polyphaga (APMV, ang. Acanathamoeba polyphaga mimivirus).

1.8. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT WIRUSÓW

Endosomy są dla wirusów wygodnym i szybkim środkiem transportu przez błonę komórkową i cytoplazmę. Zapewniają im również ochronę przed układem immunologicznym gospodarza. Ma to szczególne znaczenie w przypadku wirusów, które replikują się w jądrze komórkowym.

Ważną rolę w transporcie wirusów dostarczanych do endosomów pełnią endosomalne pęcherzyki transportujące – ILV (ang. intraluminal vesicles), zwane pęcherzykami wewnątrzbłonowymi. ILV pączkują do światła endosomu, tworząc ciała wielopęcherzykowe – MVB (ang. multivesicular bodies), w ten sposób endosom wczesny przekształca się w endosom późny. W tworzeniu tych pęcherzyków, formowaniu ciał MVB i dojrzewaniu endosomów, uczestniczą kompleksy białek związanych z endosomami – ESCRT (ang. endosomal sorting complexes required for transport). Domeny cytoplazmatyczne białek transportowanych do pęcherzyków ILV są często monoubikwitynowane. Kompleksy ESCRT są zdolne do rozpoznania i wiązania się z monoubikwitynowanymi domenami sortowanych białek. Poznano kilka rodzajów kompleksów ESCRT: ESCRT0, ESCRTI, ESCRTII, ESCRTIII.

Pęcherzyki wewnątrzbłonowe ILV mogą być wykorzystywane przez niektóre wirusy jako bezpieczny środek transportu ich nukleokapsydów do odpowiednich miejsc w komórce, m.in. wirusa VSV (ang. Vesicular stomatitis virus) do obszarów okołojądrowych w celu dalszej replikacji ich materiału genetycznego.

Endosomy to dynamiczne organelle komórkowe, które kontrolują sortowanie białek w komórce. W procesie tym, oprócz ESCRT, które rozpoznają monoubikwitynowane białka i transportują je do degradacji, w lizosomach uczestniczą również inne kompleksy białkowe, m.in. Retromer i Retriwer, które są odpowiedzialne za kierowanie białek do błony komórkowej lub aparatów Golgiego. Kompleksy te mogą być wykorzystywane przez wirusy na każdym etapie cyklu replikacyjnego, również w ich transporcie wewnątrzkomórkowym. Przykładem jest wirus brodawczaka ludzkiego, którego małe białko kapsydu L2 wiąże się zarówno z kompleksem Retromer, jak i Retriwer, a oddziaływania te ułatwiają uwalnianie L2 z endosomów i wspomagają jego transport do jądra komórkowego.

Istotne znaczenie w transporcie wirusa w komórce odgrywa również cytoszkielet komórki. Filamenty aktynowe i mikrotubule wykorzystywane są na różnych etapach cyklu replikacyjnego wirusów. Poszczególne elementy cytoszkieletu uczestniczą w wewnątrzkomórkowym transporcie wirionów lub ich części składowych, zarówno do miejsca replikacji (w cytoplazmie lub jądrze komórkowym), jak i podczas uwalniania wirionów potomnych. Elementy wirusa w endosomach są transportowane z udziałem mikrotubul do wyspecjalizowanych struktur sortujących (głównie aparatu Golgiego), skąd dostarczany jest do miejsc przeznaczenia. Podczas zakażenia wirusowego może dojść do polimeryzacji lub fragmentacji włókien cytoszkieletu, możliwa jest również ich reorganizacja lub nawet całkowite zniszczenie.

1.9. SKŁADANIE I UWALNIANIE WIRIONÓW POTOMNYCH Z KOMÓRKI

Większość wirusów RNA replikuje się w cytozolu. Wirusy DNA natomiast, z wyjątkiem np. poxwirusów i irydowirusów, replikują się w jądrze komórkowym. Aby dostać się do jądra komórkowego wirusy muszą pokonać barierę, którą jest otoczka jądrowa. W otoczce jądrowej występują pory wielkości 25 nm, które umożliwiają wniknięcie do środka jądra tylko małych wirusów, takich jak np. parwowirusy. Większość wirusów przed dostaniem się do jądra ulega odpłaszczeniu i do jądra transportowany jest najczęściej tylko materiał genetyczny wirusa w towarzystwie białek wirusowych mających sygnał lokalizacji jądrowej. Niektóre wirusy, np. wirusy brodawczaka ludzkiego, mogą się dostać do jądra komórkowego tylko w czasie mitozy, kiedy to otoczka jądrowa ulega fragmentaryzacji. Takie wirusy nie mogą replikować się w komórkach, które się nie dzielą.

