Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Zdjęcie na okładce: berya113/123RF

Wydawca: Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji: Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta: Mieczysława Kompanowska

Produkcja: Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN

Weronika Panecka / Woblink

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2020

ISBN 978-83-01-20979-7

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2020 r., (wyd. I)

Warszawa 2020

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Spis treści

1. Krótka historia mikrobiologii przemysłowej

1.1. Wprowadzenie

1.2. Ery rozwoju mikrobiologii przemysłowej

1.2.1. Era przedpasteurowska (przed 1865 r.)

1.2.2. Era Pasteura (lata 1850–1890)

1.2.3. Era rozwoju biochemii i nowych produktów (lata 1890–1940)

1.2.4. Era antybiotyków (lata 1940–1960)

1.2.5. Era postantybiotykowa (lata 1960–1975)

1.2.6. Era nowej biotechnologii (po 1975 r.)

1.3. Główne procesy w mikrobiologii przemysłowej

1.3.1. Upstream processes

1.3.2. Procesy fermentacji

1.3.3. Downstream processes

1.3.4. Skale hodowli mikroorganizmów

1.3.5. Skala produkcji przemysłowej zależna od parametrów fermentacji

1.4. Bioaktywne związki pozyskiwane z organizmów

Literatura rekomendowana

2. Ulepszanie mikroorganizmów przemysłowych

2.1.Wprowadzenie

2.2.Metabolity produkowane przez mikroorganizmy

2.2.1. Metabolity pierwotne

2.2.2. Metabolity wtórne

2.3.Mikroorganizmy stosowane w mikrobiologii przemysłowej

2.3.1. Bakterie

2.3.2. Drożdże

2.3.3. Grzyby strzępkowe

2.4.Izolacja mikroorganizmów przemysłowych

2.5.Ważniejsze kolekcje szczepów

2.6.Cechy szczepów przemysłowych

2.7.Manipulacje genetyczne mikroorganizmów

2.7.1. Mutacje

2.7.2. Fuzja protoplastów

2.7.3. Klonowanie genów

2.7.4. Protokół pozyskania szczepu przemysłowego

2.7.5. Rekombinacja genetyczna

2.7.6. Metoda CRISPR/Cas

2.7.7. Inżynieria metaboliczna

2.8.Przechowywanie szczepów przemysłowych

2.8.1. Skosy/słupki agarowe

2.8.2. Przechowywanie szczepów w temperaturach ujemnych

2.8.3. Przechowywanie szczepów w szklanych kulkach

2.8.4. Szczepy liofilizowane

Literatura rekomendowana

3. Hodowle mikroorganizmów przemysłowych

3.1.Wprowadzenie

3.2.Hodowle okresowe

3.3.Hodowle okresowe z zasilaniem

3.4.Hodowle (fermentacje) ciągłe

3.5.Hodowle ciągłe z recyklingiem biomasy

3.6.Fermentacje

3.6.1. Fermentacja powierzchniowa w podłożu stałym (SSF)

3.6.2. Substraty stałe

3.6.3. Bioreaktory SSF

3.7.Fermentacja wgłębna (SmF)

3.7.1. Bioreaktory SmF

3.8.Wydajności w procesie fermentacji

3.8.1. Produktywność

3.8.2. Intensyfikacja fermentacji

3.8.3. Naturalne fermentacje zbóż

Literatura rekomendowana

4. Bakterie „workhorse” stosowane w mikrobiologii przemysłowej

4.1.Wprowadzenie

4.2.Escherichia coli

4.3.Corynebacterium glutamicum

4.4.Bacillus subtilis

4.5.Bacillus licheniformis

4.6.Pseudomonas putida

4.7.Vibrio natriegens

Literatura rekomendowana

5. Drożdże „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

5.1.Wprowadzenie

5.2.Enzymy spożywcze i paszowe produkowane przez drożdże

5.3.Metabolity produkowane przez drożdże

5.4.Katalityczne właściwości drożdży

5.5.Biofarmaceutyki produkowane przez drożdże

5.6.Inżynieria metaboliczna w Saccharomyces cerevisiae

5.7.Drożdże kumulujące oleje

5.8.Drożdże w strefie klimatu okołobiegunowego

5.9.Zastosowanie drożdży w przechowalniach płodów rolnych

5.10.Zastosowanie drożdży w środowisku

5.11.Saccharomyces cerevisiae

5.11.1. Produkcja chemikaliów

5.11.2. Kwas bursztynowy

5.11.3. Kwas itakonowy

5.11.4. Kwas 3-hydroksypropionowy

5.11.5. Kwas mlekowy

5.11.6. Produkcja wysokowartościowych związków chemicznych

5.12.Kluyveromyces lactis

5.13.Yarrowia lipolytica

5.14.Pichia pastoris

5.15.Hansenula polymorpha

5.16.Podsumowanie

Literatura rekomendowana

6. Grzyby strzępkowe jako „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

6.1.Wprowadzenie

6.2. Przykłady „workhorse” wśród grzybów strzępkowych

6.2.1. Aspergillus niger

6.2.2. Aspergillus oryzae

6.2.3. Aspergillus terreus

6.2.4. Aspergillus flavus

6.2.5. Aspergillus carbonarius

6.2.6. Penicillium chrysogenum

6.2.7. Trichoderma reesei

6.3.Znaczenie grzybów strzępkowych

Literatura rekomendowana

7. Enzymy produkowane w skali przemysłowej przez mikroorganizmy

7.1.Wprowadzenie

7.2.Enzymy produkowane przez mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

7.2.1. Oksydoreduktazy (EC1)

7.2.2. Hydrolazy (EC3)

7.2.3. Izomerazy

7.2.4. Liaza

7.3.Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych

7.3.1. Przemysł piekarniczy

7.3.2. Przemysł mleczarski

7.3.3. Produkcja napojów

7.3.4. Przemysł spożywczy

7.3.5. Przemysł paszowy

7.3.6. Przemysł farmaceutyczny i analityczny

7.3.7. Przemysł polimerowy

7.3.8. Przemysł papierniczy i celulozowy

7.3.9. Przemysł skórzany

7.3.10. Przemysł włókienniczy

7.3.11. Enzymy w kosmetykach

7.3.12. Enzymy w detergentach

7.3.13. Przemysł syntezy organicznej

7.3.14. Enzymy w oczyszczaniu ścieków

7.3.15. Inne gałęzie przemysłu

7.4.Podsumowanie

Literatura rekomendowana

8. Mikrobiologiczna produkcja napojów alkoholowych

8.1.Wprowadzenie

8.2.Związki organiczne obecne w napojach alkoholowych

8.3.Zanieczyszczenia w napojach alkoholowych

8.4.Produkcja piwa

8.4.1. Wprowadzenie

8.4.2. Rodzaje piwa

8.4.3. Szczepy stosowane do produkcji piwa

8.4.4. Jakościowy skład chemiczny piwa

8.5.Produkcja wina

8.5.1. Wprowadzenie

8.5.2. Szampan i wina musujące

8.5.3. Wina korzenne (wermuty), słodkie likiery i miody pitne

8.5.4. Fermentacja wina

8.6.Alkohole spirytusowe

8.6.1. Whisky

8.6.2. Rum

8.6.3. Winiaki

8.6.4. Pisco

8.6.5. Cachaça

8.6.6. Tequila

8.7.Wódki

8.8.Inne alkohole

8.9.Związki chemiczne w alkoholach

8.10. Niekonwencjonalna produkcja wyrobów alkoholowych

Literatura rekomendowana

9. Mikrobiologiczna produkcja rozpuszczalników

9.1.Wprowadzenie

9.2.Globalna produkcja etanolu

9.2.1. Biochemia fermentacji alkoholowej

9.2.2. Fermentacja alkoholowa prowadzona przez Saccharomyces cerevisiae

9.2.3. Fermentacja etanolowa prowadzona przez bakterie

9.2.4. Czynniki wpływające na produkcję etanolu

9.2.5. Surowce stosowane do mikrobiologicznej produkcji alkoholi

9.3.Mikrobiologiczna produkcja glicerolu

9.4.Fermentacja aceton–butanol–etanol (ABE)

9.4.1. Szlak produkcji 1-butanolu i izobutanolu

9.4.2. Produkcja 1-butanolu z biomasy celulozowej

Literatura rekomendowana

10. Mikrobiologiczna produkcja kwasów organicznych

10.1.Wprowadzenie

10.2. Kwas cytrynowy (C6H8O7)

10.2.1. Podstawy fermentacji kwasu cytrynowego

10.2.2. Natywne mikroorganizmy zdolne do produkcji kwasu cytrynowego

10.2.3. Surowce stosowane w fermentacji kwasu cytrynowego

10.2.4. Produkcja kwasu cytrynowego w hodowlach Aspergillus niger

10.2.5. Produkcja kwasu cytrynowego z zastosowaniem drożdży

10.2.6. Odzyskiwanie produktu fermentacji

10.2.7. Zastosowanie kwasu cytrynowego

10.3. Kwas mlekowy

10.3.1. Inżynieria genetyczna mikroorganizmów produkujących kwas mlekowy

10.3.2. Warunki produkcji kwasu mlekowego w procesie fermentacji

10.3.3. Rola hodowli bakteryjnych w produkcji kwasu mlekowego

10.3.4. Optymalizacja procesu fermentacji mlekowej

10.3.5. Oczyszczanie kwasu mlekowego

10.4.Kwas itakonowy (IA)

10.4.1. Inżynieria metaboliczna kwasu itakonowego Aspergillus terreus i Aspergillus niger

10.4.2. Zoptymalizowane warunki hodowli Aspergillus terreus DSM 23081

10.4.3. Zastosowanie kwasu itakonowego

10.5.Kwas octowy

10.5.1. Systemy produkcji kwasu octowego

10.5.2. Bakterie kwasu octowego

10.5.3. Skład chemiczny i jakość octu

10.5.4. Procesy starzenia octu

10.5.5. Ocena jakości produkowanego octu

10.6.Kwas glukonowy (GA)

10.7.Kwas bursztynowy

10.8.Inne kwasy organiczne

Literatura rekomendowana

11. Mikrobiologiczna produkcja aminokwasów

11.1.Wprowadzenie

11.2.Metody pozyskiwania aminokwasów

11.2.1. Ekstrakcja aminokwasów z hydrolizatów białkowych

11.2.2. Chemiczna synteza aminokwasów

11.2.3. Mikrobiologiczna produkcja aminokwasów

11.3.Procesy fermentacji związane z produkcją aminokwasów

11.3.1. Bakterie produkujące aminokwasy

11.3.2. Corynebacterium – „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

11.3.3. Pozyskiwanie i wykorzystanie substratu węglowego

11.3.4. Metabolizm azotu

11.3.5. Metabolizm fosforu

11.3.6. Metabolizm siarki

11.3.7. Przemysłowa produkcja L-lizyny w aspekcie historycznym

11.3.8. Produkcja L-lizyny przez genomy szczepów Corynebacterium glutamicum

11.3.9. Szlak syntezy L-lizyny przez Corynebacterium glutamicum

11.3.10. Maksymalna wydajność produkcji lizyny w hodowlach Corynebacterium glutamicum

11.3.11. Inżynieria metaboliczna w Corynebacterium glutamicum

11.3.12. Inżynieria metaboliczna w produkcji NADPH

11.3.13. Kwas glutaminowy produkowany przez Corynebacterium glutamicum

11.3.14. Biosynteza kwasu glutaminowego przez Corynebacterium glutamicum

11.3.15. Produkcja przemysłowa kwasu glutaminowego

11.3.16. Zastosowanie przemysłowe i rola terapeutyczna kwasu glutaminowego

Literatura rekomendowana

12. Mikrobiologiczna produkcja antybiotyków

12.1.Wprowadzenie

12.2.Podstawowa lista dziesięciu typów antybiotyków

12.2.1. Penicyliny

12.2.2. Tetracykliny

12.2.3. Cefalosporyny

12.2.4. Chinolony

12.2.5. Linkomycyny

12.2.6. Makrolidy

12.2.7. Sulfonamidy

12.2.8. Glikopeptydy

12.2.9. Aminoglikozydy

12.2.10. Karbapenemy

12.3.Przemysłowa produkcja penicylin, cefalosporyn i cefamycyny

12.3.1. Przemysłowa produkcja penicyliny

12.3.2. Półsyntetyczne β-laktamy

12.4.Streptomycyna

12.4.1. Mechanizm działania streptomycyny

12.4.2. Produkcja streptomycyny

12.4.3. Odzyskiwanie streptomycyny

Literatura rekomendowana

13. Mikrobiologiczna produkcja witamin i prowitamin

13.1.Wprowadzenie

13.2.Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

13.2.1. Witamina A i prowitamina A

13.2.2. Witamina D

13.2.3. Witamina E

13.2.4. Witamina K

13.3.Witaminy rozpuszczalne w wodzie

13.3.1. Witamina B1

13.3.2. Witamina B2

13.3.3. Witamina B3

13.3.4. Witamina B5

13.3.5. Witamina B6

13.3.6. Witamina B7

13.3.7. Witamina B9

13.3.8. Witamina B12

13.4.Kwas askorbinowy

13.4.1. Szlaki syntezy kwasu askorbinowego

Literatura rekomendowana

14. Pigmenty produkowane przez mikroorganizmy

14.1.Wprowadzenie

14.2.Barwniki syntetyczne a naturalne pigmenty

14.3.Pozyskiwanie mikroorganizmów produkujących pigmenty

14.4.Nowatorskie strategie wzmacniające produkcję pigmentów bakteryjnych

14.5.Rodzaje pigmentów produkowanych przez mikroorganizmy

14.5.1. Pigmenty bakteryjne

14.5.2. Pigmenty grzybicze

14.6.Cechy pigmentów produkowanych przez mikroorganizmy

14.6.1. Pigmenty stosowane w przemyśle farmaceutycznym

14.6.2. Pigmenty jako barwniki stosowane w przemyśle włókienniczym

14.6.3. Pigmenty jako barwniki spożywcze

14.7.Lista pigmentów spożywczych

14.7.1. Pigmenty spożywcze bezpieczne dla zdrowia

14.7.2. Pigmenty spożywcze niebezpieczne dla zdrowia

14.7.3. Barwniki spożywcze o zalecanej ostrożności

14.7.4. Barwniki spożywcze podejrzane

14.8.Pigmenty powszechnie produkowane na drodze mikrobiologicznej w skali przemysłowej

14.8.1. Karotenoidy

14.8.2. Melaniny

14.8.3. Prodigiozyna

14.8.4. Wiolaceina

14.8.5. Ryboflawina

14.8.6. Piocyjanina

14.9.Mikrobiologiczna produkcja karotenoidów na skalę przemysłową

14.9.1. Główne szlaki biosyntezy karotenoidów

14.9.2. Naturalne źródła karotenoidów

14.9.3. Pozyskiwanie pigmentów karotenoidowych po fermentacji

14.9.4. Przykłady pigmentów karotenoidowych, ich zastosowanie oraz aktywność biologiczna

14.10. Podsumowanie

Literatura rekomendowana

15. Polimery produkowane przez mikroorganizmy i ich zastosowanie

15.1.Wprowadzenie

15.2.Poliestry

15.2.1. Mikroorganizmy produkujące PHA

15.2.3. Produkcja PHA przez Cupriavidus necator

15.2.4. Produkcja PHA przez rekombinant Escherichia coli

15.2.5. Zastosowanie PHA

15.3.Poliamidy

15.3.1. Biosynteza mikrobiologiczna γ-PGA

15.3.2. Produkcja γ-PGA

15.4.Polisacharydy bakteryjne

15.4.1. Ksantan

15.4.2. Lewan

15.4.3. Pullulan

15.4.4. Dekstran

Literatura rekomendowana

1

Krótka historia mikrobiologii przemysłowej

1.1. Wprowadzenie

Początki mikrobiologii przemysłowej sięgają ponad 200 lat wstecz. W tym czasie następował rozwój tej dziedziny – od tajemniczych koncepcji po racjonalną naukę i technologię, z ogromnymi osiągnięciami społecznymi i medycznymi oraz wpływem komercyjnym. Mikrobiologia przemysłowa to komercyjna eksploatacja mikroorganizmów celem uzyskania różnych, ważnych dla człowieka produktów. Produkty mikrobiologiczne mają bezpośredni lub pośredni wpływ na wskaźniki ekonomiczne, środowiskowe oraz socjalne w społeczeństwach. Już od zarania cywilizacji mikroorganizmy wykorzystywano w produkcji przemysłowej wyrobów alkoholowych oraz przetworów mlecznych. Pierwsze badania dotyczące roli mikroorganizmów w procesach fermentacji prowadził Ludwik Pasteur w latach pięćdziesiątych XIX w. Badania te przyczyniły się do rozwoju metod pozyskiwania czystych szczepów i wykorzystywania ich do prowadzenia fermentacji.

W latach 30. ubiegłego wieku przypadkowe odkrycie penicyliny przez Alexandra Fleminga spowodowało wzrost znaczenia mikrobiologii przemysłowej w oczach ludzkości. Związek istotnych przemysłowo metabolitów z mikroorganizmami zrewolucjonizował przemysł do poszukiwania nowych mikroorganizmów, które produkują różnego rodzaju antybiotyki, enzymy, substancje antyrakowe itp. W związku z rozwojem biochemii, techniki ich izolacji i oczyszczania znacznie podniosły jakość pożądanych metabolitów. Lata 70. ubiegłego wieku to początek ery klonowania genów, które, jak się okazuje, jest bardzo ważne w pozyskiwaniu ulepszonych szczepów produkcyjnych. Techniki takie jak bezpośrednia mutageneza genomowego DNA, umożliwiają permanentne zmiany w genomach szczepów przemysłowych. Połączenie mikrobiologii, inżynierii biochemicznej i biologii molekularnej dało podstawy biotechnologii – nowej dyscyplinie naukowej, która kontynuuje zdobycze tych poprzednich. Dywersyfikacja powstała poprzez tworzenie subdyscyplin, takich jak genomika, transkryptomika, proteomika, analiza strumienia metabolicznego z analizą ilościową złożonych metabolitów, a inżynieria biochemiczna połączyła się w inżynierię biosystemów. W ostatniej dekadzie nastąpiło ponowne zrewolucjonizowanie mikrobiologii przemysłowej dzięki zastosowaniu systemu macierzy oraz bioinformatyki.

1.2. Ery rozwoju mikrobiologii przemysłowej

Częściowo kryterium podziału mikrobiologii przemysłowej na ery rozwoju są produkty, które pojawiały się w danym czasie, zwykle po raz pierwszy. Na ogół nowa fermentacja lub jej produkt nie pojawiały się od razu w doskonałej formie, lecz wymagały dalszych prac badawczych i rozwojowych. W zasadzie większość fermentacji przemysłowych jest wciąż udoskonalana, poszukuje się wciąż nowych szczepów, poddaje procesom ulepszania za pomocą różnych narzędzi biologii molekularnej, atrakcyjnych z biotechnologicznego punktu widzenia.

1.2.1. Era przedpasteurowska (przed 1865 r.)

Przed odkryciem Pasteura metodą fermentacji produkowano wyroby alkoholowe (piwo, wino), nabiał (sery, jogurt) oraz takie wyroby, jak ocet winny, nie znając ich mechanizmu. Produkcja wina, piwa i chleba była znana już u Sumerów 6000 lat temu, a w takich krajach jak Mezopotamia i Egipt stała się głównym źródłem dochodów podatkowych. Fermentację soi w Chinach prowadzono już 3500 lat przed naszą erą. Nawet obserwacje mikroskopowe „małych zwierzątek” prowadzone przez Leeuwenhoeka (lata 60. XIX w.) nie były kojarzone z faktem, że przyczyną fermentacji są mikroorganizmy. Dopiero w latach 1837–1848 Schwann i Latour niezależnie wykazali obecność drożdży w procesie fermentacji. Z ich obserwacji wynikało, że drożdże piwne są małymi kulistymi organizmami, zdolnymi do reprodukcji, ale nie stwierdzili, czy drożdże prowadzą proces fermentacji. Krążyły równolegle dwie teorie, że fermentacja wciąż jest konsekwencją „tajnej siły życiowej” albo procesem prowadzonym przez „siły chemiczne”.

1.2.2. Era Pasteura (lata 1850–1890)

Ludwik Pasteur ostatecznie odkrył tajemnicę fermentacji. W latach 50. XIX w. codziennie odwiedzał on fabrykę produkującą alkohol i pobierał próbki płynu fermentacyjnego do analizy w swoim laboratorium. W próbkach z produkcji alkoholu znajdował drożdże pączkujące, a w próbkach pobranych z fermentacji kwaśnej (zepsute wino) laseczki fermentujące, które produkowały kwas mlekowy, nadający nieprzyjemny smak wina. Pasteur szczegółowo zbadał fermentację kwasu mlekowego i opracował podstawy procesów fermentacyjnych oraz metody izolacji pojedynczych mikroorganizmów z hodowli w postaci czystych szczepów. W dyskusji wyników swoich badań Pasteur opisał:

1. 1) biologiczną koncepcję fermentacji jako wynik aktywności żywych mikroorganizmów;

2. 2) zasady szczepienia mikroorganizmami w celu rozpoczęcia niezawodnej fermentacji, która była również powszechną praktyką w fermentacji piwa;

3. 3) pojęcie swoistości, zgodnie z którym każdą fermentację można przypisać do określonego mikroorganizmu;

4. 4) niezbędne czynniki, które muszą być dostarczone mikroorganizmom w pożywce fermentacyjnej;

5. 5) specyficzne cechy chemiczne charakteryzujące główne produkty fermentacji.

W ten sposób Pasteur położył podwaliny pod nową dyscyplinę naukową, mikrobiologię, zwaną wówczas bakteriologią. Od tego czasu (koniec XIX w.) przemysł fermentacyjny szybko się rozwijał. Obejmował produkcję piwa i wina, alkoholu przemysłowego, drożdży, kwasu octowego i mlekowego, sera, sosu sojowego i sake. Produkcja piwa stanowiła jedną z najważniejszych działalności gospodarczych. Od tej pory także produkcja wina nabrała dużego znaczenia ekonomicznego, gdyż było ono smaczne, wolne od nadmiaru kwasu octowego i mlekowego. Rozpoczęła się fala powstawania fundacji i instytutów badawczych, głównie rządowych, zajmujących się badaniami nad produkcją piwa, wina i żywności, wody, a także higieną i opieką medyczną, oraz laboratoriów w przemyśle piwowarskim i piekarniczym, w Europie (Monachium, Berlin, Hohenhein, Paryż, Birmingham, Kopenhaga) oraz w USA (Uniwersytety: MIT, Cornell i Wisconsin).

1.2.3. Era rozwoju biochemii i nowych produktów (lata 1890–1940)

W tym czasie opracowano nowe technologie fermentacji przemysłowej produkcji etanolu, butanolu, acetonu i glicerolu, a także kilku kwasów organicznych: octowego, cytrynowego oraz mlekowego. Miały też miejsce badania struktury przestrzennej związków chemicznych, takich jak białka, cukry i tłuszcze, oraz badania dotyczące enzymów. I tak stwierdzono, że ekstrakt drożdżowy powstały na skutek dezintegracji komórek drożdży prowadzi proces fermentacji alkoholowej, w wyniku którego powstaje alkohol i ditlenek węgla. A ściślej, że proces ten prowadzą enzymy uwolnione z komórek. Odkrycie fermentacji wolnej od komórek, w okresie do 1930 r., stymulowało molekularne podejście do badania procesu fermentacji alkoholowej, głównie badań nad kolejnymi półproduktami metabolizmu. Wynikiem tych badań były opracowane ścieżki przebiegu procesu glikolizy prowadzonej przez różne mikroorganizmy, w tym wykrycie produktów pośrednich, takich jak kwasy: pirogronowy, octowy, bursztynowy. W tym czasie również pracowano nad innymi rodzajami fermentacji z produkcją acetonu i wyższych alkoholi, w tym butanolu, który po przekształceniu w butadien i jego polimeryzacji tworzył kauczuk syntetyczny. W okresie I wojny światowej proces fermentacji „aceton-butanol” wykorzystano do produkcji materiałów wybuchowych przy użyciu mikroorganizmów oraz surowców naturalnych (kukurydzy) jako podłoża fermentacyjnego. W czasie I wojny światowej produkowano duże ilości acetonu (w Anglii oraz Kanadzie) oraz glicerolu (w Niemczech). Równolegle podjęto prace nad mikrobiologiczną produkcją kwasów szczawiowego i cytrynowego przez gatunki Penicillium sp. i Aspergillus niger. Kolejnymi produktami wytwarzanymi na drodze fermentacji były kwas glukonowy i kwas mlekowy. Innym ważnym przykładem przemysłowej działalności badawczej było opracowanie technologii utleniania sorbitolu przez szczep Acetobacter jako związku pośredniego do produkcji witaminy C. Z kolei w latach 30. XX w. rozpoczęto wytwarzanie środka farmaceutycznego – L-efedryny –metodą fermentacji cukru przez drożdże w obecności benzaldehydu. Etanol nadal stanowił główny produkt o wyjątkowym znaczeniu gospodarczym.

Równolegle rozwijała się technologia enzymatyczna. Wiele enzymów, w tym diastazę (enzym amylolityczny), proteazy i pektynazy, wyizolowano z różnych organizmów do zastosowań komercyjnych, głównie z Bacillus subtilis oraz Aspergillus oryzae i Aspergillus niger. Już w 1894 r. Takamine uzyskał patent na produkcję preparatu enzymatycznego takadiastazy stosowanego do produkcji amylazy używanej do hydrolizy skrobi w produkcji żywności.

Przypadkowe wydarzenie w londyńskim laboratorium w 1928 r. zmieniło bieg medycyny. Alexander Fleming, bakteriolog ze szpitala St. Mary’s, po powrocie z wakacji, podczas rozmowy z kolegą zauważył na płytce agarowej strefę wokół inwazji grzyba, w której bakterie nie rosły. Stwierdził on, że grzyb Penicillium notatum hamuje rozwój chorobotwórczej bakterii Staphylococcus aureus. Wykazał, że substancja antybakteryjna powstaje w hodowli Penicillium i nazwał ją penicyliną. Stwierdził, że penicylina ma działanie antybakteryjne wobec gronkowca i innych patogenów Gram-dodatnich. Fleming opublikował swoje odkrycia w 1929 r. Oczyszczenie niestabilnego związku z ekstraktu grzyba okazało się jednak poza jego możliwościami. Przez dekadę nie poczyniono postępów w wyodrębnianiu penicyliny jako związku leczniczego. W tym czasie Fleming wysyłał swoją pleśń Penicillium każdemu, kto o nią poprosił, w nadziei, że ktoś może wyizolować z hodowli penicylinę do użytku klinicznego.

1.2.4. Era antybiotyków (lata 1940–1960)

W tym okresie opracowano i wdrożono w skali przemysłowej produkcję antybiotyków, w tym penicyliny i streptomycyny, oraz opracowano warunki transformacji i prowadzono transformacje steroidów przy udziale mikroorganizmów (kortyzonu, testosteronu, estrogenu).

Na Uniwersytecie w Oxfordzie, Ernst Chain znalazł artykuł Fleminga z 1929 r. na temat penicyliny i zaproponował swojemu przełożonemu, Howardowi Floreyowi, że spróbuje wyizolować penicylinę. Poprzednik Floreya, George Dreyer, napisał do Fleminga wcześniej list z prośbą o przesłanie próbki szczepu Penicillium, W 1939 r. Howard Florey zebrał zespół, w tym eksperta od grzybów, Normana Heatleya, który pracował nad hodowlą Penicillium spp. i Ernsta Chaina, który z powodzeniem oczyszczał penicylinę z ekstraktu. Florey nadzorował eksperymenty na zwierzętach. 25 maja 1939 r. grupa badaczy wstrzyknęła ośmiu myszom zjadliwy szczep Streptococcus pyogenes, a następnie czterem z nich penicylinę; pozostałe cztery myszy, którym nie wstrzyknięto penicyliny, trzymano jako kontrole. Wczesnym rankiem wszystkie myszy kontrolne były martwe, a wszystkie leczone – wciąż żyły. Chain nazwał wyniki „cudem”. Naukowcy opublikowali swoje odkrycia w „The Lancet” w sierpniu 1940 r., opisując wytwarzanie, oczyszczanie i eksperymentalne stosowanie penicyliny, która ma wystarczającą siłę działania, aby chronić zwierzęta zakażone przez Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus i Clostridium septique. Zespół z Oksfordu opublikował następnie wyniki swoich badań klinicznych w 1941 r. W tym czasie firmy farmaceutyczne w Wielkiej Brytanii nie były w stanie produkować masowo penicyliny ze względu na zobowiązania w II wojnie światowej. Florey w tej sytuacji zwrócił się do rządu Stanów Zjednoczonych o pomoc finansową. Władze Northern Regional Research Laboratory (NRRL) w Peoria, Illinois, USA wyraziły chęć finansowania przedsięwzięcia. Florey i Heatley dotarli do Peoria w stanie Illinois, aby spotkać się z Charlesem Thomem, głównym mikologiem amerykańskiego Departamentu Rolnictwa i Andrew Jacksonem Moyerem, dyrektorem północnego laboratorium badawczego Departamentu. Thom także rozpoznał rzadkość szczepu Penicilium notatum, ponieważ miał jeszcze tylko jeden inny szczep w swojej kolekcji 1000 szczepów Penicillium, który wytwarzał penicylinę. Od połowy 1941 r. wznowiono prace badawcze dotyczące penicyliny także w kilku innych ośrodkach naukowych, począwszy od poszukiwania szczepów, w tym zmutowanych, poprzez prowadzenie fermentacji i ekstrakcji produktu aż po suszenie i pakowanie preparatu. Wydajność syntezy penicyliny wzrosła z 3 (grupa Oksfordzka) do 24 j./ml. Wynikami tych prac zainteresował się Departament Rolnictwa USA oraz National Research Council i cztery firmy – Merck, Squibb, Pfizer i Lererle, a potem kilka następnych. Niesamowite właściwości lecznicze penicyliny stały się faktem, a zapotrzebowanie na nią było ogromne, ale głównym celem było wyprodukowanie takiej ilości jednostek penicyliny, aby możliwe było pokrycie zapotrzebowania na okres działań armii amerykańskiej w Europie wiosną 1944 r. Dalsze poszukiwania szczepów wysoko produktywnych przyniosły oczekiwane wyniki. Badanie przesiewowe i rozwój techniki w tym techniki mutacji, okazały się kluczowym czynnikiem sukcesu. Z wielu źródeł, w tym próbek gleby z całego świata, zebranych przez armię amerykańską, wyizolowano wiele setek szczepów producentów penicyliny. Najlepszym producentem penicyliny (oznaczonym jako NRRL 1951) było Penicillium chrysogenum izolowane ze spleśniałego melona kantalupa z rynku owoców Peoria, który po ulepszeniach produkował do 100 j./ml hodowli. Kolejny szczep z Wisconsin produkował już 1500 j./ml. Heatley pozostał w Peorii przez 6 miesięcy, aby pracować nad metodami hodowli szczepów Penicillium w skali przemysłowej. Florey udał się na wschód, by zainteresować rząd USA i firmy farmaceutyczne produkcją penicyliny. Bezprecedensowa współpraca Stanów Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii w zakresie produkcji penicyliny była niezwykle udana. W 1941 r. Stany Zjednoczone nie miały wystarczającej ilości penicyliny do leczenia jednego pacjenta. Pod koniec 1942 r. dostępna była wystarczająca ilość penicyliny do leczenia mniej niż 100 pacjentów. Jednak do września 1943 r. zapasy były wystarczające, by zaspokoić potrzeby sił zbrojnych aliantów. Wszystkie te eksperymenty prowadzono w hodowlach powierzchniowych (na podłożu zestalonym agarem). Znacznie lepsze wydajności penicyliny (około 140 000 razy) uzyskano w hodowlach płynnych (zanurzeniowych/głębinowych) z zastosowaniem namoku kukurydzianego, co sprawiło że wydajność penicyliny rosła wykładniczo, a głównym problemem była ekstrakcja i oczyszczanie penicyliny w układach ciecz–ciecz, a następnie liofilizacja i krystalizacja. Penicylina stała się własnością publiczną oraz wielkim biznesem.

Bardzo pozytywne skutki leczenia zakażeń bakteryjnych z zastosowaniem penicyliny doprowadziły do przyznania Flemingowi, Chainowi i Floreyowi Nagrody Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii w 1945 r. Penicylinę izolowano także z innych mikroorganizmów, co doprowadziło do powstania nowego terminu, antybiotyków. W latach 1940 i 1950 wyodrębniono streptomycynę, chloramfenikol, erytromycynę, wankomycynę i wiele innych.

Na tym etapie rozwijała się szeroko zakrojona mikrobiologiczna produkcja nie tylko tradycyjnych towarów, np. piwa, alkoholu, sera, ale także nowych produktów, w tym kwasu cytrynowego i farmaceutyków o szczególnie dużym znaczeniu społecznym i ekonomicznym. Znaczenie ekonomiczne wzrosło w szczególności dzięki sukcesowi produkcji penicyliny. Kolejne antybiotyki, takie jak streptomycyna, stały się ogólnodostępne, a także pojawiła się nowa klasa produktów o wysokiej wartości, głównie metabolitów wtórnych, np. steroidów uzyskanych metodą biotransformacji.

1.2.5. Era postantybiotykowa (lata 1960–1975)

W tym okresie pojawiły się inne ważne produkty fermentacji mikroorganizmów, o rosnącym znaczeniu rynkowym – aminokwasy (L-glutamina, L-lizyna), węglowodany i ich pochodne (hydrolizaty, izomery), witaminy, rozpuszczalniki i enzymy do nowych zastosowań. Nowa generacja biokatalizatorów, opierająca się na technikach immobilizacji enzymów, doprowadziła do przełomu w przetwórstwie żywności i związków farmaceutycznych. Produkcja na wielką skalę została uruchomiona, dzięki użyciu biokatalizatorów do hydrolizy penicyliny (do syntezy półsyntetycznych antybiotyków β-laktamowych) i izomeryzacji glukozy.

Od połowy lat siedemdziesiątych, w związku z kryzysem naftowym oraz świadomością, że zasoby naturalne się kurczą, powstały w agendach rządowych krajów rozwiniętych (Niemcy, Wielka Brytania, Japonia, USA i inne) koncepcje innowacyjnego potencjału i wzrostu gospodarczego oraz większego znaczenia zasobów surowców odnawialnych w przyszłości. W 1974 r. niemiecka organizacja chemiczna Dechema opracowała entuzjastyczny raport dla Niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Nauki (Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft). Było to pierwsze systematyczne opracowanie finansowania strategii badawczo-rozwojowej, zachęcające do innowacji w przemyśle. Podobne strategie powstały także w Wielkiej Brytanii, Japonii i Francji. W prace badawczo-rozwojowe najbardziej zaangażowano mikrobiologię, biologię komórki, biochemię oraz – w ograniczonym zakresie – biologię molekularną, genetykę i inżynierię chemiczną. Pojawiły się także w tych latach podręczniki do mikrobiologii stosowanej (jeszcze nie w sensie biotechnologii), a także do inżynierii biochemicznej. Pierwsze encyklopedie i serie na temat biotechnologii pod redakcją Rehma and Reeda zostały wydane przez Wiley-VCH Verlag, a pod redakcją Flickingera i Drew’a przez John Wiley & Sons Inc.

Tak więc pojawiła się nowa dyscyplina naukowa – biotechnologia – integrująca badania gospodarki innowacyjnej. Pierwsze dyplomy magisterskie i inżynieryjne z zakresu inżynierii biochemicznej były przyznawane absolwentom University College London już w 1960 r., a kolejne w 1970 r. na Politechnice w Berlinie (Technical University of Berlin). Pojawiły się pierwsze czasopisma naukowe z tej dziedziny: „Journal of Microbiological & Biochemical Engineering” (1958), w następnych latach „Biotechnology & Bioengineering”, „Applied Microbiology” zmieniony na „Environmental & Applied Microbiology” oraz „Applied Microbiology & Biotechnology”.

1.2.6. Era nowej biotechnologii (po 1975 r.)

Po 1975 r. nastąpiła era technologii związanych z rekombinacjami DNA oraz pojawienie się pierwszych produktów marketowych (szczepionki, insulina). Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii przedstawiono w tabeli 1.1.

Pierwszym przełomem tej ery było ustanowienie modelu struktury molekularnej DNA przez Jima Watsona i Francisa Cricka na podstawie danych krystalograficznych Rosalindy Franklin, która w 1953 r. pracowała w laboratorium Morrisa Wilkinsa. Kolejne sukcesy − badania struktury molekularnej, złożonych struktur organicznych, w tym pierwszej struktury trójwymiarowej białka, mioglobiny, a następnie penicyliny, witaminy B_12 i insuliny.

Znaczenie struktury molekularnej DNA jako materiału, z którego powstają geny, doceniło wielu naukowców z chemii i biologii, głównie mikrobiologii: Gregor Mendel, Friedrich Miescher, Phoebus Levene, William Astbury, Erwin Chargaff, Oswald Avery, Francois Jacob, Jacques Monod, Ole Maaloe, Max Delbrück, Sydney Brenner i inni.

Tabela 1.1. Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii

Rok wdrożenia

Rodzaj aplikacji

1971

Farley, Cape, Glaser: powołanie pierwszej spółki biotechnologicznej Cetus

1972

przemysłowa produkcja kwasu 6-aminopenicylinowego

1974

przemysłowa produkcja syropu glukozowo-fruktozowego

1976

Swanson, Boyer: fundacja drugiej spółki biotechnologicznej Genentec

1977

dalsze nowe firmy biotechnologiczne

1978

rekombinowana ludzka insulina (Genentec)

1980

prace nad rekombinowaną α-amylazą (Novo)

1982

zatwierdzenie ludzkiej insuliny przez FDA (Eli Lilly)

1982

techniczna produkcja rekombinowanej α-galaktozydazy (Bochringer Mannhein, Germany)

1984

zmechanizowane sekwencjonowanie DNA

1988

Leder, Steward: patent na produkcję transgenicznych myszy

1996

masowa hodowla zrekombinowanych nasion kukurydzy

1999

CELERA – przemysłowe sekwencjonowanie genomu

1999

mikrobiologiczna produkcja witaminy C

Źródło: na podstawie Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots – a short history of industrial microbiology and biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 3747–3762, zmienione.

Opisanie przez Watsona i Cricka w 1953 r. struktury DNA spowodowało w następstwie istotny przełom naukowy oraz postęp w rozwoju licznych technik, które przyniosły sukcesy biotechnologii.

Berg, Cohen i Boyer w 1972 r. wprowadzili technologię rekombinowanego DNA (rDNA), konstruując pierwsze rekombinowane plazmidy i wirusy, które zostały wprowadzone odpowiednio do bakterii lub komórek zwierzęcych, gdzie autonomicznie się namnażały. Patent udzielony Cohenowi i Boyerowi oraz Uniwersytetowi Kalifornijskiemu został krytycznie skomentowany przez Berga.

W latach 80. i 90. XX w. wprowadzono techniki genetyczne w metodach pozyskiwania nowych szczepów przemysłowych. Nowe metody i narzędzia badawcze odegrały kluczową rolę w szybkiej ekspansji technologii rekombinacji. Obejmują one: techniki elektroforezy żelowej, wirowanie, trawienie DNA z zastosowaniem endonukleaz restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, metody ekstrakcji genów, szereg metod klonowania mniejszych fragmentów DNA z wykorzystaniem plazmidów, kosmidów oraz fosmidów, klonowanie większych fragmentów DNA z zastosowaniem sztucznych chromosomów bakteryjnych BAC i drożdżowych YAC, metagenomika i ostatnio biologia syntetyczna. Projektowanie białek stało się racjonalnym narzędziem do produkcji biofarmaceutyków i rozwoju badań nad enzymami. Dzięki dostępności powyższych technik molekularnych klonowania genów u Gram-ujemnych pałeczek E. coli zaistniała dogodna sytuacja do łatwego opracowania wektorów do klonowania genów, które można przenieść do innych gatunków nie tylko bakterii. Dotyczy to identyfikacji plazmidów replikujących się w innych organizmach, które można eksprymować i wykorzystywać do selekcji w nowym gospodarzu, w tym w bakteriach, drożdżach, liniach komórek owadzich i komórkach roślinnych.

Połączenie technik inżynierii genetycznej i technologii rDNA umożliwiło szybkie komercyjne wykorzystanie wyników naukowych w świecie biznesu. Przełomem przemysłowym była rekombinowana ludzka insulina opracowana przez Genentech we współpracy z Ely Lilly w 1978 r. i zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w 1982 r. Warto podkreślić udział polskich badaczy i biotechnologów w dziele tworzenia insuliny ludzkiej (Gensulin). Prowadzone w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w latach 1992–1995 badania nad opracowaniem technologii otrzymywania insuliny ludzkiej zaowocowały w 2000 r. uruchomieniem jej produkcji na skalę przemysłową. Polska stała się czwartym na świecie po USA, Danii i Niemczech producentem insuliny ludzkiej uzyskiwanej metodą inżynierii genetycznej. W ten sposób uzyskano możliwość nieograniczonej produkcji insuliny, bowiem do tej pory wszystkie preparaty insuliny były mniej lub bardziej oczyszczonymi preparatami insuliny wieprzowej lub wołowej. Kolejny przełomowy moment w historii badań nad insuliną nastąpił w 1996 r., w którym uzyskano analog insuliny ludzkiej – insulinę lispro – o niezwykle wartościowych cechach farmakodynamicznych, zmieniając jedynie kolejność dwóch końcowych aminokwasów (lizyny i proliny) w łańcuchu B.

Inne uzyskane produkty rekombinowane to głównie leki, których nie dało się wytworzyć innymi metodami, a które są bardzo interesujące z medycznego punktu widzenia: ludzki hormon wzrostu w 1983 r., β-interferon i szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w 1986 r., tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) w 1987 r. i erytropoetyna w 1989 r. W ostatnich dekadach tą metodą produkuje się rekombinowane białka, w tym hormony i czynniki wzrostu, czynniki krzepnięcia krwi, cytokiny, przeciwciała monoklonalne i szczepionki jako najważniejsze biofarmaceutyki. Także produkcja antybiotyków stanowi ważny sektor biofarmaceutyków o wielu różnych właściwościach.

Transfer nauki do sfery gospodarczej zaowocował powstaniem nowych firm biotechnologicznych. Pierwszy powstał Cetus (1971 r.), następnie twórca „reakcji łańcuchowej polimerazy” PCR Kary’ego Mullisa, który wykreował diagnostykę genetyczną. W 1976 r. Herbert Boyer i Robert Swanson założyli firmę Genentech. Spośród innych ważniejszych założonych w tych latach firm można wymienić Biogen (1978 r.), Amgen (1980 r.) i Chiron (1981 r.).

W ciągu ostatnich 20 lat wdrożono nowe lub bardziej wydajne przemysłowe procesy związane z wykorzystaniem mikroorganizmów, dające czystsze, tańsze produkty lub substancje niedostępne przy użyciu klasycznych metod chemicznych. Ogólnie mówiąc, teraz można:

- – przekształcać reakcje wtórne w główne szlaki metaboliczne;

- – optymalizować produkcję i wydajności procesów;

- – zmienić pierwotne szlaki metaboliczne, aby umożliwić stosowanie tańszych surowców lub uzyskanie wcześniej nieznanych cząsteczek;

- – wykorzystać właściwości enzymów w celu otrzymania nowych cząsteczek chiralnych.

Lista produktów uzyskanych tymi metodami zwiększa się co roku. W ich produkcję jest zaangażowanych wiele obszarów przemysłowych.

Do produktów najczęściej uzyskiwanych w mikrobiologii przemysłowej należą:

1. 1) białka farmaceutyczne (ludzki interferon, naskórkowy czynnik wzrostu i hemoglobina, antygeny wirusowego zapalenia wątroby typu B, stabilizatory erytropoetyny i ludzkiej kosmówki, gonadotropina) otrzymywane z wykorzystaniem mikroorganizmów, takich jak Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha lub Agrobacterium tumefaciens;

2. 2) rekombinowane enzymy do procesów przemysłowych z zastosowaniem mikroorganizmów; obejmują przemysłowy rynek enzymów stosowanych w produkcji żywności, detergentów, tekstyliów, przemysłu skórzanego, celulozowego i papierniczego; szczególnie interesujące są lipazy mikrobiologiczne, np. Lipolase™ (wyprodukowany po raz pierwszy w 1994 r. przez duńską firmę Novozymes) jest pierwszym rekombinantem lipazy; została uzyskana przez klonowanie Thermomyces lanuginosus genu lipazy do genomu Aspergillus oryzae;

3. 3) antybiotyki biosyntetyczne (w tym penicylina V) i naturalne (penicylina G); z 12 000 antybiotyków opisanych w 1995 r. ponad 20% może być wytwarzane przez grzyby nitkowate (biosyntetyczna i półsyntetyczna penicylina i cefalosporyna);

4. 4) czynniki immunosupresyjne, w tym cyklosporyna A z Tolypocladium nivenum oraz mykofenolan mofetylu z kilku gatunków Penicillium;

5. 5) czynniki hipocholesterolemiczne, w tym lowastatyna z Aspergillus terreus i prawastatyna z Penicillium citrium;

6. 6) czynniki przeciwnowotworowe, takie jak taksol po raz pierwszy wykryty w roślinie, ale później produkowany przez Taxomyces andreanae;

7. 7) mikotoksyny, w tym inhibitory adrenaliny, estrogeny i środki anaboliczne stosowane u bydła i owiec lub gibereliny w branżach piwowarskich i słodowniczych;

8. 8) pigmenty, w tym astaksantyna karotenoidowa z Phaffia rhodozyma i β-karotenoid z Blakeslea trispora, stosowane w przemyśle spożywczym i tekstylnym;

9. 9) wielokrotnie nienasycone kwasy tłuszczowe, w tym kwas γ-linolowy z Mucor circinelloides i kwas arachidowy z Mortierella isabellina.

Równolegle rozwijała się produkcja klasycznych wyrobów, innych niż farmaceutyki, zarówno tradycyjnymi metodami mikrobiologicznymi, jak i rekombinacyjnymi. Najważniejsze produkty masowe to etanol, aminokwasy i kwasy organiczne, witaminy oraz biopolimery. Inżynieria metaboliczna została z powodzeniem zastosowana do optymalizacji wydajności, np. w produkcji aminokwasów. Natomiast wytwarzanie na bardzo dużą skalę etanolu, tradycyjnie produkowanego z surowców takich jak skrobia i cukier, jako dodatku do benzyny, wywołało ostrą krytykę ze względu na wykorzystywanie do tego upraw rolnych. Ostatnio pojawił się pomysł wykorzystywania biomasy celulozowej jako źródła biopaliw. Kolejne tematy to produkcja biogazu i energii elektrycznej wytwarzanej przez mikrobiologiczne ogniwa paliwowe. Metody rekombinacji DNA również znacząco wpłynęły na technologię enzymów od późnych lat siedemdziesiątych. Nadmierna ekspresja w szybko rosnących organizmach gospodarza o wysokiej produktywności białek umożliwiła tańszą produkcję na skalę przemysłową wielu enzymów, które wcześniej nie były łatwo dostępne, a są stosowane obecnie do produkcji żywności, detergentów oraz farmaceutyków.

Udało się także pozyskać rośliny transgeniczne celem zwiększenia plonów, dzięki nabytym cechom odporności na choroby i herbicydy. Transgeniczne rośliny są uprawiane na bardzo dużą skalę w USA, Argentynie, Brazylii, Kanadzie, a także w innych krajach.

Wielkim osiągnięciem w 2000 r. było zsekwencjonowanie ludzkiego genomu dzięki międzynarodowej współpracy i całkowitym wydatkom rzędu 3 mld dolarów. Zadanie to zostało zrealizowane przez duże międzynarodowe konsorcjum i w dużej mierze niezależnie od grupy Craiga Ventera. Wyniki sekwencjonowania Human Genome Project mogą umożliwić odkrycie i wyprodukowanie setek nowych farmaceutyków, z których wiele to naturalne ludzkie produkty genowe wcześniej niedostępne w znaczących ilościach, lub preparatów wolnych od wirusów, znacznie poprawiających diagnostykę i rewolucjonizujących medycynę.

Wreszcie obiecujące badania i eksperymenty z komórkami macierzystymi, śledzenie różnicowania się komórek i embriogenezy, otwierające nową dziedzinę badań medycznych, produkcję modeli chorób genetycznych, nowe podejście do rozumienia raka. Na przykład niemiecka biolog Christiane Nüsslein--Volhard otrzymała wraz z Erikiem Wieschausem i Edwardem B. Lewisem w 1995 r. Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za badania nad genetyczną kontrolą rozwoju zarodka z wykorzystaniem muszki owocowej (Drosophila melanogaster).

Kolejnym wielkim wydarzeniem była chemiczna synteza całego genomu Mycoplasma genitalium przez Craiga Ventera, a następnie przeniesienie tego DNA do innego gatunku Mycoplasma, co spowodowało zastąpienie rezydującego genomu genomem całkowicie syntetycznym i utworzenie nowego szczepu zdolnego do ciągłej autoreplikacji (First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers). Osiągnięcie to można uważać za dalszy krok w dziedzinie zapoczątkowanej przez Pasteura wykorzystującego żywe organizmy do tworzenia nowych komórek o nowym potencjale syntetycznym.

Bardzo duże pole do zastosowania biotechnologii stanowi technologia środowiskowa, która stała się ważnym przemysłem. Obejmuje ona oczyszczanie ścieków, zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, stosowane w wielu małych i bardzo dużych instalacjach.

1.3. Główne procesy w mikrobiologii przemysłowej

1.3.1. Upstream processes

W uprzednich latach liczne i różne produkty pozyskiwano z naturalnych źródeł lub syntetyzowano w procesach chemicznych – niektóre w procesach fermentacji prowadzonych przez mikroorganizmy, inne zaś – w procesach konwersji biologicznej. Zalety wykorzystania mikroorganizmów w tego typu procesach są takie, że dodatkowo uzyskuje się w nich biomasę, mają szybkie tempo wzrostu oraz można stosować stosunkowo tanie substraty, w wielu przypadkach odpady z różnych gałęzi bioprzemysłu. Generalnie produkty mikrobiologii przemysłowej i biotechnologii mikroorganizmów są wykorzystywane w procesach opisywanych jako upstream, procesach fermentacji oraz procesach downstream.

Do procesów poprzedzających należą izolacja i selekcja mikroorganizmów, szczepów przydatnych do taniej produkcji dużych ilości oczekiwanego produktu, przechowywanie szczepów przemysłowych, namnażanie szczepionki (inoculum), selekcja substratu, optymalizacja i produkcja podłoża hodowlanego oraz przemysłowa sterylizacja podłoża produkcyjnego. Mikroorganizmy jako czynniki produkujące oraz surowy materiał jako substrat fermentacyjny są najistotniejsze w upstream processes. Szczepy stosowane w produkcji są istotne we wszystkich fermentacjach przemysłowych, ponieważ wzrost efektywności produkcji redukuje koszty produkcji. W wielu przypadkach szczepy przemysłowe są poddawane mutagenezie lub rekombinacji DNA – przechodzą procesy via mutacje i rekombinacje. Dobór podłoża zależy od skali fermentacji. W skali laboratoryjnej do sporządzania podłoża często stosuje się substraty czyste chemicznie. Stosowanie ich na skalę przemysłową jest nieopłacalne z powodu wysokich kosztów. Dlatego stosuje się tanie substraty, często odpadowe z różnych gałęzi bioprzemysłu, tj. roślinne lub zwierzęce odpady przemysłowe, które mają różny i zmienny skład. Są one także sprawdzane pod kątem przydatności w skali laboratoryjnej.

1.3.2. Procesy fermentacji

Z przemysłowego punktu widzenia fermentacja to wytwarzanie produktu przez biomasę mikroorganizmu w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Fermentację zwykle prowadzi się w fermentorach lub bioreaktorach, które są optymalne do produkcji biomasy oraz syntezy produktu fermentacji. Przyrost biomasy oraz synteza produktu zależą od wielu czynników, takich jak temperatura, pH, zawartość tlenu, mieszania hodowli i poziom piany oraz właściwości szczepu przemysłowego. W zależności od potrzeb stosuje się proste bioreaktory lub fermentory wyposażone w różne systemy kontroli procesu fermentacji podłączone do komputera. Fermentację przemysłową można prowadzić w hodowlach stacjonarnych, hodowlach półciągłych lub z ciągłym przepływem – w zależności od typu końcowego produktu.

1.3.3. Downstream processes

Downstream processes to wszystkie czynności wykonywane po zakończeniu procesu fermentacji, głównie związane z odzyskaniem produktu fermentacji, jego oczyszczaniem i krystalizacją oraz konfekcjonowaniem. Należą do nich również procesy związane z wydzieleniem biomasy i jej rozbiciem w celu pozyskania dodatkowych ilości produktu oraz usunięcie biomasy z płynu fermentacyjnego. W celu oddzielenia biomasy mieszaninę hodowlaną filtruje się lub odwirowuje, a biomasę rozbija chemicznie, fizycznie lub biologicznie – w zależności od trwałości produktu fermentacji. Ponieważ uzyskiwane ilości produktu są zwykle niewielkie, prowadzi się proces jego zagęszczania. Do oczyszczania produktu można stosować różne metody, jak np. chromatografię, dializę, odwróconą osmozę, destylację lub ekstrakcję rozpuszczalnikami – w zależności od typu i poziomu czystości finalnego produktu. Wodę lub rozpuszczalnik usuwa się przez odparowywanie lub suszenie produktu albo jego krystalizację. Generalnie są to procesy: oddzielenia i rozbijania komórek biomasy celem wyekstrahowania wewnątrzkomórkowego metabolitu, zagęszczanie, oczyszczanie, jakościowa i ilościowa kontrola produktu, pakowanie i przechowywanie produktu, sterylizacja oraz oczyszczanie ścieków powstałych w czasie produkcji i odzyskiwania produktu.

1.3.4. Skale hodowli mikroorganizmów

Słownik Cambridge definiuje zwiększanie skali produkcji mikrobiologicznej jako zwiększanie wielkości bioreaktora (fermentora), objętości hodowli i syntezy produktu (zwiększenie produkcji w jednostce czasu trwania fermentacji). W procesie hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach zachodzi synteza produktu, w następnym etapie jego odzyskiwanie i oczyszczanie oraz usuwanie powiązanych z produkcją odpadów. Typowanie szczepów produkcyjnych jest zwykle testowane w laboratorium w fermentorach objętości 0,5–10 l (skala laboratoryjna), co musi zostać przełożone na produkcję w skali przemysłowej (pełna skalę produkcji) w bioreaktorach objętości 20 000–2 000 000 l. Jeżeli w procesie występuje wiele nowych czynników, skalowanie dużych procesów przemysłowych najlepiej wykonać w dwóch etapach. Pierwszym etapem jest skala pilotażowa w fermentorach objętości 100−10 000 l z dopasowanym odpowiednio sprzętem. Celem skali pilotażowej jest przeniesienie skali laboratoryjnej na proces w realistycznie zmniejszonej wersji produkcji przemysłowej. W większości przypadków nie jest on w pełni zintegrowany i wymaga pewnych korekt. Na tym etapie sprawdza się wszystkie możliwe parametry kinetyczne fermentacji, poddaje korekcie oraz szacuje poniesione koszty. Drugi etap to skala demonstracyjna (skala demo) z fermentorami wielkości 10 000–100 000 l, która służy minimalizacji ryzyka kapitałowego podejmowanego do realizacji w pełnowymiarowej skali produkcyjnej (walidacja procesu). Jeśli stopień nowości jest stosunkowo niski, skala demonstracyjna może być pominięta.

1.3.5. Skala produkcji przemysłowej zależna od parametrów fermentacji

Na proces fermentacji wpływają następujące czynniki:

1. 1) stopień czystości dodawanych składników podłoża fermentacyjnego (naturalne lub o wysokiej czystości, zmienność między seriami surowców); może nastąpić nagromadzenie inhibitorów i niesfermentowanych składników podłoża, które mają wpływ nie tylko na przebieg fermentacji, ale także na bilans wodny i dynamikę przebiegu procesu, zwłaszcza w fermentacjach prowadzonych w hodowlach półciągłych;

2. 2) degradacja surowców oraz tworzenie inhibitorów mających wpływ na dynamikę fermentacji, procesy downstream oraz oczyszczanie ścieków i utylizację odpadównastępujące podczas sterylizacji podłoża fermentacyjnego lub dodawanego surowca zależnie od temperatury oraz czasu trwania sterylizacji;

3. 3) czas mieszania w procesie fermentacji wzrasta wraz z gradientami pewnych parametrów kontrolujących proces fermentacji i może być zależny od temperatury, wartości pH oraz stężenia substancji odżywczych, które mogą mieć negatywny wpływ na proces fermentacji;

4. 4) współczynnik przenikalności gazu (kLa) przez ciecz i biomasę mający negatywny wpływ na wydajność fermentacji;

5. 5) podwyższenie ciśnienia cząstkowego gazów pO_2 i pCO_2 wraz ze zwiększeniem brutto ciśnienia hydrostatycznego podłoża hodowlanego, które wpływa na wydajność procesu fermentacji;

6. 6) większe naprężenia ścinające (siły ścinające) w zależności od skali mogą spowodować uszkodzenie komórek, wpływając na proces fermentacji i/lub wydajność procesów downstream;

7. 7) wydłużony czas przetrzymywania podłoża w trakcie fermentacji oraz czas odzyskiwania produktu może wpływać na skład chemiczny podłoża, lizę komórek szczepów produkcyjnych oraz procesy downstream i utylizację odpadów i ścieków;

8. 8) dezaktywacja hodowli zależna od temperatury oraz czasu zatrzymania podłoża w procesie fermentacji także wpływa na lizę komórek, skład podłoża, co ma wpływ na procesy downstream i oczyszczanie ścieków.

Powiedzenie: ‘the early bird may get the worm, but the second mouse gets the cheese’ „najszybszy ptak dostaje robaka, a druga mysz dostaje ser” mówi, że należy uczyć się od innych, którzy byli wcześniej. Niektórzy z najmądrzejszych, jakich znamy, to najszybsze ptaki. Są genialni i szybcy, przekonani, że mogą zrobić wszystko sami znacznie szybciej, taniej i lepiej niż ktokolwiek inny, chociaż nigdy tego wcześniej nie robili. Nie doceniają wyzwań związanych z powiększaniem skali, a czasem nawet je ignorują. Nadrabiają to potem, zmuszając się nierozważnie do pójścia na skróty i dokonywania skoków w dobrej wierze. Zamiast ich naśladować, lepiej być „drugą myszą” – zgromadzić wokół siebie wykwalifikowane zespoły inżynierów (aby ocenili nowe możliwości), pozyskać wskazówki co do bieżących prac badawczo-rozwojowych, aby określić realistyczne oczekiwania i z powodzeniem skalować proces bez niespodzianek.

1.4. Bioaktywne związki pozyskiwane z organizmów

Produkty naturalne w najszerszym znaczeniu to związki chemiczne izolowane z różnych żywych organizmów. Podstawowe metabolity (polisacharydy, proteiny, kwasy nukleinowe i kwasy tłuszczowe) są powszechne we wszystkich systemach biologicznych. Metabolity wtórne, nazywane także metabolitami wyspecjalizowanymi, to małocząsteczkowe (MW ~3000), niezwykle różnorodne chemicznie, często pełniące niejasne funkcje, charakterystyczne głównie dla pewnych organizmów. Aktywność biologiczna lub bioaktywność metabolitów może pojawiać się na poziomie molekularnym in vitro lub in vivo. Definicja metabolitów obejmuje wszystkie metabolity, które regulują procesy wzrostu, replikacje i/lub wykazują pewien rodzaj reakcji (regulujących, hamujących, stymulujących) na komórki na poziomie biochemicznym, w minimalnym stężeniu. Wyróżnia się dwa rodzaje związków bioaktywnych: nieantybiotykowe związki bioaktywne (metabolity „inne bioaktywne”) oraz antybiotyki. Metabolity wyizolowane z mikroorganizmów wykazujące działanie antybakteryjne, antygrzybiczne, antypierwotniacze, antynowotworowe i/lub antywirusowe to antybiotyki. Wszystkie inne metabolity bioaktywne można nazwać naturalnymi bioregulatorami lub modulatorami biochemicznymi. Bez wątpienia „klasyczne” antybiotyki stanowią tylko część (być może mniejszą) możliwych bioaktywnych metabolitów mikroorganizmów. Praktyczne znaczenie antybiotyków i innych metabolitów jest ogromne. Są szeroko stosowane w leczeniu ludzi i zwierząt, a także w rolnictwie i badaniach naukowych. Produkty naturalne, w tym metabolity drobnoustrojów, można praktycznie wykorzystać na trzy różne sposoby:

1. 1) bezpośrednio w medycynie, w rolnictwie lub w jakichkolwiek innych dziedzinach;

2. 2) jako materiał wyjściowy do późniejszej modyfikacji chemicznych lub mikrobiologicznych;

3. 3) jako związki wiodące do syntezy chemicznej nowych analogów lub jako szablony projektowanych leków.

W tabeli 1.2 przedstawiono przybliżone liczby aktywnych metabolitów produkowanych przez Bacteria i Eukarya.

Tabela 1.2. Liczebności metabolitów produkowanych przez organizmy żywe

Źródło

Wszystkie znane związki

Inne bioaktywne

Antybiotyki

Produkty naturalne

> 1 000 000

200 000–250 000

25 000–30 000

Królestwo roślin

ogółem

550 000–650 000

128 000–177 000

~ 13 000

glony i porosty

3000–5000

1500–2000

~ 1000

rośliny wyższe

500 000–600 000

~ 100 000

10 000–12 000

Bakterie

> 50 000

22 000–23 000

~ 17 000

Królestwo zwierząt

ogółem

300 000–400 000

50 000–100 000

~ 5000

pierwotniaki

kilkaset tysięcy

100–200

~ 50

zwierzęta morskie

20 000–25 000

7000–8000

3000–4000

owady/robaki itp.

8000–10 000

800–1000

150–200

kręgowce

200 000–250 000

50 000–70 000

~ 1000

Źródło: na podstawie Bérdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites, J. Antibiot 58: 1–26, zmienione.

Związki bioaktywne są produkowane przez rośliny, takie jak glony, porosty, wątrobowce, paprocie i mchy, rośliny naczyniowe o działaniu antydrobnoustrojowym/antywirusowym. Często występujące metabolity roślinne (alkaloidy, flawonoidy, terpenoidy itp.) wykazują również różne działania toksyczne i farmakologiczne, a także niektóre działania antybakteryjne i antynowotworowe/antywirusowe. W najszerszym znaczeniu wszystkie powyższe związki można również uznać za antybiotyki. W królestwie zwierząt producentami metabolitów są Porifera, Mollusca, Cnidaria, Anthozoa, Echinodermata oraz Bryozoa. W grupie produktów morskich, w tym wodorostów morskich związki inne bioaktywne nieantybiotyczne stanowią około połowę wszystkich obecnie znanych bioaktywnych produktów morskich.

Z praktycznego punktu widzenia większość obecnie znanych biologicznych aktywności związków nieantybiotycznych można sklasyfikować jako:

- – środki farmakologiczno-biochemiczne lub medyczne,

- – środki wykorzystywane w rolnictwie,

- – środki regulacyjne, biofizyczne i inne.

Pierwszy rodzaj związków innych bioaktywnych o możliwej aktywności medycznej w największej liczbie obejmuje potencjalnie bardzo ważne metabolity hamujące działanie enzymów. Obecnie ponad 3000 związków, o których wiadomo, wykazuje aktywność hamującą wobec około 300 do 350 różnych układów enzymatycznych. Istnieje około 800 związków immunoaktywnych (immunosupresyjnych, immunostymulujących) oraz setki związków o najróżniejszych regulacjach: hamujących, agonistycznych i antagonistycznych, w tym przeciwzapalnych/przeciwutleniających, hipocholesterolemicznych, antymetabolitowych, a także o różnym działaniu toksycznym (mikotoksycznych). W tej grupie występują także związki o działaniu biochemicznym, takim jak hamowanie zestawu tubuliny (mikrotubuli), związki indukujące interferon, antymitotyczne/antymitogenne, uszkadzające DNA, działające antymutagennie, wykazujące aktywności indukujące apoptozę, hamujące angiogenezę. Testy wykrywające te aktywności wykazują bardzo duże różnice, a zakres ostatecznych efektów fizjologicznych, biologicznych, biochemicznych, fitochemicznych i mikrobiologicznych obejmuje blisko tysiąc kategorii bioaktywności. Związki odkryte za pomocą tych specyficznych metod można nazwać (odróżniając je od antybiotyków) mikrobiologicznymi produktami leczniczymi lub biofarmaceutykami. Warto tu wspomnieć o cyklosporynie, lowastatynie lub takrolimusie, mających duże znaczenie praktyczne.

Większość dopuszczalnych środowiskowo związków rolnych to produkty naturalne lub powstające w wyniku modyfikacji produktów naturalnych. Związki aktywne w rolnictwie mogą również zawierać związki hamujące enzymy. Tak zwane działania rolnicze obejmują głównie pestycydy (insektycydy, środki roztoczobójcze, larwicydy, repelenty, środki odstraszające, środki przeciwdziałające plewom, środki antypasożytnicze, przeciw robakom, cystycydy, akarycydy, nematocydy, związki przeciwwymiotne, algicydy i inne środki zwalczania biologicznego) oraz herbicydy (substancje fitoaktywne: fitotoksyny, regulatory wzrostu roślin, inhibitory kiełkowania, allelozwiązki, fitohormony, induktory chlorozy). Dodatki paszowe, środki konserwujące, permytanty/promotory wzrostu są stosowane w hodowli i weterynarii. Awermektyna, monensyna i bialafos są najbardziej użytecznymi związkami drobnoustrojowymi w tej grupie.

Istnieje też grupa związków wytwarzanych przez mikroorganizmy. Są to specyficzne inhibitory metaboliczne, czynniki wzrostu, czynniki morfogenne i sporogenne, związki sygnałowe, induktory powstawania grzybni, stymulatory produkcji, autoregulatory, feromony bakteryjne, induktory różnicowania; siderofory są włączone do tej grupy. Związki te odgrywają istotną rolę w cyklu życia drobnoustrojów i mogą być stosowane w testach biologicznych lub jako odczynniki biochemiczne. Związki o właściwościach biofizycznych to biosurfaktanty, bioflokulanty, czynniki chelatujące i jonowe, zmiatacze minerałów, jonofory, związki fotoaktywne, radioprotektanty i inne.

Antybiotyki i inne produkty naturalne będące metabolitami mogą być produkowane przez organizmy prokariotyczne (bakterie) oraz eukariotyczne (rośliny i zwierzęta). Zdolność wytwarzania metabolitów przez organizmy jest jednak bardzo nierównomierna. Wśród bakterii i roślin pewne grupy, jak Actinobacteria (promieniowce) i Mycota (grzyby), są najczęstszymi i najbardziej wszechstronnymi producentami. W grupie bakterii różne metabolity są produkowane przez gatunki Bacillus, Pseudomonas oraz Myxobacteria i Cyanobacteria. Wśród bakterii dominują gatunki należące do rodzaju Streptomyces. które wytwarzają około połowę wszystkich metabolitów. Liczebności naturalnych związków bioaktywnych przedstawiono w tabeli 1.3. Wśród grzybów dominują grzyby strzępkowe oraz pewne grupy grzybów wyższych (Ascomycota i Basidiomycota).

Tabela 1.3. Prawdopodobne liczebności odkrytych antybiotyków produkowanych przez mikroorganizmy w latach 1940–2010

Okres

Lata

1940–1974

Lata

1975–2000

Lata

2001–2010

Ogółem

Bakterie

ogółem

7635

17 130

5760

30 525

Myxobacteria

25

400

210

635

Cyanobacteria

10

30

1250

1290

Actinobacteria

3900

9300

3800

17 000

Streptomyces spp.

2900

5100

2400

10 400

pozostałe bakterie

800

2300

1100

4200

Grzyby

ogółem

1270

7400

6560

15 230

grzyby strzępkowe

950

5400

4900

11 250

Basidiomycota

300

1800

1500

3600

inne grzyby

20

200

160

380

Źródło: na podstawie Bérdy J. 2012. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. J. Antibiot. 65: 441, zmienione.

Promieniowce są producentami wielu antybiotyków. Wytwarzają związki antybakteryjne należące do β-laktamów, aminoglikozydów, tetracyklin, makrolidów, glikopeptydów, lipopeptydów, streptogramidów i innych. Pod względem budowy chemicznej związki wytwarzane przez promieniowce należą m.in. do poliketydów, peptydów, butenolidów, chinonów, makrolidów, alkaloidów, laktonów, laktamów, terpenów i terpenoidów.

Od kilku lat obiektem badań są peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym. Szczególne nadzieje wiąże się z bakteriocynami – peptydami antydrobnoustrojowymi syntetyzowanymi przez bakterie mlekowe, głównie z rodzaju Lactobacillus. Są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako naturalne konserwanty. Oczyszczone preparaty bakteriocyn, takie jak: dostępne komercyjnie nizyna A czy pediocyna PA-1, z powodzeniem są stosowane do konserwowania żywności. Bakteriocyny są oporne na wysoką temperaturę i tolerują szerszy zakres pH w porównaniu do klasycznych antybiotyków. Bakteriocyny są zwykle syntetyzowane rybosomalnie, w czasie fazy G1 i nie są metabolitami wtórnymi, dzięki czemu są coraz częstszym przedmiotem zainteresowania bioinżynierii. Masa cząsteczkowa bakteriocyn rzadko przekracza 10 kDa, ulegają trawieniu przez proteazy w przewodzie pokarmowym człowieka, dzięki czemu są bezpieczne jako konserwanty żywności.

Istnieje ogromna populacja prostych pochodnych aminokwasów, cyklicznych dipeptydów (CDP) występujących w wielu żywych organizmach: mikroorganizmach, roślinach i zwierzętach. Wytwarzane są dwoma głównymi szlakami: jako produkty syntetaz NRP lub, co ciekawsze, w unikalnym procesie enzymatycznym wykorzystującym syntazy cyklopeptydowe (CDPS), które wykorzystują aminoacylo-tRNA jako substrat. Analiza genomów wskazuje na obecność genów CDPS w więcej niż 50 różnych bakteriach, także grzybach i pierwotniakach. Są to najstarsze peptydy, mogące zawierać niebiałkowe aminokwasy. Stanowią rdzenień strukturalny wielu złożonych produktów naturalnych (diketopiperazyn), które obejmują aranotyny, bicyklomycynę, chetocynę, cyklomarazyny, gliotoksyny i wertycylinę. Niektóre bakterie wytwarzają nawet sześć odmian CDP. Sugeruje się, że wiele CDP wzmacnia funkcje bakteryjne, takie jak wzrost, różnicowanie i sygnalizację komórkową, niektóre zaś odgrywają niewyjaśnioną rolę. Stwierdzono, że CDP w warunkach laboratoryjnych są antynowotworowe, antywirusowe, antybakteryjne, antygrzybicze, immunosupresyjne, neurologiczne, jako cząsteczki sygnałowe, endokrynologiczne lub mogą być czynnikami wirulencji.

Literatura rekomendowana

Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots – a short history of industrial microbiology and biotechnology, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97:3747–3762.

Demain A.L., Vandamme E.J., Collins J., Buchholtz K. 2017. History of Industrial Biotechnology, [w:] Industrial Biotechnology: Microorganisms, red. Wittmann C., Liao J.C., Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

Demain A.L. 2000. Microbial biotechnology. Trends Biotechnol, 18: 26–31.

Sanchez S. i Demain A. 2009. Microbial Primary Metabolites: Biosynthesis and Perspectives, [w:] Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, 10.1002/9780470054581.eib167.

Thirumurugan D., Cholarajan A., Raja S.S.S., Vijayakumar R. 2016. An Introductory Chapter: Secondary Metabolites, http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.79766 [dostęp: 7.10.2019].

2

Ulepszanie mikroorganizmów przemysłowych

2.1.Wprowadzenie

Mikroorganizmy przemysłowe stosuje się do produkcji w procesie fermentacji szerokiej gamy produktów wykorzystywanych w życiu codziennym człowieka oraz w wielu gałęziach gospodarki. Są one szczególnie przydatne ze względu na łatwość masowej hodowli na podłożach konstruowanych na bazie odpadów przemysłu rolno-spożywczego i szybki wzrost (przyrost biomasy) oraz ze względu na różnorodność produktów powstających przy ich udziale. Łatwo poddają się różnym manipulacjami genetycznym stosowanym w celu wytworzenia w skali masowej produktów o dużej czystości.

Tradycyjne fermentacje, jak np. warzenie piwa czy fermentacja alkoholowa, były początkowo wykonywane (i nadal są w wielu przypadkach) przez mieszaninę dzikich mikroorganizmów pochodzących z surowców lub środowiska lokalnego. Pierwsze próby ulepszania mikroorganizmów były czynione w końcu XIX w., kiedy po raz pierwszy izolowano je z tych procesów jako czyste szczepy, z których następnie wybrano szczepy najbardziej użyteczne (czasy Ludwika Pasteura). Konkretnie stosowane mikroorganizmy na skalę przemysłową były często izolowane ze środowiska naturalnego, głównie z gleby, która wykazuje największą różnorodność biologiczną. Wiązało się to z losowym przesiewaniem dużej liczby izolatów. Alternatywnie, pewne mikroorganizmy uzyskano z kolekcji szczepów. W celu poprawy ich właściwości do zastosowań przemysłowych większość z nich, niezależnie od pochodzenia, zmodyfikowano za pomocą konwencjonalnych strategii ulepszania szczepów z wykorzystaniem mutagenezy lub hodowli. W ostatnich dekadach opracowano kilka sposobów rekombinacji mikroorganizmów, a do poprawy właściwości szczepów przemysłowych coraz częściej stosuje się technologie inżynierii genetycznej.

W większości przypadków przy doborze mikroorganizmów do zastosowań przemysłowych mają ogromne znaczenie regulacje prawne. Przemysł fermentacyjny woli stosować ustanowione mikroorganizmy GRAS (ogólnie uważane za bezpieczne), w szczególności do wytwarzania produktów i składników spożywczych. Wynika to z faktu, że zatwierdzenie technologii i produktu przy użyciu „nowego” mikroorganizmu jest bardzo rygorystyczne i kosztowne. Ponadto, jeżeli patogeny i niektóre GMO wykorzystuje się jako organizmy producenta, należy podjąć dodatkowe środki bezpieczeństwa. Trzeba zastosować specjalne urządzenia zabezpieczające i używać zmodyfikowanych („okaleczonych”) szczepów, które nie mogą istnieć poza środowiskiem bioreaktora.

2.2.Metabolity produkowane przez mikroorganizmy

2.2.1. Metabolity pierwotne

Według firmy Business Communication Company (BCC), całkowity światowy rynek produktów wytworzonych z zastosowaniem mikroorganizmów szacuje się na 306 mld USD (Microbial Products 2019). Zalety produkcji różnych związków z zastosowaniem mikroorganizmów w porównaniu do ich izolacji z organizmów roślin i zwierząt lub otrzymywania ich na drodze syntez chemicznych są następujące:

- 1) szybkie pobieranie składników odżywczych wspierających wysokie tempo metabolizmu i biosyntezy;

- 2) zdolność prowadzenia szerokiej gamy reakcji;

- 3) łatwość przystosowania się do wielu różnych środowisk;

- 4) łatwość manipulacji genetycznej, zarówno in vivo, jak i in vitro, w celu zwiększenia produkcji, modyfikacji struktur i procesów oraz tworzenia zupełnie nowych produktów;

- 5) prostota procedur przesiewowych;

- 6) duża różnorodność.

Produkty drobnoustrojów są bardzo zróżnicowane, począwszy od bardzo dużych cząsteczek, takich jak białka, kwasy nukleinowe, polimery węglowodanowe, a nawet komórki, do małych cząsteczek – metabolitów pierwotnych niezbędnych do ich wzrostu i metabolitów wtórnych, nieistotnych dla wzrostu.

Metabolity pierwotne to związki syntetyzowane przez mikroorganizmy, które są im potrzebne do wzrostu i przyrostu biomasy. Są one produkowane przez komórki mikroorganizmów zwykle jedynie w ilościach ściśle koniecznych do ich metabolizmu i genetycznie regulowanych procesów. Funkcjonalne geny, które determinują syntezę tych związków, wykazują aktywności tak długo, jak to konieczne, w zależności od cyklu życiowego oraz czynników środowiskowych. Poprzez zastosowanie mutacji, inżynierii genetycznej lub warunków hodowlanych, które spowodują zakłócenie procesów metabolicznych, można uzyskać większe ilości metabolitów pierwotnych. Większość z metabolitów pierwotnych uzyskuje się w procesach biotechnologicznych, np. kwasy organiczne, aminokwasy, nukleotydy, witaminy i prowitaminy, alkohole i rozpuszczalniki, polisacharydy, lipidy i enzymy.

Kwasy organiczne, takie jak octowy, propionowy, masłowy, szczawiowy, fumarowy, itakonowy, kwas cytrynowy, mlekowy, winowy, α-ketoglutarowy, glukonowy, 2-okso-D-glukonowy, 5-okso-D-glukonowy, 2,5-diokso-D-glukonowy, 2-okso-L-gulonowy, epoksy-bursztynowy, izoaskorbinowy i kojowy, są produkowane przez mikroorganizmy. Produkcja poszczególnych kwasów organicznych jest indywidualna dla każdego kwasu oraz mikroorganizmu stosowanego do jego produkcji. Celem pozyskania odpowiednich kwasów organicznych stosuje się odpowiednie gatunki należące do rodzaju Acetobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Aspergillus, Brevibacterium, Bacillus, Candida, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Hansenula, Kluyvera, Lactobacillus, Microbacterium, Pseudomonas, Paracolobacterium, Penicillium, Pichia, Propionibacterium, Proteus, Rhizopus, Serratia.

Aminokwasy: L-alanina, L-arginina, kwas L-asparaginowy, L-cytrulina, L-DOPA, kwas L-glutaminowy, L-histydyna, L-homoseryna, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyna, L-ornityna, L-fenyloalanina, L- prolina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, L-tyrozyna i L-walina produkuje się z wykorzystaniem organizmów należących do rodzaju Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Nocardia, Serratia, Arthrobacter, Streptomyces, Hansenula, Candida, Proteus i Aerobacter. Najczęściej aminokwasy otrzymuje się w hodowlach tlenowych zanurzonych, indywidualnych dla każdego organizmu i produkowanego aminokwasu. W wielu przypadkach szczepy należące do jednego gatunku produkują różne aminokwasy. Aminokwasy produkowane przez mikroorganizmy mają jedną formę izomeryczną. Mutanty bakterii Corynebacterium glutamicum i Brevibacterium flavum produkują ogromne ilości lizyny, wykorzystując do syntezy tego aminokwasu około jedną trzecią ilości węgla obecnego w podłożu.

Nukleotydy produkowane przemysłowo z zastosowaniem szczepów z rodzaju Micrococcus, Brevibacterium i Bacillus to głównie inozyno-5--monofosforan, guanozyno-5-monofosforan i ksantozyno-5-monofosforan. Nukleotydy te są stosowane w farmaceutyce oraz dodawane jako suplementy do żywności. Z kwasem glutaminowym dają efekt synergistyczny.

Witaminy i prowitaminy potrzebne mikroorganizmom mogą być przez nie syntetyzowane. Niektóre z nich są produkowane pozakomórkowo. Szczególne znaczenie mają mikroorganizmy produkujące witaminy B_12 (cyjanokobalamina), B_2 (ryboflawina, laktoflawina), ergosterol (prowitamina D_2) i β-karoten (prowitamina A), gdyż są jedynym ich źródłem w skali przemysłowej. Innym źródłem witamin są wątroba (B_12) oraz marchew (β-karoten). Komercyjne zastosowanie mają witaminy produkowane przez mikroorganizmy jak kwas pantotenowy, tiamina, kwas foliowy, kwas limonowy, witamina C i witamina K. Producentami witamin są szczepy z rodzaju Propionibacterium, Pseudomonas, Clostridium, Debaromyces, Candida, Ashby, Eromothecium, Streptomyces, Sporobolomyces, Bacillus i Chlorella. Prowitamina A (β-karoten) jest produkowana przez Choanephora, Blakeslea, Rhodotorula, Mycobacterium i Nocardia. Mutant Pseudomonas denitrificans może syntetyzować 50 000 razy więcej witaminy niż jego typ dziki. Ergosterol jest odzyskiwany z komórek drożdży.

Alkohole i rozpuszczalniki są produkowane w procesie fermentacji w warunkach beztlenowych. Ich produkcja na skalę przemysłową była stosowana jako pierwsza od XIX w. Pierwszym związkiem produkowanym przez mikroorganizmy na skalę przemysłową, wykorzystywanym następnie do produkcji syntetycznej skóry, był prawdopodobnie butanol. Obecnie na skalę przemysłową produkuje się butanol, aceton, butane-2,3-diol, glicerol, D-mannitol, D-arabitol, ksylitol, erytritol i dihydroksyaceton. Do ich produkcji wykorzystuje się szczepy z rodzaju Clostridium, Aerobacter, Serratia, Bacillus, Candida, Pichia, Monilia, Hansenula, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Acetobacter, Trigonopsis, Bacterium i Brevibacterium.

Polisacharydy są naturalnymi materiałami zapasowymi i składnikami roślin. Od 20 lat produkuje się je przemysłowo przy wykorzystaniu mikroorganizmów. Generalnie polisacharydy powodują wzrost lepkości w podłożach hodowlanych. Dziś na skalę przemysłową produkuje się pullulan, kurdlan, skleroglukan, dekstran, ksantan, bursztynyloglukan i alginian. Wykorzystuje się do tego szczepy należące do rodzaju Leuconostoc, Streptobacterium, Streptococcus, Xanthomonas, Aureobasidium, Dematium, Sclerotium, Plectania, Helotium, Alcaligenes, Pseudomonas, Azotobacter i Erwinia. Polisacharydy są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym, w farmacji i medycynie, immunochemii, przemyśle tekstylnym, papierniczym, kosmetycznym i pasz dla zwierząt.

Lipidy produkowane przez mikroorganizmy są dodawane jako suplementy do karmy dla zwierząt. Mikroorganizmami produkującymi lipidy są grzyby pleśniowe i drożdże. Do produkcji lipidów zdolne są następujące gatunki drożdży: Candida curvata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus curvatus, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica, grzyby strzępkowe: Aspergillus oryzae, Cunninghamella echinulata, Mucor mucedo, Rhizopus arrhizus, Mortierella isabellina, Mucor circinelloides, Pythium ultimum oraz bakterie: Arthrobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Rhodococcus opacus i Bacillus alcalophilus.

Enzymy to klasa białek pozyskiwanych metodami biotechnologicznymi. Wykorzystuje się je w różnych gałęziach przemysłu. Są to amylazy, celulazy, pektynazy, lipazy, proteazy, inwertazy, oksydaza glukozowa, izomeraza glukozowa, dekstrancukraza, penicylinaza, katalaza, peroksydazy, monooksygenazy. W przemysłowej produkcji enzymów wykorzystuje się szczepy należące do rodzaju Trichoderma, Byssochlamys, Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Bacillus, Rhizopus, Candida, Mucor, Nortierrella, Clostridium, Saccharomyces, Streptomyces, Leuconostoc i Actinomyces.

2.2.2. Metabolity wtórne

Metabolity wtórne są produkowane przez żywe komórki, lecz nie są absolutnie konieczne do ich wzrostu i przyrostu biomasy. Mają małą masę cząsteczkową. Należą do nich antybiotyki, roślinne hormony wzrostu, alkaloidy, toksyny oraz pewne niezwykłe aminokwasy. Znanych jest więcej niż 6000 metabolitów produkowanych przez mikroorganizmy, ale marketingowe znaczenie ma jedynie około 100 z nich. Ich chemiczna struktura oraz trudne do zidentyfikowania funkcje odbiegają od metabolitów pierwotnych. Produkcja oraz szybkość pozyskiwania metabolitów wtórnych zależą od cyklu rozwojowego mikroorganizmu (od kilkudziesięciu minut do kilku dni w warunkach laboratoryjnych). Wytwarza się je nie tylko w bardzo małych ilościach. W tabeli 2.1 przedstawiono przykładowe grupy metabolitów wtórnych biologicznie aktywnych produkowane przez mikroorganizmy.

Antybiotyki są wykorzystywane głównie jako dodatki do pasz dla zwierząt oraz w medycynie do zabijania mikroorganizmów patogenicznych. Ponad połowa antybiotyków jest produkowana przez promieniowce, szczególnie przez Streptomyces, niektóre grzyby, jak Penicillium, Aspergillus, Trichoderma i Fusarium, oraz pewne Basidiomycota.

Ze względu na strukturę cząsteczki wyróżnia się następujące typy antybiotyków:

- 1) β-laktamowe (penicyliny i cefalosporyny);

- 2) polipeptydy (gramicydyny A, B, C i S, tyrocidyna, polimyksyna, bacytracyna itp.);

- 3) aminoglikozydy (streptomycyna, neomycyna, gentamycyna, kanamycyna, streptydyna);

- 4) makrolidowe (erytromycyna [I generacji], klarytromycyna, azytromycyna, josamycyna, spiromycyna i roksatromycyna [II generacji] itp.);

- 5) związki chinonowe (tetracyklina, emodyna, islandycyna itp.);

- 6) z aromatycznymi pierścieniami (chloramfenikol, gryzeofulwina, nowobiocyna);

- 7) o różnej strukturze niezaliczane do ww. grup (mitomycyna, aktynocycyna, puromycyna itp.).

Pewne związki produkowane przez mikroorganizmy uważane za mikotoksyny jak patulina lub zearaleon są podobne do takich antybiotyków jak emodyna i islandycyna.

Hormony steroidowe są produkowane przez niektóre grzyby strzępkowe, a hormony roślinne jak gibereliny – przez Gibberella fujikuroi. Powstają one na drodze konwersji substancji znajdujących się w środowisku.

Tabela 2.1. Aktywność biologiczna pewnych metabolitów wtórnych produkowanych przez mikroorganizmy przemysłowo istotne

Substancje aktywne

Przykłady

Mikroorganizm

antybakteryjne

cefalosporyna

cefamycyna

chloramfenikol

erytromycyna

kenamycyna

penicylina

ryfamycyna

spektynomycyna

streptomycyna

tetracyklina

Acremonium chrysogenum

Saccharopolyspora erythraea

Streptomyces kanamyceticus

Streptomyces aureofaciens

Streptomyces clavuligerus

Penicillium chrysogenum

Amycolatopsis mediterranei

Streptomyces spectabilis

Streptomyces griseus

Streptomyces venezuelae

antygrzybicze

amfoterycyna

aureofacyna

griseofulwina

kandycidyna

kwas aspergilowy

nystatyna

oligomycyna

Streptomyces nodosus

Streptomyces aureofaciens

Penicillium griseofulvum

Streptomyces griseus

Aspergillus flavus

Streptomyces nourse

Streptomyces diastachromogenes

inhibitory enzymów

kwas klawulanowy

Streptomyces clavuligerus

immunosupresory

cyklosporyna A

rapamycyna

takrolimus (FK-506)

Tolypocladium inflatum

Streptomyces hygroscopicus

Streptomyces spp.

antyrakowe

aktynomycyna D

bleomycyna

doksarubicyna

mitomycyna

taksol

Streptomyces antibioticus

Streptomyces verticillus

Streptomyces peucetius

Streptomyces lavendulae

Taxomyces andreanae

antycholesterolowe

lowastatyna

monakolina

prawastatyna

Aspergillus terreus

Monascus ruber

Penicillium citrinum

promotory wzrostu

monensyna

tylozyna

Streptomyces cinnamonensis

Streptomyces fradiae

hormony wzrostu roślin

giberelina

Gibberella fujikuroi

herbicydy

bialafos

Streptomyces hygroscopicus

insektycydy

awermektyna

milbemycyna

Streptomyces avermitilis

Streptomyces hygroscopicus

Toksyny są wydzielane przez niektóre mikroorganizmy jako substancje szkodliwe, w szczególności skierowane przeciwko organizmom stałocieplnym, ale pewne z nich mogą być wykorzystywane w farmacji i medycynie w małych ilościach jako antygeny, szczepionki albo antytoksyny. Na przykład alkaloidy wytwarzane przez Claviceps purpurea są produkowane i wykorzystywane w medycynie, natomiast aflatoksyn produkowanych przez Aspergillus flavus należy unikać. Niektóre toksyny wykorzystuje się jako bioinsektycydy. Toksyny są produkowane przez bakterie: Corynebacterium diphtheriae, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Salmonella, Bacillus thuringiensis oraz grzyby: Aspergillus i Claviceps.

Niezwykłe aminokwasy w żywym organizmie to takie, które (oprócz β-alaniny) mają inną strukturę niż α-aminokwasy lub mają dodatkową grupę funkcyjną. Aminokwasy te mogą znajdować się w komórkach mikroorganizmów zarówno w postaci wolnej, jak i być zawarte w peptydzie. Do tej pory zidentyfikowano ponad 100 aminokwasów. Są to izomeryczne formy D-aminokwasów. Tworząc polipeptydy, często występują one w strukturach polisacharydowych produkowanych przez mikroorganizmy. Niektóre z nich występują w postaci wolnych aminokwasów, di- lub tripeptydów, różnych związków toksycznych lub pełnią rolę antybiotyku, jak azaseryna, azaleucyna, alanozyna, kwas diaminobursztynowy, DON (6-diazo-5-okso-L-norleucyna) i tabtoksyna.

2.3.Mikroorganizmy stosowane w mikrobiologii przemysłowej

2.3.1. Bakterie

W mikrobiologii przemysłowej są powszechnie stosowane trzy grupy organizmów: bakterie, drożdże i grzyby strzępkowe.

Bakterie są wykorzystywane do produkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych. Są również stosowane jako komórkowe fabryki do wytwarzania somatostatyny, insuliny, bydlęcego hormonu wzrostu wykorzystywanych w weterynarii, α-1 antytrypsyny, interleukiny-2, czynnika martwicy nowotworów, β-interferonu i γ-interferonu. Escherichia coli jest jednym z najwcześniej i najczęściej stosowanych bakterii do produkcji białek heterologicznych. Już w 1993 r. zrekombinowane procesy Escherichia coli dostarczyły produktów metabolicznych o wartości prawie 5 mld dolarów, tj. insuliny, ludzkiego hormonu wzrostu, interferonów i G-CSF. Do zalet Escherichia coli należą szybki wzrost, szybka ekspresja, łatwość hodowli i modyfikacji genomu, niski koszt i wysoka wydajność produktu. Służy on do masowej produkcji wielu skomercjalizowanych białek, jest doskonały do funkcjonalnej ekspresji białek nieglikozylowanych.

Genetyka Escherichia coli jest znacznie lepiej poznana niż innych mikroorganizmów. Ostatnie postępy w fundamentalnym rozumieniu transkrypcji, translacji i zwijania białek w Escherichia coli, wraz z dostępnością ulepszonych narzędzi genetycznych, czynią tę bakterię bardziej wartościową niż kiedykolwiek w ekspresji złożonych białek eukariotycznych. Jej genom można szybko i precyzyjnie z łatwością modyfikować, kontrola promotora nie jest trudna, a liczba kopii plazmidu może być łatwo zmieniona. System ten charakteryzuje się również zmianą metabolicznego przepływu węgla w zależności od potrzeb, unikaniem wbudowywania analogów aminokwasów, tworzeniem wewnątrzkomórkowych wiązań disiarczkowych i odtwarzalną wydajnością przy kontroli komputerowej. Escherichia coli może gromadzić białka rekombinowane do 80% suchej masy i przetrwać różne warunki środowiskowe. Produkcja rekombinowanego białka w Escherichia coli może być zwiększona przez mutacje, które eliminują wytwarzanie octanu.

Bakterie z rodzaju Bacillus (zazwyczaj Bacillus megaterium, Bacillus subtilis i Bacillus brevis) osiągają wydajność produkcji białek ssaków sięgającą 3 g/l. Staphylococcus carnosus może wytwarzać 2 g/l wydzielanego białka ssaków. Ulepszony producent z bakterii Gram-ujemnych do produkcji białka rekombinowanego został skonstruowany przy użyciu szczepu Ralstonia eutropha. Pod względem tworzenia inkluzji układ ten okazał się lepszy od Escherichia coli. Organofosfohydrolaza, białko podatne na tworzenie inkluzji produkowane w ilości mniejszej niż 100 mg/l przez Escherichia coli, zostało wytworzone w ilości 10 g/l przez Ralstonia eutropha. Inną użyteczną bakterią jest Pseudomonas fluorescens MB101. Ten system wytworzył 4 g/l TNF-α (czynnika martwicy nowotworów).

2.3.2. Drożdże

Drożdże to jednokomórkowe organizmy grzybów eukariotycznych. Często stosuje się je do wytwarzania białek rekombinowanych, których nie wytwarzają dostatecznie dobrze komórki Escherichia coli z powodu problemów z ich składaniem lub potrzebą glikozylacji. Główne zalety układów ekspresyjnych drożdży to:

- 1) stabilność genetyczna szczepów produkcyjnych;

- 2) prowadzenie procesu glikozylacji białek;

- 3) składanie białek;

- 4) produkcja białek bogatych w S–S;

- 5) obfity wzrost komórek (wydajność g/l oraz plon komórkowy g/g substratu);

- 6) szybki wzrost na zdefiniowanych podłożach;

- 7) obróbka produktu podobna do takiej jak w komórkach ssaków.

Szczepy drożdży są dobrze scharakteryzowane genetycznie. Wiadomo, że dokonują wielu potranslacyjnych modyfikacji syntetyzowanych białek. Są łatwiejsze i tańsze w badaniach i ich zastosowaniu przemysłowym niż komórki owadów lub ssaków i łatwo przystosowują się do warunków fermentacji.

Dwa najczęściej wykorzystywane szczepy drożdży to Saccharomyces cerevisiae i drożdże metylotroficzne Pichia pastoris. Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger jest produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 9 g/l. Rekombinowane produkty dostępne na rynku wytwarzane przez Saccharomyces cerevisiae to insulina, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, oksydaza moczanowa, glukagony, czynnik stymulujący kolonizację makrofagów granulocytów (GM-CSF), hirudyna i płytkowy czynnik wzrostu.

Pichia pastoris wykazują silny wzrost oraz indukowaną metanolem ekspresję i sekrecję rekombinowanych białek. Są stosowane do komercyjnej produkcji nieglikozylowanej albuminy surowicy ludzkiej i glikozylowanych szczepionek. Skonstruowano szczepy zdolne do N-glikozylacji typu ludzkiego, a produkty są już w fazie testów klinicznych. Wysokie wydajności białka rekombinowanego można uzyskać za pomocą Pichia pastoris (10 g/l czynnika powodującego martwicę nowotworu, 14,8 g/l żelatyny, 15 g/l mysiego kolagenu, fitazy Escherichia coli i 6 g/l lipazy/acetylotransferazy oraz 6 g/l genu Candida parapsilosis). Białka bakteryjne, takie jak wewnątrzkomórkowy fragment tężcowy C, można wytwarzać z wydajnością 12g/l. Albumina surowicy była produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 0,15 g/l, a Pichia pastoris produkuje ją w ilości 10 g/l. Mówi się, że Pichia pastoris może wytworzyć 20–30 g/l rekombinowanych białek. Heterologiczna ekspresja genu u innego gatunku metylotroficznych drożdży Hansenula polymorpha spowodowała produkcję 13,5 g/l fitazy, a innych białek – powyżej 10 g/l. Do zalet drożdży metylotroficznych w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae jako gospodarzem klonującym należą:

1. 1) wyższa produktywność białka;

2. 2) unikanie hiperglikozylacji;

3. 3) wzrost przy takich stężeniach metanolu, które zabijają większość innych mikroorganizmów;

4. 4) tania eksploatacja systemu;

5. 5) integracja wielokopii obcego DNA do chromosomalnego DNA, dającego stabilne transformanty.

2.3.3. Grzyby strzępkowe

Grzyby strzępkowe są atrakcyjnymi gospodarzami technologii rekombinacji DNA ze względu na zdolność do wydzielania dużych ilości bioaktywnych białek z przetwarzaniem posttranslacyjnym, takim jak glikozylacja. Aspergillus niger produkuje 25 g/l natywnej glukoamylazy. Obce geny można włączyć przez plazmidy do chromosomów grzybów strzępkowych, gdzie stabilnie integrują się z chromosomem jako powtórzenia tandemowe zapewniające doskonałą długoterminową stabilność genetyczną. Podobnie jak komórki ssaków, grzyby posiadają system komórkowy do translacji białek, fałdowania białek i modyfikacji posttranslacyjnej. Podobnie jak bakterie, grzyby strzępkowe są łatwe w hodowli na podłożach zdefiniowanych. Rozwój genetyczny Aspergillus obejmuje:

1. 1) układy transformacyjne;

2. 2) konstrukty ekspresyjne;

3. 3) ukierunkowaną integrację i manipulację liczbą kopii;

4. 4) promotory;

5. 5) ulepszone projektowanie genów;

6. 6) inżynierię proteaz, wydzielanie i glikozylację;

7. 7) narzędzia do znakowania i wyciszania genów.

1000-krotny wzrost produkcji fitazy osiągnięto w hodowlach Aspergillus niger dzięki zastosowaniu technologii rekombinacji. Rekombinowany Aspergillus oryzae może wytworzyć 2 g/l ludzkiej laktoferyny, a Mucor – 3,3 g/l reniny. Produkcja ludzkiej laktoferyny przez Aspergillus awamori za pośrednictwem technologii rDNA wzrosła do 2 g/l białka zewnątrzkomórkowego. Glukoamylaza Aspergillus niger wklonowana do Aspergillus awamori była produkowana z wydajnością 4,6 g/l. Grzyb Chrysosporium lucknowense został genetycznie przekształcony w niestrzępkowy, mniej lepki szczep wytwarzający małe ilości proteazy, który jest zdolny do wytwarzania bardzo dużych ilości białek heterologicznych. Dyadic International, Inc., firma zajmująca się rozwojem systemu Chrysosporium lucknowense uzyskuje produkcję natywnego białka zewnątrzkomórkowego do 100 g/l.

2.4.Izolacja mikroorganizmów przemysłowych

Mikroorganizmy przemysłowe są z wielu powodów bardzo wygodne do stosowania, zwłaszcza dla inżynierii genetycznej i metabolicznej. Wyekstrahowane z komórek mikroorganizmów przemysłowych łańcuchy DNA mogą być łatwo pocięte przez enzymy restrykcyjne produkowane przez różne inne mikroorganizmy, tworząc odpowiednie fragmenty DNA. Z kolei małe fragmenty DNA można połączyć w cząsteczki DNA wektora za pomocą ligazy DNA, tworząc sztuczne cząsteczki DNA. Wektory można łatwo wprowadzić do gospodarza, którym mogą być wirusy lub bakterie. Są one replikonami, które mogą istnieć w stanie pozachromosomalnym, mogą być przenoszone drogą transdukcji i transformacji. Łatwa jest także ostateczna charakterystyka rekombinowanego klonu.

Strategie przyjęte do izolacji odpowiedniego mikroorganizmu przemysłowego ze środowiska naturalnego można podzielić na dwa typy shotgun i racjonalne (obiektywne). Strategie typu shotgun polegają na tym, że próbki żywych mikroorganizmów zbiera się z biofilmów, materiału zwierzęcego i roślinnego, gleby, ścieków, wody i strumieni odpadów, a także ze środowisk skrajnych oraz niezwykłych siedlisk stworzonych przez człowieka. Następnie bada się je pod kątem pożądanych cech. Bardziej racjonalne (obiektywne) jest pobieranie próbek z określonych miejsc, w których składnikami naturalnej mikroflory są prawdopodobnie organizmy o pożądanych właściwościach. Na przykład mikroorganizm, który degraduje lub transformuje jakiś związek chemiczny, przez co czyni go nieszkodliwym dla środowiska, będzie prawdopodobnie obecny w miejscach zanieczyszczonych tym związkiem. Zatem należy go tam właśnie szukać, a następnie pobrać i wyizolować.