Po złożeniu nowych wirionów potomnych następuje ich uwalnianie z komórki. Wirusy bezotoczkowe zwykle uwalniają się po śmierci komórki i jej rozpadzie, na drodze lizy, natomiast wirusy osłonięte otoczką pączkują z komórki. Otoczka lipidowa wirusa jest pozyskiwana z błony komórki gospodarza.

Pęcherzyki wewnątrzbłonowe ILV mogą być nie tylko wykorzystywane przez wirusy jako bezpieczny środek transportu ich nukleokapsydów do odpowiednich miejsc w komórce, ale również brać udział w uwalnianiu wirusów z komórki na drodze pączkowania. W procesie uwalniania wirionów potomnych na drodze pączkowania ważną rolę odgrywają białka wchodzące w skład kompleksów ESCRT i domeny późne białek wirusowych. Domeny późne L (ang. late domain), występują w białkach strukturalnych wielu wirusów, m.in.: w poliproteinie Gag retrowirusów, białkach macierzy rabdowirusów, filowirusów, ortomyksowirusów, a także w białkach niestrukturalnych (NS3) wirusów BV (ang. Bluetongue virus). Mutacje w nich blokują uwalnianie wirionów potomnych z komórki na późnym etapie cyklu replikacyjnego wirusa (stąd nazwa domeny późne). Cechą charakterystyczną tych domen są zachowawcze motywy aminokwasowe: Pro-(Thr/Ser)-Ala-Pro (PTAP), Pro-Pro-Xaa-Tyr (PPXY), gdzie Xaa jest zwykle proliną, Tyr-Xaa-Xaa-Leu (YXXL), Leu-Xaa-Xaa-Leu-Phe (LXXLF), oddziałujących z białkami komórkowymi.

Jednym z najlepiej poznanych składników kompleksu ESCRT jest białko TSG101, które wchodzi w skład ESCRTI, wpływa na morfologię wczesnych endosomów. Jego brak powoduje zakłócenie w formowaniu ciał wielopęcherzykowych i wewnątrzkomórkowym transporcie. TSG101 ma zdolność wiązania się z motywami Pro(Ser/Thr)Ala-Pro (PTAP) i może brać udział w uwalnianiu z komórki na drodze pączkowania, takich wirusów jak m.in.: wirus 1 Ebola, wirus mięsaka Rousa (RSV, ang. Rous sarcoma virus), wirus choroby niebieskiego języka (BV, ang. Bluetonge virus), ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1, ang. Human immunodeficiency virus 1). Jest to kolejny przykład, pokazujący w jaki sposób wirusy potrafią wykorzystać istniejące mechanizmy komórkowe, m.in. tworzenie ciał wielopęcherzykowych i dojrzewanie endosomów w swoim cyklu replikacyjnym.

Tworzenie się i rozprzestrzenianie nowych zakaźnych cząstek wirusowych wymaga przejęcia kontroli nad maszynerią komórki gospodarza. Najnowsze badania wykazały, że wirusy w procesie składania wirionów potomnych korzystają również z innych kompleksów odpowiedzialnych za sortowanie białek w komórce, m.in. z Retromeru. Przykładem, m.in. może być wirus HIV, którego glikoproteina otoczki wirusa Env bezpośrednio oddziałuje z kompleksem Retromer, co wpływa na prawidłowe składanie wirionów potomnych w błonie komórkowej.

Warto zauważyć, że wirusy są często wykorzystywane jako model do badania różnych szlaków transportu endocytarnego. Badania mechanizmów wnikania wirusów do komórki pozwoliło na lepsze poznanie i zrozumienie maszynerii endocytarnej komórki. Przykładem jest tu wirus zapalenia wątroby typu C (HCV). Do niedawana uważano, że cząstki potomne HCV są uwalniane z komórki przez kanoniczną drogę wydzielniczą: z retikulum endoplazmatycznego (ER), przez aparat Golgiego do błony plazmatycznej. Najnowsze badania wykazały jednak, że wirus HCV może uwalniać się z komórki wykorzystując transport z ER do endosomu, autofagię sekrecyjną, a także słabo opisane mechanizmy niekonwencjonalnego wydzielania białek, które dzięki dalszym badaniom nad wirusem HCV mogą zostać lepiej wyjaśnione.

1.10. PRZEBIEG CYKLI REPLIKACYJNYCH WIRUSÓW

Anna Goździcka-Józefiak, Jakub Barylski

Przebieg cyklu replikacyjnego wirusów jest uzależniony nie tylko od „rozpoznania” przez wirusa i wniknięcia do odpowiedniej komórki, ale również od czynników komórkowych (enzymów, czynników transkrypcyjnych) niezbędnych do regulacji ekspresji wirusowych genów. Komórki, w których wirusowe geny ulegają prawidłowej ekspresji i możliwe jest przeprowadzenie wszystkich etapów cyklu życiowego wirusów, kończącego się wytworzeniem cząstek potomnych, nazywamy komórkami permisywnymi, a cykl replikacyjny – cyklem produktywnym. Liczba komórek permisywnych dla niektórych wirusów jest bardzo ograniczona, np. replikacja wirusa zapalenia wątroby typu B jest ograniczona do hepatocytów. Z kolei, niektóre wirusy mogą się w pełni replikować zarówno w komórkach roślinnych, jak i owadzich, np. wirus owadzi FHV (ang. Flock house virus) wyizolowany z chrząszcza Costelytra zealandica może replikować się w komórkach licznej grupy roślin. Rozpoczęcie cyklu replikacyjnego niektórych wirusów zależy od określonej fazy cyklu komórkowego, np. retrowirusy wymagają komórek w fazie M (mitozy), parwowirusy – w fazie S (syntezy).

W komórkach permisywnych wirusy najczęściej namnażają się bardzo intensywnie, co prowadzi do lizy komórki. Cykl taki nazywamy cyklem litycznym. Wiriony potomne powstają także podczas cyklu chronicznego, jednak z tą różnicą, że ich namnażanie nie prowadzi do lizy komórki gospodarza. Wiriony są okresowo „wypączkowywane” lub „wytłaczane” z wnętrza komórki. Należy jednak pamiętać, że namnażanie wirionów potomnych jest dla komórki niekorzystne i wiąże się z dużym wydatkiem energetycznym. Ponadto, obniża żywotność komórki, a w przypadku organizmów jednokomórkowych – jej zdolność do przetrwania i namnożenia się w środowisku.

Komórkami niepermisywnymi nazywamy takie komórki, w których wirusy nie tworzą wirionów potomnych, ponieważ ich cykl replikacyjny jest zahamowany na jednym z etapów pośrednich. Najczęściej przyczyną tego jest brak określonych czynników komórkowych niezbędnych do transkrypcji wirusowych genów. Sytuacja taka może okazać się niekorzystna zarówno dla komórki, jak i wirusa. Na przykład, obecność w komórce niepermisywnej, eukariotycznej obcego wirusowego DNA może doprowadzić do jego rekombinacji z DNA komórkowym, transformacji oraz inicjacji procesu nowotworowego (patrz rozdz. 4.5). Niektóre wirusy mogą integrować swój materiał z genomem komórkowym w sposób uprawniony, jak np. bakteriofag lambda, czy AAV. Zintegrowany z genomowym DNA wirusowy genom (prowirus) jest replikowany z komórkowym DNA i podczas podziału przekazywany do komórek potomnych. W takim przypadku nie są wytwarzane wirusowe cząstki potomne, ale informacja do ich syntezy jest zachowana i przechowywana w komórkach. Cykl taki nosi nazwę cyklu lizogennego (rys. 1.33), często spotykanego u bakteriofagów. Jeśli fag jest zdolny do lizogenii, to po wniknięciu do cytoplazmy następuje tzw. „moment wyboru”. W zależności od stanu fizjologicznego komórki (ilości substancji odżywczych, obecności czynników stresowych itp.) wirus albo inicjuje cykl lityczny, albo wchodzi na drogę lizogenii. Jeżeli „wybierze” tę ostatnią ścieżkę, wówczas integruje swój genom z genomem gospodarza. Reakcja integracji katalizowana jest przez fagowe białka nazywane integrazami. W proces ten zaangażowane są także białka komórkowe. Ekspresja genów odpowiedzialnych za cykl lityczny bakteriofaga hamowana jest przez odpowiednie białka regulatorowe. Stan taki nazywa się represją, a częściowo „uśpiony” genom faga to profag. W komórce może on pozostawać niemal nieograniczony czas, jednak niekiedy może dojść do zniesienia represji, czyli indukcji profaga, wycięcia z genomu komórkowego i powrotu na drogę cyklu litycznego. Może to nastąpić np. pod wpływem stresów środowiskowych działających na bakterię. Czynniki regulujące ten proces są przedstawione w rozdz. 7.1 i 7.2.