Po pobraniu próbek poważnym problemem jest wybranie właściwego podłoża hodowlanego i warunków hodowli, które należy zastosować do wyizolowania docelowego mikroorganizmu czy mikroorganizmów. W tym celu najczęściej zabija się lub hamuje wzrost organizmów powszechnie występujących w środowisku, a promuje do wzrostu mikroorganizmy rzadkie, niepoznane, o szczególnych cechach. Można także stosować hodowle okresowe namnażające, wzbogacające w populacje bardzo rzadkie lub prowadzić hodowle ciągłe sprzyjające namnażaniu się różnych mikroorganizmów. Sprzyjające warunki zachęcają do wzrostu organizmy docelowe o pożądanych cechach i zwiększają ich ilość przed izolacją i badaniem przesiewowym. Jednakże ten sposób selekcji jest odpowiedni tylko wówczas, gdy pożądana cecha zapewnia przewagę konkurencyjną organizmom. Stosuje się wiele rodzajów podłoży, ale nie ma takiego, które byłoby odpowiednie dla wszystkich mikroorganizmów. Na przykład, jeśli bakterie z próby gleby zostaną wysiane na agar odżywczy (pH 7,0) i inkubowane w temp. 37°C przez 24−48 godz. wyrośnie jedna frakcja tlenowych mezofilnych bakterii. Zgubione zostaną beztlenowce, termofile, alkalifile i acydofile. Powolny wzrost mezofili jak Actinomycetes, a także patogennych mezofili nie jest możliwy na agarze odżywczym. Jeśli wyrośnie mikroorganizm wydzielający substancje antybakteryjne, uniemożliwi wzrost pewnych bakterii mezofilnych. W celu zahamowania wzrostu grzybów do podłoża dodaje się antygrzybowy czynnik (cykloheksamid i nystatynę w stężeniu 50−100 µg/ml). Do izolacji bakterii Gram-ujemnych stosuje się agar MacConkeya zawierający sole kwasów żółciowych, które hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich. Do izolacji bakterii sporujących próby przed wysiewem podgrzewa się do temp. 70°C przez 10−15 min w celu zabicia form wegetatywnych i wysiewa je na podłoże M-9 z różnymi źródłami węgla. Bakterie tworzące strzępki rosną na podłożach powoli. Najliczniej występują w glebach rolniczych. Ich liczebność jest największa w sezonie suchym, a znacznie mniejsza w deszczowym. Gleba powietrznie wysuszona przez kilka dni jest idealna do selekcji Actinomycetes. Ta grupa bakterii rozwija się najlepiej na podłożu zawierającym argininę i glicerol. Ponadto dodaje się do niego chloramfenikol (50 µg/ml), nystatynę (50 µg/ml), polimyksynę (50 µg/ml) i penicylinę (100 µg/ml) w celu zahamowania wzrostu grzybów i innych bakterii.

Grzyby są bardzo różnorodne i mają różne wymagania pokarmowe. Podłoże zawierające substancje odżywcze powinno być wzbogacone w związki antybakteryjne, jak penicylinę, streptomycynę, chloramfenikol, kanamycynę i tetracyklinę, w celu zahamowania wzrostu bakterii. Do izolacji grzybów najczęściej stosuje się podłoże PDA (Potato Dextrose Agar) oraz podłoże z różem bengalskim.

Izolacja następcza na odpowiednich podłożach selekcyjnych i w określonych warunkach wzrostu prowadzi do pozyskiwania czystych szczepów rosnących na zestalonym podłożu wzrostowym. Po wyizolowaniu czystych szczepów, każdy z nich musi być poddany badaniom przesiewowym pod kątem pożądanej właściwości, produkcji specyficznych enzymów czy produkcji związków inhibitorowych. Jednak na tym etapie poziom aktywności lub stężenia produktu nie ma większego znaczenia, ponieważ rozwój szczepu można ulepszać różnymi technikami, aby doprowadzić do znacznej poprawy jego wydajności. Wybrane izolaty muszą być również badane pod kątem takich ważnych cech, jak stabilność szczepu oraz, w razie potrzeby, nietoksyczność.

Procedury izolacji i badań przesiewowych są łatwiejsze do zastosowania w poszukiwaniu pojedynczego mikroorganizmu. Znacznie trudniej jest wyodrębnić konsorcja, które razem wykazują poszukiwaną zdolność/charakterystykę i których skład może się zmieniać w czasie. Takie grupy mogą być bardziej wydajne, zwłaszcza tam, gdzie chodzi o zdolność do degradacji złożonego związku, opornego na ataki pojedynczych organizmów.

2.5.Ważniejsze kolekcje szczepów

Na całym świecie istnieje prawie 500 kolekcji mikroorganizmów, w większości niewielkich lub sprofilowanych, które dostarczają odpłatnie pożądanych szczepów lub świadczą inne powiązane usługi objęte porozumieniem. I tak w Wielkiej Brytanii istnieje UKNCC składająca się z kilku kolekcji trzymanych w różnych instytucjach specjalizujących się w kolekcjach bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych lub glonów o znaczeniu przemysłowym lub medycznym. W USA istnieje kolekcja scentralizowana American Type Culture Collection (ATCC), która przechowuje wszystkie rodzaje mikroorganizmów. Warto nadmienić, że na długiej liście różnych kolekcji nie ma kolekcji polskich. Szczepy stosowane w badaniach znajdują się w laboratoriach Zakładów Naukowych: Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Wydziału Chemii i Technologii Żywności Politechniki Łódzkiej, Akademii Techniczno-Ekonomicznej we Wrocławiu, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Instytutu Przemysłu Mleczarskiego w Warszawie, Uniwersytetu Adama Mickiewicza, Uniwersytetu Jagiellońskiego. Listę największych kolekcji mikroorganizmów przedstawiono w tabeli 2.2.

W sumie we wszystkich kolekcjach Global Catalogue of Microorganisms w 2019 r. znajdowały się 232 gatunki (580 szczepów) Cyanobacteria, 20 797 gatunków (145 963 szczepy) Bacteria, 1422 gatunki (3442 szczepy) Archaea, 29 290 gatunków (226 152 szczepy) grzybów, 4435 gatunków (15 144 szczepy) glonów, 33 gatunki (296 szczepów) wirusów, 299 gatunków (456 szczepów) fagów, 2030 plazmidów, 238 gatunków (755 szczepów) Protozoa oraz 1833 gatunki (7428 szczepów) innych organizmów. Łącznie w GCM znajduje się 54 736 gatunków (447 512 szczepów) mikroorganizmów.

Najliczniejsze są szczepy związane z człowiekiem, roślinami oraz występujące w próbkach gleby (tab. 2.3).

Tabela 2.2. Lista największych kolekcji mikroorganizmów

Lp.

Akronim

Nazwa instytucji

Kraj

Adres internetowy

1

ATCC

American Type Culture Collection

USA

www.atcc.org/

2

BCRC

Bioresource Collection and Research Center/Food Industry Research and Development Institute

Chiny Taipei

www.bcrc.firdi.org.tw

3

CAIM

Collection of Aquatic Important Microorganisms/CIAD/Mazatlán Unit for Aquaculture and Environmental Management

Meksyk

www.ciad.mx/caim

4

CCM

Czech Collection of Microorganisms/Masaryk University Czech

Czechy

http://sci.muni.cz/ccm/index.html

5

CCUG

Culture Collection University of Gothenburg

Szwecja

www.ccug.se

6

CECT

Spanish Type Culture Collection/University of Valencia

Hiszpania

www.cect.org

7

CGMCC

China General Microbiological Culture Collection Center

Chiny

www.cgmcc.net

8

CICC

China Center of Industrial Culture Collection

Chiny

www.china-cicc.org

9

CIP

Collection de l’Institut Pasteur

Francja

https://catalogue-crbip.pasteur.fr

10

ICMP

International Collection of Microorganisms from Plants

Nowa Zelandia

www.landcareresearch.co.nz/icmp

11

JCM

Japan Collection of Microorganisms/RIKEN BioResource Research Center

Japonia

http://icm.brc.rike.jp/

12

KCTC

Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

Korea

http://kctc.kribb.re.kr

13

KMM

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far-Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Rosja

niedostępny

14

NBRC

Biological Resource Center/National Institute of Technology and Evaluation

Japonia

www.nite.go.jp/en/nbrc/index.html

15

NCAIM

National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms

Węgry

http://ncaim.uni-corvinus.hu/

16

NCTC

National Collection of Type Cultures

Anglia

www.pheculturecollections.org.uk/

17

PCU

Pharmaceutical Sciences Chulalongkorn University Culture Collection/Chulalongkorn University

Tajlandia

niedostępny

18

TBRC

Thailand Bioresource Research Center/National Center for Genetic Engineering and Biotechnology

Tajlandia

www.tbrcnetwork.org

19

TISTR

TISTR Culture Collection/Bangkok MIRCEN

Tajlandia

www.tistr.or.th/tistr_culture

20

VKM

All-Russian Collection of Microorganisms

Rosja

http://www.vkm.ru/

Tabela 2.3. Liczebności szczepów izolowanych z różnych próbek

Źródło izolacji

Liczba szczepów

Powietrze

61

Produkty fermentacji

1237

Żywność

464

Genetycznie zmodyfikowane

22 698

Związane z gospodarzem

802

Związane z człowiekiem

11 265

Biofilmy

202

Inne

4761

Związane z roślinami

4436

Osady

496

Ścieki/osad czynny

1189

Gleba

4899

Woda

2602

Laboratoria kolekcjonujące szczepy mają za zadanie utrzymanie istniejących kolekcji, dalsze zbieranie nowych szczepów i dostarczanie czystych, uwierzytelnionych próbek szczepu każdego organizmu. Utrzymanie kolekcji szczepów stało się łatwiejsze dzięki zastosowaniu technik kriokonserwacji i liofilizacji, a także zminiaturyzowanej metody ich przechowywania. Inna dogodna metoda polega na adsorpcji komórek na kulkach szklanych (średnicy 2 mm) przechowywanych w zamrożonym magazynie, z którego można pobierać pojedyncze kulki bez rozmrażania całej próbki. Zastosowanie mikroorganizmów wybranych z kolekcji hodowli jest znacznie tańsze w porównaniu z izolacją środowiskową i ma tę zaletę, że pewna charakterystyka mikroorganizmu jest już przeprowadzona. Wadą jest jednak to, że konkurenci mają dostęp do tych samych mikroorganizmów.

2.6.Cechy szczepów przemysłowych

Niezależnie od pochodzenia mikroorganizmów szczepy przemysłowe powinny charakteryzować się takimi cechami, jak:

1. 1) zdolność do wykorzystywania tanich i łatwo dostępnych substratów przez cały czas;

2. 2) produkcja dużych ilości biomasy oraz dużych ilości produktu przemysłowego;

3. 3) brak cech patogenicznych i alergenowych;

4. 4) stabilność genetyczna;

5. 5) przydatność do manipulacji genetycznych;

6. 6) pozakomórkowe wydzielanie bioproduktu;

7. 7) uleganie zjawisku represji przez sprzężenie zwrotne;

8. 8) możliwość prostej ekstrakcji/oczyszczania bioproduktu.

Celem procesów biotechnologicznych jest przede wszystkim poprawa lub optymalizacja szczególnych cech poszukiwanych w danym organizmie. Postępy w tej dziedzinie osiągnięto, stosując techniki przesiewowe i selekcyjne w celu uzyskania ulepszonych organizmów. W systemie selekcji wszystkie rzadkie lub nowe szczepy rosną, podczas gdy reszta nie. W systemie przesiewowym wszystkie szczepy rosną, ale pewne szczepy są wybierane, ponieważ wykazują pożądane właściwości wymagane przez dany przemysł.

2.7.Manipulacje genetyczne mikroorganizmów

Klasyczne metody inżynierii genetycznej odgrywają istotną rolę w ulepszaniu szczepów w mikrobiologii przemysłowej. Permanentne zmiany cech dziedzicznych w genetycznej naturze organizmu są nazywane mutacjami. Czynnik, który powoduje mutacje, jest nazywany mutagenem, a organizm, w którym ta mutacja zachodzi – mutantem, ponieważ posiada gen/geny zmutowane. Jeżeli nie ma czynnika mutagennego, częstość mutacji genu jest bardzo niska i waha się od 10–8 do 10–10 na generację. W obecności czynnika mutagennego częstość mutacji może być wzmocniona od 100 do 100 000 razy. Do nadprodukcji metabolitów pierwotnych stosuje się takie techniki genetyczne, jak:

1. 1) rekonstrukcję genomu szczepu do produkcji aminokwasów, witamin, kwasów organicznych, alkoholi, karotenoidów;

2. 2) inżynierię genetyczną do produkcji ryboflawiny;

3. 3) technologię molekularną do produkcji kwasu mlekowego i etanolu.

Do nadprodukcji metabolitów wtórnych stosuje się następujące genetyczne techniki:

1. 1) fuzję protoplastów – w produkcji penicyliny G, cefalosporyny C, cefamycyny C, kwasu klawulanowego, idolizomycyny, rifamycyny;

2. 2) inżynierię metaboliczną – w produkcji antybiotyków (penicyliny G, cefalosporyny C, cefamycyny C, kwasu klawulinowego, półsyntetycznych cefalosporyn), czynników antyrakowych (antracykliny, glikopepeptolity, antracenony);

3. 3) transpozycję – w produkcji daptomycyny i tylozyny;

4. 4) analizę asocjacji – w produkcji lowastatyny;

5. 5) biosyntezę kombinatoryczną – w produkcji erytromycyny, tetracenomycyny, tylozyny, spiramycyny, surfaktyny;

6. 6) tasowanie całego genomu – w produkcji epotilonów i spinosadu;

7. 7) wydobywanie z genomu – w produkcji antybiotyków typu echinosporamycyny, związków antygrzybicznych itp.

2.7.1. Mutacje

Po znalezieniu obiecującego szczepu można ulepszyć go za pomocą chemicznej mutagenezy lub promieniowania ultrafioletowego. Metody te zwykle prowadzą tylko do utraty niepożądanych cech szczepu lub zwiększonej wydajności produkcji z powodu utraty funkcji kontrolnych. Rzadko prowadzą do pojawienia się nowej funkcji lub własności. Zatem organizm z pożądaną cechą zostaje wybrany ze środowiska naturalnego, namnażany i poddawany programowi mutacji, a następnie badany przesiewowo w celu wybrania najlepszych szczepów przemysłowych. Na przykład pierwsze szczepy Penicillium notatum, które można hodować tylko w hodowlach stacjonarnych (bez wytrząsania), produkowały penicylinę w niskich stężeniach. W 1943 r. wyizolowano szczep Penicillium chrysogenum (NRRL 1951), który został dodatkowo ulepszony na drodze mutacji. Po zadziałaniu promieniami rentgenowskimi, promieniami UV oraz gazem musztardowym wydajność produkcji penicyliny wzrosła ze 120 do 2580 IU. Obecnie większość penicylin jest produkowana z Penicillium chrysogenum hodowanego w tlenowych fermentorach z mechanicznym mieszadłem, dzięki czemu uzyskuje się 55-krotnie wyższą wydajność penicyliny niż z pierwotnych szczepów hodowanych w warunkach stacjonarnych. Istnieją dwa typy mutagenów:

1. 1) fizyczne, jak promieniowanie UV, X, γ,

2. 2) chemiczne, jak nitrosometyloguanidyna (NMG), sulfonian etylometanu (SEM), podtlenek azotu (N_2O).

Mutageny te powodują liczne zmiany DNA, w tym podstawianie par zasad (tranzycja/transwersja) oraz zmianę ramki odczytu – np. dodawanie/wypadanie nukleotydów. Mutacje są także wykorzystywane z sukcesem do wzrostu produkcji istotnie ważnych produktów, zwłaszcza antybiotyków i aminokwasów. Jednakże należy pamiętać, że mutacje fizyczne lub chemiczne podane poniżej są procesami na chybił trafił. Można uzyskać wzrost produkcji oczekiwanego metabolitu, lecz nie ma pewności, czy mutacja występuje w określonym regionie genu, czy dotyczy regionu regulacyjnego lub jeszcze innego (sekretnego szlaku).

Ostatnio genetyka przemysłowa coraz częściej wykorzystuje dwa nowe sposoby manipulowania DNA – fuzję protoplastów i komórek oraz technologię rekombinacji DNA (inżynierię genetyczną).

2.7.2. Fuzja protoplastów

Protoplasty to pojedyncze komórki pozbawione ścian komórkowych. Fuzja protoplastów dostarcza niepowtarzalnych narzędzi do pozyskiwania podobnych jak w procesie płciowym kombinacji genetycznych. Jest ona szeroko stosowana w biotechnologii roślin oraz grzybów, w tym drożdży. W procesie fuzji protoplastów komórki stają się hybrydami o pożądanych cechach. W pierwszej kolejności poddaje się degradacji ściany komórkowe. Na przykład komórki bakterii można pozbawić ścian komórkowych przez działanie lizozymu, a komórki grzybów – przez działanie celulaz i chitynazy. Po uwolnieniu ze ścian komórkowych protoplasty przybierają kształt sferyczny. Przenosi się je wówczas do roztworu osmotycznego, w którym nie ulegają lizie (roztwór izotoniczny). Protoplasty sformułowane w ten sposób są oddzielane od reszty komórek za pomocą wirowania różnicowego. W celu pokonania sił utrudniających wzajemnie łączenie się protoplastów stosuje się fuzję indukowaną chemicznie. W metodzie tej wykorzystuje się surfaktanty (niejonowe środki powierzchniowo czynne), takie jak PEG (glikol polietylenowy). Ich działanie polega na zmniejszaniu sił odpychania między protoplastami poprzez neutralizację ich ujemnego ładunku powierzchniowego. W efekcie protoplasty mogą się wzajemnie zlepiać, a następnie może dochodzić do wytworzenia integralnych połączeń między błonami zglutynowanych protoplastów. Inną metodą prowadzącą do połączenia się protoplastów jest elektrofuzja. Pod wpływem działania prądu zmiennego i stałego następuje ustawienie protoplastów wzdłuż linii pola elektrycznego. Stykają się przy tym bezpośrednio ze sobą, tworząc „łańcuchy”. Następnie dochodzi do odwracalnej perforacji błony komórkowej, która umożliwia fuzję błon stykających się ze sobą protoplastów. Technika ta umożliwia uzyskanie fuzji protoplastów z dużą częstością, przy niskiej ich cytotoksyczności. Po zakończeniu fuzji komórki są transferowane do podłoża namnażającego, w którym odtwarza się w nich ściana komórkowa. Protoplasty są regenerowane przy użyciu stabilizatorów osmotycznych, takich jak sacharoza. Ostatnim etapem jest powlekanie hybrydowych komórek selektywnym podłożem odżywczym, które podtrzymuje wzrost komórek hybrydowych. W końcowym etapie dokonuje się selekcji tych hybryd, która jest istotna przemysłowo. Główną zaletą techniki fuzji protoplastów jest to, że protoplasty różnych gatunków drobnoustrojów mogą zostać połączone, nawet jeśli nie są ściśle powiązane taksonomicznie. Na przykład protoplasty Penicillium roquefortii zostały połączone z Penicillium chrysogenum. Można łączyć nawet protoplasty drożdży i erytrocytów. W wyniku fuzji powstają heterokariony zawierające jądra i cytoplazmy obu partnerów. W przypadku genomu jądrowego po fuzji można uzyskać hybrydy symetryczne z pełną zawartością genomów obojga rodziców oraz hybrydy niesymetryczne mające niepełny genom jądrowy jednego z rodziców.

2.7.3. Klonowanie genów

Klonowanie genów jest wykorzystywane do pozyskiwania pożądanych szczepów przemysłowych. Geny wszystkich organizmów (mikroorganizmów, roślin i zwierząt) zawierają taki sam materiał genetyczny, nukleotydy (adeninę, guanidynę, cytozynę, tyminę) i geny mogą być przenoszone z jednego organizmu do drugiego. Wiele bioproduktów istotnych przemysłowo uzyskano metodą klonowania genów. Stosując tę technikę pozyskuje się kopie genów z ich wysoką ekspresją przez zamianę oryginalnego słabego promotora genu silnym promotorem. Proces klonowania genu wyjaśnia się następującym przykładem. Poszukuje się szczepu bakteryjnego produkującego istotną przemysłowo proteazę. Niefortunnie komórki bakterii produkującej proteazę rosną powoli i do wzrostu wymagają podłoża bogatego w związki organiczne. Ilości proteazy produkowanej przez te komórki są niewielkie. Szczepy bakterii produkujących duże ilości proteazy pozyskuje się przez klonowanie genu proteazy będącej pod wpływem silnego promotora u szybko rosnącego organizmu jak Escherichia coli, który nie ma dużych wymagań pokarmowych.

2.7.4. Protokół pozyskania szczepu przemysłowego

Z organizmu produkującego proteazę izoluje się genomowe DNA i tnie na krótkie fragmenty za pomocą specyficznego enzymu restrykcyjnego, np. BamH1. Z innego organizmu izoluje się obecny w nim plazmid i również tnie za pomocą tego samego enzymu. Fragmenty DNA oraz pociętego plazmidu miesza się razem i dodaje enzym ligazę, który łączy plazmid z fragmentami DNA. Zligowaną mieszaninę transferuje się następnie do zawiesiny kompetentnych komórek Escherichia coli i wysiewa na stałe podłoże selekcyjne, na którym rosną jedynie bakterie Escherichia coli posiadające plazmid. Płytki inkubuje się przez noc w temp. 37°C. Za pomocą tej techniki pozyskuje się setki transformantów. Niektóre z nich niosą gen proteazy. Transformanty (kolonie) identyfikuje się przez przeniesienie małej porcji każdej wyrosłej na szalce kolonii na podłoże z kazeiną i inkubuje przez całą noc w temp. 37°C. Kazeina dodana do podłoża opalizuje. Po inkubacji poszukuje się stref przejaśnienia wokół kolonii bakteryjnych, które są wskaźnikami aktywności proteaz produkowanych przez transformanty. Najprościej mówiąc, gen produkujący proteazę wolno rosnącej bakterii został wklonowany do Escherichia coli. Wklonowany fragment DNA przeniesiony przez plazmid niesie gen z oryginalnie słabym promotorem z dodatkowym nieistotnym fragmentem DNA. Celem znalezienia locus genu strukturalnego proteazy we wklonowanym fragmencie DNA, fragment ten zostaje poddany sekwencjonowaniu. Dokładne locus genu kodującego proteazę jest określane z zastosowaniem narzędzi bioinformatyki. Gen strukturalny jest sklonowany w wielu kopiach z wektorem z silnym promotorem i transformowany do Escherichia coli. Tak więc w ten sposób pozyskuje się nowy gen proteazy z silną ekspresją u Escherichia coli.

2.7.5. Rekombinacja genetyczna

Rekombinacja genetyczna zachodzi podczas normalnego rozmnażania płciowego, a w wyniku pęknięcia i ponownego połączenia cząsteczek DNA chromosomów następuje ponowne sortowanie materiału genetycznego, zjawisko to jest ograniczone do szczepów spokrewnionych taksonomicznie. Technologia rekombinacji DNA lub inżynieria genetyczna oferuje nieograniczone możliwości tworzenia nowych kombinacji genów. Techniki te umożliwiają łączenie cząsteczek DNA o dość zróżnicowanym pochodzeniu, a w połączeniu z technikami transformacji genetycznej ułatwiają wprowadzenie obcego DNA do innych organizmów. DNA można izolować z roślin, zwierząt lub mikroorganizmów (dawców) i podzielić na grupy zawierające jeden lub więcej genów. Takie fragmenty mogą być następnie łączone z innym fragmentem DNA (wektorem), a następnie przekazywane do komórki gospodarza lub biorcy, stając się częścią kodu genetycznego nowego gospodarza. Komórkę gospodarza można następnie namnażać, aby utworzyć nowe właściwości genetyczne i zdolności chemiczne, które były nieosiągalne za pomocą konwencjonalnych sposobów hodowli lub mutacji. Można także zsyntetyzowanych krótkie sekwencje DNA i wstawić do biorcy w procesie ukierunkowanej mutagenezy. Może to spowodować małe zmiany genetyczne prowadzące do zmiany jednego lub kilku aminokwasów w docelowym białku. Stwierdzono, że takie niewielkie zmiany aminokwasów prowadzą w wielu przypadkach do nieoczekiwanych zmian w charakterystyce białka i mogą prowadzić do powstania nowych produktów, takich jak enzymy bardziej oporne na środowisko oraz enzymy, które mogą katalizować pożądane reakcje. Zajmuje się tym inżynieria białek tworząca enzymy i bioaktywne peptydy o wyraźnie różnych właściwościach (stabilność, kinetyka, aktywność).

2.7.6. Metoda CRISPR/Cas

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to metoda inżynierii genetycznej pozwalająca na celowe i precyzyjne manipulacje genomem danego organizmu. W 1987 r. Yoshizumi Ishino odkrył, że komórki bakterii Escherichia coli posiadają w swoim materiale genetycznym, w ściśle określonym miejscu, kilka powtarzających się sekwencji. Okazało się, że jest to genotyp bakteriofagów, co sugerowało, że odkryto jeden z mechanizmów obrony immunologicznej występujący u bakterii. Dowiedziono z czasem, że nie tylko bakterie i archeony, ale komórki organizmów wyższych, w tym ludzi, mają identyczny mechanizm obrony immunologicznej przed egzogennymi elementami genetycznymi (wirusami czy plazmidami). System ten opiera się na przechowywaniu w genomie fragmentów „obcego DNA” pozyskiwanego np. w trakcie infekcji wirusowej, aby możliwe było w przyszłości wykrycie takiej sekwencji i jej zniszczenie przez nukleazy (enzymy tnące nić DNA obcego elementu genetycznego).

W organizmie bakterii CRISPR są krótkimi odcinkami DNA występującymi po kilka i oddzielonymi od siebie innymi odcinkami DNA (rys. 2.1).

Rys. 2.1. Powtarzające się sekwencje CRISPR w DNA bakterii Escherichia coli

Na czarno zaznaczono krótkie, powtarzające się sekwencje odkryte przez Yoshizumi Ishino, a umieszczone za nimi odcinki o różnych odcieniach szarości oraz zaznaczone jako cegiełki to fragmenty DNA wirusów.

Podczas transkrypcji cały odcinek DNA (z odcinkami CRISPR i odcinkami pomiędzy nimi) jest przekształcany w mRNA. W obróbce potranskrypcyjnej mRNA jest dzielone na krótsze odcinki crRNA (CRISPR RNA), zawierające odcinek CRISPR jak i odcinki bez CRISPR.

Rys. 2.2. Transkrypcja DNA i obróbka potranskrypcyjna mRNA

Następnie zachodzi przyłączenie odcinka tractRNA (transactive CRISPR RNA) do odcinka crRNA. Te dwa odcinki tworzą wspólnie gRNA, które jest wirusem stosowanym w mechanizmach obronnych komórki. Pozwala bakteriom, które przeżyły atak tego wirusa, uodpornić się na niego.

Rys. 2.3. Mechanizm tworzenia gRNA

Oprócz odcinka gRNA (wzorzec wirusa) potrzebny jest enzym z grupy Cas, zdolny do cięcia materiału genetycznego wirusa. W wyniku porównania gRNA z materiałem wirusa oraz jego bardzo precyzyjnym pocięciu przez enzym wirus nie jest zagrożeniem. Pozostałe odcinki wirusowego materiału genetycznego są wbudowywane w genom gospodarza w specjalnie przygotowane kasetony.

W przypadku CRISPR jako metody inżynierii genetycznej możliwe jest dokonywanie bardzo precyzyjnej modyfikacji genetycznej genomu komórki poddanej manipulacjom. Przy dokonywaniu transformacji genetycznej potrzebne jest odpowiednie gRNA oraz enzym Cas (CRISPR associated protein, najczęściej endonukleaza Cas9) w komórce docelowej, dokonująca enzymatycznego przecięcia nici DNA w pobliżu tej sekwencji. Zaprojektowane gRNA powinno zawierać początkową sekwencję 5’-NGG-3’, która jest rozpoznawana przez enzymy Cas oraz wspomagającą sekwencję na przeciwległej nici, antysensowną do sgRNA. Spełnienie tych dwóch warunków zapewnia wysoką specyficzność i wydajność dokonywanej transformacji. Metoda ta umożliwia samo przecięcie nici DNA, ale po połączeniu jej z procesami naprawy DNA jest możliwe wycięcie określonego segmentu DNA, a następnie „wklejenie” w to samo miejsce dostarczonej z zewnątrz sekwencji genetycznej.

2.7.7. Inżynieria metaboliczna

Inżynieria metaboliczna została zdefiniowana przez Baileya (1991 r.) jako „poprawa aktywności komórkowej przez manipulowanie funkcjami enzymatycznymi, transportowymi i regulacyjnymi komórki za pomocą technologii rekombinacji DNA”. Ponad 20 lat po tej pierwszej definicji inżynieria metaboliczna stała się nową dyscypliną nauki, coraz ważniejszą dziedziną badań w biotechnologii. Obecnie jest dziedziną interdyscyplinarną, która obejmuje biologię molekularną, mikrobiologię stosowaną, inżynierię reakcji biochemicznych, badania biomedyczne za pomocą wysokowydajnych narzędzi analitycznych w badaniach „omics” i bioinformatyce. Istnieją dwa główne podejścia w inżynierii metabolicznej: racjonalna inżynieria metaboliczna i odwrotna inżynieria metaboliczna. Racjonalna inżynieria metaboliczna wymaga obszernej informacji genetycznej i biochemicznej na temat metabolizmu lub szlaku metabolicznego będącego przedmiotem zainteresowania, aby zdefiniować pożądane manipulacje genetyczne. Komórkowe reakcje fizjologiczne są również bardzo złożone. Głównym racjonalnym ograniczeniem inżynierii metabolicznej jest brak wystarczających ilości informacji na temat zbyt skomplikowanej „fabryki komórkowej”, którą trzeba przeprojektować. Dodatkowe problemy to trudności w klonowaniu w szczepach przemysłowych z powodu braku odpowiednich narzędzi genetycznych i obawy społeczeństwa przed GMO (dotyczące przemysłu spożywczego). Odwrotne podejście do inżynierii metabolicznej miało na celu uniknięcie wyżej wymienionych ograniczeń. Pożądany fenotyp jest tu najpierw identyfikowany jako podejście „oddolne”, a następnie określa się jego podstawę genetyczną i/lub środowiskową, co jest najtrudniejszym krokiem. Jednak dzięki potężnym technologiom analitycznym w dziedzinie genomiki, transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki krok ten staje się możliwy. Tak więc bez jakichkolwiek obszernych wstępnych informacji na temat biochemii, genetyki i regulacji danego organizmu, można uzyskać jego pożądany fenotyp. Ewolucja adaptacyjna lub inżynieria ewolucyjna, która opiera się na losowej mutacji i selekcji za pomocą systematycznej hodowli początkowego szczepu mikroorganizmu w obecności presji selekcyjnej, tak aby uzyskać pożądane fenotypy, jest powszechną odwróconą strategią inżynierii metabolicznej. Inżynieria metaboliczna jest kluczową strategią wykorzystywania zdolności mikroorganizmów do produkcji związków organicznych z odnawialnych źródeł węgla. Procesy mikrobiologiczne mają znacznie mniejszy wpływ na środowisko niż procesy związane z wykorzystaniem ropy naftowej, ale są mniej atrakcyjne pod względem ekonomicznym. Dlatego ważne jest rozwijanie technologii szczepów ulepszonych pod względem wydajności, plonu i produktywności metodami inżynierii fizjologii mikrobiologicznej. Biorąc pod uwagę wartość rynkową produktów chemicznych uzyskiwanych z wykorzystaniem ropy naftowej, po osiągnięciu celu, konkurencyjne cenowo produkty biologiczne, miałyby znaczącą wartość ekonomiczną jako zamienniki. Szacuje się, że globalny udział w rynku produktów wzrośnie z 2% w 2008 r. do 22% w 2025 r. Ukierunkowane zabiegi tworzenia produktu lub właściwości komórek przez modyfikację określonych reakcji biochemicznych lub wprowadzenie nowych z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA obejmują także metody analityczne ilościowego określenia przepływów związków węgla i sterowania nimi za pomocą technik biologii molekularnej w celu wdrożenia sugerowanych modyfikacji genetycznych. Do sposobów analizowania strumienia węgla na szlaku metabolicznym zalicza się:

1. 1) studiowanie modeli opartych na kinetyce procesów;

2. 2) wykorzystanie teorii sterowania;

3. 3) eksperymenty ze znacznikami węgla;

4. 4) równoważenie metabolitu;

5. 5) oznaczanie aktywności enzymów;

6. 6) analizę zmian genetycznych.

Ogólny przepływ węgla przez szlak metaboliczny zależy od kilku etapów, a nie tylko od pojedynczej reakcji ograniczającej szybkość procesu. Wykorzystuje się to w ulepszonej produkcji aminokwasów, witamin, kwasów organicznych, etanolu, 1,3-propanodiolu i karotenoidów. Mikrobiolodzy zajmujący się fermentacjami poszukują w przyrodzie rzadkiego nadprodukcyjnego szczepu, a następnie poddają go dalszej możliwej deregulacji, aby produkował ogromne ilości pożądanego ważnego handlowego produktu, takiego jak pigment lub enzym. Deregulacja odbywa się przez manipulacje żywieniowe i molekularne manipulacje genetyczne, aby ominąć i/lub usunąć negatywne i wzmocnić pozytywne mechanizmy regulacyjne. Inżynieria metaboliczna została powszechnie uznana za skuteczne narzędzie do opracowywania biokatalizatorów pełnokomórkowych (ulepszonych szczepów produkcyjnych) do naturalnej nadprodukcji. Obecnie wyprodukowane katalizatory mikrobiologiczne (komórki fabryki), które stanowią praktyczny czynnik biotechnologiczny oferujący wiele cennych produktów w ilościach wystarczających zarówno do wsparcia badań, jak i do zastosowań. Najnowsze osiągnięcia w skali przemysłowej są uzyskiwane przez stosowanie różnych technik nowoczesnej inżynierii genetycznej do korygowania takich niedoborów i tworzenia szczepów nadprodukujących podstawowe metabolity. Istnieją dwa sposoby osiągnięcia tego celu:

1. 1) zwiększenie liczby kopii genów strukturalnych kodujących te enzymy;

2. 2) zwiększenie częstotliwości transkrypcji.

Nowe technologie genetyczne są ważne w konstrukcji szczepów zdolnych do nadprodukcji. Bieżące projekty obejmujące sekwencjonowanie setek genomów, dostępność sekwencji odpowiadających organizmom modelowym, nowe mikromacierze DNA i narzędzia proteomiczne, a także nowe techniki mutagenezy i rekombinacji, przyspieszą programy ulepszania wytrzymałości szczepów przemysłowych. Rekonstrukcja szczepu oparta na zmianach w genomie umożliwia zbudowanie doskonałego szczepu, który zawiera tylko mutacje kluczowe dla hiperprodukcji, które kumuluje się przez mutagenezę i badania przesiewowe. Generalnie wszystkie czynności zmierzające do polepszenia produktu oraz właściwości komórek przez modyfikację specyficznych reakcji biochemicznych lub wprowadzenie nowych właściwości z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA są opisywane jako inżynieria metaboliczna. Analizowany przepływ węgla przez szlak metaboliczny zależy od kilku głównych etapów, a nie od pojedynczej reakcji ograniczającej szybkość procesu syntezy. Przykładem może być synteza aminokwasów, gdzie stosowano różne techniki likwidujące bariery ograniczające przepływ węgla. Inne procesy prowadzone przez odpowiednio ulepszone szczepy dotyczą produkcji witamin, kwasów organicznych, etanolu, 1,3-propanodiolu i karotenoidów. Z kolei odwrócona inżynieria metaboliczna polega na wyborze szczepu, który ma korzystny fenotyp komórkowy, określeniu czynników genetycznych i/lub środowiskowych, które nadają ten fenotyp, a następnie przeniesieniu tego fenotypu do innego szczepu przez bezpośrednie modyfikacje zidentyfikowanych czynników genetycznych i/lub środowiskowych. Techniki biologii molekularnej polegają na naśladowaniu naturalnej rekombinacji za pomocą rekombinacji homologicznej in vitro. Manipulacje DNA dotyczą nie tylko rekombinacji fragmentów DNA, lecz także wprowadzania mutacji punktowych z bardzo małą kontrolowaną szybkością. W przeciwieństwie do mutagenezy ukierunkowanej, metoda łączenia i rekombinacji części podobnych genów z różnych gatunków lub szczepów przyniosła znaczną poprawę w konstrukcji szczepów w bardzo krótkim czasie. Manipulacje całego genomu to technika, która łączy krzyżowanie wielorodzajowego DNA z rekombinacją całych genomów przez fuzję protoplastów. Biologia systemów to zintegrowane, systemowe podejście do analizy i optymalizacji procesów komórkowych przez wprowadzanie szeregu zaburzeń i pomiar kolejnych reakcji systemu jakim jest komórka. Zmienione fenotypy tworzy się za pomocą technik biologii molekularnej lub przez zmianę środowiska. Dalszą charakterystykę fenotypu prowadzącą do maksymalnego tempa syntezy oczekiwanego produktu analizuje się i określa ilościowo przez zastosowanie wysokoczęstotliwościowych danych omicznych dotyczących genomu i analizy obliczeniowej w skali genomu.

Biologia syntetyczna jest stosunkowo nową gałęzią genetyki molekularnej, która wciela zasady inżynierii do modyfikowania pewnych aspektów fizjologii komórki, syntezy sekwencji fragmentów DNA, a nawet genomów. Próbuje się modyfikować lub nawet prowadzić syntezę całego genomu, generowanie sekwencji i projektowanie cząsteczek DNA przy użyciu Escherichia coli oraz Saccharomyces cerevisiae, które są najlepiej zbadanymi i dobrze znanymi organizmami w nauce (zidentyfikowano różne fenotypy pomocne w bioinżynierii). Wraz ze wszystkimi dostępnymi technologiami postęp w wykorzystaniu Escherichia coli do biotechnologicznych procesów syntetycznych doprowadził do rozwoju szczepów zdolnych do syntezy kilku nowych związków. Escherichia coli jest elastyczną platformą do wydajnej produkcji cząsteczek dla przemysłu farmaceutycznego, metabolitów i cząsteczek istotnych dla dodatków do żywności, pigmentów i ostatnio złożonych cząsteczek alifatycznych. Z użyciem Escherichia coli prowadzi się produkcję kilku związków aromatycznych wykazujących aktywność biologiczną, jak np. witamin i przeciwutleniaczy, pigmentów stosowanych w różnych procesach przemysłowych oraz substancji zapachowych. W przemyśle perfumeryjnym wykorzystuje się je do syntezy takich związków, jak prekursory Ambroxu, wysoko cenionego środka zapachowego, lub geraniolu, cennego acyklicznego alkoholu monoterpenowego. Innym istotnym obszarem wykorzystania Escherichia coli jest produkcja biopaliw. Istnieje kilka publikacji, w których opisano zastosowanie konstruktów Escherichia coli do syntezy rozgałęzionych kwasów tłuszczowych lub krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, które mogą ostatecznie doprowadzić do masowej produkcji prekursorów paliwa lub użytecznych materiałów.

Ważną dziedziną biologii syntetycznej, w której wykorzystuje się Escherichia coli, jest produkcja antybiotyków. Niedawne wysiłki uruchomienia produkcji antybiotyków poliketydowych nabrały tempa z wykorzystaniem Escherichia coli, co sprzyja procesowi produkcji antybiotyków z różnych źródeł, eliminuje potrzebę standaryzacji wzrostu gospodarza i warunków indukujących proces. Syntazy poliketydowe, ze względu na modularność, są doskonałymi czynnikami w inżynierii do wytwarzania nowych związków z istniejących klastrów genów lub do wprowadzenia nowych klastrów genowych. W związku z tym w Escherichia coli można z powodzeniem wytwarzać różne metabolity biologiczne lub cząsteczki przemysłowe. Escherichia coli ma wielką przyszłość dzięki z rozwojowi wysokowydajnych technologii, bardziej czułego wykrywania i narzędzi analitycznych oraz lepszej syntezy DNA. Wszystkie badania prowadzone obecnie w Escherichia coli potwierdzają wszechstronność tego mikroorganizmu. Na jego temat opublikowano prawie 340 000 prac badawczych w Pubmed, w porównaniu z 115 000 na temat Saccharomyces cerevisiae. Zsekwencjonowano kilka genomów ze źródeł środowiskowych. Opublikowano tysiące prac badawczych mających na celu ocenę potencjału metabolicznego i genetycznego tego organizmu. W pozostałych dziedzinach biotechnologii jest wystarczająco dużo informacji, które sugerują, że Escherichia coli będzie w centrum uwagi przez dłuższy czas.

Próbuje się zastąpić Escherichia coli przez Vibrio natriegens. Przeanalizowano sekwencję genomu i właściwości wzrostu tej szybko rosnącej bakterii i stworzono nową platformę inżynierii genetycznej. Wykazano, że komórki Vibrio natriegens są zdolne do transformacji plazmidami Escherichia coli, co sprawia, że wszystkie dostępne dotychczas narzędzia molekularne mogą być kompatybilne z tym nowym systemem.

2.8.Przechowywanie szczepów przemysłowych

Konwencjonalna mikrobiologia jest całkowicie zależna od dostępności czystych szczepów oraz ich stabilności. Hodowle szczepów ulegają denaturacji i/lub zamierają. Jest też faktem, że pasaże 7−8-krotne Penicillium chrysogenum i Streptomyces niveus tracą całkowicie lub prawie całkowicie zdolność do produkcji odpowiednio penicyliny i nowobiocyny. W celu utrzymania ich właściwości, czyli zdolności do produkcji metabolitów, stosuje się różne techniki przechowywania. Proponowane techniki mają swoje zalety i wady. Nie ma jednej optymalnej metody skutecznego przechowywania szczepów przemysłowych.

2.8.1. Skosy/słupki agarowe

Mikroorganizmy wysiane i wyrosłe na skosach lub słupkach przetrzymuje się w lodówce w temp. 4°C w szczelnie zakręcanych probówkach lub probówkach bakteriologicznych zatkanych korkiem owiniętym parafilmem. Hodowle takie można przetrzymywać nie dłużej niż 2−4 miesięcy. Okres przechowywania można przedłużyć przez zalanie powierzchni słupka ciekłą sterylną parafiną. Jest to metoda prosta i ekonomiczna, wymaga jednak okresowych przeszczepień. Wadą zasadniczą jest możliwość pojawiania się w genie mutacji, które uczynią szczep nieprzydatnym.

2.8.2. Przechowywanie szczepów w temperaturach ujemnych

Szczepy mikroorganizmów mogą być przechowywane w temp. –20°C, –80°C i –193°C, zamrażane w ciekłym azocie. Komórki mikroorganizmów w tym przypadku powinny być zawieszone w sterylnym roztworze glicerolu (10−20% wag./obj.) lub DMSO (5%obj.). Generalnie hodowle są przetrzymywane w fiolkach. Ponieważ glicerol jest toksyczny dla komórek, zawiesiny hodowli w glicerolu nie powinny być przetrzymywane w temperaturze pokojowej. Hodowle mogą być przetrzymywane przez 6−8 miesięcy w temp. –20°C oraz przez rok w temp. –80°C. Stosując ciekły azot o niskiej temperaturze –193°C można zachować szczep nawet przez ponad 15 lat. Wadą tej techniki jest to, że zamrażanie i rozmrażanie powoduje śmierć komórek.

2.8.3. Przechowywanie szczepów w szklanych kulkach

Powtarzanie zamrażania i rozmarzania hodowli prowadzi do śmierci komórek. W celu ominięcia tego problemu hodowle zawiesza się w roztworze niezamarzającym i dodaje do nich szklane kulki. Do wykorzystania można pobierać po jednej kulce lub po kilka kulek z bakteriami, unikając procesu rozmarzania.

2.8.4. Szczepy liofilizowane

Liofilizacja jest odpowiednia dla szczepów zarodnikujących. Polega na zmieszaniu sterylnej gleby z hodowlą bakterii, inkubowaniu przez kilka dni i pozostawieniu w temperaturze pokojowej przez 1–2 tygodni. Wysuszoną glebę trzyma się w temperaturze pokojowej lub w lodówce. Gleba może być zastąpiona przez żel krzemionkowy, kulki porcelanowe lub sterylne krążki z bibuły filtracyjnej zatopione w kroplach żelatyny. Szczepy Actinomyces mogą zachować żywotność przez 20 lat.

Literatura rekomendowana

Adrio J.L. i Demain A.L. 2010 Recombinant organisms for production of industrial products. Bioengineered Bugs, 1: 116–131.

Akada R. 2002. Genetically modified industrial yeast ready for application. J. Biosci. Bioeng., 94: 536–544.

Ali A., Sarfraz M.H., Muhyudin R., Awan W.A. 2018. Screening and selection of industrially important microorganisms. A review. European J. Pharm. Medical Res., 5: 42–47.

Cowan D. 1996. Industrial enzyme technology. Trends Biotechnol., 14: 177–188.

Falch E. 1991. Industrial enzymes-developments in production and application. Biotech. Adv., 9: 643–658.

Goraya A., Asghar F., Javaid I., Ali S. 2017. Microbial strain for overproduction of industrial products. IJRDO-J. Biological Sci., 3: 10–29.

Hashimoto S., Ogura M., Aritomi K., Hoshida H., Nishizawa Y., Akada R. 2005. Isolation of auxotrophic mutants of diploid industrial yeast strains after UV mutagenesis. Appl. Environ. Microbiol., 71: 312–319.

Lubertozzi D. i Keasling J.D. 2009. Developing Aspergillus as a host for heterologous expression. Biotechnol. Adv., 27: 53–75.

Magocha T.A., Zebed H., Yang M., Yun J., Zhang H., Qi X. 2018. Improvement of industrially important microbial strains by genome shuffling: Current status and future prospects. Bioresour. Technol., 257: 281–289.

Ouchi K., Shimoda M., Nakamura Y., Kojima Y., Nishiya T. 1983. Isolation of auxotrophic mutans from industrial yeasts. Hakkokogaku, 61: 349–352.

Paes B.G. i Almeida J.R.M. 2014. Genetic improvement of microorganisms for application in biorefineries. Chem. Biol. Technol. Agriculture, 1: 21.

Shepelin D., Hansen A.S.L., Lennen R.,Hao Luo H., Herrgard M.J. 2018.Selecting the best: evolutionary engineering of chemical production in microbes. Genes, 9: 249.

3

Hodowle mikroorganizmów przemysłowych

3.1.Wprowadzenie

W mikrobiologii przemysłowej w skali technicznej stosuje się trzy lub cztery typy hodowli mikroorganizmów w celu pozyskania biomasy i/lub metabolitów:

1. 1) okresowe (fermentacje okresowe);

2. 2) okresowe z zasilaniem (fermentacje okresowe z zasilaniem);

3. 3) ciągłe (fermentacje ciągłe);

4. 4) ciągłe z recyrkulacją biomasy (fermentacje ciągłe z recyrkulacją biomasy).

3.2.Hodowle okresowe

Hodowla okresowa (stacjonarna) to system zamknięty, w którym podłoże, składniki odżywcze i inoculum dodaje się w warunkach aseptycznych na początku hodowli. Oznacza to, że objętość płynu hodowlanego w bioreaktorze jest teoretycznie stała podczas trwania hodowli. Zwykle na początku hodowli okresowej w bioreaktorze znaną liczbą żywych komórek szczepi się wysterylizowane podłoże zawierające wszystkie składniki odżywcze wymagane przez mikroorganizm. Po zaszczepieniu hodowla komórek rozwija się zgodnie z klasyczną krzywą wzrostu opisaną przez Monoda, która jest podzielona na cztery główne fazy (rys. 3.1).

Rys. 3.1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej (stacjonarnej); 1 – faza lag, 2 – faza logarytmicznego wzrostu, 3 – faza równowagi i 4 – faza zamierania komórek, ln X – logarytm naturalny z liczebności komórek, X – biomasa komórek (g/l), µ – właściwa szybkość wzrostu bakterii (można ją zinterpretować jako ułamek biomasy tworzonej w jednostce czasu; przykładowo wartość 0,3/godz. oznacza, że ilość biomasy będzie się zwiększać co godzinę o 30%)

Faza lag jest „nieefektywnym” etapem hodowli, chociaż komórki są aktywne metabolicznie – dostosowują swój aparat enzymatyczny do nowego środowiska. W tym czasie nie obserwuje się znaczącego wzrostu biomasy, zużycia substratu ani syntezy produktów. Na długość fazy lag wpływa głównie liczebność komórek w inoculum i ich stan fizjologiczny, skład podłoża (głównie źródło węgla), pH i temperatura oraz wielkość inoculum. Faza logarytmicznego wzrostu (faza wykładnicza) charakteryzuje się szybkim i stałym podziałem komórek (ilość biomasy jest wykładniczą funkcją czasu), stałą szybkością właściwą wzrostu, która jest równa maksymalnej szybkości właściwej wzrostu hodowli w warunkach braku ograniczenia wzrostu (szybkość wzrostu nie jest ograniczona, ponieważ wszystkie składniki odżywcze są obecne w nadmiarze, a jednocześnie nie osiągają stężeń hamujących wzrost), a także szybkim zużyciem źródła węgla i energii oraz wysokim wskaźnikiem produkcji metabolitu pierwotnego. Zmniejszenie ilości składników odżywczych do końca fazy logarytmicznego wzrostu (w hodowli prowadzonej w warunkach tlenowych jest to sygnalizowane szybkim wzrostem stężenia rozpuszczonego tlenu) powoduje stopniowe obniżenie szybkości właściwej wzrostu i przejście do fazy równowagi (fazy stacjonarnej) charakteryzującej się hamowaniem wzrostu i wykorzystaniem endogennych rezerw węgla i energii. Faza ta jest ważna dla syntezy metabolitów wtórnych. Większość przemysłowych fermentacji prowadzi się w bioreaktorach w hodowlach okresowych ze względu na względną prostotę tego procesu.

Cała operacja hodowli składa się z następujących etapów: konstrukcja podłoża fermentacyjnego, napełnianie bioreaktora, sterylizacja na miejscu (systemy SIP), szczepienie inoculum, hodowla, izolacja metabolitów i biomasy, czyszczenie bioreaktora na miejscu (systemy CIP). Aby uzyskać wydajną hodowlę okresową, należy zminimalizować wszystkie etapy nieproduktywne (wszystkie wymienione powyżej z wyjątkiem hodowli), osiągnąć wysoki stopień syntezy produktu i zoptymalizować wydajność. Sposób prowadzenia konkretnej hodowli okresowej zależy od rodzaju produktu końcowego. Wydłużenie czasu wzrostu logarytmicznego jest korzystne dla efektywnej produkcji biomasy (drożdże piekarskie, biomasa paszowa) oraz metabolitów pierwotnych (etanolu, kwasów organicznych, witamin, aminokwasów). Natomiast podczas wytwarzania metabolitów wtórnych (antybiotyków, produktów zapasowych) skraca się fazę logarytmiczną przez ograniczenie jednego składnika odżywczego, zwykle źródła azotu, a przedłuża fazę stacjonarną, aby osiągnąć maksymalną wydajność produkowanego metabolitu. Hodowlę okresową wgłębną stosuje się do produkcji napojów alkoholowych (piwa, wina i destylowanych wódek, takich jak whisky, brandy), kwasów organicznych, aminokwasów, witamin.

Do przeprowadzenia fermentacji najprostsza jest hodowla okresowa. Jest to system zamknięty o stałej objętości. Jedynym dodatkiem po rozpoczęciu fermentacji jest dozowanie powietrza, jeśli jest potrzebne, co skutkuje stałą objętością. Wszystkie inne składniki podłoża ulegają ciągłym zmianom w miarę zużywania substratu, produkcji biomasy i oczekiwanych produktów.

Na rysunku 3.2 przedstawiono typowe charakterystyki przyrostu biomasy oraz szybkości właściwej wzrostu komórek w hodowli okresowej. Składniki odżywcze są obecne od początku procesu, brak jest jakiegokolwiek zasilania, a w procesie fermentacji nie można osiągnąć stanu równowagi. Innymi słowy, objętość hodowli (V) jest stała (V = const.), a właściwa szybkość wzrostu (µ) i biomasa komórek (X) ulegają zmianie.

Rys. 3.2. Krzywa przyrostu biomasy (X ≠ const.) oraz przebieg właściwej szybkości wzrostu mikroorganizmów (µ ≠ const.) w hodowli okresowej o stałej objętości (V = const.)

Fermentacje okresowe są często stosowane w przypadku wysoce zmutowanych szczepów opracowanych przez klasyczną mutagenezę i selekcję. Takie szczepy są łatwo dominowane przez szybciej rosnące, mniej produktywne szczepy w hodowlach o przedłużonym czasie. Hodowle okresowe są nadal dość powszechne w przemysłowej produkcji antybiotyków, kwasów organicznych i etanolu.

3.3.Hodowle okresowe z zasilaniem

W hodowlach okresowych z zasilaniem można dodawać składniki odżywcze, co czyni je systemami otwartymi dla substratów, ale wciąż zamkniętymi dla biomasy i produktów pochodnych biomasy. Są to układy półotwarte, w których do bioreaktora dozuje się aseptycznie jeden lub więcej składników odżywczych, a produkt jest zatrzymywany w środku bioreaktora. Oznacza to, że objętość płynu hodowlanego w bioreaktorze zwiększa się w tym czasie.

Główne zalety hodowli okresowej z zasilaniem w porównaniu do typowej hodowli okresowej:

1. 1) możliwość wydłużenia czasu syntezy produktu;

2. 2) zdolność do osiągnięcia większych gęstości komórek, a tym samym zwiększenie ilości produktu, która jest zwykle proporcjonalna do wielkości biomasy;

3. 3) zdolność do zwiększenia wydajności lub produktywności o kontrolowane sekwencyjne dodawanie składników odżywczych;

4. 4) przedłużona produktywność hodowli przez wykorzystanie „okresów nierentownych”, w których normalnie bioreaktor jest przygotowany do nowej hodowli.

Hodowla okresowa z zasilaniem jest korzystna w następujących przypadkach:

1. 1) jeżeli następuje hamowanie procesu fermentacji przez substrat lub oczekuje się represji katabolicznej, można temu zaradzić za pomocą „bezpiecznego” dozowania substratu;

2. 2) gdy spodziewany jest efekt Crabtree (represja enzymów oddechowych drożdży w obecności wysokiego stężenia glukozy), wówczas przez stopniowe podawanie substratu można wyeliminować produkcję etanolu przez drożdże w warunkach tlenowych;

3. 3) gdy jest wymagana duża gęstość komórek, wówczas przez zasilanie można utrzymać wysoką i stałą szybkość ich wzrostu;

4. 4) gdy chce się osiągnąć wysoką wydajność produkcji, wówczas przez precyzyjne sekwencyjne podawanie składników odżywczych można regulować metabolizm komórek;

5. 5) w przypadku oczekiwanej wysokiej lepkości płynu hodowlanego (jak w procesie produkcji dekstranu lub ksantanu) stopniowe rozcieńczanie podłoża ułatwia mieszanie i transfer tlenu.

Właściwy wybór tempa podawania składników odżywczych może znacznie poprawić wydajność hodowli, ponieważ wpływa na szybkość wzrostu komórek, ich fizjologię i szybkość tworzenia produktu.

Typowe strategie zasilania to:

1. 1) zasilanie regularne i nieregularne (pulsowe) substratami;

2. 2) regularne ciągłe podawanie składników odżywczych zaprojektowanych zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami lub na podstawie kontroli sprzężenia zwrotnego mierzonych zmiennych online, związanych ze wzrostem komórek i metabolizmem, np. stężeniem rozpuszczonego tlenu, pH, CO_2 i stężenia biomasy.

Produkcja drożdży Saccharomyces cerevisiae w warunkach tlenowych jest jedyną sensowną technologią. Aby uniknąć efektu Crabtree polegającego na tworzeniu etanolu w warunkach tlenowych w obecności nadmiaru substratu, produkcję biomasy drożdży prowadzi się w hodowlach okresowych z zasilaniem pulsowym. Najnowocześniejsza produkcja octu – acetyfikacja, w której kwas octowy jest wytwarzany przez utlenianie etanolu za pośrednictwem Acetobacter – odbywa się w specjalnych bioreaktorach „acetatorach”. Najpopularniejszy jest Frings Acetator® z podwójną funkcją (napowietrzania i mieszania), wyposażony w wirnik umieszczony pod bioreaktorem i połączony z rurą zasysającą powietrze. Podczas obrotu (prędkość około 1500 obr./min) aerator zasysa powietrze i pompuje ciecz, co powoduje powstawanie mieszanki powietrze-ciecz, która jest promieniowo wstrzykiwana do podłoża fermentacyjnego. Wytwarzająca się piana jest likwidowana przez mechaniczny środek przeciwpieniący, a chłodzenie jest konieczne, ponieważ utlenianie jest procesem egzotermicznym. Acetatory pracują w powtarzanym trybie hodowli okresowej z zasilaniem. Jeden cykl hodowli w pojedynczym acetatorze może wytworzyć ocet zawierający 15% wag./obj. kwasu octowego.

Jak pokazano na rysunku 3.3, w tego typu procesie objętość nie jest stała. Szybkość przepływu składników odżywczych może się zmieniać w trakcie procesu fermentacji. Hodowla okresowa z zasilaniem jest powszechnie stosowana w procesach przemysłowych do produkcji drożdży piekarskich, enzymów, aminokwasów i wielu innych metabolitów.

Rys. 3.3. Przebieg zmian parametrów kinetycznych: właściwej szybkości wzrostu (m ≠ const.), wielkości biomasy komórek (X ≠ const.) oraz objętości hodowli (V ≠ const.) w czasie trwania hodowli

3.4.Hodowle (fermentacje) ciągłe

W hodowlach ciągłych podłoże fermentacyjne jest dostarczane z optymalną szybkością, tak aby uniemożliwić nadmierne wymywanie komórek mikroorganizmu. Ilość biomasy powinna być mniej więcej na stałym poziomie właściwym do prowadzenia procesu ze stałą wydajnością. Z taką samą szybkością usuwa się nadmiar podłoża wraz z mikroorganizmami oraz produktami fermentacji. W optymalnych warunkach komórki są w fazie logarytmicznego wzrostu, czyli najbardziej aktywne metabolicznie, zdolne do produkcji biomasy i metabolitów pierwotnych. Często hodowla ciągła jest synonimem hodowli w chemostacie ze stałą szybkością wzrostu komórek równą szybkości rozcieńczania, kontrolowaną przez dostępność ograniczającego składnika odżywczego. Inny rodzaj hodowli ciągłej jest prowadzony w turbidostacie (stałe stężenie biomasy kontrolowane przez stopień rozcieńczenia) lub nutrystacie (stały parametr związany z kontrolowanym wzrostem komórek według stopnia rozcieńczenia).

Główne zalety hodowli ciągłej (w chemostacie) to:

1. 1) możliwość ustalenia optymalnych warunków hodowli dla maksymalnej i długoterminowej syntezy produktu;

2. 2) możliwość osiągnięcia stabilnej jakości produktu (stan ustalony charakteryzuje się jednorodną hodowlą komórkową reprezentowaną przez stałe stężenie biomasy i metabolitów);

3. 3) redukcja „nieopłacalnych” okresów pracy bioreaktora.

Mimo oczywistych zalet hodowli ciągłej korzystanie z niej w skali przemysłowej utrudniają:

1. 1) zwiększone ryzyko zakażenia bioreaktora mikroorganizmami w czasie dozowania i odbierania podłoża fermentacyjnego;

2. 2) niebezpieczeństwo mutacji genetycznych w szczepie produkcyjnym podczas długotrwałej operacji;

3. 3) dodatkowe inwestycje związane z wyposażeniem układu ciągłego.

W trybie ciągłym fermentacja jest definiowana jako proces przebiegający w jednym reaktorze lub większej ich liczbie w odpowiedniej temperaturze, ze stabilnym stopniem rozcieńczenia. Jedynie kilka systemów produkcji żywności i pasz z wykorzystaniem mikroorganizmów odbywa się w trybie ciągłym. Jednym z niewielu przykładów jest produkcja drożdży paszowych Kluyveromyces fragilis przy użyciu zużytego ługu siarczynowego jako substratu. Proces ten można prowadzić w sposób ciągły, gdyż możliwość zanieczyszczeń jest tu niewielka. Jednocześnie jest to jeden z niewielu przykładów produkcji na skalę przemysłową z wykorzystaniem wysoko cenionego substratu, hydrolizatu lignocelulozy, która powstaje jako produkt odpadowy w produkcji masy celulozowej. Z innych zastosowań można wymienić nowoczesne gorzelnie, w których fermentacja jest prowadzona w serii fermentorów. Obecnie szacuje się, że w Ameryce Północnej tylko około 16% etanolu jest produkowane w hodowli ciągłej z powodu problemów z zakażeniami procesu fermentacji. Ciągłe systemy fermentacji z wykorzystaniem technologii immobilizacji komórek są stosowane w produkcji piwa, ale liczba zastosowań przemysłowych jest nadal ograniczona z powodu problemów technicznych, takich jak nadmiar biomasy i usuwanie CO_2, optymalizacja warunków pracy, zatykanie się bioreaktora. Główną przeszkodą utrudniającą ekstensywną eksploatację przemysłową tej technologii jest trudność w uzyskaniu właściwej równowagi sensorycznej w krótkim czasie dla układów ciągłych.

Rys. 3.4. Stały przebieg parametrów kinetycznych w hodowli ciągłej; m – właściwa szybkość wzrostu, X – przyrost biomasy komórek oraz objętość hodowli (V = const.)

W systemie ciągłym, jak pokazano na rysunku 3.4, poprzez ciągłe usuwanie produktów metabolicznych z fermentora oraz dodawanie nowych do fermentora, proces fermentacji jest otwarty w odniesieniu do wszystkich składników obecnych w hodowli. Zazwyczaj ilości dodawane substancji odżywczych i usuwane metabolitów są równe, więc objętość hodowli jest stała. W tych warunkach osiąga się stan równowagi, w którym wszystkie parametry pozostają na stałym poziomie. Taki system jest szeroko stosowany w badaniach fizjologicznych. Jednakże zastosowania przemysłowe są zazwyczaj ograniczone do produkcji biomasy (białka jednokomórkowego) do pasz produkowanych dla zwierząt oraz w biologicznych oczyszczalniach ścieków i zakładach przetwarzania odpadów.

3.5.Hodowle ciągłe z recyklingiem biomasy

Na rysunku 3.5 pokazano system hodowli ciągłej z częściowym (CRK) lub kompletnym (KRK) recyklingiem komórek. Jest on podobny do systemu hodowli ciągłej, ale komórki są zawracane do fermentora za pomocą urządzeń do oddzielania biomasy (urządzeń do filtracji, wirówek i osadników). W fermentorze z częściowym recyklingiem komórek osiąga się stan ustalony jak w układzie ciągłym. Proces ten jest zwykle stosowany w celu zwiększenia wydajności fermentacji w systemie i jest powszechnie stosowany w biologicznym oczyszczaniu ścieków i produkcji etanolu.

Rys. 3.5. Zmiany parametrów kinetycznych w hodowlach ciągłych z częściowym (CRK) lub kompletnym recyklingiem biomasy komórek (KRK)

3.6.Fermentacje

W sensie biotechnologicznym fermentacja jest procesem mikrobiologicznym prowadzonym w bioreaktorze z zastosowaniem wybranego mikroorganizmu w celu pozyskania biomasy lub określonego produktu. W zależności od właściwości mikroorganizmu fermentacja może być prowadzona w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Istnieją trzy możliwe metody prowadzenia fermentacji:

1. 1) powierzchniowa na surowcach stałych (SSF);

2. 2) wgłębna (SmF) na podłożu płynnym;

3. 3) na syntetycznym podłożu zestalonym.

Sercem fermentacji przemysłowej jest fermentor, zwany inaczej bioreaktorem, który jest stosowany do hodowli mikroorganizmów na podłożu płynnym.

W systemie fermentacji powierzchniowej SSF (Solid State Fermentation) proces mikrobiologiczny zachodzi głównie na powierzchni surowców stałych, które mają właściwość pochłaniania lub przechowywania wody z rozpuszczalnymi składnikami odżywczymi lub bez nich. Jest to tzw. fermentacja powierzchniowa w podłożu stałym. SSF wykorzystuje takie surowce stałe, jak otręby, wytłoki i miazga papierowa, które są bogate w składniki odżywcze. W tej technice fermentacji surowce są wykorzystywane bardzo powoli i stabilnie, więc te same substraty mogą być używane przez długie okresy fermentacji. Mikroorganizmy zasiedlające surowce stałe namnażając się produkują enzymy i metabolity.

Fermentacje wgłębne SmF (Submerged Fermentation) obejmują dużą różnorodność procesów mikrobiologicznych przebiegających w bioreaktorach z mieszaniem lub bez mieszania, w których biomasa jest całkowicie zanurzona w płynnym podłożu hodowlanym.

Procesy SSF są jakościowo różne od procesów SmF. Oznacza to, że fizjologia drobnoustrojów jest nieco odmienna, przynajmniej dla wybranych przypadków związanych z produkcją zarodników, enzymów i metabolitów wtórnych. Główne różnice między SSF a SmF związane z różnymi cechami fizykochemicznymi są następujące:

1. 1) mieszanie i dyfuzja substratów, a także tworzenie produktów w stosunku do biomasy są znacznie mniej intensywne w systemie SSF;

2. 2) rozpuszczalność i dyfuzja tlenu i innych gazów niepolarnych są większe w systemie SSF,

3. 3) przewodzenie ciepła jest znacznie mniejsze w systemie SSF;

4. 4) zawartość wody jest mniejsza w systemie SSF.

Różnice te wydają się wyjaśniać istotne zalety i wady systemu SSF w stosunku do konwencjonalnych procesów prowadzonych w systemie SmF.

3.6.1. Fermentacja powierzchniowa w podłożu stałym (SSF)

Terminy „fermentacja substratu stałego” (SSF) lub „hodowla na stałym substracie” (SSC) są stosowane w systemach, w których mikroorganizmy hoduje się na powierzchni surowca nierozpuszczalnego w wodzie, najczęściej zawierającego polisacharydy jako źródło węgla i energii przy niskim poziomie wolnej wody. Technikę SSF opracowano w krajach azjatyckich, w których od wieków wykorzystuje się ją do produkcji tradycyjnej żywności, takiej jak sos sojowy, koi, miso lub sake, przy użyciu różnych substratów i mikroorganizmów. W Europie i Ameryce fermentacja ta nie jest szeroko wykorzystywana; jej zastosowanie ogranicza się głównie do produkcji enzymów przemysłowych, niektórych rodzajów produktów żywnościowych lub suplementów paszowych. Zjawisko SSF zachodzi powszechnie w przyrodzie. System SSF oferuje wiele możliwości przetwarzania i utylizacji odpadów rolno-przemysłowych. Ten typ fermentacji zużywa mało energii, produkuje mało ścieków oraz jest przyjazny dla środowiska, gdyż uczestniczy głównie w utylizacji odpadów stałych. Zastosowanie fermentacji SSF ma następujące zalety:

1. 1) małe koszty procesu;

2. 2) małe ryzyko zanieczyszczenia mikroorganizmami ze względu na niski poziom wilgoci i złożoność podłoża;

3. 3) prosta technologia i mała produkcja ścieków;

4. 4) wysoka wydajność i łatwe odzyskiwanie produktu;

5. 5) wykorzystanie odpadów rolnych jako substratów do niektórych zastosowań, np. przy produkcji dodatków paszowych i enzymów celulolitycznych.

Procesy SSF zostały prawie całkowicie zaniechane w krajach zachodnich po 1940 r. z powodu adaptacji technologii fermentacji zanurzeniowej SmF (Submerged fermentation), głównie związanej z produkcją penicyliny w hodowlach płynnych z napowietrzaniem. Słowem typ fermentacji SSF poszedł w zapomnienie. Powrót do SSF nastąpił w latach 1950−1960 w związku z transformacją steroidów przy udziale grzybów, a w latach 1960−1970 użyto go do produkcji mikotoksyny oraz białka paszowego na odpadach rolno-przemysłowych, która okazała się bardzo tania. W rzeczywistości dzięki niej badacze na całym świecie ponownie zainteresowali się technologią SSF. Pojawiło się wiele patentów i publikacji na temat jej podstawowych aspektów, konstrukcji bioreaktorów (fermentorów), modelowania i produkcji żywności przy udziale różnych drobnoustrojów, pasz dla zwierząt domowych, różnych produktów podstawowych i metabolitów wtórnych oraz bioprocesów, takich jak bioługowanie, bioremediacja, kompostowanie i produkcja biogazu, biowodoru i bioetanolu z odpadów.

Podczas prowadzenia wszelkich bioprocesów w systemie SSF należy wziąć pod uwagę dobór odpowiedniego mikroorganizmu i substratu, optymalizację parametrów procesu oraz izolację i oczyszczanie produktu. Ze względu na aktywność wody (Aw) odpowiednie do prowadzenia procesów w systemie SSF były tylko drożdże i grzyby. Bakterie wydawały się nieodpowiednie ze względu na wysokie zapotrzebowanie na wodę. Jednak doświadczenia wykazały, że szczepy bakteryjne mogą być także stosowane w procesach prowadzonych w systemie SSF. Istnieje także przeświadczenie, że mikroorganizmy prowadzące procesy w systemie SSF są bliżej swojego naturalnego środowiska, a więc ich aktywność może być także wysoka. Wybór właściwego substratu jest kolejnym kluczowym warunkiem sukcesu procesu prowadzonego w SSF. Wykorzystywane w tym celu są odpady z upraw rolnych i odpady przemysłowe, a więc surowiec nierozpuszczalny. Substrat powinien być dopasowany do zdolności fizjologiczno-biochemicznych stosowanych mikroorganizmów. Ponadto mikroorganizm powinien być dodawany na fazie stałej, tak aby mógł być wielokrotnie wykorzystywany. Optymalizacja procesu obejmuje parametry fizykochemiczne i biochemiczne, takie jak: wielkość cząstek stałych, początkowa wilgotność, pH, obróbka wstępna surowca, względna wilgotność, temperatura inkubacji, napowietrzenie, wiek i wielkość inoculum, dodatek składników odżywczych (takich jak N, P i mikroelementy), dodatkowe źródła węgla i induktorów, ekstrakcja produktu oraz jego oczyszczenie. W czasie procesu fermentacji problemem jest utrzymanie stałej temperatury w bioreaktorach, gdyż wydzielają znaczne ilości ciepła, wprost proporcjonalnie do aktywności metabolicznej mikroorganizmu. Czasami kumulacja ciepła jest tak wysoka, że powoduje denaturację produktu powstałego w złożu. Temperatura w niektórych miejscach złoża może być o 20°C wyższa niż optymalna temperatura inkubacji. Istotny w procesie fermentacji jest transfer tlenu do złoża. Zbyt wysoka wilgotność powoduje zmniejszenie porowatości złoża. Zbyt niska wilgotność prowadzi do słabej dostępności składników odżywczych, spowalniając wzrost mikroorganizmu. Ogólnie rzecz biorąc, wzrost i aktywność danego mikroorganizmu są określane przez aktywność wody (Aw).

Kolejnym ważnym aspektem jest modelowanie w systemie SSF, które wymaga szczegółowej analizy. Brak jest wystarczająco dużo dostępnych informacji na temat kinetyki reakcji w systemach SSF. Wynika to głównie z trudności związanych z pomiarami parametrów wzrostu, analizą wzrostu komórkowego i określania zużycia substratu spowodowanymi niejednorodnym charakterem złoża, które jest bardzo złożone strukturalnie i odżywczo. Rozwiązaniem tego problemu może być użycie syntetycznego substratu modelowego. Ponadto kinetyka fermentacji jest wrażliwa na zmiany składu gazu zewnętrznego i wewnętrznego. Wzrost mikroorganizmów można określić za pomocą pomiaru zmiany składu gazowego wewnątrz bioreaktora, przez tempo trawienia substratu oraz oznaczanie szybkości pobierania tlenu, wydzielania ditlenku węgla, zawartości białka oraz poziomu glukozaminy. Kontynuowane są wysiłki potrzebne do opracowania SSF jako technologii do pozyskiwania produktów mikrobiologicznych w skali komercyjnej jako metody ekwiwalentnej do fermentacji SmF (fermentacji płynnej).

W ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczący postęp w zrozumieniu zasad projektowania, obsługiwania i skalowania bioreaktorów SSF. Kluczem do tych postępów jest zastosowanie technik modelowania matematycznego do opisu różnych zjawisk fizykochemicznych i biochemicznych w systemie. Podstawową zasadą SSF jest „stały substrat” w złożu. Złoże to zawiera wilgotne ciała stałe i fazę gazową między cząstkami stałymi. SSF jest konwencjonalnie bardziej odpowiednie do hodowli grzybów strzępkowych, które rosną na powierzchni cząstek substratu i przenikają między nimi w głąb złoża. Proces w większości przypadków jest tlenowy. Odpowiednio skonstruowany bioreaktor umożliwia pokonanie efektów przenoszenia ciepła i masy, łatwą dyfuzję i ekstrakcję metabolitów. Bioreaktory tacowe oraz bębnowe są stosowane do prowadzenia wielu fermentacji, ale w ostatnich latach niektóre procesy prowadzi się w złożu upakowanym, do którego doprowadza się sprężone powietrze. Hodowle SSF mają wiele zalet w stosunku do hodowli wgłębnych. Do wad SSF należą: słaby transfer ciepła i masy w podłożu oraz ograniczone możliwości monitorowania procesu, kluczowych parametrów hodowli, jak np. temperatura, pH, rozpuszczony tlen, stężenia składników odżywczych lub zawartości wody. Ciepło wytwarzane przez mikroorganizmy w procesie metabolizmu ogranicza możliwości zwiększania skali procesu, gdyż może ono osiągnąć wartość do 3000 kcal/kg zasymilowanego substratu, co daje promieniowy gradient 5°C/cm w centrum reaktora. Mała zawartość wody w systemie i niska przewodność cieplna materiałów SSF sprzyjają gradientowi ciepła, co jest związane z ograniczonym mieszaniem. Przegrzania można uniknąć przez chłodzenie wyparne, które jednak zmniejsza zawartość wody w podłożu stałym. W procesie fermentacji powstaje gradient pH powodowany produkcją kwasów organicznych z degradowanych białek. Zwykle zapobiega się temu przez dodawanie węglanu wapnia lub mocznika. Gradientowo także układa się atmosfera gazowa.

Najważniejszymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania SSF, są dobór mikroorganizmów i wybór substratów. SSF jest najlepiej przystosowany do fermentacji prowadzonej przez grzyby, drożdże i promieniowce, które nie wymagają dużych ilości wody. Nie można zastosować SSF do fermentacji z udziałem organizmów, które wymagają wysokich wartości Aw (aktywność wody), takich jak bakterie, gdyż woda jest ich środowiskiem życia. W tych warunkach są zdolne do syntezy znacznych ilości enzymów i różnych metabolitów. Chociaż są uważane za najbardziej odpowiednie w systemie SSF, oprócz grzybów nitkowatych, również mogą być stosowane drożdże, które są także zdolne do wzrostu w środowisku o niskiej aktywności wody. Pewne gatunki bakterii, jak Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis i Lactobacillus sp., także mogą produkować enzymy na fazie stałej. W systemie SSF mogą być hodowane promieniowce, takie jak Streptomyces sp., ponieważ wykazują się silną kolonizacją substratów w fazie stałej, wytwarzaniem wielu enzymów degradacyjnych i są oporne na ekstremalne warunki. Grzyby nitkowate stosuje się w procesach SSF głównie z powodu ich zdolności do:

1. 1) wzrostu na podłożach o zmniejszonej aktywności wody;

2. 2) wnikania strzępek grzyba w stały substrat;

3. 3) wytwarzania egzoenzymów, takich jak enzymy amylolityczne i celulolityczne, które rozkładają polisacharydy (główne źródło węgla, często obecne w stałych surowcach).

Przy stosowaniu drożdży konieczne jest wstępne zdezintegrowanie materiału podłoża takimi technikami, jak: eksplozja z użyciem pary wodnej, obróbka kwasem lub zasadą, a następnie trawienie enzymatyczne lub ich kombinację. Można też zastosować mieszankę mikroorganizmów, z której pewne organizmy (zazwyczaj pleśnie) najpierw degradują złożony materiał celulozowy lub skrobiowy i są zdolne do produkcji zewnątrzkomórkowych enzymów, a uwolniona glukoza jest następnie pobierana przez drożdże, dające pożądany produkt.

3.6.2. Substraty stałe

Najbardziej obiecujące dla systemu SSF są odpady rolnicze i leśne. Jedna z tych frakcji jest wykorzystywana do wytwarzania energii elektrycznej, druga duża frakcja jest spalana bez odzysku energii lub pozostaje w polu, stanowi problem środowiskowy. Do odpadów rolniczych, które mogą być wykorzystywane jako substraty dla systemu SSF, należą wytłoki trzciny cukrowej, wytłoki z cassava, otręby zbożowe (pszenne, ryżowe, owsiane i sojowe), miazga i plewy kawy, masa owocowa, kolby kukurydzy, słomki i łuski różnych roślin. Materiały te składają się zasadniczo z celulozy, hemicelulozy, ligniny, skrobi, pektyny i innych podobnych składników. Wybór najbardziej odpowiednich mikroorganizmów do hodowli na odpadach rolniczych zależy od ich składu chemicznego. Do odpadów lignocelulozowych wskazane są grzyby zgnilizny drewna. Można je sklasyfikować jako grzyby białej zgnilizny (Basidiomycota i niektóre Ascomycota), które preferencyjnie rozkładają ligninę, grzyby brunatnej zgnilizny (Basidiomycota), które degradują celulozę i hemicelulozy, oraz grzyby miękkiej zgnilizny (Aspergillus niger i Trichoderma reesei), które wydzielają kompletny system celulaz. Zazwyczaj odpady rolnicze są źródłem nie tylko składników odżywczych, lecz także węgla i energii. Czasami jest konieczny dodatek soli mineralnych, aby zapewnić wszystkie niezbędne składniki do optymalnego ich wzrostu. Makro- i mikroelementy, które zazwyczaj dodaje się do podłoża, to fosfor, siarka, potas, magnez, wapń, cynk, mangan, miedź, żelazo, kobalt i jod. Dostępność substancji odżywczych jest głównym czynnikiem branym pod uwagę przy wyborze odpadów jako substratu lub nośnika w systemie SSF. Inne cechy substratów stałych, takie jak krystaliczność, powierzchnia, porowatość i wielkość cząstek, są również ważnymi czynnikami branymi pod uwagę. Surowce odpowiednie dla procesu SSF powinny spełniać następujące wymagania:

1. 1) powinny mieć porowatą stałą matrycę o dużej powierzchni na jednostkę objętości (10^3–10^6 m^2/cm^3);

2. 2) powinny wytrzymywać delikatne ściskanie i mieszanie;

3. 3) powinny zawierać węglowodany biodegradowalne;

4. 4) ich matryca powinna absorbować wodę w proporcji od jednego do kilku razy jak ich sucha masa;

5. 5) powinny mieć stosunkowo wysoką aktywność wody w porównaniu do ciała stałego/gazu, promującą wzrost mikroorganizmów;

6. 6) powinny wchłaniać dodawane składniki odżywcze, takie jak źródła azotu (amoniak, mocznik i peptydy) oraz sole mineralne.

Idealny materiał powinien składać się z małych ziarnistych lub włóknistych cząstek, które się nie łamią ani nie sklejają.

3.6.3. Bioreaktory SSF

W systemach SSF stosuje się dwa typy bioreaktorów: statyczne i ruchome. Bioreaktory te mają różne parametry konstrukcyjne i operacyjne, wpływające na wzrost i aktywność metaboliczną mikroorganizmów. Pierwszymi bioreaktorami wykorzystywanymi w systemie SSF były torby plastikowe, które jednak na skalę przemysłową nie są stosowane.

Bioreaktor tacowy (półkowy)

Statyczne bioreaktory SSF to głównie tradycyjne bioreaktory tacowe (półkowe) – tace wypełnione cienką warstwą podłoża umieszczone w zamkniętej komorze (rys. 3.6). Podłoże o wysokości od 1 do 4 cm nie ulega przegrzaniu i umożliwia optymalne warunki tlenowe. Zamknięte komory z tacami można stosunkowo łatwo monitorować i kontrolować w nich wilgotność, temperaturę i skład atmosfery gazowej. Zwiększanie skali bioreaktora jest stosunkowo proste, np. przez zwiększenie liczby tac (półek). Wadą bioreaktorów półkowych jest to, że ich praca nie może być zautomatyzowana, co jest problemem w produkcji na dużą skalę. Ponadto utrzymanie warunków aseptycznych w okresie inkubacji jest stosunkowo trudne.

Rys. 3.6. Schemat bioreaktora tacowego (półkowego); A – dopływ powietrza, B – obudowa komory inkubacyjnej, C – upakowana taca, D – odpływ powietrza

Upakowany bioreaktor kolumnowy

Ten typ bioreaktora ma kształt cylindra. Podłoże pozostaje statyczne, a tlen jest tłoczony przez wymuszone napowietrzanie (rys. 3.7). Dostarczane powietrze można nawilżyć, utrzymując stałą zawartość wody w podłożu. Temperatura powietrza może być regulowana i utrzymywana przez cały czas trwania procesu. Ten typ bioreaktora umożliwia pomiar stężenia ditlenku węgla i tlenu w odpływającym strumieniu powietrza, aby pośrednio monitorować wzrost mikroorganizmu w hodowli. Pomiary te mogą być wykorzystane do optymalizacji procesu fermentacji. Zasadnicza wada to napełnianie i opróżnianie bioreaktora z pozostałości oraz złe usuwanie ciepła metabolicznego.

Bioreaktory obrotowe

Bioreaktory obrotowe są wyposażone w bębny obrotowe (rys. 3.8) lub mieszadło wewnętrzne (rys. 3.9). Mieszanie zawartości sprzyja usuwaniu nadmiaru ciepła oraz natlenieniu. Bębny obrotowe mają kształt cylindryczny; obracają się wokół osi poziomej, zapewniając wymuszone napowietrzanie. Płynny ruch bębnów powoduje co prawda niewielkie mechaniczne uszkodzenie hodowli, ale też ułatwia dostęp do warstwy podłoża.

Bioreaktory z mieszaniem

Są to bioreaktory typu STR (Stirred-Tank Reactor). Do mieszania zawartości w zbiorniku wykorzystuje się mieszadła mechaniczne i dysze hydrauliczne, dzięki którym podawany surowiec jest całkowicie mieszany wewnątrz zbiornika (rys. 3.10).

Rys. 3.7. Schemat upakowanego bioreaktora kolumnowego; A – wlot powietrza, B – nawilżacz, C – upakowana kolumna, D – wylot powietrza, E – obudowa, F – wlot przepływu wody, G – wylot wody

Rys. 3.8. Schemat obrotowego bioreaktora bębnowego; A – wirnik, B – bęben, C – podłoże, D – obudowa, E – wlot strumienia wody, F – wylot wody

Rys. 3.9. Schemat bioreaktora z wewnętrznym mieszaniem; A – wirnik mieszadła, B – bęben, C – substrat, D – łopatki mieszadła, E – obudowa , F – wlot przepływu wody, G – wylot wody

Rys. 3.10. Schemat bioreaktora STR stosowanego w systemie SSF do hodowli okresowej bez zasilania

Zastosowanie systemu SSF

W Europie system SSF wykorzystuje się do produkcji serów dojrzewających, fermentowanych warzyw (kiszonej kapusty, kiszonych ogórków) lub kiszonek dla bydła, a w Azji – do produkcji wyrobów fermentowanych z soi, ryżu lub kukurydzy. Przykładem jest czerwony ryż drożdżowy, który jest produktem otrzymanym po fermentacji ryżu z różnymi gatunkami Monascus, z najbardziej typowym Monascus purpureus. Ten produkt jest znany w różnych krajach azjatyckich (Chiny, Japonia, Tajlandia, Indonezja, Tajwan i Filipiny) od wieków i używa się go do barwienia żywności, produkcji likieru (Kaoliang) lub jako suplement diety o działaniu antycholesterolowym. Tradycyjnie czerwony ryż drożdżowy jest stosowany do barwienia mączek rybnych, produktów sojowych, octu, kaczki pekińskiej, a ostatnio także parówek lub kiełbasek. Szeroko akceptowana jest hodowla grzybów takich jak Agaricus, Pleurotus, Lentinula, Flammulina i Volvariella na odpadach rolnych i leśnych w systemie SSF. Rozkładają one zwilżony materiał lignocelulozowy, taki jak słoma, słoma kukurydziana, pył drzewny, kłody drewna lub pnie jako podłoża.

System SSF jest stosowany do bioremediacji gruntów i terenów skażonych, biodegradacji i detoksykacji związków niebezpiecznych, biotransformacji płodów i resztek pożniwnych do wzbogacania pasz, produkcji biologicznie czynnych aktywnych metabolitów wtórnych, jak antybiotyki, alkaloidy, czynniki wzrostu roślin oraz enzymów (tab. 3.1), kwasów organicznych, biopestycydów, biosurfaktantów, biopaliw, związków aromatycznych (tab. 3.2).

Tabela 3.1. Enzymy produkowane przez mikroorganizmy w systemie SSF na różnych odpadach organicznych

Organizm

Enzym

Substrat

Produktywność

Bioreaktor

Lit.

Bacillus sp. BBXS-2

amylaza

słoma pszenna

6900 U/g, 5 dni

kolba Erlenmeyera

[1]

Thermomyces sp.

amylaza

odpady soi i chleba

39,900 U/g, 4 dni

reaktor cylindryczny

[2]

Aspergillus niger NRRL2001

celulaza

wytłoki z jabłek łuski ryżu i laktoza

401 U/g (F-Pase), 545 U/g(CM-Case), 285 U/g(glukozydaza), 4 dni

taca

[3]

Aspergillus fumigatus

celulaza

kukurydza

526 U/g (CM-Case),

145 U/g(F-Pase),4 dni

kolba Erlenmeyera

[4]

Trametes versicolor

ATCC 20869

lakaza

zużyte ziarno z browaru

13,506 U/g, 12 dni

taca

[5]

Pleurotus sp.

lakaza

kokos

54,600 U/g, 8 dni

taca

[6]

Penicillium simplicissimum

lipaza

odpady fasoli rycynowej

155 U/g, 4 dni

taca

[7]

Thermomucor indicaeseudaticae N31

lipaza

wytłoki z trzciny cukrowej i olej sojowy

15 U/g, 3 dni

worek polipropylenowy

[8]

Aspergillus niger F3

pektynaza

skórka cytrusowa

265 U/g, 4 dni

horyzontalny bęben

[9]

Aspergillus oryzae CPQBA394-12 DRM 01

pektynaza

miąższ cytrusowy i wytłoki z trzciny cukrowej

40 U/g, 18-24 godz.

skala pilotowa

złoże upakowane

[10]

Aspergillus niger LBA 02

proteaza

otręby pszenne, śruta sojowa, mączka z nasion bawełny, skórka pomarańczy

262,78 U/g, 2 dni

kolba Erlenmeyera

[11]

Aspergillus versicolorCJS-98

proteaza

jatropha ciasto z nasion

3366 U/g, 4 dni

kolba Erlenmeyera

[12]

Bacillus pumilus SV-85S

ksylanaza

otręby pszenne

73,000 U/g, 2 dni

kolba Erlenmeyera

[13]

Aspergillus candidus

ksylanaza

otręby pszenne

770 U/g, 3 dni

kolba Erlenmeyera

[14]

[1] Qureshi i wsp. 2016. Biocatal. Agric. Biotechnol., 8: 146–151. [2] Cerda i wsp. 2016. J. Environ. Chem. Eng., 4: 2394–2401. [3] Dhillon i wsp. 2012. Industrial Crops Prod., 38: 6–13. [4] Liu i wsp. 2011. Intern. Biodeterior. Biodegrad., 65: 717–725. [5] Dhillon i wsp. 2012. Industrial Crops Prod., 50: 346–351. [6] Bhattacharya i wsp. 2011. New Biotechnol., 28: 31-39. [7] Godoy i wsp. 2011. J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 38: 945–953. [8] Ferrarezi i wsp. 2014. J. Molecular Catalys. B: Enzymatic, 107: 106–113. [9] Rodríguez-Fernández i wsp. 2011. Bioresour. Technol., 102: 10657–10662. [10] Biz i wsp. 2016. Biochem. Eng. J., 111: 54–62. [11] Castro i wsp. 2015. Biocatalysis Agric. Biotechnol., 4: 678–684. [12] Veerabhadrappa i wsp. 2014. J. Biosci. Bioeng., 117: 208–214. [13] Nagar i wsp. 2011. New Biotechnol., 28: 581–587. [14] Garai i Kumar. 2013. Industrial Crops Prod., 44: 352–363.

Tabela 3.2. Produktywność mikroorganizmów w hodowlach prowadzonych w systemie SSF

Organizm

Produkt

Substrat

Produktywność

Hodowla

Lit.

Monascus purpureus KACC 42430

pigment czerwony

kukurydza w proszku

25,42 OD j./g,

7 dni

kolba Erlenmeyera

[1]

Xanthophyllomyces dendrorhous, Sporidiobolus salmonicolor

astaksantyna

wytłoki z oliwek

220,24 g/g, 12 dni

kolba Erlenmeyera

[2]

Aspergillus niger NRRL 567

kwas cytrynowy

wytłoki z jabłek

294,2 g/kg s.m. substratu, 5 dni

obrotowy bioreaktor bębnowy

[3]

Rhizopus oryzae 1526

kwas fumarowy

ścier z masy celulozowej i papieru

41,45 g/kg s.m. substratu, 21 dni

kolba Erlenmeyera

[4]

Lactobacillus amylovorus

kwas mlekowy

kasza kukurydziana

0,91 g/g

laboratoryjna skala STR

[5]

Aspergillus niger van Tieghem KACC 44333

kwas szczawiowy

kukurydza sproszkowana

120 g/kg substratu, 7 dni

kolba Erlenmeyera

[6]

Aspergillus awamori

związki fenolowe

proso perłowe

176,82 mg GAE/g s.m. substratu

kolba Erlenmeyera

[7]

[1] Velmurugan i wsp. 2011. J. Biosci. Bioeng., 112: 590–594. [2] Eryılmaz 2016. Biocatal. Agric. Biotechnol., 7: 224–227. [3] Dhillon i wsp. 2013. Industrial Crops Prod., 50: 346–351. [4] Das i wsp. 2016. J. Cleaner Production, 112: 4435–4444. [5] Trontel i wsp. 2011. Food Technol. Biotechnol., 49: 75–82. [6] Mai i wsp. 2016. Process Biochem., 51: 9–15. [7] Salar i wsp. 2016. Resource-Efficient Technologies, 2: 148–157.

3.7.Fermentacja wgłębna (SmF)

Fermentacja SmF wykorzystuje substraty, które rozpuszczają się w wodzie, takie jak melasa i buliony, ekstrakty, hydrolizaty. Substraty te z podłoża hodowlanego są wykorzystywane dość szybko i wyczerpują się, dlatego powinny być w hodowlach uzupełniane. Ten system fermentacji jest najbardziej odpowiedni dla takich mikroorganizmów, jak bakterie, dla których woda jest naturalnym środowiskiem życia. Dodatkową zaletą tej metody hodowli jest fakt, że uwalniane przez mikroorganizmy produkty są stosunkowo łatwe do izolowania i oczyszczania. System SmF jest głównie stosowany w produkcji i w ekstrakcji metabolitów wtórnych, które muszą być wykorzystywane w postaci płynnej. Substraty pokarmowe używane w fermentacji wgłębnej to rozpuszczalne cukry, kwasy organiczne, melasa, soki owocowe i warzywne, ekstrakty oraz ścieki z bioprzemysłu.

3.7.1. Bioreaktory SmF

W procesach fermentacji wgłębnej stosuje się kilka typów bioreaktorów w różnych rozmiarach, z których wszystkie wykazują pewne predyspozycje do określonych zastosowań.

Bioreaktor typu BST (Batch Stirred Tank)

Bioreaktor z mieszadłem jest najprostszym typem fermentora (rys. 3.11).

Rys. 3.11. Schemat bioreaktora typu BST

Podłoże fermentacyjne wraz z mikroorganizmem jest mieszane za pomocą mieszalnika, takiego jak mieszadło czy skrzydło turbiny. Sterylne podłoże fermentacyjne zaszczepia się odpowiednimi organizmami lub enzymami, które przekształcają składniki odżywcze w produkty pozostające w bioreaktorze do końca hodowli. W zależności od wymagań fermentacji na dnie zbiornika bioreaktora mogą być umieszczone urządzenia do podawania sprężonego sterylnego powietrza, tłoczonego przez odpowiedni filtr. Zmieniając szybkość przepływu powietrza i prędkość mieszania, można kontrolować ciśnienie cząstkowe tlenu. Bioreaktor może mieć płaszcz wodny służący do utrzymania odpowiedniej temperatury hodowli, przez który przepływa woda o odpowiedniej temperaturze. Ten typ reaktora jest przydatny do roztworów substratów o wysokiej lepkości i do enzymów o stosunkowo niskiej aktywności, immobilizowanych (unieruchomionych) na odpowiedniej fazie stałej. Wadą tego bioreaktora jest to, że niektóre metabolity ulegają rozkładowi podczas fizycznego mieszania. Bioreaktor do hodowli okresowej jest na ogół odpowiedni do produkcji raczej małych ilości produktu.

Bioreaktor typu CST (Continuous Stirred Tank)

Bioreaktor typu CST jest wyposażony w mieszadło oraz miejsca dopływu podłoża hodowlanego i odpływu z hodowli wraz z wytworzonym przez mikroorganizm produktem. Ten typ hodowli jest bardziej wydajny niż hodowla okresowa, ale jego wyposażenie jest bardziej skomplikowane (rys. 3.12). Hodowla mieszana w bioreaktorze przyjmuje jednorodny skład w całym zbiorniku, a także w strumieniu wylotowym produktu.

Rys. 3.12. Schemat bioreaktora typu CST

Bioreaktor do hodowli okresowej z zasilaniem (Fed-Batch Culture)

Hodowla okresowa z zasilaniem jest inną techniką pracy zbiornika z mieszadłem, w której jeden lub więcej składników odżywczych podaje się do bioreaktora podczas hodowli mikroorganizmu, a produkt lub produkty pozostają w bioreaktorze do końca trwania hodowli. Zaletą hodowli okresowej z zasilaniem jest to, że stężenie substratu zasilanego w płynie hodowlanym można dostosować do pożądanego poziomu, dzięki czemu osiąga się ekstremalnie wysokie liczebności komórek mikroorganizmu (rys. 3.13). Zaletą tego typu bioreaktora jest łatwość konstrukcji, kontroli i czyszczenia bioreaktora, wadą – stosunkowo wysokie siły ścinające.

Rys. 3.13. Schemat bioreaktora typu Fed-Batch Stirred Tank

Bioreaktor typu kolumna barbotażowa (Bubble Column)

Kolumna z barbotażem to cylindryczne naczynie, w którym podłoże hodowlane jest mieszane za pomocą sprężonego powietrza podawanego od dołu w postaci pęcherzyków, co zużywa mniej energii niż mieszanie mechaniczne. Reaktory te są ogólnie określane jako reaktory kolumnowe z pęcherzykami poruszającymi zawiesinę jako fazę stałą (rys. 3.14).

Rys. 3.14. Schemat bioreaktora typu kolumna barbotażowa

Substraty mogą być dostarczane do bioreaktora w przepływie równoległym lub przeciwprądowym. Wielkość pęcherzyków ma duży wpływ na parametry hydrodynamiczne, takie jak prędkość narastania pęcherzyków, czas przebywania powietrza, obszar międzyfazowy powietrza i cieczy oraz współczynnik przenikania masy powietrza i cieczy. Tego typu bioreaktory mają zastosowanie do produkcji enzymów, białek, antybiotyków itp. Zalety: niskie koszty inwestycyjne, łatwa konstrukcja, niskie koszty energii, brak ruchomych części (niskie siły ścinające). Wada: niezdefiniowany przepływ podłoża fermentacyjnego.

Bioreaktor typu Airlift

Bioreaktory Airlift to reaktory wieżowe do fermentacji prowadzonych w warunkach tlenowych na dużą skalę, w których mieszanie podłoża hodowlanego odbywa się za pomocą sprężonego powietrza (rys. 3.15).

Kompresor wtłacza sprężone powietrze do rury tłocznej, która jest zanurzona w cieczy na dnie reaktora. Sprężone powietrze przemieszcza się w górę reaktora, mieszając się z cieczą. Mieszanina gaz-ciecz jest mniej gęsta niż reszta otaczającego ją płynu, dlatego jest przemieszczana w górę przez rurę wewnętrzną. Ciała stałe porywane w czasie przepływu cieczy przez rurę są rozprowadzane do drugiej części bioreaktora. Do zalet tego typu bioreaktora zalicza się niskie siły ścinające oraz wymagane powietrze lub inny gaz w zależności od mikroorganizmu. Wady – wysokie koszty pracy sprężarki.

Bioreaktor typu złoże fluidalne (Fluidized Bed Reactor)

W bioreaktorze typu złoże fluidalne substrat przepuszcza się przez granulowaną lub peletowaną biomasę mikroorganizmu lub enkapsułowane enzymy z wystarczająco dużą prędkością, aby ciała stałe utrzymać z zawiesinie przez mieszanie gazem wprowadzanym na dno bioreaktora za pomocą sprężarki. Porowata płyta oddziela wlot gazu od dyspersji ciecz-ciało stałe. Po osiągnięciu optymalnych parametrów wydajność mieszania jest porównywalna z wydajnością w zbiorniku z mieszadłem, a przy tym nie ma sił ścinających (rys. 3.16). Do zalet hodowli mikroorganizmu w tym bioreaktorze należą jednolita temperatura oraz jednorodne mieszanie zawieszonych cząstek.

Rys. 3.15. Schemat bioreaktora typu Airlift

Rys. 3.16. Schemat bioreaktora typu złoże fluidalne (Fluidized bed bioreactor)

Bioreaktor typu złoże zraszane (Trickle Bed)

Bioreaktor ze złożem zraszanym (rys. 3.17) stwarza warunki do rozwoju mikroorganizmów w postaci biofilmu na fazie stałej, którą mogą być granule, granularna biomasa lub enkapsułowane enzymy. Od góry jest dozowane podłoże fermentacyjne w postaci silnie rozproszonych drobnych kropel, od dołu jest dozowane powietrze, tak aby wewnątrz złoża panowały optymalne warunki tlenowe. Ten typ reaktora jest stosowany do produkcji octu. Złoże jest łatwe w konstrukcji, ale dynamika przepływu cieczy nie jest do końca poznana.