Rys 1.33. Przebieg cykli replikacyjnych na przykładzie wirusów bakteryjnych. Cykl lityczny i lizogenny: 1 – adsorpcja wirusa, 2 – penetracja materiału genetycznego do wnętrza komórki, 3 – replikacja genomu wirusa, 4 – składanie wirionów potomnych, 5 – liza (śmierć) komórki gospodarza, 6 – integracja genomu fagowego z genomem gospodarza, 7,8 – podział komórki, 9 – indukcja prowirusa i przejście na drogę lityczną. Cykl chroniczny: 10 – adsorpcja wirusa, 11 – penetracja materiału genetycznego do wnętrza komórki, 12 – replikacja genomu wirusa, 13 – składanie wirionów potomnych, 14 – eksport wirionów potomnych bez lizy komórki gospodarza

[Na podstawie: Bauman R.W., Machunis-Masuoka E., Cosby C.D., Microbiology with diseases by body system. Pearson, San Francisco 2012]

Niektóre wirusy eukariontów wykazują zdolność do wchodzenia w stan latencji. W stanie tym w komórce znajduje się cały genom wirusa, ale ekspresja jego genów jest bardzo ograniczona, przede wszystkim do syntezy białek, które ten stan utrzymują. Przypomina to lizogenię u bakteriofagów. W trakcie latencji nie są wytwarzane cząstki potomne wirusa. W określonych warunkach może jednak dojść do uaktywnienia wirusa (reaktywacji), pełnej ekspresji wirusowych genów i wytworzenia wirionów potomnych (zakażenie produktywne). Latencja stanowi zjawisko swoiste komórkowo. Wirus jest w stanie latentnym tylko w komórkach określonych typów (np. wirus herpes wchodzi w ten stan w komórkach niedzielących się takich jak neurony). Ponadto, za zakażenie latentne uznawane jest takie, które utrzymuje się mimo działania układu odpornościowego gospodarza oraz innych niekorzystnych czynników w środowisku komórki.

1.11. PRZEBIEG ZAKAŻEŃ WIRUSOWYCH U ORGANIZMÓW WIELOKOMÓRKOWYCH

Anna Goździcka-Józefiak

W zakażeniach wirusowych organizmów wielokomórkowych obserwuje się często dwie jego fazy. Faza pierwsza zakażenia jest związana z namnażaniem się wirusa w komórkach w miejscu jego wniknięcia (pierwotne ognisko zakażenia), po czym namnożone cząstki wirusowe przedostają się do komórek sąsiednich lub wnikają, np. u człowieka do naczyń chłonnych, bądź śródbłonka naczyń włosowatych, a następnie do krwiobiegu. Rozpoczyna się wiremia. Z krwią wirusy przedostają się do komórek narządów, względem których wykazują niekiedy większe powinowactwo, aniżeli do komórek w pierwotnym ognisku zakażenia. Z tego powodu istnieje umowny, kliniczny podział wirusów na:

■ pneumotropowe – wywołujące zakażenia dróg oddechowych (np. wirus grypy);

■ dermotropowe – powodujące zakażenia skóry i błon śluzowych (np. wirus herpes);

■ neurotropowe – sprawiające zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (np. wirus wścieklizny);

■ enterotropowe – namnażające się w komórkach jelit i wywołujące zakażenia szeregu narządów wewnętrznych;

■ pantropowe – powodujące zakażenia całego organizmu (np. wirus odry, świnki);

■ onkogenne – wywołujące powstawanie nowotworów (np. wirusy brodawczaka).

Podział ten nie jest doskonały, ponieważ niektóre wirusy mogą zakażać komórki skóry i nabłonka, jak również ośrodkowego układu nerwowego (np. wirusy herpes).

Stan wiremii zależy od stanu układu odpornościowego zakażonego. Zwykle krążące w krwiobiegu przeciwciała starają się wirusy zneutralizować. Przy braku przeciwciał dochodzi do zakażenia komórek wrażliwego narządu, co prowadzi do degeneracji i martwicy komórek, uszkodzenia tkanek i związanych z tym objawów choroby. Sprzyja to innym zakażeniom, np. bakteryjnym.