Rys. 3.17. Schemat bioreaktora ze złożem zraszanym

3.8.Wydajności w procesie fermentacji

3.8.1. Produktywność

Fermentacja jest podstawową techniką produkcji różnych enzymów. Zarówno grzyby, jak i bakterie zawierają nieocenione zestawy enzymów fermentacyjnych na odpowiednich substratach. Do produkcji enzymów wykorzystuje się zarówno fermentację typu SSF i SmF. Fermentacja SmF jest zwykle stosowana do produkcji enzymów bakteryjnych ze względu na to, że bakterie wymagają wyższych wartości aktywności wody. Fermentacja typu SSF jest preferowana do produkcji i ekstrakcji enzymów z grzybów, które wymagają niższych wartości aktywności wody. Więcej niż 75% enzymów przemysłowych produkuje się przy użyciu fermentacji typu SmF, gdyż jest ona wykorzystywana przez genetycznie zmodyfikowane organizmy w większym stopniu niż SSF. Do produkcji wielu enzymów wykorzystuje się grzyby należące do rodzaju Aspergillus. Znaczenie grzybów tego rodzaju jest duże, a wyniki przedstawione w tabeli 3.3 zostały uzyskane na organizmie modelowym Aspergillus niger. W rzeczywistości Aspergillus niger jest zdecydowanie największym źródłem enzymów produkowanych przez grzyby. Różnice metaboliczne między fermentacją SSF a SmF mają bezpośredni wpływ na produktywność grzyba.

Tabela 3.3. Enzymy produkowane przez szczepy Aspergillus niger

Enzym

Substrat fermentowany

Produktywność

Lit.

SSF

SmF

SSF

SmF

lipaza

otręby pszenne z oliwą z oliwek

podłoże syntetyczne z olejem

630 IU/g s.m.

18 IU/ml

[1]

tanaza

pianka poliuretanowa

podłoże produkcyjne

12 000 IU/l

2500 IU/l

[2]

esteraza

miąż buraków cukrowych

podłoże z kwasem cynamonowym

20 nkat/mg s.m.

0,4 nkat/ml

[3]

poligalaktouronidaza

otręby pszenne z miąższem z kawy

podłoże z pektyną

2,28 U/l

0,48 U/l

[4]

[1] Mahadik i wsp. 2002. Process Biochem., 38: 715–721. [2] Aguilar i wsp. 2001. Amer. J. Biochem. Biotechnol., 4: 354–366. [3] Asther i wsp. 2002. Process Biochem., 38: 685–691. [4] Maldonado i wsp. 1998. J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 20: 34–38.

W tabeli 3.4 przedstawiono przykładowe enzymy produkowane przez szczepy Bacillus w hodowlach typu SSF.

Środki hipercholesterolowe to substancje, które blokują nadprodukcję cholesterolu w wątrobie. Wysoki poziom cholesterolu we krwi uważa się za jedną z podstawowych przyczyn artroskopii, która prowadzi do choroby wieńcowej serca. Znanych jest kilka preparatów grzybowych, jak kompaktyna, lowastatyna i prawastatyna, które są naturalnymi statynami. Fermentacja to opłacalny sposób masowej produkcji statyn. W tym celu wykorzystuje się zarówno fermentację SSF, jak i SmF. Różne szczepy stosowane do produkcji statyn przedstawiono w tabeli 3.5.

Tabela 3.4. Enzymy produkowane przez szczepy należące do rodzaju Bacillus

Enzym

Substrat fermentowany

Produktywność

Lit.

SSF

SmF

SSF

SmF

amylaza

otręby pszenne, ciasteczka olejowe, wytłoki

bulion ze skrobią

~50 000 U/g

400 U/ml

[1]

celulaza

odpady z bananów

karboksymetylo-celuloza

96,1 U/g

1,2

[2]

ksylanaza

kolby kukurydzy i otręby pszenne

kolby kukurydzy i ekstrakt drożdżowy, pepton

6,18 U/g

16,13

[3]

[1] Singh i wsp. 2010. Res. J. Pharma. Biol. Chem. Sci., 1: 867–876. [2] Sukumaran i wsp. 2005. J. Scientif. Industrial Res., 64: 832–844. [3] Gupta i wsp. 2009. Brazilian Archiv. Biol. Technol., 52: 1363–1371.

Tabela 3.5. Statyny produkowane przez grzyby strzępkowe w procesie fermentacji

Statyna/szczep

Substrat fermentowany

Produktywność

Lit.

SSF

SmF

SSF

SmF

kompaktyna

otręby pszenne, soja, olej z orzeszków ziemnych

rozpuszczalne składniki soi, glukoza, pepton

725 mg/g

456 mg/l

[1], [2]

lowastatyna

otręby pszenne, łuski ryżowe, słoma

podłoże z ekstraktem drożdżowym

1500 mg/ml

400 mg/ml

[3], [4]

mewastatyna

otręby pszenne

podłoże z nasion z glukozą, glicerolem, peptonem

0,0554 mg/ml

490 mg/l

[3], [4]

prawastatyna

otręby ryżowe z łuskami

bulion odżywczy, ekstrakt drożdżowy, glukoza

15 mg/l · godz.

80–85%

[5], [6]

[1] Shaligram i wsp. 2009. J. Microbiol. Biotechnol., 19: 690–697. [2] Chakravarti i Sahai. 2002. Process Biochem,, 38: 481–486. [3] Manzoni i Rolini. 2002. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 555–564. [4] Szakacs i wsp. 1998. Biotechnol. Letters, 20: 411–415. [5] Park i wsp. 2003. Biotechnol. Letters, 25: 1827–1831. [6] Kostova i wsp. 2004. European Patent 1 452 602 A1.

3.8.2. Intensyfikacja fermentacji

Dostępnych jest kilka strategii intensyfikacji fermentacji. Niektóre z nich skupiają się na aspektach inżynieryjnych, podczas gdy inne wykorzystują narzędzia fizjologiczne, jak modulacja (selekcja lub adaptacja mikroorganizmów), mutageneza lub manipulacja genetyczna w celu ulepszania produktywności szczepów przemysłowych. Znacząco poprawiono procesy fermentacji, stosując różne podejścia inżynieryjne celem polepszenia wymiany masy i ciepła, zmniejszenia zużycia energii, a także prowadząc hodowle komórkowe o dużej gęstości i mieszanie z niskimi siłami ścinania. Wydajność bioprocesu można zwiększyć przez dobranie odpowiedniego składu podłoża, typu bioreaktora oraz strategii zasilania hodowli wgłębnej. W ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci nastąpił znaczący postęp w dziedzinie kontroli procesów i oprzyrządowania bioreaktorów. Ma to duże znaczenie gospodarcze, ponieważ optymalnie prowadzony proces fermentacji ma większą wydajność (wysokie stężenie produktu). Obsługa procesu z wysoką wydajnością wymaga zrozumienia warunków biologicznych, kinetyki procesu (ograniczenie, hamowanie) i zjawisk transportu. Zwiększoną produktywność fermentacji można osiągnąć przez zastosowanie kontrolowanego kontaktu substratów z biokatalizatorami w wysokich stężeniach, enzymu lub komórek mikroorganizmów. Hodowle o wysokiej gęstości komórek mogą powstawać w wyniku stosowania optymalnych strategii żywieniowych, recyklingu komórek lub ich immobilizacji. Hodowle z unieruchomionymi komórkami drożdży są stosowane w produkcji żywności i napojów alkoholowych. Należą do nich produkcja wina, octu, cydru, piwa, związków aromatycznych, pigmentów, produktów mlecznych, przetwórstwo mięsa, piekarstwo, produkcja słodzików i nutraceutyków. Maksymalne stężenie unieruchomionej biomasy drożdży jest 10-krotnie wyższe niż w przypadku konwencjonalnej fermentacji piwa. Unieruchomienie mikroorganizmów wywołuje różne reakcje fizjologiczne w porównaniu do hodowli wolnych komórek o niskiej gęstości, a zatem ich stosowanie musi być starannie rozważone w aspekcie jakości powstałego produktu. Ważnym czynnikiem wpływającym na wzrost i aktywność metaboliczną komórek unieruchomionych jest mikrośrodowisko w stałej matrycy unieruchamiającej, reprezentowane przez parametry, takie jak aktywność wody, pH, stężenie tlenu, gradienty substratu i produktu oraz naprężenia mechaniczne. Chociaż istnieje wiele różnych metod badania stanu metabolizmu unieruchomionych komórek, pozyskiwanie wiarygodnych danych nadal ogranicza optymalizację procesu. Stwierdzono, że immobilizacja aktywuje niektóre funkcje metaboliczne komórek mikroorganizmów (pobieranie substratu, tworzenie produktu, ekspresja i aktywność enzymów). Unieruchomione komórki wykazują zwiększony poziom DNA, węglowodanów, kwasów tłuszczowych, modyfikacje w ścianie komórkowej oraz błonach plazmatycznych. Zmiany w ścianie komórkowej i błonach plazmatycznych mają wpływ na enzymy, białka sensoryczne, transportery oraz płynność błon. Immobilizowane komórki wykazują zwiększoną oporność na substancje hamujące (etanol, zanieczyszczenia, środki przeciwbakteryjne).

Jakie są trendy w bioprocesowaniu w okresie ostatnich 20 lat? Dominująca konstrukcja bioreaktorów o dużej objętości (10−20 tysięcy litrów) wykonanych ze stali nierdzewnej, zapewniających stabilną produkcję białka, powstała w latach 90. XX w. Dziesięć lat później firmy biotechnologiczne zaczęły przechodzić na mniejsze bioreaktory (skala 10-krotnie mniejsza). W tym kontekście zintegrowana hodowla ciągła jest postrzegana jako krok transformacyjny na drodze ewolucji procesu prowadzenia fermentacji, dążenie do wysokiej intensyfikacji, ograniczenia wyposażenia, z maksymalnym wykorzystaniem mocy produkcyjnych i mniejszymi partiami przetwórczymi. Istnieje więc tendencja ewoluowania do zintegrowanego ciągłego przetwarzania biologicznego.

3.8.3. Naturalne fermentacje zbóż

Zboża rosną na ponad 73% obszarów rolniczych całego świata i stanowią surowiec dla ponad 60% światowej produkcja żywności, zapewniając błonnik pokarmowy, węglowodany, białka, minerały i witaminy w diecie ludzkiej. Jednak jakość odżywcza produktów zbożowych i ich właściwości sensoryczne są gorsze lub słabsze w porównaniu z mlekiem i produktami mlecznymi. Zawierają mniej białka, nie zawierają pewnych niezbędnych aminokwasów oraz zawierają dodatkowe związki jak kwas fitynowy, taniny i polifenole. Produkty fermentacji mogą mieć znacznie większą wartość odżywczą niż niesfermentowany surowiec. Fermentacja mikrobiologiczna prowadzi do zmniejszenia poziomu węglowodanów i niektórych niestrawnych poli- i oligosacharydów. Nadto mogą być w niej syntetyzowane pewne aminokwasy i witaminy z grupy B. Podczas fermentacji zbóż przez bakterie kwasu mlekowego zwiększają się ilości aminokwasów (na skutek proteolizy i/lub syntezy w procesie metabolizmu), w tym lizyny, metioniny i tryptofanu. Naturalna fermentacja kukurydzy wzbogaca produkt w azot niebiałkowy oraz zwiększa zawartość białka. Po szesnastu godzinach fermentacji ciasto kukurydzy wzbogaciło się w albuminy i pewne frakcje globulin, a więc jego wartość odżywcza znacznie wzrosła. Poprawa strawności skrobi podczas fermentacji może być związana z właściwościami enzymatycznymi fermentującej mikroflory, która powoduje rozpad oligosacharydów skrobiowych. Enzymy doprowadzają do rozszczepienia amylazy i amylopektyny do maltozy i glukozy. Podobnie poprawa strawności białka fermentowanych produktów jest związana głównie ze zwiększoną aktywnością proteolityczną fermentującej mikroflory. Fermentacja jest także ważnym procesem, który znacznie obniża zawartość składników takich jak fityniany, taniny, polifenole ziaren zbóż. Fermentacja zapewnia również optymalne pH do degradacji enzymatycznej fitynianu, który występuje w zbożach w postaci kompleksów z wielowartościowymi kationami, takimi jak żelazo, cynk, wapń, magnez oraz białka. Redukcja fitynianu może kilkakrotnie zwiększyć ilość rozpuszczalnego żelaza, cynku i wapnia. Podczas fermentacji redukcja zawartości kwasu fitowego może częściowo wynikać z aktywności fitazy obecnej w mikroflorze. Z wyjątkiem niektórych zbóż o wysokiej zawartości taniny jej poziom ulega zmniejszeniu w wyniku działania kwasu mlekowego, dzięki czemu wzrasta wchłanianie żelaza. Tradycyjna żywność fermentowana przygotowana z najpopularniejszych rodzajów zbóż (takich, jak ryż, pszenica, kukurydza lub sorgo) jest dobrze znana w wielu częściach świata. Niektóre produkty fermentacji są wykorzystywane jako napoje do sporządzania śniadania lub lekkich posiłków, kilka z nich stosuje się jako główne pożywienie w dietach. Od dawna stosuje się fermentację kwasu mlekowego w zbożach jako metodę ich przetwarzania i do produkcji żywności w różnych formach, takich jak napoje, kleiki i owsianki w Azji i Afryce. Chociaż istnieją różnice między regionami, procedura przygotowania jest podobna. Najpierw ziarna zbóż, głównie kukurydzy, sorgo lub prosa, są moczone w czystej wodzie przez 0,5–2 dni. Moczenie ułatwia rozbijanie lub mielenie ziaren na mokro do zawiesiny, z której łuski i cząstki otrębów można usuwać z wykorzystaniem odpowiednich narzędzi. Podczas następnych 1–3 dni zachodzi fermentacja mlekowa, spada pH produktu z powodu nagromadzenia się kwasu mlekowego i innych kwasów produkowanych przez bakterie kwasu mlekowego. Tradycyjnym potrawom z ziaren zbóż zazwyczaj brakuje smaku i aromatu. Podczas fermentacji zbóż pojawia się kilka lotnych związków, które przyczyniają się do złożonej mieszanki smakowej produktów. Powstałe smaki są mieszaniną obecności aromatów, takich jak diacetyl, kwas octowy i kwas masłowy, co sprawia, że fermentowane produkty zbożowe są bardziej apetyczne.

Literatura rekomendowana

Gowthamana M.K., Krishna C., Moo-Young M. 2001. Fungal solid state fermentation – an overview. [w:] Agriculture and Food Production v.1., red. Khachatourians G.G. i Arora D.K. Elsevier Science B.V.

Mendez-Gonzalez F., Loera-Corral O., Saucedo-Castaneda G., Favela-Torres E. 2018. Bioreactors for the production of biological control agents produced by solid-state fermentation. [w:] Current Development Biotechnol. Bioeng. Current Adv. Solid-State Fermentation, red. Pandey A., Larroche C., Soccol C.R. s. 109–112.

Pandy A. 2003. Solid-state fermentation. Biochem. Eng. J., 13: 81–84.

Soccol C.R., Ferreira da Costa E. S., Letti L.A. Jr, Karp S.G., Woiciechowski A.L., Porto de Souza Vandenberghe L. 2017. Recent developments and innovations in solid state fermentation. Biotechnol. Res. Innovation, 1: 52–71.

Tang Y.J., Zhu L.W., Li H.M., Li D.S.2007. Submerged cultivation of mushrooms. Food Technol. Biotechnol., 45: 221–229.

4

Bakterie „workhorse” stosowane w mikrobiologii przemysłowej

4.1.Wprowadzenie

W większości fermentacji w skali przemysłowej prowadzonych przez mikroorganizmy stosuje się szczepy zaliczane do jednej z trzech grup. Są to bakterie, drożdże i grzyby strzępkowe. Zrekombinowane szczepy przemysłowe produkują metabolity pierwotne i wtórne, wykorzystywane w różnych gałęziach gospodarki. Trudno zliczyć wszystkie mikroorganizmy stosowane w mikrobiologii przemysłowej. Wybór zależy w dużej mierze od wiedzy o organizmie i dostępnych metodach manipulacji genetycznych. Pewne gatunki bakterii są nazywane jako przemysłowe „workhorse”. Escherichia coli jest jednym z najlepiej zbadanych organizmów, dlatego stanowi jedną z najważniejszych komórkowych fabryk wśród mikroorganizmów. Postępy osiągnięte w biotechnologii w ciągu ostatnich dziesięcioleci otworzyły możliwości wykorzystania organizmów alternatywnych, które wcześniej uważano za nieodpowiednie do wykorzystania jako komórkowe fabryki. Jest ich wiele, zwłaszcza zmodyfikowane i traktowane jako szczepy, a wśród nich: Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Pseudomonas putida.

Jeśli chodzi o przemysłową produkcję aminokwasów, Corynebacterium glutamicum konkuruje z Escherichia coli. Pierwszy z nich jest oporny również na zanieczyszczenia fagami, a drugi posiada naturalne transhydrogenazy, które umożliwiają szybkie zrównoważenie NADH/NAD+ i NADPH/NADP+. Escherichia coli jest szczególnie przydatna do konstruowania najlepszych producentów NADPH, związków potrzebnych do syntezy np. L-lizyny, wymagającej czterech moli NADPH do syntezy jednego mola. Oprócz tego Corynebacterium glutamicum ujawnia kolejne najlepsze cechy, jak maksymalne tempo wzrostu, które wynosi około 0,58/godz. dla szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 17965 hodowanego w podłożu zawierającym glukozę w hodowlach okresowych lub ciągłych oraz turbidostacie lub nawet wyższe 0,60−0,64/godz. na podłożu CGXII. Tempo wzrostu Corynebacterium glutamicum jest niższe ~0,4/godz. w hodowli w bioreaktorach konwencjonalnych. Escherichia coli – przeciwnie – osiąga maksymalne tempo wzrostu 1,04/godz. na podłożu minimalnym z glukozą oraz 1,73/godz. na podłożu pełnym. Ogólnie rzecz biorąc, niskie tempo wzrostu z natury rzeczy ogranicza produktywność procesu: po pierwsze przez osiągnięcie pożądanego stężenia biomasy, a po drugie – przez ograniczenie kinetyki tworzenia produktu sprzężonego ze wzrostem.

4.2.Escherichia coli

Escherichia coli była podstawowym modelem mikroorganizmów w badaniach, które przyniosły wiele odkryć w biologii molekularnej i innych obszarach fizjologii komórki. Jest nazywana także workhorse biologii molekularnej ze względu na szybki wzrost w podłożach chemicznie zdefiniowanych. Dzięki wykorzystaniu i stosowaniu Escherichia coli dokonano ważnych odkryć, z których kilka doceniono przyznaniem Nagrody Nobla w dziedzinie biologii. Do odkryć tych należą m.in.:

- – złamanie kodu genetycznego;

- – poznanie mechanizmu replikacji DNA;

- – przełomowe postępy w organizacji i regulacji genów nazywanych „operonem”;

- – ważne dowody na mutacje i ostatecznie na ewolucję organizmów;

- – uzyskanie genetycznie zmodyfikowanego organizmu wykazującego ogromną podatność na manipulacje, co uczyniło Escherichia coli głównym organizmem wykorzystywanym w biotechnologii.

Oprócz szybkiego wzrostu w pożywkach zdefiniowanych chemicznie Escherichia coli ma jeszcze następujące zalety:

- – komórki rosną na względnie tanich podłożach hodowlanych;

- – komórki nie tworzą agregatów;

- – komórki można przeskalować z warunków laboratoryjnych do skali przemysłowej produkcji różnych metabolitów;

- – można stosować różne techniki i narzędzia molekularne do manipulacji genetycznych;

- – istnieje rozległa wiedza na temat genetyki i genomiki Escherichia coli, jej transkryptomu, proteomu i metabolomu, a niektóre szczepy Escherichia coli są uważane za bezpieczne biologicznie.

Bakteria ta zasadniczo pomogła w rozwiązywaniu „zagadek” w biotechnologii, np. użyto jej w celu wygenerowania bibliotek sekwencji DNA z innych gatunków, w celu produkcji białek rekombinowanych i opracowania technologii klonowania. Wydaje się, że jak dotąd w naturze nie ma innych bakterii, które przyczyniłyby się do tak wielu postępów w dziedzinie medycyny, biologii i biotechnologii jak Escherichia coli. Została ona nazwana na cześć mikrobiologa Theodora Eschericha (1857–1911), a początkowo nazywano ją Bacterium coli commune, rezyduje w okrężnicy przewodu pokarmowego, jest organizmem wskaźnikowym na zanieczyszczenia kałowe. Escherichia coli jest zróżnicowana, opisane są różne szczepy w ramach gatunku, począwszy od szczepów probiotycznych, takich jak E. coli Nissle 1917, przez niepozorne szczepy komensalne, aż po bardzo znaczące – groźne szczepy patogeniczne. Siedem szczepów Escherichia coli jest powszechnie stosowanych w biotechnologii: E. coli C (DSMZ 4860), E. coli Crooks (DSMZ 1576), E. coli DH5a (DSMZ 6897), E. coli W (DSMZ 1116), E. coli W3110 (DSMZ 5911), E. coli BL21 (DE3) i E. coli K-12 MG1655 (ATCC 700926).

Typowe Gram-ujemne komórki Escherichia coli są pałeczkami o długości ok. 1 μm i szerokości 0,35 μm. Wymiary mogą się znacznie różnić w zależności od szczepu i warunków hodowli. Niektóre badania dotyczące różnych mutacji potwierdzają ich wpływ na wielkość i znacznie Escherichia coli. Bakterie te mogą dorastać do 750 μm długości, są zdolne do życia (do podziału komórkowego) i zachowują aktywność metaboliczną. Escherichia coli jest fakultatywnym beztlenowcem (oddychanie tlenowe odbywa się w obecności tlenu lub proces fermentacji pod jego nieobecność), który posiada czujnik obecności tlenu (potencjał redoks) i może aktywować lub tłumić wymagane enzymy metaboliczne w zależności od poziomu tlenu. Escherichia coli i inne Enterobacteriaceae mogą być pierwszymi organizmami, które kolonizują jelito niemowlęce z powodu tej zdolności do metabolizowania tlenu lub fermentacji, ponieważ te fakultatywne bakterie zużywają pozostały tlen w tym środowisku, tak że stwarzają odpowiednie warunki do kolonizowania przewodu pokarmowego przez inne bakterie ściśle beztlenowe.

Filogenetycznie Escherichia coli należy do Enterobacteriaceae i jest blisko spokrewniona z patogenami, takimi jak Salmonella, Klebsiella, Serratia i Yersinia pestis, ta ostatnia wywołuje dżumę. Chociaż w większości szczepy Escherichia coli są nieszkodliwe, u niektórych z nich zidentyfikowano wyspy patogeniczności i są związane z patogenezą, w wyniku czego powstają szczepy Escherichia coli kolonizujące różne tkanki. W skład komórek Escherichia coli wchodzi ok. 55% białka, 25% kwasów nukleinowych, 9% lipidów, 6% ściany komórkowej, 2,5% glikogenu i 3% innych metabolitów, które są ważne ze względu na problematyczny przepływ węgla organicznego przez komórkę, który należy rozwiązać, aby stworzyć nową ścieżkę metaboliczną lub poprawić obecną funkcjonującą ścieżkę. Przepływ węgla jest ściśle regulowany również przez zaawansowane sieci regulacyjne, które wymagają modelowania i podstawowej wiedzy na temat mechanizmów regulacyjnych, aby manipulować nimi i osiągnąć pożądane cele.

Escherichia coli jest częścią normalnej mikroflory organizmów stałocieplnych. U ludzi stanowi nie więcej niż 1% całej wspólnoty mikroorganizmów przewodu pokarmowego. Komórkom Escherichia coli brakuje wielu cech interesujących biotechnologów, takich jak wzrost w warunkach ekstremalnych wartości temperatury lub pH, zdolność do degradacji związków toksycznych, zanieczyszczeń lub trudnych do degradacji polimerów. Ale komórki tej bakterii potrafią robić niesamowite rzeczy, a jej jedynym ograniczeniem jest wyobraźnia biotechnologa. Escherichia coli ma genom o uderzająco zorganizowanej strukturze, pozostałości wielu fagów i sekwencje insercyjne (IS). W 1997 r. pozyskano kompletną sekwencję genomu szczepu K-12. Kompletny genom zawiera pojedynczą, kolistą, podwójną nić DNA złożoną z 4 639 221 pz. Regiony kodujące białka stanowią 87,8% genomu, podczas gdy 0,8% koduje stabilne RNA, 0,7% to niekodujące powtórzenia, a pozostałe 11% kodują funkcje regulacyjne i inne. Warto podkreślić, że prawie 34% (1431) to białka osierocone lub bez określonej funkcji molekularnej, ale wydaje się, że mogą one odgrywać rolę w określonych szlakach lub procesach molekularnych. W przypadku zastosowań biotechnologicznych optymalizacja wzrostu jest również wymaganą cechą organizmów modyfikowanych genetycznie. W przypadku Escherichia coli wykazano ostatnio, że wzrost można manipulować przez usuwanie nieistotnych sekwencji genomowych, które można również wykorzystać do projektowania ważnych szczepów biotechnologicznych do celów przemysłowych.

Escherichia coli jest najkorzystniejszym mikroorganizmem do ekspresji heterologicznych białek, które mają zastosowanie terapeutyczne, ponieważ obecnie około 30% stosowanych białek terapeutycznych produkuje się przy użyciu właśnie Escherichia coli. Kilka cech czyni, że Escherichia coli jest bardzo dobrą komórkową fabryką (cell factories) do produkcji białek heterologicznych, którą cechuje szybkie tempo wzrostu, wysoka wydajność produktu, opłacalność i łatwe skalowanie procesu fermentacji, szczególnie nieglikozylowanych białek do użytku terapeutycznego. Ponadto dostępność różnych wektorów ekspresyjnych i szczepów Escherichia coli, a także obecnie stosunkowo łatwe mechanizmy składania białek i technologie bioprocesowe sprawiają, że ten gatunek bakterii jest bardzo atrakcyjny do zastosowań przemysłowych. Jednak brak modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, fosforylacja i przetwarzanie proteolityczne, ogranicza stosowanie Escherichia coli do produkcji lekko złożonych rekombinowanych biofarmaceutyków. Trwają dalsze prace nad nowymi zmianami technologicznymi w systemie ekspresji Escherichia coli, takimi jak genetyczna modyfikacja w celu uzyskania zdolności do glikozylacji białek heterologicznych, w tym w pełnej długości glikozylowanych przeciwciał. Escherichia coli jest pierwszym mikroorganizmem, który został użyty do produkcji biofarmaceutyków – w 1982 r. zatwierdzono działanie regulacyjne insuliny ludzkiej w leczeniu cukrzycy. Zatwierdzenie bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) w 1994 r. ustanowiło nowy standard wytwarzania białek heterologicznych z Escherichia coli z zastosowaniem terapeutycznym. Są to:

1. 1) humulin (insulina, rh – rekombinant ludzki) stosowany do leczenia cukrzycy od 1982 r.;

2. 2) intron A (interferon α2b) do leczenia raka, zapalenia wątroby i brodawek narządów płciowych od 1986 r.;

3. 3) roferon (interferon α2a) do leczenia białaczki od 1986 r.;

4. 4) humatrope (hormon wzrostu rh – rekombinant ludzki) somatotropina do leczenia niedoboru hGH u dzieci od 1987 r.;

5. 5) neupogen (filgrastym) do leczenia neutropenii od 1991 r.;

6. 6) betaferon (interferon β-1b) do leczenia stwardnienia rozsianego od 1993 r.;

7. 7) lispro (szybko działająca insulina) do leczenia cukrzycy od 1996 r.,

8. 8) rapilysin (reteplaza) do leczenia ostrego zawału mięśnia sercowego od 1996 r.;

9. 9) infegren (interferon alfacon-1) do leczenia przewlekłego zapalenia wątroby typu C;

10. 10) glukagon do leczenia hypoglikemii od 1998 r.;

11. 11) buromun (tasonermina) do leczenia mięsaka miękkiego od 1999 r.;

12. 12) ontak (denileukin diftitox) do leczenia skórnego chłoniaka z komórek T od 1999 r.;

13. 13) lantus (długo działająca insulina glargine) do leczenia cukrzycy od 2000 r.,

14. 14) kineret (anakinra) do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów od 2001 r.;

15. 15) atrecor (nesiritide) do leczenia zastoinowej niewydolności serca od 2001 r.,

16. 16) somavert (pegvisomant) do leczenia akromegalii od 2003 r.;

17. 17) kalcytonina (rekombinowana kalcytonina łososia) do leczenia osteoporozy po menopauzie od 2005 r.;

18. 18) lucentis (ranibizumab) do leczenia mokrego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem od 2006 r.;

19. 19) preotact (ludzki hormon przytarczyc) do leczenia osteoporozy od 2006 r.,

20. 20) ksystexxal (PEGylowana oksydaza moczanowa rh) do leczenia dna (skazy moczanowej) od 2010 r.;

21. 21) nivestim (filgrastym, rhGCSF – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów) do leczenia neutropenii od 2010 r.;

22. 22) voraxase (glukarpidaza) do obniżenia poziomu toksyczności metotreksatu u pacjentów z zaburzeniami czynności nerek od 2012 r.;

23. 23) preos (hormon przytarczyc) do leczenia osteoporozy i niedoczynność przytarczyc od 2013 r.

Plazmidy są nie tylko najważniejszymi narzędziami do manipulacji genetycznych Escherichia coli, ale także podstawą inżynierii genetycznej wielu organizmów, klonowania i sekwencjonowania, generowania mutantów i wielu zastosowań w biologii molekularnej. Przykłady plazmidów Escherichia coli: ColE1, p15A, pMB1, pSC101, R6K, kasety ampicylina, kanamycyna, chloramfenikol i tetracyklina, LacZ, CcdB, GFP. Biosensory oparte na Escherichia coli to narzędzia do wielu zastosowań biotechnologicznych. W biotechnologii biosensory są szeroko definiowane jako dowolne urządzenia, oparte na części biologicznej, kompleksie komórkowym, tkankowym lub białkowym, połączone z czujnikiem mechanicznym lub receptorem analitycznym, który zapewnia mierzalny sygnał proporcjonalny do analitu w reakcji. Biosensory oparte na Escherichia coli wykorzystujące konstrukty plazmidowe lub chromosomalne są przydatne do wykrywania cech środowiskowych, zagrożeń lub pomiaru procesów komórkowych jako dowolnego standardowego systemu reporterowego. Bioczujniki oparte na Escherichia coli odniosły sukces w wykrywaniu różnych cech: utleniaczy, związków uszkadzających DNA, związków uszkadzających błony, związków uszkadzających białka, związków aromatycznych, ksenobiotyków, paneli antybiotykowych wykorzystujących szczepy reporterowe. W zasobach PUBMED jest prawie 340 tys. publikacji mających w tytule nazwę Escherichia coli.

4.3.Corynebacterium glutamicum

W zasobach PUBMED jest 1689 publikacji zawierających w tytule nazwę Corynebacterium glutamicum oraz ogólnie z cytatami 2445. Jest to powszechnie stosowana tlenowa Gram-dodatnia niepatogenna bakteria, należąca do typu Actinobacteria, zdolna do produkcji kilku aminokwasów, takich jak: L-glutaminian, L-lizyna, L-fenyloalanina, L-treonina, L-tryptofan, L-seryna, L-prolina, L-glutamina, L-arginina oraz L-izoleucyna. Preferuje glukozę jako źródło węgla, ale może również wykorzystywać inne cukry takie jak sacharoza, fruktoza, ryboza, mannoza i maltoza. Optymalne warunki jej wzrostu to temp. 30°C i pH 7,0. Stężenie glukozy powyżej 50 g/l i kwasu glutaminowego 12 g/l hamują jej wzrost. Maczugowiec Corynebacterium glutamicum został izolowany w poszukiwaniu producenta naturalnego glutaminianu przez badaczy firmy Kyowa Hakko w 1956 r. Corynebacterium glutamicum to gatunek Gram-dodatni, niesporujący, nieprodukujący toksyn i ogólnie uznany za bezpieczny (GRAS). Jest szeroko stosowany do produkcji L-glutaminianu i L-lizyny w skali przemysłowej. Zsekwencjonowanie genomu Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 przez dwie niezależne grupy naukowe w 2003 r. stało się przyczynkiem do początku nowej ery dla tego organizmu w zakresie mikrobiologii przemysłowej. Udostępnienie pełnej sekwencji genomu pozwoliło na lepsze zrozumienie inżynierii Corynebacterium glutamicum. Podczas ostatnich dziesięciu lat ukazało się ponad 100 publikacji dotyczących rozwoju i zastosowania wysokowydajnych technologii, takich jak genomika, transkryptomika, proteomika i metabolomika. Roczna liczba publikacji i patentów rosła szybko i została wydana kompletna informacja o genomie Corynebacterium glutamicum. Sekwencjonowanie DNA pozwoliło na szybsze, głębsze i dokładniejsze zrozumienie mechanizmów regulacji transkrypcji, funkcji i występowania małych fragmentów RNA. Po izolacji Corynebacterium glutamicum jako producenta glutaminianu wiele wysiłku włożono, aby zastosować je do celów przemysłowych. Do 2015 r. opublikowano ponad 2700 artykułów naukowych i 1700 patentów dotyczących Corynebacterium glutamicum. W latach pięćdziesiątych Abe i współpracownicy z Kyowa Hakko pozyskali wyniki badań prowadzonych na 208 szczepach produkujących glutaminian, izolowanych i nazwanych jako Micrococcus glutamicum, a później jako Corynebacterium glutamicum. Te i liczne inne szczepy zostały zaklasyfikowane do rodzaju Brevibacterium, Microbacterium, Micrococcus lub Arthrobacter. Później, dzięki postępowi w taksonomii (analiza sekwencji 16S rDNA i porównanie widm FT-IR), wiele z wcześniej błędnie sklasyfikowanych szczepów zostało przeklasyfikowanych jako Corynebacterium glutamicum. Spośród pierwszych wyizolowanych szczepów, Corynebacterium. glutamicum ATCC13032 typu dzikiego badano pod kątem jego właściwości fizjologicznych, metabolizmu, rozwoju narzędzi genetycznych i inżynierii genetycznej. Kolejny szeroko badany – Corynebacterium glutamicum R – został po raz pierwszy zastosowany do hodowli w warunkach beztlenowych. Szczep R był następnie poddany inżynierii i zastosowany do produkcji etanolu i estrów kwasu bursztynowego, mlekowego i octowego w warunkach beztlenowych. Badano również wiele przemysłowych szczepów Corynebacterium glutamicum (z testów przesiewowych lub inżynierii genetycznej). Do tej pory wg NCBI Taxonomy ID 1718 opisano 343 szczepy, w tym 198 zastrzeżonych patentami oraz typowy szczep dziki ATCC13032, i zdeponowano w ATCC (American Type Culture Collection; http://www.actt.org). Sekwencje Corynebacterium glutamicum zostały udostępnione w CoryneRegNet (http://www.coryneregnet.de) i KEGG(http://www.kegg.jp). Do chwili obecnej zebrano informacje i raporty o genomach 14 szczepów (9 kompletnych genomów, 5 genomów niekompletnych) w bazie danych genomu w NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ genomes/469). Odkryto również małe plazmidy kryptyczne, takie jak pBL1 i pAG3 u Corynebacterium glutamicum i innych maczugowców. Corynebacterium glutamicum ma następujące podstawowe właściwości fizjologiczne, które sprawiają, że jest ważnym „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej:

1. 1) jest uznawany za szczep bezpieczny dla ludzi (GRAS);

2. 2) produkuje dużą biomasę (krótki czas podwojenia), wykazuje szybki wzrost do wysokich wartości gęstości komórek, nawet do 25 g s.m./l w bioreaktorze typu membranowego (sic!);

3. 3) jest genetycznie stabilny ze względu na brak rekombinacyjnego systemu napraw;

4. 4) ma ograniczony system restrykcyjno-modyfikacyjny;

5. 5) nie ma możliwości autolizy i utrzymuje aktywność metaboliczną w różnych warunkach fizykochemicznych;

6. 6) ma niską aktywność proteazy w obecności wytwarzanych rekombinowanych białek;

7. 7) wykazuje plastyczność metabolizmu i silne właściwości metabolizmu wtórnego;

8. 8) wykazuje szerokie spektrum wykorzystania węgla (pentozy, heksozy i alternatywne źródła węgla) oraz tolerancję na stresy w stosunku do źródeł węgla stosowanych w hodowlach;

9. 9) Corynebacterium glutamicum „workhorse” wykorzystuje się do produkcji aminokwasów.

Oprócz lizyny i glutaminianu Corynebacterium jest również wykorzystywany do produkcji innych aminokwasów, takich jak L-treonina, L-metionina, L-seryna, L-histydyna, L-walina, L-tryptofan, L-fenyloalanina i L-tyrozyna, L-leucyna i L-izoleucyna.

Tabela 4.1. Przykłady kwasów organicznych produkowanych przez rekombinowane szczepy Corynebacterium glutamicum i Escherichia coli

Szczep produkcyjny

Wydajność (g/l)

Plon (Y)

(g/g substr.)

Produktywność (g/l · godz.)

Lit.

kwas pirogronowy

Corynebacterium glutamicum ELB-P

44,5

0,72

0,49

[1]

Escherichia coli ALS1059

88,9

0,69

2,08

[2]

Escherichia coli YYC202

62,6

0,84

3,22

[3]

L-mleczan

Corynebacterium glutamicum R

51,1

0,70

6,39

[4]

Corynebacterium glutamicum R

94,4

0,89

15,74

[4]

Escherichia coli SZ85

44,9

0,94

0,64

[5]

kwas bursztynowy (w warunkach tlenowych)

Corynebacterium glutamicum R ∆ldhA∆pCRA717

146,3

0,92

3,19

[6]

Corynebacterium glutamicum BOL-3/pAN6-gap

133,8

1,09

2,48

[7]

Escherichia coli SBS550MG/pHL413

38,9

1,06

1,18

[8]

Escherichia coli KJ134

71,5

1,00

0,76

[9]

[1] Wieschalka i wsp. 2012. Appl. Microbiol. Biotechnol., 94: 449–459. [2] Zhu i wsp. 2008. Appl. Environ. Microbiol., 74: 6649–6655. [3] Zelic i wsp. 2003. Eng, Life Sci., 3: 299–305. [4] Okino i wsp. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol., 68: 475–480. [5] Zhou i wsp. 2003. Appl. Environ. Microbiol., 69: 2237–2244. [6] Okino i wsp. 2008. Appl. Microbiol. Biotechnol., 81: 459–464. [7] Litsanov i wsp. 2012. Microb. Biotechnol., 5: 116–128. [8] Litsanov i wsp. 2012. Microb. Biotechnol., DOI: 10.1111/j.1751-7915.2012.00347.x. [9] Jantama i wsp. 2008. Biotechnol. Bioeng., 101: 881–893.

Podsumowując, wymienione właściwości fizjologiczne czynią Corynebacterium glutamicum podatnym na manipulacje genetyczne oraz hodowlę w bioreaktorach na skalę przemysłową. Dzięki postępom w technologiach rekombinacji DNA, stosowano różne narzędzia do manipulacji w genomie. Podstawowe narzędzia tego typu jak integracja genów, zastąpienie innymi i zakłócenia w genomie Corynebacterium glutamicum osiągnięto drogą koniugacji Escherichia coli, wykorzystując ruchome elementy genetyczne jak wektory. Podjęto próby usprawnienia efektywności transferu i przezwyciężania systemu restrykcji i modyfikacji (jak np. mutanty dam-, dcm-, mcrBC-). Pojedyncza krzyżowa rekombinacja oraz rekombinacja podwójnie krzyżowa zostały opracowane w celu zastąpienia genów lub metody zakłócania przez zderzenia. Cre/loxP- pośredniczył w systemach rekombinacji w celu uporządkowania dużych regionów genomu. Dokonane rekombinacje delecyjne nieistotnych dużych genów zmniejszyły rozmiary genomu do 25 610 kpz, z 33 094 kpz dla szczepu dzikiego. Stosowano również różne promotory w inżynierii Corynebacterium glutamicum. Osiągnięto wielki sukces w produkcji kwasu glutaminowego i L-lizyny na dużą skalę. Począwszy od L-glutaminianu i L-lizyny Corynebacterium glutamicum został zastosowany do przemysłowej produkcji różnych innych aminokwasów i innych polimerów w ciągu półwiecza po jego odkryciu w latach 50. XX w. (tab. 4.1).

W 2000 r. zastosowano szczepy Corynebacterium do produkcji innych aminokwasów, takich jak L-arginina, L-alanina, L-metionina, L-leucyna, L-ornityna, L-tryptofan, L-seryna, a także innych cennych związków chemicznych, takich jak γ-aminomaślan (GABA), który można stosować w produkcji żywności, farmaceutyków lub poliamidu. Zbadane zostały także możliwości zastosowania szczepów Corynebacterium glutamicum na skalę przemysłową do produkcji etanolu, izobutanolu, L-mleczanu, D-mleczanu i bursztynianu oraz 2-ketoglutaranu w warunkach niedoboru tlenu. Podjęto także wysiłki w celu wyprodukowania diamin (putrescyny, kadaweryny) z zastosowaniem odpowiednio genetycznie zmodyfikowanego Corynebacterium glutamicum. Rekombinowany Corynebacterium glutamicum z ekspresją PhbCAB z Ralstonia eutropha są zdolne do produkcji odpowiednio 6,0 g/l polihydroksyalkanianu (PHA) i polihydroksymaślanu (PHB) 0,99 g/l. W tabeli 4.2 przedstawiono przykładowe metabolity produkowane przez konstrukty Corynebacterium glutamicum.

Tabela 4.2. Metabolity produkowane przez konstrukty Corynebacterium glutamicum

Producent

Źródło

Produkt

Wydajność (g/l)

Lit.

aminokwasy

ATCC 13032 1argG 1argR + ArgJ

Corynebacterium glutamicum

L-cytrulina

8,5

[1]

KY10865 + DS + CM + PD

L-fenyloalanina

28

[2]

KY9218 + DS + PGD + TK

L-tryptofan

58

[3]

KY10865 + DS + CM

L-tyrozyna

26

[4]

AceE A16 Dpqo D ppc(pJC4ilvBNCE)

L-walina

86,5

[5]

ATCC13032 1argR 1argF + ArgB (A49V, M54V)

Pseudomonas putida

L-prolina

12,7

[6]

R 1ldhA 1ppc 1alr + AlaD + GapA

Lysinibacillus sphaericus

L-alanina

98

[7]

ATCC14067 + GlnA (Y405F) + Vgb

Vitreoscilla sp.

L-glutamina

17,3

[8]

kwasy organiczne

ATCC13032 1ltbR 1ilvE 1prpC1 1prpC2 + PgltA mut_L1 + IlvBN + IlvC + IlvD

Corynebacterium glutamicum

2-ketoizowalerian

35

[5]

VB +IlvBN + IilvC + IlvD + leuA (G462D)

2-ketoizokapryn

9,2

[9]

ATCC13032 + GFP + ADH

Micrococcus luteus

kwas 12-ketooleinowy

74%

[10]

R 1ldhA + D-LDH

Lactobacillus delbrueckii

D-mleczan

120

[11]

ATCC13032 1aceB icdGTG + YcdW

Escherichia coli

glikolan

5,3

[12]

ATCC13032 icd A1G + MalE + CAD1

Aspergillus terreus

kwas itakonowy

7,8

[13]

inne związki

ATCC13032 1hom + AmyA + CadA

Escherichia coli

Kadaweryna

2,34

[14]

WJ008+ GadB mutant (Glu89Gln/1452466 gene)

Kwas gamma aminomasłowy (GABA)

9,4

[15]

ATCC13032 1argR 1argF + SpeC + 5′21-ArgF (synthetic 5′-region)

1,4-diaminobutan (putrescyna)

19

[16]

ATCC13869 + PhaA + PhaB + PhaC

Ralstonia eutropha

Polihydroksyalkanian (PHA)

6

[17]

SY6 + RhaD + YqaB (lac promoter)

Escherichia coli

D-Sorboza

19,5

[18]

SY6 + RhaD + YqaB (lac promoter)

D-Psikoza

13,4

[18]

ATCC13032 Gmd + WcaG + ManB + ManC

Guanozyna 50-difosforan (GDP)

-L-fukoza

0,086

[19]

PICG+ D-GaI

Geobacillus thermodenitrificans

D-Tagatoza

165

[20]

R 1ldhA 1ppc + Pgi + PfkA + GapA + Pyk + Glk + Fba + Tpi + Pdc + AdhB

Zymomonas mobilis

Etanol

119

[21]

[1] Zhang i wsp. 2018. AMB Express, 8: 26. [2] Ikeda i Katsumata. 1992. Appl. Environ. Microbiol., 58: 781–785. [3] Ikeda i Katsumata. 1999. Appl. Environ. Microbiol., 65: 2497–2502. [4] Ikeda i wsp. 1992. Appl. Environ. Microbiol., 58: 781–785. [5] Buchholz i wsp. 2013. Appl. Environ. Microbiol., 79: 5566–5575. [6] Jensen i Wendisch. 2013. Microbial Cell Fact., 12: 63. [7] Jojima i wsp. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol., 87: 159–165. [8] Liu i wsp. 2008. Appl. Microbiol. Biotechnol., 77: 1297–1304. [9] Buckle-Vallant i wsp. 2014. Appl. Microbiol. Biotechnol., 98: 297–311. [10] Lee i wsp. 2015. J. Microbiol. Biotechnol., 25: 452–458. [11] Okino i wsp. 2008. Appl. Microbiol. Biotechnol., 78: 449–454. [12] Zahoor i wsp. 2014. J. Biotechnol., 192 (Pt.B): 366–375. [13] Otten i wsp. 2015. Metab. Eng., 30: 156–165. [14] Tateno i wsp. 2009. Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 115–121. [15] Choi i wsp. 2015. Microbial Cell Fact., 14: 207. [16] Schneider i wsp. 2012. Appl. Microbiol. Biotechnol., 95: 169–178. [17] Matsumoto i wsp. 2011. J. Biotechnol., 152: 144–146. [18] Yang i wsp. 2015. Appl. Environ. Microbiol., 81: 4284–4294. [19] Chin i wsp. 2013. Bioprocess Biosyst. Eng., 36: 749–756. [20] Shin i wsp. 2016. J. Agric. Food Chem., 64: 8146–8153. [21] Jojima i wsp. 2015. Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 1165–1172.

4.4.Bacillus subtilis

Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis to najbardziej komercyjnie dostępne ważne bakterie wykorzystywane do produkcji wielu metabolitów (witamin, aminokwasów i antybiotyków) i enzymów przemysłowych. Są blisko spokrewnione z innymi gatunkami kompleksu gatunków Bacillus subtilis (grupa Bacillus subtilis), która obejmuje również Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus mojavensis, Bacillus paralicheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus tequilensis, Bacillus vallismortis i Bacillus velezensis. Występują powszechnie w glebie, gdzie uczestniczą w obiegu węgla i azotu przez produkcję i wydzielanie makrocząsteczkowych hydrolaz, takich jak proteazy, amylazy i celulazy. Podstawowym rezerwuarem grupy Bacillus subtilis jest gleba, ryzosfera i fylosfera roślin. Bakterie z grupy Bacillus subtilis od dawna są znane z produkcji szeregu metabolitów wtórnych, w tym poliketydów (PK), terpenów i sideroforów, a także rybosomalnie i nierybozomalnie syntetyzowanych peptydów.

Referencyjnym szczepem rodzaju Bacillus jest szczep Marburg Bacillus subtilis. W zasobach PUBMED istnieją 14 433 publikacje mające w tytule nazwę gatunku Bacillus subtilis, a wraz z cytatami jest ich w sumie 35 771. Bacillus subtilis jest jednym z najbardziej wszechobecnych i różnorodnych tlenowców produkujących endospory, powszechnie występujących w glebie, osadach rzecznych, wodach przybrzeżnych i ujściach rzek, wchodzących w interakcje mutualistyczne z roślinami. Jego metaboliczna różnorodność doprowadziła do wyselekcjonowania szczepów wykorzystywanych w takich procesach przemysłowych, jak produkcja enzymów hydrolitycznych (amylazy i proteazy), antybiotyków, białek oraz toksyn. Jednym z powszechnie znanych zastosowań Bacillus subtilis jest fermentacja soi używanej do natto, (tradycyjnego dania japońskiego). Bacillus subtilis uzyskał status GRAS nadany przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA).

Bacillus subtilis jest najlepiej scharakteryzowanym gatunkiem wśród bakterii Gram-dodatnich. Jego genom (4 214 810 par zasad) obejmuje 4100 genów kodujących białka. Z genów kodujących białka 53% jest reprezentowanych tylko raz, podczas gdy jedna czwarta genomu odpowiada kilku rodzinom genów, które zostały zduplikowane z największą rodziną zawierającą 77 przypuszczalnych białek transportujących wiążących ATP. Duża część genów koduje zdolności do korzystania z różnych źródeł węgla, w tym wielu pochodzenia roślinnego. Ważne jest pięć genów peptydazy sygnałowej, a także kilka genów jako składników aparatu wydzielniczego, biorąc pod uwagę zdolność szczepów Bacillus do wydzielania dużych ilości ważnych przemysłowo enzymów. Wiele genów bierze udział w syntezie metabolitów wtórnych, w tym antybiotyków, które są bardziej związane z gatunkami Streptomyces. Genom zawiera co najmniej dziesięć profagów lub pozostałości profagów, co wskazuje, że infekcja bakteriofagowa odegrała ważną rolę ewolucyjną w horyzontalnym transferze genów, w szczególności w propagacji patogenezy bakteryjnej.

Od dawna wiadomo, że Bacillus subtilis ma zdolność wykorzystywania różnych węglowodanów jako źródeł węgla i energii. Zgodnie z oczekiwaniami genom koduje szlak glikolityczny Embdena–Meyerhofa–Parnasa, sprzężony z funkcjonalnym cyklem kwasów trikarboksylowych. Ponadto Bacillus subtilis może również rosnąć w warunkach beztlenowych w obecności azotanów jako akceptorów elektronów. Godny uwagi jest fakt, że metabolizm Bacillus subtilis wymaga rozgałęzionych krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych do biosyntezy lipidów, co może sugerować, że jest zdolny syntetyzować liniowe rozgałęzione krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe i alkohole.

Oprócz wielu genów kodujących enzymy degradacyjne, prawie 4% genomu Bacillus subtilis koduje duże enzymy wielofunkcyjne (np. srf, pps i pks loci), zaangażowane w syntezę antybiotyków u innych rodzajów bakterii Gram-dodatnich, takich jak Streptomyces. Naturalne izolaty Bacillus subtilis wytwarzają związki o aktywności antybiotykowej, takie jak surfaktynę, fengicynę i difficidynę. Bacillus subtilis zapewnia zatem prosty i genetycznie podatny model, w którym można badać syntezę antybiotyków i ich regulację. Te ścieżki są często zorganizowane w bardzo długie operony (np. obszar PKS obejmuje 78,5 kpz, ok.2% genomu). Bacillus produkuje dwie klasy metabolitów wtórnych: syntetyzowane przez syntazy poliketydowe (PKS) i peptydy syntetyzowane przez syntetazy nierybosomalne (NRPS). Sześćdziesiąt osiem zsekwencjonowanych szczepów Bacillus subtilis o różnych rozmiarach genomu od 3,88 do 4,30 Mpz koduje peptydy:

- – nierybosomalne, takie jak surfaktyna, plipastyna, fengicyna, bacillibaktyna, bacilizyna, locillomycyna, ksenokumacyna, pelgipeptyna i tridekaptyna oraz

- – rybosomalne poliketydy, takie jak: bacillena, makrolaktyna, difficidyna, kalimantacyna (batumina).

Surfaktyna ma niespecyficzną aktywność cytolityczną – lizuje komórki ssaków. Plipastatyna i fengicyna są biosurfaktantami przeciwgrzybiczymi, powodującymi hamowanie fosfolipazy A2 i tworzenie porów w błonach grzybowych, mogą być zamiennikami chemicznych środków grzybobójczych. Bacillena jest antybiotykiem bakteriostatycznym, hamującym syntezę białek prokariotycznych. Bacillibaktyna jest sideroforem o niezwykle wysokim powinowactwie do żelaza, pozyskuje go i przekazuje jako niezbędny element na teren cytoplazmy. Żelazo jest niezbędnym składnikiem enzymów oddechowych, syntezy DNA i ochroną przed stresem oksydacyjnym.

Bacillus subtilis może być gospodarzem ekspresji obcych białek o właściwościach farmakologicznych lub aktywności immunologicznej. Takie zainteresowanie wynika z następujących powodów:

1. 1) jako bakterie Gram-dodatnie szczepy Bacillus subtilis nie mają zewnętrznej błony, więc wszystkie wydzielane białka uwalniają bezpośrednio do podłoża hodowlanego, co znacznie upraszcza i zmniejsza koszty dalszych etapów oczyszczania;

2. 2) wiedza na temat genetyki i fizjologii Bacillus subtilis jest ogromna na równi tylko z Escherichia coli K12, co ułatwia rozwój kontrolowanych systemów ekspresji genów i adaptacji do procesów fermentacji na dużą skalę;

3. 3) szczepy Bacillus subtilis są bezpieczne i należą do grupy GRAS (ogólnie uważane jako bezpieczne);

4. 4) produkują zarodniki, co gwarantuje łatwą konserwację szczepów nawet w trudnych warunkach środowiskowych;

5. 5) są zdolne do szybkiego wzrostu w prostych i niedrogich podłożach z najwyższą pozycją kandydata do ekspresji heterologicznych białek, również tych z potencjalnym zastosowaniem w opracowywaniu szczepionek.

Szczepy Bacillus subtilis promują wzrost roślin przez produkcję hormonu IAA, enzymów rozpuszczających związki fosforu i azotany. Ponadto wykazują głębokie działanie przeciwgrzybicze przeciwko patogenom grzybowym powodującym różne choroby różnych roślin. Szczepy Bacillus produkcją celulazy, chitynazy, siderofory i antybiotyki oraz zwalczają patogen Pythium irregulare porażający rukolę.

Biocząsteczki produkowane przez szczepy Bacillus subtilis w hodowli okresowej z zasilaniem: adenozyna, alkaliczna PGL (liaza pektatowa), α-amylaza, cyklodekstryny, transferaza glikozylowanej dekstryny, β-galakto-zydaza, GFP (białko zielonej fluorescencji), hGH (ludzki hormon wzrostu), insektycyd, isobutanol, ituryna A, kwas mlekowy, lewan, lucyferaza, menachinon-7, mykosubtilina, N-acetyloglukozoamina, nattokinaza, acylaza penicilliny G, fitaza, polihydroksymaślan, ryboflawina, D-ryboza, proteazy, subtilizyna, tetrametylopyrazyna, ksylanaza.

4.5.Bacillus licheniformis

W zasobach PUBMED w 1314 publikacjach pojawiła się nazwa gatunku Bacillus licheniformis, a razem z cytacjami w 2811 publikacjach. Gram-dodatni Bacillus licheniformis tworzy przetrwalniki i jest szeroko rozpowszechniony w środowisku jako organizm saprofityczny. Gatunek ten jest blisko spokrewniony z Bacillus subtilis, organizmem, który ustępuje atrakcyjnością tylko Escherichia coli. Szczepy Bacillus licheniformis są fakultatywnymi beztlenowcami, które w warunkach beztlenowych wykorzystują azotany/azotyny jako akceptory elektronów.

Istnieje wiele komercyjnych i rolniczych zastosowań Bacillus licheniformis i jego produktów zewnątrzkomórkowych. Gatunek ten od dziesięcioleci był wykorzystywany do przemysłowej produkcji enzymów obejmujących kilka proteaz, α-amylazę, penicylinazę, pentozonazę, cykloglukozylotransferazę, β-mannanazę i kilka enzymów pektynolitycznych. Syntetyzowane proteazy z Bacillus licheniformis mają zastosowanie w produkcji detergentów oraz do wyprawiania skór w garbarstwie. Amylazy z Bacillus licheniformis są stosowane do hydrolizy skrobi, do uszlachetniania tekstyliów i papieru. Specyficzne szczepy Bacillus licheniformis wykorzystuje się do wytwarzania antybiotyków peptydowych, takich jak bacytracyna i proticyna, a także wielu związków chemicznych, jak kwas cytrynowy, inozyna, kwas inozynowy i poli-γ-glutaminowy. Niektóre izolaty Bacillus licheniformis mogą łagodzić atak grzybów patogenicznych na kukurydzę, trawy i uprawy warzywne. W ostatnich badaniach taksonomicznych, na podstawie porównań sekwencji 16S rDNA i sekwencje 16S−23S wewnętrznej transkrybowanej przestrzeni (ITS), wykazano, że Bacillus licheniformis jest blisko spokrewniony z Bacillus subtilis i Bacillus amyloliquefaciens.

Genom Bacillus licheniformis ATCC 14580 składa się z kolistego chromosomu zawierającego 4 222 336 par zasad (pz) ze średnią zawartością G+C 46,2%. Podczas analizy genomu nie znaleziono plazmidów. Genom zawiera 4208 genów kodujących białka, które stanowią 87% genomu o średniej długości 873 par zasad. Co najmniej 82 geny prawdopodobnie kodują wydzielane białka i enzymy. Ponadto przewiduje się 27 białek pozakomórkowych kodowanych w genomie Bacillus licheniformis ATCC 14580, niewystępujących w genomie Bacillus subtilis 168. Zgodnie z saprofitycznym stylem życia, genom Bacillus licheniformis zawiera geny wielu wydzielanych enzymów, które hydrolizują polisacharydy, białka, lipidy i inne składniki odżywcze. Celuloza jest najliczniejszym polisacharydem na Ziemi, więc mikroorganizmy, które hydrolizują celulozę, przyczyniają się do globalnego obiegu węgla. Co ciekawe, w degradację i wykorzystanie celulozy są zaangażowane dwa klastry genowe odkryte w Bacillus licheniformis, które nie mają odpowiedników w Bacillus subtilis 168. Enzymy kodowane przez pierwszy z tych klastrów obejmują dwie domniemane endoglukanazy należące do hydrolazy glikozydowej rodziny GH9 i GH5, prawdopodobna celulozo-1,4-β--celobiozydaza rodziny GH48 i domniemanej β-mannanazy rodziny GH5. Drugi klaster genowy koduje przypuszczalną β-glukozydazę (GH1) i β-glukozydazę (GH3). W sumie geny w tych dwóch klastrach powinny umożliwić Bacillus licheniformis wykorzystanie celulozy jako źródło węgla i energii, przekształcając ją w celobiozę i ostatecznie do cząsteczek glukozy. Szczep Bacillus licheniformis ATCC 14580 jest zdolny do wzrostu na karboksymetylocelulozie jako jedynym źródle węgla. Genom Bacillus licheniformis ATCC 14580 koduje szereg dodatkowych aktywności karbohydrazy, która może pozwolić organizmowi rosnąć na szerokiej gamie polisacharydów. Obejmują one ksylanazę, endoarabinazę i liazę pektynianową, które mogą być zaangażowane w degradację hemicelulozy, α-amylazy i α-glukozydazy prowadzące hydrolizę skrobi, chitynazy do rozkładu chitooligosacharydów od grzybów i owadów oraz lewanazy do wykorzystania β-D-fruktanów (lewanów). Pewne z tych enzymów są sprzedawane jako enzymy przemysłowe. Szczepy Bacillus licheniformis hodowane w odpowiednich warunkach w fazie wykładniczej produkowały egzopolisacharydy (EPS) w podłożach z cukrem z dodatkiem etanolu. Jest to heteropolimer, w którym mannoza jest dominującym monosacharydem, stanowiącym 80% całkowitego polisacharydu.

Organizmy saprofityczne muszą wykorzystywać różne rodzaje związków azotowych z białek, peptydów, aminokwasów, amoniaku, azotanów i azotynów. Bacillus licheniformis wydziela zewnątrzkomórkowe proteazy, jak proteazę serynową (aprE, epr, vpr), metaloproteazy (mpr) i kilka endo- i egzopeptydaz (yjbG, ydiC, gcp, ykvY, ampS, bpr (dwie kopie), yfxM, yuiE, yusX, ywaD, pepT). Jest on zdolny do produkcji wielu dodatkowych proteaz i peptydaz, które nie są kodowane w genomie Bacillus subtilis. Ma również zdolność do wykorzystania azotu z argininy, asparaginy i glutaminy z udziałem arginazy, asparaginazy i glutaminazy. Szczepy Bacillus licheniformis są zdolne do produkcji L-asparaginazy (ASN-aza), która jest ważnym środkiem przeciwnowotworowym szeroko stosowanym na całym świecie. Szczep bakteryjny Bacillus licheniformis (K-508) jest zdolny do rozkładu keratyny obecnej w ptasich piórach w optymalnych warunkach przy pH 7,0 w temp. 47°C. Zarówno proteazy trypsynopodobne, jak i chymotrypsynopodobne były konstytutywnie wydzielane przez ten szczep. Pewne szczepy Bacillus licheniformis posiadają geny odpowiedzialne za syntezę hydrolazy poliglutamylowej – enzymu, który katalizuje hydrolityczny rozkład kwasu poli-γ-d-glutaminowego (PGA).

Bacytracyna jest antybiotykiem cyklicznego peptydu syntetyzowanego nierybosomalnie przez niektóre izolaty Bacillus licheniformis. Sądzi się, że ok. 50% szczepów nie ma zdolności do produkcji tego antybiotyku z powodu braku operonu bac, nie ma go także referencyjny szczep ATCC 14580. Pozornie jedyny nierybosomalny operon syntazy peptydowej kodowany przez genom Bacillus licheniformis jest odpowiedzialny za biosyntezę lichenyzyny, która jest strukturalnie nieco podobna do surfaktyny Bacillus subtilis. W genomie znaleziono klaster 11 genów kodujących lantybiotyki, z powiązanymi funkcjami modyfikacji i transportu. Peptyd składający się z 75 aminokwasów został nazwany lichenicydyną. A jej najbliższym homologiem jest mersacydyna z Bacillus sp. szczep HIL-Y85/ 54728. Lantybiotyki są peptydami syntetyzowanymi rybosomalnie, które są modyfikowane posttranslacyjnie, tak że ostateczne cząsteczki zawierają rzadkie tioeterowe aminokwasy, takie jak lantioninę i/lub metylolantioninę. Podobnie jak Bacillus subtilis 168, chromosom Bacillus licheniformis ATCC 14580 niesie klaster genów kodujących biosyntezę sideroforu (dhbABCEF), a organizacja klastra jest podobna do odpowiedniego segmentu chromosomalnego w Bacillus subtilis. Ponadto genom Bacillus licheniformis zawiera drugi klaster czterech genów (iucABCD), który wykazuje znaczne podobieństwo do białek zaangażowanych w biosyntezę aerobaktyny u Escherichia coli.

4.6.Pseudomonas putida

Pseudomonas putida to wszechstronna metabolicznie saprofityczna bakteria glebowa, która jest wykorzystywana do klonowania obcych genów. Ana-liza kolistego genomu wykazuje 6 181 863 par zasad i średną zawartość G+C 61,6%. To daje wgląd w niepatogenny charakter Pseudomonas putida i wskazuje na potencjalne nowe zastosowania w rolnictwie, biokatalizie, bioremediacji i produkcji biopolimerów. Pseudomonas putida szczep KT2440 jest najlepiej scharakteryzowanym saprofitycznym gatunkiem wśród gatunków z rodzaju Pseudomonas, który zachował zdolność do przetrwania i funkcjonowania w środowisku. Oprócz potencjału metabolicznego tej bakterii, zdolność Pseudomonas putida KT2440 do kolonizacji ryzosfery roślin uprawnych może ułatwiać produkcję biopestycydów i stymulatorów wzrostu roślin. Jest jednym z nowych organizmów uważanych za obiecujące z przemysłowego punktu widzenia i najlepiej przebadanych gatunków z rodzaju Pseudomonas charakteryzującym się wszechstronnością metaboliczną. Gatunek ten wykazuje duży potencjał metaboliczny dzięki zakodowanym na chromosomie ścieżkom katabolicznym szerokiego zakresu związków organicznych. Jego zdolność do adaptacji w zmiennych warunkach fizykochemicznych czyni je wszechobecnym. Powszechnie stosowanym szczepem jest Pseudomonas putida, który nie posiada plazmidu TOL. Zsekwencjonowanie genomu Pseudomonas putida KT2440 w 2002 r. pozwoliło na ujawnienie wrodzonych genomowych możliwości organizmu oraz ułatwiło stosowanie inżynierii genetycznej w celu ulepszenia szczepu produkcyjnego z przemysłowego punktu widzenia. Szczep Pseudomonas putida KT2440 został uznany jako bezpieczny (nie produkuje toksyn) i może być stosowany w produkcji przemysłowej. Wszechstronność metaboliczna Pseudomonas putida jest bardzo przydatna w stosowaniu surowców alternatywnych. Na przykład wykorzystanie surowego glicerolu z produkcji biodiesla okazało się możliwe bez wprowadzania modyfikacji genetycznych. Pseudomonas putida ma zdolność przyswajania różnych substratów, nie może jednak wykorzystywać pentoz, co byłoby bardzo korzystne, jako że biomasa lignocelulozowa zawiera cukry pentozowe, takie jak ksyloza i arabinoza. Konstrukt Pseudomonas putida jest zdolny do wykorzystywania zarówno ksylozy, jak i arabinozy jako źródło węgla. Tolerancja Pseudomonas putida okazała się bardzo korzystna w produkcji różnych związków chemicznych. Bardziej tradycyjne organizmy, takie jak Escherichia coli i Pseudomonas putida są w stanie poradzić sobie z zanieczyszczeniami znajdującymi się w surowym glicerolu z produkcji biodiesla. Dzięki temu można wykorzystywać surowy glicerol bez konieczność jego detoksykacji. Nieodłączne właściwości Pseudomonas putida są nie tylko korzystne w stosowaniu alternatywnych surowców do wzrostu, lecz także bardzo interesujące w produkcji substancji biochemicznych, w tym ramnolipidów. Spośród powszechnie stosowanych mikroorganizmów, takich jak Escherichia coli, Bacillus subtilis i Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida jest najlepiej dopasowany do wytwarzania ramnolipidów. Jego wrodzona tolerancja na ramnolipidy sprawia, że nie ma potrzeby prowadzenia uciążliwych modyfikacji genetycznych, aby umożliwić mu radzenie sobie ze związkiem, który syntetyzuje. Podobnie jak w produkcji ramnolipidów, Pseudomonas putida jest również przydatny do wytwarzania polimerów polihydroksyalkanianowych (PHA). W zależności od warunków hodowli Pseudomonas putida może syntetyzować różne PHA. Inżynieria genetyczna oparta na znajomości szlaków metabolicznych może być stosowana do przekierowywania produkcji w kierunku interesującego związku. Postępy w inżynierii genetycznej Pseudomonas putida odegrały kluczową rolę w produkcji substancji biochemicznych. Nieodłączna tolerancja Pseudomonas putida stanowi doskonały punkt wyjścia do tłumienia przeszkód w wytwarzaniu toksycznych związków chemicznych pochodzenia naturalnego lub heterogenicznego.

Jedną z klas chemikaliów, które zyskały dużą wagę, są środki powierzchniowo czynne – surfakanty. Są one zdolne do interakcji między fazami wodnymi i niewodnymi. Pośredniczy w tym amfifilowa natura cząsteczek składających się z hydrofilowego trzonu i hydrofobowego ogona. Struktura ta zwiększa rozpuszczalność cieczy hydrofobowych w wodzie przez zmniejszenie napięcia powierzchniowego na styku powietrze-woda i woda-olej. Właściwość ta powoduje, że działają one jako detergenty, emulgatory, środki pieniące i środki zwilżające. Szerokie zastosowanie tej grupy chemikaliów czyni je klasą chemikaliów ważną i szeroko stosowaną w rolnictwie, w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Biosurfaktanty mają znaczne zalety w porównaniu z ich odpowiednikami chemicznymi. Surfaktanty produkowane z ropy naftowej na drodze chemicznej są zwykle toksyczne i rzadko ulegają degradacji przez mikroorganizmy i dlatego stanowią potencjalne źródło zanieczyszczeń. Natomiast biosurfaktanty są bardziej przyjazne dla środowiska, ponieważ są mniej toksyczne lub nietoksyczne i biodegradowalne. Ponadto mają wysoką aktywność powierzchniową, są bardziej zróżnicowane strukturalnie i mogą być wytwarzane z surowców odnawialnych. Te cechy sprawiają, że są one źródłem nowych aplikacji stosowanych do bioremediacji węglowodorów z zanieczyszczonej gleby i wody, usuwania metali ciężkich, oczyszczania gleby i neutralizacji wycieków oleju. Biosurfaktanty są klasyfikowane na podstawie ich struktury chemicznej na pięć grup. Są to glikolipidy, lipopeptydy, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy i biosurfaktanty polimerowe. Różnice we właściwościach biosurfaktantów sprawią, że będą one mniej lub bardziej odpowiednie do różnego zastosowania. Produkcja biosurfaktantów nie jest jeszcze kosztowo konkurencyjna w porównaniu z ich produkcją na drodze syntezy chemicznej. Rozważa się w tym względzie różne substraty odnawialne takie jak odpady przemysłowe. Są to np. ścieki powstałe w olejarni produkującej oliwę z oliwek na drodze ekstrakcji, zużyty olej kuchenny i glicerol z produkcji biodiesla. Spośród różnych biosurfaktantów zainteresowanie budzą glikolipidy − ramnolipidy. Jest to grupa biosurfaktantów zbudowanych z części hydrofilowej reprezentowanej przez ramnozę i części hydrofobowej utworzonej przez kwasy tłuszczowe. Liczba reszt ramnozy, długość kwasów tłuszczowych zmienia się w zależności od zastosowanego szczepu i warunków wzrostu.

Pseudomonas putida okazał się jednym z „workhorse” laboratoryjnych mających wiele zalet. W ostatnich dekadach ta Gram-ujemna bakteria glebowa była praktycznie udomowiona za pomocą biologii syntetycznej. Genomy ważnych szczepów, takich jak Pseudomonas putida KT2440 lub S12 są w pełni zsekwencjonowane, co jest podstawą do zrozumienia sieci metabolicznych i zaawansowanego spojrzenia genetycznego. Ze względu na stosunkowo wysoką zawartość guaniny-cytozyny (GC) (61,5%) Pseudomonas putida jest odpowiednia do heterologicznej ekspresji genów, podobnie jak promieniowce i miksobakterie. Na poziomie biosyntezy Pseudomonas putida oferuje bogactwo kofaktorów, szczególnie dla oksydoreduktaz i wszechstronnego metabolizmu z różnorodnymi wewnętrznymi zdolnościami enzymatycznymi do celów produkcyjnych, a także produkcji wielu metabolitów heterologicznych. Ponadto bakteria wykazuje wysoką tolerancję wobec ksenobiotyków, w tym antybiotyków i rozpuszczalników organicznych. Analiza kolistego genomu 6 181 863 par zasad i średniej zawartości G+C 61,6% Mpz KT2440 daje wgląd w niepatogenny charakter Pseudomonas putida. W genomie zidentyfikowano 5420 otwartych ramek odczytu (ORF) o średniej długości 998 pz, można przypuszczalnie przypisać role 3571 ORF, z kolejnymi 600 ORF (11,1%) o charakterze unikalnym u Pseudomonas putida. W sumie 1037 (19,1%) ORF koduje konserwatywne białka hipotetyczne. Analiza genomu KT2440 ujawnia szlaki metaboliczne do transformacji różnych związków aromatycznych. Niektóre z nich, jak kwas ferulowy, koniferylowy oraz alkohol kumarynowy, kwasy waniliowy, hydroksybenzeosowy, protokatechusowy są pochodnymi lignin i pojawiają się w procesie degradacji materiału roślinnego. W genomie zakodowanych jest odpowiednio 18 dioksygenaz odpowiedzialnych za degradację pochodnych lignin, 15 monooksygenaz o nieznanej specyficzności, 80 oksydoreduktaz o nieznanej specyfice substratu, 51 hydrolaz, 62 transferaz i 40 dehydrogenaz, 82 transpozazy, 350 cytoplazmatycznych układów transportu błony komórkowej, 5 transporterów GABA (kwasu γ-aminomasłowego) zaangażowanych w pobieranie kwasu masłowego, który można przekształcić w kwasy polihydroksyalkanowe (biopolimery). Pseudomonas putida ma niewiele systemów dotyczących wykorzystania węglowodanów, np. tylko z jednym transporterem PTS z prawdopodobną specyfiką dla fruktozy. Pseudomonas putida KT2440 ma wiele transporterów aminokwasów ABC, co może odzwierciedlać fizjologiczny nacisk na metabolizm aminokwasów, które są wykorzystywane w udanej rywalizacji w ryzosferze. KT2440, również zdolny do kolonizacji korzeni roślin, posiada przewidywany transporter opiny z rodziny ABC, który został wcześniej opisany dla innych mikroorganizmów ryzosferowych, oraz enzymy do metabolizmu opin. Pseudomonas putida stał się jednym z kilku „workhorse” w laboratorium. Dostępnych jest wiele narzędzi do manipulacji genetycznej i ekspresji genów, w tym liczne indukowalne systemy promotorów (i odpowiadających im związków indukujących), takie jak natywne Pm/XylS (m-toluen), PsaI/NahR (salicylan) oraz PalkB/AlkS (krótkołańcuchowe alkany), a także systemy nienatywne.

Poza wykorzystaniem Pseudomonas putida do rekombinacji naturalnego produktu biosyntezy warto wspomnieć o szczepach tego organizmu, które w sposób naturalny wytwarzają wtórne metabolity o znaczeniu biotechnologicznym. Na szczególną uwagę zasługują polimery alginianowe o średniej długości łańcucha polihydroksyalkaniany (PHA). Są to produkty termoplastyczne i/lub elastomerowe, nierozpuszczalne w wodzie, enancjomerycznie czyste i nietoksyczne. Wykazują wysoki stopień polimeryzacji i są uważane za alternatywne biodegradowalne polimery przemysłowe. Wykazano, że Pseudomonas putida wytwarza antybiotyk i środek przeciwnowotworowy, pochodną fenazyny, kwas 5-metylofenazyno-1-karboksylowy. Ponadto różne szczepy Pseudomonas putida produkują nierybosomalnie peptydy, które nie były jeszcze intensywnie badane pod względem zastosowań biotechnologicznych. Bardzo często wśród Pseudomonas zachodzi synteza fluorescencyjnego sideroforu powerdyny, która jest promotorem wzrostu roślin. Szczepy 267, PCL1445 i W15Oct28 lub RW10S2 Pseudomonas putida wydzielają biosurfaktanty lipopeptydowe o właściwościach antydrobnoustrojowych, a mianowicie putizoliny i peptydy wiskozyno-podobne. Analiza chromosomu i megaplazmidu Pseudomonas putida S12 pTTS12 ujawniła również obecność dwóch klastrów odpowiedzialnych za biosyntezę bakteriocyn.

Ramnolipidy są obecnie uważane za najlepiej przebadane z biosurfaktantów bakteryjnych, metabolitów o najróżniejszych składach chemicznych produkowanych przez różne bakterie i grzyby. Ze względu na doskonałe właściwości środka powierzchniowo czynnego, niską toksyczność, wysoką biodegradowalność i działanie przeciwbakteryjne ramnolipidy są stosowane jako środki czyszczące, kosmetyki, w przemyśle spożywczym, biokontroli i remediacji gleb. Ramnolipidy składają się z domeny hydrofobowej złożonej z dwóch cząsteczek kwasów hydroksytłuszczowych tworzących kwas 3-(hydroksyalkanoiloksy)-alkanowy (HAA) i części hydrofilowej jednej lub dwóch cząsteczek cukru ramnozy, tworząc w ten sposób odpowiednio mono-ramnolipidy i di-ramnolipidy. Pseudomonas putida stała się doskonałą platformą do produkcji rekombinowanego ramnolipidu i może zastąpić patogenny szczep Pseudomonas aeruginosa w przyszłych procesach produkcji ramnolipidu. Dodatkowo, Pseudomonas putida jest oporna na bardzo wysokie stężenia ramnolipidów, wykazując niewielką zmianę tempa wzrostu w przypadku osiągniecia stężenia ramnolipidów do 90 g/l, co sugeruje, że możliwe są wyższe wydajności. W tabeli 4.3 przedstawiono wydajności produkcji niektórych metabolitów przez szczepy Pseudomonas putida w wyniku heterologicznej ekspresji i konstrukcji inżynierskiej, produkowane na zamówienie.

Tabela 4.3. Naturalne produkty syntetyzowane przez szczepy Pseudomonas putida w wyniku heterologicznej ekspresji i konstrukcji inżynieryjnej

Produkt

Producent

Pseudomonas putida

Wydajność/plon

Lit.

ramnolipidy (RL)

mono- i di-RL

Burkholderia glumae

KT2440

80 mg/l (mono-RL)

50 mg/l (mieszanina)

[1]

mono-RL

Pseudomonas aeruginosa

KCTC 1067

7,3 g/l

[2]

Pseudomonas aeruginosa

KT2440

1,68 g/l

[3]

terpenoidy

kwas geranowy

Ocimum basilicum

DSM12264

193 mg/l, BR FB

[4]

zeaksantyna

Pantoea ananatis

KT2440

239 mg/l, FB

[5]

poliketydy/nierybosomalne peptydy

flawiolina

Sorangium cellulosum

KT2440

~6 mg/l

[6]

tyrozyna

Cystobacter sp.

KT2440

1,76 μg/l

[7]

β-laktam DAC

Lysobacter lactamgenus UK90

IFO14164

~2 mg/l

[8]

myxochromid S

Stigmatella aurantiaca

KT2440

40 mg/l

[9]

prodigiozyna

Serratia marcescens

KT2440

0,5 mg/g CDW

[10]

pochodne aminokwasów

t-cynamonowy

Rhodosporidium toruloides

S12

5,4 mM, BR FB

C plon 0,07

[11]

p-hydroksybenzoesan

Rhodosporidium toruloides

S12

2,3 mM

C plon 0,13

[12]

deoksywiolaceina

Duganella sp.

MT-2

1,5 g/l

[13]

piocyjanina

Pseudomonas aeruginosa

KT2440

45 mg/l

[14]

cyjanoficyna

Anabaena sp.

KT2440

24% CDW

[15]

cytrulina/cyjanoficyna

Synechocystis sp.

ATCC4359

4,4% CDW

[16]

ramnolipid

–

EM383

15,5 g/l

[17]

lipopeptyd

–

MTCC2467

2,8 g/l

[18]

[1] Blank i wsp. 2013. Patent No. EP2573172 A1. [2] Cha i wsp. 2008. Bioresour. Technol., 99: 2192–2199. [3] Cao i wsp. 2012. World J. Microbiol. Biotechnol., 28: 2783–2790. [4] Mi i wsp. 2014. Microb. Cell Factories, 13: 170. [5] Beuttler i wsp. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol., 89: 1137–1147. [6] Gross i wsp. 2006. Arch. Microbiol., 185: 28–38. [7] Chai i wsp. 2012. Chem. Biol., 19: 361–371. [8] Kimura i wsp. 1996. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45: 490–501. [9] Wenzel i wsp. 2005. Chem. Biol., 12: 349–356. [10] Loeschcke i wsp. 2013. ACS Synth. Biol., 2: 22–33. [11] Nijkamp i wsp. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol., 69: 170–177. [12] Verhoef i wsp. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol., 87: 679–690. [13] Xing i Jiang. 2011. Patent No US20110183384 A1. [14] Schmitz i wsp. 2015. Front. Microbiol., 6: 284. [15] Voss i wsp. 2004. Biomacromolecules, 5: 1588–1595. [16] Wiefel i wsp. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol., 90: 1755–1762. [17] Anic i wsp. 2018. AMB Express, 8: 122. [18] Kanna i wsp. 2014. J. Biol. Sci., 14: 435–445.

4.7.Vibrio natriegens

Escherichia coli jest jednym z organizmów modelowych (gospodarzy) związanych z technologią rekombinacji genów. Jednak jego tempo wzrostu, w przybliżeniu 20 minut na pokolenie w standardowych warunkach, jest zbyt małe w obliczu rosnącego zapotrzebowania na szybki czas obrotu w niektórych aplikacjach. Tak więc naukowcy zainteresowali się nowymi organizmami wykazującymi znacznie szybsze tempo wzrostu. Jednym z nich jest Vibrio natriegens. Ta Gram-ujemna bakteria jest znana z szybkiego czasu generacji, połowę czasu Escherichia coli, mniej niż 10 minut (9,8 minut). Kompletny genom Vibrio natriegens składający się z dwóch chromosomów około 3,2 i odpowiednio 1,9 Mpz, koduje ponad 4500 otwartych ramek odczytów (ORF). Vibrio natriegens może być genetycznie ulepszane przy użyciu takich narzędzi i technik genetycznych, jak transformacja DNA, plazmidy i bakteriofagi replikowane w Vibrio natriegens, mutageneza transpozonowa całego genomu (WGTM) oraz system interferencji CRISPR w V. natriegens. Jako bakterie o najkrótszym znanym czasie replikacji, zdolności do przetrwania na tanich źródłach węgla i zdolności do wydzielania białek do podłoża Vibrio natriegens są obiecującym kandydatem do manipulacji biotechnologicznych.

Literatura rekomendowana

Ali S., Hameed S., Imran A., Iqbal M., Lazarovits G. 2014. Genetic, physiological and biochemical characterization of Bacillussp. strain RMB7 exhibiting plant growth promoting and broad spectrum antifungal activities. Microbial Cell Factories, 13: 144.

Baeshen M.N., Al.-Hejin A.M., Bora R.S., Ahmed M.M.M., Ramadan H.A.I., Saini K.S., Baeshen N.A., Redwan E.M. 2015. Production of biopharmaceuticals in E. coli: current scenerio and future perspectives. J. Microbiol. Biotechnol., 25: 953–962.

Banat I.M., Makkar R.S., Cameotra S.S. 2000. Potential commercial applications of microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 495–508.

Becker J., Wittmann C. 2016. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for the heterologous production of high value molecules-a veteran at new shores. Curr. Opin. Biotechnol., 42: 178–188.

Bentley G.J., Jiang W., Guamán L.P., Xiao Y., Zhang F.2016. Engineering Escherichia coli to produce branched-chain fatty acids in high percentages. Metab. Eng., 38: 148–158.

Davis R.H. 2004. The age of model organisms. Nat. Rev. Genet., 5: 69−76.

Faizal I., Dozen K., Hong C.S., Kudora A., Takiguchi N., Ohtake H., Takeda K., Tsunekawa H., Kato J. 2005. Isolation and characterization of solvent-tolerant Pseudomonas putida strain T-57, and its application to biotransformation of toluene to cresol in a two-phase (organic-aqueous) system. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 32: 542−547.

Ferreira L.C.S., Ferreira R.C.C., Schumann W. 2005. Bacillus subtilis as a tool for vaccine development: from antigen factories to delivery vectors. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 77: 113–124.

Garnier M., Labreuche Y., Garcia C., Robert M., Nicolas J.L. 2007. Evidence for the involvement of pathogenic bacteria in summer mortalities of the Pacific oyster Crassostrea gigas. Microb. Ecol., 53: 187–196.

Harwood C.R., Mouillon J.M., Pohl S., Arnau J. 2018. Secondary metabolite production and the safety of industrially important members of the Bacillus subtilis group. FEMS Microbiology Reviews, 42: 721–738.

Idalia N.V.M., Bernardo F. 2017. Escherichia colias a model organism and its application in biotechnology. http://dx.doi.org/10.5772/67306

Koppolu V., Vasigala V.K. 2016. Role of Escherichia coli in biofuel production. Microbiol. Insights, 9: 29–35.

Lee HH, Ostrov N, Wong BG, Gold MA, Khalil A, Church GM. 2016. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. BioRxiv. 058487.

Loeschcke A. i Thies S. 2015. Pseudomonas putida – a versatile host for the production of natural products. Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 6197–6214.

Liu W., Zhang R., Tian N., Xu X., Cao Y., Xian M., Liu H. 2015. Utilization of alkaline phosphatasePhoA in the bioproduction of geraniol by metabolically engineered Escherichia coli. Bioengineered, 6: 288–293.

Ozturk S., Calik P., Ozdamar T.H. 2016. Fed-batch biomolecule production by Bacillus subtilis: A state of the art review. Trends in Biotechnology, 34: 329–245

Pei L. i Schmidt M. 2018. Fast-growing engineered microbes: New concerns for gain-of-function research? Frontiers in Genetics, 9: Article 207.

Poblete-Castro I., Becker J., Dohnt K., Dos Santos V.M., Wittman C. 2012. Industrial biotechnology of Pseudomonas putida and related species. Appl. Microbiol. Biotechnol., 93: 2279–2290.

Posada J.A., Naranjo J.M., Lopez J.A., Higuita J.C., Cardona C.A. 2011. Design and analysis of poly-3-hydroxybutyrate production processes from crude glycerol. Process Biochemistry, 46: 31–317.

Schalk M., Pastore L., Mirata M.A., Khim S., Schouwey M., Deguerry F., Pineda V., Rocci L., Daviet L. 2012. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. J. Am. Chem. Soc., 134: 18900−3.

Tuli H.S., Chaudhary P., Beniwal V., Sharma A.K. 2015. Microbial pigments as natural color sources: current trends and future perspectives. J. Food Sci. Technol., 52: 4669−4678.

Wittgens A., Tiso T., Arndt T.T., Wenk P., Hemmerich J., Miller C., Wichmann R., Kupper B., Zwick M., Wilhelm S., Hausmann R. Syldatk C., Rosenau F., Blank L.M. 2011. Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440. Microb. Cell Fact., 10: 80.

5

Drożdże „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

5.1.Wprowadzenie

Drożdże są używane do wyrobu chleba, piwa i wina od czasów starożytnych. Pierwszych obserwacji mikroskopowych komórek drobnoustrojów i opisu mikroskopowego wyglądu drożdży dokonał Antoni van Leeuwenhoek w 1680 r. Ich rolę w fermentacji docenił Pasteur, a pierwsze szczepy (hodowle starterowe) drożdży piwnych i winnych zostały zastosowane pod koniec XIX w. Stosowanie starterów drożdżowych stało się standardową praktyką w fermentacji przemysłowej nie tylko żywności i napojów, ale także szerokiej gamy innych produktów wytwarzanych przez drożdże. Tradycyjne procesy fermentacji przeprowadza pojedynczy gatunek drożdży, Saccharomyces cerevisiae, stąd często ta nazwa jest synonimem drożdży i uważa się, że wszystkie drożdże prowadzą fermentacje. Wbrew powszechnemu przekonaniu, około połowa opisywanych gatunków rodzaju Saccharomyces nie jest w stanie prowadzić procesu fermentacji, niemniej wiele z nich zyskało znaczącą rolę w mikrobiologii przemysłowej.

Drożdże tworzą grupę grzybów składającą się głównie z organizmów jednokomórkowych rozmnażających się wegetatywnie przez pączkowanie i można je zaklasyfikować do Ascomycota (Saccharomyces, Candida) lub Basidiomycota (Filobasidiella, Rhodotorula). Opisano około 74 000 gatunków grzybów, w tym wiele drożdży, podczas gdy całkowitą liczbę gatunków grzybów szacuje się na 1 500 000. Zatem grzyby należą do najbogatszych królestw na świecie pod względem bioróżnorodności, są więc potencjałem dostarczania cennych zasobów przemysłowych. Obecnie wymienia się około 1500 gatunków drożdży, a szacunkowa całkowita ich liczba wynosi około 150 000, co stanowi około 5−10% wszystkich szacowanych gatunków grzybów. Opisano do tej pory ponad 1500 gatunków drożdży, w tym wiele należących do Basidiomycota. Spośród wszystkich gatunków drożdży, tylko kilkanaście wykorzystuje się na skalę przemysłową, a w przypadku około 70−80 gatunków w skali laboratoryjnej wykazano ich potencjalną przydatność w biotechnologii.

Najważniejsze składniki odżywcze w hodowli drożdży – węglowodany – są zarówno źródłem węgla, jak i energii. W warunkach tlenowych drożdże wykorzystują cukry (heksozy i pentozy) oraz alkohole, kwasy organiczne i inne związki węgla. Nie wszystkie drożdże są zdolne do metabolizowania pewnych di- i trisacharydów (sacharozy, maltozy, laktozy lub rafinozy) z powodu braku niezbędnych enzymów hydrolitycznych. To samo dotyczy wykorzystania pentoz. Fermentacja ksylozy może być potencjalnie użyteczną właściwością przemysłowej produkcji etanolu z produktów hydrolizy hemiceluloz roślinnych. Zdolność do metabolizowania polisacharydów i złożonych węglowodanów wykazuje stosunkowo niewiele gatunków. Wykorzystanie skrobi ma szczególne znaczenie w przemysłowej produkcji biomasy drożdżowej (białko organizmów jednokomórkowych, SCP) ze skrobiowych odpadów rolniczych. Drożdże Schwanniomyces occidentalis (Debaryomyces occidentalis) i gatunki Lipomyces posiadają enzymy o różnych aktywnościach amylazy. Saccharomyces cerevisiae nie jest w stanie hydrolizować skrobi. Kilka gatunków drożdży jest w stanie rosnąć na takich źródłach węgla jak węglowodory. Drożdże mogą wykorzystywać zarówno organiczne, jak i nieorganiczne źródła azotu. Chociaż bardzo niewiele gatunków może hydrolizować białka, krótkie peptydy mogą być transportowane do komórki i wykorzystywane wewnątrzkomórkowo. Oprócz nieorganicznych soli amonowych aminokwasy, aminy i mocznik są odpowiednimi źródłami azotu dla praktycznie wszystkich drożdży. Wykorzystanie azotanów jest jednak ograniczone do pewnych gatunków drożdży i jest to cenny wskaźnik diagnostyczny do ich identyfikacji. Drożdże są zazwyczaj tolerancyjne na szeroki zakres pH i często występują w silnie kwaśnych środowiskach, w których niewiele bakterii jest w stanie z nimi konkurować. Prawie wszystkie drożdze są mezofilne i rosną najlepiej w temp. 20–30°C. Prawdziwie termofilne drożdże nie są znane. Rzadko mogą rosnąć w temperaturze powyżej 42°C i zajmują wyspecjalizowane siedliska, takie jak jelita zwierząt stałocieplnych. Większość szczepów Saccharomyces cerevisiae stosowanych w fermentacji przemysłowej może rosnąć w temp. 37°C, podczas gdy wzrost w podobnym środowisku Saccharomyces bayanus jest ograniczony do temp. 30–35°C. Istnieje kilka termotolerancyjnych gatunków drożdży zdolnych do wzrostu powyżej 40°C. Należą one do Kluyveromyces marxianus, Geotrichum capitatum, Candida i Debaryomyces. Szczepy Kluyveromyces są godne uwagi ze względu na tolerowanie stosunkowo najwyższych wartości temperatury, ale temperatura powyżej 50°C jest śmiertelna dla komórek drożdży.

W tradycyjnych fermentacjach spożywczych drożdże były wykorzystywane do produkcji napojów alkoholowych, biomasy i glicerolu. Saccharomyces cerevisiae został opisany jako organizm najbardziej udomowiony przez ludzkość i nadal jest szeroko wykorzystywany w przemyśle. Produkcja napojów alkoholowych i zakwaszanie ciasta są praktykowane od kilku tysięcy lat. Natomiast wytwarzanie glicerolu przez Saccharomyces cerevisiae przez przemieszczenie centralnych szlaków metabolicznych w drodze mutacji zostało wprowadzone przed drugą wojną światową. Sfermentowana żywność lub napoje są definiowane jako produkty jadalne przygotowane z surowych lub gotowanych materiałów pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego przez mikroorganizmy naturalnie albo przez dodanie mieszanych lub czystych szczepów. Zasadniczym celem fermentacji żywności jest jej konserwacja. Tradycyjnie ludzie wiedzieli, jak hodować pożyteczne mikroorganizmy, głównie bakterie kwasu mlekowego, drożdże i pleśń, do produkcji żywności zdatnej do spożycia. Drożdże odgrywają istotną rolę w produkcji wielu tradycyjnych wyrobów fermentowanych i napojów na całym świecie. Z produkcją sfermentowanej żywności i napojów są związane głównie Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Galactomyces, Geotrichum, Hansenula, Hanseniaspora, Hyphopichia, Kluyveromyces, Metschnikowia, Rhodotorula, Saccharomyces, Pichia, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Trichosporon, Yarrowia i Zygosaccharomyces. Do najbardziej powszechnych produktów żywnościowych i napojów otrzymywanych z zastosowaniem fermentacji, głównie przez drożdże lub w połączeniu z bakteriami i pleśnią, należą: piwo, pieczywo i produkty piekarnicze, cachaca, sery, kenkey, kimczi, produkty mleczne (jak kefir, jogurt, mleko fermentowane), kakao, kawa, fermentowane mięso i kiełbasy, fermentowane oliwki i ogórki, pasta sojowa, grzyb herbaciany, kiszonki.

Drożdże są od dawna hodowane na biomasę, która jest bogatym źródłem białka, minerałów, witamin (szczególnie witamin z grupy B) i innych składników odżywczych dla ludzi i zwierząt. Do produkcji biomasy wykorzystuje się kilka gatunków drożdży, w tym Candida utilis, inne niemetylotroficzne gatunki Candida, Saccharomycopsis (Endomycopsis), Kluyveromyces spp. oraz Saccharomyces cerevisiae. Drożdże metylotroficzne, wykorzystujące etanol, tłuszcze i węglowodory, w tym gatunki Candida, Ogataea, Pichia i Trichosporon, również są wykorzystane do produkcji biomasy. Drożdże produkujące białko SCP mają pewne zalety w porównaniu ze źródłami białka roślinnego, zwierzęcego i innych drobnoustrojów. Są to wysoka zawartość białka (do 50%), witamin i minerałów oraz zdolność do wzrostu na tanich podłożach, którymi mogą być odpady. Produkcja SCP o wartości dodanej z niedrogich substratów mogłaby pomóc złagodzić światowe niedobory w dostawach żywności, szczególnie w krajach ubogich. Wykorzystywane substraty obejmują melasę, skrobię, maniok, topinambur, serwatkę, odpady ziemniaczane, odpady browarnicze, odpady z przetwórstwa surowców rolniczych oraz z przetwórstwa żywności. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar komórek i zdolność flokulacji drożdży, można je łatwiej zebrać z hodowli fermentacyjnej niż bakterie. W porównaniu z bakteriami wiele drożdży zawiera niewielkie ilości kwasów nukleinowych. Pewne gatunki drożdży są stosowane jako środki prebiotyczne i probiotyczne do zapobiegania lub leczenia różnych zaburzeń jelitowych i toksykologicznych. W szczególności szczepy Saccharomyces boulardii, pierwotnie izolowane z owoców w Indochinach, są stosowane w leczeniu chorób jelitowych u dzieci i dorosłych. Kontrolowane badania kliniczne wykazały skuteczność Saccharomyces boulardii w zapobieganiu lub eliminacji kilku zaburzeń jelitowych, w tym zakażenia Clostridium difficile związanego z biegunką wywołaną antybiotykami. Wysunięto hipotezę, że drożdże zapobiegają innym infekcjom jelitowym, w tym chorobie zapalnej jelit i chorobie Crohna. Mechanizmy aktywności probiotycznej nie zostały wyjaśnione, ale mogą obejmować zmianę odpowiedzi zapalnych i immunologicznych lub niszczenie czynników toksycznych. Wstępne dowody wskazują, że niektóre drożdże mogą wytwarzać prebiotyki, które są związkami (ogólnie oligosacharydami) stymulującymi wzrost Bifidobacterium i innych pożytecznych bakterii w jelitach ludzi i zwierząt lub oligopeptydów mających korzystne właściwości zdrowotne przez stymulację odpowiedzi immunologicznej. Prebiotyki są często pochodnymi cukru, takimi jak fruktooligosacharydy, z których niektóre drożdże mogą je metabolizować w procesie tworzenia inulinaz. Stwierdzono, że Kluyveromyces lactis syntetyzuje prebiotyczne oligosacharydy i peptydy immunostymulujące z serwatki. Glukany i polisacharydy ścian komórkowych drożdży są stosowane jako dodatki do pasz dla zwierząt i ryb. Wykazano, że polisacharydy te sprzyjają wzrostowi i zdrowiu zwierząt przez różne mechanizmy, w tym immunomodulację, status oksydacyjny, wiązanie toksyn i eliminację patogenów oraz interakcje ze składnikami jelita. Stwierdzono również, że glukany i mannany mają niezliczone funkcje biologiczne w modelach zwierzęcych i potencjalnie u ludzi, w tym modulację uwalniania histaminy i działania przeciwnowotworowe. Aby ocenić promocję zdrowia przez polisacharydy ściany komórkowej drożdży, potrzebne są dalsze badania w tej dziedzinie.

Roczna światowa produkcja Saccharomyces cerevisiae przekracza o około dwa rzędy wielkości łączną produkcję wszystkich innych mikroorganizmów przemysłowych. Ekonomiczne wartości napojów fermentowanych i żywności z udziałem drożdży są ogromne. Chociaż drożdże są synonimem Saccharomyces cerevisiae, inne ich gatunki o znaczeniu biotechnologicznym zostały wprowadzone do wytwarzania produktów przemysłowych poza żywnością tradycyjną. Lista drożdży wykorzystywanych na skalę przemysłową z Ascomycota zawiera następujące gatunki: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Schwaniomyces accidentalis, Lipomyces spp., Saccharomycopsis spp., Debaryomyces hansenii, Ogataea polymorpha, Komagataella pastoris, Scheffersomyces stipitis, Pichia spp., Yarrowia lipolytica, Candida spp., Blastobotrys adeninivorans oraz z Basidiomycota: Rhodotorula spp., Rhodospirillum spp., Trichosporon spp., Xanthophyllomyces dendrorhous, Cryptococcus spp., Phaffia rhodozyma.

Drożdże mają szerokie fundamentalne i przemysłowe znaczenie w nauce, produkcji żywności, medycynie i rolnictwie. Oprócz tradycyjnych zastosowań przemysłowych drożdży w kilku fermentacjach żywności (napoje alkoholowe, produkty piekarnicze, sery, kiełbasy i inne produkty fermentowane) nowoczesne zastosowania drożdży obejmują produkcję etanolu jako komponentu paliwa, białka jednokomórkowego (SCP) dodawanego do pasz, enzymów przemysłowych i metabolitów o małej masie cząsteczkowej.

Ostatnio przygotowano drożdże Komagataella (Pichia) pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Ogataea (Hansenula) polymorpha i pewne inne gatunki jako organizmy przemysłowe do heterologicznej produkcji enzymów i białek, w tym białkowych czynników farmaceutycznych (tab. 5.1). Drożdże, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, są coraz częściej stosowane jako gospodarze do ekspresji biokatalizatorów białkowych i szlaków wieloenzymowych do syntezy subtelnych związków chemicznych i związków o małej masie cząsteczkowej o znaczeniu medycznym i odżywczym. Drożdże odgrywają ważną rolę w rolnictwie jako czynniki biokontroli i bioremediacji oraz jako wskaźniki jakości środowiska. Kilka z tych procesów i produktów osiągnęło skalę komercyjną, podczas gdy inne są w trakcie opracowywania technicznego.

Tabela 5.1. Grzyby „workhorse” z zsekwencjonowanymi genami

Grzyb

Szczep

Wielkość genomu (Mpz/pz)

Liczba chromosomów

Szybkość wzrostu µ/godz.

Lit.

Saccharomyces cerevisiae

ATCC204508

S288c

181 165 425

16

0,31

[1]

CEN.PK113-7D

217 582 960

16

0,41

Pichia pastoris

NRRL Y-48124

9,4

4

0,40

[2]

Yarrowia lipolytica

CLIB89

20 500 066

6

0,37–0,46

[3]

[4]

Kluyveromyces marxianus var. marxianus

KCTC 17555 (CBS 6556, ATCC 26548)

10 920 600

8

0,57

[5]

Kluyveromyces lactis

GG 799

10,7

6

0,29–0,43

[6], [7]

Hansenula polymorpha

DL1

9,1

7

0,38

[8]

Blastobotrys (Arxula) adeninivorans LS3

NRRL Y-17692

11,8

4

0,40

[9]

[1] Otero. 2010. BMC Genomics, 11: 723. [2] Love i wsp. 2016. BMC Genomics, 17: 17. [3] Magnan i wsp. 2916. PLoS One, 11: e0162363. [4] Robak. 2007. Biotechnologia, 6: 23–31. [5] Jeong i wsp. 2012. Eukaryotic Cell, 11: 1584–1585. [6] Chuzel i wsp. 2017. Genome Announc., 5: e00623–17. [7] Barba i wsp. 2001. Process Biochem., 36: 531–536. [8] Ravin i wsp. 2013. BMC Genomics, 14: 837. [9] Kunze i wsp. 2014. Biotechnol. Biofuels, 7: 66. [10] Li i wsp. 2017. Biotechnol. Biofuels, 10: 170. [11] Machida i wsp. 2005. Nature, 438: 1157–1161.

Mikrobiologia przemysłowa drożdży obejmuje następujące procesy oraz grupy związków powstałych w procesach fermentacji:

1. 1) fermentacja tradycyjna przy produkcji piwa, wina, sake, sosu sojowego i innych produktów żywnościowych;

2. 2) produkcja żywności i składników pokarmowych, jak związki zapachowe, pigmenty, aminokwasy i kwasy organiczne;

3. 3) produkcja składników biopaliw, jak np. bioetanol, biodiesel, biobutanol, farnesen, bisabolen, amorfadien i seskwiterpenoidy;

4. 4) produkcja biokatalizatorów, jak np. farmaceutyki, chemiczne intermediaty i katalizatory do biotransformacji;

5. 5) produkcja heterologicznych białek, jak np. białka farmaceutyczne, enzymy, hormony, szczepionki i toksyny;

6. 6) produkcja różnych czynników do badań naukowych;

7. 7) badania farmaceutyczne, jak np. odkrywanie nowych leków, metabolitów;

8. 8) biokontrola bezpieczeństwa produkcji żywności, ochrona upraw i plantacji, probiotyki;

9. 9) biotechnologia środowiskowa, jak np. bioremediacja.

5.2.Enzymy spożywcze i paszowe produkowane przez drożdże

Termin „enzym” został wymyślony przez niemieckiego fizjologa Wilhelma Kühne w 1876 r. W 1907 r. Eduard Büchner otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za odkrycie „fermentacji bezkomórkowej” przy użyciu ekstraktów z drożdży piekarskich. Technologia enzymatyczna wykorzystująca wolne od komórek enzymy i biokatalizatory całokomórkowe stanowi integralną część kilku dużych bioprocesów chemicznych, farmaceutycznych i rolniczych.

Enzymy rynkowe dzieli się na ogół na cztery klasy użytkowe:

1. 1) enzymy techniczne, które stanowią około 65% rynku, w tym enzymy stosowane w przemyśle detergentów, upłynnianiu skrobi, tekstyliów, skóry, masy celulozowej i papieru oraz środków higieny osobistej;

2. 2) enzymy spożywcze, około 25% rynku, w tym enzymy stosowane w browarnictwie, mleczarstwie, produkcji win i soków, oczyszczaniu tłuszczów i olejów oraz przemyśle piekarniczym;

3. 3) enzymy paszowe, około 10% rynku, stosowane w paszach dla zwierząt;

4. 4) enzymy diagnostyczne, wysokiej czystości, obejmujące niewielką część całego rynku enzymów.

W ostatnich latach rozwój przemysłu enzymów masowych był szczególnie silny w sektorach piekarniczym i paszowym, w przemysłowych syntezach organicznych związków chemicznych wysokowartościowych i farmaceutyków, a w mniejszym stopniu w przetwórstwie papieru i masy celulozowej czy produkcji biopaliw.

Przemysł spożywczy jest największym użytkownikiem enzymów masowych, stanowiąc około 45% całkowitego zużycia. Rynek enzymów masowych jest zdominowany przez enzymy wytwarzane w hodowlach płynnych przez bakterie i grzyby strzępkowe, zwłaszcza gatunki z rodzaju Bacillus i Aspergillus. Jak pokazano w tabeli 5.2, tylko ograniczona liczba enzymów drożdżowych jest obecnie stosowana jako enzymy masowe.

Tabela 5.2. Enzymy produkowane przez drożdże na skalę przemysłową

Drożdże

Enzymy

Zastosowanie

Kluyveromyces spp.

Saccharomyces cerevisiae

chymozyna

spożywcze

Saccharomyces spp.

α-galaktozydaza

spożywcze

Zygosaccharomyces rouxii

L-glutaminaza

spożywcze

terapeutyczne

w analityce

Candida spp.

Kluyveromyces marxianus

inulinazy

spożywcze

Saccharomyces cerevisiae

inwertaza

spożywcze

Candida pseudotropicalis

Kluyveromyces spp.

laktaza

spożywcze

Candida rugosa

Yarrowia lipolytica

Trichosporon fermentum

Geotrichum candidum

Pseudozyma antarctica

lipaza

spożywcze

terapeutyczne

do produkcji detergentów

do bioremediacji

do oczyszczania ścieków

Rhodotorula spp.

Rhodospirillum spp.

amoniakoliaza

L-fenyloalaninowa

w farmaceutyce

Candida boidinii

dehydrogenaza fenyloalaninowa

w farmaceutyce

Ogataea polymorpha

fitaza

spożywcze

Kilka enzymów produkowanych przez drożdże znalazło zastosowanie w produkcji wysokowartościowych specjalistycznych związków chemicznych i do biotransformacji półproduktów farmaceutycznych. W chwili obecnej około 90% enzymów przemysłowych jest wytwarzanych metodami rekombinacyjnymi jako białka heterologiczne. Przykładami istotnych dla przemysłu rekombinowanych enzymów wytwarzanych w drożdżach są chymozyna produkowana przez Kluyveromyces lactis oraz oksydaza glikolanowa i fitaza produkowane przez Komagataella pastoris (dawne Pichia). Niektóre drożdże, zwłaszcza Komagataella pastoris i Saccharomyces cerevisiae, są coraz częściej wykorzystywane do heterologicznej produkcji enzymów i wielu innych białek, a Blastobotrys adeninivorans, Ogataea polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pseudozyma spp. i inne gatunki drożdży zostały również przygotowane do produkcji białek heterologicznych. Przemysłowe rekombinowane enzymy i te zbliżone do komercjalizacji wytwarzane przez drożdże przedstawiono w tabeli 5.2. Drożdże są organizmami pożądanymi do produkcji enzymów stosowanych w branży spożywczej ze względu na to, że nie wytwarzają toksycznych metabolitów wtórnych. Kluyveromyces lactis jest obecnie zatwierdzony przez FDA do produkcji rekombinowanych enzymów (chymozyny) stosowanych do wyrobu serów. Również wykorzystywanie całych komórek drożdży jako biokatalizatorów w produkcji wysokowartościowych farmaceutyków i chemikaliów jest szybko rozwijającym się sektorem przemysłu enzymatycznego.

5.3.Metabolity produkowane przez drożdże

Kilka gatunków drożdży wytwarza towarowe substancje chemiczne w ilościach zbliżonych do handlowych. Drożdże wykorzystuje się do „białej biotechnologii” oraz do produkcji tanich masowych wyrobów. Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis i Scheffersomyces stipitis przygotowano do masowej produkcji kwasu L-mlekowego. Produkcja kwasu mlekowego z drożdży i innych organizmów przyczyniła się do innych zastosowań, takich jak jego polimeryzacja do kwasu polimlekowego. Kwas polimlekowy i pokrewne polimery są produktami biodegradowalnymi. Saccharomyces cerevisiae i Rhodotorula glutinis stosowano do produkcji aminokwasów (lizyny, metioniny, fenyloalaniny i proliny) w skali ułamkowej. Drożdże stosowano również do produkcji alkoholi w procesach masowych. Candida magnoliae, Candida peltata i Candida sp. mogą wytwarzać erytrytol z wydajnością od 41 do 56% odpowiednio z glukozy lub ksylozy w procesie 3-dniowej fermentacji. Mannitol szeroko stosowany w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i chemicznym jest wytwarzany przez różne gatunki drożdży z glicerolu. Glicerol jest stosowany w wielu produktach przemysłowych. Tradycyjnie wytwarza się go przez syntezę chemiczną z propylenu, a także odzyskuje po hydrolizie tłuszczów. Candida glycerinogenes wytwarza glicerol (144 g/l) z glukozy w 72-godzinnej fermentacji płynnej. Na początku XX w. Carl Neuberg odkrył, że produkcja glicerolu w Saccharomyces cerevisiae zostaje wzmożona przez chemiczne przekierowanie centralnych szlaków metabolicznych. Aby zwiększyć dostępność czynników redukujących (NADH/NADPH) w komórkach do produkcji glicerolu, do hodowli dodawano takie środki, jak siarczyn lub alkalia w celu zahamowania konwersji aldehydu octowego do etanolu i przeniesinia przepływu węgla do produkcji glicerolu. Zastosowanie siarczynów jest użyteczne w innych fermentacjach, takich jak fermentacja ksylozy, tworzenia astaksantyny przez Xanthophyllomyces dendrorhous, w którym biosynteza wymaga dużych ilości czynników redukujących. Yarrowia lipolytica jest stosowana do przemysłowej produkcji kwasów organicznych, w tym kwasów α-ketoglutarowego, pirogronowego, cytrynowego i izocytrynowego, które są składnikami produktów spożywczych. Kwas cytrynowy jest produktem masowej fermentacji przemysłowej, ustępującym tylko produkcji etanolu. Wzrosło zainteresowanie zdolnościami Yarrowia lipolytica i niektórych Candida spp. do wytwarzania dużych ilości kwasów organicznych z różnych substratów, takich jak sacharoza i glicerol. Inne gatunki drożdży, w tym Candida glabrata, są stosowane na skalę przemysłową do produkcji kwasu pirogronowego. Przemysł zainteresował się produkcją podstawowych związków chemicznych, takich jak kwasy itakonowy, jabłkowy, glukonowy, brasylikowy, sebacynowy i fumarowy, przez kilka gatunków drożdży, ale procesy te obecnie nie mogą konkurować z innymi komercyjnymi procesami chemicznymi lub fermentacyjnymi. Drożdże były używane do produkcji witamin. Pichia guilliermondii nadprodukuje ryboflawinę z ksylozy i rybitolu w odpowiedzi na niedobór żelaza w pożywce. Pichia sp. zostały zbadane pod kątem produkcji pirydoksyny. Kilka gatunków drożdży wytwarza glikolipidy i środki powierzchniowo czynne, które mogą mieć zastosowanie w przemyśle naftowym, spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Reprezentatywną listę związków chemicznych handlowych produkowanych przez drożdże przedstawiono w tabeli 5.3.

Drożdże są dobrze znane jako źródła substancji smakowych dodawanych do żywności, w tym nukleotydów i ekstraktów drożdży i autolizatów, rybonukleotydów, mannoprotein, glukanów ściany komórkowej, białek, choliny, glicerolu i inozytolu, drożdży wzbogaconych w minerały, sterole, witaminy, białka, oleje i enzymy. Nukleotydowe substancje smakowe są również wytwarzane przez enzymatyczną hydrolizę RNA drożdży do nukleotydów. Polisacharydy ściany komórkowej drożdży stosowano jako dodatki do pasz dla zwierząt i ryb. Wykazano, że wspierają one wzrost i zdrowie zwierząt przez różne mechanizmy, w tym immunomodulację, status oksydacyjny, wiązanie toksyn i patogenów oraz interakcje ze składnikami jelita. Synteza chemiczna jest preferowaną technologią wytwarzania związków smakowych, ale istnieje rosnące zapotrzebowanie na „naturalne aromaty”, które dały impuls do rozwoju systemów mikrobiologicznych do produkcji lotnych organicznych związków siarki (VOSC) przez drożdże.

Tabela 5.3. Rynkowe związki chemiczne produkowane przez drożdże

Produkt

Drożdże

aminokwasy, w tym lizyna, metionina, fenyloalanina, prolina

Saccharomyces cerevisiae,

Rhodotorula glutinis

kwasy: α-ketoglutarowy, cytrynowy, izocytrynowy, pirogronowy

Yarrowia lipolytica

kwas glukonowy

Aureobasidium pullulans

kwas pirogronowy

Candida glabrata

glicerol

Saccharomyces cerevisiae, Candida glycerinogenes, Torulopsis anomala, Torulopsis versatilis, Torulopsis nodaensis

astaksantyna

Xanthophyllomyces dendrorhous, Phaffia rhodozyma, Yarrowia lipolytica

etanol

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus

mannitol

Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Torulopsis anomala, Torulopsis versatilis, Torulopsis nodaensis

erytritol

Candida magnoliae, Moniella sp., Candida peltata,

Candida sp., Yarrowia lipolytica

2-fenyloetanol

Pichia fermentans

ryboflawina

Pichia guilliermondii

glikolipidy i surfaktanty, soforolipidy

Candida sp., Pseudozyma sp., Kurtzmanomyces sp.

Źródło: na podstawie Amaral, 2008; Branduardi i wsp. 2012; Sauer i wsp. 2008, zmienione.

5.4.Katalityczne właściwości drożdży

Kataliza w przemyśle chemicznym i farmaceutycznym tradycyjnie była zdominowana przez syntezę chemiczną z zastosowaniem katalizatorów niebiologicznych. Jednakże pewne wady, jak niska wydajność wielu reakcji katalitycznych, brak specyficzności dla syntez chiralnych, potrzeba wysokiej temperatury reakcji, niskiego pH i wysokiego ciśnienia, stosowanie rozpuszczalników organicznych, powstawanie odpadów organicznych i zanieczyszczeń, spowodowały, że zainteresowano się procesami biokatalitycznymi z użyciem enzymów. Do zalet stosowania enzymów w procesach chemicznych należą: łagodne warunki reakcji, prowadzenie procesu w temperaturach od 20 do 80°C, obojętne lub lekko kwaśne pH i normalne warunki atmosferyczne. Ale wciąż, mimo licznych badań, w skali przemysłowej prowadzi się niewiele procesów enzymatycznych. Oszacowano, że obecnie około 150 syntez przemysłowych wykorzystuje enzymy lub całe komórki jako katalizatory. Kilka gatunków drożdży wytwarza enzymy i bioakatalizatory stosowane w tradycyjnym przemyśle enzymatycznym oraz jako biokatalizatory specyficzne w produkcji chiralnych związków chemicznych wykorzystywanych w przemyśle chemicznym i farmaceutycznym. Lipazy i esterazy, powszechnie produkowane przez drożdże, są najczęściej stosowanymi biokatalizatorami w przemysłowych syntezach organicznych. Saccharomyces cerevisiae jest najdokładniej przebadanym mikroorganizmem eukariotycznym, dlatego najczęściej stosuje się w biotransformacjach z udziałem drożdży. Jeśli chodzi o podejścia klasyczne, Saccharomyces cerevisiae był prawie zawsze jednym z pierwszych biokatalizatorów wybranych do rozwiązania danego problemu katalitycznego. Jednak ostatecznie z powodzeniem przeprowadzono tylko trzy typy reakcji enzymatycznych z całymi komórkami Saccharomyces cerevisiae – biotransformacje za pośrednictwem oksydoreduktaz, hydrolaz i liaz. To samo dotyczy alternatywnych szczepów drożdży, które znaleziono w wyniku badań przesiewowych. Alternatywnymi szczepami drożdży stosowanymi do klasycznej biokatalizy całych komórek są np. Candida sp., Cryptococcus sp., Geotrichum sp., Issatchenkia sp., Kloekera sp., Kluyveromyces lactis, Pichia sp., Rhodotorula sp., Rhodosporidium sp., Schizosaccharomyces pombe, Torulopsis sp., Trichosporon sp., Yarrowia lipolytica i Zygosaccharomyces rouxii. Do biotransformacji w przemyśle stosuje się szczepy drożdży Candida sp., Cryptococcus laurentii, Geotrichum candidum, Pichia sp., Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Trigonopsis variabilis i Zygosaccharomyces rouxii.

5.5.Biofarmaceutyki produkowane przez drożdże

Od wczesnych lat 80. ubiegłego wieku drożdże wykorzystywano do heterologicznej produkcji różnych białek. Ważnym przełomem w ekspresji białek heterologicznych w drożdżach było klonowanie, ekspresja, przetwarzanie i wydzielanie ludzkiej proinsuliny w Saccharomyces cerevisiae. Drożdże są intensywniej stosowane jako systemy ekspresji białek w porównaniu do linii komórek ssaczych, gdyż wykazują wyższą wydajność procesu, wyższe wydajności produkcji biomasy komórek, krótsze cykle fermentacji, mogą być hodowane na podłożach skonstruowanych ze stosunkowo niedrogich surowców, mogą wydajnie wydzielać białka, posiadają szlaki posttranslacyjnej modyfikacji, są niepatogenne i niepirogenne. Pod kątem heterologicznej produkcji białek badano szczepy Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica i Arxula adeninivorans.

Większość biofarmaceutyków, które zostały zatwierdzone do zastosowań terapeutycznych przez organy regulacyjne, to białka wytworzone za pomocą technologii rekombinacji DNA w różnych systemach ekspresyjnych. Stanowią one około jednej szóstej całego rynku farmaceutycznego i są jego najszybciej rozwijającym się segmentem (tab. 5.4).

Tabela 5.4. Komercyjne rekombinowane białka jako farmaceutyki oraz szczepionki produkowane przez drożdże

Drożdże produkcyjne

Produkt

Zastosowanie

Sacharomyces cerevisiae

krótko działająca rekombinowana insulina

cukrzyca

kolonia makrofagów granulocytów

przeszczep szpiku kostnego

czynnik stymulujący GM-CSF

regulacja hematopoezy

ostra białaczka szpikowa

hirudyna/lepirudyna

antykoagulant

oksydaza moczanowa

hiperurikemia

płytkowy czynnik wzrostu

wrzody cukrzycowe

albumina surowicy ludzkiej

substancja pomocnicza, wstrząs, marskość wątroby, inne zastosowania

erytropoetyna

choroba nerek

glukagon

hipoglikemia

ludzki hormon wzrostu

krasnoludy, naprawa tkanek

płytkowy czynnik wzrostu

niedokrwistość

insulina

cukrzyca

szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A

wirusowe zapalenie wątroby typu A

Saccharomyces cerevisiae

Ogataea polymorpha Komagataella pastoris

szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B

wirusowe zapalenie wątroby typu B

Saccharomyces cerevisiae

błonica, tężec, krztusiec

wirusowe zapalenie wątroby typu B

Saccharomyces cerevisiae

haemophilus influenzae typ B

szczepionki skojarzone i polio

Komagataella pastoris

antygen wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV)

wirus brodawczaka ludzkiego

Generalnie, biofarmaceutyki są stosowane w celu skompensowania niedoboru lub braku białek ważnych do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Można je podzielić na następujące główne kategorie: czynniki krwi, leki trombolityczne i przeciwzakrzepowe, hormony, enzymy, czynniki wzrostu, interferony i interleukiny, szczepionki i przeciwciała monoklonalne. Spośród 211 biofarmaceutyków, które uzyskały zatwierdzenie regulacyjne do końca 2011 r., 66 (31%) wyprodukowano w Escherichia coli, 31 (15%) w drożdżach (w tym 30 w Saccharomyces cerevisiae i 1 – w Komagataella pastoris) i 91 (43%) w komórkach ssaków. Komórki Escherichia coli, drożdże i komórki ssaków razem wytwarzają 89% zatwierdzonych biofarmaceutyków.

5.6.Inżynieria metaboliczna w Saccharomyces cerevisiae

Inżynieria metaboliczna to nauka umożliwiająca rozwój wydajnych komórkowych fabryk, głównie bakterii i grzybów, zdolnych do produkcji składników żywności, chemikaliów, farmaceutyków i składników paliw w procesie fermentacji. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są główną „fabryką” wykorzystywaną do produkcji szerokiej gamy produktów przemysłowych. Wraz z rozwojem inżynierii genetycznej w latach 70. ubiegłego wieku stało się możliwe wytwarzanie związków, które nie są rodzime dla drobnoustrojów, takich jak białka farmaceutyczne (insulina ludzka i ludzki hormon wzrostu), z wykorzystaniem technologii fermentacji. Inżynieria genetyczna umożliwiła również przekształcenie drobnoustrojów w „fabryki komórkowe” do produkcji chemikaliów przez inżynierię metaboliczną, dziedzinę polegającą na projektowaniu metabolizmu mikroorganizmów w celu wydajnej konwersji tanich surowców, takich jak cukry i biomasa do paliw i chemikaliów. W ramach strategii inżynierii metabolicznej dąży się do skonstruowania szczepów drożdży Saccharomyces cerevisiae posiadających właściwości celulolityczne, ksylanolityczne i amylolityczne, zdolnych do produkcji etanolu. Jest to rozszerzenie zdolności metabolizowania różnych substratów, wprowadzenie nowych ścieżek produkcji metabolitów, których drożdże nie wytwarzają, ulepszanie produktów i poprawa właściwości komórkowych. W ramach udoskonalania lub tworzenia nowych konstruktów za pomocą inżynierii metabolicznej powstały szczepy Saccharomyces cerevisiae zdolne do produkcji wielu związków ściśle związanych z metabolizmem pierwotnym, a także cząsteczki, których tworzenie z centralnych metabolitów drożdży wymaga funkcjonalnej ekspresji całych szlaków heterologicznych i/lub syntetycznych. Są to:

1. 1) poszczególne odczynniki chemiczne, jak 1,2-propanediol, D-ryboza i rybitol, kwas L-mlekowy, kwas bursztynowy, kwas propionowy, polihydroksyalkaniany, antranilany cynamoilu, kubebo, linalol, kwas eikozapentenowy (EPA), farnez i geranyl geraniolu, kwas L-askorbinowy;

2. 2) białka leki, jak insulinopodobny czynnik wzrostu I (fhlGF-1), glukagon, jednołańcuchowe przeciwciała (scFv), antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby (HBsAg), parwowirus B19 VP2, czynnik wzrostu naskórka (EGF), immunoglobulina G, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), białko L1 wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) typu 16, metylomalonylo-CoA, patchoulol, resweratrol, wanilina, Se-metyloselenocysteina, nierybosomalne peptydy;

3. 3) drobne chemikalia, jak β-amyryna, β-karoten, amorfa-4,11-dien, walensen i amorfadien, kazben (diterpen przeciwgrzybiczy);

4. 4) biopaliwa, jak etanol, biobutanol, biodiesel, bisabolen, seskwiterpenoidy (farnesen, amorfadien), estry etylowe kwasów tłuszczowych (FAEE).

Izoprenoidy, określane również jako terpeny lub terpenoidy, należą do najbardziej zróżnicowanej klasy produktów naturalnych, składających się z ponad 40 000 strukturalnie różnych związków, które zostały wyizolowane z różnych gatunków zwierząt i mikroorganizmów, a także z wielu różnych organów roślinnych. Izoprenoidy stanowią dobry przykład klasy związków, których wytwarzanie przez Saccharomyces cerevisiae jest związane z zastosowaniem inżynierii metabolicznej, czego wyrazem jest funkcjonalna ekspresja i lub deregulacja szlaków wieloenzymatycznych prowadzących od centralnego metabolizmu do złożonych produktów. Kilka związków lipidowych może ulegać ekspresji w Saccharomyces cerevisiae do produkcji nowych, wysokowartościowych związków lipidowych. Saccharomyces cerevisiae był jednym z pierwszych organizmów, które zostały uznane ogólnie za „bezpieczne” (GRAS) pierwsze organizmy zmodyfikowane genetycznie (GMO) wykorzystywane do rekombinacyjnej produkcji żywności i dodatków paszowych. W 1990 r. genetycznie zmodyfikowany szczep Saccharomyces cerevisiae stał się jednym z pierwszych GMO zatwierdzonych do stosowania na skalę przemysłową w Wielkiej Brytanii. Jest on wykorzystywany w produktach piekarniczych do zwiększonej produkcji ditlenku węgla. Wiele genów kodujących pożądane właściwości sklonowano również w szczepach drożdży piwnych i winnych, jak Saccharomyces pastorianus i Saccharomyces bayanus. Jednakże szczepy te nie były wykorzystywane komercyjnie z powodu negatywnego postrzegania przez opinię publiczną.

5.7.Drożdże kumulujące oleje

Spośród dobrze znanych ponad 600 gatunków drożdży opisano 30 gatunków kumulujących oleje w ilości powyżej 25% suchej masy. Tylko 5% z nich opisano jako zdolne do gromadzenia lipidów w ilości ponad 25% s.m. komórkowej. Obejmują takie rodzaje drożdży, jak Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon i Lipomyces. Niektóre drożdże gromadzą olej w ilości do 80% s.m. i mogą rzeczywiście wytwarzać różne lipidy, rosnąc na różnych źródłach węgla. Ze względu na różnorodność drożdży i warunków hodowli, mogą one być przydatne do produkcji triglicerydów, środków powierzchniowo czynnych lub wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Na liście drożdży kumulujących substancje olejowe są: Cryptococcus curvatus (69% s.m.), Cryptococcus albidus (65% s.m.), Candida sp. 107 (42% s.m.), Lipomyces starkeyi (73% s.m.), Rhodotorula glutinis (72% s.m.), Rhodospirillum toruloides (76% s.m.), Rhodotorula graminis (36% s.m.), Trichosporon pullulans (65% s.m.) i Yarrowia lipolytica (36% s.m.).

5.8.Drożdże w strefie klimatu okołobiegunowego

Ponad 80% ziemskiego środowiska naturalnego stanowią obszary, na których temperatura wynosi poniżej 5°C. Główną część tych siedlisk zajmują głębiny oceanów, arktyczne i antarktyczne pokrywy śnieżne i lodowe, wieczne zmarzliny, lód morski i lodowce wysokogórskie. Antarktyda jest najbardziej reprezentatywnym przykładem lądowego zimnego siedliska, którego prawie cała powierzchnia jest pokryta lodem i śniegiem. W wielu ekosystemach z niskimi temperaturami są często związane inne czynniki ograniczające, takie jak niska dostępność wody i składników odżywczych, wysokie ciśnienie hydrostatyczne, stres oksydacyjny czy wysokie napromieniowanie słoneczne, które powodują, że te ekstremalne siedliska są bardzo niegościnne dla rozwoju organizmów. Drożdże są lepiej przystosowane do niskich temperatur niż bakterie. W zimnym środowisku Antarktydy występują drożdże rodzajów Bullera, Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Kondoa, Leucosporidium, Metschnikowia, Mrakia, Pseudozyma, Rhodotorula, Sakaguchia, Sporopachydermia, Sympodiomyces i Trichosporon. Drożdże te rosną w zakresie temperatur od około 0 do 25°C, przy czym temperatura optymalna do ich wzrostu wynosi około 15°C. Adaptacja do niskiej temperatury jest związana z dużą ilością nienasyconych kwasów tłuszczowych w składzie membran komórkowych. Organizmy rozwijające się na stałe w temperaturach bliskich zeru syntetyzują stosowane aktywne enzymy, aby podtrzymać swój cykl komórkowy. Drożdże przystosowane do życia w niskich temperaturach można wykorzystać w biotechnologiach rolniczych, spożywczych i środowiskowych, można je też ekonomicznie wykorzystywać do produkcji wina i piwa w niskiej temperaturze, kontroli chorób owoców i nasion po zbiorze oraz bioremediacji ekosystemów zanieczyszczonych węglowodorami. Drożdże przystosowane do metabolizmu w siedliskach zimnych mogą potencjalnie powodować fizyczne i chemiczne pogorszenie jakości żywności. Enzymy drożdży adaptowanych do niskich temperatur są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym i mleczarskim, browarnictwie i przemyśle winiarskim, a także w przemyśle włókienniczym. Aktywne w niskich temperaturach enzymy hydrolityczne, takie jak lipazy, proteazy, celulazy i amylazy, mogą być stosowane jako środek aktywny w detergentach stosowanych do prania i mycia na zimno. I tak:

- – białka przeciw zamarzaniu (AFP) produkowane przez drożdże Glaciozyma antarctica, Glaciozyma sp. i Rhodotorula glacialis, rekombinanty Saccharomyces cerevisiae mogą być stosowane w przemyśle spożywczym (do przedłużenia okresu trwałości lodów, mrożonego ciasta, owoców i warzyw), do kriokonserwacji krwinek czerwonych, oocytów, narządów i tkanek, w kriochirurgii;

- – amylazy, ksylanazy, chitynazy i lizozymy produkowane przez Candida antarctica mogą być stosowane w przemyśle spożywczym;

- – enzymy pektynolityczne produkowane przez Cystofilobasidium, Cryptococcus i Mrakia są wykorzystywane w przemyśle spożywczym, w produkcji kosmetyków oraz w przetwórstwie owoców do zmniejszania lepkości soków, przez co poprawiają jakość napojów;

- – β-galaktozydazy i proteazy produkowane przez Glaciozyma antarctica i Guehomyces sp. mogą być stosowane do produkcji mleka i serwatki bez laktozy, jako enzymy do produkcji detergentów, artykułów spożywczych, produkcji serów wolno dojrzewających, a także w biotransformacjach związków organicznych;

- – fitazy i esterazy produkowane przez Cryptococcus laurentii, Rhodotorula mucilaginosa i Yarrowia lipolytica są wykorzystywane do produkcji karmy dla zwierząt;

- – lipazy są jednymi z najbardziej użytecznych enzymów, zwłaszcza w produkcji żywności, wysokowartościowych chemikaliów, farmaceutyków, polimerów, detergentów, komponentów biodiesela; spośród wszystkich znanych lipaz z różnych środowisk i organizmów szczególne znaczenie mają zimne aktywne lipazy A i B z drożdży Pseudozyma (Candida) antarctica.

5.9.Zastosowanie drożdży w przechowalniach płodów rolnych

Straty magazynowanych owoców, warzyw i zbóż spowodowane rozkładem przez grzyby patogeniczne mogą być bardzo znaczące, a rozwiązanie tego problemu staje się coraz ważniejsze, ponieważ wzrasta światowe zapotrzebowanie na żywność. Niszczenie owoców po zbiorze można zmniejszyć, unikając uszkadzania ich podczas zbioru i późniejszych manipulacji, stosowanie rygorystycznych praktyk sanitarnych, chemicznych środków grzybobójczych podczas przechowywania w zimnej i/lub zmodyfikowanej atmosferze. Te korzystne praktyki zwykle nie wystarczają jednak do ochrony zebranych owoców przed psuciem się spowodowanym głównie przez kilka gatunków grzybów należących do rodzaju Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Gloeosporium, Mucor, Monilinia, Penicillium, Rhizopus itp. Jednym z najszerzej badanych nekrotroficznych patogenów grzybiczych jest Botrytis cinerea powodujący szarą pleśń w ponad 500 gatunkach roślin. Ten patogen powoduje katastrofalne starty ekonomiczne dla różnych ważnych gospodarczo upraw, w tym winogron, truskawek i pomidorów. Może być obecny w łodygach, liściach, kwiatach, owocach i nasionach. Może wywołać oczywiste objawy choroby w okresie przed zbiorem lub pozostać w spoczynku aż do okresu po zbiorach. Botrytis cinerea uznano za jeden z najważniejszych patogenów po zbiorach świeżych owoców i warzyw. Roczne straty ekonomiczne spowodowane przez Botrytis cinerea z łatwością przekraczają na całym świecie 10 mld dolarów. Ze względu na swoje naukowe i ekonomiczne znaczenie Botrytis cinerea sklasyfikowano jako drugi pod względem ważności patogen roślinny. Trudno jest go kontrolować, ponieważ ma wielu gospodarzy, różne typy ataku, a także etapy rozwoju (bezpłciowy i płciowy), aby przetrwać w sprzyjających lub niekorzystnych warunkach. Bezpłciowe zarodniki Botrytis cinerea są konidiami łatwo przenoszonymi przez wiatr lub wodę, a zarodniki po akcie płciowym to sklerocja niezbędne do przeżycia w niekorzystnym środowisku. Do tej pory głównym sposobem kontroli szarej pleśni spowodowanej przez Botrytis cinerea pozostaje stosowanie syntetycznych fungicydów, które mogą stanowić około 8% całego rynku fungicydów na świecie, a roczne globalne wydatki na kontrolę Botrytis zwykle przekraczają 1 mld euro. Jednak efekty kontrolne działania fungicydów nie są zadowalające, ponieważ genom tego patogena jest plastyczny i podatny na rozwój genów oporności na fungicydy. Ponadto fungicydy nie są bezpieczne dla ludzi i środowiska.

Jednym z najważniejszych ekonomicznie problemów na świecie jest choroba niebieskiej pleśni powodowana głównie przez Penicillium expansum (Link) Thom. Zniszczenia wywołane przez pleśń niebieską prowadzą do znacznych strat ekonomicznych podczas przechowywania. Niszczą również owoce przeznaczone do przetworzenia przez wydzielanie rakotwórczej mikotoksyny – patuliny. Penicillium expansum infekuje owoce przede wszystkim przez rany spowodowane przebiciami lub siniakami podczas zbioru lub podczas obsługi po zbiorze. Grzyb może również dostać się do owocu przez naturalne otwory w roślinie. Objawy występują w postaci jasnych, miękkich zmian. Uszkodzenia są miękkie z powodu maceracji tkanki przez enzym poligalakturonazę, który odgrywa znaczącą rolę w wirulencji Penicillium expansum. Gdy zmiana rozszerza się, zepsuta część może być łatwo oddzielona od otaczającej tkanki. Wzrost grzybów na powierzchni zmiany chorobowej, początkowo biały, staje się bladoniebieski, gdy zachodzi sporulacja. Chociaż zmiany niebieskich pleśni zaczynają się głównie od infekcji rany, grzyb może spowodować „zagnieżdżanie się” w pojemniku na owoce poprzez wyrastanie na sąsiednie zdrowe owoce.

Wykorzystanie żywych mikroorganizmów do zwalczania chorób grzybiczych po zbiorach jest potencjalną technologią zamiast chemicznych środków grzybobójczych (fungicydów). Różne antagonistyczne drożdże mogą skutecznie hamować psucie się owoców po zbiorach spowodowane przez Botrytis cinerea. Antagonistyczne drożdże są bardziej poszukiwane, ponieważ są bezpieczniejsze niż bakterie, ponieważ nie wykryto toksycznych metabolitów wtórnych w ich aktywności przeciwko patogenom. Ich sposoby działania przeciwko patogenom grzybowym polegają na konkurencji o składniki odżywcze i wytwarzaniu enzymów litycznych ściany komórkowej, które ułatwiają infekcję. Preparaty zawierające antagonistyczne drożdże połączone z chlorkiem, kwasem salicylowym, wodorowęglanem sodu, krzemem, borem i betainą glicyny mogą znacznie poprawić skuteczność biokontroli w zwalczaniu chorób po zbiorach w różnych owocach. Spośród alternatywnych dróg ochrony zbiorów wykazano, że stosowanie mikroorganizmów antagonistów, takich jak drożdże, grzyby i bakterie, jest dość obiecujące. Przykłady gatunków drożdży potencjalnie wykorzystywanych w ochronie biologicznej płodów rolnych po ich zbiorze (tab. 5.5).

Tabela 5.5. Przykłady gatunków drożdży wykorzystanych w ochronie biologicznej plonów po zbiorze

Drożdże antagoniści

Grzyby patogeniczne dla roślin

Plony roślin

Lit.

Rhodotorula glutinis

Trichosporon pullulans

Alternaria alternata

Botrytis cinerea

Penicilium expansum

Rhizopus stolonifer

czereśnie

[1]

Candida oleophila

Debaryomyces hansenii

Metschnikowia sp.

Pichia guilliermondii

Aspergillus niger

Botrytis cinerea

Penicilium digitatum

Rhizopus stolonifer

grapefruit

pomidory

winogrona

[2]

Aureobasidium pullulans

Metschnikowia sp.

Pseudozyma fusiformata

Monilinia laxa

brzoskwinie

[3]

Metschnikowia fructicola

Monilinia fructigena

brzoskwinie

nektarynki

[4]

Metschnikowia pulcherrima

Monilinia fructigena

morele

[5]

Metschnikowia pulcherrima

Penicilium expansum

jabłka

[6]

Cryptococcus humicola

Filobasidium floriforme

Rhodospirillum toruloides

Botrytis cinerea

jabłka

[7]

Candida melibiosica

Candida butyri

Candida parapsilosis

Pichia stiptis

Botrytis cinerea

jabłka

[8]

Aureobasidium pullulans

Cryptococcus laurentii

Rhodotorula glutinis

Botrytis cinerea

Penicilium expansum

jabłka

[9]

Pichia sp.

Wickerhamomyces sp.

Penicillium digitatum

Penicillium italicum

cytrusy

[10]

Candida sake

Botrytis cinerea

Penicillium expansum

Rhizopus nigricans

jabłka

[11]

[1] Qin i wsp. 2004. Postharv. Biol. Technol., 31: 51–58. [2] Schena i wsp. 2000. Europ. J. Plant Pathol., 106: 681–691. [3] Zhang i wsp. 2010. Postharv. Biol. Technol., 55: 174–181. [4] Ferrari i wsp. 2007. Bull. OILB/SROP,30: 43–46. [5] Grebenisan i wsp. 2008. Acta Hortic., 767: 355–360. [6] Janisiewicz i wsp. 2001. Biol. Control, 91: 1098–1108. [7] Filonow i wsp. 1996. Biol. Control, 7: 212–220. [8] Wagner i wsp. 2006. Prog. Plant Prot., 46: 625–628. [9] Lima i wsp. 2003. Europ. J. PlantPathol., 109: 341–349. [10] Perez i wsp. 2016. PLoS One, 11: e0165590. [11] Vinas i wsp. 1998. Intern. J. Food Microbiol., 40: 9-16.

Większość mikroorganizmów badanych pod kątem ich potencjalnego zastosowania jako biokontroli po zbiorze to drożdże ze względu na to, że wiele z nich uważa się za ogólnie uznane za bezpieczne. Drożdże w preparatach biokontroli pozbiorczej najwyraźniej mają przewagę nad innymi organizmami: są łatwe do hodowli i mają krótki czas generacji. Wszystkie te zabiegi powinny być przeprowadzane w niskiej temperaturze, w środowisku kwaśnym, w warunkach stresu osmotycznego, oporności na wysychanie oraz tolerancji na chemikalia. Na liście przykładowych gatunków grzybów antagonistów w stosunku do patogenów obecnych na plonach znalazły się niżej wymienione.

1. 1. Szczepy Aureobasidium pullulans wykazują antagonistyczną aktywność skierowaną przeciwko patogenom roślinnym (zwłaszcza patogenom po zbiorach) i są stosowane obecnie w rolnictwie, gdyż szybko rosną i konkurują z innymi o składniki odżywcze oraz przestrzeń, produkcją liczne enzymy hydrolityczne (β-glukozydazę, amylazy, celulazy, lipazy, proteazy, ksylanazy i mannanazy) i związki antybakteryjne i przeciwgrzybicze (mikotoksyny). Produkują pozakomórkowe polisacharydy, jak pullulan, różne enzymy, jak również inne cząsteczki (liamocyny, aureobazydyny) o wysokiej masie, które zajmują przestrzeń, tworząc jednocześnie mniej korzystne lub nawet wrogie środowisko dla patogenów roślinnych.

2. 2. Kwas rodotorulowy produkowany przez szczepy Rhodotorula glutinis prowadzi biologiczną kontrolę zgnilizny niebieskiej spowodowanej przez Penicillium expansum w przechowywanych jabłkach. Antagonizm powodowany przez produkcję sideroforów jest związany z rywalizacją o żelazo. W testach biokontroli na ranach jabłek niebieska pleśń Penicilium expansum była skuteczniej kontrolowana przez środek antagonistyczny plus siderofory niż przez sam środek antagonistyczny,

3. 3. Przesiewano mikroorganizmy epifityczne wyizolowane z jabłek, gruszek i powierzchni liści jabłoni pod kątem antagonistycznej aktywności przeciwko Penicillium expansum (niebieska pleśń), Botrytis cinerea (szara pleśń) i Rhizopus nigricans (Rhizopus rot) na jabłkach (Malus domestica). Candida sake wyizolowana z jabłek w okresie przechowywania była bardzo skuteczna przeciwko chorobom powodowanym przez te patogeny. Zranione jabłka „Golden Delicious” zabezpieczone zawiesiną drożdży w stężeniu 2,6 · 10^6 jtk/ml i zaszczepione konidiami odpowiednio Botrytis cinerea i Rhizopus nigricans 10^5 i 10^4 konidiów/ml nie ulegały gniciu. Całkowitą kontrolę nad Penicillium expansum uzyskano przy tym samym stężeniu antagonisty i stężeniu inoculum patogenu wynoszącym 10^3 konidiów/ml. Ten szczep zapewnia również doskonałą kontrolę nad rozwojem zgnilizny w warunkach przechowywania w niskich temperaturach. Maksymalna populacja Candida sake na ranach jabłek była taka sama w temp. 20°C jak w temp. 1°C odpowiednio po trzech i dwudziestu dniach.

4. 4. Drożdże Cryptococcus albidus (Saito) Skinner, antagonistyczne, wyizolowane z owoców brzoskwini, oceniano pod względem możliwości kontroli biologicznej w jabłku „Fuji” po prowokacji 1 · 10^5 lub 5 · 10^4 zarodników/ml patogenów w okresie ich przechowywania w stosunku do Botrytis cinerea i Penicillium expansum. Zawiesina przemytych komórek drożdży w ilości 1 · 10^8 jtk/ml całkowicie hamowała rozwój i pleśni i rozkład jabłek w temp. 23 i 1°C.

5. 5. Cryptococcus laurentii oceniano pod względem jego aktywności w redukcji rozprzestrzeniania się szarej i niebieskiej pleśni na owocach brzoskwini powodowanej przez szczepy Botrytis cinerea, Penicillium expansum i Rhizopus stolonifer oraz w zmniejszaniu naturalnego ich rozkładu. Występuje także na wielu innych owocach. Liczebność komórek drożdży Cryptococcus laurentii miała znaczący wpływ na skuteczność biokontroli: im wyższe stężenie Cryptococcus, tym mniejsza częstość występowania choroby. Przy liczebności komórek Cryptococcus laurentii 1 · 10^9 jtk/ml wzrost szarej pleśni został całkowicie zahamowany po 4 dniach inkubacji w temp. 25°C, po zaszczepieniu zawiesiną Botrytis cinerea 1 · 10^5 zarodników/ml; nie obserwowano całkowitego zahamowania pleśni niebieskiej Penicillium expansum lub pleśni Rhizopus stolonifer, gdy owoce brzoskwini przechowywano odpowiednio w temp. 25°C. Cryptococcus laurentii znacznie zmniejszył naturalny rozpad owoców brzoskwini i nie pogorszył parametrów jakościowych owoców po przechowywaniu w temp. 2°C przez 30 dni, a następnie w temp. 20°C przez 7 dni.

6. 6. Mechanizmy działania i skuteczności izolatów drożdży Metschnikowia pulcherrima przeciwko Botrytis cinerea, Penicillium expansum, Alternaria sp. i Monilia sp., patogenów po zbiorze owoców jabłoni i przechowywaniu ich w warunkach kontrolowanych i półhandlowych. Zastosowanie zawiesiny komórek Metschnikowia (10^8 komórek/ml) do ran jabłek sztucznie wykonanych zmniejszyło wzrost Botrytis cinerea i Penicillium expansum po przechowywaniu w temp. 23°C. Całkowicie zahamowało patogen Monilia sp. w temp. 23°C oraz Botrytis cinerea i Penicilium expansum w temp. 4°C. Wyniki przeciw Alternaria sp. były bardziej zmienne. Filtraty oraz zabite komórki Metschnikowia nie były skuteczne – do biokontroli są niezbędne żywe komórki.

Badania nad wykorzystaniem drożdży jako antagonistów zwalczających strzępkowe grzyby patogeniczne skupiły się głównie na ich stosowaniu w leczeniu chorób pozbiorczych, w trakcie przechowywania owoców. Podane przykłady stanowią tylko niewielką część pełnego spektrum walki z chorobami roślin. Istnieją firmy produkujące preparaty przemysłowe do walki biologicznej przeciw grzybom powodującym pleśnienie i psucie się owoców w przechowalniach po ich zbiorze, oparte na różnych gatunkach drożdży. Przykładowo są to preparaty:

1. 1) Aspire, stosowany do biokontroli, zawierający komórki drożdży Candida oleophila jako aktywny czynnik skierowany przeciwko Penicillium digitatum i Penicillium italicum powodującym psucie się owoców cytrusowych, produkowany przez firmę Ecogen Inc. USA;

2. 2) Yield Plus, zawierający komórki Cryptococcus albidus, skierowany przeciwko Botrytis cinerea powodującemu pleśnienie plantacji truskawek, produkowany przez firmę Lallemand, Montreal, Kanada;

3. 3) ShemerTM, zawierający drożdże Metschnikowia fructicola występujące często na kiściach winogron, stosowany do eliminacji patogenów, takich jak Botrytis, powodujących gnicie winogron, produkowany przez firmę Bayer CropScience;

4. 4) Candifruit, zawierający komórki drożdży Candida sake skierowany przeciwko patogenom, takim jak Botrytis, Penicillium i Rhizopus, powodującym pleśnienie oraz gnicie owoców w przechowalniach, produkowany przez firmę Sipcam-Inaagri, Hiszpania;

5. 5) Nexy, zawierający komórki drożdży Candida oleophila, skierowany przeciwko patogenom, takim jak Botrytis cinerea i Penicillium expansum, atakującym różne owoce w przechowalniach, produkowany przez firmę Lesaffre-Bionext, Francja;

6. 6) Boni-Protect, zawierający komórki drożdży Aureobasidium pullulans, skierowany przeciwko Botrytis, Penicillium i Rhizopus, produkowany przez firmę Biofa, Niemcy.

5.10.Zastosowanie drożdży w środowisku

Drożdże odgrywają ważną rolę w rolnictwie jako czynniki biokontroli, bioremediacji i jako wskaźniki jakości środowiska. Szczególnie drożdże z Basidiomycota odgrywają ważną rolę w biotransformacji i degradacji zanieczyszczeń i ksenobiotyków. Uważa się, że ta aktywność wynika głównie z wytwarzania kwasów organicznych w konsorcjach mikrobiologicznych, takich jak biofilmy, rozpuszczających minerały. Niepatogenne gatunki Cryptococcus i Trichosporon są zdolne do degradacji polisacharydów, związków fenolowych, złożonych kwasów organicznych i pewnych węglowodorów. Doniesiono, że szczepy Pseudozyma degradują tworzywa sztuczne i związki pokrewne. Wykazano, że drożdże z Basidiomycota wykorzystują skrobię, pullulan, dekstran, ksylan, poligalakturonian, galaktomannan i kwas garbnikowy jako jedyne źródło węgla. Nie są w stanie rosnąć na celulozie, chitynie, arabinogalaktanie i gumie ksantanowej. Pewne drożdże z Basidiomycota rosną na związkach fenolowych. Ze względu na zdolność różnych gatunków drożdży do wzrostu na szerokiej gamie substratów, w tym związków aromatycznych, alkanów, związków lipidowych, amin i innych opornych na degradację, posiadają one zdolność do przekształcania szkodliwych związków w ich nieszkodliwe pochodne. Yarrowia lipolytica jest zdolna do transformacji 2,4,6-trinitrotoluenu (TNT) w produkty pochodne. Degradację fenoli prowadzą również inne gatunki drożdży, w szczególności rodzaje z Basidiomycota, takie jak Cryptococcus, Rhodotorula i Trichosporon. Drożdże kilku gatunków Candida i Trichosporon przekształcają fluorowcowe związki aromatyczne. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne są degradowane przez gatunki Candida, Cryptococcus, Rhodotorula i Trichosporon. Stwierdzono, że drożdże Pseudozyma jejuensis są zdolne do degradacji kutyny oraz niektórych odpadów z tworzyw sztucznych. Unieruchomione i adaptowane do życia w niskich temperaturach systemy drożdży są opracowywane jako przemysłowe systemy biodegradacji. Wiadomo, że Xanthophyllomyces dendrorhous i Phaffia rhodozyma rozkładają ochratoksynę, silną mikotoksynę. Trichosporon spp. są zdolne do degradacji ochratoksyny A i zearalenonu w warunkach laboratoryjnych. Szczepy Saccharomyces cerevisiae degradują patulinę podczas fermentacji cydru. Zdolność drożdży do degradacji mikotoksyn ma ważne znaczenie zdrowotne, ponieważ te substancje toksyczne występują w paszach, żywności i napojach, stwarzając zagrożenie zdrowia.

Yarrowia lipolytica to gatunek drożdży z Ascomycota o charakterystycznych cechach fizjologicznych i biochemicznych, które są istotne dla ochrony środowiska. Szczepy naturalnie tego gatunku występujące w glebie, wodzie morskiej, osadach i ściekach mają nieodłączne zdolności do degradacji węglowodorów, takich jak alkany (krótko- i średniołańcuchowe) oraz związków aromatycznych (bifenylu i dibenzofuranu). Oprócz skutecznego rozkładu węglowodorów alifatycznych i aromatycznych, szczepy typu dzikiego i rekombinowane Yarrowia lipolytica mogą również rozkładać związki nitroaromatyczne, chlorowcopochodne i fosforoorganiczne. Drożdże mają wrodzoną zdolność do detoksykacji jonów metali. Yarrowia lipolytica może rozkładać różnego typu odpady, w tym odpady oleiste i stałe, powodując redukcję ChZT.

Fermentacja, jako mechanizm pożądanych modyfikacji biochemicznych, polega na konwersji cukrów w produkty, takie jak alkohole, kwasy organiczne, ditlenek węgla i związki smakowe, a proces ten odbywa się głównie za pośrednictwem enzymów produkowanych przez drożdże. Fermentacja jest też przeprowadzana w celu poprawy smaku, zapachu, okresu trwałości, tekstury i wartości odżywczej żywności oraz innych atrakcyjnych właściwości. Szacuje się, że miliardy ludzi na całym świecie spożywają ponad 5000 różnych rodzajów sfermentowanej żywności i napojów. Proces fermentacji może prowadzić także do detoksykacji i zniszczenia niepożądanych składników obecnych w surowej żywności, takich jak fityniany, garbniki i polifenole, a także do usunięcia laktozy z mleka. Na przykład surowe ziarna kakaowe są niejadalne ze względu na ich gorzki i cierpki smak. Jednak po sfermentowaniu stają się podstawowym surowcem do produkcji czekolady. Produkcja dobrej jakości fermentowanej żywności zależy od obecności, wzrostu i metabolizmu różnych mikroorganizmów. Zatem mikroorganizmy nadają żywności zróżnicowane cechy dzięki produktom pochodzącym z ich własnego metabolizmu. Wytwarzanie kwasów organicznych, alkoholi i związków lotnych jest bezpośrednio związane z właściwościami produktu końcowego. Aktywność biologiczna drobnoustrojów podczas procesu może również spowodować wytwarzanie kilku metabolitów zdolnych do hamowania wzrostu i przeżycia niepożądanych mikroorganizmów.

5.11.Saccharomyces cerevisiae

Drożdże Saccharomyces cerevisiae od tysięcy lat są stosowane przez ludzi w produkcji żywności i napojów, głównie w procesach fermentacji. Mikroorganizmy te obecne w żywności przekształcają chemicznie jej skład, wzbogacając w wartości odżywcze i korzyści zdrowotne produkty wykorzystywane przez ludzi. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są szeroko stosowane w procesach fermentacji i ściśle związane z produkcją żywności i napojów fermentowanych do spożycia przez ludzi, takich jak chleb, czekolada, wino i piwo. Ponadto drożdże te mają wiele pożądanych właściwości przemysłowych, takich jak wysoka zdolność fermentacyjna (zdolność do metabolizmu szerokiego zakresu cukrów, np. glukozy, fruktozy, mannozy, galaktozy, sacharozy i maltozy), flokulacja, tolerancja na etanol, ciśnienie osmotyczne, tolerancja niskiego pH środowiska. Drożdże fermentacyjne, zwłaszcza należące do gatunku Saccharomyces cerevisiae, są stabilne w fermentacji żywności i napojów. Mogą być stosowane w wielu postaciach w różnych warunkach fermentacji. Ponadto postęp w genetyce i ekologii Saccharomyces cerevisiae przyczynił się do lepszego poznania szczepów i wiedzy na temat ich roli w produkcji fermentowanej żywności i napojów. Opublikowano wiele artykułów na temat badań z użyciem Saccharomyces cerevisiae jako szczepów starterowych do produkcji żywności i napojów, takich jak fermentacja kakao i kawy, w celu kontrolowania spontanicznej fermentacji. Ponadto badania wykazały również przydatność izolatów szczepów pochodzących z naturalnych środowisk w uzyskiwaniu szczepów z nowymi i ulepszonymi cechami dla przemysłu. Zmiany te, związane z innymi postępami w dziedzinie genetyki, takimi jak technologia rekombinacji DNA, mogą służyć lepszej wydajności fermentacji i jakości produktu.

Tabela 5.6. Produkcja chemikaliów przez konstrukty metaboliczne S. cerevisiae

Kwas

Zmiany genetyczne

bursztynowy

– zakłócenie cyklu kwasu cytrynowego przez usunięcie SDH1, SDH2, IDH1, IDP1

– wyłączenie syntezy seryny z glikolizy poprzez potrójne usunięcie SDH1, SER3 i SER33

– zwiększony eksport kwasu bursztynowego przez heterologiczną ekspresję MAE1 z Schizosaccharomyces pombe w szczepach Saccharomyces cerevisiae z uszkodzonym SDH1 i SDH2

itakonowy

nadekspresja CAD z syntetycznym promotorem hybrydowym i poprawą przepływu węgla w kierunku cyklu kwasu cytrynowego przez sekwencyjną delecję genów ADE3, BNA2 i TES1

3-hydroksypropionowy

– rekonstrukcja szlaku malonylo-CoA do 3-HP przez ekspresję MCR z Sulfolobus tokodaii i HPDH do Metallosphaera sedula oraz zwiększenie dostępności prekursora i kofaktora

– rekonstrukcja szlaku β-alaniny do 3-HP przez koekspresję BAPAT z Bacillus cereus i HPDH z Escherichia coli i przekierowanie przepływu węgla w kierunku β-alaniny przez nadekspresję PAND z Tribolium castaneum

– rekonstrukcja szlaku malonylo-CoA do 3-HP przez koekspresję MCR z Chloroflexus aurantiacus i ACC1 z niedoborem inhibicji i optymalizacją acetylu

– podawanie CoA przez nadekspresję natywnego PDC1, ALD6 i ACS z Salmonella enterica

– laboratoryjna adaptacyjna ewolucja w celu poprawy tolerancji na 3-HP przy pH 3,5

mlekowy

– ekspresja zintegrowanego z genomem L-LDH z bydła pod promotorem PDC1 i inaktywacja PDC1

– ekspresja zintegrowanego z genomem D-LDH z Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides pod promotorem PDC1 i inaktywacja PDC1

– delecja PDC1 i ekspresja wielu kopii L-LDH z bydła

– hamowanie zużycia L-LDH przez delecję DLD1 i JEN1, eliminacja etanolu i wytwarzanie glicerolu przez usunięcie PDC1, ADH1, GPD1 i GPD2 oraz poprawę tolerancji kwasu mlekowego przez ewolucję adaptacyjną i nadekspresję HAA1

– nadekspresja transporterów heksozowych HXT1 i HXT7

– represja produkcji etanolu przez usunięcie PDC1 i ADH1 i ulepszonego acetylu i dostarczanie CoA przez wprowadzenie genów kodujących acetylujący acetaldehyd enzym dehydrogenazy z Escherichia coli

– zwiększenie transportu kwasu mlekowego przez ekspresję JEN1 i ADY1

– ekspresja ESBP6, nowego celu wyizolowanego przez przesiewanie wieloskładnikowego genomowej biblioteki DNA drożdży

5.11.1. Produkcja chemikaliów

Rafinerie ropy naftowej są obecnie głównym źródłem chemikaliów, takich jak rozpuszczalniki i prekursory polimerów. Znaczna część ropy naftowej jest wykorzystywana w chemicznej katalizie do produkcji chemikaliów i tworzyw sztucznych. Jednak w ostatnich latach produkcja mikrobiologiczna związków chemicznych opartych na źródłach odnawialnych takich jak biomasa stała się ważna w ramach wysiłków na rzecz zmniejszenia popytu na malejące zasoby ropy naftowej i zmniejszenia ilości odpadów niebezpiecznych. Ponadto biotechnologia udostępnia nowe monomery związków chemicznych, które są niedostępne z powodu wysokich kosztów produkcji na drodze syntezy chemicznej. W biorafineriach biomasa jest najpierw przekształcana w cukry proste oraz proste kwasy tłuszczowe, a następnie w wartościowe związki chemiczne na drodze fermentacji. Mikroorganizmy są katalizatorami konwersji biomasy do końcowych metabolitów. Dla każdego procesu są potrzebne odpowiednie szczepy przemysłowe. Jako szczep modelowy Saccharomyces cerevisiae jest przedmiotem badań inżynierii metabolicznej w zakresie produkcji chemikaliów na bazie biologicznej. Kwasy organiczne 1,4-dikwasy (bursztynowy, fumarowy i jabłkowy), kwas itakonowy, kwas 3-hydroksypropionowy i kwas mlekowy są wymienione wśród celów o wysokim potencjale dla mikrobiologii przemysłowej. Reprezentatywne przykłady wytwarzania tych masowych chemikaliów przez Saccharomyces cerevisiae poddane inżynierii metabolicznej przedstawiono w tabeli 5.6.

5.11.2. Kwas bursztynowy

Kwas bursztynowy jest stosowany w wielu gałęziach przemysłu, zwłaszcza w przemyśle spożywczym i rolnictwie. Jest uważany za półprodukt generyczny dla polimerów pochodzenia biologicznego i może być substytutem bezwodnika maleinowego pochodzącego z ropy naftowej, który ma ogromny rynek. Dlatego rośnie zapotrzebowanie na kwas bursztynowy. Obecnie jest produkowany głównie w procesie syntezy chemicznej produktów petrochemicznych. Dąży się więc do osiągnięcia zrównoważonej mikrobiologicznej produkcji kwasu bursztynowego związanej z ochroną środowiska naturalnego. Naturalnymi producentami kwasu bursztynowego są Anaerobiospirillum succiniciproducens i Actinobacillus succinogenes. Organizmy te nie spełniają warunków produkcji masowej, gdyż efektywnie rosną tylko w środowisku obojętnym, a hodowle wymagają ciągłej neutralizacji pH oraz ciągłego odbierania produktu. Drożdże Saccharomyces cerevisiae nie są naturalnym producentem kwasu bursztynowego jako końcowego metabolitu, ale dzięki inżynierii metabolicznej, są zdolne do wzrostu oraz syntez komórkowych w środowisku kwaśnym. Przedmiotem obecnych badań są, ogólnie rzecz biorąc, cykl kwasów trikarboksylowych (TCA) i uboczny cykl glioksalowy. Strategia jest następująca: należy tak przekierować szlak TCA, aby wyeliminować aktywność dehydrogenazy bursztynianowej i izocytrynianowej. Szczep drożdży z zaburzonym cyklem TCA z powodu delecji SDH1, SDH2, IDH1, IDP1, wytwarza kwas bursztynowy z wydajnością 0,11 mol/mol glukozy w hodowlach okresowych wytrząsanych prowadzonych w kolbach Erlenmeyera.

5.11.3. Kwas itakonowy

Kwas ten ma obecnie zastosowanie w produkcji środków farmaceutycznych, klejów i żywic. Ponadto jego spolimeryzowana postać (kwas poliitakonowy) może służyć jako zamiennik kwasu akrylowego stosowanego jako superabsorbent i może być stosowany do produkcji detergentów i środków czyszczących. Obecnie organizmem wybranym do przemysłowej fermentacji kwasu itakonowego jest Aspergillus terreus. Jednak proces ten wiąże się z pewnymi ograniczeniami związanymi z jego wrodzonymi cechami, takimi jak wrażliwość na stres ścinania w hodowlach płynnych napowietrzanych. Izolowana dekarboksylaza kwasu cis-akonitowego (CAD), która jest głównym enzymem w konwersji cis-akonitynianu do kwasu itakonowego w Aspergillus terreus, i jej heterologiczna ekspresja w Saccharomyces cerevisiae wykazały możliwość produkcji kwasu itakonowego przez te drożdże. Wykorzystano syntetyczny promotor hybrydowy niosący wzmacniacz i moduł rdzeniowy promotora do optymalizacji ekspresji CAD w Saccharomyces cerevisiae. Model metaboliczny całego genomu drożdży wykorzystano do identyfikacji delecji genów w celu dalszego zwiększenia produkcji kwasu itakonowego. Trzy kolejne rundy skanowania genomu in silico zaproponowały usunięcie trzech enzymów i są to: cytoplazmatyczna trifunkcyjna syntaza C1-tetrahydrofolianowa (THF), domniemana 2,3-dioksygenaza tryptofanowa lub 2,3-dioksygenaza indoloaminowa i tioesteraza acylo-CoA peroksysomalna, kodowana odpowiednio przez ADE3, BNA2 i TES1. Delecje zmieniły przepływ metaboliczny w kierunku cyklu TCA i spowodowały zwiększoną wydajność produkcji kwasu itakonowego (168 mg/l). Konieczne są jednak dalsze wysiłki w celu przekierowania strumieni węgla w kierunku produkcji kwasu itakonowego przez drożdże, aby uzyskać wydajność jak u gatunków z rodzaju Aspergillus (powyżej 80 g/l).

5.11.4. Kwas 3-hydroksypropionowy

Kwas 3-hydroksypropionowy (3-HP) to kolejna ważna platforma chemiczna, którą można wytworzyć z cukrów lub glicerolu, a nastepnie przekształcać w 1,3-propanodiol, kwas akrylowy, kwas malonowy i akrylamid. Pochodne 3-HP mają wiele zastosowań jako polimery absorbenty, powłoki powierzchniowe, składniki klejów i farb. Chociaż istnieją biologiczne szlaki prowadzące do 3-HP przez glicerol, mleczan, malonylo-CoA lub β-alaninę, nie jest znany organizm, który wytwarza go jako produkt końcowy. Ścieżki oparte na malonylo-CoA i β-alaninie zostały skonstruowane w Saccharomyces cerevisiae. Reduktaza malonylo-CoA (MCRCa) z Chloroflexus aurantiacus została uzyskana w drożdżach w celu konwersji malonylo-CoA do 3-HP w dwuetapowej reakcji redukcji. Ponadto strumień węgla został przekierowany na 3-HP przez zwiększenie poziomu malonylo-CoA i jego bezpośredniego prekursora – acetylo-CoA. W tym celu natywne ADH2 (dehydrogenaza alkoholowa) i ALD6 (dehydrogenaza aldehydowa zależna od NADP) oraz syntetyczną acsL641PSE (niewrażliwa na acetylację syntetaza acetylo-CoA z Salmonella enterica) poddawano nadmiernej ekspresji w celu zwiększenia poziomu acetylo-CoA. Stężenie komórkowe malonylo-CoA zostało zwiększone przez nadekspresję ACC1 (karboksylazy acetylo-CoA), która jest jedynym enzymem prowadzącym konwersję acetylo-CoA do malonylo-CoA. Ostatecznie 3-HP został wyprodukowany z wydajnością 463 mg/l w procesie połączonym ze zwiększoną podażą dawcy elektronów MCRCa (NADPH) przez heterologiczną ekspresję GAPNp (dehydrogenaza 3-fosforanowa niefosforyzowanego aldehydu glicerynowego ze Streptococcus mutans). W innym badaniu osiągnięto znaczącą poprawę produkcji 3-HP, gdy wiele kopii MCR zostało zintegrowanych z genomem drożdży i wyrażono zmodyfikowany ACCp z niedoborem fosforylacji. Wreszcie, inżynieria zredukowała metabolizm tego szczepu i spowodowała produkcję 3-HP z wydajnością 9,8 g/l w systemie hodowli okresowej z zasilaniem glukozą. Dokonywano modelowania w skali genomu, aby porównać dwie drogi biosyntezy pod względem maksymalnych wydajności teoretycznych i zidentyfikowano szlak β-alaninowy jako korzystniejszy. Zaimplementowano biosyntezę 3-HP z glukozy przez β-alaninę do komórek Saccharomyces cerevisiae przez koekspresję aminotransferazy pirogronianu β-alaniny z Bacillus cereus i dehydrogenazy 3-hydroksypropanianowej z Escherichia coli. Ponadto strumień węgla został przekierowany w kierunku β-alaniny przez dostarczanie L-asparaginianu, bezpośredniego prekursora β-alaniny. Ostateczny szczep produkował 3-HP z wydajnością 13,7  g/l w hodowli okresowej z zasilaniem glukozowym. W podobny sposób wytwarzanie 3-HP przez szlak malonylo-CoA i β-alaninę opisano w Saccharomyces cerevisiae wykorzystując ksylozę.

5.11.5. Kwas mlekowy

Kwas mlekowy jest dobrze znanym produktem fermentacji szeroko stosowanym w produkcji żywności, kosmetyków i przemyśle farmaceutycznym. Kwas mlekowy pochodzący z biomasy jest również ceniony jako monomer w syntezie bioplastików. Do produkcji kwasu mlekowego są często stosowane bakterie kwasu mlekowego, zwłaszcza gatunki rodzaju Lactobacillus. Do produkcji kwasu mlekowego na dużą skalę wykorzystuje się mikroorganizmy fermentacyjne o wysokiej tolerancji na niskie wartości pH, zdolności do wzrostu na prostych podłożach bez dużych wymagań żywieniowych i osiągajace duże przyrosty biomasy. Szczep Saccharomyces cerevisiae zdolny do produkcji kwasu mlekowego skonstruowano przez włączenie genu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do genomu. Pożądane jest zmniejszenie symultanicznego wytwarzania etanolu i glicerolu w celu skierowania metabolizmu na produkcję kwasu mlekowego. Dlatego konieczne są delecje PDH kodujące dehydrogenazę pirogronianową, ADH kodujący dehydrogenazę alkoholową i dehydrogenazę GPD1 kodującą glicerolo-3-fosforan. Inny zabieg polegał na zwiększeniu poboru glukozy przez nadekspresję transporterów heksozy (HXT1 i HXT7) lub wzmożonego dostarczania acetylo-CoA przez wdrożenie szlaku syntezy acetylo-CoA z Escherichia coli do komórek Saccharomyces cerevisiae w celu poprawy wzrostu komórek wytwarzających kwas mlekowy. Ponadto eliminacja zużycia NADH przez delecje NDE1 i NDE2 kodujące zewnętrzny mitochondrialny NADH wykazała, że dehydrogenazy poprawiają wytwarzanie kwasu mlekowego dzięki zwiększonej dostępności kofaktora. Szczepy drożdży, które eksprymowały JEN1 i ADY2 kodujące permeazy monokarboksylanowe, konstytutywnie znacznie poprawiły wytwarzanie kwasu mlekowego z powodu wyższego wyciekania z komórek kwasu mlekowego. Ostatnio badania przesiewowe biblioteki genomowego DNA z wieloma kopiami ujawniły nowe białko (ESBP6), które bierze udział w odpowiedzi adaptacyjnej kwasu mlekowego, mimo że ma niskie podobieństwo do permeazy monokarboksylanowej. Gromadzenie się kwasu mlekowego w warunkach niskiego pH jest szkodliwe dla komórek drożdży. Dlatego tolerancja na słabe kwasy jest kolejnym celem do osiągnięcia tolerancji na wysoki poziom kwasów organicznych takich jak kwas mlekowy. Badano szczep drożdży eksprymujący rekombinowane LDH przez laboratoryjną ewolucję adaptacyjną w obecności stopniowo zwiększonego stężenia kwasu D-mlekowego. Otrzymano szczep z dodatkowymi kopiami kodowania LDH i HAA1 i uzyskano wydajność produkcji kwasu mlekowego wynoszącą 112 g/l w hodowli półciągłej.

5.11.6. Produkcja wysokowartościowych związków chemicznych

Obecnie postępy i narzędzia w inżynierii metabolicznej pozwalają na mikrobiologiczną produkcję wielu chemikaliów na skalę przemysłową. Istnieje duże zainteresowanie odtwarzaniem szlaków biosyntetycznych różnych produktów naturalnych z zastosowaniem Saccharomyces cerevisiae. Obok kwasów organicznych konstrukty Saccharomyces cerevisiae mogą produkować związki smakowe dodawane do żywności, zapachowe wykorzystywane do produkcji perfum i wód kolońskich oraz farmaceutyków. Związki smakowe mogą być wytwarzane z cukrów (synteza de novo) lub ze specyficznych prekursorów na drodze biokonwersji przy użyciu różnych mikroorganizmów.

1. 1. Wanilina jest syntetyzowana z różnych prekursorów lub de novo z glukozy przy udziale Saccharomyces cerevisiae z wydajnością waniliny (500 mg/l).

2. 2. Kwas p-kumarowy jest handlowo atrakcyjnym produktem oraz istotnym związkiem do produkcji flawonoidów, polifenoli i poliketydów. Osiągnięto wysoką wydajność kwasu p-kumarowego (2 g/l) jako produktu końcowego u Saccharomyces cerevisiae, przez optymalizację biosyntezy natywnych aminokwasów aromatycznych.

3. 3. β-Jonon jest apokarotenoidem występującym naturalnie w malinach aktualnie produkowanym przez konstrukt Saccharomyces cerevisiae.

Innym, atrakcyjnym pod względem ekonomicznym, związkiem smakowym o zapachu róży jest 2-fenyloetanol (2-PE). Biokonwersja fenyloalaniny do 2-fenyloetanolu w komórkach Saccharomyces cerevisiae zachodzi przy udziale szlaku Ehrlicha. Eliminacja allosterycznej regulacji sprzężenia zwrotnego powodowanego przez fenyloalaninę spowodowała 200-krotny wzrost w produkcji związków aromatycznych, w tym 2-fenyloetanolu. Dalsze poprawki genetyczne sprawiły, że wytwarzanie 2-PE z glukozy zachodzi z wydajnością 96 mg/l.

5.12.Kluyveromyces lactis

Gatunek drożdży Kluyveromyces lactis, podobnie jak bakterie kwasu mlekowego, jest zdolny do metabolizmu laktozy, głównego węglowodanu występującego w mleku. Dla pozostałych bakterii brak zdolności metabolizmu laktozy jest stanem naturalnym, ponieważ laktoza ewolucyjnie pojawiła się wraz z pojawieniem się ssaków i wcześniej nie była obecna, ponieważ zarówno rośliny jak i zwierzęta nie są zdolne do syntezy laktozy. Enzym laktaza Kluyveromyces lactis jest wytwarzany na skalę przemysłową i sprzedawany pod nazwą handlową Maxilact™ (DSM Food Specialties, Delft, Holandia). Enzym ten uzyskał status GRAS i jest stosowany głównie w produktach mlecznych do degradacji cukru mlecznego (laktozy), dzięki czemu osoby z nietolerancją laktozy mogą spożywać produkty na bazie mleka.

W rzeczywistości Kluyveromyces lactis został wyizolowany z mleka i jest dominującym eukariotem w procesie produkcji sera, który obniża pH serwatki, a tym samym toruje drogę do rozwoju bakterii kwasu mlekowego. Kluyveromyces lactis, nazwany tak na cześć holenderskiego mikrobiologa Alberta Jana Kluyvera (1888–1956), jest jednokomórkowym eukariotem, który dzieli się polarnie przez pączkowanie (Ascomycota) i wygląda bardzo podobnie do mniejszej wersji „drożdży” Saccharomyces cerevisiae. Występuje w stabilnej formie haploidu oraz w półstabilnej fazie diploidalnej, może być indukowany do wytwarzania tetrad przez brak pewnych składników odżywczych.

W rzeczywistości obok laktozy wykorzystuje inne węglowodany jako źródło węgla. Kluyveromyces lactis wykazuje efekt Kluyvera, to znaczy wykorzystuje takie cukry, jak galaktoza, sacharoza lub maltoza tylko w warunkach tlenowych, nie wykorzystuje ich w warunkach beztlenowych. W warunkach beztlenowych, nie rośnie na żadnym cukrze (nawet na glukozie), ani w obecności „czynników przeżycia”, takich jak ergosterol czy nienasycone kwasy tłuszczowe. Ten fakt wynika z braku możliwości transportu cukru do komórek w warunkach beztlenowych. W przypadku wykorzystywania laktozy, tenże dwucukier zbudowany z D-galaktozy i D-glukozy, połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym, w warunkach tlenowych jest najpierw importowany przez permeazę (zakodowaną przez gen LAC12, która transportuje galaktozę o niskim powinowactwie). Laktoza jest następnie wprowadzana do glikolizy szlakiem Leloir. Glukoza jest głównie fosforylowana przez pojedynczą heksokinazę (kodowaną przez RAG5). Po wytworzeniu centralnego metabolitu 6-fosforanu glukozy jego dalszy metabolizm różni się znacznie między Kluyveromyces lactis i Saccharomyces cerevisiae (mimo identycznego czasu generacji wynoszącego po 80 min). Saccharomyces cerevisiae 90% zużywanej glukozy metabolizuje w procesie glikolizy, a w komórkach Kluyveromyces lactis jest ona głównie kierowana do szlaku pentozofosforanowego (PP). Niezależnie od przyjętej drogi katabolizmu glukozy, wytworzone fosforany triozy są przekształcane w pirogronian. Poniżej pirogronianu Kluyveromyces lactis, podobnie jak większość innych drożdży i podobnych do komórek ssaczych (w przeciwieństwie do Saccharomyces cerevisiae), opiera się głównie na katabolizmie tlenowym. Zatem Kluyveromyces lactis wykazuje efekt Pasteura, czyli spala glukozę zamiast prowadzić fermentację alkoholową i należy do drożdży negatywnych, jeśli chodzi o proces Crabtree (pozyskiwanie energii na drodze fermentacji w warunkach wysokiego poziomu cukrów i obecości tlenu jest nazywane efektem Crabtree). Acetylo-CoA wytwarzany przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej w mitochondriach wchodzi w cykl TCA, ulega spaleniu do ditlenku węgla z wytworzeniem energii. Należy zauważyć, że Kluyveromyces lactis są drożdżami, które nie mogą przetrwać bez mitochondrialnego DNA i syntezy białek mitochondrialnych. Mogą również wykorzystywać nieulegające fermentacji źródła węgla takie jak glicerol i mleczan. Charakter transportera glicerolu w Kluyveromyces lactis pozostaje do zbadania. Po wejściu do komórki, dwa wewnątrzkomórkowe enzymy są niezbędne do wzrostu na glicerolu, który zawiera cytozolową kinazę glicerolową (kodowaną przez KlGUT1) i mitochondrialną (zależną od FAD) dehydrogenazę glicerolo-3-fosforanową (kodowaną przez KlGUT2). W przypadku mleczanu do tej pory scharakteryzowano trzy geny, których produkty są wymagane do jego wykorzystania, a mianowicie KlJEN1, KlDLD i KlCYB2 (które kodują odpowiednio permeazę i dwie mleczanowe oksydoreduktazy żelazowe). Etanol dyfunduje swobodnie przez błonę plazmatyczną i jest kierowany do cyklu Krebsa przez mitochondrialną dehydrogenazę alkoholową (kodowaną przez KlADH4), przypuszczalnie niektóre dehydrogenazy aldehydowe są kodowane w genomie Kluyveromyces lactis, ale nadal niescharakteryzowane. Glukozo-6-fosforan, niezbędny do wzrostu na nieulegających fermentacji źródłach węgla, jest syntetyzowany u Kluyveromyces lactis przez glukoneogenezę z pominięciem nieodwracalnych etapów glikolitycznych. Sugeruje się, że ten centralny metabolit jest częściowo kierowany z powrotem do PP, aby umożliwić syntezę pentoz i innych istotnych metabolitów. Reakcje anaplerotyczne są zapewnione przez szlak glioksylanowy (GP), z KlICL1 kodującym kluczowy enzym – liazę izocytrynianu.

Ze względu na tradycyjne zastosowanie do produkcji sera Kluyveromyces lactis ma status GRAS, a zatem jest również atrakcyjnym organizmem produkcyjnym w przemyśle spożywczym. Jest on również naturalnym producentem ß-galaktozydazy, która jest używana do usuwania laktozy z mleka przeznaczonego dla konsumentów z nietolerancją laktozy. Ponadto enzym ten jest stosowany w produkcji serów i jogurtów oraz lodów. Zdolność do transglikozylacji β-galaktozydazy można wykorzystać do wytwarzania galaktooligosacharydów (GOS) jako związków prebiotycznych, które, jak się uważa, zmniejszają poziom cholesterolu we krwi i zapobiegają rakowi okrężnicy. GOS są również używane jako niskokaloryczne substraty słodzące. Kluyveromyces lactis posiada także potencjał probiotyczny. Jego zdolność do wykorzystywania laktozy ma również coraz większe znaczenie w usuwaniu odpadów w przemyśle mleczarskim, w którym wytwarzana serwatka stanowi poważny problem środowiskowy ze względu na wysokie obciążenie organiczne. Drożdże te mogą być również wykorzystywane do produkcji białek na dużą skalę w przemyśle farmaceutycznym. W rzeczywistości komórki Kluyveromyces lactis mogą wytwarzać wiele białek o znaczeniu farmaceutycznym. Ssacze białka interleukiny 1-b, interferon α A, β-laktoglobulina, lizozym, czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów, albumina surowicy i prekursor insuliny są pozyskiwane z komórek Kluyveromyces lactis. Mikroorganizm ten jest również skuteczny w wytwarzaniu jednołańcuchowych przeciwciał Fv. Jedyną wadą stosowania Kluyveromyces lactis (i innych systemów ekspresyjnych drożdży i grzybów strzępkowych) do wytwarzania środków terapeutycznych jest to, że wydzielane białka, które ulegają glikozylacji, będą miały inny wzór glikozylacji niż ludzki. Może to niekorzystnie wpływać na okres ich półtrwania i immunogenność białek terapeutycznych. Jednak postępy w dziedzinie humanizowania szlaków glikozylacji białek drożdży przez ekspresję ludzkich enzymów glikozylacji w drożdżach mogą zaowocować obiecującą technologią produkcji białka terapeutycznego, także z wykorzystaniem Kluyveromyces lactis. Ostatecznie potencjał biotechnologiczny Kluyveromyces lactis nie ogranicza się do jego doskonałych możliwości syntezy białek. Niedawno zainteresowano się nimi jako możliwym źródłem białka jednokomórkowego z domniemanymi właściwościami probiotycznymi, a także jako producentem substancji zapachowych, pochodnych nukleotydów. Dodatkowo, Kluyveromyces lactis wytwarza interesujące handlowo natywne enzymy, takie jak inulinazę, fosfolipazę B i chitynazę. Enzym krzepnięcia mleka – chymozynę bydlęcą – można wydzielać z jego komórek.

Serwatka stanowi obecnie tanie źródło węgla do wzrostu drożdży, gdyż cena tradycyjnie używanej melasy znacznie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Ponieważ Saccharomyces cerevisiae nie może utylizować laktozy, geny kodujące permeazę laktozy (LAC12) i ß-galaktozydazę (LAC4) z Kluyveromyces lactis zostały wyrażone heterologicznie. W odniesieniu do Kluyveromyces lactis jako gospodarza do produkcji białek heterologicznych, najbardziej znaczącym przykładem jest wytwarzanie chymozyny, enzymu laboratoryjnego stosowanego do produkcji sera, który tradycyjnie otrzymywano z grasicy cielęcej. Wiele innych enzymów i białek uzyskano z heterologicznych układów ekspresyjnych w Kluyveromyces lactis.

Kluyveromyces lactis z powodzeniem można stosować do wytwarzania na skalę przemysłową zarówno enzymów wydzielanych, jak i wewnątrzkomórkowych oraz wielu różnorodnych białek biologicznie czynnych, jak hormony, przeciwciała, inhibitory, probiotyki itp. Ich listę można znaleźć w pracy Spohnera i wsp. (2016). Od 1991 r. prawie 100 rekombinowanych białek zostało wyprodukowanych przez Kluyveromyces lactis a 20% przez ostatnie dwa lata.

5.13.Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica jest jednym z najdokładniej badanych „niekonwencjonalnych” szczepów drożdży. Jest to mikroorganizm ściśle tlenowy zdolny do wytwarzania ważnych metabolitów i intensywnej aktywności wydzielniczej, co sprawia, że jest wykorzystywany w przemyśle (jako biokatalizator), w biologii molekularnej i badanych genetycznych. Jest uważany za niepatogenny, a kilka procesów z jego udziałem zostało sklasyfikowanych jako bezpieczne (GRAS) przez Food & Drug Administration (FDA, USA). Yarrowia lipolytica służy jako model do badań nad dimorfizmem u drożdży, ponieważ posiada skuteczny system transformacji inżynierii genetycznej i łatwo można odróżnić jego formy morfologiczne. Znany jest system Yarrowia lipolytica do ekspresji heterologicznych białek możliwych do zastosowań komercyjnych.

Istnieje naturalna zdolność drożdży Yarrowia lipolytica do obfitego wydzielania różnych białek z powodu niskiej nadglikozylacji, wysokiej wydajność wydzielania i dobrej wydajność produktu. Jednym z najważniejszych produktów wydzielanych przez Yarrowia lipolytica jest lipaza, enzym wykorzystywany w produkcji detergentów, żywności, w farmacji i ochronie środowiska. Jako że są to drożdże tlenowe, na ich wzrost i wydzielanie metabolitu ma wpływ ilość tlenu dostępnego w podłożu hodowlanym. Wydajność lipazy rośnie wraz z poprawą szybkości transferu tlenu pod zwiększonym ciśnieniem, zapotrzebowanie na tlen jest większe do wytwarzania lipazy niż do wzrostu komórek. Tlen i całkowite ciśnienie odgrywają ważną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowych enzymów, takich jak szlak β-oksydacji biorący udział w biotransformacji kwasu rycynowego w aromat. Oprócz oleju rycynowego, jego pochodne, takie jak rycynooleinian metylu, stosowane jako substraty do produkcji aromatu, okazały się induktorami lipazy w Yarrowia lipolytica. Szczepy Yarrowia lipolytica mogą być hodowane na podłożu zawierającym ścieki z produkcji oliwy do wytwarzania związków o wysokiej wartości. Hodowane w warunkach z ograniczonymi składnikami odżywczymi są w stanie produkować kwas cytrynowy z różnych źródeł węgla, w tym z cukrów, alkanów, olejów roślinnych, hydrolizatów skrobi, etanolu i surowego glicerolu. Wiele szczepów Yarrowia lipolytica wykazuje zdolność do degradacji różnych związków organicznych, w tym węglowodorów alifatycznych i aromatycznych, którym często towarzyszy produkcja biosurfaktantów. Yarrowia lipolytica to wyjątkowe, tlenowe drożdże, zdolne do skutecznej degradacji substratów hydrofobowych, takich jak n-alkany, kwasy tłuszczowe, tłuszcze i oleje, przy udziale specyficznych szlaków metabolicznych. Sekwencje genomu Yarrowia lipolytica ujawniły, że organizm ten jest spokrewniony z konwencjonalnymi drożdżami Saccharomyces cerevisiae. Jednak podstawowe mechanizmy genetyczne wydają się być znacząco różne. Yarrowia lipolytica jest zdolna do degradacji kilku heksoz, takich jak glukoza, fruktoza i mannoza, przenoszonych na teren komórek przy udziale określonych transporterów, czasami nazywanych permeazami. Transport zwykłych monosacharydów, glukozy, fruktozy lub mannozy w Saccharomyces cerevisiae jest ułatwionym procesem dyfuzji. U Yarrowia lipolytica istnieje system transportu glukozy z dwoma składnikami, a ich aktywność jest niezależna od stężenia glukozy w podłożu. Heksozy wewnątrz komórek po fosforylacji przez heksokinazy wchodzą w szlak glikolityczny. Jako że jest to ścisły tlenowiec, wysokie stężenia glukozy nie wpływają na szybkość oddychania, zawartość i stosunek molekularny cytochromów lub właściwości mitochondrialnych u Yarrowia lipolytica. Jednak produkcja lipazy przez Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 podlega represji glukozy, a derepresja nie zależy od obecności induktora. Yarrowia lipolytica typu dzikiego, z powodu braku inwertazy enzymu rozszczepiającego sacharozę, nie wykorzystuje sacharozy. Yarrowia lipolytica wykorzystuje kwasy octowy, mlekowy, propionowy, jabłkowy, bursztynowy, cytrynowy i oleinowy jako jedyne źródło węgla i energii i nie zależy od pH podłoża hodowlanego. W hodowlach na substratach mieszanych, jak np. na glukozie i kwasie cytrynowym lub mlekowym, wykazuje wzrost z diauksją, najpierw jest wykorzystywana glukoza, a po jej wyczerpaniu – kwasy organiczne. Większość szczepów Yarrowia lipolytica rośnie bardzo wydajnie na octanie jako jedynym źródle węgla (optymalne stężenia do 0,4% octanu sodu). Yarrowia lipolytica wykorzystuje etanol jako źródło węgla w stężeniach do 3%. Wyższe stężenia etanolu są toksyczne. Glicerol może być również wykorzystywany jako źródło węgla w warunkach tlenowych przez wiele drożdży, przyswajany w szlakach glicerolo-3-fosforanowym lub dihydroksyacetonowym. Wysokie początkowe stężenie glicerolu w podłożu (40 g/l) z ograniczeniem azotu doprowadziło do produkcji kwasu cytrynowego do wartości 35 g/l (plon 0,42–0,44 g kwasu/g zużytej glicerolu). Drożdże Yarrowia lipolytica są często izolowane z siedlisk zawierających lipidy, takich jak produkty mleczne, zanieczyszczone środowisko i surowy drób, a zwłaszcza z substratów hydrofobowych. Uważa się, że Yarrowia lipolytica żyją w środowisku wodnym, w którym źródło węgla jest hydrofobowe, a zatem są rozproszone w ośrodku w postaci kropel. Kontakt między kroplami oleju a komórkami wydaje się być mechanizmem, przez który transportowana jest większość hydrofobowego podłoża. Obszar kontaktu między mikroorganizmem a podłożem obejmuje duże kropelki substratu, które przylegają do drobnoustroju i małe, które są adsorbowane na powierzchni komórki. Yarrowia lipolytica produkuje bioemulsyfikatory zbudowane z węglowodanów i białek jak liposan, który zawiera odpowiednio z 83% węglowodanów i 17% białek, produkowany konstytutywnie.

Na wzrost i wydzielanie metabolitów wpływają różne czynniki środowiskowe. Ilość tlenu dostępnego dla Yarrowia lipolytica wydaje się być ważnym parametrem. Podczas hodowli ciągłej Yarrowia lipolytica N1 stwierdzono, że zapotrzebowanie tlenu na przyrost biomasy i syntezę kwasu cytrynowego zależy od stężenia żelaza w podłożu. Dodanie perfluorowęglowodorów (PFC – organiczne związki chemiczne z grupy halogenoalkanów, w których wszystkie atomy wodoru zastąpione zostały atomami fluoru) do podłoża hodowlanego Yarrowia lipolytica zwiększa pobór tlenu. Rozpuszczalność tlenu w PFC jest 10–20 razy wyższa niż w wodzie. Stwierdzono wyższe specyficzne szybkości wzrostu Yarrowia lipolytica związane ze wzrostem stężenia PFC i szybkości mieszania. W zużyciu tlenu pośredniczą dwie końcowe oksydazy, oksydaza cytochromowa i alternatywna oksydaza, aczkolwiek w różnym stopniu w różnych fazach wzrostu. Dane wskazują, że system alternatywny nie jest w stanie konkurować z łańcuchem oddechowym cytochromów przy przepływie elektronów. Alternatywna oksydaza przenosi tylko elektrony, które są zbędne dla łańcucha oddechowego. Przed stresem oksydacyjnym bronią takie enzymy jak katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa, dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i reduktaza glutationowa. Pięciokrotny i 3,4-krotny wzrost produkcji biomasy i właściwej szybkości wzrostu Yarrowia lipolytica zaobserwowano w warunkach hodowli z ciśnieniem powietrza poniżej 6 barów.

Oprócz hydrolizy, lipazy mają zdolność katalizowania kilku reakcji o znaczeniu przemysłowym, takich jak estryfikacja, interestryfikacja i transestryfikacja. Z tego powodu są to najpowszechniej stosowane enzymy w syntezie organicznej i mogą być również wykorzystywane do wielu zastosowań przemysłowych, takich jak produkcja detergentów (chemicznych środków powierzchniowo czynnych), w żywności, zwłaszcza do wzmocnienia smaku, do produkcji optycznie czynnych związków dla przemysłu farmaceutycznego lub do oczyszczania ścieków zawierających substancje oleiste. Jednym z obiecujących zastosowań lipazy jest produkcja oleju napędowego biodiesla. Na produktywność lipazy wpływają różne czynniki środowiskowe. Najważniejsze są źródła węgla i azotu. Wykazano, że najlepsze są substraty lipidowe, a glukoza może hamować produkcję enzymów. Pepton jest znacznie lepszym źródłem azotu niż mocznik lub siarczan amonu do produkcji lipazy przez Yarrowia lipolytica UFRJ 50682. Trypton i kwas oleinowy były najbardziej odpowiednimi źródłami azotu i węgla do wytwarzania zewnątrzkomórkowej lipazy przez mutanta Yarrowia lipolytica. Zazwyczaj lipaza wytwarzana przez drożdże pozostaje wewnątrz komórki (związana ze ścianą komórki) i jest wydzielana tylko do podłoża hodowlanego, gdy stosuje się rzadkie źródło węgla w podłożu lub w fazie stacjonarnej. Istotnym parametrem jest również ilość tlenu dostępnego dla mikroorganizmów, ponieważ wielu autorów wykazało zależność produktywności lipazy od systemu napowietrzania. Dodanie nośnika tlenu zwiększa produkcję lipazy 24-krotnie, a wzrost ciśnienia powietrza do 8 barów poprawia szybkość transferu tlenu, a także zwiększa produkcję lipazy przez Yarrowia lipolytica. Szczepy mikroorganizmów należące do tego samego rodzaju lub gatunku mogą wytwarzać różne lipazy, które można wykorzystać do różnych celów. Mutant Yarrowia lipolytica wytwarza lipazę z 35-krotną wyższą aktywnością enzymu niż szczep typu dzikiego. Opisano gen LIP2 odpowiedzialny za całą zewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną Yarrowia lipolytica W29. Zamplifikowany gen LIP2 w komórkach mutanta Yarrowia lipolytica wykazywał aktywność lipazy 26,450 U/ml w hodowlach okresowych i 158,246 U/ml w hodowlach okresowych zasilanych.

Cykliczne estry, jakimi są laktony, odpowiadają za zapach i smak owoców, warzyw, mięsa, grzybów oraz napojów alkoholowych. Ich właściwości zależą przede wszystkim od liczby atomów w pierścieniu, rodzaju podstawników, obecności wiązań nienasyconych oraz konfiguracji centrów stereogenicznych. Na zapach i smak owoców, warzyw i napojów alkoholowych wpływają głównie γ-laktony. Do najpowszechniejszych należą: kumaryna – o zapachu świeżego siana, lakton jaśminowy – o słodkim, kwiatowym zapachu oraz γ-dekalakton. Ten ostatni jest brzoskwiniowym związkiem aromatycznym obecnym w wielu produktach spożywczych i napojach, dlatego przemysł spożywczy chce go pozyskiwać. γ-Dekalakton może być wytwarzany biotechnologicznie przez biotransformację kwasu rycynowego (kwasu 12-hydroksy-oktadeco-9-enowy) katalizowaną przez niektóre drożdże o statusie GRAS, nadającym aromatowi naturalną etykietę. Jednymi z drożdży zdolnych do przeprowadzenia tej biotransformacji są Yarrowia lipolytica. Proces obejmuje biodegradację substratu poprzez β-oksydację, co prowadzi do powstawania kwasu 4-hydroksydekanowego, który przekształca się w γ-dekalaton. Kwas rycynolowy jest hydroksylowanym kwasem tłuszczowym C_18, który w swojej zestryfikowanej postaci jest głównym składnikiem (około 86%) oleju rycynowego. Ten kwas tłuszczowy jest prekursorem stosowanym do wytwarzania γ-dekalaktonu. W niektórych przypadkach substratami procesu są hydrolizaty oleju rycynowego, kwasy tłuszczowe lub estry tych związków, takie jak rycynooleinian metylu. Nagromadzenie γ-dekalaktonu w podłożu zależy od szybkości produkcji i tempa degradacji przez komórki. W obu przypadkach biorą udział szlak β-oksydacyjny i kilka związków (3-hydroksy-γ-dekalakton, dec-2-en-4-olid i dec-3-en-4-olid), wychodząc z bezpośredniego prekursora γ-dekalaktonu (kwas 4-hydroksydekanowy). Oprócz dobrze ugruntowanych gatunków grzybów strzępkowych drożdże Yarrowia lipolytica wykazują zdolność do wytwarzania i wydzielania wielu różnych kwasów organicznych, w tym półproduktów cyklu TCA, takich jak kwas cytrynowy, kwas izocytrynowy, kwas α-ketoglutarowy i kwas pirogronowy (tab. 5.7). Źródłami węgla stosowanymi w tych procesach są n-alkany, oleje roślinne, etanol, melasa i hydrolizowana skrobia w warunkach ograniczonego wzrostu spowodowanych przez różne czynniki odżywcze, takie jak źródło azotu, tiamina, fosforan lub związki mineralne (magnez, siarka). W warunkach limitowania azotu dochodzi do wydzielania kwasu cytrynowego i izocytrynowego, natomiast ograniczenie tiaminy (witaminy niesyntetyzowanej przez Yarrowia lipolytica, ale niezbędne dla aktywności dehydrogenazy α-acetoglutaranowej), przy niższym pH, prowadzi głównie do α-ketoglutaranu (20–25%) i kwasu pirogronowego (75–80%).

Tabela 5.7. Kwasy organiczne/alkohole produkowane przez Yarrowia lipolytica

Substrat

Kwas organiczny

Wydajność (g/l)

Plon (w %)

Lit.

wazelina

α-ketoglutarowy

109

120

[1]

glicerol

pirogronowy

61

71

wazelina

cytrynowy + izocytrynowy

102

142

etanol

izocytrynowy

66

66

wazelina

cytrynowy

217

145

etanol

cytrynowy

120

88

glicerol

bursztynowy

43

–

[2]

glicerol

α-ketoglutarowy

46,7

–

[3]

glicerol

pirogronowy

12,3

–

glicerol

pirogronowy

30,4–35,8

–

[4]

glicerol

α-ketoglutarowy

14,4–17,9

–

glicerol

erytritol

59–63

0,37–0,41

[5]

glukoza

erytritol

27,8

0,215

[6]

[1] Finogenova i wsp. 2005. Appl. Biochem .Microbiol., 41: 418–425. [2] Gao i wsp. 2016. Biotechnol. Biofuels, 9: 179. [3] Guo i wsp. 2015. Scientific Reports, 5: 8183. DOI: 10.1038/srep08138. [4] Cybulski i wsp. 2013. Acta Sci. Pol. Biotechnologia, 12: 5–14. [5] Tomaszewska i wsp. 2011. Acta Sci. Pol. Biotechnologia, 10: 15–28. [6] Ghezelbash i wsp. 2012. Jundishapur J. Microbiol., 5: 546–549.

Yarrowia lipolytica także została skonstruowana jako fabryka komórkowa do produkcji kwasu cytrynowego. Obecnie roczna produkcja kwasu cytrynowego wynosi około 1,6 mln ton. Jego produkcja we wszystkich krajach rozwiniętych jest zgodna z konwencjonalną procedurą, która obejmuje stosowanie Aspergillus niger (jako producenta) i melasy (jako substratu). Konwencjonalna produkcja kwasu cytrynowego jest procesem złożonym i niebezpiecznym ekologicznie ze względu na właściwości użytego surowca. W całym procesie stosuje się stężone kwasy i zasady, a zrzut odpadów do środowiska (zawierających cyjanki i gips) jest niebezpieczny. Ze względu na ekologiczne problemy procesu produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger, interesujące jest opracowanie alternatywnych procesów wykorzystujących drożdże jako organizmy produkujące. Produkcja kwasu cytrynowego przy użyciu Yarrowia lipolytica miałaby kilka dodatkowych zalet w porównaniu z procesem prowadzonym przez Aspergillus niger, w tym większą różnorodność substratów (możliwy byłby wybór tanich substratów), mniejszą wrażliwość na niskie stężenia rozpuszczonego tlenu i metale ciężkie oraz wyższą wydajność produktu. Wadą stosowania szczepów Yarrowia lipolytica typu dzikiego do produkcji kwasu cytrynowego jest wydzielanie kwasu izocytrynowego jako produktu ubocznego procesu. Zanieczyszczenia kwasem izocytrynowym w ilości powyżej 5% wytworzonego kwasu cytrynowego zakłócają krystalizację kwasu cytrynowego podczas procesu oczyszczania. W tabeli 5.8 przedstawiono przegląd danych dotyczących produkcji kwasu cytrynowego.

Tabela 5.8. Wydajność produkcji kwasu cytrynowego przez szczepy Yarrowia lipolytica

Szczep

Źródło węgla

Wydajność (g/l)

Plon (g/g)

Lit.

NRRL-Y1095

glukoza

50

0,61

[1]

H222

glukoza

62

0,37

[2]

N15 (M)

olej słonecznikowy

150

1,32

[3]

AWG7 (M)

glicerol

157,5

–

[4]

W1.31

glicerol

82

0,53

[5]

NG40/UV7

glicerol

115

0,64

[6]

A-101-1.22

glicerol surowy

124,2

–

[7]

H181

olej rzepakowy

198

1,16

[8]

H222-S4(p671CL1)

sacharoza

127–140

0,75–0,82

[9]

NG40/UV5

olej rzepakowy

140

1,5

[10]

[1] Rane i Sims. 1996. Biotechnol Lett., 18: b1139–1144. [2] Moelier i wsp. 2010. Eng. Life Sci., 10: 311–320. [3] Kamzolova i wsp. 2008. Food Technol. Biotechnol., 46: 51–9. [4] Rywińska i wsp. 2010. World J. Microbiol. Biotechnol., 26: 1217–1224. [5] Rywińska i wsp. 2010. World J. Microbiol. Biotechnol., 26: 1217–1224. [6] Morgunov i wsp. 2013. Appl Microbiol. Biotechnol., 97: 7387–7397. [7] Rymowicz i wsp. 2010. Appl Microbiol Biotechnol., 87: 971–979. [8] Aurich i wsp. 2003. Biotechnol. Adv., 21: 454–455. [9] Forster i wsp. 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 1409–1417. [10] Morgunov i wsp. 2018. Fermentation, 4: 36.

Glicerol jest ważnym surowcem odnawialnym, głównym produktem ubocznym procesu produkcji biodiesla, który jest obecnie stosowany na dużą skalę. Ponadto glicerol wytwarza się w kilku innych gałęziach przemysłu, takich jak zmydlanie tłuszczu i produkcja napojów alkoholowych. U eukariotów glicerol przekształca się w związki pośrednie szlaku glikolitycznego w procesie fosforylacji, w którym zachodzi bezpośrednia fosforylacja do glicerolo-3-fosforanu, a następnie odwodornienie glicerolu i następcza fosforylacja produktu reakcji. Produktem tych reakcji jest fosforan dihydroksyacetonu, który można przekształcić w kwas cytrynowy i inne produkty. Można wyróżnić trzy różne fazy wzrostu Yarrowia lipolytica na glicerolu, mianowicie fazę produkcji biomasy, fazę lipogeniczną i fazę produkcji kwasu cytrynowego. Wykryto różne aktywności enzymów: dehydrogenazy izocytrynianowej zależnej od NAD+ (NAD+-ICDH) podczas produkcji biomasy i znaczące obniżenie aktywności w fazie lipogenezy. Co zaskakujące, produkcji kwasu cytrynowego towarzyszyła synteza lipidów, takich jak glikolipidy, sfingolipidy i fosfolipidy. Tak więc Yarrowia lipolytica z powodzeniem przekształca glicerol przez szlak fosforylacji w cenne produkty biotechnologiczne, takie jak olej (single cell oil) i kwas cytrynowy.