Obecność wirusów w ustroju działa toksycznie na organizm. Związane jest to przede wszystkim z toksycznym działaniem białek wirionów.

1.12. SPOSOBY PRZENOSZENIA WIRUSÓW

Wirusy namnażane w komórkach bakteryjnych są uwalniane do środowiska gospodarza i dalszy ich los zależy od znalezienia odpowiedniej komórki, do której mogą się przyłączyć i zainicjować swój nowy cykl replikacyjny. U wirusów atakujących komórki organizmów wielokomórkowych (roślinnych, zwierzęcych) infekcja może rozprzestrzeniać się do komórek sąsiednich lub w miejsca odległe od pierwotnego źródła zakażenia, w czym uczestniczą płyny ustrojowe zwierząt i wiązki przewodzące u roślin. Niekiedy jest to związane z koniecznością znalezienia innego gospodarza wirusa. W takim przypadku wirusy mogą być także przenoszone przez wektory. W ten sposób przemieszczają się najczęściej wirusy roślinne, dla których wektorami są owady, nicienie lub grzyby pasożytnicze. Wirusy mogą przebywać w sporach grzybów od miesięcy do lat, aż nie znajdzie się nowy gospodarz. Wirusy roślinne mogą być także przenoszone w nasionach, bądź organach wegetatywnych roślin. Za pomocą wektorów, którymi mogą być owady: komary, muszki czy kleszcze, często w środowisku przenoszone są wirusy zwierzęce i ludzkie. Z kolei wiriony niektórych wirusów owadzich uwalniane są do środowiska w ciałach okludowanych (patrz rozdz. 3.13). Wirusy zwierzęce są także przenoszone drogą kontaktów bezpośrednich (jak np. transmisja horyzontalna), płciową, kropelkową lub z matki do dziecka poprzez łożysko czy mleko (transmisja wertykalna). Za pomocą wiatru czy wodami rzek wirusy mogą być niekiedy przenoszone na nowe znacznie odległe tereny. W ich transmisji pośredniczą zwierzęta i człowiek. Często związane jest to z migracją ptaków, podróżami ludzi, bądź eksportem zwierząt i roślin. Osobną drogę zakażeń ludzi, jak i zwierząt stanowią transfuzje krwi, zabiegi operacyjne, iniekcje.

Piśmiennictwo

Ackermann H.W., Berthiaume L., Tremblay M., Virus Life in Diagrams. CRC Press, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington 1998.

Albert F.G., Fox J.M., Young M.J., Virion Swelling Is Not Required for Cotranslational Disassembly of Cowpea Chlorotic Mottle Virus In Vitro. Journal of Virology 71, 6:4296–4299, 1977.

Amen M.A., Griffiths A., Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virrions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics 2, 81, 2011. https://doi.org/10.3389/fgene.2011.00081

Bauman R.W., Machunis-Masuoka E., Cosby C.D., Microbiology with diseases by body system. Pearson, San Francisco 2012.

Bunz M., Ritter M., Schindler M., HCV egress – unconventional secretion of assembled viral particles. Trends Microbiol. 2:S0966–842X(21)00190–6, 2021 Sept.

Cann A.J., Principles of Molecular Virology, ed. 5. Academic Press, San Diego, USA 2012.

Carter J., Saunders V., Virology: Principles and Applications, ed. 3. John Wiley & Sons Ltd., Chichester 2011.

Chen K.E., Healy M.D., Collins B.M., Towards a molecular understanding of endosomal trafficking by Retromer and Retriever. Traffic 20(7):465–478, 2019 Jul. doi: 10.1111/tra.12649. PMID: 30993794.

Darcy-Tripier F., Nermut M.V., Braunwald J., Williams L., The organization of frog virus 3 as revealed by freeze-etching. Virology 138(2):287–299, 1984.

Dimmock N.J., Easton A.J., Leppard K.N., Introduction to Modern Virology, ed. 7. Wiley-Blackwell, Oxford 2016.

Dimmock N.J., Primrose S.B., Introduction to Modern Virology, ed. 4. Blackwell Science Ltd., Oxford 1998.

Ducani C., Bernardinelli G., Hogberg B., Rolling circle replication requires single-stranded DNA binding protein to avoid termination and production of double-stranded DNA. Nucleic Acids Research 42, 16, 2014. doi: 10.1093/nar/gku737

Dulbecco R., Ginsberg H.S., Virology, ed. 2. JD Lippincott Company, Philadelphia 1980.