Wiadomo, że niewiele spośród mikroorganizmów jest w stanie wytwarzać znaczną ilość ciał lipidowych wewnątrz komórek na poziomie ponad 20% ich biomasy – opisuje się je jako drożdże oleiste. Najbardziej znane drożdże oleiste należą do rodzajów Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon i Yarrowia. Mikroorganizmy oleiste mają różne mechanizmy generowania acetylo-CoA, niezbędnego prekursora biosyntezy kwasów tłuszczowych. Kluczem do tego procesu jest wyczerpywanie się substancji odżywczych z pożywki, zwykle azotu, co zmienia proces metabolizmu komórkowego. W tym przypadku aktywowana deaminaza AMP (monofosforan adenozyny) katalizuje transformację AMP w IMP (inozyna 5’-monofosforan) i amoniaku. Aktywacja deaminazy AMP zmniejsza stężenie mitochondrialnego AMP i zwiększa komórkowe stężenie amonu. Zmniejszenie stężenia AMP powoduje hamowanie dehydrogenazy izocytrynianowej, blokując cykl kwasu cytrynowego na poziomie izocytrynianu, a akonitaza pośredniczy w akumulacji cytrynianu w mitrochondriach. Następnie cytrynian pochodzący z mitochondriów jest cięty przez liazę ATP-cytrynian w cytozolu, dostarczając acetylo-CoA w dużych ilościach do syntezy kwasów tłuszczowych. Enzym ten nie występuje w drożdżach nieoleistych, takich jak Saccharomyces cerevisiae, ale wykazano, że jest obecny w Yarrowia lipolytica. Akumulację ciał lipidowych LB obserwowano podczas hodowli Yarrowia lipolytica w środowisku kwasów tłuszczowych lub triglicerydów (nawet od 37 do 70% biomasy). Skumulowane lipidy Yarrowia lipolytica mają interesujący skład kwasów tłuszczowych: 14,7–23,1% kwasu palmitynowego (16 : 0), 47,1–68,3% kwasu stearynowego (18 : 0), 6,9–18,2% kwasu oleinowego (18 : 1) ) i 2,2–8,9% kwasu linolenowego (18 : 2).

5.14.Pichia pastoris

Drożdże metylotroficzne Pichia pastoris, obecnie sklasyfikowane jako Komagataella pastoris, stały się istotnym „workhorse” w biotechnologii, zwłaszcza w heterologicznej produkcji białek. Komórki Pichia pastoris zostały wprowadzone ponad 40 lat temu przez Phillips Petroleum do komercyjnej produkcji białka (SCP) jako dodatku do paszy dla zwierząt w procesie fermentacji z metanolem jako źródłem węgla. W latach 80. ubiegłego wieku zastosowano Pichia pastoris jako heterologiczny system ekspresji białek przy użyciu silnego promotora AOX1. W połączeniu z już opracowanym procesem fermentacji do produkcji SCP, promotor AOX1 zapewniał wyjątkowo wysoki poziom heterologicznych białek. Jednym z pierwszych procesów przemysłowych na dużą skalę ustanowionych w latach 90. była produkcja enzymu liazy hydroksynitrylowej pochodzenia roślinnego z wydajnością ponad 20 g/l rekombinowanego białka. Enzym ten jest stosowany jako biokatalizator do produkcji m-fenoksybenzaldehydu cyjanohydryny – budulca syntetycznych piretroidów – w skali technicznej. Ważnym przełomem była publikacja szczegółowych sekwencji genomu oryginalnego szczepu produkcyjnego SCP CBS7435, pierwszego szczepu stosowanego do ekspresji białek heterologicznych Pichia pastoris GS115, a także Pichia pastoris DSMZ 70382. Równie ważne dla komercyjnego zastosowania komórkowej fabryki Pichia pastoris było nadanie przez Food & Drug Administration (FDA) statusu GRAS białka SCP stosowanego w paszach dla zwierząt, fosfolipazy C, oraz zatwierdzenie przez FDA rekombinowanego produktu biofarmaceutycznego Kalbitor®, inhibitora kalikreiny (grupy peptydaz wchodzących w skład rodziny enzymów proteolitycznych należących do proteaz serynowych).

W ciągu ostatnich 15 lat drożdże metylotroficzne Pichia pastoris z powodzeniem stosuje się jako system do produkcji różnych białek heterologicznych. Rosnąca popularność tego konkretnego systemu ekspresyjnego może być przypisana kilku czynnikom, przede wszystkim:

1. 1) prostocie technik potrzebnych do molekularnej manipulacji genetycznej Pichia pastoris i ich podobieństwa do Saccharomyces cerevisiae, jednego z najbardziej charakterystycznych systemów eksperymentalnych we współczesnej biologii;

2. 2) zdolność Pichia pastoris do wytwarzania obcych białek na wysokim poziomie, wewnątrzkomórkowym lub zewnątrzkomórkowym;

3. 3) zdolność do wykonywania wielu eukariotycznych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, tworzenie wiązań disiarczkowych i obróbka proteolityczna;

4. 4) dostępność systemu ekspresyjnego jako zestawu w handlu.

System ekspresji Pichia pastoris jest stosowany w przemyśle, czego wyrazem jest liczba opublikowanych patentów dotyczących ekspresji heterologicznej w Pichia pastoris i inżynierii metabolicznej. Produkty uzyskane przez ekspresję heterologiczną w Pichia pastoris znalazły się na rynku, jak pokazuje lista biofarmaceutyków lub enzymów przemysłowych zatwierdzonych przez FDA (tab. 5.9 i 5.10). Biofarmaceutyki są ważnym sektorem współczesnej medycyny. Należą do nich białka terapeutyczne, w tym hormony, szczepionki, interferon, hormony wzrostu i przeciwciała specjalnie sklasyfikowane jako biofarmaceutyki białkowe.

Tabela 5.9. Przykłady heterologicznych białek farmaceutycznych produkowanych przez szczepy Pichia pastoris

Produkt

Wydajność produkcji

Szczepy Pichia

Lit.

hormony

insulina ludzka

4,0 g/l

X-33

[1]

insulina ludzka

2,6 g/l

GS-115

[2]

ludzki hormon przytarczyc

300 mg/l

Szczep Pichia

[3]

przeciwciała

ludzkie przeciwciało anty-αIIbβ3 (HuAb)

30 mg/l

X-33

[4]

IgG (ScFv fragment)

60 mg/l

X-33

[5]

monoklonalne przeciwciała (mAbs)

1,0 g/l

Zmodyfikowany szczep Pichia

[6]

IgG

148–227 mg/l

YGLY27435/YGLY27431

[7]

MAb pełnej długości

0,5 g/l

Zmodyfikowany szczep YGLY18483

[8]

szczepionki

HBsAg

6–7 g/l

GS115

[9]

rekombinowana HINI grypy

60 mg/l

His+ szczep Pichia

[10]

białko HCV E1E2

35 mg/l

SMD 1168

[11]

cytokininy

rekombinowana ludzka interleukina-6

280 mg/l

X-33

[12]

rekombinowana ludzka interleukina-3

26 mg/l

X-33

[13]

rekombinowany bydlęcy interferon α1

0,2 mg/l

GS115

[14]

inne białka

ludzki plazminogen

510 mg/l

GS115

[15]

rekombinowana ludzka erytropoetyna (rhEPO)

150 mg/l

X-33

[16]

białko fuzyjne ludzkiej albuminy

275 mg/l

Pichia pastoris

[17]

angiogenina

30 mg/l

Gs115

[18]

[1] Gurramkonda i wsp. 2010. Microbial Cell Factories, 9: 31. [2] Polez i wsp. 2016. PLOS One, 11: e0167207. [3] Vad i wsp. 2005. J. Biotechnol., 116: 251–260. [4] Vallet-Courbin i wsp. 2017. PLOS One, 12: e0170305. [5] Cai i wsp. 2009. Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 41–48. [6] Barnard i wsp. 2010. J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 37: 961–971. [7] Chen i wsp. 2012. Microbial Cell Factories, 11: 91. [8] Shaheen i wsp. 2013. PLOS One, 8: e70190. [9] Gurramkonda i wsp. 2009. Microbial Cell Factories, 8: 13. [10] Athmaram i wsp. 2011. Virology J., 8: 524. [11] Cai i wsp. 2010. Antiviral Res., 88: 80–85. [12] Tripathi i wsp. 2015. Front. Microbiol., 6: 1005. [13] Li i wsp. 2011. Protein Express. Purif., 80: 185–193. [14] Shao i wsp. 2015. J. Interferon Cytokine Res., 35: 168–175. [15] Liu i wsp. 2015. BMC Biotechnol., 15: 50. [16] Maleki i wsp. 2010. Avicenna J. Medical Biotechnol., 2: 197–206. [17] Zhu i wsp. 2012. Protein Express. Purif., 85: 32–37. [18] Xia i wsp. 2012. Biosci. Biotechnol. Biochem., 76: 1384–1388.

Tabela 5.10. Przykłady enzymów przemysłowo istotnych produkowanych przez Pichia pastoris

Enzym

Pochodzenie genów

Szczep Pichia

Wydajność

Lit.

ksylanaza

Bacillus pumilus

GS115

6,400 U/ml

[1]

proteaza neutralna

Aspergillus oryzae

GS115

12,9 mg/ml

[2]

proteaza serynowa

Trichoderma koningii

GS115

3,2 g/l

[3]

proteaza alkaliczna

Aspergillus oryzae

GS115

513 mg/l

[4]

α-amylaza

Bacillus licheniformis

GS115

8,3 g/l

[5]

glukoamylaza

Rhizomucor pusillus

KM71/9KGla

1237 U/ml

[6]

lipaza

Aureobasidium melanogenum

X-33

3,8 U/ml

[7]

lipaza

Yarrowia lipolytica

GS115

2,82 g/l

[8]

lipaza

Burkholderia cepacia

GS115

184,3 U/ml

[9]

fitaza

Peniophora lycii

KM71

12,2 g/l

[10]

fitaza

Citrobacter amalonaticus

GS115

9,58 g/l

[11]

laktaza

Trametes versicolor

GS115

11,97 U/ml

[12]

laktaza

Botrytis aclada

X33

495 mg/l

[13]

celulaza

Trichoderma reesei

GS115

6,55 g/l

[14]

β-glukozydaza

Trichoderma reesei

GS115

60 U/ml

[15]

trypsyna

Streptomyces griseus

GS115

47,4 U/ml

[16]

liaza pektynianowa

Bacillus subtilis 168

GS115

271 U/ml

[17]

peroksydaza

Trachycarpus fortunei

GS115

112 U/mg

[18]

galaktozydaza

Aspergillus niger

KM71H

1299 U/ml

[19]

[1] Lu i wsp. 2016. Scientific Reports, 6: 37869. [2] Ma i wsp. 2016. Protein Express. Purif., 128: 52–59. [3] Shu i wsp. 2016. Enzyme Microbial Technol., 92: 56–66. [4] Guo i wsp. 2008. Protein Express. Purif., 58: 301–308. [5] Wang i wsp. 2015. BioMed Res. Intern., 2015. 248680. [6] He i wsp. 2014. BMC Biotechnol., 14: 114. [7] Wongwatanapaiboon 2016. Biosci. Biotechnol. Biochem., 80: 2231–2240. [8] Zhou i wsp. 2015. Enzyme Microbial Technol., 71: 66–72. [9] Jia i wsp. 2010. Acta Microbiol. Sinica, 50: 1194–1201. [10] Xiong i wsp. 2006. Appl. Microbiol. Biotechnol., 72: 1039–1047. [11] Li i wsp. 2015. BMC Biotechnol., 15: 88. [12] Li i wsp. 2014. Appl. Biochem. Microbiol., 50: 140–147. [13] Kittl i wsp. 2012. Bioengineered, 3: 232–235. [14] Mellitzer i wsp. 2012. Microbial Cell Factories, 11: 61. [15] Chen i wsp. 2011. Biotechnol. Letters, 33: 2475–2479. [16] Zhang i wsp. 2016. Sci. Reports, 6: 23158. [17] Wang i wsp. 2017. Chinese J. Biotechnol., 33: 2017–2027. [18] Wen i wsp. 2017. J Agric Food Chem., 65: 4676–4682. [19] Zheng i wsp. 2016. PLOS One, 11: e0161529.

Enzymy lityczne produkowane przez Pichia pastoris są szeroko stosowane w różnych gałęziach przemysłu, takich jak przemysł spożywczy, farmaceutyczny, papierniczy, tekstylny, do produkcji detergentów i napojów.

Strona internetowa www.pichia.com zawiera listę białek produkowanych przez Pichia pastoris z komercyjnym systemem ekspresji licencjonowanym przez Research Corporation Technologies (RCT) i ich zastosowania. Są to:

1. 1) fitaza, stosowana jako dodatek do paszy dla zwierząt do hydrolizy fitynianu pochodzenia roślinnego, będąca w pokarmie źródłem fosforanu;

2. 2) trypsyna, stosowana np. jako proteaza w badaniach proteomicznych w celu uzyskania wzorców peptydowych do analizy MS;

3. 3) reduktaza azotanowa, stosowana do oceny jakości wody oczyszczonej i pitnej;

4. 4) fosfolipaza C, stosowana do odśluzowywania olejów roślinnych i kolagenu stosowanego w badaniach medycznych jako wypełniacz skórny;

5. 5) proteinaza K.

Jeśli chodzi o biofarmaceutyki produkowane w komórkach Pichia pastoris, znanym przykładem jest Kalbitor® (Ecallantide), który jest inhibitorem kalikreiny osoczowej wskazanym przeciwko dziedzicznemu obrzękowi naczynioruchowemu. Ten produkt był pierwszym biofarmaceutykiem, który został zatwierdzony przez FDA do wprowadzenia na rynek w 2009 r.

Jak można się dowiedzieć ze strony internetowej RCT (www.rctech.com), Pichia pastoris produkuje lek niedawno zatwierdzony przez FDA i Komisję Europejską jako Jetrea®, stosowany w leczeniu objawowej adhezji witreomakalnej. Indyjska firma Biocon dostarcza inne produkty pochodzące z Pichia pastoris – rekombinowaną ludzką insulinę i jej analogi (insulina, Glargine). W 2008 r. firma Novozymes opracowała wysoce aktywny środek przeciwdrobnoustrojowy, który otrzymał nazwę Plectasin NZ2114. Może to być pierwszy peptyd przeciwdrobnoustrojowy dopuszczony do obrotu w przyszłości, chociaż nie zatwierdzono go do użytku medycznego. Wiele produktów będących na rynku służy do celów badawczych. Inne produkty to rekombinowane cytokiny i czynniki wzrostu, takie jak ludzki HSA-IFN-alfa 2b, ludzki czynnik komórek macierzystych SCF, mysi TNF-α i owczy IFN-τ. Rekombinowaną ludzką angiostatynę z Pichia pastoris można znaleźć np. w odczynnikach oferowanych przez Sigma Aldrich.

5.15.Hansenula polymorpha

Większość badań nad tym mikroorganizmem przeprowadzono na trzech szczepach:

1. 1) Hansenula polymorpha CBS 4732 (synonimy ATCC34438, NRRL-Y-5445, CCY38-22-2) został wyizolowany w 1959 r. przez de Morais i Maia z gleby nawadnianej ściekami z gorzelni w Pernambuco w Brazylii. Niemniej historia gatunku jest starsza.

2. 2) Hansenula angusta NCYC495 (synonimy CBSi976, ATCCi4754, NRRL-Y-I789, VKM-Y-I397) to wcześniejszy szczep, który został wyizolowany z soku pomarańczowego w latach 30. ubiegłego wieku i zmieniony na Hansenula polymorpha. Epitet „polymorpha” odzwierciedla zmienny wygląd kolonii. Kolonie haploidalne i diploidalne mogą być różnicowane kolorem, wielkością i rozmieszczeniem komórek. Kolonie dwóch ploidów różnią się intensywnością różowego koloru (z powodu askospor), gdy hodowle na płytkach agarowych mają około sześciu dni, ponieważ diploidy sporulują szybciej niż haploidy.

3. 3) Hansenula polymorpha DL-1 (synonimy ATCC26oi2, NRRL-Y-756o) jest doskonałym gatunkiem do wykazywania konwersji jednej ploidalności w drugą. Kolejne izolaty pochodzą z muszek owocowych, przewodu pokarmowego trzody chlewnej, z pozostałości oliwek, z larw, które żywiły się żołędziami, gnijących kaktusów (Opuntia) Teksasu i pustyni Australii. Wyizolowano także szczep Hansenula polymorpha z gleby w hodowli prowadzonej w chemostacie na podłożu z metanolem w wyższej temperaturze wzrostu (37–40°C, z maksymalną temperaturą wzrostu 48°C) w warunkach silnego napowietrzania, przy stężeniu tlenu bliskiemu połowie nasycenia powietrzem. Stała substratu dla rozpuszczonego tlenu kilku szczepów drożdży asymilujących metanol, w tym Hansenula spp. wynosi 0,5–1,3 mg O_2/l, gdy komórki asymilują metanol, a poniżej 0,15 mg O_2/l, gdy asymilują etanol lub substrat endogenny.

Hansenula polymorpha na podłożach zestalonych tworzy od białych do kremowych kolonii i nie wytwarza strzępek. Rośnie na podłożach z różnymi związkami organicznymi jak metanol, etanol, mannitol, glukoza, trehaloza i innych w temp. od 20 do 45°C i pH w zakresie od 2,5 do 6,0. Pewne szczepy mogą rosnąć w temp. 49°C. Rosnąc w wyższych temperaturach kumulują trehalozę, która jest wymagana do uzyskania tolerancji termicznej. Szczep CBS4732 został zsekwencjonowany, a cała informacja genetyczna znajduje się na sześciu chromosomach. Około 82% sekwencji otwartych ramek to sekwencje znanych białek. Średnia wielkość genu to 1,5 kilo par zasad z 440 aminokwasami w białku. Zsekwencjonowano także genom mitochondrialny, który zawiera geny kodujące podjednostki 24 tRNA oraz 19 białek. Pierwszym enzymem jest oksydaza nadtlenku związana z FAD wytwarzajaca nadtlenek wodoru utleniający metanol do formaldehydu, który jest dalej utleniany przy udziale dehydrogenaz formaldehydowej i mrówczanowej. Jak się okazuje, oksydaza metanolowa i katalaza znajdują się w peroksyzomach, jeśli komórki Hansenula polymorpha są hodowane na podłożu z metanolem. Komórki Hansenula polymorpha są dobrze przystosowane do wzrostu w temp. do 48°C (częściowo w zależności od źródła węgla wykorzystywanego do wzrostu). Hansenula polymorpha jest w stanie rosnąć w obecności bardzo wysokich stężeń różnych metali ciężkich, które są toksyczne dla innych organizmów. Komórki rosnące na podłożach zawierających wanad mają znacznie podwyższone ilości polifosforanów w wakuolach. Komórki Hansenula polymorpha są bardziej oporne na jony kadmu (Cd2+) w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae. Oporność ta silnie zależy od stosowanego źródła węgla. Najbardziej oporne na Cd2+ są komórki hodowane w pożywkach zawierających glukozę, a najbardziej wrażliwe, gdy w pożywkach jedynym źródłem węgla i energii jest metanol. Hansenula polymorpha (Pichia angusta), która naturalnie kolonizuje tkanki roślin, była brana pod uwagę jako czynnik biologicznej kontroli skierowany przeciwko chorobom owoców w okresie ich przechowywania powodowanych przez inne patogeny. Podczas wzrostu na podłożu z metanolem wytwarza ona duże ilości peroksysomów, a właśnie metanol pojawia się w czasie degradacji pektyn obecnych w owocach. Hansenula polymorpha kontroluje rozwój takich patogenów, jak Penicillium expansum tworzący niebieską pleśń, Botryotinia fuckeliana powodujący gnicie oraz Monilinia fructicola powodujący brązową zgniliznę. Izolaty Hansenula redukowały brązową zgniliznę jabłek w zakresie od 86 do 100%. Hansenula polymorpha w krajach azjatyckich jest stosowana do tradycyjnej fermentacji żywności oraz napojów.

W ciągu ostatnich dwudziestu lat fakultatywne metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha zostały wykorzystane i ulepszone jako „uniwersalne komórkowe fabryki” do produkcji białek heterologicznych. Hansenula polymorpha produkuje bardzo dużą biomasę komórek w bioreaktorach w hodowlach prowadzonych na niedrogich podłożach fermentacyjnych. Posiada stabilne narzędzia genetyczne, takie jak silne promotory regulacyjne i konstytutywne, które w konsekwencji dają wysoką wydajność produkowanego metabolitu. Systemy ekspresji na ogół wymagają stosownego układu wektor/gospodarz, któremu towarzyszy zjawisko transformacji. Opisano wiele nadekspresywnych i wytwarzanych w tych konkretnych drożdżach obcych białek. Niektóre przemysłowe procesy produkcyjne zostały wprowadzone do celów komercyjnych. Heterologiczna produkcja pożądanego polipeptydu silnie zależy od maszynerii ekspresji genów gospodarza, która obejmuje procesy biologiczne, takie jak transkrypcja, translacja, modyfikacje posttranslacyjne lub wydzielanie. Dostarczanie aminokwasów jako elementów budulcowych do polimeryzacji polipeptydów na rybosomach jest niezbędne do utrzymania procesów komórkowych, a ponadto do zapewnienia wystarczającej puli do produkcji białek heterologicznych. Wykazano, że geny kodujące enzymy biosyntezy aminokwasów są wiarygodnymi narzędziami selekcji w systemach eukariotycznych wektor/gospodarz, a zatem są wybitnymi kandydatami do tworzenia nowych wektorów w procesach biotechnologicznych opartych na drożdżach. Obecna wiedza na temat biosyntezy aminokwasów w komórkach Hansenula polymorpha jest ograniczona. W przeciwieństwie do ssaków, grzyby są na ogół zdolne do syntezy de novo wszystkich 20 aminokwasów białkowych. Hansenula polymorpha jest w stanie rosnąć na podłożu bez aminokwasów. Aminokwasy służą nie tylko jako budulec dla polipeptydów, ale także, zwłaszcza u grzybów, jako prekursory metabolitów wtórnych. Godną uwagi cechą Hansenula polymorpha jest znaczny wzrost peroksysomów w hodowli na metanolu, co pozwala na wysoką zdolność przechowywania rozpuszczalnych białek. Brak enzymów modyfikujących białko w matrycy peroksysomów zapewnia również korzystny rozwój białek heterologicznych, które są podatne na degradację proteolityczną. Oprócz zastosowania w produkcji szczepionek, Hansenula polymorpha jest również stosowana w produkcji ludzkiej hemoglobiny przy zastosowaniu pojedynczego wektora ekspresyjnego. Hansenula polymorpha została wykorzystana jako gospodarz do bardzo silnej ekspresji heterologicznych białek o znaczeniu rynkowym.

Pojawienie się technologii aranżacji genów dostarczyło nowych i skutecznych metod bezpiecznej i wydajnej produkcji farmaceutyków. Wczesne przykłady obejmują ludzki hormon wzrostu i insulinę wytwarzane w rekombinowanych szczepach Escherichia coli. Do najważniejszych dostępnych rekombinowanych farmaceutyków produkowanych przez drożdże należą szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B oparte na cząstkach zawierających antygen zapalenia wątroby typu B. Sukces obecnych programów szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B jest bezpośrednim wynikiem opracowania skutecznych szczepionek rekombinowanych pochodzących z drożdży. Początkowo produkcja takich szczepionek była ograniczona do drożdży Saccharomyces cerevisiae, ale dzięki ulepszeniom metod biotechnologicznych opracowano wiele nowych systemów ekspresyjnych. W szczególności stwierdzono, że metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha wykazują wiele lepszych właściwości ekspresyjnych i są obecnie wykorzystywane w produkcji kilku szczepionek przeciwko różnym podtypom wirusowego zapalenia wątroby typu B. Posiada również właściwości termotolerancyjne, dzięki czemu nadaje się do produkcji rekombinowanych białek, takich jak IFN-2α, IL-6, rekombinowana ludzka albumina surowicy, oksydaza glukozowa i katalaza (tab. 5.11).

Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) został zidentyfikowany w surowicy jako czynnik sprawczy zapalenia wątroby w 1970 r., wówczas gdy odkryto antygen australijski jako białko surowicy specyficzne dla Aborygenów w Australii. Antygen australijski okazał się białkiem powierzchniowym HBV wydzielanym do krwiobiegu zakażonych pacjentów w dużym nadmiarze w stosunku do cząstek wirusowych. Stwierdzono, że HBV występuje endemicznie w wielu częściach świata. Uszkodzenie hepatocytów (komórki wątroby) zakażonych HBV nie jest spowodowane przez sam wirus, ale przez odpowiedź gospodarza, np. przez sygnały apoptyczne (sygnały śmierci) za pośrednictwem receptora CD95 z naciekających cytotoksycznych limfocytów T (CTL) (odpowiedzialnych za komórkową odpowiedź odpornościową). Tak więc, zakażenie hepatocytów pośrednio indukuje apoptozę. Stopień śmierci komórek w zakażonej wątrobie pozornie zdrowego przewlekłego nosiciela może być ogromny bez objawów choroby wątroby. Oszacowano, że dziennie jest zabijanych 0,3–3% wszystkich hepatocytów wątroby i trzeba je uzupełniać. Około 90% zakażonych dorosłych całkowicie odzyskuje zdrowie po pozornym lub niewidocznym zapaleniu wątroby i uważa się ich za wyleczonych. Jednak u 10% zakażonych zdrowych dorosłych i u 90% noworodków rozwija się przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu B (antygenemia SHBs przez ponad 6 miesięcy) i po długotrwałym zakażeniu wirusem zapalenia wątroby typu B ostatecznie następuje marskość wątroby. Bez wcześniejszej marskości wątroby jest możliwy rozwój raka komórek wątroby (HCC). Pomimo powodzenia szczepień przeciwko HBV pozostaje ok. 350 mln przewlekłych nosicieli, którzy są narażeni na ryzyko śmierci z powodu marskości wątroby lub raka związanego z HBV. Dla tych osób stosuje się terapię interferonem i analogami nukleozydów przeciwwirusowych.

Tabela 5.11. Przykładowe metabolity produkowane przez konstrukty Hansenula polymorpha

Grupy organizmów

Dawcy genów

Geny

Lit.

wirusy

wirus T4

lizozym

[1]

wirus brodawczaka ludzkiego

białko L1

[2]

rotawirus

białko VP6

[3]

bakterie

Escherichia coli

b-laktamaza

[4]

b-galaktozydaza

[5]

Staphylococcus aureus

stafylokinaza (SAK)

[6]

grzyby

Schwanniomyces occidentalis

glukoamylaza

[7]

Saccharomyces cerevisiae

inwertaza

[8]

Saccharomyces cerevisiae

katalaza T

[9]

Aspergillus niger

oksydaza glukozowa

[10]

Aspergillus niger

fitaza

[11]

Yarrowia lipolytica

lipaza

[12]

Candida utilis

urikaza

[13]

rośliny

szpinak

oksydaza glikolanowa

[14]

melon

dehydrogenaza jabłczanowa

[15]

owies

fitochrom

[16]

zwierzęta

pijawka lekarska

hirudyna

[17]

wół

aprotynina

[18]

homo

człowiek

HbsAg (M)

[19]

HbsAg (S, S/L)

[20]

hemoglobina

[21]

H-lipaza

[22]

h-peroksydaza tyroidowa

[23]

h-urokinaza

[24]

α1 antytrypsyna

[25]

albumina surowicy ludzkiej (HSA)

[26]

[1] Wang i wsp. 2011. Sci. China Life Sci., 54: 520–526. [2] Li i wsp. 2009. Chin. J. Biotech., 25: 1516–1523. [3] Bredell i wsp. 2016. FEMS Yeast Res., 16: fow001. [4] Janowicz i wsp. 1988. Yeast, 4S: 155. [5] Brito i wsp. 1999. Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 23–29. [6] Moussa i wsp. 2012. BMC Biotechnol., 12: 96. [7] Gellissen i wsp. 1991. Biotechnol., 9: 291–295. [8] Narciandi i wsp. 1995. Biotechnol. Letteers, 17: 949–952. [9] Gellissen i wsp. 1996. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46: 46–54. [10] Hodgkins i wsp. 1993. Yeast, 9: 625–635. [11] Kumari i wsp. 2015. Protein Expr. Purif., 110: 138–144. [12] Chen i wsp. 2008. Appl. Microbiol. Biotechnol., 79: 545–554. [13] Gellissen i wsp. 1991. Biotechnol., 9: 291–295. [14] Mayer i wsp. 1999. Biotechnol. Bioeng., 63: 373–381. [15] Faber i wsp. 1994. Curr. Genet., 25: 305–310. [16] Mozley i wsp. 1997. Photochem. Photobiol., 66: 710–715. [17] Weydemann i wsp. 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol., 44: 377–385. [18] Zurek i wsp. 1996. Process Biochem., 31: 679–689. [19] Shen i wsp. 1989. Gene, 84: 303–309. [20] Janowicz i wsp. 1991. Yeast, 7: 431–443. [21] Gilbert i wsp. 1994. Yeast, 10: 1569–1580. [22] Buckholz i wsp. 1991. Biotechnol., 9: 1067–1072. [23] Wedlock I wsp. 1993. J. Mol. Endicrinol., 10: 325–336. [24] Agapophonov i wsp. 1995. Yeast, 11: 1241–1247. [25] Kang i wsp. 1998. Yeast, 14: 371–381. [26] Youn i wsp. 2010. J. Microbiol. Biotechnol., 20: 1534–1538.

Krzepnięcie krwi i antykoagulacja to procesy życiowe, które zachowują integralność układu krążenia w różnych warunkach fizjologicznych. Po uszkodzeniu naczyń zatrzymanie krwawienia i zatrzymanie płynów ustrojowych jest wynikiem hemostazy. Gojeniu się ran towarzyszy tymczasowe tworzenie bogatej w płytki, włóknistej skrzepliny, która utrudnia prawidłowy przepływ krwi. Odwrotny proces koagulacji (antykoagulacja) ostatecznie prowadzi do usunięcia skrzepliny i odtworzenia łożyska naczyniowego. W związku z tym hemostaza obejmuje dwa pozornie przeciwne procesy, tworzenie skrzepliny i rozpuszczanie skrzepliny; oba muszą pozostać w równowadze, gdy zachowują właściwości hemodynamiczne stałej krwi. Zwierzęta hematofagiczne, takie jak pijawki, komary i kleszcze, powodują hamowanie krzepnięcia krwi podczas jej ssania od odpowiednich gospodarzy. Pasożyty te wykorzystują różne inhibitory krzepnięcia, aby utrzymać płynność krwi podczas karmienia i trawienia. Niektóre jady węża także zawierają inhibitory, które ułatwiają szybką dystrybucję trucizn przez ciało ofiary. Ślina pasożytów krwiotwórczych i jadów węży są cennym źródłem antykoagulantów na bazie peptydów. Dwa peptydy produkowane przez pijawki Hirudo medicinalis o działaniu antykoagulacyjnym, hirudyna i saratyna, są produkowane przez metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha. Hirudyna to białko o działaniu przeciwkrzepliwym należące do bezpośrednich inhibitorów uniemożliwiających przekształcanie protrombiny w trombinę. Rekombinowana hirudyna (lepirudyna, r-hirudyna) jest stosowana jako lek w prewencji żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Hirudyna jest szybko eliminowana z krążenia przez nerki w związku z okresem półtrwania w zakresie 0,85–1,5 godz. Długotrwała obecność rekombinowanej hirudyny w układzie krążenia byłaby korzystna przy stosowaniu w terapii antykoagulacyjnej. Eliminacja białek przez nerki zależy głównie od wielkości molekularnej krążącej cząsteczki. Zwiększenie masy cząsteczkowej potencjalnego białka terapeutycznego przez kowalencyjne wiązanie wielu ugrupowań PEG znacząco zwiększa jego okres półtrwania.

Rekombinowana, pochodząca od Hansenula polymorpha, saratyna (białko) jest silnym inhibitorem zależnym od czynnika von Willebranda, adhezji płytek krwi do kolagenu. O ile hirudyna interweniuje w procesie krzepnięcia na końcu kaskady krzepnięcia czynników krzepnięcia krwi, saratyna hamuje adhezję płytek w początkowej fazie. Saratyna zmniejsza adhezję płytek krwi, rozrost warstwy wewnętrznej, zwężenie światła i zakrzepicę po endarterektomii. Saratyna może służyć jako środek do miejscowego hamowania zakrzepicy i przerostu po manipulacji naczyniowej.

Cytokiny są peptydami regulatorowymi wytwarzanymi i wydzielanymi przez komórki jądrzaste. Wykazują działanie plejotropowe na wiele typów komórek biorących udział w procesach obronnych i naprawczych gospodarza, przede wszystkim na komórkach krwiotwórczych. Cytokiny obejmują czynniki limfocytogenne (limfokiny), czynniki pochodzące z monocytów (monokiny), czynniki hematopoetyczne (czynniki stymulujące kolonie), „czynniki wzrostu” tkanki łącznej i chemokiny chemotaktyczne. Do chwili obecnej opisano 22 interleukin i sklonowano ponad 150 cytokin. Interferony odkryto w 1957 r. jako selektywne środki przeciwwirusowe wytwarzane przez komórki ssaków zakażone wirusem. Kolejne badania stopniowo identyfikowały je jako białka wykazujące szeroki zakres działań na wzrost i różnicowanie komórek, zarówno wewnątrz układu odpornościowego, jak i bez niego. Dlatego interferony są obecnie uważane za cytokiny. Większość cytokin działa na niewielką odległość jako sygnały autokrynne lub parakrynne w lokalnych tkankach. Są one zwykle wytwarzane w sytuacjach awaryjnych i utrzymują homeostazę przez regulację układu odpornościowego i promowanie procesów naprawczych. Ze względu na ich rolę w procesach obronnych gospodarza, w pośredniczeniu w odpowiedzi na inwazyjne organizmy, guzy i urazy, cytokiny stanowią ważną klasę białek o wysokim potencjale jako związki terapeutyczne. Obecnie stanowią one ważną grupę rekombinowanych farmaceutyków i oczekuje się, że nowe produkty zostaną uruchomione w najbliższej przyszłości. Produkty te są wytwarzane w bakteriach lub w komórkach ssaków.

Komórki Hansenula polymorpha produkują rekombinowane enzymy do celów technicznych. Glukoamylaza z amylolitycznych drożdży Schwanniomyces occidentalis była pierwszym białkiem heterologicznym wydzielanym z Hansenula polymorpha jako glikoproteina. Ma kilka cech, które czynią go atrakcyjnym dla przemysłu spożywczego, a mianowicie zdolność do hydrolizowania skrobi do glukozy i do inaktywacji w warunkach pasteryzacji. Komórki Hansenula polymorpha zastosowano do produkcji termostabilnej celulazy pochodzącej z organizmu termofilnego, wykazującej wysoką aktywność w temperaturze 70°C. Rekombinanty Hansenula polymorpha produkują heterologiczne enzymy, takie jak: celulaza I, celuloza II, celulaza termostabilna, oksydaza glukozowa, oksydaza glikolanowa, oksydaza heksozowa, inwertaza, lipaza, fitaza i ksylanaza, zakodowane w genach odpowiednio pozyskanych z Aspergillus aculeatus, Humicola insolens, organizmu termofilnego, Schwanniomyces occidentalis, Aspergillus niger, szpinaku, Chondrus crispus, Saccharomyces cerevisiae, Thermomyces lanuginosus, Aspergillus sp., Humicola insolens.

5.16.Podsumowanie

Drożdże są organizmami niezwykłymi, które bardziej niż Saccharomyces cerevisiae wykorzystuje się w tradycyjnych fermentacjach. Liczba zidentyfikowanych gatunków drożdży i ich potencjał biotechnologiczny wciąż się zwiększają ze względu na szereg właściwości i możliwości ich rozwoju. Nowe osiągnięcia w dziedzinie inżynierii na drożdżach z wykorzystaniem biologii systemowej i technologii rDNA spowodowały rozszerzenie zakresu substratów, poprawę właściwości komórkowych i wytwarzania nowych produktów, których drożdże nie mogły wytwarzać. Opracowywane są konstrukty Saccharomyces cerevisiae i niektórych innych gatunków drożdży do produkcji biopaliw z materiałów celulozowych i potencjalnie innych substratów. W ciągu ostatniej dekady opracowano systemy z zastosowaniem drożdży do produkcji białek heterologicznych dużej wydajności. Drożdże są coraz ważniejsze jako źródła biokatalizatorów do produkcji wysokowartościowych chemikaliów i enzymów. Wiele gatunków, zwłaszcza drożdży z Basidiomycota, jest zdolnych do bioremediacji i degradacji chemikaliów, zanieczyszczeń, takich jak związki aromatyczne, tworzywa sztuczne i inne oporne na degradację związki i polimery.

Drożdże wykorzystywane w różnych gałęziach przemysłu spożywczego: Candida milleri, Candida oleophila, Candida rugosa, Candida tropicalis, Candida versatilis, Candida zemplinina, Candida zeylanoides, Cyberlindnera jadinii, Cyberlindnera mrakii, Cystofilobasidium infirmominiatum, Debaryomyces hansenii, Dekkera bruxellensis, Geotrichum candidum, Hanseniaspora guilliermondii, Hanseniaspora osmophila, Hanseniaspora uvarum, Kazachstania exigua, Kazachstania unispora, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea fermentati, Lachancea thermotolerans, Lecanicillium lecanii, Metschnikowia pulcherrima, Pichia fermentans, Pichia kluyveri, Pichia membranifaciens, Pichia kudriavzevii, Pichia occidentalis, Pichia pijperi, Rhodospirillum sp., Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces vanrijiae, Starmerella bombicola, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora rouxii, Torulopsis candida, Torulopsis holmii, Trigonopsis cantarellii, Wickerhamomyces anomalus, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii, Zygotorulaspora florentina.

Literatura rekomendowana

Ageitos J.M., Vallejo J.A., Veiga-Crespo P., Villa T.G. 2011. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Appl. Microbiol. Biotechnol., 90: 1219–1227.

Amaral P.F.F., Coelho M.A.Z., Marrucho I.M., Coutinho J.A.P. 2008. Biosurfactants from yeasts: characteristics, production and application. [w:] Biosurfactants. Ed. Sen R. Landes Bioscience.

Bankar A.V., Kumar A.R., Zinjarde S.S. 2009. Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol. Biotechnol., 84: 847–865.

Begum A., Katsumata H., Kaneco S., Suzuki T., Ohta K. 2003. Biodegradation of phthalic acid esters by bakery yeast Saccharomyces cerevisiae. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 70: 255–261.

Bourdichon F., 17 wsp. i Hansen E.B. 2012. Food fermentations: Microorganisms with technological beneficial use. Intern. Food Microbiol., 154: 87–97.

Bozoudi D. i Tsaltas D. 2018. The multiple and versatile roles of Aureobasidium pullulans in the vitivinicultural sector. Fermentation, 4: 85.

Branduardi P. i Porro D. 2012. Yeast biotechnology. [w:] Yeast: molecular and cell biology, Ed. Feldmann H. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.

Buijs N.A., Siewers N., Nielsen J. 2013. Advanced biofuel production by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current Opinion Chem. Biol., 17: 480−488.

Buzzini P., Margesin R. 2014. Cold-adapted yeasts: biodiversity, adaptation strategies and biotechnological significance. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg.

Calvente V., Benuzzi D., de Tosetti M.I.S. 1999. Antagonistic action of siderophores from Rhodotorula glutinis upon the postharvest pathogen Penicillium expansum. Intern. Biodeterioration & Biodegradation, 43: 167−172.

Cereghino G.P.L., Cereghino J.L., Ilgen C., Cregg J.M. 2002. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr. Opinion Biotechnol., 13: 329–332.

Cregg J.M., Cereghino, J.L., Shi J., Higgins D.R. 2000. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Molec. Biotechnol., 16: 23–52.

de Almeida Silva Vilela J. i de Figueiredo Vilelaa L. 2018. The role of the Saccharomyces cerevisiae in production of fermented product – minireview. Annals of Short Reports, 1: Article 1017.

Fan Q. i Tian S.P. 2001. Postharvest biological control of grey mold and blue mold on apple by Cryptococcus albidus (Saito) Skinner. Postharvest Biol. Technol., 21: 341–350.

Gellissen G. 2000. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 741–750.

Goncalves C., Lopes M., Ferreira J.P., Belo I. 2009. Biological treatment of olive mill wastewater by non-conventional yeasts. Bioresour. Technol., 100: 3759–3763.

Hong K.K. i Nielsen J. 2012. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae: a key cell factory platform for future biorefineries. Cell. Mol. Life Sci., 69: 2671–2690.

Johnson E.A. 2013a. Biotechnology of non-Saccharomyces yeasts – the ascomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 503–517

Johnson E.A. 2013b. Biotechnology of non-Saccharomyces yeasts – the basidiomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 7563–7577.

Johnson E.A. i Echavarri-Erasun C. 2011. Yeast Biotechnology. [w:] The yeasts, a taxonomic study. Elsevier B.V., Eds: Kurtzman P.C., Fell J.W., Boekhout T. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sidney, Tokyo.

Kildegaard K.R.,Belda D.D., KhanguraJ.K., Holkenbrink C., Borodina I. 2017. Engineering of Yarrowia lipolyticafor production of astaxanthin. Synthetic Syst. Biotechnol., 2: 287–294.

Krallish I., Gonta S., Savenkova L., Bergauer P., Margesin R. 2006. Phenol degradation by immobilized cold-adapted yeast strains of Cryptococcus terreus and Rhodotorula creatinivora. Extremophiles, 10: 441–449.

Margesin R. i Feller G. 2010. Biotechnological applications of psychrophiles, Environ. Technol., 31: 835–844.

Parveen S., Wani A.H., Bhat M.Y. 2016. Biological control of postharvest fungal rots of rosaceous fruits using microbial antagonists and plant extracts – a review. Czech Mycology, 68: 41–66.

Rodicio R. I Heinisch J.J. 2013. Yeast on the milky way: genetics, physiology and biotechnology of Kluyveromyces lactis. Yeast, 30: 165–177.

Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. 2008. Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol., 26: 100–109.

Safder I., Khan S., Islam I., Ali M.K., Bibi Z., Waqas M. 2018. Pichia pastoris expression system: a potential candidate to express protein in industrial and biopharmaceutical domains. Biomedical Letters, 4: 114.

Schisler D.A., Janisiewicz W.J., Boekhout T., Kurtzman C.P. 2011. Agriculturally important yeasts: biological control of field and postharvest diseases using yeast antagonists, and yeasts as pathogens of plants, in the yeasts, a taxononic study, red. Kurtzman P.C., Fell J.W., Boekhout.

Spadaro D., Vola R., Piano S., Gullino M.L. 2002. Mechanisms of action and efficacy of four isolates of the yeast Metschnikowia pulcherrima active against postharvest pathogens on apples. Postharvest Biol. Technol., 24: 123–134

Spohner S.C., Schaum V., Quitmann H., Czermak P. 2016. Kluyveromyces lactis: An emerging tool in biotechnology. J. Biotechnol., 222: 104–116.

Tondee T., Sirianuntapiboon S., Ohmomo S. 2008. Decolorization of molasses wastewater by yeast strain Issatchenkia orientalis No. SF9-246. Bioresour. Technol., 99: 5511–5519.

Turker M. 2014. Yeast biotechnology: diversity and applications. 27th VH Yeast Conference, April 14th – 15th, Istanbul. Adv. Sci. Industrial Prod. Baker’s Yeast

Watanabe T., Masaki K., Iwashit, K., Fuji T., Iefuji H. 2009. Treatment and phosphorus removal from high-concentration organic wastewater by the yeast Hansenula anomala J224 PAWA. Bioresour. Technol., 100: 1781–1785

Vinas I., Ussal J., Teixido N., Sanchis V. 1998. Biological control of major postharvest pathogens on apple with Candida sake. Intern. J. Food Microbiol., 40: 9–16.

Zhang H., Zheng X., Yu T. 2007. Biological control of postharvest diseases of peach with Cryptococcus laurentii. Food Control, 18: 287–291.

6

Grzyby strzępkowe jako „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

6.1.Wprowadzenie

Różnorodność biomów na świecie wynika z bogactwa flory, fauny, grzybów i mikroorganizmów. Opisano dotychczas ok. 100 000 gatunków grzybów, a jest to zaledwie cząstka istniejących w przyrodzie, których liczebność szacuje się między 3,5 a 5,1 mln gatunków. Grzyby są starożytnymi organizmami o ogromnym znaczeniu, ponieważ:

1. 1) są główne odpowiedzialne za degradację materii organicznej w ekosystemach lądowych i wodnych, za globalny obieg węgla i recykling substancji odżywczych;

2. 2) są niezbędne do podtrzymania istnienia wielu grup organizmów, z którymi wchodzą w interakcje mutualistyczne (mutualizm);

3. 3) wiele gatunków grzybów to patogeny ludzkie, roślinne lub zwierzęce;

4. 4) są dobrze rozwiniętymi systemami modeli genetycznych do celów biologii molekularnej;

5. 5) są istotne w rolnictwie;

6. 6) wykazują ogromny potencjał biotechnologiczny w produkcji różnych substancji biologicznie czynnych.

Według Jensa H. Petersona (The Kingdom of Fungi) królestwo grzybów zawiera siedem następujących typów: Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Chytridimycota, Microsporidia, Glomeromycota, Ascomycota, Basidiomycota oraz grzybopodobne Zygomycota.

Już w czasach przedbiblijnych grzyby, w tym głównie drożdże i grzyby strzępkowe, były wykorzystane do produkcji piwa, wina, chleba i sera. Od ubiegłego wieku, złotego wieku mikrobiologii przemysłowej (lata 1945–1960), drożdże i grzyby strzępkowe zaczęły być powszechnie stosowane do produkcji enzymów i licznych metabolitów. Pojawiło się mnóstwo produktów wytworzonych w procesach fermentacji prowadzonych przez grzyby: enzymy, antybiotyki, witaminy, aminokwasy, kwasy organiczne, rozpuszczalniki, polimery i wiele innych przydatnych związków. Rozwój technik biologii molekularnej dostarczył nowych sposobów wykorzystania drożdży i grzybów strzępkowych jako komórek „fabryk” białek homologicznych i heterologicznych (zwłaszcza ssaczych), jak również innych metabolitów, takich jak nowe antybiotyki, pigmenty i kwasy tłuszczowe. Podstawą wyboru szczepu jest wydajność produkcji i kwestie regulacyjne, zwłaszcza w stosunku do grzybów stosowanych w przemyśle spożywczym. Do tych celów wybiera się szczepy, które osiągnęły status GRAS (ogólnie uznany za bezpieczny) wg Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA). Status ten ma kilka gatunków grzybów obecnie stosowanych do produkcji rekombinowanych białek i różnych metabolitów na dużą skalę. Produkty metaboliczne grzybów wykorzystuje się w przemyśle spożywczym, medycynie, ochronie środowiska, rolnictwie oraz kontroli grzybów patogenicznych. Lista grzybów Aspergillus niger wykorzystywanych na skalę przemysłową jest podana w tabeli 6.1.

Tabela 6.1. Lista wybranych szczepów Aspergillus niger produkujących metabolity

Szczep Aspergillus niger

Produkowane metabolity

ATCC 1015 (NRRL 328, CBS 113.46)

glukuronidaza, lipaza

NRRL 3 (ATCC 9029, CBS 120.49, N400)

kwasy organiczne i enzymy

CBS 513.88

kwas cytrynowy

NRRL 3122 (ATCC 22343, CBS 115989)

glukoamylaza, β-glukozydaza

ORS-4

kwas glukonowy

BO-1

glukoamylaza

GCMC-7

kwas cytrynowy

B03

ksylanaza

H915-1, A1, L2

kwas cytrynowy

UAM-GS1

hemicelulazy i celulazy

ATCC 11414

kwas cytrynowy

FTU-8

fitaza

YX-1217

kwas cytrynowy

Biała biotechnologia wykorzystuje żywe komórki i enzymy do syntezy produktów pochodzenia biologicznego, które łatwo ulegają biodegradacji, wymagają mało energii i wytwarzają mniej odpadów podczas ich produkcji. Enzymy mają wiele zalet – prowadzą procesy chemiczne w sposób specyficzny substratowo i są wydajne, bezpieczne, opłacalne oraz przyjazne środowisku. Procesy katalizowane enzymami stopniowo zastępują procesy chemiczne w wielu dziedzinach przemysłu, a większość enzymów przemysłowych to rekombinowane formy wytwarzane przez grzyby. Inżynieria białek, biologia syntetyczna, racjonalne projektowanie i ukierunkowana ewolucja dostarczyły ważnych narzędzi do opracowania nowych enzymów lub enzymów o ulepszonych właściwościach w nowych obszarach zastosowań. Wiele białek rekombinowanych o jakości spożywczej jest pochodzenia grzybowego. Istnieje jeden wyjątek, tj. cielęca renina (chymozyna) używana do produkcji sera, której szczepem dawcy nie jest grzyb. Produkcja tego białka wołowego w rekombinowanym Aspergillus niger var. awamori wynosi około 1 g/l po mutagenezie nitrozoguanidyną i selekcji oporności na 2-deoksyglukozę. Dalsza poprawa wydajności po kolejnych seriach rekombinacji to 1,5 g/l enzymu. Rekombinowany szczep Aspergillus oryzae wytwarzający proteinazę asparaginową pobraną z Rhizomucor miehei został zatwierdzony przez FDA do produkcji sera. Zdolność do wytwarzania i wydzielania dużych ilości metabolitów do środowiska zewnątrzkomórkowego umożliwiła zastosowanie grzybów strzępkowych do przemysłowej produkcji natywnych białek lub homologicznych/heterologicznych białek rekombinowanych. Takie grzyby strzępkowe, jak Aspergillus niger, Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Rhizopus oryzae, Fusarium venenatum, Penicillium funiculosum, Penicillium emersonii, Penicillium chrysogenum, Penicillium roquefortii, Humicola insolens, wykazujące wiele zalet, są stosowane jako „workhorse” do produkcji homologicznych lub heterologicznych białek.

Zrekombinowane grzyby są jednym z głównych źródeł enzymów wykorzystywanych w różnych gałęziach przemysłowych. Rynek enzymów przemysłowych osiągnął wartość ponad 2,5 mld USD. Są one stosowane w takich obszarach, jak: żywność (45%), detergenty (34%), tkaniny (11%), przemysł skórzany (3%), bielenie masy celulozowej i papieru (1,2%), a także w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Około 90% enzymów przemysłowych to produkty szczepów rekombinowanych; ponad 60% enzymów stosowanych w produkcji detergentów, przemyśle spożywczym i hydrolizie skrobi pochodzi ze szczepów rekombinowanych. Enzymy produkowane przez grzyby mają zastosowanie w wielu dziedzinach, w tym w syntezie organicznej (peptydazy, amidazy, acylazy, glikozydazy), enzymatycznej analizie biologicznej (oksydaza glukozy, lipaza, ureaza, dehydrogenaza glutaminianowa), produkcji środków farmaceutycznych (celulazy, proteazy, lipazy), detergentów do prania (proteazy 91%, lipaza 6%, amylaza 2%, celulaza 1%), w przemyśle skrobiowym (amylazy, amyloglukozydazy, glukoamylazy, izomeraza glukozowa), mleczarskim (lipazy), włókienniczym (amylaza, celulazy), piwowarskim (amylazy, glukanazy, proteinazy, amyloglukozydaza, β-glukanaza), piekarniczym (α-amylaza, β-ksylanaza, proteinaza), skórzanym (proteazy), celulozowo-papierniczym (β-ksylanazy, lipazy, celulazy), w konwersji biomasy (celulazy, ksylanazy, α-arabinofuranozydazy, esteraza acetyloksylanowa, α-gala-ktozydazy, peroksydaza manganowa, peroksydaza ligninowa i lakazy), a także w przeciwdziałaniu degradacji środowiska (bioremediacja enzymatyczna), elektrokatalizatory w produkcji biopaliw (hydrogenazy, lakazy i inne enzymy, redoks). Lipazy pozyskiwane w procesach syntez z użyciem mikroorganizmów mają zastosowanie w technologii żywności, naukach biomedycznych i przemyśle chemicznym, ponieważ są:

1. 1) stabilne w rozpuszczalnikach organicznych;

2. 2) posiadają szeroką specyficzność substratową;

3. 3) nie wymagają kofaktorów;

4. 4) wykazują wysoką selektywność.

W przemyśle spożywczym lipazy powszechnie stosuje się do produkcji soków owocowych, pożądanych aromatów w serach oraz estryfikacji tłuszczów i olejów w celu wytworzenia modyfikowanych acylogliceroli. Istnieją trzy rekombinowane lipazy stosowane obecnie w przemyśle spożywczym, pozyskiwane z Rhizomucor miehi, Thermomyces lanuginosus i Fusarium oxysporum, wszystkie są wytwarzane w Aspergillus oryzae. Lipazy są niezwykle ważne w produkcji detergentów i obróbce skór. Odpowiednie lipazy powinny być alkalofilne, aktywne w temperaturze powyżej 45°C i pH ok. 10 oraz oporne na środki powierzchniowo czynne. W 1994 r. Novo Nordisk wprowadził do detergentów lipolazę przez wklonowanie genu lipazy Humicola lanuginosa w genom Aspergillus oryzae. Grzyby strzępkowe są szeroko stosowane w komercyjnej produkcji kwasów organicznych mających duży rynek światowy, a także do produkcji żywności fermentowanej, pigmentów i barwników dla przemysłu spożywczego oraz terpenoidów dla przemysłu farmaceutycznego. Biokatalizatorami są zarówno izolowane enzymy, jak i całe komórki. Coraz częściej są wykorzystywane do wspomagania syntezy złożonych cząsteczek o znaczeniu przemysłowym.

Czerwona biotechnologia, czyli poszukiwanie związków o nowych właściwościach farmakologicznych (bezpiecznych, silnych i o szerszym spektrum) ma kluczowe znaczenie. Duże znaczenie dla sektora farmakologicznego mają związki zwalczające patogeny, naturalnie oporne na działanie bakterii i grzybów, stosowane do diagnostyki i jako enzymy terapeutyczne. Grzyby są bogatym i obiecującym źródłem nowych antybiotyków i leków o właściwościach antygrzybiczych, nicieniobójczych, antypierwotniaczych, antybakteryjnych i antywirusowych, a także inhibitorów antyzapalnych, leków przeciwgruźliczych i antynowotworowych, agonistów lub antagonistów adrenergicznych, receptorów dopaminergicznych i serotoninergicznych oraz środków do leczenia hipercholesterolemii.

Antybiotyki są najbardziej znanymi metabolitami wtórnymi wytwarzanymi przez grzyby, definiowanymi jako organiczne produkty naturalne o niskiej masie cząsteczkowej wytwarzane przez mikroorganizmy, które są aktywne w niskim stężeniu wobec innych mikroorganizmów. Unia Europejska wdrożyła program New Drugs for Bad Bugs (ND4BB), przedstawiający strategie zwalczania oporności na antybiotyki i stymulujący badania w tej dziedzinie. Wydaje się jednak, że w naturze istnieją miliony bioaktywnych cząsteczek o właściwościach antybiotykowych wytwarzanych przez grzyby oczekujące na odkrycie.

Taksol (ogólna nazwa paklitaksel) jest substancją chemiczną tetracyklicznych laktamów diterpenowych, wytwarzanych w niskich stężeniach (0,01–0,05%) z kory cisu pacyficznego (Taxus brevifolia). Jest to lek antynowotworowy o wartości rynkowej milionów dolarów rocznie. Taksol produkują grzyby endofityczne (Taxomyces andreanae). Poszukiwanie nowych źródeł taksolu i taksanu doprowadziło do ich izolacji jako potencjalnych gatunków, które mogą zwiększyć jego produkcję, a tym samym zaspokoić duże zapotrzebowanie na ten produkt. Ostatnio zgłoszono nowe metabolity o aktywności antynowotworowej uzyskane z grzybów.

Podwyższone stężenie cholesterolu w osoczu jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju chorób serca, dlatego też odkrycie środków obniżających poziom cholesterolu wytwarzanych przez grzyby zostało przyjęte z dużym zainteresowaniem. Związki o takich właściwościach obejmują statyny grzybowe wytwarzane przez Penicillium brevicompactum, Penicillium citrinum, Monascus ruber i Aspergillus terreus, w tym lowastatynę, prawastatynę, które działają jako inhibitory reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A, regulatora i enzymu ograniczającego szybkość biosyntezy cholesterolu w wątrobie. Cyklosporyna A, lek stosowany w transplantacji narządów uzyskiwany z workowca Tolypocladium inflatum jest pierwszym lekiem immunosupresyjnym wykazującym akceptowalny poziom toksyczności.

Halowiry, ekwisetyna i fomasetyna są związkami bioaktywnymi wytwarzanymi przez grzyby z rodzajów Scytalidium i Phoma, użyteczne odpowiednio przeciwko wirusom opryszczki zwykłej i HIV.

Innym przykładem metabolitów wtórnych pozyskanych z Aspergillus nidulans są nowe leki przeciwgruźlicze, które mają silne działanie hamujące rozwój Mycobacterium tuberculosis i wzrost ludzkiego pasożyta malarii Plasmodium falciparum.

Zielona biotechnologia to produkcja związków chemicznych pochodzących z biomasy oraz biopaliw w celu zastąpienia paliw kopalnych. Prowadzone są badania nad zmniejszeniem zanieczyszczenia środowiska i zwiększeniem produkcji żywności, pasz i produkcji rolnej, ze szczególnym uwzględnieniem wykorzystania grzybów lub enzymów grzybowych i ich metabolitów. Materiały celulozowe stanowią największe na świecie źródło węgla organicznego, a grzyby wykorzystują lub przetwarzają je jako ważne źródło węgla. Energia pochodząca z biomasy może przyczynić się do zmniejszenia emisji gazów cieplarnianych. Wąskim gardłem w produkcji biopaliw są oporność lignocelulozy, udomowienie upraw bioenergetycznych i niskie plony oleju z roślin i glonów. Zrównoważone biopaliwa, takie jak bioetanol celulozowy i biodiesel, są wykorzystywane jako paliwo w samochodach lub pojazdach drogowych, zastępując produkty na bazie paliw kopalnych. W tym kontekście proces degradacji biomasy wykorzystuje rozkład biologiczny, w którym mieszaniny enzymów produkowanych przez grzyby dokonują degradacji celulozy i hemicelulozy do rozpuszczalnych cukrów, które są następnie fermentowane do etanolu przez różne mikroorganizmy. Grzyby Cunninghamella japonica i Mortierella isabellina produkują odpowiednie lipidy do produkcji biodiesla. Zidentyfikowano także wytwarzanie w grzybach lotnych związków organicznych (VOC) o potencjalnym zastosowaniu w rolnictwie, medycynie i przemyśle. Odkryto wiele grzybów endofitycznych, które wytwarzają węglowodory (alkany, cykloheksany, cyklopentany i alkohole alkilowe/ketony, benzeny i węglowodory poliaromatyczne) o potencjalnym zastosowaniu jako zielone związki chemiczne i biopaliwa. Grzyby posiadają zdolność do degradacji organicznych substancji chemicznych w środowisku i zmniejszania ryzyka związanego z metalami, metaloidami i radionuklidami, albo przez modyfikację chemiczną, albo przez wpływ na biodostępność chemiczną. Niektóre grzyby mają zdolność metaboliczną do przekształcania i/lub mineralizacji szerokiego zakresu zanieczyszczeń chemicznych, takich jak:

1. 1) wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) – Phanerochaete chrysosporium, Cunninghamella elegans, Penicillium sp., Trichoderma viride, Alternaria tenuis i Aspergillus terreus;

2. 2) benzen, toluen, etylobenzen i ksylen (BTEX) – Penicillium chrysosporium i Cladophialophora sp.;

3. 3) chlorofenol – Coriolus versicolor, Trametes villosa, Panus tigrinus, Bjerkandera adusta, Trametes versicolor i Penicillium chrysosporium;

4. 4) odpady z produkcji amunicji – Penicillium chrysosporium, Acremonium sp., Trichoderma lombrachiatum, Trichoderma sp., Fusarium sp., Acremonium sp., Cylindrocarpon sp., Gliocladium sp., Penicillium janczewskii i Penicillium sp.;

5. 5) pestycydy – Penicillium chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Phellinus weirii, Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare, Botrytis cinerea i Sordaria superba;

6. 6) metale ciężkie – Aspergillus sp., Alternaria sp., Geotrichum sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Trichoderma sp., Rhizopus sp. i Monilia sp.;

7. 7) surowy olej – Trichoderma sp.;

8. 8) radionuklidy – Aspergillus niger, Hormoconis resinae, Cladosporium cladosporioides, Penicillium roseopurpureum, Rhizopus arrhizus, Penicillium italicum, Penicillium chrysogenum;

9. 9) produkty farmaceutyczne i produkty do pielęgnacji ciała (PPCP) – Bjerkandera sp. R1, Bjerkandera adusta i Phanerochaete chrysosporium.

Zdecydowana większość spośród 1062 opisanych gatunków z rodziny Aspergillaceae (typ Ascomycota) należy do rodzajów Aspergillus (42,5%; 451/1,062) i Penicillium (51,6%; 549/1,062). Do rodzaju Aspergillus należy około 250 gatunków, w tym ważne gatunki eksploatowane przemysłowo (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sojae, Aspergillus terreus) i patogeniczne dla zwierząt i/lub roślin (Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus). Ze względu na ich niezwykłą wszechstronność metaboliczną, szczepy Aspergillus są stosowane w biotechnologii do produkcji metabolitów, takich jak kwasy organiczne, farmaceutyki, białka i enzymy. Dla przykładu, szczepy Aspergillus można hodować na szeroką skalę w warunkach temp. 10–50°C, w środowisku o pH 2–11, przy zasoleniu 0–34%, aktywności wody 0,6–1, w bogatych lub oligotroficznych warunkach pokarmowych. Stąd w skali przemysłowej Aspergillus można hodować w fermentacjach prowadzonych na podłożu zestalonym lub w stanie ciekłym.

Grzyby z rodziny Aspergillaceae są zróżnicowanie ekologiczne, np. Penicillium verrucosum jest szeroko rozpowszechniony w klimacie zimnym, a nie został dotąd wyizolowany w strefie tropikalnej, podczas gdy Aspergillus nidulans jest w stanie rosnąć w szerokim zakresie temperatur. Kilka gatunków z rodziny Aspergillus jest wykorzystywanych przez ludzi w celach gospodarczych, podczas gdy wiele innych jest szkodliwych dla ludzi lub ich działalności. Przykładem gatunków Aspergillus pożytecznych dla ludzi są Aspergillus oryzae stosowany w produkcji tradycyjnych potraw japońskich, w tym sosu sojowego, sake i octu jak również amylazy i proteazy, oraz Aspergillus terreus, który wytwarza lowastatynę – silny lek obniżający poziom cholesterolu. Przykładem użytecznych dla człowieka gatunków Penicillium są Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti, które służą do produkcji serów pleśniowych, oraz Penicillium citrinum, który wytwarza lek obniżający poziom cholesterolu – mewastatynę – pierwszą statynę na świecie. Szkodliwe dla ludzi są gatunki wytwarzające mikotoksyny –Aspergillus fumigatus i Aspergillus flavus – oraz patogeny po zbiorach owoców cytrusowych, ziaren zbóż i innych roślin zbożowych – Penicillium expansum, Penicillium digitatum i Penicillium italicum. Grzyby z Aspergillaceae są również dobrze znane ze swojej zdolności do wytwarzania niezwykłej różnorodności metabolitów wtórnych – małych cząsteczek, które działają jako toksyny, cząsteczki sygnałowe i pigmenty. Metabolity wtórne mają kluczowe znaczenie w ekologii grzybów, ale często też wykazują działanie biologiczne szkodliwe lub korzystne dla dobrostanu człowieka. Na przykład wtórny metabolit wytwarzany przez Aspergillus fumigatus – gliotoksyna – jest silnym czynnikiem wirulencji w przypadkach grzybicy układowej u kręgowców, a metabolit drugorzędny aflatoksyna B1 i B2 wytwarzany przez Aspergillus flavus jest jednym z najbardziej toksycznych i rakotwórczych naturalnie występujących związków. W przeciwieństwie do innych, metabolity wtórne są podstawowymi antybiotykami i lekami, np. penicylina wytwarzana przez Penicillium chrysogenum jest jednym z najczęściej stosowanych antybiotyków, a statyny obniżające poziom cholesterolu wytwarzane przez Penicillium citrinum należą nadal do najlepszych na świecie.

Monascus purpureus Went jest tradycyjnie używany do produkcji wina, octu, barwników spożywczych i konserw mięsnych. W 1979 r. wyizolowano z niego monakolinę K, środek obniżający poziom cholesterolu.

6.2. Przykłady „workhorse” wśród grzybów strzępkowych

Istnieje wiele grzybów strzępkowych, które można nazwać „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej. Są to m.in. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Penicillium chrysogenum i Trichoderma reesei.

6.2.1. Aspergillus niger

Mikrobiologia przemysłowa narodziła się 100 lat temu. W 1917 r. chemik branży spożywczej James Currie dokonał obiecującego odkrycia: każdy szczep pleśni Aspergillus niger wytwarzał wysokie stężenia kwasu cytrynowego, gdy był hodowany na podłożu z cukrem. Ten trikarboksylowy kwas jest metabolitem pośrednim cyklu Krebsa, wcześniej ekstrahowany z owoców cytrusowych i stosowany do produkcji żywności i napojów. Dwa lata po odkryciu Currie’ego rozpoczęła się produkcja przemysłowa kwasu cytrynowego przy użyciu Aspergillus niger i tym samym narodziła się biotechnologia przemysłowa. Obecnie przemysł produkcji kwasu cytrynowego przy użyciu Aspergillus niger jest wart wiele miliardów dolarów, przy czym Aspergillus niger dodatkowo produkuje całą gamę białek, enzymów i metabolitów wtórnych. Przed końcem XIX i na początku XX w. produkcje te były prowadzone bez znajomości podstawowych procesów biologicznych. Teraz produkcja piwa i wina są dobrze poznane, a proces w skali przemysłowej jest kontrolowany. Kwas cytrynowy nie jest – lub już nie jest – izolowany z owoców cytrusowych, ale jest produkowany przemysłowo przez grzyb strzępkowy Aspergillus niger. W szczególności Currie (1917) opracował podłoże hodowlane do biosyntezy kwasu cytrynowego oraz wykazał zdolność grzyba do wzrostu przy niskim pH (2,5–3,5) przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do wytwarzania dużych ilości tego metabolitu. Autor wykazał bezpośrednią korelację między ilością substratu w podłożu a ilością produktu, tworząc podstawę dla współczesnej przemysłowej fermentacji kwasu cytrynowego. W przeciwieństwie do innych gatunków grzybów, o których doniesiono, że produkują kwas cytrynowy do 1917 r., każdy pojedynczy szczep Aspergillus niger, który testował Currie, mógł wydajnie produkować kwas cytrynowy, gdy był hodowany w podłożu z cukrem. Dwa lata później amerykańska firma Pfizer przeprowadziła pilotażową instalację mikrobiologicznej produkcji kwasu cytrynowego, a w połowie lat 20. ubiegłego wieku produkcja przy użyciu fermentacji Aspergillus niger znacznie przewyższyła ekstrakcję kwasu cytrynowego z owoców cytrusowych.

W następnych kilku dekadach zostały kompleksowo ustalone przemiany kwasów w cyklu kwasów trikarboksylowych, za co przyznano Nagrodę Nobla Hansowi Krebsowi i Fritzowi Lipmannowi w 1953 r. Istnieją różnice w technikach fermentacji, ale ogólnie przemysłowe wytwarzanie kwasu cytrynowego wymaga obecności tlenu, a hodowlę prowadzi się w płynnym podłożu hodowlanym z niedrogich źródeł, takich jak melasa, namok kukurydziany czy scukrzona skrobia kukurydziana. Po fermentacji, biomasa Aspergillus niger jest fizycznie usuwana z hodowli, zwykle przez filtrację, a kwas cytrynowy jest izolowany przez wytrącenie mieszaniny fermentacyjnej wodorotlenkiem wapnia (wapnem) w celu wytworzenia soli cytrynianu wapnia. Później do izolacji kwasu cytrynowego stosowano też kwas siarkowy. Światowa produkcja kwasu cytrynowego została oszacowana na 3,6 mld USD w 2020 r. Słaby kwas cytrynowy może być stosowany jako przeciwutleniacz, środek konserwujący, środek zakwaszający czy regulator pH dodawany do żywności i napojów, a także w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym. Kwas cytrynowy jest obecnie produkowany głównie w Chinach (około 60% światowej produkcji).

Rys. 6.1. Zdjęcia strzępków Aspergillus niger na cebuli i pod mikroskopem Źródło: search?rlz=1C1AVNE_enPL705PL719&sxsrf=ACYBGNT5PWaBlqO56MB2FybVmpsXB0LXxA:1575911794370&q=zdjęcia+aspergillus+niger&tbm=isch&source=univ&sa=X&ved=2ahUKEwiDos31iKnmAhUB36QKHUC-AYQQsAR6BAgKEAE&biw=1260&bih=555

Badania podstawowe i wykorzystujące Aspergillus niger w ciągu ostatnich 100 lat są niezwykle zróżnicowane. Powstało w tym czasie ponad 3000 artykułów naukowych, w których w kolejnych latach pojawiały się słowa: „kwas cytrynowy” i „fermentacja”. Odkrycie przez Currie warunków hodowli do maksymalnej produkcji kwasu cytrynowego było rzeczywiście rewolucją w mikrobiologii przemysłowej, która stanowiła główny przedmiot badań w kolejnych dekadach. W okresie pierwszych dwudziestu lat (1937–1956) badacze Aspergillus niger zajmowali się głównie wpływem mikro- i makroelementów zawartych w podłożach hodowlanych i parametrami wzrostu w zoptymalizowanej fermentacji kwasu cytrynowego. Badania te prowadzono w hodowlach płynnych, które uniemożliwiały kontrolę wzrostu, morfologii grzybni i produkcji kwasu cytrynowego podczas fermentacji. W późnych latach 40. i na początku 50. ubiegłego wieku przeprowadzono serie mutagenez Aspergillus niger w celu wygenerowania szczepów o lepszej wydajności produkcji kwasu cytrynowego. W tym okresie dowiedziono, że Aspergillus niger jest także producentem przydatnych enzymów, w tym m.in. różnych oksydaz, dehydrogenaz, hydrolaz, celulaz i pektynaz. Odkrycia te wykorzystano do przemysłowej produkcji enzymów i poznania ich funkcji. Aspergillus niger jest biotechnologicznie ważnym grzybem strzępkowym używanym jako przemysłowa komórkowa fabryka do produkcji kwasów organicznych i enzymów. Główna cechą Aspergillus niger jest szybkie zakwaszanie podłoża hodowlanego podczas logarytmicznej fazy wzrostu wskutek wydzielania kwasów glukonowego, cytrynowego i szczawiowego, które powodują spadek pH podłoża poniżej 2,0 w niekontrolowanych hodowlach okresowych. Zakwaszenie to ma duże znaczenie dla zachowania Aspergillus niger jako komórkowej fabryki, ponieważ zarówno wytwarzanie kwasu organicznego, jak i produkcja enzymów są silnie zależne od pH podłoża. Produkcja kwasu organicznego zależy w dużym stopniu od składu podłoża i, co ciekawe, od pH podłoża hodowlanego. W warunkach laboratoryjnych w procesie fermentacji prowadzonej w bioreaktorze, pH jest utrzymywane na stałym poziomie. Produkcja kwasu cytrynowego jest optymalna przy niskiej wartości pH (2,0) i wymaga wysokiego stężenia glukozy i niskiego stężenia manganu. Wytwarzanie kwasu szczawiowego jest najbardziej wydajne przy pH 5,0–8,0 i nie zachodzi przy pH 3,0. Natomiast wytwarzanie kwasu glukonowego jest optymalne przy pH 6,0, a nie zachodzi przy pH 2,5. Kwas glukonowy i kwas cytrynowy mogą być metabolizowane przez Aspergillus niger, podczas gdy kwas szczawiowy nie jest wchłaniany i metabolizowany i gromadzi się w podłożu. Dlatego akumulacja kwasu szczawiowego jest główną przyczyną zakwaszenia podłoża w późnych fazach wzrostu w hodowlach okresowych. Jako grzyb saprofityczny Aspergillus niger jest znany ze swojej zdolności do wydzielania enzymów potrzebnych do degradacji polisacharydów i białek pochodzenia roślinnego. Wpływ pH podłoża na wytwarzanie proteazy zbadano bardziej szczegółowo i wykazano, że produktywność i aktywność proteazy jest wysoka przy pH 4,0. Przy wyższym pH aktywność i produkcja proteazy spada. Regulacja produkcji proteaz zależy nie tylko od pH podłoża, ale również od jego składu, w tym od źródła azotu i dostępności metabolizowanego węgla. W produkcję proteaz jest zaangażowanych kilka czynników transkrypcyjnych o szerokiej domenie, w tym regulator azotu AreA, ogólny represor TupA, białko represora węgla CreA i PacC. Jedną z godnych uwagi jest para izoenzymów oczyszczonych na przełomie lat 60. i 70. – glukoamylaza Aspergillus niger. Odkrycia te doprowadziłyby ostatecznie do powszechnego stosowania glukoamylaz Aspergillus niger w przemyśle fermentacyjnym, spożywczym i produkcji napojów, gdzie katalizują one scukrzanie częściowo przetworzonej skrobi do glukozy. Prawdziwa rewolucja w mikrobiologii przemysłowej nastąpiła w kolejnym dwudziestoleciu (w latach 1977–1996) wraz z pojawieniem się biologii molekularnej. Postępy technologiczne i genetyczne Aspergillus niger dokonały się dzięki skoncentrowaniu badań na analizie genów, klonowaniu i analizie sekwencji w chromosomach. Prawdopodobnie najbardziej podstawową techniką analizy molekularnej dowolnego organizmu jest zdolność do przekształcania egzogennego DNA w komórki docelowe i integrowanie ich w genomach biorcy. W ostatnim dwudziestoleciu (w 1997 r. i obecnie) znaczenie Aspergillus niger jako komórkowej fabryki do produkcji enzymów nadal szybko rośnie. Na przykład fitazy zaczęto sprzedawać w 1991 r. jako pierwsze enzymy i do dziś są wciąż używane do poprawy wartości odżywczej pasz dla zwierząt przez uwalnianie fosforu nieorganicznego z kwasu fitynowego, który jest główną formą fosforu organicznego w nasionach roślin. Szacuje się, że rynek produkcji biotechnologicznej fitaz jest wart ponad 150 mln euro rocznie, przy czym jednym z najczęściej stosowanych producentów jest tu Aspergillus niger. Oprócz produkcji pojedynczych istotnych dla przemysłu białek, Aspergillus niger i inne gatunki Aspergillus były w ciągu ostatniej dekady coraz częściej wykorzystywane do syntezy różnych enzymów. Jednym z krytycznych zastosowań takich mieszanek gatunków Aspergillus jest rozkład polisacharydów roślinnych, w którym celuloza, hemiceluloza i pektyna mogą być upłynniane do oligosacharydów i monosacharydów. Okazuje się, że liczba genów Aspergillus niger, które zgodnie z przewidywaniami kodują enzymy zdolne do degradacji biomasy roślinnej, wynosi ponad 170. Te i kolejne badania molekularne zmierzają do opracowania izolatów Aspergillus niger o zwiększonych zdolnościach do degradacji biomasy roślinnej. Wpływ takich komórkowych fabryk Aspergillus niger umożliwia odnawialne wytwarzanie materiału wyjściowego do produkcji biopaliw i innych procesów przemysłowych z materiału roślinnego. W konsekwencji przyszłe szczepy Aspergillus niger mogą umożliwić przejście z naszej obecnej gospodarki opartej na paliwach kopalnych do gospodarki opartej na biologii, dzięki której przyszłe paliwo będzie wytwarzane ze źródeł odnawialnych. Ogólnie rzecz biorąc, od 1996 r. do dnia dzisiejszego poczyniono znaczne postępy w ekspresji enzymów przy użyciu Aspergillus niger, przy czym osiąga się coraz wyższe wydajności produkcji wydzielanych białek (np. glukoamylazy – 30 g/l). Ze względu na to, że metabolity wtórne mikroorganizmów są bogatym źródłem nowych bioaktywnych produktów, skupia się obecnie uwagę na ustanowieniu Aspergillus niger jako szczepu platformy przemysłowej do odkrywania leków i produktów naturalnych do syntezy peptydów nierybosomalnych. Niektóre z tych nowych odkrytych produktów wykazały zwiększoną aktywność antypasożytniczą w porównaniu z istniejącymi lekami.

Podsumowując jedno stulecie po przełomowej pracy Jamesa Currie (1917) nad mikrobiologiczną produkcją kwasu cytrynowego oraz innymi zdolnościami Aspergillus niger świadczącymi o ich wszechstronności metabolicznej, można powiedzieć, że jest on najbardziej wszechstronną platformą z grzybów strzępkowych, którą można teraz wykorzystać do produkcji kwasów, białek, enzymów i leków. Na skalę przemysłową produkuje się: kwas cytrynowy, glukoamylazę, laktoferynę, β-galaktozydazę, glukoamylazę, oksydazę glukozy, hemicellulazę, proteazy, fitazę, pektynazę, chymozynę, arabinazę, asparaginazę, katalazę, celulazę, lipazę, ksylanazę oraz inulinazę. W 2007 r. opublikowano wyniki sekwencjonowania genomu Aspergillus niger, szczepu CBS 513.88, który jest pochodną Aspergillus niger NRRL 3122, skonstruowanego w procesie klasycznej mutagenezy do produkcji glukoamylazy A. W tym to czasie dostępne były również trzy zsekwencjonowane genomy Aspergillus: Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae i Aspergillus fumigatus. Genomy te wykorzystuje się do różnych zastosowań, jakie stwarza rodzaj Aspergillus: odpowiednio modelowy organizm, producent żywności i grzyb patogeniczny dla człowieka. Publikacja zsekwencjonowanego genomu Aspergillus niger była pierwszą i dotyczącą zapewne najważniejszego przemysłowego genomu z rodzaju Aspergillus. Była to ważna analiza genomu szczepu CBS 513.88 Aspergillus niger, który jest jednym z najbardziej wszechstronnych metabolicznie organizmów wykorzystywanych w mikrobiologii przemysłowej. Liczne wyjaśnienia dotyczące przydatności Aspergillus niger do produkcji kwasu cytrynowego oraz różnych enzymów i metabolitów zostały zidentyfikowane na podstawie zsekwencjonowanego genomu 33,93 Mpz, z szacowanymi 14 165 genami. Przewidywano duplikację genów, które doprowadziły do ekspansji genów niezbędnych do produkcji szczawiooctanu, prekursora cytrynianu, co wyjaśnia niezwykłą zdolność produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger. Hipoteza ta została poparta bardzo niedawną kompleksową porównawczą analizą genomiczną szczepów z rodzaju Aspergillus. Stwierdzono, że jest to szeroki i różnorodny gatunek, zawierający szczepy z różnymi cechami fizjologicznymi. Analiza porównawcza genomów dwóch szczepów Aspergillus niger – szczepu ATCC 1015 wytwarzającego duże ilości kwasu cytrynowego i szczepu CBS 513.88 produkującego enzymy – wykazała różnorodność w obrębie tego gatunku.

Wszechstronność wykorzystania substancji odżywczych przenoszonych przez przypuszczalne transportery u Aspergillus niger, jak wynika z analizy sekwencji genomu, jest znacznie większa niż u Aspergillus nidulans lub Aspergillus fumigatus. Przypuszcza się, że geny te umożliwiają pobieranie węgla i azotu z różnych źródeł lub wykrywanie ich. Odkryto nowe przypuszczalne loci cząsteczek bioaktywnych metabolitów wtórnych na podstawie obecności genu kodującego syntazę poliketydową (PKS) i NRPS. Rzeczywiście, obserwacje te zostały potwierdzone przez niedawne porównawcze analizy genomowe rodzaju Aspergillus, które wskazują, że Aspergillus niger CBS 513.88 ma od 57 do 81 przewidywanych klastrów wtórnego metabolitu, co czyni go najbardziej różnorodnym wśród gatunków rodzaju Aspergillus. Zidentyfikowano wiele przewidywanych genów kodujących proteazy, co stanowi znaczące wyzwanie dla przemysłowej produkcji białka. Ponadto stwierdzono obecność klastrów genów przewidywanych do biosyntezy mikotoksyn fumonizyny i ochratoksyny A. Kolejne analizy metabolomiczne sugerują, że do 10% przemysłowych izolatów Aspergillus niger jest w stanie wyprodukować te potencjalne czynniki rakotwórcze, które przy użyciu stosowanych technologii mogą być usunięte z genomu. Dalsze odczytywanie funkcji genów z czasem było możliwe przy użyciu internetowych baz danych genomów i portali analitycznych, co zwiększyło tempo adnotacji funkcjonalnych genów. Rzeczywiście, eksploracja genomu kwasotwórczego szczepu Aspergillus niger ATCC 1015 przy użyciu publicznie dostępnych analiz portalu FungiDB wskazuje, że z 14 165 przypuszczalnych genów 4491 (około 41%) koduje produkty opisane jako „hipotetyczne białko”, któremu również brakuje określonej funkcji. Ta genomowa „czarna skrzynka” stanowi wyzwanie dla zrozumienia metabolizmu Aspergillus niger.

W ostatnich dwóch dekadach w procesach ulepszania szczepów (edycji genomu) stosuje się system CRISPR/Cas9 do wycinania dowolnej sekwencji DNA o wysokiej specyficzności. Technologię CRISPR/Cas9 wykorzystano w celu usuwania wielu genów u Aspergillus niger do biotechnologicznej produkcji kwasu galakturonowego. Pochodzący z kwasu D-galakturonowego, głównego składnika pektyny, naturalnego polimeru, kwas galakturonowy jest stosowany jako prekursor nylonu i kosmetyków do pielęgnacji skóry. Problemem jest jednak ściana komórkowa grzybów strzępkowych. Zabiegi te wykonuje się na protoplastach komórek Aspergillus niger. Do ulepszania szczepów produkcyjnych stosuje się więc także strategie, które obejmują wykorzystanie efektywnych promotorów, takich jak promotory trpC, gpdA lub polimerazy RNA III, takich jak U6 do ekspresji endonukleazy lub gRNA in vivo, optymalizacji kodonów Cas9, przejściowej ekspresji endonukleazy, integracji endonukleazy z genomem gospodarza, dostarczenia syntetyzowanego in vitro gRNA lub oczyszczonej endonukleazy.

Z zastosowaniem różnych konstruktów Aspergillus niger produkuje na skalę przemysłową takie metabolity, jak: kwas cytrynowy, glukoamylaza, laktoferyna, lipaza, ksylanaza, inulinaza, β-galaktozydaza, oksydaza glukozy, hemicellulaza, proteazy, fitaza, celulaza, pektynaza, chymozyna, arabinaza, asparaginaza, katalaza. Fermentacja kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger była badana przez prawie 100 lat, współczesna wydajność produkcji tego kwasu osiąga wartość powyżej 200 g/l przy ponad 90% konwersji cukru do kwasu cytrynowego. Produkcja enzymów też jest bardzo wydajna, ale wydajności handlowe są zastrzeżone. Glukoamylaza jest wydzielana w ilościach powyżej 10 g/l (tab. 6.1, na s. 168). Zgodnie z oczekiwaniami często saprofity izolowane z gleb i gnijącej roślinności, jak Aspergillus niger, posiadają szereg genów kodujących celulazę, ksylanazę, amylazę i pektynazę. Jednym z priorytetów badawczych w ostatnich latach stało się wykorzystanie grzybów takich jak Aspergillus niger do produkcji celulazy w celu degradacji niedrogich materiałów celulozowych do glukozy z wysoką wydajnością.

6.2.2. Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae – gatunek, który obejmuje kilka szczepów fermentacyjnych – ma bogatą historię zastosowania w azjatyckim przemyśle spożywczym do produkcji sosu sojowego, wina ryżowego (sake), octu i wielu innych produktów. Podobnie jak Aspergillus niger, Aspergillus oryzae znajduje się na liście mikroorganizmów GRAS, co sprawia, że jego produkty mogą być bezpiecznie stosowane w przemyśle spożywczym. W minionym stuleciu Aspergillus oryzae był wykorzystywany do produkcji kwasu kojowego jako głównego metabolitu oraz produkcji enzymów, głównie proteaz, α-amylaz i hydrolaz. Dzięki optymalizacji warunków fermentacji, Aspergillus oryzae może produkować ponad 100 g/l kwasu kojowego w hodowli płynnej z glukozą jako źródłem węgla. Kwas kojowy działa antybakteryjnie na bakterie tlenowe. Ze względu na nietoksyczne właściwości jest on stosowany jako dodatek do żywności, kosmetyków, farmaceutyków. Aspergillus oryzae jest również w stanie wytwarzać duże ilości kwasu jabłkowego w określonych warunkach fermentacji, dając możliwości opracowania wydajnego szczepu produkującego kwas jabłkowy z wykorzystaniem inżynierii genetycznej. W mutancie Aspergillus oryzae 2103a-68, istniejąca nadekspresja trzech genów kodujących karboksylazę pirogronianową, dehydrogenazę jabłczanową i transporter jabłczanu w połączeniu może znacznie zwiększyć wydajność produkcji kwasu jabłkowego do 154 g/l w podłożu z glukozą. Oprócz kwasu kojowego i kwasu jabłkowego Aspergillus oryzae po mutagenezie losowej jest zdolny do produkcji kwasu glukonowego. Inaczej niż Aspergillus niger, produkuje on kwas glukonowy z glukozy głównie z zastosowaniem dehydrogenazy glukozowej zamiast oksydazy glukozowej. Chociaż produkcja kwasu glukonowego przez Aspergillus oryzae (72 g/l) jest niższa niż uzyskana z Aspergillus niger, to jego potencjał wskazuje do zastosowania go w przemysłowej produkcji kwasu glukonowego. Aspergillus oryzae, jako kolejny „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej, przypomina Aspergillus niger w charakterze komórkowej fabryki do przemysłowej produkcji kwasów organicznych. Aspergillus oryzae można stosować do wytwarzania takich enzymów jak proteazy, amylazy, glukoamylazy, celulozy i fitazy. Aspergillus oryzae, jako jeden z najważniejszych szczepów w japońskim przemyśle fermentacyjnym, został użyty do produkcji tempeh, jednego z najstarszych fermentowanych produktów sojowych wytwarzanego w Chinach.

6.2.3. Aspergillus terreus

Gatunek Aspergillus terreus jest zdolny do przemysłowej produkcji kwasu itakonowego. W ciągu ostatnich dziesięcioleci poczyniono znaczne wysiłki w celu identyfikacji biosyntezy szlaku kwasu itakonowego w Aspergillus terreus i osiągnięto duży postęp w jej zrozumieniu, dzięki izolacji kluczowego enzymu – dekarboksylazy cis-akonitynianowej (CAD), który prowadzi konwersję cis-akonitanu do itakonianu. Identyfikacja kluczowych genów w szlaku biosyntezy kwasu itakonowego stanowi solidną podstawę do dalszej poprawy procesu wytwarzania kwasu itakonowego przez Aspergillus terreus. Mimo że dołożono wielu starań w celu zwiększenia wydajności produkcji kwasu itakonowego przez Aspergillus terreus, wzrosła ona niewiele (ok. 80–90 g/l), tj. relatywnie mało w porównaniu z wydajnością kwasu cytrynowego Aspergillus niger (ok. 200 g/l).

6.2.4. Aspergillus flavus

Aspergillus flavus to znany grzyb patogeniczny roślin. Jest odpowiedzialny za zanieczyszczenie różnych ważnych upraw rolnych, w tym pszenicy, kukurydzy, soi i orzechów. Był szeroko badany pod kątem produkcji kwasów organicznych. Wykazano, że podobnie jak Aspergillus oryzae, jest on zdolny do produkcji kwasu jabłkowego i kwasu kojowego. Badania nad produkcją kwasu jabłkowego dostarczyły wielu przydatnych informacji na temat warunków fermentacji i mechanizmów biochemicznych gromadzenia kwasu jabłkowego przez grzyby nitkowate. Pomiar aktywności kilku kluczowych enzymów, w tym wzrost aktywności dehydrogenazy jabłczanowej w cytosolu w porównaniu z fumarazą, liazą izocytrynianową i dehydrogenazą bursztynianową, sugeruje, że gromadzenie się kwasu jabłkowego pochodzi z cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA), w którym pirogronian jest karboksylowany do szczawiooctanu, a ostatecznie jabłczan jest tworzony przez redukcję szczawiooctanu. Biochemiczny mechanizm akumulacji kwasu jabłkowego został wyjaśniony w hodowlach Aspergillus flavus przez poprawę produkcji kwasu jabłkowego głównie za pomocą optymalizacji parametrów procesu fermentacji, jak szybkość mieszania, szybkość napowietrzania, obecność stosownych składników odżywczych i morfologia grzyba w czasie produkcji kwasu jabłkowego. Najwyższe stężenie kwasu jabłkowego (113 g/l) można uzyskać ze 120 g/l glukozy i wszystkimi wyżej wymienionymi czynnikami na optymalnym poziomie. Główną barierą w zastosowaniach przemysłowych Aspergillus flavus jest kwestia bezpieczeństwa ze względu na wytwarzane aflatoksyny groźne dla ludzi i zwierząt. Aflatoksyny są śmiertelnymi mikotoksynami, które mogą powodować aflatoksykozę. Ostra aflatoksykoza prowadzi do śmierci, a przewlekła – może powodować raka. Z powodu tych obaw Aspergillus flavus nie jest uważany za możliwy szczep produkcyjny do produkcji kwasu jabłkowego. Mimo to badania nad produkcją kwasu jabłkowego przez Aspergillus flavus są nadal inspirujące i cenne dla przyszłego stosowania innych gatunków Aspergillus do produkcji kwasów organicznych.

6.2.5. Aspergillus carbonarius

Aspergillus carbonarius wykazuje duży potencjał jako komórkowa fabryka produkująae kwasy organiczne, takie jak kwas cytrynowy (przy pH poniżej 3,0), kwas glukonowy i kwas szczawiowy. W Aspergillus carbonarius podjęto kilka prób zbadania potencjału produkcji kwasów organicznych za pomocą inżynierii genetycznej. Heterologiczna ekspresja karboksylazy fosfoenolopirogronianowej z Escherichia coli i karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej z Actinobacillus succinogenes, pozwoliła zwiększyć przepływ węgla w kierunku gałęzi TCA i spowodować nadprodukcję kwasu cytrynowego u Aspergillus carbonarius. Delecja oksydazy glukozowej, która jest odpowiedzialna za przekształcanie glukozy w kwas glukonowy w Aspergillus carbonarius, doprowadziła również do zwiększonej produkcji kwasu cytrynowego i kwasu szczawiowego w hodowli płynnej przy ściśle określonym pH. W celu metabolizowania ksylozy dokonano ekspresji zmutowanej reduktazy ksylozy, założono zmianę preferencji kofaktora NADPH do NADH, a to zmniejszyło kumulację ksylitolu jako półproduktu w katabolicznym szlaku pentozowym i tym samym zwiększyło wydajność produkcji kwasu cytrynowego u Aspergillus carbonarius. Ponadto Aspergillus carbonarius uczyniono zdolnym do metabolizowania biomasy lignocelulozowej jako substratu do produkcji węglowodorów. Podobnie poszukiwania tańszych substratów w procesach przemysłowych wykazały, że hydrolizat lignocelulozy okazał się również cenny w produkcji kwasów organicznych przez Aspergillus carbonarius. Gatunek ten ma wiele zalet jako producent kwasów organicznych, ale produkuje też ochratoksynę A (OTA) – toksynę, która powoduje zanieczyszczenie artykułów spożywczych, suszonych owoców, winogron, wina i kawy. Jest to nefrotoksyczna, rakotwórcza i teratogenna mikotoksyna, która może mieć szkodliwy wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt domowych. Aspergillus carbonarius wydaje się zawierać wysoki procent szczepów ochratoksygenicznych, które są zdolne do konsekwentnego wytwarzania OTA. Przez ostatnią dekadę prowadzono badania nad poznaniem mechanizmu produkcji OTA przez Aspergillus carbonarius, zarówno w aspekcie biochemicznym, jak i fizykochemicznym (warunki wzrostu). Okazało się, że uszkodzona syntaza poliketydowa zaangażowana w biosyntezę części poliketydowej ochratoksyny doprowadziła do braku syntezy OTA w Aspergillus carbonarius. Ostatnio pozyskano trzy szczepy atoksygeniczne, które są naturalnie niezdolne do produkcji OTA i należą do Aspergillus carbonarius. Skuteczna eliminacja produkcji OTA przez inżynierię genetyczną i nowo zidentyfikowane szczepy atoksygeniczne mogą stanowić doskonałe perspektywy dla biotechnologicznego zastosowania Aspergillus carbonarius.

6.2.6. Penicillium chrysogenum

Penicillium chrysogenum (aktualnie Penicillium rubens) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych grzybów w przyrodzie. Od czasu odkrycia penicyliny przez Alexandra Fleminga wyprodukowanej przez grzyb strzępkowy Penicillium notatum, rodzaj Penicillium został dogłębnie zbadany pod kątem jego zdolności do wytwarzania szerokiej gamy produktów naturalnych (metabolitów wtórnych). Wiele z nich jest stosowanych w mikrobiologii przemysłowej i medycynie. Penicillium chrysogenum (Penicillium rubens) jest najbardziej cenionym z 549 gatunków Penicillium, które tworzą ten rodzaj. Jest znany jako przemysłowy producent antybiotyku β-laktamowego, w szczególności penicyliny. Szczepy produkcyjne powstały jako konstrukty w procesach ulepszania szczepów. Program CSI (Classical Strain Improvement) rozpoczęty w 1943 r. od izolacji Penicillium chrysogenum NRRL 1951 doprowadził do sukcesu, polegającego na tym, że szczep jest zdolny do wzrostu w hodowlach płynnych. Szczep ten został poddany seryjnym procesom mutacji indukowanych przez promieniowanie ultrafioletowe 275 nm i promieniowanie rentgenowskie, przez działanie kwasu musztardowego, nitrozo-metyloguanidyny oraz wybór pojedynczych zarodników i selekcję pod kątem utraty pigmentów. Uzyskano lepszy wzrost w przemysłowych fermentorach na dużą skalę i zwiększony poziom produkcji penicyliny. Programy CSI były prowadzone w kilku firmach, dzięki czemu osiągnięto wzrost wydajności produkcji penicyliny o co najmniej trzy rzędy wielkości. W konsekwencji wprowadzono liczne modyfikacje genetyczne w Penicillium chrysogenum. Niektóre z nich zostały szczegółowo zbadane, zwłaszcza amplifikacja klastrów biosyntezy penicyliny oraz inwersje DNA w tym regionie. Program CSI miał duży wpływ nie tylko w kwestii produkcji β-laktamów przez Penicillium chrysogenum, lecz także ogólnie wpłynął na badania całego metabolizmu wtórnego. Rzeczywiście, analiza proteomiczna przeprowadzona między szczepem Penicillium chrysogenum NRRL 1951 a dwoma szczepami pochodnymi – Wisconsin 54-1255 i AS-P-78 – wskazała na obniżony poziom białek związanych z metabolizmem wtórnym w szczepie produkującym wyższe stężenia penicyliny. Sekwencjonowanie genomu Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 ujawniło obecność kilku klastrów genów kodujących biosyntezę wtórnych metabolitów (BGC), oprócz klastra kodującego penicyliny. Produkty BGC są albo peptydami nierybosomalnymi (NRP), albo poliketydami (PK) lub cząsteczkami hybrydowymi. Penicillium chrysogenum wytwarza szeroki asortyment metabolitów wtórnych, takich jak rokwefortiny, fungisporiny (cykliczny hydrofobowy tetrapeptyd), siderofory, kwas penitrowy, hydroksyemodyna, chrysogenina, chryzogina, seskwiterpeny i sorbicylinoidy, posiada zdolność do produkcji innych związków niewykrywanych wcześniej. Ponadto gatunki Penicillium mają zdolność do degradacji lignocelulozy. Geny zaangażowane w biosyntezę, regulację i transport metabolitów wtórnych wydają się być ułożone w genomie w klastrach. Co ważne, klastry tych genów obejmują podstawowe geny biosyntetyczne, które również kodują syntazy poliketydowe (PKSs), peptyd nierybosomalnej syntetazy (NRPS) lub geny syntaz terpenowych. Ostatnio przeprowadzono globalną analizę 24 genomów gatunków Penicillium i zidentyfikowano 1317 domniemanych BGC, w których przeważają dwie klasy oparte na PKS (467) i NRPS (260). W Penicillium chrysogenum w rodzeniu występują 33 geny w metabolizmie wtórnym, które kodują 10 NRPS, 20 PKS, 2 hybrydy NRPS – PKS i syntazę dimetylo-allilotryptofanową. Duża liczba PKS, a także enzymy NRPS występuje również u innych gatunków Penicillium, ale tylko część tych klastrów genowych jest wspólna.

6.2.7. Trichoderma reesei

Pierwszy opis grzyba o nazwie Trichoderma pochodzi z 1794 r. W kolejnych latach zaproponowano, aby rodzaj ten zawierał tylko jeden gatunek – Trichoderma viride – pierwotnie izolowany na Wyspach Salomona podczas drugiej wojny światowej. Izolat został zidentyfikowany jako Trichoderma viride i nazwany QM6a jako część kolekcji US Army Quarter Master Research & Development Center at Natick, Massachusetts USA. Nową nazwę gatunkową Trichoderma reesei otrzymał na część badacza laboratorium Natick Elwyna T. Reese (rys. 6.2). Na początku XXI w. (w 2006 r.) rodzaj Trichoderma zawierał ponad 100 filogenetycznie zdefiniowanych gatunków. W 2014 roku na liście rodzaju Trichoderma znajdowało się 254 gatunki grzybów strzępkowych, w tym jedynie 75 gatunków ze strefy umiarkowanej Europy. Gatunki tego rodzaju wytwarzają szeroką gamę pigmentów od jasnego zielonkawo-żółtego do czerwonawego, niektóre są również bezbarwne. Podobnie pigmentacja konidialna waha się od bezbarwnego do różnych zielonych odcieni, a czasami również szarego lub brązowego.

Rys. 6.2. Karykatura Elwyna T. Reese’a (pracownika naukowego US Army Quarter Master Research & Development Center at Natick, Massachusetts, United States) w stroju grzyba Trichoderma reesei

Gatunki Trichoderma są wszechobecnymi kolonizatorami materiałów celulozowych. Można je znaleźć wszędzie, gdzie następuje rozkład dostępnego materiału roślinnego, a także w ryzosferze roślin, gdzie mogą wywoływać oporność ogólnoustrojową na pewne patogeny. Silne aktywnie degradujące biomasę roślinną szczepy Trichoderma wyizolowano także z karaluchów, małż morskich i skorupiaków oraz termitów. Gatunki Trichoderma to grzyby szybko rosnące, które bardzo skutecznie kolonizują różne siedliska, dzięki efektywnemu wykorzystaniu składników podłoża hodowlanego, jak również zdolności wydzielania metabolitów i enzymów. Są w stanie zasiedlać różnorodne środowiska – od bogatego i zróżnicowanego siedliska tropikalnego lasu deszczowego po ciemny i sterylny fermentor. W różnych warunkach reagują odpowiednio na otoczenie przez regulację wzrostu, konidiacji i produkcji enzymów, dlatego dostosowują swój styl życia do aktualnych warunków. Jednym z tych środowiskowych czynników jest obecność lub brak światła. Poza jego wpływem na wzrost, reprodukcję i biosyntezę metabolitów wtórnych, które są powszechnymi reakcjami świetlnymi u grzybów, stwierdzono również wpływ światła na ekspresję genu celulazy u szczepów Trichoderma. Ten związek między światłem a procesami metabolicznymi został poparty badaniami wykorzystania źródeł węgla przy użyciu fenotypowych mikromacierzy w świetle i ciemności. Badania molekularne potwierdzają istnienie zależności między światłem a syntezą białka G, szlakiem cAMP, metabolizmem siarki i stresem oksydacyjnym.

W ostatnich latach przeprowadzono badania z Trichoderma przez sekwencjonowanie genomów trzech szczepów reprezentujących najważniejsze zastosowania w przemyśle. Są to: sekwencja genomu Trichoderma reesei, przemysłowego „workhorse”, która ujawniła zaskakujący fakt, że mimo znaczenia w produkcji celulazy przemysłowej, genom ten zawiera najmniejszą liczbę genów kodujących enzymy celulolityczne i hemicelulolityczne. Kolejne to genomy Trichoderma atroviride i Trichoderma virens – dwa ważne gatunki biokontroli patogenów. Genomy te są znacząco większe i mają około 2000 genów więcej niż Trichoderma reesei.

Udana kolonizacja danego siedliska przez dowolny organizm w znacznym stopniu zależy od jego potencjału do obrony niszy ekologicznej, która pozwala mu na rozwój i prosperowanie pomimo konkurencji o składniki odżywcze, przestrzeń i światło. Wiele grzybów, a zwłaszcza z rodzaju Trichoderma, to mistrzowie kolonizacji różnych siedlisk. Ich mechanizmy obronne działają na zasadzie produkcji enzymów i wydzielania różnych metabolitów, które stanowią broń chemiczną (fungicydy). Dzięki temu gatunki Trichoderma prowadzą kontrolę antagonistów oraz patogenów grzybowych w środowisku. Tym samym odgrywają one ważną rolę: prowadzą interakcję z rośliną i patogenem. W dzisiejszych czasach najważniejszymi gatunkami do walki z innymi grzybami są Trichoderma atroviride, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens i Trichoderma asperellum, podczas gdy Trichoderma reesei to biotechnologiczny „workhorse”, modelowy organizm używany do łatwego pozyskiwania szczepów rekombinowanych z zastosowaniem metod biologii molekularnej. Gatunki Trichoderma są w stanie zwalczać Ascomycota (workowce), Basidiomycota (podstawczaki) i Oomycetes (lęgniowce), a także nicienie. W swoich działaniach obronnych stosują one enzymy lityczne, w tym proteolityczne, pompy membranowe transportera ABC oraz lotne metabolity jako aktywne środki przeciwko gospodarzom lub zmieniają warunki środowiskowe na niesprzyjające wzrostowi patogenów. Co ciekawe, sukces tych działań zależy od temperatury otoczenia, która może być kluczowa jako czynnik biokontroli w różnych strefach klimatycznych, a przy tym mogą być wydzielane dodatkowe elementy związane z potencjalną skutecznością, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa i oksydazy aminokwasowe. Ponadto wykazano również takie reakcje Trichoderma na gospodarza, jak reakcja na stres, reakcja na niedobór azotu, metabolizm lipidów i procesy sygnałowe.

Stwierdzono, że Trichoderma reesei QM6a jest bardzo dobrym producentem celulazy, co zostało uznane za bardzo cenną właściwość, gdyż świat potrzebuje alternatywnych źródeł paliwa. Jego zdolność do hydrolizy bogatej w celulozę biomasy do glukozy i następczej jej fermentacji do etanolu spotkała się z dużym zainteresowaniem. Ulepszanie szczepu zostało zainicjowane przy użyciu losowej mutagenezy dzikiego typu Trichoderma reesei QM6a w celu pozyskania stabilnego mutanta o wysokiej produkcji enzymów celulolitycznych. Głównym celem była ekonomiczna produkcja enzymów do wytwarzania bioetanolu z odpadów przemysłu drzewnego. Hipersekrecyjny mutant Trichoderma reesei RUT-C30 (ATCC 56765) jest jednym ze szczepów grzybów strzępkowych najczęściej stosowanych do produkcji enzymów celulolitycznych i rekombinowanych białek. Szczep został uzyskany po trzech rundach losowych mutagenezy z typu dzikiego QM6a w programie przesiewowym ukierunkowanym na wytwarzanie dużej ilości celulazy.

Jako silny producent celulazy gatunek ten jest do tej pory najważniejszym gatunkiem wykorzystywanym do celów przemysłowych. Badania nad Trichoderma reesei są obecnie szczególnie skoncentrowane na poprawie wydajności mieszanki enzymów produkowanej w celu obniżenia kosztów produkcji bioetanolu z celulozowego materiału odpadowego. Enzymami jest też zainteresowany przemysł celulozowo-papierniczy oraz włókienniczy. Po serii ulepszeń, wydajność wydzielania białek enzymatycznych przez szczepy przemysłowe osiąga obecnie 100 g/l, 60% głównej celulazy Cel7a (CBHI) i 20% Cel6a (CBHII). Wysoki poziom ekspresji genu celulazy i hemicelulazy można uzyskać w hodowli na celulozie, ksylanie lub mieszaninie polimerów roślinnych. Analizując sekwencje genomu Trichoderma reesei narzędziami inżynierii metabolicznej stwierdzono, że ten przemysłowy „workhorse” ma najmniejszą liczbę genów w obrębie Sordariomycetes, kodujących enzymy degradujące ściany komórkowe roślin. Dostępność sekwencji genomu pobudzała również szeroka analiza wczesnych zmutowanych szczepów i identyfikacja przypuszczalnie korzystnych mutacji, które spowodowały wzrost wydajności produkcji celulaz. Co ciekawe, wydaje się, że nawet wczesne mutanty, takie jak RutC-30, mają znaczne zmiany w genomach.

Grzyby nitkowate są często stosowane do produkcji białek heterologicznych. Przemysłowe zastosowanie Trichoderma reesei jako producenta białek heterologicznych rozpoczęło się ponad 20 lat temu od produkcji chymozyny cielęcej, stosowanej do koagulacji mleka przetwarzanego na sery. Wkrótce potem zaczęto produkować liczne enzymy i białka. Obecnie Trichoderma reesei jest jednym z najczęściej używanych grzybów nitkowatych do produkcji białek heterologicznych (tab. 6.2).

Tabela 6.2. Przykłady głównych klas enzymów produkowanych przez Trichoderma reesei i ich aplikacje przemysłowe

Enzym

Zastosowanie

amylaza (A)

upłynnianie skrobi do cukrów prostych

glukoamylaza (GA)

hydroliza skrobi kukurydzy do syropu bogatego we fruktozę

izomeraza glukozy

piekarnictwo, cukry proste ze skrobi

proteazy

detergenty

renina, chymozyna

koagulacja mleka do produkcji serów

celulaza

przemysł tekstylny

β-glukanaza

w browarnictwie do redukcji lepkości cieczy, pozyskiwanie cukrów prostych z lignocelulozy, w produkcji detergentów, bielenie pulpy

ksylanaza

w piekarnictwie, bielenie pulpy celulozowej, efekt prebiotyku

pektynaza

klarowanie wina i soków, maceracja pulpy

fitaza

uwalnianie fosforu z fityny

lipaza

detergenty, usuwanie plam z tłuszczu

fosfolipaza i lizofosfolipaza (PL, LPL)

piekarnictwo, produkcja żywności, upłynnianie olejów, produkcja papieru, produkcja syropów

Wydajna produkcja enzymów opiera się na skutecznej regulacji i ekspresji genów regulowanych przez odpowiednie promotory. W wielu przypadkach w celu ułatwienia skutecznego wydzielania produktu do podłoża hodowlanego jest stosowany peptyd sygnałowy Cel7a (CBHI). Należy wziąć pod uwagę, że duża ilość enzymów wydzielana do hodowli może być problemem w konkretnym oczyszczaniu białka heterologicznego, gdyż aktywność proteaz może wywołać niepożądane efekty. Enzymy Trichoderma spp. są szeroko stosowane do produkcji dodatków do żywności i pokrewnych produktów. Różne enzymy Trichoderma stosuje się do poprawy procesu warzenia (β-glukanazy), w procesie maceracji owoców, w procesie produkcji soków owocowych (pektynazy, celulazy, hemicelulazy), jako dodatek do pasz w hodowli zwierząt (ksylanazy) i karmy dla zwierząt domowych. Celulazy stosuje się głównie w piekarnictwie, słodownictwie i produkcji alkoholu ze zbóż. Nie tylko enzymy, ale także metabolity Trichoderma spp. są używane jako dodatki. Jednymi z pierwszych produktów wyizolowanych z Trichoderma viride była substancja chemiczna charakterystyczna dla aromatu kokosowego, tj. 6-pentylo-α-piron o właściwościach antybiotycznych. Obecnie po ulepszeniu szczepu Trichoderma viride wydajność produkcji tych aromatów wynosi 7 g/l.

Rodzaj Trichoderma obejmuje także oportunistyczne ludzkie patogeny, które stanowią poważne i często śmiertelne zagrożenie – zwłaszcza dla osób zakażonych HIV oraz pacjentów z obniżoną odpornością. Grzyby te często nie są rozpoznawane ani diagnozowane, gdy skuteczne leczenie jest problematyczne. Gatunki Trichoderma są przyczyną problemów z oddychaniem spowodowanych produkowanymi przez nie związkami organicznymi, ale co ważniejsze, mogą infekować pacjentów z upośledzoną odpornością po przeszczepach i cierpiących na białaczkę lub HIV.

Uprawa grzybów jadalnych Agaricus bisporus (pieczarek) i Pleurotus ostreatus (boczniaków) w pieczarkarniach na całym świecie jest istotna gospodarczo. W latach 80. ubiegłego wieku mieszanka szczepów zidentyfikowana jako Trichoderma harzianum powodowała infekcje w tych gospodarstwach, generujące straty dochodzące do 30%, a nawet 100%. Tak zwana „zielona pleśń” spowodowana głównie przez Trichoderma pleurotum i Trichoderma pleuroticola w plantacjach Pleurotus ostreatus i Trichoderma aggressivum w Agaricus bisporus rozprzestrzeniła się na cały świat.

Obecnie 87% energii zużywanej na świecie pochodzi ze źródeł nieodnawialnych, takich jak gaz ziemny, ropa naftowa i węgiel. Pod tym względem produkcja biopaliw drugiej generacji z odpadów rolnych za pomocą celulaz i hemicelulaz wytwarzanych przez Trichoderma reesei i fermentacja otrzymanych oligosacharydów przez drożdże zapewnia strategię alternatywną. Ekonomicznie uzasadniony byłby konkurencyjny ponad 40-krotny wzrost wydajności, co jest ważnym groźnym wyzwaniem dla naukowców prowadzących badania z Trichoderma.

6.3.Znaczenie grzybów strzępkowych

Globalną wielkość sprzedaży produktów białej biotechnologii oszacowano na 110 mld EUR w 2008 r., a prognozuje się na 450 mld EUR w 2020 r. Firmy europejskie, takie jak AB Enzymes, BASF, Bayer, Chr. Hansen, DSM, DuPont, Novozymes, Puratos i Roal Oy, mają zasięg globalny w stosowaniu grzybów do masowej produkcji kwasów organicznych, białek, enzymów i metabolitów wtórnych. Światowa produkcja kwasu cytrynowego z zastosowaniem grzyba strzępkowego Aspergillus niger wynosi około 1,6 mln t, co znacznie przekracza wielkość produkcji innych kwasów organicznych wytworzonych w procesie fermentacji. Jest to najczęściej stosowany kwas organiczny w żywności, napojach, farmaceutykach oraz zastosowaniach technicznych, a zapotrzebowanie na niego wciąż rośnie. Kwas itakonowy produkowany przez Aspergillus terreus jest używany przez przemysł chemiczny do produkcji żywic syntetycznych, włókien, tworzyw sztucznych, gumy, środków powierzchniowo czynnych i dodatków olejów, więc popyt na ten produkt ciągle rośnie. Inne wielofunkcyjne kwasy organiczne produkowane przez grzyby nitkowate, takie jak kwas bursztynowy, fumarowy i jabłkowy, są wykorzystywane jako towary do produkcji polimerów biodegradowalnych. Enzymy grzybowe są stosowane w produkcji na dużą skalę takich produktów, jak papier i pulpa, żywność i pasza, napoje, wino, detergenty, tekstylia i biopaliwa. Aktywne składniki farmaceutyczne również są z powodzeniem produkowane na dużą skalę przez grzyby strzępkowe. Większość enzymów stosowanych na całym świecie jest produkowana przez grzyby strzępkowe. W 2015 r. wartość światowego rynku enzymów przemysłowych oszacowano na 3,5 mld euro, w tym 48% udziału ma firma Novozymes, a 20% firma Dupont. Najważniejsze w przemysłowej produkcji enzymów jest kilka gatunków Aspergillus, a także inne grzyby, w tym Trichoderma reesei i Myceliophthora thermophila. Różnorodność metaboliczna grzybów i szeroki zakres nisz ekologicznych oznaczają, że wiele gatunków, zwłaszcza grzyby z Basidiomycota, mają znaczny potencjał jako źródła nowych enzymów do przyszłej eksploatacji. Grzybicze związki bioaktywne – od antybiotyków po statyny – uratowały życie milionom ludzi od czasu odkrycia penicyliny przez Aleksandra Fleminga w latach 20. ubiegłego wieku. Są to na ogół metabolity wtórne lub ich pochodne, a ich produkcja przemysłowa jest i będzie kontynuowana. Istnieje znaczny potencjał w identyfikacji i produkcji nowych związków, przeprojektowaniu ich i zmianie za pomocą biologii syntetycznej. Jednak oporność bakterii na antybiotyki obecnie się rozprzestrzenia, a liczba nowo odkrywanych antybiotyków maleje. Patogeny grzybicze zabijają na całym świecie więcej ludzi rocznie niż malaria lub gruźlica (szacunkowo 1,6–2 mln). Głównymi czynnikami sprawczymi ludzkich zgonów są metabolity produkowane przez szczepy z rodzaju Cryptococcus, Candida i Aspergillus, przy czym rodzaj Aspergillus powoduje od 38 do 80% śmiertelności związanej z chorobami grzybiczymi, w zależności od położenia geograficznego. Ważna jest rosnąca potrzeba wykrywania grzybów i ich metabolitów w odniesieniu do bezpieczeństwa żywności, ochrony upraw itp.

Wśród niekonwencjonalnych źródeł pozyskiwania pigmentów, takich jak karotenoidy, melanina, flawina, fenazyna, chinony, a dokładniej monascyna, wiolaceina i indygo, są grzyby strzępkowe. Sukces dowolnej klasy pigmentów wytwarzanych na drodze fermentacji zależy od jego akceptacji przez konsumentów, regulacji prawnych oraz inwestycji kapitałowych. Obecnie wystarczy kilka dni na proces fermentacji, aby do branży spożywczej dostarczono pigmenty takie jak: Monascus, Arpink redTM Penicillium oxalicum, ryboflawina z Ashbya gossypii, likopen i β-karoten z Blakeslea trispora. Na przykład wydajność produkcji β-karotenu wynosi aż 17 g/l podłoża hodowlanego Blakeslea trispora.

Grzyby strzępkowe wykorzystywane w różnych gałęziach przemysłu spożywczego to: Aspergillus acidus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Fusarium domesticum, Fusarium venenatum, Mucor hiemalis, Mucor mucedo, Mucor plumbeus, Mucor racemosus, Penicillium camemberti, Penicillium caseifulvum, Penicillium chrysogenum, Penicillium commune, Penicillium nalgiovense, Penicillium roqueforti, Penicillium gorgonzolae, Penicillium stilton, Penicillium solitum, Rhizopus microsporus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Scopulariopsis flava.

Literatura rekomendowana

Bourdichon F., Hansen E.B. 2012. Food fermentations: Microorganisms with technological beneficial use. Intern. Food Microbiol., 154: 87–97.

Dufosse L., Mireille Fouillaud M., Caro Y., Mapari S.A.S., Sutthiwong N. 2014. Filamentous fungi are large-scale producers of pigments and colorants for the food industry. Current Opinion Biotechnol., 26: 56–61.

Guzmán-Chávez F., Zwahlen R.D., Bovenberg R.A.L., Driessen A.J.M. 2018. Engineering of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum as cell factory for natural products. Front. Microbiol., 9: 2768.

Li D., Tang Y., Lin J., Cai W. 2017. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microb. Cell Fact., 16: 168.

Lubertozzi D. i Keasling J.D. 2009. Developing Aspergillus as a host for heterologous expression. Biotechnol Adv., 27: 53–75.

Meyer V., Andersen M.R., Brakhage A.A., Braus G.H., Caddick M.X., Cairns T.C., de Vries R.P., Haarmann T., Hansen K., Hertz-Fowler C., Krappmann S., Mortensen U.H., Peńalva M.A., Ram A.F.J., Head R.M. 2016. Current challenges of research on filamentous fungi in relation to human welfare and a sustainable bio-economy: a white paper. Fungal Biol. Biotechnol., 3: 6.

Meyer V. 2008. Genetic engineering of filamentous fungi – progress, obstacles and future trends. Biotechnol Adv., 26: 177–185.

Steenwyk J.L., Shen X.X., Lind A.L., Goldman G.H., Rokas A. 2018. A robust phylogenomic time tree for biotechnologically and medically important fungi in the genera Aspergillus and Penicillium. bioRxiv doi: http://dx.doi.org/10.1101/370429.

Yang L. 2016. Development of new Aspergillus fungal cell factories for organic acid production. PhD thesis. Aalborg University Copenhagen. https://doi.org/10.5278/vbn.phd.engsci.00144

7

Enzymy produkowane w skali przemysłowej przez mikroorganizmy

7.1.Wprowadzenie

Enzymy produkowane przez mikroorganizmy są powszechnie wykorzystywane na całym świecie w różnych gałęziach przemysłu, w tym przy produkcji żywności, w rolnictwie, w medycynie, przy produkcji chemikaliów oraz w energetyce. Enzymy wykorzystywane w różnego rodzaju procesach charakteryzują się szybkim działaniem i niskim poborem energii, a przy tym małymi kosztami, są też nietoksyczne i przyjazne środowisku. Dzięki zastosowaniu rekombinacji oraz inżynierii białek można tak ulepszać mikroorganizmy, aby spowodować nadprodukcję enzymów w dużych ilościach, które zaspokoją popyt. Zapotrzebowanie na enzymy rośnie do 7% rocznie i w latach dwudziestych naszego stulecia osiągnie wartość prawie 6,2 mld dolarów USA.

Enzymy to cząsteczki biologiczne o naturze białkowej, z wyjątkiem katalitycznych cząsteczek RNA (rybosomów), które działają jako katalizatory wspierające prawie wszystkie reakcje chemiczne wymagane do podtrzymania życia. Enzymy są wysoce specyficzne. Przyspieszają tempo danej reakcji przez obniżenie energii aktywacji bez przechodzenia w jakąkolwiek inną trwałą formę, a tym samym, są niezbędnymi biocząsteczkami podtrzymującymi życie. Do katalizowania reakcji wymagają zazwyczaj odpowiedniej temperatury, pH i ciśnienia oraz braku zanieczyszczeń chemicznych, które hamowałyby katalizowanie reakcji. Enzymy są podatne na działanie pojawiającego się produktu reakcji, który może hamować reakcję na zasadzie sprzężenia zwrotnego. W warunkach odbiegających od optymalnych enzymy ulegają denaturacji.

Enzymy to duże makrocząsteczki złożone z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Ich masy cząsteczkowe wynoszą od kilodaltonów (insulina) do megadaltonów (rybosom). Katalityczne miejsca tych makrocząsteczek często znajdują się głęboko w hydrofobowych kieszeniach, które określa specyficzność ich substratu. Ta specyficzna właściwość enzymu katalizowania reakcji jednego typu związku chemicznego stanowi podstawę jego klasyfikacji i nazwy. Duża liczba enzymów wyizolowana i scharakteryzowana po 1940 r. wymagała uregulowania ich nomenklatury. Międzynarodowa Unia Biochemii i Biologii Molekularnej (IUBMB) w porozumieniu z Międzynarodową Unią Czystej i Stosowanej Chemii (IUPAC) założyły Komisję Enzymów (EC) odpowiedzialną za kierowanie nazewnictwem i systematyczną klasyfikacją enzymów. W zależności od rodzaju katalizowanej reakcji enzymy podzielono na sześć głównych klas:

1. 1) oksydoreduktazy (EC1), które przenoszą cząstki wodoru, tlenu lub elektrony między cząsteczkami chemicznymi; są to dehydrogenazy, oksydazy, oksygenazy, peroksydazy;

2. 2) transferazy (EC2), które przenoszą grupy atomów z jednej cząsteczki do drugiej; są to fruktotransferazy, transketolazy, acylotransferazy, transaminazy;

3. 3) hydrolazy (EC3), które przy udziale wody rozszczepiają wiązania; są to proteazy, amylazy, acylazy, lipazy, fosfatazy, kutynazy;

4. 4) liazy (EC4), które odszczepiają odwracalnie lub nieodwracalnie grupy bez udziału wody; są to hydratazy, dehydratazy, dekarboksylazy, fumaraza, arginosukcynaza, liazy pektynowe;

5. 5) izomerazy (EC5), które przemieszczają grupę z jednej pozycji do drugiej w ramach jednej cząsteczki; są to izomerazy trans-cis, epimerazy, racemazy;

6. 6) ligazy (EC6), które kowalentnie łączą dwie cząsteczki, wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP lub podobnych trifosforanów; są to syntetazy i ligazy.

Do przemysłowej produkcji enzymów wykorzystuje się łatwo dostępne i szybko rosnące mikroorganizmy. W celu zwiększenia produkcji enzymów i rozwoju naukowego dokonuje się zmian genetycznych z zastosowaniem rekombinacji DNA na ich komórkach. Enzymy pozyskiwane z różnych mikroorganizmów wykazują lepsze działanie w szerokim zakresie różnych warunków fizycznych i chemicznych, więc są chętnie wykorzystywane w różnych sektorach przemysłowych. Ponadto są też stosowane w leczeniu zaburzeń zdrowia związanych z niedoborem ludzkich enzymów spowodowanych defektami genetycznymi. Na przykład pacjenci z wrodzonym niedoborem sacharazy-izomaltazy nie są w stanie przyswajać sacharozy, a zatem enzym ten (β-fruktofuranozyd, fruktohydrolaza) musi być podawany doustnie. W przypadkach choroby zwanej fenyloketonurią, która jest powodowana niedoborem enzymu produkowanego w wątrobie, hydroksylazy fenyloalaninowej, dochodzi do zwiększenia ilości fenyloalaniny we krwi i tkankach, powodującej zaburzenia neurologiczne oraz uszkodzenia mózgu. Defekt ten powoduje, że fenyloalanina nie może się przekształcić w inny aminokwas – tyrozynę – niezbędną do budowania hormonów tarczycy lub melaniny.

Obecnie do produkcji enzymów na skalę przemysłową wykorzystuje się następujące grupy organizmów: grzyby (60%), bakterie (24%), drożdże (17%), Streptomyces (2%), zwierzęta wyższe (6%) i rośliny wyższe (4%).

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego mogą być pozyskiwane z hodowli mikroorganizmów poddanych różnym manipulacjom genetycznym, zgodnie z potrzebą ich przemysłowego zastosowania. Wykorzystuje się je na coraz większą skalę w produkcji żywności, farmaceutyków, tekstyliów, papieru, skór i w innych branżach ze względu na wysoką wydajność i jakość.

7.2.Enzymy produkowane przez mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

7.2.1. Oksydoreduktazy (EC1)

7.2.1.1. Oksydaza glukozowa (E.C.1.1.3.4)

Oksydaza glukozowa katalizuje utlenianie glukozy do glukono-δ-laktonu przy użyciu tlenu atomowego jako akceptora elektronów z jednoczesnym wytwarzaniem nadtlenku wodoru. Glukono-δ-lakton jest następnie hydrolizowany do kwasu glukonowego przez laktonazy, podczas gdy wytworzony nadtlenek wodoru jest rozkładany na tlen i wodę przez katalazy. Oksydazę glukozową skutecznie produkują grzyby strzępkowe, takie jak: Aspergillus tubingensis, Aspergillus oryzae, Aspergillus carbonarius, Aspergillus flavus i Aspergillus niger, natomiast wśród gatunków rodzaju Penicillium – Penicillium notatum, Penicillium funiculosum, Penicillium amagasakiense, Penicillium variabile i Penicillium fellutanum. Oksydaza glukozowa jest produkowana na skalę przemysłową przez szczepy Aspergillus niger ZBY-7 i Penicillium amagasakiense i Penicillium purpurogenum.

7.2.1.2. Peroksydaza (E.C.1.11.1.7)

Peroksydazy są oksydoreduktazami, które przekształcają różne związki w produkty utlenione lub spolimeryzowane, atakując je wolnymi rodnikami. W szczególności aktywność peroksydazy jest związana z oddawaniem elektronów żelazicyjankom i witaminie C. Peroksydazy są produkowane w dużych ilościach przez takie rośliny, jak chrzan (Armoracia rusticana), papaja (Carica papaya), banan (Musa paradisiaca). Wśród szczepów bakteryjnych duże ilości peroksydazy produkują Escherichia coli, Bacillus sp. i Pseudomonas sp., wśród szczepów grzybów – Thanatephorus sp., Auricularia sp., Pleurotus ostreatus, Umbelopsis isabellina i Penicillium geastrovirus, a wśród drożdży – Candida tropicalis i Debaryomyces polymorphus.

7.2.1.3. Lakazy (E.C.1.10.3.2)

Lakazy są enzymami należącymi do grupy oksydaz fenolowych, które utleniają związki fenolowe i aromatyczne, w tym niektóre aminy, etery i estry za pomocą pojedynczych elektronów. Ta wielopierścieniowa niebieska oksydaza łączy transfer elektronów, powodując utlenianie cząsteczek wody. Największe ilości lakaz wytwarzają grzyby białej zgnilizny: Pleurotus florida, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus tailandia. Z innych grzybów producentami lakazy są Trametes sp., Coriolopsis sp., Grifola sp., Lentinula sp. Ponadto lakazy są również wytwarzane przez grzyby patogeniczne: Gaeumannomyces graminis, Magnaporthe grisea, Ophiostoma novo-ulmi, Marginella sp., Melanocarpus albomyces, Monocillium indicum, Neurospora crassa i Podospora anserina.

7.2.1.4. Katalazy (EC1.11.1.6)

Katalazy są enzymami przeciwutleniającymi, które katalizują rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Zgodnie ze strukturą i sekwencją, katalazy można podzielić na trzy klasy:

1. 1) katalaza monofunkcyjna (typowa katalaza),

2. 2) peroksydaza (katalaza),

3. 3) pseudokatalaza (katalaza Mn).

Obecnie jest znanych kilkanaście szczepów niepatogennych, które mogą wytwarzać katalazy: Penicillium variable, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Staphylococcus, Micrococcus lysodeiktious, Campylobacter jejuni, Desulfovibrio gigas, Thermoascus aurantiacus, Bacillus subtilis i Rhizobium radiobacter. Kocuria sp. ASB107 jest zdolna do produkcji stosunkowo dużej ilości alkalicznej katalazy i jest rekomendowana do zastosowania w przemyśle.

7.2.2. Hydrolazy (EC3)

7.2.2.1. Acylaza penicyliny (E.C.3.5.1.11)

Acylaza penicyliny, formalnie znana jako amidaza penicyliny, jest ważnym enzymem terapeutycznym. Odgrywa istotną rolę w produkcji antybiotyków β-laktamowych. Początkowo została wyizolowana z Penicillium chrysogenum. Najważniejszymi źródłami przemysłowej produkcji acylazy penicyliny G są Escherichia coli i Bacillus megaterium. Producentami acylazy penicyliny są:

1. 1) bakterie – Acetobacter turbidans, Achromobacter sp., Alcaligenes faecalis, Arthrobacter viscosus, Bacillus badius, Bacillus megaterium i promieniowce Streptomyces lavendulae i Streptomyces mobaraensis;

2. 2) grzyby strzępkowe – Aspergillus terreus i Fusarium sp.

Mimo że mnóstwo mikroorganizmów wytwarza acylazę penicylinową, w skali komercyjnej stosuje się rekombinowane szczepy Escherichia coli i Bacillus megaterium jako szczepy przemysłowe.

7.2.2.2. Amylazy

Amylazy hydrolizują wiązania α-1,4-glikozydowe w skrobi, dlatego nazywane są również hydrolazami glikozydowymi. Dzieli się je na α-amylazy (E.C. 3.2.1.1), β-amylazy (E.C. 3.2.1.2) i glukoamylazy (E.C. 3.2.1.3). α-Amylazy katalizują hydrolizę cząsteczek skrobi w sposób losowy, do liniowego (glukoza) i rozgałęzionego oligosacharydu (maltoza) o różnych długościach łańcucha. β-Amylazy i glukoamylazy hydrolizują substrat z końca nieredukującego, uzyskując kolejno krótsze produkty końcowe. Amylazy wytwarzają liczne szczepy bakteryjne: Bacillus, w tym Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus mesentericus, Bacillus vulgaris, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans. Inne szczepy bakterii: Caldimonas taiwanensis, Chromohalobacter sp., Corynebacterium gigantea, Geobacillus thermoleovorans, Lactobacillus fermentans i Lactobacillus manihotivorans. Niektóre szczepy halofilne są również zdolne do wytwarzania amylaz, w tym Bacillus dipsosauri, Halobacillus sp., Haloarcula hispanica, Chromohalobacter sp. i Halomonas. Wśród producentów amylaz wymienia się też grzyby z rodzaju Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus kawachii i Aspergillus flavus) i Penicillium sp. (Penicillium brunneum, Penicillium fellutanum, Penicillium expansum, Penicillium chrysogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium janthinellum, Penicillium camemberti i Penicillium olsonii). Największym źródłem amylaz są gatunki bakterii należące do Bacillus (Bacillus amyloliquefaciens i Bacillus licheniformis) oraz szczepy grzybów należące do rodzaju Penicillium (Penicillium brunneum). Amylazy stanowią około 25% światowego rynku enzymów.

7.2.2.3. L-Asparaginaza (E.C.3.5.1.1)

L-Asparaginaza katalizuje deaminację L-asparaginy do kwasu L-asparaginowego i amoniaku. Najważniejszymi bakteryjnymi źródłami L-asparaginazy są Erwinia aroideae, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Serratia marcescens, Vibrio succinogenes, Citrobacter freundii i Klebsiella aerogenes, Thermus aquaticus i Thermus thermophilus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, Alcaligenes faecalis. Asparaginaza jest też produkowana przez grzyby, w tym Aspergillus terreus, Mucor sp., Penicillium sp., Fusarium sp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra i Rhodotorula toruloides. Do promieniowców silnie produkujących ten enzym należą szczepy Nocardia sp., Streptomyces sp. i Amycolactopsis keratinophilum.

7.2.2.4. Celulazy

Celulazy hydrolizują wiązania β-1,4-glikozydowe celulozy. Syntetyzują je pewne mikroorganizmy podczas wzrostu na podłożach zawierających celulozę. Do całkowitej hydrolizy materiałów celulozowych są potrzebne trzy różne typy celulaz: endoglukanaza (E.C.3.2.1.4), egzoglukanaza (celobiohydrolazy)(E.C.3.2.1.74) i β-glukozydaza (E.C.3.2.1.21). Endoglukanaza hydrolizuje wiązania glikozydowe substratów celulozowych, podczas gdy egzoglukanaza atakuje ich krystaliczne końce, uwalniając celobiozę, która jest przekształcana do glukozy przy udziale β-glukozydazy. Główną zaletą biokonwersji z udziałem tych enzymów jest stosowanie tanich substratów, takich jak słoma ryżowa, skórki manioku, skórki bananów itp., które składają się głównie z celulozy i hemiceluloz (75–80%). Dlatego naukowcy na całym świecie są zainteresowani nowymi mikroorganizmami, które mogą wytwarzać celulazy z wysoką wydajnością i specyficznością. Celulazy izolowano z różnych szczepów grzybów, drożdży i bakterii. Wśród najlepiej scharakteryzowanych układów celulaz, grzyby są ich głównymi producentami. Dobrze poznanymi producentami celulaz są gatunki Aspergillus niger, Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Penicillium pinophilum, Penicillium funiculosum, Fusarium solani i Sporotrichum pulverulentum. Silnymi producentami celulaz są Trichoderma viride i Trichoderma asperellum. Do bakterii wytwarzających celulazy należy zaliczyć szczepy Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Microbispora sp., Thermomonospora sp., Clostridium sp. i Ruminococcus sp. Termofile produkują celulazy korzystne dla procesów przemysłowych, które tolerują temperatury w zakresie 50–90°C i są mniej podatne na zanieczyszczenie. Przykładami takich obiecujących mikroorganizmów są bakterie i grzyby należące do rodzaju Clostridium, Cellulomonas, Thermomonospora, Trichoderma i Aspergillus.

7.2.2.5. Chitynazy

Chitynazy należą do rodziny hydrolaz glikozylowych. Hydrolizują wiązania β-1-4 glikozydowe N-acetylo-D-glukozaminy w chitynie do jednostek monomeru (N-acetylo-D-glukozoamina). Istnieją dwa rodzaje chitynaz: endochitinazy (E.C.3.2.1.14) i egzochitinazy (E.C.3.2.1.52). Endochitinazy losowo rozszczepiają chitynę w wewnętrznych miejscach łańcucha do chitotriozy, chitotetraozy i diacetylochitobiozy. Egzochitinazy dzieli się na:

1. 1) chitobiozydazy (E.C.3.2.1.29), które uwalniają diacetylochitobiozę z nieredukującego końca chityny;

2. 2) β-1,4-N-acetyloglukozaminidazy (E.C.3.2.1.30), które rozszczepiają produkty endochitynaz i chitobiozydaz, wytwarzających jednostki N-acetylo-D-glukozaminy.

Szczepy bakteryjne, które wytwarzają chitynazy należą do rodzajów Serratia, Chromobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Arthrobacter i Aeromonas. Z rodzaju Streptomyces znaczne ilości chitynaz produkują Streptomyces antibioticus, Streptomyces griseus, Streptomyces plicatus, Streptomyces lividans i Streptomyces aureofaciens. Z grzybów strzępkowych chitynazy produkują szczepy z rodzaju Trichoderma, Penicillium, Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor, Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium, Stachybotrys i Agaricus.

7.2.2.6. Fitazy

Fitazy należą do rodziny fosfohydrolaz. Katalizują hydrolizę fitynianu do inozytolu i kwasu ortofosforowego. Fityniany – sole kwasu fitynowego – stanowią formę zapasową fosforanów i składników mineralnych w ziarnach zbóż (pszenica, żyto, jęczmień, owies, ryż, gryka), nasionach, orzechach, warzywach, szczególnie nasionach roślin strączkowych i owocach. Fitazy są klasyfikowane jako 3-fitaza (E.C. 3.1.3.8) i 6-fitaza (E.C. 3.1.3.28), które inicjują defosforylację fitynianu odpowiednio w pozycji C3 i C6. Fitazy mikrobiologiczne hydrolizują fosforan z trzeciej pozycji, podczas gdy fitazy roślinne hydrolizują z szóstej pozycji cząsteczki fityny. Po usunięciu pierwszej grupy fosforanowej pozostały fosforan z fityny jest łatwo uwalniany przez fitazy. W innym systemie fitazy są podzielone na cztery grupy, a mianowicie BPP, HAP, CP i PAP. Fitazy BPP pochodzą ze szczepów bakteryjnych, fitazy HAP – z roślin i drobnoustrojów, fitazy CP – z Selenomonas ruminantium, a fitazy PAP – z roślin, zwierząt i grzybów. Większość fitaz izolowanych z grzybów i drożdży klasyfikuje się jako 3-fitazy. Fitaza PhyA Aspergillus niger jest pierwszym dobrze scharakteryzowanym i skomercjalizowanym enzymem. Wśród szczepów grzybów strzępkowych Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus ficuum, Aspergillus oryzae, Aspergillus carneus, Thermomyces lanuginosus i Mucor pusillus są także silnymi producentami fitazy. Szczepy drożdży takie jak Arxula adeninivorans, Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala i Candida krusei wytwarzają fitazy, które są aktywne w środowisku kwaśnym w optymalnej temperaturze 60–74°C. Alkaliczne fitazy bakteryjne mają wysoką aktywność, są oporne na hydrolizę pepsyny i środowisko kwaśne, więc bakterie są preferowane do produkcji fitazy. Takimi obiecującymi szczepami są Pseudomonas syringae, Citrobacter braaki, Obesumbacterium proteus, Klebsiella sp., Bifidobacterium sp.

7.2.2.7. Inulinazy

Inulinazy – enzymy hydrolizujące inulinę – należą do rodziny hydrolaz glikozydowych. Należą do nich: egzoinulinazy (E.C.3.2.1.80), endoinulinazy (E.C.3.2.1.7) 1,2-β-fruktano-1F-fruktozylotransferazy ((E.C.2.4.1.100), 1-egzohydrolazy (E.C.3.2.1.153) lub sacharozo-1F-fruktozylotransferazy (E.C.2.4.1.99). Egzoinulinazy prowadzą degradację inuliny z jej nieredukującego końca, uwalniając fruktozę i glukozę, podczas gdy endoinulinazy hydrolizują wewnętrzne wiązania β-2,1-glikozydowe inuliny do fruktooligosacharydów o różnych długościach łańcucha. 1-Egzohydrolaza działa na inuliny typu fruktanów podobnie jak egzoinulinaza, wytwarzając fruktozę. Działając na inulinę, 1,2-β-fruktano-1F-fruktozylotransferaza wytwarza fruktooligosacharydy, podczas gdy 1F-fruktozylotransferaza specyficznie wytwarza krótkołańcuchowe fruktooligosacharydy z sacharozy. W sumie mikroorganizmy hydrolizują inulinę do glukozy, fruktozy i fruktooligosacharydów. Najważniejszymi producentami inulinaz są szczepy należące do rodzaju Aspergillus, Penicillium, Kluyveromyces, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Torulaspora, Metschnikowia, Lachancea, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces i Xanthomonas. Preferowane są inulinazy produkowane przez grzyby, ponieważ mogą tolerować niskie pH, wysoką temperaturę i dobrze rosną przy niskim stężeniu substratu w podłożu. Z rodzaju Aspergillus skutecznymi producentami inulinaz są: Aspergillus niger, Aspergillus niveus, Aspergillus ficuum, Aspergillus tamari, Aspergillus terreus i Aspergillus tubingensis, a z rodzaju Penicillium silnymi producentami inulinaz są: Penicillium subrubescens, Penicillium expansum, Penicillium purpurogenum, Penicillium rugulosum, Penicillium trzebinski. Wśród szczepów drożdży efektywnymi producentami są Cryptococcus aureus i Zygosaccharomyces cerevisiae.

7.2.2.8. Inwertaza (E.C.3.2.1.26)

Inwertaza, zwana inaczej β-fruktofuranozydazą, β-fruktozydazą, sacharazą, to enzym, który katalizuje hydrolizę wiązania β-D-fruktofuranozydowego sacharozy do glukozy i fruktozy. Producentami inwertazy są grzyby strzępkowe, drożdże i bakterie. Wśród grzybów strzępkowych szczepy z rodzaju Aspergillus i Penicillium są w stanie produkować inwertazy o wysokiej wydajności. Z rodzaju Aspergillus wysoko produktywne są Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus casiellus, Aspergillus oryzae, Aspergillus ochraceus i Aspergillus flavus, a z rodzaju Penicillium – gatunki: Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium pinophilum i Penicillium purpurogenum. Drożdże efektywnie produkujące inwertazę to: Rhodotorula glutinis, Thermomyces lanuginosus, Kluyveromyces marxianus, Leucosporidium antarcticum i Hansenula polymorpha. Bakterie zdolne do produkcji inwertazy to Bacillus cereus oraz Arthrobacter globiformis i Bifidobacterium breve.

7.2.2.9. Keratynazy (E.C.3.4.21/24/99.11)

Keratynazy to ogólnie proteazy serynowe lub metaloproteazy, które hydrolizują keratyny. Na podstawie zawartości siarki (cysteiny) można podzielić keratyny na twarde i miękkie. Keratynazy mogą hydrolizować miękką keratynę (zawierającą do 1% siarki) obecną w materiałach cytoszkieletu w tkankach nabłonkowych, jak również twardą keratynę (zawierającą do 5% siarki) obecną w tkankach ochronnych – we włosach, paznokciach, piórach, dziobach i pazurach ptaków. Największymi producentami keratynaz są Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis. Keratynazy produkują także inne gatunki bakterii, jak np. Aeromonas sp., Arthrobacter creatinolyticus, Brevibacillus sp., Brevundimonas terrae, Caldicoprobacter algeriensis, Chryseobacterium sp., Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis. Wśród grzybów skutecznymi producentami są Alternaria sp., Aspergillus sp., Chrysosporium sp., Penicillium sp. i Trichophyton sp. Wśród promieniowców efektywnie degradują keratynę Streptomyces sp., Thermoactinomycetes sp., Actinomadura keratinilytica.

7.2.2.10. Laktaza (E.C.3.2.1.23)

Laktazy, głównie β-galaktozydaza, należą do hydrolaz glikozydowych. Są to dobrze znane biokatalizatory, które mogą katalizować zarówno reakcje hydrolityczne, jak i transglikozylacyjne. Laktoza jest głównym składnikiem produktów mlecznych. β-Galaktozydaza katalizuje hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy. Ze względu na ich właściwości transglikozylacyjne, β-galaktozydazy są stosowane do produkcji galaktooligosacharydów (GOS). Na podstawie optymalnego pH dla aktywności enzymów laktazy dzieli się na dwa rodzaje: obojętne i kwaśne. β-Galaktozydazy są wszechobecnymi enzymami wytwarzanymi przez rośliny, zwierzęta i mikroorganizmy. Znajdują się w takich roślinach, jak owoce (brzoskwinie, morele, jabłka), lucerna, kawa, migdały, czubki dzikich róż, nasiona soi i wielu innych. Enzym ten jest również wytwarzany przez ślimaki, owce, króliki, psy, kozy, szczury i wiele innych zwierząt. Do mikroorganizmów wytwarzających β-galaktozydazy należą bakterie, grzyby i drożdże. Wydajnymi producentami β-galaktozydazy są bakterie należące do rodzaju Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Escherichia coli. Co więcej, termofilne bakterie kwasu mlekowego wytwarzają β-galaktozydazy, które mają wysoką stabilność i aktywność w wysokich temperaturach. Spośród grzybów szczepy należące do rodzaju Aspergillus, Mucor i Neurospora także są silnymi producentami β-galaktozydazy. Szczepy drożdży należące do rodzaju Kluyveromyces i Candida są potencjalnymi kandydatami do produkcji enzymów. Komercyjnie do wytwarzania β-galaktozydazy są stosowane szczepy Aspergillus i Kluyveromyces.

7.2.2.11. Lipazy (E.C.3.1.1.3)

Lipazy katalizują hydrolizę triglicerydów do glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych na granicy faz olej–woda. W zastosowaniach przemysłowych producentami lipaz są najczęściej mikroorganizmy. Spośród bakterii Bacillus najlepszymi potencjalnymi producentami lipaz są gatunki: Bacillus alcalophilus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus i Bacillus stearothermophilus. Ważne na rynku są lipazy wytwarzane przez grzyby należące do rodzajów Penicillium (Penicillium camemberti, Penicillium roquefortii), Rhizopus (Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus oryzae i Rhizopus niveus), Aspergillus sp. i Mucor sp. Szczepy drożdży wytwarzające lipazy to Candida rugosa, Candida tropicalis, Candida antarctica, Candida cylindracea, Candida parapsilopsis, Candida deformans, Candida curvata, Candida valida, Pichia bispora, Pichia mexicana, Pichia sivicola, Pichia xylosa, Pichia burtonii, Saccharomycopsis crataegenesis, Torulaspora globosa. Wśród bakterii największy potencjał do przemysłowej produkcji lipaz mają gatunki należące do rodzaju Bacillus oraz Burkholderia multivorans i Burkholderia cepacia. Trzy rekombinanty grzybowe – Rhizomucor miehi, Thermomyces lanuginosus i Fusarium oxysporum – są stosowane w przemyśle spożywczym.

7.2.2.12. Mannazy

Mannazy to grupa enzymów odpowiedzialna za degradację mannanów występujących w hemicelulozach do cukrów prostych. W skład kompleksu mannolitycznego wchodzą:

1. 1) α-galaktozydaza (galaktohydrolaza α-D-galaktozydów, EC 3.2.1.22) odpowiadająca za hydrolizę końcowych, nieredukujących reszt α-D-galaktozy w α-D-galaktozydach, w tym oligosacharydów galaktozy, galaktomannanów i galaktolipidów;

2. 2) β-glukozydaza (glukohydrolaza β-D-glukozydów, celobiaza, EC 3.2.1.21) odpowiadająca za hydrolizę końcowych, nieredukujących reszt β-D-glukozy różnych glikozydów;

3. 3) β-1,4-D-mannozydaza (β-mannozydaza, mannohydrolaza β-D-man-nozydów, EC 3.2.1.25) usuwa mannozę z nieredukującego końca mannooligosacharydów lub mannobiozę do mannozy;

4. 4) endo-β-1,4-D-mannaza (β-1,4-mannan 4-mannanohydrolaza, β-mannanaza, EC 3.2.1.78) atakuje wewnętrzne wiązania glikozydowe, uwalniając krótkie β-1,4-mannooligosacharydy.

Hemiceluloza jest drugim najbardziej rozpowszechnionym heteropolimerem obecnym w przyrodzie. Najczęściej jest związana z celulozą i ligniną w ścianach komórek roślinnych. Szacuje się, że hemicelulozy stanowią jedną trzecią całości składników dostępnych w roślinach. Stanowią 25–30% całkowitej suchej masy drewna. Dwie najważniejsze i reprezentatywne hemicelulozy to hetero-1,4-β-D-ksylany i hetero-1,4-β-D-mannany. Ksylany stanowią główny składnik hemiceluloz w drewnie twardym i trawach, a mannany są bardziej widoczne w hemicelulozach drewna iglastego i wyspecjalizowanych strukturach, takich jak nasiona roślin i owoce. Ksylanazy hydrolizują hetero-1,4-β-D-ksylany (ksylany), a mannazy atakują hetero-1,4-β-D-mannany (mannany). Mannazy są produkowane przez liczne bakterie i grzyby strzępkowe. Wśród grzybów dominują szczepy należące do rodzaju Bacillus (Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus spp.), poza nimi szczepy Paenibacillus, Klebsiella oxytoca, Chryseobacterium indologenes, Cellulosimicrobium sp. i Acinetobacter sp. Wśród grzybów strzępkowych dominują różne szczepy należące do Aspergillus niger, a poza nimi szczepy Aspergillus oryzae, Penicillium occitanis, Trichoderma reesei, Streptomyces sp. i Scopulariopsis candida.

7.2.2.13. Naringinaza (E.C.3.2.1.40)

Naringinaza, znana również jako α-L-ramnozydaza, katalizuje hydrolizę naringinu (4,5,7-trihydroksyflawonono-7-ramnoglukozydu) do ramnozy i naringeniny (4,5,7-trihydroksyflawononu). Naringinaza jest mieszaniną dwóch enzymów, α-ramnozydazy i β-glukozydazy, które znajdują się na dwóch oddzielnych polipeptydach. α-Ramnozydaza degraduje naringinę do pruniny i ramnozy, podczas gdy β-glukozydaza hydrolizuje powstałą pruninę do naringeniny i glukozy. Naringinazę produkują grzyby strzępkowe: Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus kawachii, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Penicillium decumbens, Penicillium ulaiense, drożdże: Hansenula sp., Debaryomyces sp., Pichia sp. i Cryptococcus sp., a także szczepy bakterii z rodzaju Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Clostridium, Bacteroidetes, Ralstonia, Sphingomonas.

7.2.2.14. Pektynazy

Pektynazy są grupą enzymów, które katalizują degradację substancji pektynowych w reakcji deestryfikacji (esterazy) lub poprzez depolimeryzację (depolimerazy − hydrolazy i liazy). Esterazy działają na pektynę jako:

1. 1) esteraza metylowa pektyny (E.C. 3.1.1.11),

2. 2) esteraza acetylowa pektyny (E.C.3.1.1.6).

Depolimerazy działają na pektynę, kwas poligalakturonowy i ramnogalakturonan. Depolimerazy działające na pektynę to:

1. 1) polimetylogalakturonaza,

2. 2) liaza pektynowa.

Depolimerazy działające na kwas poligalakturonowy to:

1. 1) poligalakturonaza,

2. 2) liaza.

Na ramnogalakturonan działają:

1. 1) ramnogalakturonaza hydrolizująca ramnogalakturonan,

2. 2) endolaza ramnogalakturonanowa powodująca transeliminację ramnogalakturonanu.

Pektyny reprezentują bardzo złożoną, heterogeniczną rodzinę polisacharydów ścian komórek roślinnych. Podstawowymi produktami destrukcji pektyn są kwas galakturonowy, ramnoza, arabinoza, galaktoza, ksyloza, fukoza i kwas ferulowy. Szczepy należące do rodzaju Aspergillus (Aspergillus fumigatus, Aspergillus kawachii, Aspergillus niger i Aspergillus giganteus) i Penicillium (Penicillium notatum i Penicillium occitanis) są głównymi producentami pektynaz. Inne gatunki grzybów także produkują pektynazy: Aureobasidium pullulans, Thermoascus indicaeseudaticae i Thermoascus aurantiacus. Pektynazę produkują także bakterie: Chryseobacterium indologenes, Pectobacterium carotovorum, Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Paenibacillius sp. W przemysłowej produkcji enzymów pektynolitycznych powszechnie jest stosowany Aspergillus niger.

7.2.2.15. Proteazy

Proteazy, zwane również proteinazami lub enzymami proteolitycznymi, należą do rodziny hydrolaz. Ich funkcją katalityczną jest hydrolizowanie wiązań peptydowych białek do krótkich peptydów i aminokwasów. Proteazy dzieli się na dwie główne grupy: egzo- i endopeptydazy. Egzopeptydazy rozszczepiają wiązania peptydowe od końca aminowego lub karboksylowego łańcucha. Ze względu na miejsce ich działania – na N- lub C-końcu – klasyfikuje się je jako aminopeptydazy i karboksypeptydazy. Endopeptydazy rozszczepiają wewnętrzne wiązanie peptydowe substratu. Biorąc pod uwagę grupę funkcjonalną obecną w miejscu aktywnym, dzieli się je na cztery grupy: serynowe, asparaginianowe, cysteinowe i metaloproteazy. Większość proteaz o wysokiej wartości handlowej pochodzi z gatunków z rodzaju Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis). Inne dominujące gatunki bakterii produkujące proteazy to Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Microbacterium sp., Pseudomonas stutzeri. Wśród szczepów grzybów głównie Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae i Aspergillus niger) produkują znaczne ilości proteaz.Aktualnie 29 gatunków bakterii z rodzaju Bacillus oraz 17 gatunków grzybów produkuje proteazę alkaliczną. Komercyjnymi producentami proteazy alkalicznej są Bacillus licheniformis, alkalofilny Bacillus sp. i Aspergillus sp. Enzymy (proteazy serynowe) dodawane do detergentów są produkowane przez Bacillus licheniformis i Bacillus amyloliquefaciens.

7.2.2.16. Pullulanazy

Pullulanazy hydrolizują wiązania glikozydowe pullulanu, polisacharydu syntetyzowanego przez pewne grzyby strzępkowe, i innych rozgałęzionych polisacharydów, w tym dekstryny i amylopektyny. Na podstawie ich katalitycznych produktów końcowych i specyficzności substratowej pullulanazy zostały podzielone na trzy typy:

1. 1) pullulanazy (E.C.3.2.1.41),

2. 2) hydrolazy pullulanowe (E.C.3.2.1.135),

3. 3) glukoamylazy (E.C.3.2.1.20).

Pullulanaza hydrolizuje wiązania α-1,6 w pullulanie, skrobi, amylopektynie, glikogenie i dekstrynie. Hydrolaza pullulanowa rozbija wiązania α-1,4 pullulanu w celu uwolnienia panozy i izopanozy, maltotriozy oraz maltozy. Glukoamylaza działa na wiązania α-1,4 z nieredukującego końca pullulanu do uzyskania glukozy. Pullulanazy są efektywnie produkowane przez bakterie: Anoxybacillus sp., Bacillus pseudofirmus, Bacillus naganoensis, Bacillus acidopullulyticus, Bacillus cereus, Bacillus deramificans, Bacillus flavothermus, Paenibacillus barengoltzii, Klebsiella variicola, Thermotoga neapolitana.

7.2.2.17. Tanaza (E.C.3.1.1.20)

Tanaza, znana również jako tanazowa hydrolaza acylowa, jest enzymem hydrolitycznym, który katalizuje hydrolizę wiązań estrowych i depresyjnych obecnych w galotaninach, elagitaninach, złożonych taninach i estrach kwasu galusowego, uwalniając kwas galusowy, kwas elagowy i glukozę/alkohole. Do tej pory tanaza jest najlepiej zbadanym enzymem stosowanym w biodegradacji tanin. Szczepy mikrobiologiczne grzybów, bakterii i drożdży mogą wydajnie wytwarzać tanazy. Grzyby nitkowate należące do rodzaju Aspergillus (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus japonicus, Aspergillus gallonyces, Aspergillus awamori) i bakterie należące do rodzaju Bacillus (Bacillus pumilus i Bacillus polymyxa), Corynebacterium sp., Klebsiella pneumoniae, Streptococcus bovis, Selenomonas ruminantium oraz drożdże Saccharomyces cerevisiae są głównie wykorzystywane do produkcji tanazy.

7.2.2.18. Ksylanaza (E.C.3.2.1.8)

Ksylanaza, znana także jako endo-β-1,4-ksylan-ksylanohydrolaza, należy do rodziny hydrolaz glikozydowych. Katalizuje hydrolizę ksylanu do ksylooligosacharydów, ksylobiozy i D-ksylozy, składnika hemicelulaz. Do wytwarzania ksylanazy wykorzystuje się gatunki bakterii Bacillus (Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis i Bacillus amyloliquefaciens). Niektóre inne bakterie, w tym należące do Arthrobacter, Cellulomonas, Micrococcus, Paenibacillus, Staphylococcus, Thermotoga, Microbacterium, Pseudoxanthomonas i Rhodococcus również wytwarzają znaczne ilości ksylanaz. Wśród szczepów grzybów dobrze znanymi producentami ksylanazy są Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Geotrichum, Paecilomyces, Cephalosporium i Trichoderma. Promieniowce, takie jak Streptomyces, Thermomonospora i Thermoactinomycetes, także produkują ksylanazy. Kilka gatunków z rodzaju Bacillus i grzyby strzępkowe wydzielają duże ilości zewnątrzkomórkowej ksylanazy, która często towarzyszy enzymom celulolitycznym – jak np. gatunki Trichoderma, Penicillium i Aspergillus. Takie szczepy jak Trichoderma citrinoviride Bisset (IMI SD135), Trichoderma reesei (ATCC PTA 5588), Trichoderma reesei (BCCM/MUCL 49755), Trichoderma longibrachiatum (CNCM MA6-10) są stosowane w przemysłowej produkcji ksylanazy.

7.2.3. Izomerazy

7.2.3.1. Izomeraza glukozowa (E.C.5.3.1.5)

Izomeraza glukozowa, zwana także izomerazą D-glukozową/ksylozową lub izomerazą ketolową D-ksylozy, jest trzecim enzymem o największej wartości tonażowej, po amylazie i proteazie. Katalizuje odwracalną izomeryzację glukozy i ksylozy odpowiednio do fruktozy i ksylulozy. Izomeryzacja glukozy do fruktozy katalizowana izomerazą glukozową jest ważnym procesem w przemysłowej produkcji wysokofruktozowego syropu kukurydzianego (HFCS), który jest stosowany w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym. Szczepy bakterii, takie jak Pseudomonas hydrophila, Brevibacterium sp., Flavobacterium sp., Lactobacillus sp., Micromonospora sp., Nocardia sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., Enterobacter sp., są skutecznymi producentami izomerazy glukozowej. Spośród szczepów drożdży najbardziej wydajne są Saccharomyces sp., Candida sp., Pichia sp.

7.2.4. Liaza

7.2.4.1. Aspartaza (E.C.4.3.1.1)

Aspartaza katalizuje odwracalną deaminację kwasu asparaginowego z wytworzeniem fumaranu i amoniaku.

Zdolność do produkcji aspartazy posiadają liczne mikroorganizmy: Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pyocyanea, Serratia marcescens, Propionibacterium sp., Lactobacillus helveticus, Diplococcus pneumoniae, Micrococcus aureus, Sarcina sp., Propionibacterium freudenreichii, Pseudomonas putida, Rhizobium leguminosarum, Erwinia sp. Termofilny szczep Bacillus sp. YH55-1 wykazuje kilkakrotnie wyższą aktywność aspartazy niż Pseudomonas fluorescens i Escherichia coli. Termostabilną aspartazę produkują także Bacillus stearothermophilus KP 1041, Bacillus aminogenes T-596 i Bacillus thermoaminophilus T-585. Również drożdże i grzyby należą do producentów aspartaz. Spośród pleśni najbardziej wydajnymi producentami aspartazy są Aspergillus glaucus, Penicillium notatum i Rhizopus arrhizus. Kodowany gen aspartazy (aspA) z Escherichia coli, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Cytophaga sp., Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens został pomyślnie sklonowany i wdrożony do produkcji aspartaz rekombinowanych.

7.3.Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych

7.3.1. Przemysł piekarniczy

W przemyśle piekarniczym enzymy służą do wzbogacania mąki w celu poprawy stabilności ciasta, tekstury, objętości i koloru, przedłużającej się miękkości miękiszu, jednolitej struktury miękiszu i przedłużenia świeżości pieczywa. Obecnie enzymy są postrzegane jako naturalne polepszacze jakości wypieków. Produkcja chleba jest jedną z najbardziej powszechnych metod przetwarzania żywności. Zastosowanie enzymów w produkcji chleba polepsza jego jakość i zwiększa wydajność produkcji. Dodawana do mąki chlebowej amylaza, sama lub w połączeniu z innymi enzymami, zatrzymuje wilgoć, efektywnie zwiększa miękkość i świeżość pieczywa. W celu stabilizacji i kondycjonowania ciasta dodatkowo stosuje się lipazę i ksylanazę, a w celu wzmocnienia bieli ciasta – oksydazę glukozową i lipooksygenazę. Transglutaminaza jest stosowana w produkcji pieczywa na skalę przemysłową w celu poprawy jakości mąki, wydajności i tekstury chleba, a w produkcji makaronu – do poprawy jego tekstury po ugotowaniu. Lipazy, które uwalniają krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w procesie estryfikacji, stosuje się również w celu poprawy smaku oraz przedłużenia trwałości produktów piekarniczych.

7.3.2. Przemysł mleczarski

Enzymy mleczarskie, ważny segment enzymów przemysłu spożywczego, są wykorzystywane do poprawy cech organoleptycznych (zapachu, smaku i koloru) oraz uzyskania wyższej wydajności przetworów mlecznych (tab. 7.1). Enzymy, takie jak proteazy, lipazy, esterazy, laktaza, aminopeptydaza, lizozym, laktoperoksydaza, transglutaminaza, katalaza i inne, mają na celu zwiększenie trwałości i bezpieczeństwa produktów mlecznych. Enzymy mleczarskie są stosowane do produkcja sera, jogurtu i innych przetworów mlecznych. Do koagulacji i tworzenia stałych skrzepów mleka stosuje się podpuszczkę, połączenie chymozyny i pepsyny, i oddziela się je od płynnej serwatki. Obecnie około 33% globalnej produkcji sera odbywa się przy użyciu podpuszczki mikrobiologicznej. Lipazy znajdują zastosowanie do przyspieszonego przetwarzania sera, poprawy smaku, osłabienia właściwości alergizujących składników mleka, produkcji niestandardowych przetworów mlecznych i hydrolizy tłuszczów w mleku. Transglutaminaza katalizuje polimeryzację białek mleka, poprawiając właściwości funkcjonalne produktów mlecznych.

Tabela 7.1. Zastosowanie enzymów bakteryjnych w przemyśle mleczarskim

Mikroorganizm

Enzym

Zastosowanie

Lit.

Aspergillus niger

lipaza

szybkie dojrzewanie serów

[1]

Aspergillus niger

katalaza

dojrzewanie serów

[2]

Aspergillus sp.

proteaza kwaśna

koagulacja mleka

[3]

Aspergillus oryzae

proteinaza neutralna

szybkie dojrzewanie serów

[4]

Streptomyces sp.

transglutaminaza

sieciowanie białek

[5]

Lactobacillus sp.

aminopeptydaza

szybkie dojrzewanie serów

[6]

[1] Sharma i Sharma. 2018. Recent Pat. Biotechnol., 12: 81–91. [2] Perin i wsp. 2017. Microb. Pathog. 110: 196–201. [3] Qureshi i wsp. 2015. Int. J. Appl. Res., 1: 523–527. [4] Palomba i wsp. 2017. Food Chem., 221: 1637–1641. [5] Domagała i wsp. 2016. J. Sci. Food Agric, 96: 3500–3507. [6] Masoud i wsp. 2017. J. Appl. Pharm. Sci., 7: 123–128.

Nietolerancja laktozy to brak zdolności trawienia laktozy z powodu niedoboru enzymu laktazy w przewodzie pokarmowym człowieka. Laktaza (β-galaktozydaza) katalizuje hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy, jest więc stosowana jako środek trawiący, zwiększający rozpuszczalność i słodycz przetworów mlecznych. Wymagane jest zminimalizowanie lub całkowite usunięcie zawartości laktozy z produktów mlecznych dla osób z nietolerancją laktozy, która może objawiać się ciężkim odwodnieniem tkanek, biegunką oraz innymi konsekwencjami zdrowotnymi.

β-Galaktozydazy są ważnymi przemysłowo enzymami, mającymi szerokie zastosowanie w sektorach żywienia i produkcji żywności. Jednym z ważnych zastosowań β-galaktozydaz jest produkcja GOS stosowanych jako prebiotyki, które mają wiele właściwości korzystnych dla zdrowia człowieka. β-Galaktozydazy są również stosowane w produkcji hydrolizowanych produktów mlecznych przeznaczonych dla osób z nietolerancją laktozy z powodu niedoboru aktywności laktazy. Oprócz tego β-galaktozydazy mogą być również stosowane w przetwórstwie serwatki w przemyśle mleczarskim. Rekombinowane β-galaktozydazy mają zastosowanie w skali przemysłowej do wytwarzania produktów hydrolizowanych laktazą. β-Galaktozydazy przekształcają laktozę serwatkową w słodki syrop, który można stosować w produktach piekarniczych i cukierniczych.

7.3.3. Produkcja napojów

Napoje dzieli się na dwie główne grupy: bezalkoholowe (lekkie napoje i syropy, woda butelkowana, soki owocowe wraz z herbatą i napoje kawowe) oraz alkoholowe (destylowane alkohole, wino i piwo). Enzymy przemysłowe są stosowane w browarach do przetwórstwa i wytwarzania wysokiej jakości produktów – służą do trawienia ściany komórkowej materiału roślinnego podczas ekstrakcji. Enzymy są również powszechnie stosowane w produkcji soków owocowych i warzywnych do zwiększenia wydajności przez klarowanie, wydzielanie soku, ulepszanie produktu. Celulazy, amylazy i pektynazy służą do maceracji surowca, upłynniania i klarowania soków, poprawiania wydajności i opłacalności produkcji soków owocowych. Dodanie enzymów poprawia jakość i zwiększa stabilność produkowanych soków. Enzymy trawią pektynę, skrobię, białka i celulozę owoców i warzyw, przez co zwiększają wydajność, skracają czas przetwarzania i wzmacniają cechy sensoryczne. Amylazy są używane do klarowania i rozpuszczania cukrów w sokach. Celulazy i pektynazy są wykorzystywane do stabilizowania soków, a naringinaza i limoninaza hydrolizują gorzkie składniki obecne w sokach i poprawiają cechy jakościowe soków cytrusowych. Pektyna, strukturalna część składników roślinnych, to heteropolisacharyd, który powoduje zmętnienie soków. Jest hydrolizowana przy udziale takich enzymów, jak poligalakturonaza, esterazy pektynowe, liaza pektynowa i różne arabanazy. Amylazy pozyskane z mikroorganizmów można stosować w celu hydrolizy skrobi do cukrów przed fermentacją destylowanych napojów alkoholowych i zminimalizowania lub usunięcia zmętnienia spowodowanego obecnością skrobi. Zastosowanie enzymów do hydrolizy niesłodowanego jęczmienia i innych dodatków skrobiowych przyczynia się do zmniejszenia kosztów piwa. W warzeniu piwa stosuje się także proteazy do kontroli rozwoju zimnych mgieł w piwie. Oksydaza glukozowa jest stosowana w produkcji piwa i wina. Nadtlenek wodoru wytwarzany w procesie biologicznym redukuje dodane chemiczne środki konserwujące w winie, zwiększając tym samym jego trwałość.

7.3.4. Przemysł spożywczy

Departament Spraw Gospodarczych i Społecznych ONZ (UNDESA) szacuje, że przewidywana liczba ludności na świecie wzrośnie z 6,9 mld do 9,1 mld, a popyt na żywność wzrośnie o 70% do 2050 r. Problem dostaw żywności wysokiej jakości można rozwiązać przez zastosowanie enzymów w przemyśle spożywczym. Biomolekuły te można skutecznie wykorzystać do poprawy metod produkcji żywności oraz jej właściwości, takich jak smak, zapach, kolor, tekstura, wygląd i wartość odżywcza. Enzymy są stosowane zarówno do modyfikacji tłuszczu, jak też w technologii słodzików. Obecnie stosowanie enzymów przemysłowych zdominował segment żywności i napojów, w tym browarnictwo (warzenie wysokiej jakości piwa), przemysł mięsny (ulepszanie białek zwierzęcych) i przetwórstwo owocowo-warzywne (enzymatyczna hydroliza białek w celu uzyskania soków mających lepszy kolor i aromat). W przemyśle spożywczym największe wykorzystanie enzymów notuje się w piekarstwie, przetwórstwie mleczarskim, produkcji soków i browarnictwie. W piekarstwie – głównym rynku zastosowania enzymów w przemyśle spożywczym – dodaje się je w celu poprawy stabilności, miękkości i struktury miękiszu ciasta oraz wydłużenia trwałość produktów. Jednym z głównych zastosowań oksydazy glukozowej jest produkcja kwasu glukonowego, który jest używany jako regulator kaustyczny i stabilizator koloru, jako przeciwutleniacz i chelat w chlebie i napojach, a także w formowaniu twarogu i zapobieganiu powstawaniu kamienia mlecznego. W przemyśle spożywczym L-asparaginaza produkowana przez grzyby jest szeroko stosowana do redukcji akrylamidu powstającego podczas smażenia produktów bogatych w skrobię. Enzymy mikrobiologiczne są powszechnie wykorzystywane w przetwarzaniu sera, największe ilości w przemyśle mleczarskim, który jest kolejnym największym przemysłem stosującym enzymy po produkcji napojów. Amylazy na skalę przemysłową stosuje się do produkcji scukrzonej skrobi, która jest następnie wykorzystywana w wielu bioprocesach. W przemyśle spożywczym amylazy są również stosowane w procesie pieczenia chleba, produkcji glukozy, maltozy i syropów z kukurydzy oraz syropów czekoladowych, a także jako dodatki do żywności.

7.3.5. Przemysł paszowy

Aby sprostać stale rosnącemu światowemu popytowi na spożycie mleka i mięsa, zaczęto stosować enzymy do produkcji pasz dla zwierząt. Stosowanie enzymów w żywieniu zwierząt zainicjowano w latach 80. ubiegłego stulecia i od tej pory ciągle wzrasta ich powszechne stosowanie do produkcji pełnowartościowych pasz dla zwierząt. Dodatek enzymów hydrolitycznych zwiększa strawność składników odżywczych i ich lepsze wykorzystanie. Szacuje się, że w 2020 r. rynek enzymów w produkcji pasz osiągnie wartość 1,3 mld dolarów USA. Enzymy paszowe mogą być stosowane w formulacji diety zwierzęcej. Na przykład są dodawane w celu obniżenia jakości konkretnego składnika paszy, który jest w danym stężeniu szkodliwy lub nie ma odpowiedniej wartości odżywczej. Ponadto mogą być stosowane w celu wzmocnienia wartości odżywczej, np. białek w paszach stosowanych w hodowli drobiu. Enzymy paszowe stosowane w żywieniu drobiu to głównie fitazy, proteazy, α-galaktozydazy, glukanazy, ksylanazy, α-amylazy i poligalakturonazy. Fitaza, która stanowi największy segment wśród enzymów stosowanych w przemyśle paszowym, jest używana do wykorzystania naturalnego fosforu występującego w kwasie fitynowym w paszy na bazie zbóż. Zwierzęta monogastryczne nie są w stanie strawić pasz roślinnych zawierających duże ilości celulozy i hemicelulozy. Ksylanaza i β-glukanaza są dodawane do tych pasz, ponieważ w pełni hydrolizują i trawią duże ilości skrobi opornej, nierozkładanej przez zwierzęta monogastryczne. Proteazy są również stosowane w paszach dla zwierząt w celu rozkładu białek na ich części składowe – aminokwasy. Oprócz poprawy wartości odżywczej pasz, enzymy polepszają strawność paszy przez zwierzęta.

W tabeli 7.2 podano przykłady zastosowania enzymów w przemyśle spożywczym.

Tabela 7.2. Enzymy stosowane w przemyśle spożywczym

Enzym

Zastosowanie

Lit.

α-amylaza

pieczenie, warzenie piwa, upłynnianie skrobi

poprawa jakości pieczywa

produkcja ciastek ryżowych

klarowanie soku owocowego

[1]

[2]

[3]

[4]

glukoamylaza

produkcja piwa

poprawa jakości pieczywa

syropy o wysokiej zawartości glukozy i fruktozy

[5]

[6]

[6]

laktaza

(β-galaktozydaza)

zmniejszenie nietolerancji laktozy u ludzi

prebiotyczne składniki żywności

[7]

[7]

celulaza

pasza dla zwierząt

klarowanie soków owocowych

[8]

[9]

ksylanaza

klarowanie soków owocowych

poprawa jakości piwa

[10]

[11]

pektynaza

klarowanie soków owocowych

[12]

oksydaza glukozowa

poprawa trwałości żywności

poprawa smaku żywności

[13]

[14]

proteaza

browarnictwo

zmiękczanie mięsa

koagulacja mleka

poprawa jakości pieczywa

[15]

[15]

[15]

[16]

lipaza

poprawa smaku sera

produkcja sera Cheddar

[17]

[18]

fosfolipaza

poprawa smaku sera

produkcja lipolizowanego tłuszczu mlecznego

[19]

[19]

asparaginaza

redukcja tworzenia się akrylamidu podczas pieczenia

[20]

esteraza

poprawa smaku i zapachu soku owocowego

deestryfikacja błonnika pokarmowego

produkcja estrów o krótkim łańcuchu smakowym

[21]

[22]

[23]

lakaza

usuwanie polifenolu z wina

pieczenie

[24]

[25]

katalaza

konserwacja żywności (z oksydazą glukozową)

usuwanie nadtlenku wodoru z mleka przed produkcją sera

[26]

[27]

peroksydaza

poprawa smaku, koloru i jakości odżywczej żywności

[28]

naringinaza

usuwanie gorzkiego smaku w soku owocowym

poprawa aromatu wina

[29]

[30]

[1] Rodríguez Couto i Ángeles Sanromán. 2006. J. Food Eng., 76: 291–302. [2] Van der Maarel i wsp. 2002. J. Biotechnol., 94: 137–55. [3] Aiyer. 2005. Afr. J. Biotechnol., 4: 1525–1529. [4] Kumar. 2015. Adv. Appl. Sci. Res., 6: 114–124. [5] Blanco i wsp. 2014. Int. J. Food Sci. Nutr., 6: 655–660. [6] James i wsp. 1996. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 36: 437–463. [7] Gibson i Wang. 1994. J. Appl. Microbiol., 77: 412–420. [8] Sukumaran i wsp. 2005. J. Sci. Ind. Res., 64: 832–844. [9] Grassin i Fauquembergue. 1996. [w:] Industrial enzymology, red. Godfrey T., West S. London, UK: MacMillan Press. s. 226–264. [10] Camacho i wsp. 2003. Appl. Biochem. Biotechnol., 104: 159–172. [11] Dervilly i wsp. 2002. Carbohydr. Polym., 47: 143–149. [12] Pasha i wsp. 2013. J. Pure. Appl. Sci. Technol., 16: 89–95. [13] Zhu i wsp. 2006. Biosens. Bioelectron., 21: 2046–2051. [14] Hanft i Koehler. 2006. J. Sci. Food Agric., 86: 1699–1704. [15] Aruna i wsp. 2014. Int. J. Appl. Biol. Pharm., 5: 201–221. [16] Miguel i wsp. 2013. [w:] Food Industry, red. Muzzalupo I. Rijeka, Croatia: InTech. https://doi.org/10.5772/53168. [17] Jooyendeh i wsp. 2009. J. Food. Sci. Tech., 46: 181–189. [18] Aravindan i wsp. 2007. Indian J. Biotechnol., 6: 141–158. [19] Law. 2009. [w:] Enzymes in food technology, red. Van Oort i Whitehurst. Oxford, UK: Wiley-Blackwell. s. 88–102. [20] Kumar i wsp. 2014. Food Bioprocess Tech., 7: 741–748. [21] Panda i Gowrishankar. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol., 67: 160–169. [22] Faulds. 2010. Phytochem. Rev., 9: 121–132. [23] Alvarez-Macarie i Baratti. 2000. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2000; 10: 377–383. [24] Tanrıöven i Ekşi. 2005. Food Chem., 93: 89–93. [25] Labat i wsp. 2000. Cereal Chem., 77: 823–828. [26] Ough. 1975. Am. J. Enol. Viticulture, 26: 30–36. [27] Sîrbu. 2011. An. Univ. Oradea Fasc. Biol., 2: 164–167. [28] Regaldo i wsp. 2004. Phytochem. Rev., 3: 243–256. [29] Zhu i wsp. 2017. Process Biochem., 62: 114–121. [30] Gallego Custodio. 1996. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 203: 522–527.

7.3.6. Przemysł farmaceutyczny i analityczny

Enzymy odgrywają wiele znaczących i ważnych ról w przemyśle farmaceutycznym i diagnostycznym. Są powszechnie stosowane jako leki związane z niedoborem enzymatycznym i zaburzeniami trawienia pokarmu oraz w różnych testach diagnostycznych, takich jak ELIZA oraz w zestawie do testowania cukrzycy. Zdolność peroksydaz do wytwarzania produktów chromogennych przy niskich stężeniach powoduje, że są to enzymy dobrze dopasowane do zestawu przygotowania testu immunoenzymatycznego (ELISA) używanego w diagnostyce różnych chorób. Enzymy mają duże zastosowanie w medycynie. Sole kwasu glukonowego tworzone w reakcji z oksydazą glukozową są szeroko stosowane w syntezie leków, takich jak glukonian sodu używany do usuwania goryczy z produktów spożywczych i glukonian cynku stosowany w leczeniu przeziębienia, wysypki skórnej i niedoboru cynku związanego z letargiem psychicznym i opóźnionym dojrzewaniem płciowym. Enzymy proteolityczne (fibrolityczne) stosuje się do usuwania martwej skóry i oparzeń oraz skrzepów. Nattokinazę, silny enzym fibrolityczny, stosuje się do leczenia zakrzepicy. Proteaza kwaśna, dekstranaza i rodanaza są stosowane w leczeniu odpowiednio dyspepsji pokarmowej, próchnicy i zatrucia cyjankami. Lipazy są najczęściej wykorzystywane w syntezie organicznej optycznie czynnych alkoholi, kwasów, estrów i laktonów. Lipazy mikrobiologiczne i oksydazy polifenolowe biorą udział w syntezie metoksyfenyloglicynianu (półproduktu diltiazemu) oraz 3,4-dihydroksylofenyloalaniny (DOPA) do leczenia choroby Parkinsona. Tyrozynaza, ważna oksydaza, bierze udział w melanogenezie i produkcji L-dihydro-ksyfenyloalaniny (L-DOPA) – prekursora do produkcji dopaminy, która jest silnym lekiem stosowanym w leczeniu choroby Parkinsona i do kontrolowania uszkodzenia neurogennego mięśnia sercowego. Chitosanaza katalizuje hydrolizę chitozanu do aktywnie biologicznego oligosacharydu chitozanowego (COS) stosowanego jako lek przeciwdrobnoustrojowy i przeciwutleniacz obniżający poziom cholesterolu we krwi. Powoduje także spadek ciśnienia krwi, kontroluje zapalenie stawów, działa ochronnie przeciw infekcjom i wspomaga działanie przeciwnowotworowe. Rekombinowana L-asparaginaza jest najczęściej stosowana w celach terapeutycznych. PEGylację lub powlekanie L-asparaginazy prowadzi się w celu zwiększenia jej okresu półtrwania i zmniejszenia immunogenności. Dostępna w handlu „pegaspargaza”, która jest produktem L-asparaginazy sprzężonej z PEG, ma wyższą wartość terapeutyczną niż jego rodzimy odpowiednik.

W nauce i analityce enzymy stosuje się do oszacowania stężenia substratu i określenia aktywności katalitycznej enzymów obecnych w próbkach biologicznych. Postępy w technologii enzymatycznej zastąpiły lub zminimalizowały użycie szkodliwych pierwiastków promieniotwórczych w różnych testach immunologicznych, które są używane do oznaczania różnych białek i hormonów. Ponadto w diagnostyce klinicznej stosuje się enzymy do ilościowego oznaczania cukru w cukrzycy i poziomu innych związków w zaburzeniach metabolicznych, jak np.:

1. 1) oksydaza glukozowa – oznaczanie glukozy;

2. 2) ureaza i dehydrogenaza glutaminianowa – oznaczanie mocznika;

3. 3) lipaza, esteraza karboksylowa i kinaza glicerynowa – oznaczanie triglicerydów;

4. 4) oksydaza moczanowa – oznaczanie kwasu moczowego;

5. 5) kreatynaza i oksydazy sarkozynowe – oznaczanie kreatyniny;

6. 6) oksydaza cholesterolowa – wykrywanie i konwersja cholesterolu;

7. 7) oksydaza putrescyny – wykrywanie amin biogennych, takich jak putrescyna, marker psucia się żywności.

Enzymy są niezbędne w prowadzeniu manipulacji w inżynierii genetycznej kwasów nukleinowych. Na przykład endonukleazy restrykcyjne są stosowane w celu specyficznego rozszczepienia DNA do klonowania molekularnego, a polimerazy DNA – do amplifikacji DNA przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).

7.3.7. Przemysł polimerowy

Wobec coraz większego zużycia polimerów i w trosce o zdrowie ludzkie i bezpieczeństwo środowiska podjęto badania związane z wykorzystaniem enzymów mikrobiologicznych w syntezie biodegradowalnego polimeru. Proces katalizujący syntezę polimeru przez enzym in vitro jest bezpieczny dla środowiska i ma kilka zalet w porównaniu do konwencjonalnych metod syntezy środków chemicznych.

Biopolimery to materiały przyjazne ekologicznie, ponieważ są syntetyzowane z odnawialnych źródeł węgla w procesach biologicznych. Są biodegradowalne – po użyciu wracają do środowiska naturalnego jako zasoby odnawialne, w postaci CO_2 i biomasy. Biopolimery, takie jak poliestry, poliwęglany i polifosforany, mają zastosowanie w różnych branżach biomedycznych, jak np. do produkcji urządzeń ortopedycznych, barier adhezyjnych, kontroli dostarczania leków. Rynek biopolimerów rośnie w tempie 14,5% CAGR w branżach takich jak medycyna, opakowania, urządzenia, motoryzacja i elektronika. Rosnące zapotrzebowanie na materiały opakowaniowe i bezpieczeństwo ekologiczne można rozwiązać dzięki biodegradowalnym polimerom. Lipazy katalizują polimeryzację laktonów, cyklicznych diestrów i cyklicznych węglanów do produkcji poliestrów lub poliwęglanów. Polimeryzacja katalizowana przez lipazę jest przyjazną dla środowiska techniką przygotowywania użytecznych poliestrów przez polikondensację, a także polidodatków. Inne enzymy, takie jak lakaza, peroksydaza i transglutaminaza, są wykorzystywane do sieciowania w biopolimerach do produkcji materiałów in situ w procesach polimeryzacji.

7.3.8. Przemysł papierniczy i celulozowy

Wraz ze wzrostem świadomości zrównoważonego rozwoju wzrosło zastosowanie enzymów mikrobiologicznych w przemyśle papierniczym i celulozowym, gdyż dzięki nim można zmniejszyć negatywny wpływ produkcji papieru i celulozy na środowisko naturalne. Enzymy skracają czas przetwarzania, a także zmniejszają ilość zużytej energii i chemikaliów stosowanych w procesie produkcji. Enzymy są stosowane do wzmocnienia odbarwiania i wybielania celulozy i produkcji papieru oraz oczyszczania odpadów przez zwiększenie biologicznego zapotrzebowania tlenu (BZT) i chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT). Celem usunięcia lignin i hemiceluloz z masy lignocelulozowej stosuje się ksylanazy i ligninazy. W przemyśle papierniczym peroksydazy są również stosowane do degradacji składników drewna przez hydrolizę ligniny i celulozy. Amylazy są stosowanie w tych branżach do powlekania skrobią, odbarwiania i wzmocnienia czystości papieru oraz poprawiają odwodnienie pulpy. Lipazy stosuje się do odbarwiania i wzmacniania kontroli wysokości tonu, podczas gdy celulazy są używane do odbarwiania i poprawy miękkości pulpy. Celulaza została również wykorzystana w bioprocesie do recyklingu zużytego papieru zadrukowanego (gazet, dokumentów). Lakaza jest alternatywą dla stosowania dużej ilości chloru w procesie roztwarzania chemicznego, powodującego duże ilości odpadów, zubożenie warstwy ozonowej i zakwaszenie pulpy. Mannany używane są do degradacji glukomannanu w celu poprawy jasności papieru.

7.3.9. Przemysł skórzany

Odpady usuwane z różnych etapów wyprawiania skóry metodą tradycyjną powodowały poważne zagrożenia dla zdrowia człowieka i środowiska. Dzięki zastosowaniu enzymów można skutecznie poprawić jakość skóry i ograniczyć ilość odpadów powstających w trakcie procesu. Początkowe próby zastosowania enzymów, takich jak proteazy, lipazy i amylazy, w przemyśle skórzanym dotyczyły usuwania włosów. Enzymatyczne usuwanie włosów minimalizuje lub eliminuje szkodliwe chemikalia, takie jak siarczek, wapno i aminy. Proteazy alkaliczne i neutralne oraz lipazy są stosowane we wszystkich etapach przetwarzania i produkcji skóry takich jak, peklowanie, moczenie, wapnowanie, usuwanie włosów, trawienie, odtłuszczanie i garbowanie. Proteazy alkaliczne wykorzystuje się do usuwania białek niefibrylarnych podczas moczenia i trawienia, aby skóra była miękka, elastyczna i giętka. Proteazy neutralne są stosowane także do usuwania włosów, a lipazy do odtłuszczania skóry. Dzięki stosowaniu enzymów zamiast chemikaliów redukuje się zapach oraz zmniejsza BZT i ChZT w ściekach powstających w procesie produkcji skóry.

7.3.10. Przemysł włókienniczy

Przemysł włókienniczy generuje ogromne ilości ścieków zawierających kleje, chemikalia wybielające i barwniki. Jest jednym z największych producentów zanieczyszczeń środowiska. Enzymy stosowane w tej branży umożliwiają rozwój przyjaznych technologii przetwarzania włókna i pozyskiwania dobrej jakości produktu końcowego. W obróbce wstępnej bawełny i procesie wykończeniowym biorą udział hydrolazy i oksydoreduktazy. Grupa hydrolaz obejmuje takie enzymy, jak amylazy, celulazę, kutynazę, proteazy, pektynazę i lipazę/esterazę, które są zaangażowane w procesy biopolerowania i czyszczenia tkanin, antyfilcowania wełny, zmiękczania bawełny, wykończenia tkaniny jeans (denim, dżins), wykończania wełny oraz modyfikacji włókien syntetycznych. Enzymy innej grupy – oksydoreduktazy (katalazy, lakazy, peroksydaza i ligninaza) biorą udział w wybielaniu biologicznym, odbarwianiu tkanin, wykończaniu wełny itp. Jeden z takich procesów polega na degradacji barwników syntetycznych, takich jak barwniki azowe, niebieski remazol, czerwony cibakron, błękit remazolowy, antrachinon itp., przy użyciu peroksydazy ligninowej, peroksydazy manganu i peroksydazy chrzanowej.

7.3.11. Enzymy w kosmetykach

Stosowanie enzymów w kosmetykach staje się coraz bardziej popularne. Enzymy są używane jako wolne rodniki w kremach z filtrem przeciwsłonecznym, pastach do zębów, płynach do płukania ust, płynach do układania i kręcenia włosów oraz do farbowania. Dysmutaza nadtlenkowa (SOD) jest stosowana do zatrzymania wolnych rodników i kontroli uszkodzenia skóry spowodowanego przez zanieczyszczenia w powietrzu i wodzie, mikroorganizmy i szkodliwe czynniki chemiczne. Kombinacje SOD i peroksydazy stosuje się w kremach z filtrem przeciwsłonecznym. Są zmiataczami wolnych rodników, przez co zmniejszają rumień. Proteazy w kremach są wykorzystywane do czyszczenia i wygładzania skóry przez usuwanie jej martwych lub uszkodzonych elementów. Endoglikozydaza i papaina są szeroko stosowane w paście do zębów i płynie do płukania ust – powodują wybielanie zębów, usuwają płytkę nazębną i nieprzyjemny zapach osadów na zębach i tkance dziąseł. Lakaza, oksydazy, peroksydazy i oksydazy polifenolowe są wykorzystywane w preparatach do farbowania włosów, lipazy – katalaza, papaina, bromelaina i subtilizyna – w preparatach do pielęgnacji skóry, a izomeraza disiarczkowa, oksydaza sulfhydrylowa glutationu i transglutaminaza – do falowania włosów. Enzymy zawarte w środkach do czyszczenia soczewek mają za zadanie usunięcie błon białkowych.

7.3.12. Enzymy w detergentach

Produkcja detergentów pochłania największe ilości – 25–30% całkowitej sprzedaży – enzymów i oczekuje się, że ilość ta będzie rosła. Detergenty są stosowane w środkach do zmywania naczyń, prania i sprzątania. Enzymy zawarte w detergentach mają za zadanie usuwanie białek, plam na bazie skrobi, oleju i tłuszczów. Enzymy w detergentach piorących są wydajne, rozszczepiają uszkodzone włókna bawełny, poprawiają biel lub kolor tkaniny. Są to głównie enzymy z grupy hydrolaz – najczęściej amylaza i proteaza. Czasami kombinacja enzymów, np. mieszanina proteaz, amylazy, pektynazy, celulazy i lipazy, zwiększa wydajność czyszczenia plam i pielęgnacji tkanin. Amylazy i lipazy są odpowiednio skuteczne w usuwaniu złogów skrobi w żywności i plam z produktów tłuszczowych. Kutynaza, enzym hydrolityczny, jest wykorzystywana jako enzym lipolityczny w środkach do zmywania naczyń i detergentach do prania. Proteaza trawi plamy z krwi, jajka i ludzkiego potu, podczas gdy celulazy rozjaśniają kolory, zmiękczają tkaniny i eliminują małe włókna z tkanin bez uszkadzania głównych włókien. Proteaza i amylaza są stosowane w detergentach przeznaczonych do zmywarek do naczyń. Mają za zadanie usuwanie białka i węglowodanów znajdujących się na cząstkach żywności. Stosowanie enzymów w produktach detergentowych jest korzystne, gdyż zastępują one środki wybielające i fosforany, mają korzystny wpływ na zdrowie ludzi i środowisko.

7.3.13. Przemysł syntezy organicznej

Enzymy są stosowane do produkcji łatwych do separacji drobnych związków organicznych bez tworzenia ubocznych związków chemicznych. Potencjał katalityczny mikroorganizmów był wykorzystywany przez setki lat w produkcji alkoholu i serów. W syntezie organicznej najczęściej wykorzystywane są lipazy, zwłaszcza przy tworzeniu szerokiej gamy aktywnych optycznie alkoholi, kwasów, estrów i laktonów. Lipazy stosuje się do produkcji kwasu (S, R)-2,3-petoksyfenyloglicyklicznego, związku pośredniego w produkcji diltiazemu. Oksydoreduktazy, takie jak oksydaza polifenolowa, biorą udział w syntezie 3,4-dihydroksylofenyloalaniny (DOPA), substancji chemicznej stosowanej w leczeniu choroby Parkinsona. Oligosacharydy i polisacharydy odgrywają istotną rolę w rozpoznawaniu się komórek i procesach komunikacji, są syntetyzowane z wykorzystaniem odpowiedniej glikozylotransferazy. W grę wchodzą liazy uczestniczące w syntezie organicznej cyjanohydryn z ketonów, akrylamidu z akrylonitrylu, kwasu jabłkowego z kwasu fumarowego. Za pośrednictwem hydratazy nitrylowej prowadzi się produkcję akrylamidu. Syrop kukurydziany o wysokiej zawartości fruktozy, alternatywny do sacharozy – środka słodzącego stosowanego w przemyśle spożywczym i produkcji napojów – jest komercyjnie produkowany przy użyciu izomerazy glukozowej.

7.3.14. Enzymy w oczyszczaniu ścieków

Zastosowanie enzymów w oczyszczaniu ścieków jest rozległe, wiele enzymów bierze udział w degradacji toksycznych zanieczyszczeń. Ścieki przemysłowe i komunalne zawierają wiele związków chemicznych, które są niebezpieczne lub toksyczne dla organizmów i ekosystemu. Enzymy mikroorganizmów, same lub w kombinacjach, są stosowane do oczyszczania ścieków przemysłowych zawierających fenole, aminy aromatyczne, nitryle itp., przez ich degradację lub biokonwersję toksycznych związków chemicznych do nieszkodliwych produktów. Do oczyszczania ścieków stosuje się amidazy, amylazy, amyloglukozydazy, celulazy, glukoamylazy, lipazy, hydratazy nitrylowe, pektynazy i proteazy. Prowadzi się detoksykację toksycznych związków organicznych przez sprzężone utlenianie za pośrednictwem oksydoreduktaz. Enzymy te, takie jak lakaza, peroksydaza manganowa, peroksydaza ligninowa i tyrozynaza, katalizują usuwanie chlorowanych związków fenolowych ze ścieków przemysłowych. Lakazy są również stosowane do oczyszczania ścieków z przemysłu włókienniczego zawierających barwniki, bioremediacji gleby zanieczyszczonej węglowodorami olejowymi oraz w procesach odbarwiania. Enzymy pozyskane z mikroorganizmów są również wykorzystywane w recyklingu odpadów do ponownego wykorzystania, jak odzyskiwanie dodatkowego oleju z nasion oleistych, przekształcanie skrobi w cukier prosty czy przekształcanie serwatki w różne przydatne produkty. Oksygenazy mikroorganizmów, takie jak monooksygenazy i dioksygenazy są aktywne wobec szerokiej gamy związków, w tym chlorowanych związków alifatycznych. Są one wykorzystywane do degradacji fluorowanych związków organicznych będących zanieczyszczeniem, takich jak herbicydy, insektycydy, fungicydy, płyny hydrauliczne i przenoszące ciepło, plastyfikatory i półprodukty do syntezy chemicznej.

7.3.15. Inne gałęzie przemysłu

Oksydaza glukozowa jest wykorzystywana w budowie biosensorów do monitorowania różnych zagrożeń środowiska, jak również do poprawy produkcji biopaliw. Peroksydazy są używane w konstrukcji biosensorów do oznaczania nadtlenku wodoru i organicznych wodoronadtlenków oraz związków fenolowych, a także w procesach elektrochemicznych i bioelektrokatalitycznych. Amylazy są używane w produkcji biopaliw.

7.4.Podsumowanie

W tabeli 7.3 przedstawiono stosowanie enzymów produkowanych przez mikroorganizmy w różnych gałęziach przemysłu (bez przemysłu spożywczego).

Tabela 7.3. Enzymy produkowane przez mikroorganizmy i ich zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu

Gałąź przemysłu

Enzymy

Zastosowanie

Lit.

produkcja wyrobów alkoholowych

celulaza, ligninaza, mannaza

produkcja alkoholu z różnych surowców

[1]

[2]

[3]

pasza dla zwierząt

fitaza, ksylaza

wzrost ilości fosforu w paszy, polepszenie strawności paszy

[4]

[5]

[6]

detergenty

proteaza, amylaza, lipaza, celulaza, mannaza

usuwanie białka po zabarwieniu, środki czyszczące, usuwanie nierozpuszczalnej skrobi, tłuszczów i olejów, zwiększenie skuteczność detergentów

[1]

[7]

[8]

tekstylia

proteaza, amylaza, celulaza, pektynaza, katalaza, peroksydaza, keratynaza

wykańczanie tkanin dżinsowych, oczyszczanie wełny, odśluzowywanie surowego jedwabiu (biopolerowanie), zmiękczanie bawełny

[1]

[9]

[10]

[11]

produkcja papieru i celulozy

proteaza, amylaza, lipaza, celulaza, hemicellulaza, esteraza, ligninaza, ksylaza

rozpad skrobi w celu obniżenia lepkości, wspomaganie sklejania, odbarwiania i powlekania papieru, zwiększanie gładkości włókna, zwiększanie odprowadzania wody i wspomaganie usuwania tuszu, redukcja substancji smolistych, usuwanie ligniny w celu zmiękczenia papieru

[12]

[13]

[14]

wyprawienie skór

proteazy, lipazy

usuwanie nadmiernego białka i tłuszczu

[10]

[15]

farmaceutyki

acylaza penicyliny, peroksydaza

synteza antybiotyków półsyntetycznych

[16]

[17]

[18]

biologia molekularna

ligaza DNA, enzymy restrykcyjne, polimeraza

inżynieria genetyczna DNA, cięcie łańcucha DNA na fragmenty, reakcja łańcuchowa polimerazy, enzymy ważne w kryminalistyce

[19]

[20]

biopolimery

lakaza, peroksydaza, lipaza, transglutaminazy

produkcja materiałów w procesie polimeryzacji

[21]

[22]

produkcja alkoholi i olejów

celulazy, ligninazy, mannaza, lipaza, ksylanaza

produkcja etanolu, usuwanie żelu w czasie wydobywania olejów, produkcja estrów metylowych kwasów tłuszczowych, rozkład lignocelulozy do produkcji bioetanolu

[23]

[24]

[25]

[26]

[27]

[1] Rejzek i wsp. 2011. Mol. Biosyst., 7: 718–730. [2] http://distillery-yeast.com/data-sheets/ amyloglucosidase. [3] Jolly. 2001. Int. Sugar. J., 103: 117–125. [4] Mitidieri i wsp. 2006. Bioresour. Technol., 97: 1217–1224. [5] Tomschy i wsp. 2000. Protein. Sci., 9: 1304–1311. [6] Suresh i wsp. 2008. J. Mol. Graph. Modelling, 26: 845–849. [7] Pandey i wsp. 2000. Biotechnol. Appl. Biochem., 31: 135–152. [8] Wintrode i wsp. 2000. J. Biol. Chem., 275, 31635–31640. [9] Liu i wsp. 2013. World J. Microbiol. Biotechnol., 29: 825–832. [10] Saha i wsp. 2009. Encyclopedia of Microbiology. Academic Press, Oxford. [11] Noone i wsp. 2001. Gastroenterology, 121: 1310–1319. [12] Kirk i wsp. 2002. Curr. Opin. Biotechnol., 13: 345–351. [13] Kohli i wsp. 2001. Enzyme Microb. Technol., 28: 606–610. [14] Polizeli i wsp. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol., 67: 577–591. [15] Parameswaran i wsp. 2013. J. Sci. Ind. Res., 72: 271–286. [16] Neelam i wsp. 2013. BioMed Res. Int., 2013, Article ID 329121, 1–18. [17] Roberts i wsp. 2007. Nucleic Acids Res., 35: D269–D270. [18] Roberts i wsp. 2007. Nucleic Acids Research, 35: D269–D270. [19] Nigam. 2013. Biomolecules, 3: 597–611. [20] Roberts i wsp. 2010. Nucleic Acids Res., 38, D234–D236. [21] Tarantino. 2003. GRAS Notice No. GRN 000132, U.S. Food Drug Adm. [22] Baganz i wsp. 1951. American J. Medical Sciences, 222: 1–6. [23] Frias i wsp. 2003. Food Chemistry, 81: 233–239. [24] Liew i wsp. 2014. J. Clean. Prod., 71: 11–29. [25] Raman i wsp. 2011. Biomass Bioenergy, 35: 4221–4229. [26] Olofsson i wsp. 2017. Biotechnol. Biofuels,10: 51. [27] Tan i wsp. 2010. Biotechnol. Adv.,28: 628–634.

Literatura rekomendowana

Abada E.A. 2018. Application of microbial enzymes in the dairy industry. Chapter 5. [w:] Enzymes in Food Biotechnology, red. Kuddus M. Academic Press.

Aracri E., Colom J.F., Vidal T. 2009. Applications of laccase natural mediators system to sisal pulp: an effective approach to biobleaching or functionalizing pulp fibres? Bioresour. Technol., 100: 5911–5916.

Chapman J., Ismail A.E., Dinu C.Z. 2018. Industrial applications of enzymes: Recent advances, techniques, and outlooks. Catalysts, 8: 238.

Choct M. Enzymes for the feed industry: past, present and future. XXII World’s Poultry Congress, 8–13 June 2004, Istanbul, Turkey.

de Souza F.R. i Gutterres M. 2012. Application of enzymes in leather processing: a comparison between chemical and coenzymatic processes. Brazilian J. Chem. Eng., 29: 473–481.

Hasan F., Shah A.A., Javed S., Hameed. 2010. Enzymes used in detergents: Lipases. African J. Biotechnol., 9: 4836–4844.

Hemalatha T., Maheswari T.U., Krithiga G., Sankaranarayanan P., Puvanakrishnan R. 2013. Enzymes in clinical medicine: An overview. Indian J. Experimental Biology, 51: 777–788.

Jayasekara S. i Ratnayake R. 2019. Microbial cellulases: An overview and applications. DOI: http://dx.doi.org/ 10.5772/intechopen.84531.

Karam J. i Nicell J.A. 1997. Potential applications of enzymes in waste treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 69: 141È153.

Li S., Yang X., Yang S., Zhu M., Wang X. 2012.Technology prospecting on enzymes: application, marketing and engineering. Computational Structural Biotechnol. J., 2: e201209017.

Mamo J. i Assefa F. 2018. The role of microbial aspartic protease enzyme in food and beverage industries. J. Food Quality, Article ID 7957269, 15 pages.