Everett R.D., The Spatial Organization of DNA Virus Genomes in the Nucleus. PLOS Phatogens 9, 6, 2013. e1003386. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003386

Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., Fundamental Virology, ed. 3. Lippincott-Raven, New York 1996.

Flint J., Racaniello V., Rall G., Skalka A.M., Principles of Virology, vol. 1. Molecular Biology, ed. 4. ASM Press, Washington 2015.

Goździcka-Józefiak A., Wirusologia molekularna. Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań 2004.

Grant J., Chen L., Quiñones-Parra S., Pang K., Kedzierska K., Chen W., T-Cell Immunity to Influenza A Viruses. Critical Reviews™ in Immunology 34(1):15–39, 2014.

Harper D., Viruses: Biology, Applications and Control. Garland Science, London 2011.

Hull R., Mathews Plant Virology, ed. 4. Academic Press, San Diego, USA 2002.

Izaguirre G., The Proteolytic Regulation of Virus Cell Entry by Furin and Other Proprotein Convertases. Viruses 9; 11(9):837, 2019 Sept.

Mahy B., van Regenmortel B., Desk Encyclopedia of Human and Medical Virology, ed. 4. Academic Press, Atlanta 2010.

Martinez-Salas E., Francisco-Velilla R., Fernandez-Chamorro J., Embarek A.M., Insights into Structural and Mechanistic Features of Viral IRES Elements. Front Microbiol 2018. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02629

McNally K.E., Cullen P.J., Endosomal Retrieval of Cargo: Retromer Is Not Alone. Trends Cell Biol. 28(10):807–822, 2018 Oct. doi: 10.1016/j.tcb.2018.06.005. Epub 2018 Jul 30. PMID: 30072228.

Mercer J., Schelhaas M., Helenius A., Virus entry by endocytosis. Annu Rev Biochem 79:803–833, 2010.

Ni J.T., Zhou X., McCarty D.M., In Vitro Replication of Adeno-Associated Virus DNA. Virology of Journal 68(2):1128–1138, 1994.

Ortin J., Martin-Benito J., The RNA synthesis machinery of negative-stranded RNA. Viruses of Virology 479–480, 532–544, 2015.

Picard-Jean F., Tremblay-Letourneau M., Serra E., Dimech Ch., Schulz H., Anselin M., Dutilly V., Bisailon M., RNA 5’-end Maturation: A crucial Step in the Replication of Viral Genomes, Biochemistry, Genetics and Molecular Biology. In: Current Issues in Molecular Virology – Viral Genetics and Biotechnological Applications, ed. Victor Romanowski. IntechOpen, Wisconsin 2013.

Rivika B., Replication and Synthesis of Nucleic Acids. Macromolecules. http://www.biologydiscussion.com/acids/nucleic-acid/replication-and-synthesis-of-nucleic-acids-macromolecules/35872

Ryu W.S, Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. Academic Press, Elsevier, San Diego, USA 2017.

Schelhaas M., Come in and take your coat off – how host cells provide endocytosis for virus entry. Cell Microbiol 12, 10:1378–1388, 2010.

Schmidt M., Speiseder T., Dobner T., Gonzales R.A., DNA Virus Replication Compartments. Journal of Virology 88, 1404–1420, 2014.

Seidah N.G., Pasquato A., Andréo U. How, Do Enveloped Viruses Exploit the Secretory Proprotein Convertases to Regulate Infectivity and Spread? Viruses 13, 1229, 2021.

Semler B.L., Poliovirus proves IRES-istible in vivo. J Clin Invest 113(12):1678–1681, 2004. https://doi.org/10.1172/JCI22139.

Słońska A., Cymerys J., Bańbura M.W., Mechanisms of endocytosis utilized by viruses during infection. Post Hig Med Dośw (online) 1, 70:572–580, 2016.

Tao Y.J., Ye Q., RNA Virus Replication Complexes. PLOS Pathogens 6, 2010. e1000943. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000943.2010.

Yamauchi Y., Helenius A., Virus entry at a glance. J Cell Sci 126, 6:1289–1295, 2013.

https://www.crick.ac.uk/research/worldwide-influenza-centre/

https://www.projectinform.org/glossary/hiv-structure-function/

https://www.researchgate.net/publication/260440310

https://www.quantamagazine.org/tag/viruses/Hints of Life’s Start Found in a Giant Virus by Arnold C.