Miguel A.S.M., Martins-Meyer T.S., da Costa Figueiredo E.V., Lobo B.W.P., Dellamora-Ortiz G.M. 2013. Enzymes in Bakery:Current and Future Trends. http://dx.doi.org/10.5772/53168 INTECH.

Paul D. 2016. Microorganisms and α-amylase: A concise review. Innovare J. Sci., 4: 1–5.

Raveendran S., Parameswaran B., Ummalyma S.B., Abraham A., Mathew A.K., Madhavan A., Rebello D., Pandey A. 2018. Applications of microbial enzymes in food industry, Food Technol. Biotechnol., 56: 16–30.

Singh R., Kumar M., Mitt A., Mentha P.K. 2016. Microbial enzymes: industrial progress in 21st century. 3 Biotech., 6: 174.

Singh R.S., Singh T., Pandey A. 2019. Microbial enzymes – An overview. Adv. Enzyme Technol., https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64114-4.00001-7.

Vellard M. 2003. The enzyme as drug: application of enzymes as pharmaceuticals. Curr. Opinion Biotechnol., 14:1–7.

Vivekanand V., Dwivedi P., Sharma A., Sabharwal N., Singh R.P. 2008. Enhanced delignification of mixed wood pulp by Aspergillus fumigatus laccase mediator system. World J. Microbiol. Biotechnol., 24: 2799–2804.

8

Mikrobiologiczna produkcja napojów alkoholowych

8.1.Wprowadzenie

Schemat produkcji napojów alkoholowych w procesie fermentacji z udziałem mikroorganizmów przedstawiono na rysunku 8.1. Różne napoje alkoholowe (piwo, wino i wódka, a także inne, mniej znane, napoje) łączy jedna wspólna cecha – są to produkty fermentacji drożdży, głównie Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces carlsburgiensis w przypadku piw. Reakcja, w której jest wytwarzany alkohol, to reakcja fermentacji

drożdże + glukoza → alkohol (etanol) + CO_2 + biomasa drożdży.

Ta sama reakcja jest również wykorzystywana w procesie pieczenia chleba, przy czym pożądanym produktem jest tu ditlenek węgla. Produkcja alkoholu przebiega najlepiej bez dostępu tlenu. Z punktu widzenia drożdży alkohol i ditlenek węgla są produktami odpadowymi. Drożdże cały czas rosną i metabolizują w roztworze cukru, a gromadzący się alkohol staje się dla nich toksyczny w stężeniu 14−18%. Dlatego wino i piwo mają zawartość alkoholu najwyżej 14−16%. Aby wyprodukować napój o wyższym stężeniu alkoholu, produkty fermentacji trzeba poddać destylacji.

Jaka jest różnica między piwem a winem? Potocznie winem nazywa się napoje pochodzące ze sfermentowanego soku owocowego. W istocie „wino” jest sfermentowanym sokiem winogronowym z Vitis vinifera. Inne wina są określane nazwą owocu, z którego pozyskano sok, np., wino z czarnego bzu, wino brzoskwiniowe. W krajach zachodnich piwo zazwyczaj wytwarza się w procesie fermentacji słodu z kiełkujących ziaren jęczmienia, ale są też znane gatunki piw produkowane z ziaren innych zbóż. Procesy fermentacji wina i piwa są różne i, wbrew pozorom, bardziej skomplikowana jest produkcja piwa. Produkcja piwa to prawie osobna nauka. Tymczasem wino każdy może wyprodukować domowym sposobem. Drożdże odpowiedzialne za fermentację cukrów w owocach są zwykle obecne w skórkach winogron, a fermentacja wystąpi za każdym razem, gdy nastąpi pęknięcie skórki. Początkowo produkcja wina polegała właśnie na zebraniu owoców, zmiażdżeniu ich i umożliwieniu im fermentacji, co jest znacznie prostszym procesem niż wytwarzanie piwa.

Rys. 8.1. Schemat produkcji napojów alkoholowych przez mikroorganizmy

8.2.Związki organiczne obecne w napojach alkoholowych

Piwo, wino i inne napoje alkoholowe zawierają lotne i nielotne związki smakowe. Większość tych związków można pogrupować według tego, czy są obecnie w napojach destylowanych czy nie. Związki lotne obejmują alifatyczne związki karbonylowe, alkohole, kwasy monokarboksylowe i ich estry, związki zawierające azot i siarkę, węglowodory, związki terpenowe oraz związki heterocykliczne i aromatyczne. Nielotne związki smakowe to niesfermentowane cukry, dwu- i trójzasadowe kwasy karboksylowe, substancje barwiące, substancje garbnikowe i polifenolowe oraz sole nieorganiczne. Lotne związki napojów alkoholowych i destylatów zasadniczo pochodzą z trzech źródeł: obecne w surowcach, wytworzone w procesie fermentacji i wyekstrahowane z drewna beczek. Podczas dojrzewania znikają nieprzyjemne aromaty, prawdopodobnie spowodowane przez lotne związki siarki. Obserwacje prowadzone w czasie dojrzewania destylatów w beczkach dębowych wykazują obecność wielu związków uwalnianych przez alkohol ze ścian beczek. Niektóre aromatyczne aldehydy i związki fenolowe uwalniają się z lignin, oprócz monosacharydów, takich jak pentozy i kwercitol, kwasy karboksylowe i „lakton whisky” (5-butylo-4-metylodihydro-2-(3H)-furanon). Występowanie aromatycznych związków w alkoholu jest dowodem na proces chemicznego utleniania lignin. Procedura destylacji wpływa na występowanie i stężenie lotnych smakowych substancji w destylacie, zwyczajowo poprawiających jego smak. Jest to szczególnie ważne w procesie produkcji mocnych alkoholi. Niektóre aromatyzowane napoje alkoholowe mogą zawierać, oprócz naturalnych związków, dodane substancje syntetyczne i składniki izolowane z ziół i przypraw. Na przykład smaki wermutów, aperitifów, likierów i niektórych wódek smakowych często składają się z różnych olejków eterycznych lub ich mieszanin oraz surowego karmelu. Dokładne kompozycje smaków napojów alkoholowych są objęte tajemnicami handlowymi, ale w literaturze można znaleźć ich listę, która przekracza 1300 już zidentyfikowanych. Często do win i piw, aby zabezpieczyć je przed psuciem, dodaje się konserwanty, np. ditlenek siarki, które zapobiegają aktywności metabolicznej mikroorganizmów, oraz służą jako środek przeciwutleniający dodawany do moszczu lub słodu w ilości 70 mg/l. W piwach ditlenek siarki wiąże się z naturalnie występującymi związkami. Jest jednym z najważniejszych dodatków w produkcji wina. Większość ditlenku siarki dodawanego w roztworze wodnym lub jako roztwór wodny pirosiarczynu potasu jest wiązana przez aldehydy, pigmenty i polifenole. W wielu krajach dozwolone ilości wolnego ditlenku siarki w winach komercyjnych wynoszą 35−100 mg/l. Ditlenek siarki reaguje powoli z wolnym tlenem w winie, dlatego jest słabym przeciwutleniaczem, chyba że zostanie dodany do wina w znacznie wyższych stężeniach niż ogólnie akceptowane do hamowania aktywności bakteryjnej. Dodatek kwasu askorbinowego do wina tuż przed butelkowaniem służy utrzymaniu umiarkowanego poziomu ditlenku siarki. W obecności tlenu kwas askorbinowy szybko reaguje, tworząc nadtlenek wodoru i kwas dehydroaskorbinowy. Ditlenek siarki reaguje z nadtlenkiem wodoru, tworząc jony siarczanowe. Dopuszcza się stosowanie kwasu sorbowego (kwasu heksa-2,4-dienowego) w celu ochrony wina przed aktywnością bakterii i pleśni. Przy stężeniach 180−200 mg/l hamuje on wzrost drożdży, ale nie wpływa na metabolizm bakterii. Niektóre rodzaje bakterii mlekowych przekształcają kwas sorbowy w 2-etoksy-3,5-heksadien.

8.3.Zanieczyszczenia w napojach alkoholowych

Poniżej wymieniono niektóre zanieczyszczenia toksyczne, a nawet rakotwórcze obecne w napojach alkoholowych.

1. 1. N-nitrozoaminy. Występowanie nitrozoamin w napojach alkoholowych zostało wielokrotnie stwierdzane, mimo trudności analitycznych. Zanieczyszczenia N-nitrozodimetyloaminą (NDMA), N-nitrozodietyloaminą (NDPA) i N-nitrozodipropyloamina (NDPA) pojawiają się w czasie słodowania i suszenia słodu w wyniku reakcji z udziałem tlenków azotu. Zanieczyszczenia te mogą występować w whisky.

2. 2. Mikotoksyny. Na winogronach występuje wiele gatunków pleśni. Wśród nich może być obecny Aspergillus flavus, który produkuje aflatoksyny, mogące występować w pewnych seriach win w stężeniu około 1−3 µg/l. Inne mikotoksyny, jak ochratoksyna A oraz zearaleon, znaleziono w jęczmieniu stosowanym do produkcji piwa.

3. 3. Karbaminian etylu (uretan). Powstaje w wyniku reakcji fosforanu karbamylu z etanolem, jest obecny w większości napojów fermentowanych: w handlowych piwach, w sake, komercyjnych winach, brandy z owoców pestkowych (ze śliwek, moreli, wiśni, gruszek, jabłek, topinamburu), amerykańskim Bourbonie, kanadyjskiej, szkockiej i irlandzkiej whisky oraz w koniaku, armaniaku i tequili.

4. 4. Fungicydy. Są stosowane do likwidacji grzybów pleśniowych atakujących winnice, które przynoszą czasem ogromne straty. Pozostałości tych fungicydów są znajdowane w wyprodukowanych winach. Stosowanie pewnych fungicydów jest zakazane w Europie, Australii i USA, ale nie w innych szerokościach geograficznych. W większości krajów europejskich jako środki grzybobójcze są stosowane: diwęglan dietylu, diwęglan dimetylu, pimaricyna, kwas 5-nitrofuryloakrylowy i n-alkilowe estry 4-hydroksybenzoesanu. Inne fungicydy stosowane do ochrony winnic zawierają arszenik, który w pewnych sytuacjach może przenikać do wina.

8.4.Produkcja piwa

8.4.1. Wprowadzenie

Domowa produkcja piwa stała się popularnym hobby wielu ludzi. Niezbędne składniki i przepis na wytwarzanie piwa można kupić w wyspecjalizowanych sklepach. Niektórzy historycy uważają, że piwo mogło być znane przed okresem cywilizacji, w czasach gdy ludzie prowadzili koczowniczy tryb życia. Jednak większość wierzy, że produkcja piwa pojawiła się w dobie wczesnych cywilizacji. Sposób produkcji piwa, bardziej skomplikowany niż wina, został opanowany przez wiele społeczności na różne sposoby. Podobno starożytni mieszkańcy Mezopotamii i Sumerowie warzyli piwo już 10 000 lat p.n.e., ale tabliczki gliniane z recepturą na piwo pochodzą z Babilonii z okresu ok. 6000 lat p.n.e. i są pierwszymi udokumentowanymi dowodami produkcji piwa. Wykorzystywali oni niedopieczony chleb z kiełkującego jęczmienia, który służył jako żywy szczep drożdży. Chleb krojono na małe kawałki i umieszczano w dużym dzbanku z wodą. W ten sposób powstał słód, który fermentowano, aby uzyskać piwo. Czasami dodawano zioła i miód w celu nadania aromatu. W starożytnych Chinach do produkcji piwa wykorzystywano ryż. W cywilizacjach prekolumbijskich w obu Amerykach zamiast jęczmienia używano kukurydzy i nieświadomie wprowadzano własny enzym pochodzący ze śliny – przeżuwano kukurydzę przed umieszczeniem w zbiorniku fermentacyjnym. Enzymy zawarte w ślinie brały udział w procesie przekształcania skrobi w cukier i nadawały piwu lepszy i wyraźniejszy smak. Na obszarach wiejskich w Rosji od kilkuset lat wytwarza się kwas chlebowy przez fermentację mieszaniny kawałków czerstwego czarnego chleba, słodu, mąki, cukru i wody. Powstała mikstura zawiera tylko 1–2% alkoholu.

Warto zauważyć, że w wielu kulturach historycznie to kobiety trudniły się produkcją piwa, tak jak i innych artykułów żywnościowych, jak np. masło i ser. Babilończycy w Siris i w Rzymie poświęcili piwo bogini Ceres, która była boginią kukurydzy. Piwo nazywano wtedy cerevisia – od nazwy drożdży piwowarskich Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ kobiety uważano za bliskie bogini kukurydzy, stały się jej kapłankami, a także piwowarami w różnych kulturach. Piwo uważano za dar niebiański. Nordycy wierzyli, że ich piwo było w niebie napojem Vahalli, którzy zginęli w bitwie, a w Chinach piwo było po prostu darem z nieba. W kulturze zachodniej, w średniowieczu piwowarstwo było sztuką gospodarstwa domowego, do której każda dziewczyna przed zamążpójściem była przyuczana, tak jak do pieczenia chleba, ponieważ obie sztuki dotyczyły tych samych składników i tajemnic. Piwo nazywano „chlebem płynnym”, a posiłek składał się z piwa, chleba i sera. Dopiero w średniowieczu piwo zaczęto produkować w klasztorach i browarnictwo stało się procesem zdominowanym przez mężczyzn. W tym samym czasie do procesu produkcji piwa wprowadzono chmiel, który służył jako środek aromatyzujący, ale też konserwujący, nadawał piwu dłuższy okres trwałości. Wczesne piwo nie było zbyt smaczne, a jednym z powodów, dla których zostało powszechnie wybrane w wielu wczesnych kulturach, była zła jakość i zanieczyszczenie wody. Rzymskie armie niosły ze sobą piwo, gdy szły na podbój odległych ziem, aby uniknąć chorób z powodu złej jakości wody w obcych krajach. Na zdobytych terenach rozpowszechniano rzymskie drożdże, używając brzeczki z poprzednich partii piwa, aby mieć pewność, że napój będzie miał przyzwoitą jakość. Dużo później, w Czechach, regionie historycznym i dawnym królestwie na terenie dzisiejszych zachodnich Czech, założono browary państwowe w 1256 r. w mieście Budweis, a do 1384 r. powstały browary pilzneńskie pod kontrolą Karola IV. W Niemczech, gdy miejscowe piwo było niesmaczne, sprowadzano je z innego miasta i sprzedawano po kosztach w piwnicy ratusza. W średniowiecznej Anglii rodzina panny młodej przygotowywała dla niej specjalny „Ale dla panny młodej”. Słowo „Ale” pochodzi od średniowiecznego hael, co oznaczało „dobre zdrowie”. Rządy wykorzystywały również piwo jako sposób pobierania podatków. Nie można było bezpośrednio nałożyć podatku na piwo, ponieważ powstawało ono w domu. Podatek pobierano zatem od składników, które były potrzebne do jego produkcji. Kościoły były zwolnione z tego podatku, ze względu na to, że do produkcji piwa stosowały własne surowce, a często kupowały też piwo od miejscowej społeczności. W Anglii, z powodu niechęci wiernych do tej praktyki, doszło do rozłamu Kościoła Rzymskokatolickiego. Dopiero po reformacji i osłabieniu kościoła browarnictwo przeszło w ręce browarów komercyjnych, które można było opodatkować za warzenie piwa. Zanim Europejczycy ruszyli na podbój świata, piwo było już znane wszędzie. Kolumb pił piwo kukurydziane produkowane przez Hindusów z Indii. Mówi się, że kurczące się zapasy piwa na pokładzie Mayflower w 1620 r. doprowadziły do zakończenia podróży w Plymouth. Pierwsi osadnicy, tacy jak George Washington i William Penn, uznali produkcję piwa za konieczną i założyli własne browary. Anglicy rozpoczęli budowę własnych lokalnych browarów w 1629 r. Holendrzy również zakładali własne browary. W Niemczech produkowano piwo lager. Można powiedzieć, że piwo przyczyniło się nawet do wyższego wykształcenia kobiet, gdyż w 1861 r. Matthew Vassar zainwestował swoją fortunę, zarobioną na piwie, w otwarcie Vassar College.

Dziś piwo jest spożywane na świecie w ogromnych ilościach, a jego produkcja jest w dużej mierze zautomatyzowana, jak wszystkich wyrobów produkowanych masowo. Pomimo wyrafinowanej aparatury stosowanej do warzenia piwa, procedury są wciąż takie same jak stosowane od setek lat. Ludzie od dawna wiedzieli, jak wytwarzać piwo, ale nie znali naukowych podstaw tego procesu. Dopiero w XIX w. odkryto, że podczas kiełkowania ziaren zbóż są uwalniane enzymy, które hydrolizują nie tylko skrobię jęczmienia, ale i białka, odpowiednio na cukry proste i aminokwasy, a także robią to samo w innych surowcach takich jak ziemniaki, kukurydza i pszenica. To odkrycie przyczyniło się do obniżenia kosztów produkcji piwa, ponieważ kiełkujący jęczmień można było zastąpić ziemniakami, kukurydzą czy pszenicą.

Proces fermentacji stosowany od tysięcy lat długo uważano bardziej za magiczny niż materialny. W rezultacie istniało wiele rytuałów i przesądów w kierowaniu i kontroli fermentacji. Przez wiele lat spierano się na temat udziału drożdży w procesie fermentacji. Dopiero prace Ludwika Pasteura, w latach 50. i 60. XIX w., wyjaśniły to zjawisko. Pasteur został poproszony przez destylarnię z Lille, która produkowała alkohol z cukru buraczanego, o wyjaśnienie problemu wytwarzania kwasu mlekowego w procesie fermentacji alkoholowej. Podczas badania produktu fermentacji pod mikroskopem Pasteur zaobserwował zwykłe komórki drożdży, a także wiele mniejszych komórek w kształcie laseczek i ziarniaków. Gdy umieścił niewielką ilość tego materiału w roztworze cukru, nastąpiła energiczna fermentacja kwasu mlekowego wraz z wytworzeniem szarego osadu w roztworze. Kolejne transfery tych komórek zawsze skutkowały fermentacją kwasu mlekowego i wzrostem liczby komórek. Pasteur nazwał te komórki nowymi „drożdżami”, które podczas wzrostu specyficznie przekształcają cukier w kwas mlekowy. Dopiero po latach odkryto, że nowe „drożdże” to bakterie. Stosując podobną metodę, Pasteur badał wiele organizmów i ich procesy fermentacyjne. Udało mu się wykazać, że różnym wytwarzanym produktom fermentacji zawsze towarzyszyły określone mikroorganizmy. Odkrycie to miało też dalsze znaczenie. Tak jak różne mikroorganizmy produkowały różne produkty fermentacji z cukru, tak różne choroby powstały w wyniku działania różnych mikroorganizmów, które nie powstawały spontanicznie, jak kiedyś sądzono, ale każdy z nich pochodził z wcześniej istniejących komórek takiego samego typu. Odkryto, że zniszczenie mikroorganizmów w produktach spożywczych i napojach lub zapobieżenie ich pojawieniu się w produktach sterylnych, zapobiega psuciu się tych produktów. Koncepcja ta doprowadziła do obróbki cieplnej produktów spożywczych i napojów, którą obecnie znamy jako pasteryzację.

Pierwotnie piwo miało smak słodu i ziarna, dopiero w browarach w Europie Środkowej odkryto, że dodatek szyszek chmielu zachował charakter piwa i nadał mu lekko gorzki smak, przez co uczynił go bardziej smacznym. Jednak chmiel nie był jedynym stosowanym gorzkim dodatkiem. W Skandynawii dodawano garbniki z drzew dębowych i jesionowych, w południowej Europie – cynamon, a w Ameryce – słodki koper włoski, lukrecję lub sassafry. Niemniej do końca XV w. to chmiel stał się standardowym gorzkim i konserwującym dodatkiem do piwa. Tylko w Anglii broniono się przed dodatkiem chmielu, ale i tam zaakceptowano go pod koniec XVI w.

8.4.2. Rodzaje piwa

Dzięki genetycznej manipulacji wyhodowano wiele odmian drożdży, co wraz z modyfikacjami w procesie warzenia, doprowadziło do powstania różnych rodzajów piw. Niżej wymieniono podstawowe rodzaje piwa.

1. 1. Lager – piwa produkowane z użyciem drożdży Saccharomyces carlsbergensis, które w czasie wzrostu osadzają się na dnie bioreaktora, dzięki czemu otrzymywane piwo jest przezroczyste. Większość piw to lagery.

2. 2. Pilsner – bezbarwne piwo lager pierwotnie warzone w Pilźnie. Do warzenia tego piwa używa się wody o podwyższonej zawartości wapnia i magnezu. Kolor pilsnera jest jaśniejszy niż lagera.

3. 3. Ale – piwa produkowane przy użyciu drożdży Saccharomyces cerevisiae, które pływają na szczycie kadzi warzelniczych, przez co piwo jest mętne. Piwo to ma wyższą zawartość alkoholu niż lager.

4. 4. Stout – piwo bardzo ciemne, prawie czarne. Ciemny kolor i palony smak pochodzą z prażonego jęczmienia i/lub słodu. Historycy piwa uważają je za potomka piwa porter.

5. 5. Porter – bardzo ciemne piwo typu ale. Ciemniejszy kolor i specjalny smak pochodzi z opiekania słodu przed zaparzeniem. Zwykle ma bardziej wyrazisty smak i wyższą zawartość alkoholu. Uważany przez historyków piwa za prekursora piwa stout.

8.4.3. Szczepy stosowane do produkcji piwa

Do produkcji piwa stosuje się brzeczkę słodu jęczmiennego, która zawiera glukozę, maltozę i maltotriozę. Piwo lager jest produkowane przez drożdże Saccharomyces pastorianus lub przez ich naturalne hybrydy (Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces eubayanus). Do produkcji piwa typu lager stosuje się szczepy, które wykorzystują maltotriozę bardziej efektywnie niż szczepy do produkcji piwa ale, a fermentację prowadzą w niskich temperaturach. Liczne szczepy stosowane w produkcji piwa ale prowadzą fermentację w temperaturach wyższych w porównaniu do produkcji piwa lager. Piwa lambic tradycyjnie charakteryzują się fermentacją spontaniczną, ale niektóre z nich oraz belgijskie są produkowane przy użyciu szczepów Brettanomyces bruxellensis i innych drożdży.

8.4.4. Jakościowy skład chemiczny piwa

Piwo zawiera wiele związków organicznych, w tym:

1. 1) aldehydy: octowy, pirogronowy, krotonowy, izomasłowy, izowalerianowy, octanal, nonanal, dekanal, dodekanal (aldehyd laurylowy);

2. 2) alkohole: glicerol (od 1100–2100 aż do 3170 mg/l), 1-propanol, izobutanol, metylobutanol, fenetylowy (fuzle), benzylowy, tyrosol, tryptofol;

3. 3) kwasy lotne: kwasy monokarboksylowe od kwasu mrówkowego do C18, w tym znaczne ilości kwasu octowego, heksanowego, oktanowego, dekanowego;

4. 4) hydroksykwasy: kwas mlekowy (36–430 mg/l), pirogronowy oraz kwas trihydroksydecenowy;

5. 5) kwasy nielotne: szczawiowy (2–28 mg/l), bursztynowy (12–166 mg/l), jabłkowy (0–213 mg/l), cytrynowy (5–252 mg/l);

6. 6) estry kwasów alifatycznych: etylooctan (10–69 mg/l), octan izopentylowy, etyloheksanian i etylooktanian, octan fenetylu;

7. 7) aminy i amidy: metyloaminę, etyloaminę, n-propyloaminę, isobutyloaminę, n-butylaminę, izopentyloaminę (izoamylaminę), n-heksyloaminę, N,N-dimetylo-n-butyloaminę, 2-aminoacetofenon, dimetyloaminę, trimetyloaminę, para-(2-aminoetylo)-fenol (tyraminę) jako czynniki odpowiedzialne za zapach piwa;

8. 8) histaminę i inne N-heterocykliczne związki (puryny i pirymidyny): histaminę (do 1,9 mg/l), uracyl, adeninę, cytozynę, ksantynę, guaninę, tyminę, tymidynę, adenozynę, inozynę (wszystkie w ilościach do 40 mg/l), guanozynę (30–160 mg/l), cytydynę (18–70 mg/l), urydynę (15–200 mg/l);

9. 9) pyrole i indole: 2-metylopyrol,2-formylopyrol, 2-acetylopyrol, 2-acetylo-S-metylopyrol, 1-acetylopyrol, 1-furfurylopyrol, 2-pyrrolidon i indole: 2-acetylotiazol, 4-metylo-S-hydroksyetaylotiazol, nikotynian metylu, nikotynian etylu, nikotynian 3-metylobutylu, nikotynian 2-fenetylu;

10. 10) fenole: krezole, 4-winylofenol, 2-metoksy-4-winylofenol, 4-hydroksybenzyloaldehyd;

11. 11) kwasy aromatyczne: benzoesowy, fenylomlekowy, salicylowy, 4-hydroksybenzoesowy, protokatechusowy, waniliowy. 4-hydroksyfenylooctowy, fenylomlekowy, ferulowy, cynamonowy, kumarowy, fenylopropionowy, 4-hydroksyfenylopropionowy;

12. 12) związki siarki (w µg/l): siarczyn, siarkowodór, ditlenek siarki, disiarczek węgla, metanotiol, siarczek etylenu, etanotiol, propanetiol, siarczek dimetylu, disiarczek dimetylu, disiarczek dimetylu, trisiarczek dimetylu, tiooctan metylu, tiooctan etylu, metionol, metional, 3-metylo-2-buteno-1-tiol.

W tabeli 8.1 przedstawiono wydajności produkcji alkoholu przez drożdże inne niż Sacharomyces oraz substancje zapachowe.

Tabela 8.1. Wydajności technologiczne i cechy drożdży innych niż Saccharomyces z potencjalnymi zaletami w technologii warzenia piwa

Gatunek drożdży

Cukier fermentowany

Procentowa zawartość etanolu

(% obj.)

Zawartość związków smakowo--zapachowych (g/l)

Lotne związki organiczne

Lit.

Saccharomyces cerevisiae

glukoza, fruktoza, galaktoza, maltoza, sacharoza

12–18

< 0,5

wyższe alkohole, estry

[1]

Torulaspora debrueckii

glukoza, fruktoza, galaktoza, maltoza, sacharoza

< 9

< 0,5

mleczan etylu

2-fenyloetylooctan

3-etoksypropanol

[2]

[3]

[4]

Lachancea thermotolerans

glukoza, fruktoza, galaktoza, maltoza

< 9

< 0,5

2-fenylooctan

mleczan etylu

[5]

Schizosaccharomyces pombe

glukoza, fruktoza, sacharoza, maltoza

12–14

0,8–1,4

wyższe alkohole

estry

[1]

[6]

Saccharomycodes ludwigii

glukoza, fruktoza, sacharoza

12–14

< 0,5

diacetyl, acetoina

[7] [8]

Brettanomyces bruxellensis

glukoza, fruktoza, maltoza, sacharoza, celobioza

< 2

> 1

etylofenole

kwas izowalerianowy

kwas izomasłowy

pirazyny

[2]

[9]

[10]

[11]

[12] [13]

[1] Suárez-Lepe i wsp. 2012. Trends Food Sci. Technol., 23: 39–50. [2] Basso i wsp. 2016. Food Res. Intern., 86: 112–120. [3] Ciani i wsp. 2006. Intern. J. Food Microbiol., 108: 239–245. [4] Loira i wsp. 2014. LWT – Food Sci. Technol., 59: 915–922. [5] Comitini i wsp. 2011. Food Microbiol., 28: 873–882. [6] Palomero i wsp. 2009. Food Chemistry, 112: 432–441. [7] De Francesco i wsp. 2015. J. Inst. Brewing, 121: 113–121. [8] Domizio i wsp. 2011. Intern. J. Food Microbiol., 147: 170–180. [9] Crauwels i wsp. 2015. Brewing Sci., 68: 110–121. [10] Snauwaert i wsp. 2016. Intern. J. Food Microbiol., 221: 1–11. [11] Suárez i wsp. 2007. Food Chemistry, 102: 10–21. [12] Blomqvist i wsp. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol., 87: 1487–1497. [13] Kulkarni i wsp. 2015. LWT – Food Sci. Technol., 64: 1255–1262.

8.5.Produkcja wina

8.5.1. Wprowadzenie

Podobnie jak w przypadku piwa, miejsce i czas powstania wina są niepewne. Ze względu na ogromną liczbę różnych rodzajów wina, które są produkowane, opis będzie dotyczył wina gronowego. Gatunki winogron używane w większości win to Vitis vinifera. Około 600 lat p.n.e. uprawa winorośli rozprzestrzeniła się z regionu śródziemnomorskiego do Francji, a później do Hiszpanii, Portugalii i Algierii. Do niedawna Europa i Afryka Północna były światowym liderem pod względem jakości i ilości produkowanych win. Obecnie USA, Argentyna i Rosja plasują się w pierwszej dziesiątce krajów produkujących wino na świecie.

Jeśli pożądanym produktem jest białe wino, sok z winogron przenosi się do zbiornika fermentacyjnego, a skórki i łodygi usuwa się i ponownie prasuje. Sok z drugiej prasy można dodać do oryginalnego soku lub wykorzystać do produkcji wina gorszej jakości. Jeśli pożądanym produktem jest czerwone wino, skóry gron winogronowych trafiają do zbiornika fermentacyjnego z sokiem winogronowym. Czerwony kolor wina pochodzi z czerwonego pigmentu skóry gron. Jako bioreaktory fermentacyjne mogą być używane różne zbiorniki. Gdy sok znajduje się w zbiorniku fermentacyjnym, często dodaje się preferowane szczepy drożdży, ale nie są one niezbędne. Na skórze winogron są już odpowiednie drożdże, aby ten krok można było pominąć, ale w ten sposób otrzymuje się wina niekontrolowanej jakości. Dodanie korzystnych drożdży daje pewną kontrolę nad produktem końcowym. W tym czasie do soku jest też zwykle wprowadzany ditlenek siarki, aby powstrzymać wzrost bakterii, które mogą zepsuć smak produktu końcowego. Istotnym elementem jest dodanie odpowiedniej ilości komórek drożdży w inoculum. Drożdże powinny być aktywne metabolicznie. Inoculum przygotowuje się poprzez ich preinkubację w podłożu zawierającym cukier, który potrafią metabolizować. Preinkubację można prowadzić w warunkach tlenowych, ponieważ w tych warunkach pozyskuje się dużą biomasę drożdży. Po początkowej „szybkiej fermentacji” trwającej 5−10 dni w zależności od temperatury drożdże opadają na dno fermentora. Po tym czasie należy zdekantować płyn znad osadu i dalej prowadzić fermentację przez 20 dni do około jednego miesiąca. Podczas tej drugiej fermentacji martwe komórki drożdży oraz różne inne cząstki stałe wciąż osiadają na dno fermentora. Po zakończeniu tego procesu wino oddziela się od osadu i przenosi do zbiornika do jego dalszego dojrzewania (starzenia). W miarę postępu procesu dojrzewania dochodzi do dalszej sedymentacji drożdży. Podczas dojrzewania wino jest często przenoszone przez szereg zbiorników (ostatnim zbiornikiem jest zwykle drewniana beczka). Ponieważ drewnianych beczek nie można dokładnie wyczyścić, nadają one winom niepowtarzalny charakter, niektóre sprawiają, że wino staje się „lepsze”. Jednak zastosowanie kadzi ze stali nierdzewnej usuwa tę niepewność. Dojrzewanie wina jest zmienne. Białe wina dojrzewają najczęściej od roku do osiemnastu miesięcy, a czerwone wina mogą dojrzewać długo – nawet pięć i wiele więcej lat. W kolejnych etapach dojrzewania wino jest pobierane i oceniane przez mistrza procesu produkcji wina. Los wina zależy od jego decyzji. Wino może być butelkowane dopiero po zakończeniu procesu starzenia. Wino butelkowane, na podstawie decyzji mistrza wina, może jeszcze leżakować dłużej lub być sprzedawane natychmiast po butelkowaniu. Wina białe poddawane starzeniu przez okres do pięciu lat, mają tendencję do pogarszania smaku. Wina czerwone mogą leżakować przez trzydzieści, a nawet więcej lat. Takie wina stają się „martwymi”, ponieważ są fermentowane w otwartych zbiornikach i nie zawierają gazowego ditlenku węgla. Jeśli fermentacja zatrzyma się, zanim wszystkie cukry zostaną zmetabolizowane przez drożdże, produktem końcowym jest wino słodkie. Jeśli wszystkie cukry zostaną zmetabolizowane, to wino jest wytrawne. W winie, podobnie jak w piwie, procentowa zawartość alkoholu będzie wynosić 14−18%. Szczegółowy przepis na czerwone i białe wina można pobrać z Wydziału Winiarstwa i Technologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Mają ładną stronę internetową na temat robienia wina w domu, z recepturami w plikach pdf.

8.5.2. Szampan i wina musujące

Szampan to szczególny rodzaj musującego wina, a potocznie – każde wino musujące. Nazwę swą zawdzięcza Szampanii, regionowi w północno-wschodniej Francji, gdzie jest tradycyjnie produkowany. Szampan jest produkowany bez sztucznego nasycania napoju ditlenkiem węgla. Ditlenek węgla tworzy się w nim na skutek naturalnego procesu dojrzewania wina w butelkach. Do butelek nalewa się młode, nie do końca przefermentowane wino, a następnie przechowuje się je lekko pochylone w stronę korka w piwnicach, w stałej temperaturze 3−5°C. W odróżnieniu od szampana (nazwa została zastrzeżona w 1911 r.) inne francuskie wina musujące produkowane metodą szampańską są nazywane „mousseux”. A co z naprawdę tanim szampanem? Cena szampana niekoniecznie oznacza, że brakuje mu jakości. Niektóre szampany są tanie, ponieważ są produkowane masowo w dużych kadziach, a nie w pojedynczych butelkach. W Szampanii produkuje się również wina o słabej mocy, które noszą nazwy: czerwone (Bouzy), białe (Coteaux champenois) lub różowe (rosé des Riceys). Produkuje się tam także wina białe musujące ze szczepów winogron chardonnay, pinot noir i pinot meunier, które uchodzą za doskonałe, dlatego są stosunkowo drogie.

Cava to hiszpańskie wino musujące wytwarzane metodą szampańską. Jest to produkt znacznie lepszy niż pozostałe wina musujące, ma wyśmienity smak i jest alternatywą zarówno dla drogiego francuskiego szampana, jak i zwyczajnych win musujących. Cava to katalońska wariacja francuskiego szampana. Po burzliwej fermentacji, płyn zostaje zdekantowany, a świeże wino zabutelkowane. W czasie leżakowania w butelkach pochylonych szyjką lekko ku dołowi zachodzi samoistnie druga fermentacja z udziałem pozostających w nim drożdży, podczas której wydzielany ditlenek węgla rozpuszcza się w winie. Zgromadzony osad zostaje usunięty. Jest to wino typu szampan, a nie musujące, do którego nie jest nabijany ditlenek węgla. Podstawową różnicą jest miejsce wytwarzania wina. Szampan francuski jest wytwarzany w Szampanii, a Cava w Katalonii oraz innych regionach jak Alto Penedes, skąd pochodzi prawie 95% wszystkich butelek oraz Walencja, Nawarra, Rioja, Kraj Basków, Kastylia czy Estremadura.

8.5.3. Wina korzenne (wermuty), słodkie likiery i miody pitne

Wermut to wino aromatyzowane dodatkami ziołowymi i korzennymi. (najczęściej piołunem, a także szałwią, kolendrą, gałką muszkatołową). Zawartość alkoholu waha się w granicach 12–20% objętościowych (może być wzmacniane alkoholem). Bywa dosładzane cukrem lub karmelem. Ze względu na barwę wyróżnia się wermuty czerwone (włoskie rosso) i białe (włoskie bianco), a w zależności od ilości cukru dzieli się je na: gorzkie (włoskie amaro), wytrawne (włoskie secco) i słodkie (włoskie dolce).

Likier (francuski liqueur) to napój alkoholowy o smaku słodkich owoców, korzennym lub korzenno-ziołowym i zawartości alkoholu 23–45%, zwany powszechnie nalewką.

Miód pitny to tradycyjny napój alkoholowy powstały w procesie fermentacji brzeczki miodu pszczelego, najczęściej lipowego. Jest wyrabiany i spożywany w Polsce i na Litwie, zarejestrowany przez Komisję Europejską jako gwarantowana tradycyjna specjalność. Podział miodów pitnych jest warunkowany stopniem rozcieńczenia miodu w brzeczce. Różne bukiety miodów uzyskuje się przez doprawianie brzeczki sokami owocowymi (miody owocowe) lub przyprawami korzennymi i ziołami (miody korzenne i „miody korzenno-ziołowe”).

8.5.4. Fermentacja wina

Tradycyjne wino charakteryzuje się spontanicznymi fermentacjami moszczu winogronowego przez naturalnie występującą mikroflorę (główne rodzaje drożdży związane z winogronami to: Kloeckera i Hanseniaspora, mniej reprezentowane Candida, Metchnikowia, Cryptococcus, Pichia i Kluyveromyces i bardzo słabo przez populacje Saccharomyces cerevisiae). Nowoczesne, wielkoskalowe winnice wykorzystują specjalnie wyselekcjonowane szczepy startowe Saccharomyces cerevisiae dostępne w postaci wysuszonej (aktywne suche drożdże ADY) produkowane przez specjalistyczne firmy dostarczające drożdże. Czasami drugorzędne komercyjne szczepy starterowe, inne niż Saccharomyces, jak Candida stellata, mogą być stosowane do nadawania specyficznego smaku i aromatu wina.

Ogólnie rzecz biorąc istnieje pięć podstawowych etapów procesu produkcji wina: zbiór winogron, wytwarzanie moszczu, fermentacja, klarowanie oraz dojrzewanie i butelkowanie wina.

1. 1. Zbiór winogron jest pierwszym krokiem w procesie produkcji wina i ważną częścią zapewnienia jego jakości. Winogrona są jedynym owocem, który zawiera kwasy, estry i taniny niezbędne do wytwarzania naturalnego i stabilnego wina. Moment zbierania winogron decyduje o kwasowości, słodyczy i smaku wina. Kwasowość i słodycz winogron powinny być w doskonałej równowadze, ale zbiory są również silnie uzależnione od pogody. Zbiór może odbywać się ręcznie lub mechanicznie. Po dostarczeniu zabranych winogron do winnicy, usuwane są owoce zgniłe lub niedojrzałe.

2. 2. Wytwarzanie moszczu zaczyna się po sortowaniu. Mechaniczne prasy wyciskają z winogron sok winogronowy (moszcz) zawierający skórki, nasiona i inne ciała stałe. Prasowanie mechaniczne w odpowiednich warunkach sanitarnych zwiększa trwałość i jakość wina. W produkcji białego wina oddziela się sok od skór, nasion i ciał stałych, aby nie przedostały się do niego niepożądany kolor i garbniki. Natomiast czerwone wino pozostaje w kontakcie ze skórami, aby nabrało smaku, koloru i dodatkowo taniny.

3. 3. Fermentacja moszczu (lub soku) może się zacząć naturalnie w ciągu 6−12 godzin, gdy jest wspomagana dzikimi drożdżami. Wielu producentów wina dodaje komercyjne drożdże hodowlane, aby zapewnić spójność i przewidywalność wyniku końcowego, sterylizuje moszcz, dodając pirosiarczyn potasu jako czynnik wytwarzający SO_2 i czynnik dezynfekcyjny (K_2S_2O_5 + 2HCl → 2KCl + 2SO_2 + H_2O). Fermentacja trwa, dopóki cały cukier nie zostanie przetworzony w alkohol i wytworzy się wytrawne wino. Aby uzyskać słodkie wino, zatrzymuje się proces, zanim cały cukier zostanie przetworzony. Fermentacja może trwać od 10 dni do miesiąca lub dłużej.

4. 4. Klarowanie wina rozpoczyna się po zakończeniu fermentacji. Jest to proces, w którym usuwa się ciała stałe, takie jak martwe komórki drożdży, garbniki i białka. Wino jest przenoszone lub „pakowane” do beczki dębowej lub do zbiornika ze stali nierdzewnej. Klarowanie polega na dodaniu do wina pewnych substancji w celu usunięcia zawiesin. Na przykład dodaje się glinę, do której przylegają cząstki stałe. Podczas filtracji wina przechwytuje się większe cząstki. Następnie sklarowane wino umieszcza się w innym naczyniu i przygotowuje do butelkowania lub przyszłego dojrzewania.

5. 5. Dojrzewanie i butelkowanie to ostatnie etapy produkcji wina. Sklarowane wino można natychmiast butelkować lub poddać jeszcze dojrzewaniu. Wino może dojrzewać w butelkach, w zbiornikach ze stali nierdzewnej lub w dębowych beczkach. Dojrzewanie wina w dębowych beczkach sprawia, że jest ono bardziej waniliowe, ma mniej taniny oraz utrzymuje bukiet smakowy. Zbiorniki stalowe są powszechnie używane do wytrawnych białych win. Po okresie starzenia wina są butelkowane z korkiem lub zakrętką, w zależności od preferencji producenta.

Decydujący wpływ na smak i zapach win białych i czerwonych mają następujące grupy związków:

1. 1. Związki karbonylowe: głównie aldehyd octowy, który stanowi 90% wszystkich aldehydów w winie, i występuje w ilości 50–160 mg/l w winach białych i czerwonych. W winie występują również niewielkie ilości innych alifatycznych aldehydów i ketonów, jak np.: 3-hydroksy-2-butanon (0,002−0,3 mg/l) i 3-hydroksy-2-pentanon we francuskich winach białych i czerwonych. Chardonnay i Riesling zawierają niewielkie ilości 2-metylobutanalu, 3-metylobutanalu, heksanalu i 2-heptanonu. W różnych winach francuskich znaleziono benzaldehyd. Dwa diketony obecne w winach białych i czerwonych, 2,3-butanodion i 2,3-pentanodion, mogą mieć wpływ na smak, chociaż występują w małych ilościach.

2. 2. Acetale. W przeciwieństwie do piw, wina zawierają acetal (1,I-dietoksyetan) jako główny składnik substancji lotnych. Powstaje on w reakcji aldehydu octowego z etanolem i nadaje winom zapach, co ma ogromne znaczenie. Jego ilości wahają się od części mg/l do kilkunastu mg/l. Inne liczne acetale występują w niskich stężeniach.

3. 3. Alkohole. Oprócz etanolu, dwa związki – glicerol (2−36 g/l) i 2,3-butanediol (2,7−3,3 g/l) – dominują wśród alkoholi obecnych w winach. Znajdują się także alkohole fuzlowe i długołańcuchowe, takie jak: 1-propanol (11−125 mg/l), 2-metylo-l-propanol (15−174 mg/l), 2-metylo-1-butanol (12−311 mg/l) i izopentanol (49−180 mg/l) i fenetyl (5−138 mg/l), alkohole aromatyczne, jak tyrosol (4-hydroxyfenetyl, 5−45 mg/l) i tryptofol (3-indoletanol, 0,3−3,1 mg/l). Z innych alkoholi długołańcuchowych wina zawierają pentanole, heksanol i jego izomery, heptanol, oktanol, nonanol i dekanol.

4. 4. Kwasy lotne. Kwas octowy jest dominującym kwasem w winach francuskich i kalifornijskich (900–1200 mg/l), a w niemieckich jest go znacznie mniej (około 300 mg/l). Oprócz niego w winach znajdują się znaczne ilości kwasu mlekowego (900−5600 mg/l) oraz 2,3-dihydroksy-2-metylomasłowego (60−550 mg/l).

5. 5. Kwasy nielotne. W winach obecne są kwasy: jabłkowy (3380 mg/l), cytrynowy (270 mg/l), bursztynowy (500 mg/l) i w największych ilościach winowy (3380 mg/l).

6. 6. Estry. Octan etylu jest głównym estrem win białych (44−122 mg/l) i win czerwonych (78−257 mg/l). Często występują estry etylowe kwasów krótkołańcuchowych. Również estry octanowe jako fuzle znaleziono w winach białych i czerwonych. Zazwyczaj są to estry etylowe kwasów dekanowych i dodekanowych. Ponadto w winach zidentyfikowano szereg estrów pochodzących z winogron, jak antranilan metylu, którego zapach został opisany jako charakterystyczny dla odmiany winorośli Vitis labrusca. Ester cykliczny, 2,6,6-trimetylo-2-4-acetoksytetrahydropiran winylu, razem z pochodną tetrahydrofuranu, tlenkiem linalolu, potencjalnie przyczynia się do smaku wina. Szereg estrów kwasów di- i trikarboksylowych: wszechobecny bursztynian dietylu, monooctan 2,3-butanodiolu, bursztynian metyloetylu, malonian dietylu, jabłczan dietylu, 2-ketoglutaran dietylu i 2-hydroksyglutaran dietylu znaleziono w winach francuskich.

7. 7. Aminy. Są tworzone głównie przez bakteryjną dekarboksylację aminokwasów, ale małe ilości mogą również produkować w reakcjach enzymatycznych drożdże. Saccharomyces cerevisiae mogą wytwarzać odpowiednie N-acetyloaminy z 2-metylobutyloaminy, 3-metylobutyloaminy i 2-fenetyloaminy w podłożu fermentacyjnym. W konsekwencji niektóre amidy wykryte w winie powstają z amin produkowanych przez drożdże podczas fermentacji wina. Z innych amin w winie znajdują się etyloamina, izobutyloamina, izopentyloamina, heksyloamina, etanoloamina, tyramina, putrescyna, histamina, kadaweryna, spermidyna i spermina, których stężenie zmniejsza się w czasie dojrzewania w butelkach. Ilości amin w różnych winach są bardzo zróżnicowane, ale stosunkowo niskie i nie przekraczają kilkanastu miligramów w litrze wina.

8. 8. Amidy. W winach zidentyfikowano liczne acetamidy. Należą do nich N,N-dimetyloformamid, N-3-metylobutyloacetamid, N-n-pentyloacetamid, N-etyloacetamid, N-n-heksyloacetamid, N-n-propyloacetamid, N-cykloheksyloacetamid, N-izopropyloacetamid, N-n-butyloacetamid, N-2-fenetyloacetamid, N-izobutyloacetamid, N-piperydyloacetamid, N-2-metylobutyloacetamid i N,N-dietyloacetamid, które występują w ilościach ledwie oznaczalnych.

9. 9. Związki terpenowe. Wino zawiera liczne węglowodory terpenowe, aldehydy terpenowe i ketony, alkohole terpenowe, estry alkoholi terpenowych i ich produkty utleniania. Ilości poszczególnych terpenów różnią się znacznie w zależności od wina. Skład związków terpenowych zależy częściowo od odmian winogron. Ponieważ wolne i glikozydowe pochodne monoterpenów są równomiernie rozmieszczone między skórą, miazgą i sokiem, dość duża część terpenów związanych z glikozydami występuje w młodym winie, a ilości związków glikozydowych zmieniają się podczas dojrzewania.

10. 10. Związki fenolowe. Oprócz alkoholi fenolowych, aldehydów i kwasów, wina czerwone zawierają niewielkie ilości fenolu, o-krezolu, m-krezolu, p-krezolu, gwajakolu, 2-etylofenolu (syringolu etylowego), 4-etylofenolu, 4-winylofenolu, 4-etylogwajakolu, 4-winylogwajakolu, eugenolu i 2,6-dimetoksyfenolu, 2,6-dimetoksy-4-izopropylofenol (syringolu izopropylowego). Występują również pochodne kwasu cynamonowego, antocyjany, flawonole i taniny. Antocyjany i garbniki pochodzące z winogron to główne pigmenty w czerwonym winie. Ich obecność wpływa na kolor i właściwości organoleptyczne wina. Poszczególne antocyjany różnią się liczbą grup hydroksylowych i metoksylowych w cząsteczce, a także charakterem i liczbą glikozydowo związanych cukrów. Pięć antocyjanów – delfinidyna, petunidyna, malwidyna, cyjanidyna i peonidyna – oraz ich 3-monoglukozydy i 3,5-diglukozydy występują powszechnie w winogronach i winach.

8.6.Alkohole spirytusowe

Czyste wódki (40%) kilkakrotnie destylowane zawierają wodę oraz etanol. Pozostałe, zwłaszcza leżakowane w beczkach, zawierają dodatkowo wiele substancji organicznych, których obecność może budzić niepokój z powodu ich stężenia, zwłaszcza że mogą być niebezpieczne. Zwykle alkohole typu whisky oraz koniaki i rumy, które są dwukrotnie destylowane, zawierają oprócz etanolu różne produkty fermentacji. Surowcami do produkcji alkoholi spirytusowych są moszcze pochodzące z ziaren zbóż lub kukurydzy, winogron, trzciny cukrowej i liści agawy. Winiaki mogą być produkowane z win wytwarzanych na bazie jednego owocu, jak calvados czy śliwowica, lub mieszanki różnych owoców, jak ratafia.

8.6.1. Whisky

Whisky to jeden z najpopularniejszych napojów spirytusowych. Zgodnie z europejską definicją jest to napój spirytusowy wytwarzany w drodze destylacji zacieru z ziarna słodowego lub z ziaren, które zostały scukrzone przez diastazę zawartego w nim słodu. Brzeczka zbożowa na bazie słodu jęczmiennego, egzogenne enzymy plus skrobia niesłodowana z pszenicy, żyta, kukurydzy, sorgo itp., zawierające glukozę, maltozę i maltotriozę, służą do produkcji piwa, szkockiej whisky, amerykańskiego Burbona i whisky Tennessee, whisky z żyta kanadyjskiego, irlandzkiej whisky. Szkocka whisky słodowa jest produkowana z brzeczki słodu jęczmiennego. Whisky są produkowane z użyciem szczepów Saccharomyces cerevisiae. Producenci szkockiej whisky używają obecnie wybranych szczepów Saccharomyces cerevisiae w trzech głównych postaciach – drożdże kremowe, drożdże prasowane (ciasto) i drożdże suszone. Słodowe destylarnie whisky tradycyjnie stosują drożdże prasowane, ale większe gorzelnie zbożowe stosują teraz drożdże kremowe. Suszone drożdże nie są tak dobre, jak prasowane i kremowe w fermentacjach whisky. Destylację prowadzi się w ilości poniżej 94,8% objętości w celu zachowania aromatu i smaku pochodzącego z użytych surowców. Whisky powinna dojrzewać przez co najmniej trzy lata w drewnianych beczkach o pojemności do 700 l. Końcowy destylat zachowuje swój kolor, aromat i smak pochodzący z procesu produkcyjnego. Do destylatu można dodawać tylko wodę i zwykły karmel. Szkocka whisky to najpopularniejszy rodzaj whisky. Produkowana jest w całości ze słodu jęczmiennego. Lotne związki fenolowe, m.in. krezol i gwajakol, które tworzą się w palonym jęczmieniu, odpowiadają za jej specyficzny smak. Whisky pochodząca z północnej części USA jest wytwarzana z mieszanki kukurydzy, żyta, pszenicy, jęczmienia i innych zbóż. Jest starzona w dębowych beczkach przez co najmniej dwa lata. Właściwie jedyną różnicą między zbożową whisky a wódką jest to, że ta pierwsza musi dojrzewać przez trzy lata w dębowej beczce. Istnieją obecnie trzy rodzaje whisky: mieszana whisky (blended), whisky zbożowa (grain) i whisky słodowa (malt). Whisky mieszana (blended), produkowana przez zmieszanie whisky zbożowej i whisky słodowej, jest reprezentowana przez takie marki, jak Johnny Walker i Ballantine’s. Produkowana jest również whisky zbożowa z jednego rodzaju ziarna. Słodowa whisky wytwarzana ze słodu jęczmiennego dojrzewa w dębowych beczkach zwykle przez ponad 8 lat.

8.6.2. Rum

To destylowany alkohol wytwarzany z trzciny cukrowej wyprodukowany po raz pierwszy na Karaibach. Obecnie jest produkowany w wielu krajach (Hiszpanii, Francji, Anglii, Holandii), ma wyjątkowy smak i aromat. Jest stosowany w koktajlach przyrządzanych według wielu różnych przepisów z rumem w składzie. Produkcja rumu zajmuje czwartą pozycję w rankingu wyrobów spirytusowych produkowanych komercyjnie.

Mimo że trzcina cukrowa jest uprawiana od ponad 2000 lat i ma azjatyckie pochodzenie, rum jest pierwszym alkoholem produkowanym z trzciny cukrowej o znaczeniu historycznym. Pierwsze uprawy trzciny cukrowej na Karaibach na wyspie Hispaniola (Republika Dominikańska) pochodziły z sadzonek przywiezionych tam przez Krzysztofa Kolumba. Najstarszy raport, w którym opisano produkcję cukru, melasy i jakiegoś rodzaju alkoholu z soku z trzciny cukrowej w regionie Pernambuco i Bahia w Brazylii, należy do Portugalczyków. Rum zyskał sławę dzięki piratom, którzy pijali ten alkohol w XVII i XVIII w. Rum był nie tylko przez nich spożywany, ale także używany jako waluta handlowa, którą wymieniano w tamtych czasach na towary, takie jak bawełna, tytoń, proch strzelniczy, pistolety, a nawet na niewolników. Rum (rhum – po francusku lub ron – po hiszpańsku), jak każdy alkohol, jest wytwarzany z fermentującego cukru pochodzącego z trzciny cukrowej o maksymalnej zawartości alkoholu 96% obj. Może być w całości wyprodukowany z melasy, syropu z trzciny cukrowej lub soku z trzciny cukrowej. Melasa jest produktem ubocznym rafinacji cukru. Rozpuszczona w wodzie może być sfermentowana, a następnie oddestylowana. Rum znany jako „Agricole” jest produkowany z soku z trzciny cukrowej i odpowiada tylko 3% światowej produkcji, podczas gdy rum produkowany z melasy stanowi 97%. Rum produkowany z soku z trzciny cukrowej jest ziemisty, trawiasty, czasem o mineralnym posmaku, podczas gdy z melasy można uzyskać pewne nuty kwiatowe i korzenne ze śladami słodyczy. Butelkowany rum powinien mieć co najmniej 35,4% obj. alkoholu. Rum może zawierać trochę przypraw i nieco karmelu. Ogólnie rum wyprodukowany z melasy lub soku z trzciny cukrowej w procesie fermentacji, a następnie oddestylowany, jest akceptowany jako napój o zawartości alkoholu co najmniej 35,4% w temp. 20°C. Może leżakować w drewnianych beczkach lub w zbiornikach z dodatkiem wiórów drewnianych. Dopuszcza się dodawanie cukru do najwyżej 6 g/l. Akceptowalne jest użycie karmelu do barwienia, a węgla aktywnego do korekty koloru. Kongenerów (produktów ubocznych fermentacji) nie może być mniej niż 40 mg/l lub ponad 500 mg/l bezwodnego alkoholu.

Moszczem użytym do fermentacji może być rozpuszczona w wodzie melasa, świeży sok ekstrahowany z trzciny cukrowej lub ich mieszanina. Większość rumów jest produkowana z melasy, produktu ubocznego przemysłu cukrowniczego, który jest bardzo lepki i ma ciemne zabarwienie. Niektóre wyjątki, takie jak rum Agricole, powstają wyłącznie z soku trzciny cukrowej (Francja). Słodki moszcz ma średnie stężenie cukru 17−24°Brix i pH w zakresie 4,8–5,0 i może zawierać pewne składniki odżywcze, takie jak sole. Musi być pasteryzowany przed zaszczepieniem w celu uzyskania lepszej stabilności mikrobiologicznej – ograniczenia wzrostu bakterii, które mogłyby zaburzyć fermentację lub wytwarzać nieprzyjemne zapachy.

Melasa w swoim składzie zawiera 55% cukrów fermentujących, z czego około 35% stanowi sacharoza, a 20% – mieszanka glukozy i fruktozy. Jednym z pierwszych procesów podczas rafinacji cukru jest maceracja trzciny cukrowej w celu uzyskania słodkiego soku. Sok jest mętny, żółtawy i bardzo słodki – ma zawartość cukru 10–15%  (wag./obj.). Przechowywanie soku nie jest powszechnie stosowane, gdyż ma on niską stabilność mikrobiologiczną i może być szybko fermentowany przez obecne w trzcinie cukrowej bakterie i drożdże.

Fermentacja w produkcji rumu ma na celu uzyskanie wysokiej konwersji cukru do etanolu i kongenerów – produktów ubocznych nadających smak i zapach alkoholu, jak kwasy organiczne, aldehydy, estry i alkohole. Wszystkie związki powinny być w równowadze, aby uzyskać wysokiej jakości rum. Fermentacja na ogół trwa 20–26 godz. dla rumów lekkich, a dla rumów cięższych – 2–4 dni lub nawet 1–3 tygodni. Optymalny zakres temperatury dla większość szczepów drożdży wynosi 31−32°C. Pewne tropikalne szczepy drożdży wykazują wysoką wydajność alkoholu w temperaturach 34−36°C, a istnieją szczepy o wysokiej produkcji alkoholu nawet w temperaturach sięgających 40°C. Sfermentowany moszcz ma stężenie alkoholu 5–10% w zależności od szczepu drożdży, stężenia cukru, temperatury i czasu fermentacji. Ogólnie fermentację prowadzi się w hodowlach okresowych bez zasilania. Kiedy fermentacja się kończy, powszechną praktyką jest pozostawienie sfermentowanego soku na okres 6−12 godz. celem dekantacji ciał stałych i komórek drożdży przed destylacją. Destylację prowadzi się dwukrotnie, tak aby uzyskać pożądaną jakość i stężenie około 76% obj. etanolu.

Po destylacji spirytus jest poddawany leżakowaniu w drewnianych beczkach, na ogół dębowych, jak w przypadku produkcji whisky Bourbon lub Tennessee. W temperaturach tropikalnych dojrzewanie rumu zachodzi szybciej niż whisky w Szkocji lub Irlandii. Reakcje utleniania, kondensacji, estryfikacji i ekstrakcji związków aromatycznych (aldehydów, garbników i substancji związanych z ligniną) nadają postarzonemu rumowi charakter i kolor.

Rum można sklasyfikować według dwóch rodzajów fermentacji:

1. 1) rum lekki – moszcz o niskiej zawartości kongenerów (poniżej 200 mg/l) i wysokiej zawartości etanolu sfermentowany przy użyciu szczepów Saccharomyces cerevisiae.

2. 2) rum ciężki – moszcz zawiera duże ilości cukru, co powoduje wytwarzanie wysokiego stężenia różnych kongenerów (200–500 mg/l) i niższą zawartość etanolu. Większość fermentacji w produkcji rumu ciężkiego zachodzi z zastosowaniem szczepów Schizosaccharomyces pombe, czasami zdarzają się fermentacje spontaniczne lub indukowanie z zastosowaniem szczepionek bakteryjnych oprócz drożdży, dzięki czemu powstaje wiele kongenerów pożądanych dla charakteru rumu.

8.6.3. Winiaki

Winiaki (z francuskiego Cognac – nazwa miejscowości oraz gminy we Francji, a z angielskiego brandy) są produkowane w kilku regionach świata. Winiakami są: śliwowica, francuskie Cognac, Armagnac i Calvados, włoska Grappa i Vecchia Romagna, portugalski Aguardente, hiszpańskie Barco, Cardenal, Casajuana, Gran Deque de Alba. Globalnie winiak (z 1,2 mld litrów) jest piątą co do wielkości kategorią napojów alkoholowych (łącznie 20,0 mld litrów). Największą sprzedaż na świecie osiąga brandy pochodząca z Indii i Filipin. Według prawodawstwa unijnego winiak to destylat winny (napój alkoholowy) produkowany z alkoholu winnego, zawierający poniżej 94,8% obj., sprzedawany jako napój alkoholowy nieprzekraczający maksymalnie 50% alkoholu. Przed sprzedażą powinien leżakować przez co najmniej rok w dębowych pojemnikach o pojemności mniejszej niż 1000 l. Winiak powinien zawierać substancje lotne w ilościach równych lub przekraczających 1,25 g/l czystego alkoholu (125 gramów na hektolitr alkoholu 100% obj.) i maksymalną zawartość metanolu do 2,0 g/l czystego etanolu (200 gramów na hektolitr alkoholu 100% obj.). Alkohole winne powinny być produkowane wyłącznie w procesie destylacji poniżej 86% (obj./obj.) alkoholu. Aby wyprodukować litr winiaku, potrzeba około 4,5 l wina. Kondensacja zachodząca podczas destylacji powoduje znaczny wzrost stężenia związków aromatycznych, czyli odpowiada za intensywny i mocny smak winiaku. Do produkcji winiaku używa się winogron o neutralnym smaku. Smak winiaku pochodzi głównie ze związków, które powstają podczas fermentacji alkoholowej. Winogrona stosowane do miażdżenia i ekstrakcji moszczu winny być wolne od grzybów patogenicznych jak Botrytis cinerea, które mają negatywny wpływ na jakość win i produkowanych z nich winiaków, ponieważ zapachy pleśni można wykryć nawet po destylacji i leżakowaniu alkoholu. W tym celu podczas dojrzewania winogron dokonuje się pomiarów stężenia wybranego lotnego związku, takiego jak 1-okten-3-ol, produkowanego przez Botrytis cinerea. Moszcz produkuje się w taki sposób, aby wydobyć jak najmniejsze ilości związków fenolowych, zwłaszcza taniny. Czas między pozyskaniem moszczu a procesem fermentacji winien być jak najkrótszy, gdyż nie dodaje się ditlenku siarki, który chroni moszcz przed zepsuciem. Podczas produkcji moszczu nie stosuje się wysokiego ciśnienia, tak aby odzyskać jedynie 80% moszczu z winogron. W niektórych przypadkach, gdy stan higieniczny winogron jest niewystarczający, do moszczu można dodać ditlenek siarki w ilości 0,01 g/l w celu pozbycia się pewnych szczepów bakterii produkujących octan etylu i mleczan etylu. Wino do produkcji winiaku jest produkowane z moszczu w procesie fermentacji prowadzonej przez drożdże. Produkcja winiaku odbywa się w sposób tradycyjny, dlatego wprowadza się niewiele innowacji w procesie fermentacji, destylacji czy dojrzewania alkoholu. Fermentacja alkoholowa moszczu zachodzi głównie spontanicznie z udziałem autochtonicznych drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immobilizowane komórki drożdży wykorzystuje się również do produkcji wina bazowego, uzyskując wyższe wydajności procesu oraz niższe koszty produktu końcowego. Obecność bakterii kwasu mlekowego wpływa również na jakość wina i winiaku. Różne szczepy bakterii kwasu mlekowego były izolowane z moszczu winogronowego na różnych etapach produkcji wina w południowoafrykańskich winnicach. Obecność Lactobacillus spp. jest kojarzona ze spadkiem jakości wina bazowego i destylatu. Natomiast szczepy Oenococcus oeni mają korzystny wpływ na wino bazowe i smak destylatu. Okres między fermentacją a destylacją może trwać nawet do 5 miesięcy. W tym czasie zachodzi kilka reakcji chemicznych, które mają wpływ na zmianę kompozycji wina. Należy jednak zachować ostrożność, tak aby ten okres był jak najkrótszy. Destylację można także prowadzić natychmiast po zakończeniu fermentacji. Wyższe stężenie alkoholu i polioli nie mają wpływu na kompozycję wina, ale zawartości estrów jest istotna. Najbardziej interesujące właściwości aromatyczne mają takie związki, jak octan izoamylowy, heksylowy, octan fenyloetylu, kapronian etylu, kaprylan etylu, kaprynian etylu i laurynian etylu. Niepożądany jest wzrost octanu etylu, mleczanu etylu, bursztynianu dietylu, aldehydu octowego (etanalu) i kwasu octowego, które mają wpływ na zawartość wina bazowego. W pierwszej destylacji wina bazowego prawie cały etanol jest oddestylowany. W drugiej destylacji osobno zbiera się około 1% objętości całkowitej, która stanowi „głowę”, podczas gdy destylat, który zawiera mniej niż 86% (obj./obj.), około 70% (obj./obj.) etanolu, stanowi „serce”. To esencja winiaku. Wreszcie destylat, który się kończy, „ogon”, jest zbierany oddzielnie aż do prawie całego oddestylowania etanolu. Dojrzewanie i starzenie destylatów odbywa się w beczkach drewnianych, głównie dębowych. Ten proces może trwa od kilku miesięcy do kilku lat. Nowe destylaty są umieszczone w beczkach o maksymalnej pojemności 225–1000 l, podczas gdy bardziej starzejące się destylaty można przechowywać w beczkach o pojemności 5000 l. Podczas procesu starzenia winiak nabiera bardzo charakterystycznego smaku, który wyraźnie różni się od świeżego destylatu. Złożoność aromatu winiaku zwiększa się wskutek ekstrakcji niektórych związków (lotnych i nielotnych) z drewna do destylatu, takich jak np. taniny, polimeryczne związki fenolowe. Ważne właściwości sensoryczne mają też lotne związki ekstrahowane z drewna (laktony, związki furanowe, pochodne waniliny i pochodne fenolu). Nadają one zapachy, np. waniliowy, dymu, prażonych i suszonych owoców, które są pozytywnie kojarzone z ogólną jakością winiaku. Starzejące się destylaty można sklasyfikować według ich aromatu i smaku, dzięki zastosowaniu odpowiednich i niezawodnych systemów eksperckich.

Ponieważ winiak jest produktem destylacji wina, destylat nie zawiera związków organicznych i nieorganicznych. Brak nielotnych kwasów organicznych w destylacie wpływa na równowagę smaku. Wysoka zawartość alkoholu w brandy, około 40% obj., „pali” usta. Winiaki, które zazwyczaj dojrzewają w dębowych beczkach przez kilka lat, mają bardzo złożony aromat. W brandy z winogron zidentyfikowano setki lotnych związków. Niektóre z nich są już obecne w winogronach (aromaty pierwotne) i winie (aromaty fermentacyjne), a niektóre powstają podczas destylacji (wskutek ogrzewania) lub są wydobywane z drewna dębowego. Wśród nich aldehyd octowy, octan etylu, metanol, 1-propanol, izobutanol i alkohol izoamylowy, które są obecne w destylatach w stosunkowo dużych ilościach, zwykle między 50 a 2000 mg/l. Niektóre inne ważne związki aromatyczne wytwarzane podczas dojrzewania winogron (monoterpeny) i podczas fermentacji alkoholowej (wyższe alkohole i kwasy monokarboksylowe) zwykle występują w stężeniach 0–50 mg/l.

Koniak (z francuskiego Cognac – nazwa miejscowości oraz gminy we Francji, po angielsku ‘brandy’) to napój alkoholowy typu winiak, zawierający około 40–45% alkoholu, produkowany w okolicach miejscowości Cognac w departamencie Charente we Francji. Na terenie Unii Europejskiej nazwa „koniak”, a ściślej „cognac” jest zastrzeżona wyłącznie dla produktów pochodzących z tego terenu. Do produkcji koniaku w tej okolicy używa się tylko trzech określonych odmian białych winogron, zbieranych w październiku. Następnie owoce są poddawane zgnieceniu w młynkach lub prasach w celu uzyskania moszczu, który jest przelewany do fermentorów. Po fermentacji trwającej zwykle tydzień powstałe wino poddaje się dwukrotnej destylacji i uzyskuje się zawartość 70% alkoholu. Z ośmiu litrów wina uzyskuje się litr koniaku. Kolejnym etapem jest dojrzewanie w beczkach produkowanych z odpowiednich gatunków dębu stuletniego, zdrowego i prostego. Powszechne są marki koniaków: Brillet, Camus, Courvoisier, De Luze, Gaston de Casteljac, Hennessy, Martell, Napoleon, Remy Martin.

8.6.4. Pisco

Pisco to napój alkoholowy produkowany na określonych obszarach Peru i Chile metodą destylacji wina z moszczu winogronowego. Pisco peruwiańskie powstaje z różnych odmian winogron Breaks, Muscatel, Black Current, Uvina, Torontel, Mushy, Italia i Albilla, Pedro Jimenez. Pisco chilijskie jest produkowane w dwóch odmianach: White Pisco, które nigdy nie leżakuje w beczkach, oraz Aged Pisco leżakujące przez 540 dni w beczkach wykonanych z twardego drewna. W tym czasie do alkoholu przechodzą związki wyekstrahowane z powierzchni beczek i mieszają się z aromatami destylatu, w wyniku czego powstaje harmonijna mieszanka o słodkim i waniliowym charakterze. W Peru jest znanych kilka rodzajów Pisco:

1. 1) niearomatyczne Pure Pisco, wytworzone z jednej odmiany winorośli;

2. 2) aromatyczne Pure Pisco, otrzymane z jednej odmiany aromatycznych winogron;

3. 3) Acholado Pisco, wyprodukowane z mieszanki różnych odmian winogron;

4. 4) greek Must Pisco, powstałe w wyniku niekompletnej fermentacji soku winogronowego.

Istnieją różnice w procesach produkcyjnych i jakości napojów pisco wytwarzanych w Chile i Peru. W Peru produkcja jest realizowana w następujących etapach: zbiór, rozdrabnianie, prasowanie, maceracja, fermentacja, destylacja, leżakowanie i butelkowanie. W marcu produkcja zaczyna się od ręcznego zbioru winogron. Winogrona są następnie rozdrabniane, prasowane oraz poddawane maceracji, aby uwolnić sok winogronowy. Celem maceracji jest ekstrakcja aromatu, a czas maceracji różni się w zależności od odmiany winogron. Po maceracji, moszcz jest oddzielony od wytłoków. Po dekantacji moszcz uwalnia się od substancji stałych. W procesie fermentacji moszcz staje się winem. Po usunięciu biomasy mikroorganizmów poddaje się je destylacji głównie w alembiku z podgrzewaczem, których wszystkie elementy składają się z miedzi lub cyny. Destylacja jest przeprowadzana w sposób umożliwiający odzyskanie związków aromatycznych. Pierwsza frakcja nazywana „head” (głowa) ma wysoką zawartość alkoholu i niepożądane lotne związki. Ostatnia frakcja zwana „tail” (ogon) zawiera również niepożądane związki, które muszą zostać odpędzone. Z czystej frakcji środkowej zwanej „body” (ciało) powstaje Pisco, po okresie leżakowania. Wywar gorzelniczy powinien być zutylizowany lub oczyszczony przed jego odprowadzeniem do wód powierzchniowych. Zgodnie z informacjami rzemieślniczego producenta Pisco, możliwe jest uzyskanie 0,25 ± 0,05% frakcji „head”, 19 ± 1% frakcji „body”, 5 ± 1% frakcji „tail” i 76 ± 2% wywaru przy użyciu 50-litrowego destylatora. W Chile Pisco jest produkowane przez odparowanie wina w reboilerze (destylacja) i kondensację oparów, które częściowo wracają, reszta składa się z szeregu frakcji destylatu. Frakcje destylatu są mieszane ze sobą w różnych proporcjach. Pisco może również dojrzewać w dębowych beczkach lub leżakować z dodanymi wiórami dębowymi i karmelem. Komercyjny produkt składa się zasadniczo z etanolu (30–50% obj.), wody i związków aromatycznych zawierających charakterystyczne terpeny.

Pisco ma owocowy smak i kwiatowy aromat, głównie ze względu na obecność terpenów, estrów i aldehydów, pochodzących m.in. z odmian winogron stosowanych do produkcji wina, a także powstających podczas fermentacji i destylacji. Zawartość alkoholu i substancji lotnych w składzie Pisco mogą być różne. W komercyjnym Pisco chromatograficznie stwierdzono obecność ponad 50 związków aromatycznych. Środkami zapachowymi w Pisco są terpeny, takie jak linalol, cis-3-heksen-1-ol i nerol oraz estry, takie jak oktanian etylu, etyloheksanian i octan izoamylu. Jak powszechnie wiadomo winogrona muszkatołowe zawierają wysokie stężenia terpenów, które różnią się w zależności od odmiany i mogą również zależeć od ekspozycji na słońce i warunków zbiorów winogron. W procesie fermentacji wytwarzane są alkohole, estry i kwasy, a ich zawartość zależy od początkowej zawartości cukru i czasu fermentacji. Na przykład w przypadku zielonego Pisco produkowanego w Peru, fermentacja wina zostaje zatrzymana, gdy poziom cukru w płynie fermentacyjnym wynosi około 25 g/l. W destylacie wysokie stężenie estrów znaleziono we frakcji „head”, podczas gdy pierwsza część frakcji „heart” (serca) jest bogata w alkohole i terpeny, a kwasy, alkohole i aldehydy dominują w drugiej części frakcji „heart”. Furfural jest wytwarzany w procesie destylacji w czasie rozkładu termicznego ksylozy obecnej w płynie fermentacyjnym.

Pisco pochodzące z Chile może zawierać do 3,5 g/l zanieczyszczeń, 1,5 g/l kwasów lotnych oraz stężenie cukru co najwyżej 5 g/l. W zależności od ilości alkoholu wyróżnia się cztery typy Pisco: Great (43°GL), Reserved (40°GL), Special (35°GL) i Traditional (30°GL).

8.6.5. Cachaça

Cachaça (wym. ka’szasa) to typowe i ekskluzywne określenie spirytusu trzcinowego produkowanego w Brazylii o zawartości alkoholu 38–48% obj., uzyskanego z destylacji sfermentowanego soku z trzciny cukrowej. Brazylijskie alkohole z trzciny cukrowej są bardzo cenione za swój charakterystyczny aromat i smak, który można jeszcze poprawić przez leżakowanie w beczkach dębowych.

Historia Cachaça przeplata się z historią Brazylii. Był to pierwszy destylowany alkohol w Ameryce Łacińskiej, odkryty w latach 1534–1549, produkowany z resztek trzciny cukrowej pozostałej w procesie produkcji cukru w młynach w Sao Vicente, Sao Paulo. Obecnie w Brazylii produkuje się około 1,7 mld litrów Cachaça, około 75% jest wytwarzane przez przemysł, a 25% przez rzemieślników. Rzemieślnicze Cachaça są produkowane w małych gorzelniach, które są zwykle rodzinnymi przedsiębiorstwami. Cachaça jest czwartym produkowanym ilościowo napojem wśród lokalnych kategorii alkoholi świata, za baijiu, wódką i soju. Trzcina cukrowa (Saccharum spp.) to wieloletnia trawa o cylindrycznej łodydze osiągającej ok. 3 m wysokości i składającej się się z 75% wody i 25% materii organicznej (cukry stanowią 12−18 g/100 g łodygi). Z łodygi przesyconej sacharozą ekstrahuje się sok do produkcji cukru. Proces produkcji Cachaça rozpoczyna się od zmielenia trzciny cukrowej i oddzielenia soku od wytłoków. Następnie sok przesiewa się i dekantuje w celu usunięcia drobnych ciał stałych i, jeśli jest to konieczne, rozcieńcza w celu dostosowania zawartości rozpuszczalnych substancji stałych (14−16 Brix). Na tym etapie sok z trzciny cukrowej, nazywany moszczem, zostaje poddany fermentacji przy udziale drożdży. Fermentacja jest punktem krytycznym w procesie produkcji Cachaça. W tym czasie powstają związki aromatyczne charakterystyczne dla tego napoju. Fermentacja rozpoczyna się od wprowadzenia inoculum do podłoża. Proces początkowo charakteryzuje się fazą propagacji komórek drożdży w obecności tlenu (namnażanie biomasy), a następnie, po zaniechaniu napowietrzania, zachodzi proces fermentacji alkoholowej. W tej fazie inkubacja odbywa się w optymalnych warunkach wzrostu. W trakcie procesu fermentacji prowadzonej w hodowli okresowej (stacjonarnej) bez zasilania, z wyjątkiem tlenu niezbędnego w początkowej fazie do tworzenia biomasy drożdży. Uważa się, że wzrost biomasy drożdży jest dobry w zakresie pH między 5,0 a 6,0, a dla produkcji etanolu optymalne pH wynosi 4,5. Sok z trzciny cukrowej ma pH 5,5. Przy tym jest utrzymywana optymalna temperatura 28–32°C. W systemie półciągłym fermentacji dodawanie składników odżywczych lub substratu postępuje stopniowo w małych stężeniach. Produkcja alkoholi na dużą skalę odbywa się w hodowlach z ciągłym przepływem. Fermentacja trwa około 24 godz. Cachaça może być produkowana z rodzimych drożdży (drożdży domowych), to znaczy używa się drożdży naturalnie obecnych w środowisku. Rzemieślnicy przygotowują inoculum z pasty składającej się z otrębów ryżowych, mąki kukurydzianej, krakersów, soku z cytryny lub kwaśnej pomarańczy. Rozcieńczony sok z trzciny cukrowej dodaje się w odstępach 24-godzinnych. Proces powtarza się aż do chwili, gdy inoculum odpowiada 20% objętości moszczu poddawanego fermentacji w bioreaktorze. Chociaż jest to powszechna praktyka, istnieje możliwość zanieczyszczeń przez mikroorganizmy, a czas wymagany do osiągnięcia pożądanej objętości i gęstości komórek w inoculum jest stosunkowo długi. Zastosowanie wybranych szczepów drożdży pozwala uniknąć wahań jakości napoju i przyczynia się do szybszego uruchamiania procesu fermentacji w skali przemysłowej. W porównaniu z fermentacją spontaniczną istnieje mniejsze ryzyko zanieczyszczenia, fermentacja jest szybka i jednolita, konkurencja dla niezbędnych składników odżywczych jest mniejsza, plon jest wyższy, a poziom cukrów w roztworze fermentacyjnym – niższy. Generalnie, szczepy Saccharomyces cerevisiae są izolowane i pozyskiwane z procesów fermentacyjnych. Jeśli chodzi o wytwarzanie alkoholu drożdżowego, mogą być stosowane różne szczepy Saccharomyces cerevisiae znalezione w bioreaktorze w procesie fermentacji i produkcji Cachaça. Drożdże te charakteryzują się wysoką wydajnością alkoholu i tolerancją na wysokie stężenia etanolu. Ponadto selekcjonowane szczepy drożdży mogą prowadzić szybko fermentację cukru z soku z trzciny cukrowej, mieć niskie zapotrzebowanie na witaminy, kwasy tłuszczowe i tlen, być względnie oporne na niskie pH, zdolne do flokulacji, tolerancyjne na wysokie ciśnienie osmotyczne, zdolne do produkcji składników aromatycznych (kwasy organiczne, estry) oraz niezdolne do produkcji kwasu octowego. Przygotowanie inoculum z wybranymi drożdżami rozpoczyna się od namnażania komórek z czystej hodowli laboratoryjnej. Początkowo szczep jest wstępnie zaszczepiony w małych objętościach na soku z trzciny cukrowej 5°Brix, wzbogacony i sterylny. Objętość inoculum zwiększa się do 400 ml przy 7°Brix, aż osiągnie 10% objętości bioreaktora. Te etapy powinny być dobrze kontrolowane, aby inoculum było aseptyczne.

Mikrobiom tradycyjnej fermentacji trzciny cukrowej jest bardzo złożony. W procesie fermentacji Cachaça w płynie fermentacyjnym można znaleźć różne drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Pichia heimii, Pichia subpelliculosa, Debaryomyces hansenii i Hanseniaspora uvarum oraz bakterie kwasu mlekowego i octowego oraz kilka gatunków bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae, oraz z dominacją Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum i Lactobacillus fermentum. Lactococcus lactis często występuje w fermentacjach trzciny cukrowej jako zanieczyszczenie podczas fermentacji alkoholowej Cachaça i innych. Ta złożona mieszanka drożdży i gatunków bakterii wytwarza metabolity i lotne związki, dzięki którym rzemieślniczo produkowana Cachaça ma swoisty smak i zapach. W tym etapie powstają oprócz etanolu takie produkty uboczne, jak ditlenek węgla, glicerol, aldehydy, estry i kwasy organiczne jako materiały do produkcji biomasy i produkty do przeżycia i adaptacji drożdży do środowiska. Bukiet zapachowo-smakowy zawiera ponad 250 związków określanych jako kongenery. Fermentacja kończy się, gdy ilość ditlenku węgla jest znacznie zmniejszona, a komórki drożdży sedymentują na dnie bioreaktora.

Zbadano wpływ drożdży innych niż Saccharomyces na końcową jakość napojów alkoholowych. Kluyveromyces marxianus i Saccharomyces cerevisiae porównywano w procesie fermentacji agawy do produkcji tequili. Lepszą jakość organoleptyczną tequili zaobserwowano, gdy jako szczep biokatalizator zastosowano Kluyveromyces marxianus. Dekkera bruxellensis może łatwo wytwarzać związki aromatyczne, dostosowuje się do warunków fermentacji, zatem jest to szczep drożdży o potencjale przemysłowym do produkcji Cachaça. Jego zdolność do produkcji alkoholi fuzlowych objawia się w obecności aminokwasów aromatycznych. Zbadano także wpływ gatunków Saccharomyces cerevisiae i innych niż Saccharomyces na jakość napoju. Stwierdzono, że Lactococcus lactis i Saccharomyces cerevisiae w kokulturze podczas fermentacji trzciny cukrowej przy produkcji Cachaça doprowadziły do wzrostu kwasowości napoju. Zastosowanie bakterii nie wpłynęło na aktywność drożdży, a poprawiło aromat Cachaça.

Sfermentowany moszcz lub wino są następnie destylowane i dzielone na trzy frakcje: ogon, głowę i serce. Wszystkie substancje będące przedmiotem zainteresowania powstałe podczas procesu fermentacji muszą zostać odzyskane, z tego powodu destylacja jest uważana za niezwykle ważną dla uzyskania Cachaça najwyższej jakości. Napój otrzymany przez destylację typu pot stills ma lepszy skład chemiczny i wyższą zawartość kongenerów niż pochodzący z destylacji ciągłej. Cachaça była tradycyjnie destylowana w miedzianych kadziach, co zapewniało jej lepszą jakość, niż stosowanie innych rodzajów materiałów, takich jak stal nierdzewna. Miedź ma zdolność katalizowania pewnych reakcji chemicznych w procesie destylacji, które wiążą lotne składniki, przyczyniając się do eliminacji nieprzyjemnych zapachów podczas destylacji. Wino destylowane w aparatach ze stali nierdzewnej może zawierać wyższe stężenia związków siarki z płynu fermentacyjnego. Wino zawierające od 7–12% obj. etanolu poddaje się ogrzewaniu w temp. 92,6–95,9°C. Rozdział frakcji następuje na podstawie temperatury wrzenia. Pierwsza frakcja jest pozyskiwana w temperaturze wrzenia wyższej niż etanolu, metanolu, aldehydów (aldehydu octowego) i estrów (metylu i octanu etylu). Ta frakcja, zwana głową, zawiera alkohol poniżej 60 GL i odpowiada 1−5% początkowej objętości wina. Ułamek produktu końcowego stanowi frakcja uzyskana w pośredniej temperaturze wrzenia. Frakcja serca ma 60−40 GL i 80% objętości wina. Ogon jest frakcją mającą zawartość alkoholu 38−14 GL i stanowi około 15% objętość wina. Frakcje głowy i ogona muszą być rozdzielone, ponieważ zawierają związki, które obniżają jakość napoju. Frakcja serce Cachaça jest później przechowywana lub poddana leżakowaniu w beczkach drewnianych. W celu zmniejszenia zawartości karbaminianu etylu w 1991 r. w Brazylii wprowadzono dwukrotną destylację Cachaça i spirytusu wyprodukowanych na drodze fermentacji cukrów z trzciny cukrowej. Początkowo destylat otrzymany z wina jest zbierany bez oddzielenia frakcji. Destylat ten, nazywany flegmą, zawiera około 21% etanolu. W drugiej destylacji oddziela się trzy frakcje: głowę, serce (65% etanolu) i ogon.

Badano wpływ dziewięciu rodzajów brazylijskiego drewna na profil związków lotnych alkoholi w Cachaça dojrzewających w beczkach. Drewno do wyrobu beczek pozyskiwano z następujących drzew: Pterogyne nitens, Centrolobium tomentosum, Myrocarpus frondosus, Amburana cearensis, Apuleia leiocarpa, Tabebuia heptaphylla, Cariniana estrellensis, Cariniana legalis, Quercus sessilis i Platycyamus regnellii. Spośród tych rodzajów brazylijskich drzew, Cariniana legalis wykazała duży potencjał w zastosowaniu do starzenia Cachaça, dzięki zawartości kwasu waniliowego oraz waniliny w dojrzałym napoju.

W komercyjnie sprzedawanych Cachaça są określone limity związków organicznych oraz zanieczyszczeń. Oznacza się cukry całkowite, kwasowość lotną jako kwas octowy, wyższe alkohole (wyrażone jako suma alkoholu n-propylowego, izobutylowego i izoamylowego), furfural, hydroksymetylofurfural, aldehydy i całkowite estry jako octan etylu. Współczynnik kongenerów (2000−6000 mg/l alkoholu) obejmuje sumę lotnej kwasowości, estrów, aldehydów, furfuralu, hydroksymetylofurfuralu i wyższych alkoholi. Normy wymagają również kontroli obecności zanieczyszczeń, takich jak karbaminian etylu, akroleina, alkohol sec-butylowy, alkohol n-butylowy, ołów, arsen, miedź i metanol.

8.6.6. Tequila

Tequila jest produkowana zgodnie z meksykańską normą NOM-006-SCFI-2005 w pięciu stanach Meksyku w ilości 300 mln l rocznie z agawy, która rośnie na obszarze 11 194 600 ha. Tequila jest bez wątpienia „meksykańskim par excellence” napojem destylowanym. Z regionalnej poufnej produkcji od lat 80. stała się znanym napojem alkoholowym, który jest eksportowany na cały świat. Należy do dużej rodziny „mezcal”, ogólnego określenia napojów destylowanych uzyskanych z różnych gatunków agawy o lekko słomkowym kolorze. Tequila dzieli się na dwie główne kategorie: do pierwszej kategorii należy tequila produkowana w 100% z agawy, a do drugiej – z dodatkiem innych cukrów (do 49% masy cukru całkowitego), np. trzciny cukrowej, melasy z trzciny cukrowej lub syropu kukurydzianego. W każdej kategorii znajduje się pięć różnych produktów (definicje z Rady Regulacyjnej Tequili):

1. 1) Silver/White Tequila, uzyskiwana bezpośrednio z destylowanego produktu, rozcieńczonego wodą;

2. 2) Young/Gold Tequila, produkt zmiękczony przez „abocado”, proces dodawania jednego lub więcej składników takich jak karmel, naturalny ekstrakt dębowy, gliceryna i syrop cukrowy;

3. 3) Aged Tequila, produkt uszlachetniany przez co najmniej 2-miesięczne leżakowanie w beczkach z dębu lub dębu białego;

4. 4) Extra-Age Tequila, produkt uszlachetniany przez co najmniej jeden rok przez leżakowanie w 600-litrowych beczkach z francuskiego dębu lub dębu białego;

5. 5) Ultra-Aged Tequila, produkt uszlachetniany przez leżakowanie trwające co najmniej trzy lata w beczkach o pojemności powyżej 600 litrów z dębu francuskiego lub dębu białego.

Tabela 8.2. Fizykochemiczne właściwości różnych typów tequili (wg NOM-006-SCFI-2005)

Właściwości tequili

Silver/White

Young/Gold

Aged

Extra-Aged

Ultra-Aged

zawartość alkoholu (% obj.)

35–55

35–55

35–55

35–55

35–55

sucha masa (g/l)

0–0,3

0–5

0–5

0–5

0–5

zawartość w mg/100 ml bezwodnego etanolu

alkohole wyższe

20–500

50–500

20–500

20–500

20–500

metanol

30–300

30–300

30–300

30–300

30–300

aldehydy (jako acetoaldehyd)

0–40

0–40

0–40

0–40

0–40

estry (jak etylooctan)

2–200

2–200

2–200

2–200

2–200

Furfural

0–4

0–4

0–4

0–4

0–4

Głównym surowcem do produkcji tequili są liście Agave tequilana Weber var. azul. Zdaniem naukowców w Meksyku rośnie prawie 135 endemicznych gatunków należących do rodzaju Agave. Rosną one prawie na całym terytorium Meksyku. Są sukulentami o strukturze rozety mającej lancetowate liście, zwykle zakończone cierniem. Są bardzo dobrze przystosowane do siedlisk, szczególnie suchych, w których niektóre gatunki agawy wykazują wysoką produkcję biomasy w cyklu życia 5–6 lat. Są w stanie gromadzić dużą ilość rozpuszczalnych węglowodanów niestrukturalnych, będących silnie rozgałęzionymi fruktanami, często nazywanymi agawiną. W szczególnych przypadkach produkcja tequili jest oparta na jednym gatunku agawy hodowlanej – Agave tequilana Weber var. azul – uprawianej na określonym terytorium. Dzikie Agave tequilana Weber nie istnieją. Zbiór biomasy liści odbywa się zanim agawa wchodzi w fazę kwitnienia. Główną cechą tego gatunku jest wysokie stężenie (27%) cukrów redukujących w liściach, są to głównie rozgałęzione fruktany i neofruktany, których struktury zmieniają się w zależności od wieku rośliny. Cukry agawy są powszechnie określane w przemysłowej produkcji tequila jako „inulina” (niepoprawny termin).

Przed fermentacją liście agawy muszą przejść dwa ważne procesy: najpierw odbywa się gotowanie liści, którego głównym celem jest hydroliza fruktanów do cukrów prostych – fruktozy i glukozy – w przybliżonym stosunku 90/10. Podczas gotowania wytwarzają się też związki ważne z punktu widzenia smaku końcowego destylatu. Związki te powstają w wyniku karmelizacji i reakcji Maillarda. W szczególności niektóre furany przechodzą w furfural, metylo-2-furoinian, 5-metylofurfural, 5-hydroksymetylofurfural i 2-metylotetrahydrofuran, 2-acetylofuran – związki aromatyczne, które ostatecznie nadają smak i zapach tequili. Na tym etapie większość metanolu powstaje z metylowanych pektyn. Gotowane agawy miele się, aby wyekstrahować sok z agawy z włóknami lub bez włókien. Nowoczesne urządzenia do mielenia są podobne do używanych do trzciny cukrowej. Są to dyfuzory, które przeprowadzają ekstrakcję fruktanów z agawy, a następnie hydrolizę tych cukrów. Ekstrakcję i hydrolizę można prowadzić w sposób ciągły, stosując handlową inulinazę, dzięki której eliminuje się hydrolizę z zastosowaniem kwasów mineralnych. Fermentacja, podobnie jak we wszystkich napojach alkoholowych, jest kluczowym etapem produkcji tequili. Podczas tego etapu cukry agawy (głównie fruktoza) są metabolizowane do etanolu, ditlenku węgla i innych aktywnych związków smakowych przez różne mikroorganizmy, zwłaszcza drożdże. Brzeczka, poza cukrami, może zawierać dodatkowo źródło azotu mineralnego: siarczan amonu, fosforan amonu, siarczan magnezu, a także inne składniki odżywcze. Naturalne pH soku ~4,5, więc nie ma potrzeby regulacji. Fermentacja w brzeczce może być prowadzona spontanicznie (w ogromnej większości gorzelni) lub po zaszczepieniu odpowiednim szczepem drożdży – głównie w dużych firmach przemysłowych. We wczesnej fazie fermentacji spontanicznej w procesie tym biorą udział liczne gatunki drożdży: Candida intermedia, Candida krusei, Brettanomyces anomalus, Kluyveromyces marxianus, Pichia membranifaciens, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora spp., Candida spp., Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala, Saccharomycodes ludwigii, Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri, Brettanomyces bruxellensis i Zygosaccharomyces rouxii. W kolejnej fazie maleje udział drożdży innych niż Saccharomyces, a pod koniec fermentacji największy udział ma Saccharomyces cerevisiae. W końcowej fazie fermentacji (ponad 5 dni procesu) występuje głownie Saccharomyces cerevisiae i w mniejszości cztery gatunki Pichia membranifaciens, Candida milleri, Zygosaccharomyces bailii i Brettanomyces bruxellensis. We wczesnej fazie fermentacji również obecne są bakterie kwasu mlekowego, takie jak Leuconostoc spp. i Lactobacillus spp. oraz bakterie octowe, w szczególności Acetobacter aceti. W spontanicznych fermentacjach agawy mikroorganizmy mogą wyprodukować etanol w niskim stężeniu (około 6%). Gorzelnie przemysłowe jako inoculum stosują różne szczepy Saccharomyces cerevisiae jako drożdże winne, z produkcji bioetanolu lub zwykłe do pieczenia chleba. Ostatnio jako inoculum stosuje się szczepy drożdży izolowane z agawy lub pozyskane z próbek pobranych w czasie fermentacji. Większość gorzelników używa zbiorników fermentacyjnych ze stali nierdzewnej o objętości 2000−120 000 l. Niektóre firmy nadal używają rustykalnych drewnianych zbiorników o pojemności od 2000−10 000 l, zwłaszcza do fermentacji w obecności włókien agawy. Typowa fermentacja soku z agawy zaszczepiona inoculum zachodzi szybko i trwa od 20 godz. do 3 dni, w pewnych przypadkach. Na końcu fermentacji liczebności drożdży wahają się od 100 tys. do 200 mln komórek/ml. Jeśli nie zostanie dodane inoculum lub fermentacja soku agawy zachodzi w obecności włókien, proces może trwać dłużej niż 7 dni. Temperatura osiągana podczas fermentacji jest stosunkowo wysoka, waha się w przedziale 30–35°C, a czasami wzrasta do 40°C. Pod koniec fermentacji zawartość alkoholu wynosi 4–9% obj., w zależności od początkowego stężenia cukru. Szybkość fermentacji zależy od różnych czynników, takich jak rodzaj fermentacji (z włóknami lub bez włókien), zastosowany szczep drożdży, skład podłoża i warunki pracy. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność transformacji cukrów do etanolu w fermentacji wynosi około 75%, jest stosunkowo niska i pokazuje, że nadal istnieje możliwość poprawy fermentacji w niektórych gorzelniach. Prace koncentrują się głównie na wykorzystaniu drożdży innych niż Saccharomyces w kokulturze z Saccharomyces lub bez nich. Kluyveromyces marxianus i Pichia kluyveri są dwoma interesującymi szczepami do prowadzenia fermentacji tequili. Dwa szczepy są w stanie przeprowadzić fermentację alkoholową prawie jak Saccharomyces cerevisiae, które syntetyzują bardzo interesujący specyficzny profil smaku z wysokimi stężeniami estrów.

Destylacja jest ostatnim etapem otrzymywania White Tequila. Klasycznie tequila ta jest uzyskiwana po dwóch kolejnych destylacjach. Najpierw sfermentowana brzeczka jest destylowana w celu zwiększenia stężenia alkoholu do 20−30% obj. W pierwszej destylacji są zbierane w kolejności trzy frakcje: pierwsza lekka frakcja zwana „head” jest poddawana recyklingowi w procesie fermentacji; druga frakcja to produkt właściwy, poddawany redestylacji (frakcja zwana zwykłą) i wreszcie frakcja „tail”, która jest odrzucana. Następnie frakcja zwykła jest ponownie destylowana i z niej uzyskuje się trzy produkty: produkt „head”, który jest odrzucany, drugi „heart”, który jest prawie końcowym destylatem i produkt drugiego „tail”. Zawartość etanolu we frakcji „heart” wynosi około 55−60% obj. Jest ona filtrowana, rozcieńczana lub poddawana leżakowaniu w celu uzyskania produktów końcowych w procesie starzenia. Leżakowanie destylatu tequila w pojemnikach dębowych (Quercus alba) lub w pojemnikach z dębu Holm (Quercus ilex) ma na celu uzyskanie specyficznych cech smakowych produktu związanych ze wzrostem stężenia wyższych alkoholi i metanolu, zachowanie estrów jest bardziej złożone. Według czasu dojrzewania produkty tequili można podzielić na trzy grupy: Tequila Silver – bez leżakowania, Tequila Ripening (2−8 tygodni leżakowania), Tequila Aged (10−34 tygodni). Właściwości sensoryczne i organoleptyczne tequili wynikają z zawartości w niej związków powstających w czasie całego procesu lub pochodzą bezpośrednio z agawy. W komercyjnej tequili zidentyfikowano łącznie 327 związków zebranych w różne grupy. Komercyjna tequila zawiera 8 różnych acetali, 24 kwasy organiczne, 44 alkohole, 27 aldehydów, 51 ketonów, 64 estrów, 23 fenole, 10 furanów, 22 węglowodory, 9 związków siarki, 25 terpenów oraz 17 innych związków. Ponadto tequili nadaje się pewne specyficzne deskryptory smaku, jak: wędzonka, migdał, anyż, lakier, kawa, karmel, cytrus, zjełczały kokos, smak sfermentowany, kwiatowy, owocowy, suszone owoce, drewno żywiczne, mokra słoma, wanilia, pikantny ocet.

8.7.Wódki

Hydrolizat ziemniaczany (z enzymami amylolitycznymi) zawierający glukozę służy do produkcji Aquavita i wódki przy użyciu szczepów Saccharomyces cerevisiae, a hydrolizat ryżu (z enzymami Koji), także zawierający glukozę, służy do produkcji wódek Sochu, Arak i Awamori.

8.8.Inne alkohole

Moszcz winogronowy, soki owocowe, miód zawierający glukozę i fruktozę służą do produkcji wiśniówki, śliwowicy, perry, cydru, miodu pitnego. Do fermentacji stosuje się Saccharomyces cerevisiae.

8.9.Związki chemiczne w alkoholach

W wyrobach alkoholowych typu whisky, winiak i rum jest obecna szeroka gama związków organicznych, pochodzących głównie z substratu, aktywności drożdży w procesie fermentacji oraz leżakowania w beczkach dębowych, z drewna których są ekstrahowane różne związki chemiczne, od cukrów do składników lignin i pektyn. Są to:

1. 1. Związki karbonylowe. Aldehyd octowy jest głównym składnikiem karbonylowym i ogólnie stanowi ponad 90% całkowitej zawartości aldehydów (tab. 8.3). Jest łatwo destylowany razem z wodą i alkoholem, stąd jego obecność w alkoholach. W okresie długiego leżakowania zmniejsza się zawartość wolnego aldehydu octowego, a tworzą się acetale. W brandy znajdują się aldehydy alifatyczne – od aldehydu mrówkowego (C1) do dodekanalowego (C12). W whisky i koniaku znajdują się także aldehyd propionowy, 2-metylomasłowy, izomasłowy, izowalerianowy, n-heptanal, oktanal, n-nonanal.

Liczne nienasycone aldehydy znajdują się w koniakach: 2-buten-1-al, 2-hexen-1-al, 2-methylo-2-propen-l-al, (Z)-2-methyl-2-buten-1-al, 3-methyl-2-buten-l-al, (E)-2-penten-1-al, (E)-2-methyl-2-penten-1-al, (E)-izomery 2-C6, 2-C7, 2-C8, 2-C9-enal i (E,E)-hepta-2,4-dien-1-al, nona-2,4-dien-1-al i deca-2,4-dien-1-al, (E)-2-octen-l-al, (E)-2-nonen-l-al, (E,E)-2,4-decadien-l-al, β-cyklocitral, α-felandral i geranial.

Tabela 8.3. Całkowita zawartość aldehydów w mg/l etanolu jako ilość aldehydu octowego w napojach alkoholowych

Napój alkoholowy

Aldehyd octowy (mg/l etanolu)

amerykański bourbon whisky

40–120

kanadyjska whisky

20–70

irlandzka whisky

30–140

szkocka mieszana whisky

40–220

szkocka słodowa whisky

40–160

brandy

130–600

koniak

~210

rum

20–150

1. 2. Ketony. W alkoholach leżakowanych w beczkach wykryto dużą liczbę alifatycznych ketonów, od acetonu do tetradekanonu, większość to monoketony. W alkoholach typu whisky, a także w rumie i koniakach znajdują się ketony alifatyczne. Zawartość acetonu w alkoholach jest bardzo zróżnicowana i waha się w granicach 3–10 mg/l. Niektóre monoketony brandy i koniaków, jak 2-pentanon, 2-metylocyklopentanon, 2-heksanon, 2-heptanon i 2-nonanon, są obecne także w kolorowych alkoholach. Jamajski rum zawiera 2-butanon, 3-penten-2-on, 2-pentanon, 4-etoksy-2-butan i 4-etoksy-2-pentanon.

W alkoholach typu whisky, rum i koniak są obecne monoketony nienasycone. W japońskiej whisky zidentyfikowano trzy ketony nienasycone: tri-6-decen-2-on, penta-6-decen-2-on i hepta-6-decen-2-on. Nienasycone ketony 3-penten-2-on i (E)-6-nonen-2-on wykryto w rumie i koniaku. Zapach toffi pochodzący ze związku 2,3-butanedionu i 2,3-pentanodionu (diketony) można rozpoznać w bardzo niskich stężeniach w whisky, brandy i rumie.

Najprostszy aromatyczny aldehyd, benzaldehyd, można znaleźć w wielu destylowanych napojach. Wykryto go w dużych ilościach w brandy produkowanych z owoców pestkowych (wiśniowe brandy – 33−75 mg/l, brandy z moreli – 129 mg/l). Ilość aromatycznych aldehydów uwolnionych podczas dojrzewania whisky zależy od rodzaju beczki. Aldehydy o podwójnym wiązaniu w łańcuchu bocznym takie jak aldehyd koniferylowy i aldehyd sinapinowy, które są utleniane do waniliny, i aldehyd syringowy, a także aldehydy drzew iglastych, syringowy i sinapinowy, znaleziono w whisky i koniaku, a aldehyd salicylowy znaleziono tylko w whisky.

1. 3. Alkohole. Niektóre spirytusy, takie jak wódka, zawierają niewiele związków smakowych i składają się zasadniczo z etanolu i wody. Natomiast whisky, koniaki, brandy i rumy zawierają wiele różnych lotnych związków. Metanol nie jest produktem ubocznym fermentacji drożdży, ale pochodzi z pektyn obecnych w moszczu i sokach winogron i owoców. Ogólnie rzecz biorąc, zawartości metanolu w komercyjnych napojach alkoholowych są niewielkie, z wyjątkiem tych produkowanych z winogron i owoców pestkowych, jak wiśnie i śliwki. Stwierdzono, że brandy z moreli zawiera do 10,81 g/l, śliwowica do 8,85 g/l i brandy wiśniowe do 5,29 g metanolu na litr czystego alkoholu. W alkoholach typu szkocka whisky ilości metanolu są niskie (80−260 mg/l).

Wyższe alkohole i fuzle, jak 1-propanol, 2-metylopropanol, 2-metylobutanol, 3-metylobutanol i alkohol fenyloetylowy, powstają w reakcjach biochemicznych drożdży w procesie fermentacji aminokwasów i węglowodanów. Ilości wyższych alkoholi w różnych napojach znacznie się różnią. Zgłoszono, że szkocka whisky zawiera 1-propanol (70−255 mg/l), 2-metylo-1-propanol (170−410 mg/l), 2-metylo-1-butanol (74−124 mg/l) i 3-metylo-1-butanol (215−352 mg/l). Irlandzka, kanadyjska i japońska whisky nie różnią się znacznie od szkockiej whisky pod względem stężeń alkoholi fuzlowych, podczas gdy amerykańska whisky Bourbon może zawierać do 1390 mg/l 2-metylo-l-butanolu i do 1465 mg/l 3-metylo-l-butanolu. Brandy i koniaki zawierają nieco więcej alkoholi fuzlowych niż szkocka whisky: 1-propanol (53−895 mg/l), 2-metylo-1-propanol (7−688 mg/l), 2-metylo-1-butanol (21−396 mg/l) i 3-metylo-1-butanol (98−2108 mg/l). Łączne ilości alkoholi fuzlowych w rumach korelują z całkowitą zawartością kongenerów. Wyjątkowo wysokie zawartości 1-propanolu zawierają niektóre mocno przyprawione jamajskie rumy, w których stężenie kongenerów jest wyższe niż 9000 mg/l czystego alkoholu i waha się w granicach 23,84–31,3 g/l czystego alkoholu.

1. 4. Kwasy organiczne. Wszystkie monołańcuchowe kwasy monokarboksylowe od C1 do C18 i wiele kwasów o rozgałęzionych łańcuchach wykryto w destylowanych napojach alkoholowych, w większości produkowanych przez drożdże w procesie fermentacji. Ostatnio potwierdzono obecność kwasu mrówkowego w koniaku i rumie i jest to jeden z głównych kwasów w whisky. Przeważają kwasy o łańcuchu prostym nasyconym, na ogół kwas octowy. Względna proporcja kwasu octowego w szkockich whisky wynosi około 50% wszystkich lotnych kwasów, a w innych gatunkach whisky 60–95%. Koniaki i rumy zawierają 50–75% kwasu octowego i 75–90% całkowitej ilości lotnych kwasów tłuszczowych. Drugim co do wielkości kwasem w napojach destylowanych jest kwas dekanowy, a następnie kwas oktanowy i kwas dodekanowy oraz laurynowy. Stężenie kwasów palmitynowego i palmitynooleinowego jest stosunkowo wysokie w szkockiej whisky. Z kwasów krótkołańcuchowych kwas propionowy, 2-metylopropionowy, masłowy, 3-metylomasłowy występują w obfitości w rumach. W destylowanych napojach alkoholowych można znaleźć niewielkie ilości kwasów aromatycznych. Większość to kwasy fenolowe, które prawdopodobnie pochodzą z drewnianych beczek używanych do dojrzewania alkoholi. W badaniach nielotnych związków uwalnianych przez alkohol z wiórów dębowych znaleziono kwasy benzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, 2-hydroksybenzoesowy i benzenotrikarboksylowy. W rumie zidentyfikowano kwas 3-fenylopropanowy, kwas salicylowy i kwas homowaniliowy, a kwas 4-hydroksybenzoesowy – w koniaku. Ponadto, kwas kumarowy został znaleziony w whisky, a kwasy galowy, wanilinowy, syringinowy i ferulowy – w rumie. Podczas przedłużonego dojrzewania armaniaku zwiększa się stężenie kwasów aromatycznych, takich jak cynamonowy, benzoesowy, syringowy, waniliowy, ferulowy, 4-hydroksybenzoesowy i 4-hydroksycynamonowy.

2. 5. Estry. Estry stanowią największą grupę związków smakowych w whisky, koniaku i rumie. Większość z nich to estry etylowe kwasów monokarboksylowych. Prostołańcuchowe estry etylowe kwasów od C1 do C18 i niektóre estry etylowe kwasów o rozgałęzionym łańcuchu występują w whisky, koniaku i rumie jako związki smakowe. Całkowita zawartość estrów w mocnych alkoholach jest bardzo zróżnicowana. Estry znaleziono w szkockiej whisky słodowej (360 mg/l), w szkockich whisky (550 mg/l), irlandzkiej whisky (1010 mg/l), kanadyjskiej whisky (645 mg/l) i amerykańskiej whisky (269–785 mg/l), w rumie (44–643 mg/l) i brandy (300–6000 mg/l). Mrówczan etylu jest powszechnym składnikiem alkoholi typu whisky (4–27 mg/l), koniaku (13–33 mg/l) i rumu (5–35 mg/l). Octan etylu jest ilościowo najważniejszym składnikiem frakcji estrowej (zwykle ponad 50%). Wiele estrów krótkołańcuchowych, takich jak octan izobutylu, izomaślan etylu, etylo-n-maślan, izowalerian etylu, octan 2-metylobutylu i octan 3-metylobutylu dają dość silny zapach alkoholom typu whisky, koniak i rum. W whisky stężenie długołańcuchowych estrów kwasów karboksylowych wzrasta od heksanu etylu do dekanianu etylu, niższe stężenia są notowane dla estrów etylowych kwasów C14–C18.

3. 6. Związki fenolowe. W whisky stwierdzono niewielkie ilości fenoli, prawdopodobnie pochodzących z surowców. Są to: fenol, krezole, 2-metoksyfenol (gwajakol), 2,6-ksylenol, etylofenole, 2-metoksy-4-metylofenol, 2-methoksy-6-metylofenol, 2-methoksy-4-etylofenol, 2-methoksy-4-allylofenol (eugenol). Taniny występują w alkoholach dojrzewających w drewnianych beczkach. Brandy zawierają epikatechinę, galokatechinę, katechinę, flawonony i wiele innych związków fenolowych. Stężenie tanin w brandy po czterech do dziesięciu lat leżakowania w dębowych beczkach wahało się w granicach 240–1120 mg/l. Whisky Bourbon dojrzewające w zwęglonych beczkach przez okres do 12 lat zawierały 230−670 mg/l taniny.

4. 7. Składniki roślinne. Do produkcji alkoholu stosuje się różne ekstrakty roślinne i niezbędne składniki, oprócz produktów syntetycznych, do aromatyzowania likierów, aperitifów, wermutów i niektóre wódki gatunkowe. Trawa Hierochloe odorata zawiera wiele związków terpenowych, ketonów, alkoholi, aldehydów, a także estry, laktony, fenole i etery fenolowe oraz kwasy zidentyfikowane jako składniki smakowe Hierochloe odorata. Podstawowym składnikiem trawy jest kumaryna, która stanowi około 60% całkowitej zawartości lotnych związków. Anetol, który ma silny zapach anyżu, jest również naturalną substancją w wielu napojach, a zwłaszcza w likierach. Naturalny anetol otrzymuje się z materiałów roślinnych lub produkuje syntetycznie. Wiele innych naturalnych i syntetycznych aromatów o tym samym zapachu stosuje się do zaprawiania wódek.

8.10. Niekonwencjonalna produkcja wyrobów alkoholowych

Sfermentowane pokarmy i napoje są częścią diety człowieka od tysięcy lat. Podobnie jak sama cywilizacja, sfermentowane produkty spożywcze powstały w czasach wczesnego neolitu, ale zasady biologiczne leżące u podstaw procesów fermentacyjnych zostały odkryte dopiero niedawno. Początkowo fermentacja żywności była procesem spontanicznym, polegającym na naturalnie występujących mikroorganizmach, głównie drożdżach i bakteriach, które były przypadkowo obecne w surowcu, na sprzęcie lub wprowadzane przez owady. Wkrótce producenci zauważyli, że szybkość i jakość procesu fermentacji często wzrastają pod wpływem zaszczepienia małą próbką gotowego produktu fermentacji. Dopiero pod koniec XIX w. tę naturalną mikroflorę zaczęto stopniowo zastępować przez zdefiniowane mikroorganizmy składające się tylko z jednego lub kilku wybranych szczepów. Często do większości kontrolowanych procesów spontanicznych fermentacji, w tym do produkcji chleba, piwa, sake i wina, wybierano szczepy drożdży Saccharomyces spp. (zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae). Gatunki te łączą kilka kluczowych cech, takich jak produkcja pożądanych aromatów, brak produkcji toksyn i wysoka produkcja etanolu oraz tolerancja alkoholu. Jednak w badaniach stwierdza się, że przez ograniczenie różnorodności mikrobiologicznej ogranicza się cechy sensoryczne i zmniejsza złożoność produktu końcowego. Zainspirowało to niektórych producentów do ponownego odkrycia procesu spontanicznej fermentacji. Wielcy producenci wykazują obecnie również zainteresowanie wykorzystaniem niekonwencjonalnych (nie-Saccharomyces) drożdży w kontrolowanych procesach fermentacji w celu zwiększenia różnorodność smaku oraz ze względu na końcową zawartość alkoholu. Spontaniczne fermentacje stosowane od tysięcy lat do produkcji wyrobów sfermentowanych są zmienne i nieprzewidywalne, a niewielkie zmiany liczby i rodzaju obecnych mikroorganizmów mogą wpływać na ich wydajność lub jakość produktu. Dlatego dzisiaj w większości przemysłowej produkcji chleba, piwa i wina wykorzystuje się określone szczepy startowe. Najczęściej stosowanym gatunkiem jest Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces pastorianus dla fermentacji typu lager i Saccharomyces bayanus do niskotemperaturowych fermentacji wina lub cydru.

Podstawowe zasady fermentacji od zarania pozostawały tajemnicą aż do odkryć pionierów, takich jak Antoni van Leeuwenhoek, Ludwik Pasteur i Emile Christian Hansen. Nazwa fermentacja pochodzi od łacińskiego słowa fervere (gotować), gdyż zaobserwowano pęcherzyki, powstające w fermentującym podłożu. Dopiero w połowie XVII w. naukowcy zaczęli odkrywać mechanizm procesu fermentacji, otwierając tym samym drogę do rozwoju czystych szczepów starterowych i bezpośredniej selekcji i hodowli najlepszych szczepów i odmian. Na początku lat 80. XIX w. Emile Christian Hansen, pracownik laboratorium Carlsberga w Kopenhadze opisał kilka technik izolowania pojedynczych komórek mikroorganizmów. Był pierwszym, któremu udało się wyizolować czyste szczepy drożdży. W listopadzie 1883 r. stary browar Carlsberg zaczął używać jednego z izolatów Hansena, Unterhefe Nr 1 (Saccharomyces carlsbergensis, teraz przeklasyfikowany jako Saccharomyces pastorianus) do produkcji piwa lager. Technikę tę szybko przyjęły inne browary i zakłady przemysłowe, aż stosowanie starterów fermentacyjnych czystych szczepów Saccharomyces stało się powszechne. Warto zauważyć, że Saccharomyces cerevisiae są drożdżami z wyboru w kontrolowanym procesie fermentacji przemysłowej. Przede wszystkim dlatego, że wytwarzają wysokie stężenia etanolu, który pomaga chronić napoje przed psuciem się wskutek działania mikroorganizmów. Ponadto fermentacja jest korzystnym sposobem metabolizmu w Saccharomyces cerevisiae, który jest naturalnym fermentorem. Powielanie kluczowych genów kodujących dehydrogenazę alkoholową, transportery heksozowe i enzymy związane z glikolizą, jak również globalne ponowne połączenie sieci transkrypcyjnej po duplikacji całego genomu przyczyniają się do przydatności Saccharomyces cerevisiae jako czynnika napędzającego fermentacje przemysłowe. Oprócz tej bardziej ogólnej adaptacji Saccharomyces spp. do bogatego w cukier substratu, ograniczonego tlenem środowiska, kilka innych adaptacji zdaje się zwiększać wydajność drożdży w fermentacjach specyficznych dla człowieka. Podczas tych fermentacji pojawiało się kilka nowych, lepszych mutantów drożdży, dzięki głównie niezamierzonej hodowli i ukierunkowanej ewolucji. Skutkowało to pojawieniem się organizmów wyspecjalizowanych w specyficznych środowiskach fermentacji, czyniąc Saccharomyces cerevisiae jednym z najstarszych udomowionych organizmów na planecie.

Szczepy „browarowe” wykazują duplikację genów zaangażowanych w wykorzystanie maltozy i maltotriozy jako pierwotnych źródeł węgla w fermentacjach piwa. Ponadto drożdże piwne wykazują oznaki selekcji szczepów drożdży związanych z produkcją smaków piwa, zwłaszcza 4-winylogwajacolem (4-VG) o goździkowym smaku, który pojawia się tylko w kilku specyficznych gatunkach piwa, takich jak niemieckie piwa Hefeweizen. Innym przykładem udomowienia jest zachowanie flokulacji u drożdży. Flokulacja (zdolność komórek do przyklejania się do siebie) powoduje, że tworzą one agregaty, które szybko sedymentują, dzięki czemu można łatwo i tanio oddzielić komórki drożdży od gotowego napoju. Szeroko stosowane drożdże lager, Saccharomyces pastorianus, są międzygatunkową hybrydą Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces eubayanus. Sukces hybrydy w fermentacji lagerowej polega na jej prowadzeniu w niskich temperaturach, aby zapewnić typowy profil smakowy, przez połączenie zimnej tolerancji Saccharomyces eubayanus z ogólną lepszą fermentacją Saccharomyces cerevisiae. Podobnie z innymi odmianami piwa i wina, które powstają w fermentacjach prowadzonych przez hybrydę Saccharomyces cerevisiae i kriotolerancyjnego, silnie aromatyzującego gatunku Saccharomyces kudriavzevii. Użycie szczepów wybranych do adaptacyjnych mutacji i zdolności Saccharomyces cerevisiae oraz hybrydyzacja z innymi gatunkami łączy pożądane cechy udomowionych szczepów przemysłowych. Szczepy drożdży Saccharomyces cerevisiae wybrano do większości szczepów starterowych.

Szczepy starterowe stosuje się w dzisiejszej fermentacji na dużą skalę przemysłową w celu osiągnięcia dużej wydajności. Istnieją jednak procesy przemysłowe, w których stosowanie określonych szczepów startowych nie jest powszechną praktyką. Przykładem takiego procesu jest fermentacja ziaren kakaowych do produkcji czekolady. W produkcji piwa i wina szczepy starterowe są stosowane powszechnie, ale niektórzy rzemieślnicy powracają do praktyki wykorzystywania lokalnej mikroflory w celu uzyskania swoistego charakteru, złożoności i/lub autentyczności produktu.

Chociaż drożdże do kontrolowanych fermentacji wina są dostępne od 1890 r. liczne dzisiejsze winnice wolą polegać na spontanicznej fermentacji prowadzonej przez lokalną mikroflorę, aby osiągnąć swoisty, odróżnialny charakter wina, łączący produkt z konkretną winnicą. Spontaniczne fermentacje wina są złożonym procesem ekologicznym i biochemicznym prowadzonym przez mikroorganizmy obecne na powierzchni skórek winogron i rodzimej flory bakteryjnej związanej z powierzchniami winiarskimi. Z powierzchni winogron lub fermentowanego moszczu oprócz drożdży, można izolować takie mikroorganizmy jak bakterie kwasu mlekowego i octowego, grzyby epifityczne, mykowirusy i bakteriofagi. Ogólnie, fermentacja jest inicjowana przez szybkie wykorzystanie glukozy przez drożdże inne niż Saccharomyces, takie jak Hanseniaspora uvarum, Candida stellata, Candida zemplinina i Metschnikowia pulcherrima, z których większość jest często związana z powierzchnią winogron. Wiele z tych gatunków nigdy nie osiąga wysokiej liczebności komórek w moszczu, ich zdolność do syntezy lotnych związków aktywnych smakowo-zapachowych może wpływać na bukiet wina. Ogólnie drożdże we wczesnej fazie fermentacji rosną do około 10^6–10^7 jtk/ml, opadają i znikają wraz ze wzrostem stężenia etanolu w płynie hodowlanym. Gatunki tolerujące etanol, głównie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus (w przypadku zimnych fermentacji) lub w niektórych rzadkich przypadkach Pichia kudriavzevii, stają się dominującymi gatunkami drożdży, osiągając gęstości do 10^8–10^9 jtk/ml, i biorą udział w procesie produkcji etanolu. Co ciekawe, gatunki te są rzadko izolowane z winogron. Ich obecność na uszkodzonych jagodach i na powierzchniach w winnicy i/lub transport przez wektory owadów są zatem najprawdopodobniej pierwszorzędnymi źródłami tych gatunków w spontanicznych fermentacjach wina.

Ogromna większość dzisiejszego piwa jest wytwarzana przez drożdże w procesie fermentacji. Niektóre browary produkują piwo w procesie fermentacji spontanicznych. Są to tradycyjne piwa w stylu Lambic. Brzeczka jest najpierw gotowana, po czym chłodzona przez noc w dużych, płytkich otwartych zbiornikach (chłodniach) w kontakcie z otwartym powietrzem. Następnie jest przenoszona zazwyczaj do beczek dębowych, w których fermentuje przez okres do trzech lat. Ponieważ przygotowanie brzeczki obejmuje etap wrzenia, drobnoustroje pochodzące z surowca są, w przeciwieństwie do produkcji wina, rzadko istotne dla procesu fermentacji. Jednak mikroorganizmy obecne w powietrzu i na powierzchniach zbiorników trafiają do brzeczki podczas schładzania i przenoszenia do beczek. Szczegółowa analiza mikrobiomu w tego typu piwach wskazuje, że proces fermentacji prowadzi złożona, wielofazowa sukcesja kilku gatunków drożdży i bakterii. Typowe spontaniczne fermentacje piwa na ogół wykazują trzy różne fazy:

1. 1) fazę początkową,

2. 2) fermentację główną,

3. 3) dojrzewanie.

Początkowa faza spontanicznych fermentacji wina charakteryzuje się dużą różnorodnością drobnoustrojów, głównie Enterobacter i drożdży innych niż Saccharomyces, takich jak Kluyveromyces, Rhodotorula i Pichia spp. Dalej, ze względu na zmiany fizyczne i chemiczne w środowisku fermentacji (zwłaszcza zwiększone stężenie etanolu i obniżone pH), Saccharomyces spp. zaczynają dominować i prowadzić główną fermentację alkoholową. W tej fazie większość fermentujących cukrów w podłożu jest konwertowana do etanolu. Proces ten może trwać 3–4 miesięcy. Oprócz Saccharomyces spp. w płynie hodowlanym znajdują się bakterie kwasu mlekowego oraz bakterie kwasu octowego. Kiedy wszystkie cukry są przefermentowane przez Saccharomyces spp. (zazwyczaj glukoza, fruktoza, sacharoza, maltoza i maltotrioza), liczba komórek Saccharomyces spada. Niszę tę później wypełniają drożdże Brettanomyces spp., głównie Brettanomyces bruxellensis, które osiągają liczebność 10^4–10^5 komórek/ml i pozostają dominującą podgrupą mikroorganizmów podczas dojrzewania, które trwa kilka miesięcy lub nawet lat. Brettanomyces spp. wykazują wysoką tolerancję na wysokie stężenia etanolu oraz mogą wykorzystywać bardziej złożone węglowodany, które normalnie nie są fermentowane przez Saccharomyces spp., takie jak maltodekstryny maltotetraoza i maltopentaoza.

Literatura rekomendowana

Medeiros A.B.P., de Matos M.E., de Pinho Monteiro A., de Carvalho J.C., Soccol C.R. 2017. Cachaça and rum. s. 451–468. Chapter 16. [w:] Current Developments in Biotechnology and Bioengineering: Food and Beverages Industry. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-444-63666-9.00016-9.

Sarris D. i Papanikolaou S. 2016. Biotechnological production of ethanol: Biochemistry, processes and technologies. Eng. Life Sci., 16: 307–329.

Sampaio O.M., Reche R.V., Franco D.V. 2008. Chemical profile of rums as a function of their origin. The use of chemometric techniques for their identification. J. Agricultural & Food Chemistry, 56: 1661–1668.

Tsakiris A., Kallithraka S., Kourkoutas Y. 2014. Grape brandy production, compositionand sensory evaluation. J. Sci. Food Agric.,94: 404–414.

WHO International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Alcohol drinking. Volume 44. This publication represents the views and expert opinions of an IARC Working Group on theEvaluation of Carcinogenic Risks to Rumans, which met in Lyon, 13–20 October 1987.

Walker G.M. i Stewart G.G. 2016. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages, 2, 30. doi:10.3390/beverages2040030.

9

Mikrobiologiczna produkcja rozpuszczalników

9.1.Wprowadzenie

Rozwój wielu obszarów gospodarczych oraz ciągły i szybki wzrost liczby ludności na świecie zmuszają do wykorzystywania wszystkich rodzajów źródeł energii – zarówno odnawialnych, jak i nieodnawialnych. Nieodnawialne źródła energii są przyczyną znacznego wzrostu emisji gazów i pojawienia się efektu cieplarnianego. Stąd wykorzystanie odnawialnych źródeł energii takich jak biopaliwa stało się niezwykłe korzystne. Obecnie na rynku są dostępne dwa najważniejsze rodzaje odnawialnych biopaliw płynnych – biodiesel i bioetanol. Biodiesel jest wytwarzany przez transestryfikację olejów roślinnych, tłuszczów zwierzęcych oraz tłuszczów odpadowych. Możliwa jest też produkcja „paliw niekonwencjonalnych” z wykorzystaniem mikroorganizmów zdolnych do wytwarzania lipidów wewnątrzkomórkowych, które mogą zostać przekształcone w biodiesel drugiej lub trzeciej generacji w procesie sekwestracji atmosferycznego CO_2. Jednakże koszty produkcji paliwa trzeciej generacji są wysokie. Produkcja bioetanolu jest korzystna ekonomiczne dla środowiska, ponieważ etanol jako paliwo ma wysoką wartość liczby oktanowej, a nawet małe ilości etanolu dodane do benzyny mogą znacznie zwiększyć liczbę oktanową mieszanki. Ponadto wyższa zawartość tlenu poprawia wydajność spalania paliwa. Globalnie bioetanol jest objętościowo największym biopaliwem stosowanym w sektorze transportu. Największe ilości etanolu pochodzącego z kukurydzy są produkowane głównie w USA, a pochodzącego z trzciny cukrowej – głównie w Brazylii. Zarówno bioetanol pierwszej generacji (z fermentacji hydrolizowanych jadalnych materiałów skrobiowych lub jadalnych cukrów prostych), jak też drugiej generacji (z konwersji niektórych odpadów) są obiecującymi odnawialnymi źródłami energii stosowanymi na całym świecie. Od początku XIX w. zaczęto stosować etanol jako paliwo samochodowe lub źródło energii. W 1826 r. Samuel Morey użył alkoholu jako paliwa w pierwszym amerykańskim prototypie silnika spalinowego. W latach 60. XIX w. powstały tysiące gorzelni produkujące 90 mln galonów amerykańskich (340 000 m^3) etanolu rocznie, używanego głównie do oświetlenia miast. W 1860 r. niemiecki wynalazca Nikolaus Otto po raz pierwszy użył etanolu jako paliwa we wczesnym silniku spalinowym. Pierwsze samochody wyprodukowane przez firmę „Henry Ford” (model T) były napędzane wyłącznie etanolem. Obecnie na etanolu jeździ około 820 mln samochodów osobowych i lekkie ciężarówki.

Zgodnie z prognozami Światowej Rady Energetycznej z 1994 r. paliwa kopalne będą w dalszym ciągu zapewniać większość zapotrzebowania na energię przez najbliższe dziesięciolecia. Węgla wystarczy na około 250 lat, ropy naftowej na ponad 40 lat, a gazu naturalnego – na ponad 65 lat. Jednym z alternatywnych źródeł energii jest energia odnawialna, w tym biomasa. Użycie etanolu produkowanego z biomasy jako paliwa pozytywnie wpływa na równowagę CO_2 i jest zgodne z deklaracją z Rio z 1992 r., protokołem z Kioto z 1997 r. i ustawą Unii Europejskiej o czystym powietrzu z 1994 r. Etanol ma następujące właściwości fizyczne zbliżone do właściwości produktów ropopochodnych:

1. 1) temperatura wrzenia +78,3°C pod ciśnieniem 101,3 kPa,

2. 2) temperatura spalania w powietrzu +426°C,

3. 3) gęstość 0,78927 g/l,

4. 4) liczba oktanowa 106,

5. 5) minimalne ciepło spalania 26,9 MJ/kg.

Paliwo etanolowe można stosować jako mieszankę z benzyną w ilości 5–100%. Najpopularniejsze mieszanki są znane jako E85 (85% bioetanolu, 15% benzyny), E20 (20% bioetanolu, 80% benzyna) i E10 (10% bioetanol, 90% benzyna; znana w USA jako gazohol). W Brazylii jest stosowana również mieszanka zawierająca 24% bioetanolu i 76% benzyny. Mieszanki o wyższych stężeniach bioetanolu mogą być stosowane w pojazdach Flexible Fuel Vehicle (FFV) z silnikami przystosowanymi do spalania benzyny, etanolu lub ich mieszanki, w tym zawierającej do 85% bioetanolu (E85). Mieszanki biodiesla są oznaczone literą B.

W skali technicznej przy udziale mikroorganizmów produkuje się następujące rozpuszczalniki: etanol, glicerol, aceton, butanol i izobutanol.

9.2.Globalna produkcja etanolu

Etanol jest stosowany jako surowiec do produkcji chemikaliów, napojów, farmaceutyków i kosmetyków, a także jako paliwo (bioetanol). Większość etanolu (90–95%) wytwarza się w biologicznych procesach fermentacji (bioetanol), reszta jest produkowana przy użyciu etenu (pochodzącego z krakingu ropy naftowej) i/lub gazu ziemnego z udziałem pary wodnej i kwasu fosforowego jako katalizatora (syntetyczny etanol). W procesie produkcji syntetycznego etanolu powstają toksyczne produkty uboczne, a etanol syntetyczny nie nadaje się do spożycia. Na świecie najwięcej etanolu produkują USA i Brazylia – razem osiągają 62–87% globalnej produkcji. W Ameryce bioetanol produkuje się z hydrolizowanej skrobi pochodzącej z kukurydzy, a w Brazylii – z cukru z trzciny cukrowej. W Europie produkcja etanolu stanowi 5% (w 2008 r.) produkcji światowej, głównymi producentami są Niemcy i Francja, a głównymi surowcami do produkcji etanolu są zboża i burak cukrowy.

9.2.1. Biochemia fermentacji alkoholowej

Niezależnie od rodzaju substratów (prostych lub złożonych) wykorzystywanych jako biologiczne źródła węgla, ich obróbka wstępna ma na celu wytworzenie heksoz, pentoz lub glicerolu, które następnie będą fermentowane przez odpowiednie mikroorganizmy do bioetanolu. Głównymi prostymi źródłami węgla są glukoza (i inne heksozy), disacharydy (głównie sacharoza), ksyloza i glicerol. Glukozę można konwertować do etanolu w procesie fermentacji prowadzonej głównie przez drożdże Saccharomyces cerevisiae i bakterie Zymomonas mobilis. Ksylozę można bezpośrednio poddać fermentacji z udziałem drożdży Pachysolen tannophilus, Candida shehatae lub Pichia stipitis albo najpierw przeprowadzić jej izomeryzację do ksylulozy za pomocą enzymu izomerazy glukozy (ksyloza), a następnie poddać fermentacji z udziałem drożdży piekarniczych Saccharomyces cerevisiae. W pobieraniu ksylozy pośredniczą transportery glukozowe, które nie są specyficznymi transporterami dla ksylozy, a zostały zidentyfikowane u szczepów typu dzikiego Saccharomyces cerevisiae. Nadekspresja genu reduktazy aldozy (ksylozy), dehydrogenazy ksylitolu, izomerazy ksylozy i umiarkowany poziom ksylulokinazy mogą potencjalnie umożliwić asymilację ksylozy i fermentację przez genetycznie zmodyfikowane szczepy Saccharomyces cerevisiae. Wreszcie glicerol także może być przekształcany w etanol przy udziale szczepów bakteryjnych lub drożdżowych.

Biochemia fermentacji alkoholowej obejmuje szlak degradacji substratu (glikoliza, fermentacja alkoholowa, fermentacja gliceropirogronianowa i oddychanie w przypadku wykorzystania heksoz, szlaki kataboliczne ksylozy w przypadku wykorzystania pentoz i asymilacji glicerolu oraz glikolizy w przypadku mikroorganizmów konwertujących glicerol) między fermentacją a oddychaniem (efekt Pasteura, efekt Crabtree). Glikoliza jest częścią szlaku Embdema–Meyenhorfa–Parnasa (EMP) dla Saccharomyces cerevisiae, pentozo-fosforanowego (PP) dla mikroorganizmów degradujących ksylozę i szlaku Entnera–Doudoroffa (ED) dla bakterii Zymomonas mobilis.

Szlak Embdema–Meyenhorfa–Parnasa (EMP) to seria reakcji zachodzących w cytozolu, w których glukoza (fruktoza) pobrana dzięki dyfuzji ułatwionej jest przekształcana do pirogronianu z wytworzeniem ATP i NADH. Drożdże zawierają kilka transporterów glukozy, mianowicie Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt6, Hxt7 i Gal2. Pirogronian jest końcowym produktem glikolizy. W procesie glikolizy z jednego mola glukozy tworzą dwa mole kwasu pirogronowego, cztery mole ATP i dwa mole NADH. Wytwarzany w procesie glikolizy pirogronian może być wykorzystywany przez drożdże w kilku szlakach metabolicznych. Najwyraźniej mikroorganizm musi zregenerować NAD+ z NADH, aby przywrócić potencjał utleniania i redukcji komórki na odpowiednim poziomie. Mogą to zrobić przez fermentację lub oddychanie. To wyznacza koniec wspólnego szlaku glikolizy. Z jednej strony reakcje fermentacji alkoholowej, fermentacji gliceropirogronianowej lub oddychania następują w zależności od różnych warunków tlenowych. Z drugiej strony, podczas asymilacji glicerolu przez grzyby strzępkowe, drożdże lub bakterie z mola zasymilowanego glicerolu otrzymuje się mol NADPH i pirogronian.

Na rysunku 9.1 przedstawiono szlaki metaboliczne wykorzystania glukozy i ksylozy z rekombinowanym szczepem Saccharomyces cerevisiae. Glukoza przekształca się w pirogronian drogą szlaku Embdena–Meyerhofa–Parnasa, podczas gdy ksyloza po konwersji do ksylulozy jest metabolizowana w cyklu pentozo-fosforanowym.

Rys. 9.1. Szlaki metaboliczne zaprojektowane do fermentacji ksylozy w rekombinowanym Saccharomyces cerevisiae; ścieżka Embden–Meyerhof–Parnas jest oznaczona grubymi liniami, a szlak pentozo-fosforanowy – cienkimi. Ważnymi genami w szlakach są: GND1 – dehydrogenaza fosfoglukonianowa, RKI1 – izomeraza rybozo-5-fosforanowa, TAL1 – transaldolaza, TKL1 – transketolaza, XKS1 – ksylulokinaza, XYL1 – reduktaza ksylozy (XR), XYL2 – dehydrogenaza ksylitolowa (XDH), XYL3 – ksylulokinaza, XylA – izomeraza ksylozy (XI), ZWF1 – G-dehydrogenaza 6-P, XI, XR i XDH są enzymami heterologicznymi

W ostatnich latach stosowano inżynierię genetyczną w celu uzyskania biopaliw z surowca lignocelulozowego. Różne gatunki bakterii, takie jak Saccharolyticum sp., Escherichia coli, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium sp., Caldicellulosiruptor bescii, Caldicellulosiruptor fitofermentans, Zymomonas mobilis, Clostridium cellulolyticum oraz gatunki grzybów takie jak Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Paecilomyces variotii, Fusarium oxysporum i drożdże takie jak Saccharomyces cerevisiae, Clavispora sp., Kluyveromyces marxianus i Pichia stipitis zostały przebadane pod kątem ich zastosowania w produkcji bioetanolu. Lista genetycznie zmodyfikowanych mikroorganizmów stosowanych w produkcji etanolu zawiera bakterie i drożdże (tab. 9.1).

Tabela 9.1. Lista genetycznie zmodyfikowanych mikroorganizmów stosowanych w produkcji etanolu

Mikroorganizmy

Szczepy

Cechy szczepów

bakterie

Zymomonas mobilis ZM4

fermentacja ksylozy i glukozy

Pichia stipitis BCC15191

Zymomonas mobilis AX101

fermentacja arabinozy, glukozy i ksylozy

Thermoanaerobacterium saccharolyticum ALK2

ulepszona wydajność produkcji etanolu, fermentacja arabinozy, glukozy, ksylozy i mannozy

Thermoanaerobacter mathranii BG1L1

ulepszona produkcja etanolu

Clostridium thermocellum DSM1313&YD01

ulepszona produkcja etanolu

Escherichia coli KO11

fermentacja ksylozy i glukozy

Escherichia coli FBR5

fermentacja ksylozy i arabinozy

Pichia stipitis A

adaptacja do wyższych stężeń koncentratów

Pichia stipitis NRRLY-7124

drożdże

Candida shehatae NCL-3501

kofermentacja ksylozy i glukozy

Saccharomyces cerevisiae D5a

ulepszenie fermentacji etanolu

Saccharomyces cerevisiae 590E1

fermentacja glukozy i celobiozy

Saccharomyces cerevisiae RWB217

fermentacja glukozy i ksylozy

Saccharomyces cerevisiae RWB218

Źródło: Aditiya H.B., Mahlia T.M.I., Chong W.T., Nur H., Sebayang A.H. 2016. Second generation bioethanol production: A critical review. Renew. Sustain. Energy Rev., 66: 631–653).

9.2.2. Fermentacja alkoholowa prowadzona przez Saccharomyces cerevisiae

Produkcja etanolu prowadzona przez Saccharomyces cerevisiae i inne drożdże to fermentacja alkoholowa umieszczona w cytoplazmie komórek, gdzie aldehyd octowy – produkt zdekarboksylowanego kwasu pirogronowego – służy jako akceptor elektronów. Podczas fermentacji alkoholowej przebiegają dwie dodatkowe reakcje enzymatyczne. Początkowo pirogronian jest dekarboksylowany do aldehydu octowego przez dekarboksylazę pirogronianową. Kofaktorami są pirofosforan tiaminy (TPP) i magnez. Następnie aldehyd octowy redukuje się do etanolu przy udziale NADH, który oddaje wodory i przechodzi w formę utlenioną NAD+. Reakcja ta jest katalizowana przez dehydrogenazę alkoholową wykorzystującą cynk jako kofaktor. Oba produkty końcowe fermentacji alkoholowej – etanol i ditlenek węgla – są transportowane poza komórkę drogą prostej dyfuzji. Do produkcji etanolu w różnych warunkach hodowli zdolne są także mikroorganizmy eukariotyczne jak Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Saccharomyces rouxii, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Candida tropicalis, Candida oleophila, Hanseniaspora spp. i Mucor rouxianus

9.2.3. Fermentacja etanolowa prowadzona przez bakterie

Etanol produkują różne mikroorganizmy prokariotyczne należące do gatunków Zymomonas mobilis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium sporogenes, Bacillus stearothermophilus i Thermoanaerobacter ethanolicus. Podobnie jak drożdże z rodzaju Saccharomyces bakteria Zymomonas mobilis jest niezdolna do metabolizowania pentoz (ksylozy lub odpadów zawierające ksylozę), a genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy wymienionych gatunków są zdolne do rozbicia ksylozy na drodze fermentacji. Zymomonas mobilis produkuje etanol w warunkach beztlenowych, a Saccharomyces cerevisiae – zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych (patrz efekt Crabtree).

Wydajności reakcji w obu przypadkach są takie same, z jednego mola katabolizowanego cukru powstają 2 mole etanolu i 2 mole CO_2. Podczas fermentacji prowadzonej przez szczepy Zymomonas mobilis z jednego mola katabolizowanej heksozy powstaje jeden mol ATP, a podczas konwersji prowadzonej przez szczepy drożdży, powstają 2 mole ATP i na 1 mol heksozy. Widać więc, że w procesie fermentacji Zymomonas mobilis tworzy się znacznie mniej biomasy niż w procesie fermentacji prowadzonym przez szczepy drożdży. W obu przypadkach teoretyczna maksymalna wydajność jest zbliżona i wynosi 0,43–0,47 g wytworzonego etanolu na 1 g zużytego cukru. W tabeli 9.2przedstawiono parametry kinetyczne procesu produkcji etanolu przez Zymomonas mobilis i Saccharomyces cerevisiae.

Fermentacje prowadzone przez Zymomonas mobilis i szczepy drożdży różnią się znacznie kinetyką procesu. Zymomonas mobilis może również wytwarzać produkty uboczne, takie jak mannitol, sorbitol, dihydroksyaceton i głównie egzopolisacharyd lewan, podczas gdy szczepy Saccharomyces wytwarzają (oprócz etanolu) głównie glicerol. Dodatkowo w błonach komórkowych szczepów Zymomonas mobilis wykryto niezwykłe komórkowe kwasy tłuszczowe, jak np. C18:1. Drożdże w warunkach tlenowych syntetyzują nienasycone kwasy tłuszczowe takie jak C16:1, C18:1 i C18:2. Szczepy drożdży zawierają w lipidach komórkowych niewielkie ilości ergosterolu, który zapewnia stabilność komórkową i tolerancję na etanol. Szczepy Zymomonas mobilis i Saccharomyces spp. mogą tolerować do 120–140 g/l etanolu. Tak więc drożdże cieszą się większym zainteresowaniem z powodu produkcji większej ilości biomasy, którą można wykorzystać jako dodatek do paszy dla zwierząt. Bakterie z rodzaju Thermoanaerobacter mogą być z powodzeniem stosowane do produkcji etanolu na kilku rodzajach substratów cukrowych obecnych w podłożu.

Tabela 9.2. Porównanie produkcji etanolu przez bakterie Zymomonas mobilis i drożdże Saccharomyces cerevisiae

Parametr kinetyczny

Zymomonas mobilis

Saccharomyces cerevisiae

maksymalna specyficzna szybkość wzrostu (m/godz.)

0,43

0,41

specyficzna szybkość asymilacji glukozy (g/g · godz.)

1,75

10,5

specyficzna szybkość produkcji etanolu

0,67

5,67

plon (g etanolu/g glukozy)

0,43

0,47

plon (%)

85

92

maksymalne stężenie etanolu

– w hodowlach okresowych

– w hodowlach ciągłych

< 10

5,5–6,0

< 20

< 5

Fermentację alkoholową różnych cukrów heksozowych i pentozowych można prowadzić z zastosowaniem szczepów hybrydowych genetycznie zmodyfikowanych lub dwóch szczepów drożdży, z których jeden jest zdolny do fermentacji heksoz, a drugi pentoz. Szczep hybrydowy powstał z połączenia protoplastów Saccharomyces cerevisiae i drożdży fermentujących ksylozę, takich jak Pachysolen tannophilus, Candida shehatae i Pichia stipitis. Genetycznie zmodyfikowany szczep Saccharomyces cerevisiae oraz hodowle dwóch szczepów są zdolne do produkcji etanolu z wysoką wydajnością. Wprowadzenie do komórek Saccharomyces cerevisiae genu reduktazy ksylozy i genu dehydrogenazy ksylitolu z Pichia stipitis uczyniły szczep Saccharomyces cerevisiae zdolnym do fermentacji ksylozy. Zmodyfikowane szczepy drożdży mogą także szybciej przekształcać celulozę w etanol w porównaniu do niezmodyfikowanych szczepów drożdży. Współhodowla dwóch różnych gatunków drożdży wykazuje lepszą produkcję etanolu w porównaniu z hodowlami jednogatunkowymi. We wspólnej hodowli pentozy są wykorzystywane przez Pichia fermentans i Pichia stipitis, a heksozy przez Saccharomyces cerevisiae. Szczepy drożdży stosowane w produkcji bioetanolu przedstawiono w tabeli 9.3.

Tabela 9.3. Wydajności procesu fermentacji alkoholowej na podłożach z różnymi substratami organicznymi

Szczep

Typ szczepu

Surowiec

Cukier (g/l)

Warunki fermentacji

Etanol (g/l)

Produkcja

(g/l · godz.)

Lit.

Różne szczepy Saccharomyces cerevisiae

RL-11

lab.

kawa zmielona

195

30°C, 48 godz.

11,7

0,49

[1]

MTCC 173

lab.

słoma sorgo

200

30°C, 96 godz.

60

0,94

[2]

KL17

dziki

galaktoza i glukoza

500

30°C, 28 godz.

96,9

3,46

[3]

CHY1011

dziki

skrobia kassawy

195

32°C, 66 godz.

89,1

1,35

[4]

ZU-10

rekombinant

słoma kukurydzy

99

30°C, 72 godz.

41,2

0,57

[5]

RPRT90

hybryd

ipomea carnea

72,1

30°C, 28 godz.

29

1,03

[6]

CHFY0321

hybryd

skrobia kassawy

195

32°C, 65 godz.

89,8

1,38

[7]

Inne gatunki z rodzaju Saccharomyces

S. stipitis CBS6054

lab.

trzcina olbrzymia

33,4

30°C, 96 godz.

8,2

0,17

8]

S. pombe CHFY0201

dziki

skrobia kassawy

95

32°C, 66 godz.

72,1

1,16

[9]

[1] Mussato i wsp. 2012. Appl. Energy, 92: 763–768, [2] Sathesh-Prabu i wsp. 2011. Bioresour. Technol., 102: 2788–2792, [3] Scordia i wsp. 2012. Biomass-Bioenergy, 39: 296–305, [4] Choi i wsp. 2010. Biomass-Bioenergy, 34: 1223–1231, [5] Zhao i wsp. 2010. Fuel Process Technol., 91: 1807–1811. [6] Kumari i Pramanik. 2013. Appl. Biochem. Biotechnol., 171: 771–1785, [7] Choi i wsp. 2010. Biomass-Bioenergy, 34: 1232–1242, [8] Scordia i wsp. 2012. Biomass-Bioenergy, 39: 296–305, [9] Choi i wsp. 2010. J. Microbiol. Biotechnol., 20: 828–834.

Saccharomyces cerevisiae jest najszerzej badanym gatunkiem „workhorse” drożdży. Do produkcji bioetanolu stosowano różne rodzaje surowców. Najwyższe stężenie etanolu 89,8 g/l i tempo produkcji etanolu 3,46 g/(l · godz.) zostało uzyskane przez konstrukt Saccharomyces cerevisiae CHFY0321 hodowany w podłożu zawierającym skrobię kassawy, przy stężeniu cukrów 195 g/l w temperaturze 32°C w czasie trwania hodowli 65 godz. Dla porównania drożdże szczepu dzikiego Saccharomyces cerevisiae KL17, które są zdolne do fermentacji glukozy i galaktozy, produkowały 96,9 g/l etanolu z szybkością 3,46 g/(l · godz.) w temperaturze inkubacji 30°C w ciągu 28 godz. inkubacji. Wyniki te wskazują na ogromny potencjał drożdży typu dzikiego do fermentacji cukrów do etanolu.

9.2.4. Czynniki wpływające na produkcję etanolu

Istnieje kilka czynników, które wpływają na produkcję bioetanolu, w tym temperatura, stężenie cukru, pH, czas fermentacji, szybkość mieszania i wielkość inoculum.

Temperatura ma bezpośredni wpływ na tempo wzrostu mikroorganizmów. Wysoka temperatura, która jest niekorzystna dla wzrostu komórek, staje się czynnikiem stresowym dla mikroorganizmów. Idealny zakres temperatur dla procesu fermentacji wynosi 20–35°C. Optymalna temperatura wolnych komórek Saccharomyces cerevisiae wynosi ok. 30°C, a komórek unieruchomionych – nieco więcej, dzięki ich zdolności do przenoszenia ciepła od powierzchni cząstek do wnętrza komórek. Ponadto enzymy, które regulują aktywność mikrobiologiczną i proces fermentacji są wrażliwe na wysoką temperaturę, która może denaturować ich trzeciorzędową strukturę i dezaktywować je. Tak więc temperatura musi być dokładnie regulowana przez cały proces fermentacji. Wzrost stężenia cukru do pewnego poziomu powoduje wzrost tempa fermentacji. Jednak stosowanie nadmiernego stężenia cukru powoduje przebieg fermentacji na stałym poziomie. Dzieje się tak wówczas, gdy stężenie cukru obecnego jest wyższe niż stężenie cukru wykorzystywanego przez mikroorganizmy. Szybkość produkcji etanolu jest maksymalna przy stężeniu cukrów w podłożu 150 g/l. Za ważny czynnik w procesie produkcji etanolu uznano również początkowe stężenie cukru. Wysoką produktywność etanolu i wydajność w procesie fermentacji można uzyskać, stosując wyższe początkowe stężenie cukru, jednak wymaga dłuższego czasu fermentacji.

Odczyn (pH) podłoża fermentacyjnego wpływa na wzrost drożdży, szybkość fermentacji i tworzenie produktów ubocznych. Stężenie H+ w podłożu fermentacyjnym wpływa na przepuszczalność niektórych niezbędnych składników odżywczych przez komórki. Na przetrwanie i wzrost drożdży ma wpływ pH w zakresie 2,75–4,25. Optymalny zakres pH fermentacji alkoholowej Saccharomyces cerevisiae wynosi 4,0–5,0. W warunkach pH < 4,0, wymagany jest dłuższy okres inkubacji, ale stężenie etanolu nie jest znacząco mniejsze. W warunkach pH > 5,0 produkcja etanolu zmniejsza się zasadniczo.

Czas fermentacji wpływa na wzrost mikroorganizmów. Zbyt krótki czas fermentacji jest przyczyną nieefektywności procesu z powodu nieodpowiedniego wzrostu mikroorganizmów. Z kolei zbyt długi czas fermentacji wydłuża kontakt drobnoustrojów z etanolem, który działa na nie toksycznie i hamuje ich wzrost, zwłaszcza w hodowli okresowej z wysokim stężeniem etanolu w fermentowanym podłożu. Kompletną fermentację w niższej temperaturze można osiągnąć przez wydłużeniu czasu fermentacji, co skutkuje niższą wydajnością produkcji etanolu.

Szybkością mieszania kontroluje się homogenność składników odżywczych w podłożu fermentacyjnym oraz ich pobieranie i wydzielanie etanolu do podłoża fermentacyjnego. Im większa szybkość mieszania, tym wyższa ilość produkowanego etanolu, większe pobieranie cukru i mniejsze hamowanie aktywności komórek etanolem. Optymalna szybkość mieszania dla fermentacji etanolowej wynosi 150–200 obr./min. Nadmierna szybkość mieszania nie jest odpowiednia dla produkcji etanolu, ponieważ powoduje ograniczenie aktywności metabolicznej komórek.

Wielkość inoculum nie ma znaczącego wpływu na końcowe stężenie etanolu, ale wpływa na tempo zużycia cukru i produktywność etanolu w czasie. Widoczna produkcja etanolu wzrasta wraz ze wzrostem liczby komórek od 1 · 10^4 do 1 · 10^7 komórek/ml, ale nie stwierdzono znaczącej zwiększonej produkcji etanolu (10^7 i 10^8 komórek/ml). To dlatego, że wzrost liczebności komórek w określonym zakresie skraca czas fermentacji, komórki szybko rosną i bezpośrednio zużywają cukry do produkcji etanolu.

Technologia stosowania komórek unieruchomionych na fazie stałej jest powszechnie stosowana w procesie fermentacji etanolu. Ma ona następujące zalety:

1. 1) większa biomasa komórek w porównaniu do biomasy wolnych komórek w objętości reaktora;

2. 2) biomasę drożdży łatwiej oddzielić od płynu fermentacyjnego;

3. 3) wyższe tempo konwersji substratu;

4. 4) mniejsze hamowanie procesu przez produkty fermentacji;

5. 5) krótszy czas reakcji;

6. 6) kontrola podziału komórek.

Aktywność komórek unieruchomionych zależy od czynników takich jak:

1. 1) właściwości powierzchni nośnika;

2. 2) wielkość porów;

3. 3) zawartość wody;

4. 4) hydrofilowość.

Komórki można unieruchomić różnymi metodami, takimi jak adsorpcja, sieciowanie, kapsułkowanie i uwięzienie w sieci fazy stałej. Uwięzienie biomasy osiąga się przez polimeryzację wodnego roztworu akryloamidu, w którym są zawieszone mikroorganizmy. Metoda ta pozwala uniknąć uwalniania komórek, jednocześnie umożliwiając dyfuzję substratów i produktów. Uwięzienie biomasy skutkuje wysoką wydajnością produkcji etanolu. Jest to metoda powszechnie stosowana ze względu na prostotę, nietoksyczność i dobre właściwości mechaniczne. Najczęściej unieruchomienie komórek drobnoustrojów polega na uwięzieniu ich w żelu. Używane żele mają formę kulistych koralików o średnicy 0,3–5 mm. Jednakże żel ma ograniczoną stabilność mechaniczną. Może być łatwo uszkodzony przez wzrost komórek drobnoustrojów i produkcję ditlenku węgla. Obecność fosforanów osłabia trwałość żelu utworzonego przez alginian wapnia. Innym sposobem unieruchamiania komórek jest adsorpcja. Jest to sposób bardzo popularny prosty, tani i szybki. Komórki utrzymują się na powierzchni materiału w wyniku działania sił elektrostatycznych, takich jak siły van der Waalsa, wiązania jonowe, mostki wodorowe lub oddziaływania kowalencyjne. Użyty materiał pomocniczy musi mieć wysokie powinowactwo, aby szczep drożdży był oporny na warunki środowiskowe obecne w bioreaktorze. Inną powszechnie stosowaną metodą unieruchamiania komórek jest enkapsulacja, która polega na zamykaniu komórek w cienkiej półprzepuszczalnej membranie. Komórki mogą swobodnie poruszać się w płynnym wnętrzu rdzenia wnętrza kapsułki ograniczonego przez zewnętrzną membranę. W procesie fermentacji wymiary molekularne mikrokapsułek mogą ograniczać szybkość wzrostu komórek, pobieranie składników odżywczych i usuwanie produktów. Metoda kapsułkowania ma kilka zalet takich jak stabilność mechaniczna i chemiczna systemu membranowego, możliwość wysokiego obciążenia i regulacji reakcji fermentacji przez selektywną dyfuzję substratu i produktów. Istnieje wiele rodzajów materiałów pomocniczych, które są stosowane do unieruchamiania komórek drożdży, np. alginian wapnia, wytłoki trzciny cukrowej, delignifikowane materiały celulozowe, skórka pomarańcza, zużyte ziarna, kolby kukurydzy, karagenian, bloczki drewna, porowata celuloza, zeolit i wytłoki z sorgo. Stosowane materiały muszą zapewnić żywotność komórek i odpowiednią przepuszczalność w celu umożliwienia dyfuzji tlenu, niezbędnych składników odżywczych, produktów metabolicznych i wydzielanych produktów w sieci polimerowej. Istnieją dwa rodzaje polimerów używanych jako nośniki do immobilizacji drożdży – naturalne lub syntetyczne. Polimery naturalne są czyste, tanie i nie są zanieczyszczone produktami reakcji chemicznych. Polimery syntetyczne mają wysoką stabilność chemiczną, biologiczną i mechaniczną, są odporne na ścieranie, przepuszczalne dla odczynników i mają dużą powierzchnię, pojemność i porowatość.

Większość procesów fermentacji z wykorzystaniem Saccharomyces cerevisiae przeprowadza się w temp. 30°C, a z użyciem Kluyveromyces marxianus – w temp. 42°C. Idealna temperatura do produkcji bioetanolu zależy od szczepu drożdży. Produkcję bioetanolu prowadzi się w środowisku o pH 4,5–5,5 i różnym stężeniu cukrów. Czas trwania fermentacji wynosi zazwyczaj 24–72 godz. przy rotacji 120–150 obr./min. Do produkcji etanolu stosuje się inoculum w stężeniu 5% i 10%. W tych warunkach można uzyskać najwyższe stężenie etanolu 128,5 g/l z wydajnością 4,76 g/(l · godz.). Jednak produkcja etanolu z użyciem wolnych komórek drożdży w skali przemysłowej jest nadal nieefektywna ze względu na wysoki koszt recyrkulacji komórek, duże ryzyko zanieczyszczenia, ograniczenie stopnia rozcieńczenia i podatność na zmiany środowiskowe.

9.2.5. Surowce stosowane do mikrobiologicznej produkcji alkoholi

9.2.5.1. Surowce bezpośrednio fermentowalne do etanolu

Podłoża fermentacyjne do produkcji etanolu to pewne tanie surowce w prawie czystej postaci, surowce odpadowe węglowodanowe oraz odpady z produkcji drewna (lignoceluloza).

Proste surowce na bazie cukru, surowa glukoza lub surowa sacharoza oraz surowce, które nie nadają się do spożycia – buraki cukrowe, melasa, owoce, soki owocowe, słodki sok sorgo, sok z trzciny cukrowej, serwatka, ścieki zawierające znaczne ilości prostych cukrów lub ścieki wzbogacone cukrami – mogą być wykorzystywane jako jedyne substraty przez szczepy mikrobiologiczne produkujące etanol. Surowcem powszechnie stosowanym do produkcji etanolu metodą fermentacji alkoholowej jest melasa – produkt odpadowy przemysłu cukrowniczego. Istnieją różne rodzaje melasy – zawierające około 45–50%wag. cukrów ulegających fermentacji i 50–55% związków organicznych i nieorganicznych. Podłoże fermentacyjne powinno zawierać odpowiednie stężenie melasy, aby uniknąć zbyt wysokiego ciśnienia osmotycznego. Po rozcieńczeniu wodą, regulacji pH, sterylizacji i dodaniu inoculum (drożdże lub bakterie) rozpoczyna się proces fermentacji. Zamiast melasy do podłoża fermentacyjnego można stosować kwas glukonowy, kwas cytrynowy, fruktooligosacharydy, pullulan, kwas bursztynowy, olej i erytromycynę. Olej dodaje się jako środek przeciwpienny, a antybiotyk przeciwko zakażeniom przez bakterie i grzyby. Inną ważną kategorią podłoża są surowce odpadowe z tłoczni oliwy (OMW). Jako surowce do produkcji etanolu mogą być stosowane OMW wzbogacane w cukry. Są one uważane za odpady ciekłe trudno degradowalne, ponieważ zawierają do 10 g/l związków fenolowych oraz pewne ilości cukrów, głównie glukozę w ilości 70 g/l.

Ostatnio zainteresowano się bakterią Zymomonas mobilis produkującą etanol. Zrekombinowany Zymomonas mobilis zdolny do fermentacji cukrów pentozowych jest uważany za ważną alternatywę dla rekombinowanego szczepu Escherichia coli do syntezy biopaliw z etanolu pozyskanego z odpadów rolniczych i leśnych. Wysoka specyficzna szybkość pobierania cukru przez Zymomonas mobilis i jego stosunkowo mały rozmiar genomu (ułatwiający manipulację genetyczną) sprawia, że jest idealnym kandydatem do wytwarzania różnych metabolitów. Zymomonas mobilis to bakteria o interesującej fizjologii. Klasyczne przejawy zjawiska wzrostu komórek niezwiązanego z produkcją etanolu oznaczają, że tempo katabolizmu tej bakterii znacznie przekracza wymagania jej anabolizmu. Sieć centralnego metabolizmu Zymomonas mobilis jest prostsza niż większości modelowych mikroorganizmów, w tym Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae. Zymomonas mobilis ma skrócony cykl Krebsa, który służy tylko do celów biosyntetycznych, i nie ma cyklu glioksalowego. Również szlak pentozofosforanowy ma niekompletny, pozbawiony aktywności transaldolaz. Prawdziwy „szkielet” metabolizmu Zymomonas mobilis tworzą wysoce aktywny szlak glikolityczny Entnera–Doudoroffa wraz z dekarboksylazą pirogronianową i dwoma izoenzymami dehydrogenazy alkoholowej. Ponadto bakteria ta posiada konstytutywny łańcuch oddechowy. Przyczyna niskiej wydajności sprzęgania utleniającej fosforylacji w Zymomonas mobilis nie jest jasna. Aktywny, ale energetycznie nieefektywny transport elektronów może być zaletą w równoważeniu reakcji redoks podczas syntezy bardziej utlenionych produktów, zwłaszcza że u tej bakterii zarówno NADH, jak i NADPH mogą służyć jako oddechowe donory elektronów. Należy zauważyć, że centralny metabolizm i katabolizm zazwyczaj stanowią główne cele inżynierii metabolicznej w biotechnologii biopaliw i podstawowych substancji chemicznych. Rekonstrukcja obejmuje 55 reakcji centralnych szlaków metabolicznych i 21 reakcji transbłonowych.

Skrobia

Skrobia to obfity i ważny substrat zapasowy produkowany przez rośliny. Występuje w ziemniakach, ziarnach zbóż i nasionach wielu innych roślin w postaci ziaren widocznych pod mikroskopem. Składa się z polimerów amylozy i amylopektyny. Stosunek tych dwóch składników jest zasadniczą cechą poszczególnych źródeł skrobi (pewne odmiany kukurydzy i grochu zawierają amylozę w ilości ponad 50%). Cząsteczki glukozy połączone głównie w liniowe łańcuchy wiązaniami α-1,4-β-glikozydowymi tworzą polimer zwany amylozą, podczas gdy amylopektyna jest silnie rozgałęzionym polimerem glukozy w punkcie rozgałęzienia wiązań α-1,6. Skrobia najpierw musi zostać przekształcona w glukozę (scukrzanie), która będzie substratem pokarmowym w procesie fermentacji etanolowej prowadzonej przez Saccharomyces spp. i Zymomonas mobilis. Skrobia jest hydrolizowana przez dwa enzymy – najpierw przez amylazy, które katalizują rozkład skrobi do maltozy lub glukozy, a następnie przez egzoamylazę i glukoamylazę, które hydrolizują łańcuchy amylozy i amylopektyny do glukozy. Znane są różne rodzaje amylaz, najważniejsze nich to: α-amylaza zaliczana do endoamylaz oraz α-amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz. Skrobia jest najpierw hydrolizowana przez α-amylazę, endoamylazę, która atakuje wiązania α-1,4, następnie jest gotowana w wysokiej temperaturze i poddawana hydrolizie przez egzoamylazę, glukoamylazę, które hydrolizują łańcuchy amylozy i amylopektyny z wytworzeniem glukozy. Mikroorganizmy ogólnie lepiej metabolizują skrobię scukrzoną, a scukrzanie metodą hydrolizy wymaga dużej ilości energii, dlatego badania koncentrują się na poszukiwaniu enzymów, głównie produkowanych przez grzyby, które są zdolne do degradacji surowców skrobiowych.

Idealne byłoby ulepszenie szczepu produkcyjnego metodą inżynierii genetycznej polegające na wstawianiu genów kodujących syntezę enzymów zdolnych do rozbijania skrobi (α-amylazy, izoamylazy, amyloglukozydazy) w genomie mikroorganizmów prowadzących fermentację alkoholową, takich jak Zymomonas mobilis i Saccharomyces spp., aby ten sam mikroorganizm wydzielał enzymy hydrolizujące skrobię i produkujące etanol. Produkcja przemysłowego etanolu odbywa się z zastosowaniem materiałów skrobiowych, takich jak kukurydza, pszenica, ziemniaki, korzenie manioku. W USA w większości zakładów produkujących bioetanol wykorzystuje się hydrolizat mąki kukurydzianej i Saccharomyces cerevisiae ATCC 26602 (ponad 75 g/l etanolu).

Tabela 9.4. Wybrane przykłady maksymalnej produkcji bioetanolu przez różne szczepy stosowane w różnych konfiguracjach fermentacji z zastosowaniem różnych substratów

Szczepy

Źródło węgla

Stężenie substratu (g/l)

Wydajność produkcji etanolu (g/l)

Lit.

Saccharomyces cerevisiae

drożdże piekarnicze

melasa

150–300

53

[1]

drożdże piekarnicze

sacharoza

220

96,7

[2]

CMI237

cukier

160

70

[3]

CBS8066

glukoza

100*

147

[4]

24860

glukoza

150

48

[5]

ATCC 24858

hydrolizat mąki

150

76

[6]

MAK-1

moszcz winogronowy

250

106,1–119,2

[7]

Drożdże piekarnicze

słodkie wytłoki sorgo

–

41,43

[8]

Saccharomyces cerevisiae

hydrolizat cassava

100–200

38–48

[9]

Zymomonas mobilis

ZM4&ZMI_2

glukoza

100-200

47,6–78

[10]

ATCC29191

hydrolizat skrobi

120

50

[11]

ZM4

hydrolizat skrobi

80–110

39–54

[12]

ATCC 29191

sacharoza

200

55,8

[13]

NS-7

glukoza

150

73,2

[14]

NRRL-B-14023

glukoza

100

40–55

[15]

* hodowla okresowa z zasilaniem;

[1] Roukas 1996. J. Food. Eng., 27: 87–96. [2] Caylak i Sukan 1998. Turk. J. Chem., 22: 351–360. [3] Navarro i wsp. 2000. Waste Management, 20: 581–585. [4]Alfenore i wsp. 2004. Appl. Microbiol. Biotechnol., 63: 537–542. [5] Najafpour i wsp. 2004. Bioresour. Technol., 92: 251–260. [6] Wang i wsp. 2007. Proc. Safety Environ. Prot., 85: 404–412. [7] Sarris i wsp. 2009. Eng. Life Sci., 9: 29–37. [8] Matsakas i wsp. 2013. Bioresour. Technol., 127: 202–208. [9] Betiku i wsp. 2014. Energ. Sourc. A, 36: 1990–1998. [10]Sreekumar i wsp. 1991. Biotechnol. Lett., 13: 365–370. [11 Weuster-Botz i wsp. 1993. Appl. Microbiol. Biotechnol., 39: 685–690. [12] Davis i wsp. 2006. Biomass Bioenerg., 30: 809–814. [13] Cazetta i wsp. 2007. Bioresour. Technol., 98: 2824–2828. [14] Tao i wsp. 2005. Proc. Biochem., 40: 183–187. [15] Ruanglek i wsp. 2006. Proc. Biochem., 41: 1432–1437.

Wydajność produkcji etanolu z niesterylizowanej melasy buraczanej z użyciem Saccharomyces cerevisiae w hodowli półciągłej wynosi 53 g/l z plonem 0,31 g/g. Innym przykładem jest produkcja etanolu w bioreaktorze typu złoże zatopione wieżowe z zastosowaniem szczepu Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 i odpadowej melasy jako substratu. Wyniki wydajności produkcji etanolu w hodowli niesterylnej wynoszą 51,4 g/l z plonem 0,47 g/g. W tabeli 9.4 przedstawiono wybrane wydajności procesu fermentacji alkoholowej z zastosowaniem różnych surowców węgla organicznego i różnych szczepów należących do dwóch gatunków Saccharomyces cerevisiae i Zymomonas mobilis.

Obecnie produkcja etanolu opiera się na wykorzystaniu gatunków drożdży z rodzaju Saccharomyces i Kluyveromyces. W warunkach beztlenowych każdy gram glukozy może teoretycznie dawać 0,51 g etanolu. W praktyce jednak wydajność etanolu zawiera się w granicach 90–95%, a na skalę przemysłową 86–90% wartość teoretycznej. Niektóre składniki odżywcze są wymagane do syntezy biomasy komórek. Zazwyczaj około 4 lub 5% całkowitego substratu jest przeznaczona do produkcji glicerolu i bursztynianu. Podłoże do produkcji etanolu wymaga niewielkiej ilości O_2, P, S, K, Mg, Mn, Co, Cu, Zn oraz organicznych czynników wzrostu, takich jak aminokwasy, kwasy nukleinowe i witaminy. Drożdże są bardzo wrażliwe na wyprodukowany etanol. Na przykład obecność 1 lub 2% (wag./obj.) etanolu zmniejsza wzrost komórek i 10% (wag./obj.) i hamuje syntezę etanolu. Podczas procesu fermentacji powstają oleje fuzlowe z α-ketokwasów pochodzących z dezaminacji aminokwasów. Głównym składnikiem oleju fuzlowego jest alkohol izoamylowy (40–60%). Wraz z optycznie czynnym alkoholem amylowym i alkoholem izobutylowym stanowi on 15–20% wszystkich fuzli. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność oleju fuzlowego wynosi 20 l/m^3 wytworzonego etanolu. Oleje fuzlowe mogą pozostać w produkcie końcowym jako składnik etanolu paliwowego.

Ksyloza

Cukier pentozowy D-ksyloza stanowi około 1/3 całkowitej ilości cukrów węglowodanowych w biomasie lignocelulozowej. Fermentację ksylozy z wytworzeniem etanolu mogą prowadzić drożdże należące do rodzaju Brettanomyces, Candida, Kluyveromyces, Clavispora, Pachysolen, Pichia i Schizosaccharomyces. Najbardziej zdolne do tego są gatunki typu dzikiego Candida shehatae, Pachysolen tannophilus, Kluyveromyces marxianus i Pichia stipitis. Inne, należące do rodzaju Fusarium, Monilia, Mucor, Neurospora, Paecilomyces, Polyporus i Rhizopus, mogą uczestniczyć w degradacji materiałów lignocelulozowych przy udziale enzymów hydrolitycznych produkujących etanol. Bakterie należące do Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacteroides, Erwinia i Klebsiella (szczepy mezofilne) oraz Clostridium i Thermoanaerobacter (szczepu termofilne) są także zdolne do fermentacji ksylozy z produkcją etanolu. Główne szlaki metaboliczne fermentacji ksylozy są podobne dla bakterii, drożdży i grzybów strzępkowych. Wytwarzanie etanolu z ksylozy odbywa się szlakmi PP i EMP. Po przetransportowaniu do komórek ksyloza musi zostać przekształcona do ksylulozy, a następnie poddana fosforylacji do ksylulozo-5-fosforanu przed wejściem w szlak PP, dalej ksylulozo-5-fosforan jest metabolizowany do aldehydu 3-fosfo-glicerynowego i fruktozo-6-fosforanu, a następnie te związki są przekształcane szlakiem EMP w pirogronian, który ostatecznie jest przekształcany w etanol. Oprócz szlaku PP, ksyloza może być również metabolizowana w reakcji fosfoketolazy, która przekształca ksylulozo-5-fosforan w aldehyd 3-fosofo-glicerynowy i acetylofosforan. Aldehyd-3-fosfo-glicerynowy wchodzi w reakcję glikolizy, podczas gdy fosforan acetylu ulega konwersji do octanu. Maksymalna teoretyczna wydajność produkcji etanolu na jednostkę zużytej ksylozy wynosi 0,51 g/g.

Glicerol

Glicerolmoże być stosowany do produkcji etanolu. Maksymalne stężenia etanolu uzyskane przy zastosowaniu glicerolu są z pewnością niższe niż uzyskane w typowych fermentacjach heksoz prowadzonych przez Saccharomyces spp. i Zymomonas mobilis, ale ze względu na obfitość glicerolu jako surowca, jego konwersja do etanolu budzi zainteresowanie. Wydajności produkcji etanolu przez różne gatunki bakterii i drożdży w podłożach zawierających glicerol jako jedyne źródło węgla są przedstawione w tabeli 9.5.

Tabela 9.5. Produkcja etanolu z glicerolu przez wybrane szczepy bakterii i drożdży

Mikroorganizm

Wydajność (g/l)

Plon (g/g)

Tempo produkcji

(g/(l · godz.))

Lit.

Klebsiella oxytoca FMCC-197

25,2

0,20

0,29

[1]

Enterobacter aerogenes Hu-101

10

0,40

0,83

[2]

Klebsiella pneumoniae BLh-1

6,1

0,14

–

[3]

Klebsiella pneumoniae GEM167

21,5

–

0,91

[4]

Escherichia coli

19,8

0,47

0,20

[5]

Citrobacter freundii FMCC-207

14,5

0,45

0,66

[6]

Kluyvera cryocrescens S26

27

0,80

0,61

[7]

Pachysolen tannophilus CBS4044

28,1

0,06

–

[8]

[1] Metsoviti i wsp. 2012. Process Biochem., 47: 1872–1882. [2] Ito i wsp. 2005. J. Biosci. Bioeng., 100: 260–265. [3] Rossi i wsp. 2012. Renew. Energy, 39: 223–227. [4] Oh i wsp. 2011. Bioresour. Technol., 102: 3918–3922. [5] Cintolesi i wsp. 2012. Biotechnol. Bioeng.,109: 187–198. [6] Metsoviti i wsp. 2012. Eng. Life Sci., 12: 57–68. [7] Choi i wsp. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol., 89: 1255–1264. [8] Liu i wsp. 2012. Bioresour. Technol., 104: 579–586.

9.2.5.2. Biomasa trudno fermentowalna

Do biomasy trudno fermentowalnej należą odpady drzewne, wióry i trociny, resztki pożniwne, trawa, słoma, bawełna, słoma rzepakowa, łodygi słonecznika i łupiny orzecha. Są to alternatywne odnawialne i dostępne na całym świecie źródła energii. Lignoceluloza jest najbardziej złożonym substratem organicznym tych odpadów. Jest to mieszanina ligniny (niefermentowalna frakcja fenylopropanowa), polimerów węglowodanowych celulozy (polimer glukozy) i hemicelulozy (heteropolimer cukrów) połączone ze sobą wiązaniami wodorowymi.

Proces biologiczny przetwarzania biomasy lignocelulozowej w etanol składa się z trzech etapów:

1. 1) delignifikacji, która uwalnia celulozę i hemicelulozę od ligniny;

2. 2) depolimeryzację polimerów węglowodanowych;

3. 3) fermentację wolnych heksoz i pentoz.

Biomasa lignocelulozowa musi być poddana obróbce wstępnej w celu zwiększenia powierzchni i porowatości materiału lignocelulozowego, aby zmniejszyć krystaliczność łańcuchów celulozy, a w końcu ją udostępnić do hydrolizy. Najważniejszym i najbardziej kosztownym wyzwaniem jest obróbka wstępna lignocelulozy, która wpływa na cały proces produkcji etanolu. Stosowane są różne metody wstępnej obróbki materiału lignocelulozowego, które można podzielić na cztery kategorie: fizyczne, fizykochemiczne, chemiczne i biologiczne. Są to:

1. 1) piroliza, która jest fizycznym procesem endotermicznym obejmującym obróbkę materiału w temperaturach wyższych niż 300°C celem szybkiego rozkładu celulozy i pozyskania produktów gazowych;

2. 2) łagodna hydroliza kwasowa w wyniku przekształcenia pozostałości celulozy pirolitycznej;

3. 3) redukcja wielkości mechanicznych, zwykle poprzez mokre lub suche rozdrabnianie drewna, wibracyjne mielenie kulowe, frezowanie kompresyjne;

4. 4) proces zmniejszania krystaliczności celulozy;

5. 5) eksplozja parowa (wybuchowa dekompresja materiałów lub autohydroliza), wstępna obróbka fizykochemiczna, która jest powszechnie stosowana wzgledem biomasy lignocelulozowej i czyni ją bardziej dostępną dla ataku celulaz;

6. 6) alkaliczna termiczna metoda fizykochemiczna AFEX, polegająca na poddaniu drewna działaniu ciekłego amoniaku pod ciśnieniem w wysokiej temperaturze przez pewien czas, a potem gwałtownym uwolnieniu ciśnienia; nie powstają przy tym żadne inhibitory i nie jest wymagane przemywanie wodą degradowanego materiału drzewnego, a amoniak podlega recyklingowi;

7. 7) eksplozja przy udziale ditlenku węgla, bardziej opłacalna niż AFEX, oparta na tworzeniu kwasu węglowego, prowadzącego do zwiększenia procesu hydrolizy lignocelulozy;

8. 8) ozonoliza, która koncentruje się głównie na degradacji ligniny (usuwaniu ligniny) i hemicelulozy, nie działa na celulozę i nie tworzy inhibitorów;

9. 9) hydroliza kwaśna z zastosowaniem stężonych i rozcieńczonych kwasów mineralnych takich jak H_2SO_4 i HCl; jest mniej dotkliwa i poprawia szybkość reakcji; tworzą się inhibitory wzrostu mikroorganizmów takie jak kwas octowy, furfural i 5-hydroksymetylofurfural, które utrudniają metabolizm węgla, wpływa na aktywność szeregu enzymów jak heksokinaza, izomeraza glukozo-fosforanowa, dehydrogenaza 3-fosfo-aldehydu glicerynowego, dehydrogenaza 6-fosfoglukozowa,

10. 10) hydroliza alkaliczna trawiąca matrycę ligniny uwalnia celulozę i hemicelulozę, która jest podatna na działanie enzymatyczne; rozcieńczony roztwór NaOH powoduje zwiększenie powierzchni wewnętrznej materiału i jednoczesny spadek stopnia krystaliczności i polimeryzacji polimerów węglowodanowych, jak również rozerwanie struktury ligniny i rozdzielenie powiązań strukturalnych między węglowodanami a ligniną; zastosowanie alkalicznych substancji chemicznych poprawia strawność celulozy;

11. 11) oksydatywna delignifikacja lignocelulozy to proces, w którym jest ona traktowana nadtlenkiem wodoru (H_2O_2) katalizującą biodegradację ligniny; rozpuszczalniki organiczne powodują chemiczny rozkład wewnętrznych wiązań ligniny i hemicelulozy; są one poddawane recyklingowi;

12. 12) biologiczna hydroliza, w której grzyby są używane do degradacji hemicelulozy i ligniny zawartych w materiałach lignocelulozowych; jedne z nich atakują celulozę (brunatna zgnilizna), drugie celulozę i ligninę (zgnilizna biała); niezbędne enzymy wydzielane i biorące udział w biodegradacji związków ligninowych różnych form materiałów lignocelulozowych to lakaza, peroksydaza ligninowa oraz peroksydaza niezależna od manganu i peroksydaza zależna od manganu; proces hydrolizy biologicznej przebiega z bardzo niską wydajnością (tab. 9.6).

Generalnie surowce do produkcji etanolu dzieli się na dwie grupy: cukry proste i dwucukry, jak glukoza, fruktoza, ksyloza i sacharoza, oraz polisacharydy, jak skrobia, glikogen i celuloza. Pierwsza grupa jest bezpośrednio poddawana fermentacji alkoholowej, druga jest hydrolizowana do cukrów prostych, a następnie poddawana fermentacji. Cukry proste występują w warzywach, owocach, trzcinie cukrowej, melasie i odpadach przemysłu spożywczego. Polisacharydy występują w odpadach z produkcji ryżu, kukurydzy, pszenicy, żyta, owsa, w ziemniakach, topinamburze, manioku, cykorii i odpadach lignocelulozy. Melasa zaś jest odpadem powstającym w procesie produkcji cukru z buraków cukrowych. Jest dobrym surowcem do produkcji etanolu, ponieważ zawiera dużo węglowodanów (ponad 50%). W zależności od stosowanego surowca uzyskuje się różne ilości etanolu. Z tony ryżu uzyskuje się 350–500 l etanolu, z tony kukurydzy – 360–400 l, z tony pszenicy – 350–390 l, z tony żyta – 310–370 l, z tony melasy – 350 l, z tony owsa – 240 l, z tony ziemniaków – 80–120 l, a z tony jabłek – 35−60 l etanolu.

Tabela 9.6. Mikroorganizmy stosowane w hydrolizie biomasy lignocelulozowej

Gatunek grzyba stosowany do hydrolizy lignocelulozy

Materiał hydrolizowany

Lit.

Aspergillus terreus, Aspergillus awamori,

Trichoderma reesei, Trichoderma viride

odpady trzciny cukrowej

[1], [2]

Ceriporiopsis subvermispora

biomasa kukurydzy

[1], [3], [4]

Echinodontium taxodii

drewno miękkie

drewno twarde

biomasa kukurydzy

[1], [5]

[1], [5]

Irpex lacteus

biomasa kukurydzy

[1], [5], [7]

Phanerochaete chrysosporium

słoma pszeniczna

słoma ryżowa

łodygi bawełny

[1], [8]

[1], [9]

[1], [7]

Pleurotus ostreatus

biomasa kukurydzy

słoma ryżowa

[5]

[1]

Pycnoporus cinnabarinus

słoma pszeniczna

[1], [8]

Pycnoporus sanguineus

słoma zbożowa

[1], [10]

Fusarium concolor

słoma pszeniczna

[1], [6]

[1] Aditiya i wsp. 2016. Renew. Sustain. Energy Rev., 66: 631–653. [2] Singh i wsp. 2008. World J. Microbiol. Biotechnol., 24: 667–673. [3] Wan i wsp. 2010. Bioresour. Technol., 101: 6398–6403. [4] Wan i wsp. 2010. Enzyme Microb. Technol., 47: 31–36. [5] Yu i wsp. 2009. Bioresour. Technol., 100: 5170– 5175. [6] Yang i wsp. 2010. Int. Biodeterior. Biodegradation. 64: 119–123. [7] Kuhar i wsp. 2008. Can. J. Microbiol., 54: 305–313. [8] Bak i wsp. 2009. Biotechnol. Bioeng., 104: 471–482. [9] Shi i wsp. 2008. Bioresour. Technol., 99: 6556–6564. [10] Li i wsp. 2008. Lett. Appl. Microbiol., 47: 415–420.

Proces fermentacji biomasy w skali technicznej

Procesy, w których do produkcji etanolu są wykorzystywane polimeryczne źródła węgla, można prowadzić dwoma sposobami. Jednak zawsze obróbka wstępna fizyczna lub fizykochemiczna powinna być wykonana przed scukrzaniem enzymatycznym.

Po wstępnej obróbce fizycznej, fizykochemicznej lub chemicznej można przeprowadzić:

1. 1) hydrolizę enzymatyczną surowców i następczo fermentację (SHF);

2. 2) jednoczesne scukrzanie i fermentację (SSF);

3. 3) jednoczesne scukrzanie i kofermentację (SSCF);

4. 4) bioproces skonsolidowany (CBP).

Oddzielna hydroliza i fermentacja (SHF) to proces przebiegający w dwóch etapach, w których oba procesy (hydroliza i fermentacja) występują oddzielnie. W pierwszym etapie biomasa lignocelulozowa jest traktowana enzymami hydrolitycznymi, w wyniku czego uwalniają się glukoza i ksyloza. Produkty hydrolizy surowców celulozowych (glukoza i krótkie łańcuchy z hydrolizy celulozy) silnie hamują celulazę. W drugim etapie uwolnione cukry (glukoza i ksyloza) są fermentowane do etanolu. Hydroliza enzymatyczna i fermentacja w tym procesie przebiegają w optymalnych warunkach. Do korzyści z tego procesu można zaliczyć krótki czas zatrzymania, niski koszt chemikaliów i prosty system wyposażenia, który zachęca do jego zastosowania na dużą skalę. Wadą jest kumulacja cukrów, która hamuje aktywność enzymów hydrolitycznych.

Jednoczesne scukrzanie i fermentacja (SSF) – proces scukrzania biomasy oraz fermentacja cukru zachodzą w pojedynczym reaktorze. Zaletą SSF jest to, że cukry ekstrahowane z biomasy szybko przekształcają się w etanol dzięki aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. W rezultacie zapobiegają gromadzeniu się cukrów, które mają działanie hamujące na aktywność hydrolityczną enzymów w podłożu. W tym procesie obecność etanolu w podłożu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. W SSF uzyskuje się wyższą wydajność etanolu w porównaniu z SHF. Jednak większość użytych mikroorganizmów nie może wykorzystać ksylozy, produktu hydrolizy hemicelulozy obecnej w surowcach z lignocelulozą. SSF jest dobrym sposobem wydajnej produkcji etanolu, ponieważ ma niewiele operacji jednostkowych. Wadą tej metody jest trudność w optymalizacji parametrów procesu, ponieważ w tym samym bioreaktorze są obecne jednocześnie mikroorganizmy i enzymy. Enzymy celulolityczne stosowane do hydrolizy enzymatycznej zachowują optymalną aktywność w temp. 50°C, a dla mikroorganizmów optymalne warunki produkcji etanolu są w temp. 28–37°C.

Jednoczesne scukrzanie i kofermentacja (SSCF) obejmuje asymilację wszystkich rodzajów cukrów przez mikroorganizmy uwolnione w procesie hydrolizy lignocelulozowej. Zarówno pentozy, jak i heksozy są fermentowane przez mieszane szczepy różnych gatunków drożdży. SSCF obejmuje hydrolizę i kofermentację heksoz i pentoz w jednym bioreaktorze. Problemem jest szybsza konwersja heksoz do etanolu, ponieważ mikroorganizmy, które wykorzystują heksozy rosną szybciej niż mikroorganizmy, które wykorzystują pentozy. Odmianą tej metody jest wykorzystanie do produkcji etanolu pojedynczego mikroorganizmu, który ma zdolność asymilacji heksoz i pentoz. Inżynieria genetyczna jest nieużyteczna w opracowywaniu mikroorganizmów zdolnych do jednoczesnego wytwarzania etanolu przez fermentację cukrów pięciu i sześciu atomów węgla. Krótszy czas operacji, niski koszt, niskie ryzyko zanieczyszczenia i mniej efektów hamujących to zalety tego procesu.

Bioproces skonsolidowany (CBP) – wydzielanie enzymów hydrolitycznych i wytwarzanie etanolu przez ten sam mikroorganizm – to bezpośrednia fermentacja biomasy do etanolu za pomocą kofermentacji z produkcją heksoz/pentoz przez stosowne mikroorganizmy. Generalnie towarzyszy temu niższa produkcja etanolu niż w typowej konwersji cukrów prostych w etanol przez Saccharomyces cerevisiae. Istnieją mikroorganizmy zmodyfikowane genetycznie w celu zwiększenia produkcji etanolu i tolerancji na etanol w wyższych stężeniach. Nie ma pojedynczego komercyjnie dostępnego skonsolidowanego organizmu (CBP). Do prowadzenia procesu CBP można więc wykorzystać konsorcjum zamiast pojedynczy konstrukt. Konsorcjum powinno się składać się ze szczepów wytwarzających enzymy zdolne do hydrolizy dostępnej biomasy roślinnej i dwóch innych różnych szczepów, które są zdolne do fermentacji pentoz i heksoz do etanolu. Zaproponowane konsorcjum złożone z Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae i Scheffersomyces stipitis. Trichoderma reesei wydziela enzymy celulolityczne hydrolizujące celulozę, Saccharomyces cerevisiae zdolne do fermentacji heksozy oraz Scheffersomyces stipitis fermentujący pentozy. Wszystkie trzy grzyby obecne w biofilmie w reaktorze membranowym przekształcają biomasę lignocelulozową w etanol. To podejście wydaje się rozsądne, ale główną przeszkodą w utrzymaniu konsorcjum jest dopasowanie optymalnych warunków wzrostu i rozwoju dla każdego szczepu.

9.3.Mikrobiologiczna produkcja glicerolu

Mikrobiologiczna produkcja glicerolu jest znana od 150 lat. W Niemczech podczas I wojny światowej produkowano w drodze fermentacji duże ilości glicerolu koniecznego do produkcji materiałów wybuchowych. Produkcję glicerolu prowadzono według protokołu opracowanego przez W. Connsteina i K. Ludecke’a, którzy odkryli, że dodanie wodorosiarczynu sodu do bioreaktora, w którym zachodzi fermentacja alkoholowa prowadzona przez drożdże na podłożu zawierającym cukier buraczany sprawia, że następuje synteza glicerolu. W 1919 r. Carl Neuberg i jego współpracownik J. Hirsh ujawnili mechanizm działania wodorosiarczynu, dzięki czemu można było zapobiec tworzeniu się alkoholu i przekierować proces w stronę nadprodukcji glicerolu. Przez pewien czas w Niemczech 24 fabryki produkowały glicerol przeznaczony do produkcji materiałów wybuchowych w ilości 12 000 t/rok. Po wojnie wykorzystanie mikroorganizmów do produkcji glicerolu zmniejszyło się, ponieważ nie było w stanie konkurować z syntezą chemiczną z surowców petrochemicznych z powodu niskiej wydajności i trudności z ekstrakcją i oczyszczaniem glicerolu ze składników podłoża hodowlanego. Obecnie glicerol jest dostępny w dużej ilości jako cenny produkt uboczny w produkcji biodiesla i hydrolizy tłuszczu. Obecnie produkcja glicerolu na drodze fermentacji stała się bardziej atrakcyjna, ponieważ cena propylenu wzrosła, a jego dostępność się zmniejszyła. Glicerol jest surowcem do produkcji różnych chemikaliów, leków, żywności, papierosów, kosmetyków, pasty do zębów, farb malarskich, celofanu, dynamitu i glicerynotrioctanu. Glicerol jako substrat dla mikroorganizmów jest wykorzystywany do mikrobiologicznej produkcji różnych związków organicznych jak 1,3-propanediolu, dihydroksyacetonu, kwasu bursztynowego, kwasu propionowego, etanolu, kwasu cytrynowego, pigmentów, polihydroksyalkanianów i biosurfaktantów.

Glicerol jest wytwarzany przez redukcję glikolitycznego związku pośredniego fosforanu dihydroksyacetonu do 3-fosforanu glicerolu (G3P), a następnie defosforylację G3P do glicerolu (rys. 9.2). Pierwszy etap tej konwersji jest katalizowany przez zależną od NAD dehydrogenazę 3-fosfoglicerynową (Gpd), która jest kodowana jako dwie izoformy przez geny GPD1 i GPD2. Ekspresja GPD1 wymagana do wzrostu przy wysokiej osmolarności jest indukowana przez stres hiperosmotyczny ścieżkę sygnałową HOG (High Osmolarity Glycerol). Z drugiej strony gen GPD2 jest niezbędny do produkcji glicerolu przy braku tlenu i uważa się, że pomaga utrzymać wewnątrzkomórkową równowagę potencjału redoks w komórce. Z dwóch enzymów kluczowa jest dehydrogenaza 3-fosfoglicerynowa kodowana przez gen Gpd1p podczas tworzenia glicerolu w Saccharomyces cerevisiae, a ważnymi metabolitami pośrednimi są 3-fosfo-glicerynian i fosforan dihydroksyacetonu. Warto dodać, że istnieje szlak z wykorzystaniem tych metabolitów pośrednich do syntezy fosfolipidów i glicerolipidów, a fosforan dihydroksyacetonu jest również prekursorem do syntezy aminokwasów.

Rys. 9.2. Biosynteza glicerolu przez Saccharomyces cerevisiae

Biosynteza glicerolu z fosforanu dihydroksyacetonu jest procesem dwuetapowym. Pierwszy krok, który jest katalizowany przez enzym Gpd, ogranicza szybkość wytwarzania glicerolu. Nadprodukcja glicerolu i przepływu węgla w kierunku produkcji glicerolu wiąże się ze zmniejszeniem produkcji CO_2 ze sfermentowanego cukru.

Znaczną nadprodukcję glicerolu z monosacharydów przez drożdże można uzyskać przez:

1. 1) utworzenie kompleksu między jonami aldehydu octowego i wodorosiarczynu, które opóźnia wytwarzanie etanolu i przywraca równowagę redoks przez syntezę glicerolu;

2. 2) utrzymanie wartości pH bliskiej 7,0 lub nieco wyższej dla szczepów drożdży;

3. 3) użycie drożdży osmotolerancyjnych.

W ostatnich latach w Chinach dokonano znacznych ulepszeń w produkcji glicerolu na skalę handlową przy użyciu drożdży osmotolerancyjnych. Do najwybitniejszych osiągnięć należą:

1. 1) izolacja nowych szczepów drożdży osmotolerancyjnych produkujących do 130 g/l glicerolu z plonem dochodzącym do 63% i produktywności do 32 g/(l · doba);

2. 2) uzyskanie wysokich wskaźników plonu glicerolu, produktywności i wydajności w podłożu hodowlanym, odpowiednio do 58%, 30 g/(l · doba) i 110–120 g/l, w zoptymalizowanym procesie fermentacji tlenowej na skalę przemysłową;

3. 3) opracowanie techniki destylacji z wydajnością glicerolu większą niż 90%.

Ponieważ metabolizm glicerolu u drożdży stał się lepiej zrozumiały, pojawiają się możliwości skonstruowania nowego nadprodukującego mikroorganizmu za pomocą inżynierii metabolicznej (tab. 9.7).

Tabela 9.7. Produkcja glicerolu przez wybrane szczepy drożdży w warunkach laboratoryjnych na podłożu z glukozą

Mikroorganizm

Glicerol (g/l)

Plon (%)

Produktywność

g/(l · doba)

Lit.

Saccharomyces cerevisiae

80

25

30

[1]

219

50

57,6

[2]

130

63

32

[3]

Saccharomyces szczep LORRE

260

47

29,8

[4]

Candida glycerinogenes

137

64,5

40,6

[5]

Candida magnoliae

80

32

15,6

[6]

Pichia furinosa

300

46

37,5

[7]

[1] Kalle i Naik. 1985. J. Ferment. Technol., 63: 411–414. [2] Overkamp i wsp. 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 2814–2821. [3] Wang i wsp. 2001. Biotechnol. Advances, 19: 201–223. [4] Gong i wsp. 2002. Appl. Biochem. Biotechnol., 84–86: 543–559. [5] Zhuge i wsp. 2001. Appl. Microbiol. Biotechnol., 55: 686–692. [6] Sahoo i Agarwal. 2001. Process Biochem., 36: 839–846. [7] Vijaikishore i Karanth. 1987. Biotechnol. Bioeng., 30: 325–328.

9.4.Fermentacja aceton–butanol–etanol (ABE)

Na początku XX w. młody chemik Chaim Weizmann – asystent prof. W.H. Perkina w Manchester University w Wielkiej Brytanii – odkrył, że niedobory kauczuku naturalnego można zastąpić alternatywnymi surowcami i/lub syntezą chemiczną kauczuku syntetycznego. Firma chemiczna Strange & Graham Ltd. (Londyn) zainteresowała się procesem przygotowania butadienu i izoprenu, które są składnikami budulcowymi sztucznego kauczuku powstającymi przez utlenianie n-butanolu lub alkoholu izoamylowego, otrzymywanych na drodze fermentacji cukrów. Do pracy nad tym projektem zatrudniono Perkina i Weizmanna. Ten wspólny projekt badawczy został zaniechany podczas I wojny światowej, ponieważ Wielka Brytania potrzebowała acetonu jako rozpuszczalnika do produkcji bezdymnego wybuchowego kordytu. Butanol i aceton zostały już zgłoszone jako produkty fermentacji przez Pasteura w 1861 r. (produkowane przez szczep Vibrion butyrique) i F. Schardingera w 1905 r. Weizmann wybrał bardziej produkcyjny szczep Clostridium acetobutylicum, który wytwarzał z pewną wydajnością aceton, butanol i etanol (ABE) z wykorzystaniem mąki zbożowej jako surowca do produkcji podłoży hodowlanych, i złożył wniosek patentowy w 1915 r., a przemysłową produkcję uruchomiono w 1916 r. Wskutek niemieckiej blokady Wielka Brytania wkrótce doświadczyła braku zboża i postanowiła przenieść zakłady produkcji rozpuszczalników do Kanady i Indii. Również US Air Service i British War Mission zakupiły destylarnie komercyjne i Majestic Whisky w Terre Haute, Indiana i zmodyfikowały je do produkcji acetonu z wykorzystaniem procesu Weizmanna. Między majem a listopadem 1918 r. wyprodukowano 400 tys. l acetonu i 800 tys. l n-butanolu jako produktu ubocznego. Nadwyżki n-butanolu stały się cenne w czasach prohibicji w USA (1920–1933), gdyż mogły zastąpić octan amylu w lakierach (do samochodów). Butanol również znalazł zastosowanie w produkcji rozpuszczalników, plastyfikatorów, farb i żywic. Od lat 30. ubiegłego wieku proces fermentacji butanolu został w znacznym stopniu zastąpiony przez jego produkcję petrochemiczną. Obecnie metoda fermentacji znów zyskuje zainteresowanie komercyjne. Po 1940 r. ciągłe zainteresowanie fermentacjami z produkcją rozpuszczalników doprowadziło do dalszego rozwoju fermentacji butanolowej.

Obecnie proces Weizmanna i jego nowoczesne pochodne ponownie zyskują zainteresowanie i znaczenie. Tym razem wyznacznikiem jest potrzeba zrównoważonego rozwoju – pragnienie powrotu do łatwo odnawialnych źródeł energii i unikanie w miarę możliwości toksycznych substancji chemicznych. Fermentacja butanolowa prowadzona przez mikroorganizmy trafia do nowoczesnych biorafinerii. Organiczne surowce odnawialne, które mogą pochodzić z biomasy lub odpadów, jak melasa, są przekształcane w procesie konwersji mikrobiologicznej w pożądany produkt. Bioproces jest bardzo często interesujący dla naukowców, z kolei cena wytwarzanej substancji chemicznej lub paliwa, która decyduje o powodzeniu lub niepowodzeniu danego podejścia, jest podyktowana głównie kosztami substratu. O produkcji butanolu na drodze mikrobiologicznej decydują koszty podłoża i oczyszczania produktu dla celów komercyjnych. Skrobia była historycznie substratem z wyboru (i nadal jest głównym substratem do produkcji bioetanolu poza krajami, które uprawiają trzcinę cukrową), a przejście na melasę jako tani produkt odpadowy pozwala na utrzymanie rentowności procesu. Od kiedy atrakcyjność melasy wzrosła, poszła w górę jej cena, znacząco przyczyniając się do zaniechania mikrobiologicznej fermentacji acetonu i butanolu. Obecnie lignoceluloza jest postrzegana jako obiecujące źródło węgla, gdyż jest w obfitości i nie konkuruje z produkcją żywności. Inny przykład to scukrzanie i fermentacja wstępnie obrobionej słomy kukurydzianej. Nowatorski jest system współhodowli rekombinowanej Escherichia coli zdolnej do biokonwersji hydrolizatu celulozy do cukrów prostych. Oczywiście rdzeniem procesu fermentacji aceton–butanol–etanol (ABE) jest mikrobiologia. Clostridia to naturalne mikroorganizmy prowadzące proces fermentacji ABE. Są bakteriami tworzącymi zarodniki, które mają znaczenie w przygotowywaniu inoculum do procesu fermentacji oraz w produkcji rozpuszczalników. Optymalna produkcja zależy od warunków wzrostu w podłożu hodowlanym, które jest buforowane przez wapń. Istotnym elementem procesu fermentacji jest tolerowanie wysokich stężeń rozpuszczalników przez organizmy produkujące. Jak się okazuje, wzrost tolerancji butanolu można osiągnąć przez nadekspresję dwóch reagujących na stres małych niekodujących RNA. Znaczenie takich RNA w świecie prokariotycznym dopiero niedawno zostało docenione. Odkrycie tych nowych cząsteczek sygnałowych otworzyło zupełnie nowy poziom organizacji komórkowej z implikacjami dla zrozumienia procesu i jego bioinżynierii. Innym przykładem jest kwestia pobierania cukru przez bakterie. Historycznie naturalne izolaty Clostridium zastosowano do przemysłowej fermentacji ABE. Izolaty te mogą zostać zoptymalizowane przez mutagenezę i selekcję nowymi metodami, jak np. indukowalnym systemem transpozonowym dla wydajnej losowej mutagenezy. Historycznie w procesach ABE w charakterze gospodarzy produkcji wykorzystywano szczepy Clostridium. Bardzo dobrymi alternatywnymi gospodarzami produkcji mogą być drożdże. Drożdże piekarnicze wykorzystano do zaawansowanej produkcji biobutanolu. Jako alternatywnych gospodarzy do produkcji rozpuszczalników sugerowano również Escherichia coli lub Pseudomonas putida. Fermentacje Clostridium odbywają się w dwóch bardzo wyraźnych fazach – fazie kwasotwórczej, w której związki organiczne są przekształcane głównie do kwasu masłowego, a następnie w fazie rozpuszczalnikowej, w której kwasy są przekształcane w odpowiednie alkohole. Historycznie kwasy miały drugorzędne znaczenie przemysłowe, a bardziej poszukiwane były alkohole. Kwasy można jednak na wiele sposobów przekształcać w alkohole lub w inne interesujące produkty.

Przemysłowa fermentacja aceton–butanol–etanol prowadzona przez szczepy Clostridium cieszy się do dziś dużym zainteresowaniem komercyjnym i naukowym. Nie znaleziono jeszcze odpowiedzi na wiele pytań i nie odkryto wielu tajemnic i aspektów z nią związanych. Przyszłe pokolenia naukowców będą mieć wystarczająco dużo do zrobienia, aby zrozumieć i zoptymalizować instrument bazowy procesów metabolicznych.

9.4.1. Szlak produkcji 1-butanolu i izobutanolu

Historycznie 1-butanol produkowano komercyjnie z wykorzystaniem Clostridium acetobutylicum w podłożu zawierającym skrobię lub cukier. W procesie fermentacji ABE oprócz butanolu powstają także aceton i etanol. Mimo sukcesu produkcja 1-butanolu na bazie biologicznej została wyparta po 1950 r. przez produkcję z ropy naftowej. Bioprodukcja butanolu powróciła ze względu na potrzebę pozyskiwania paliw i chemikaliów ze źródeł odnawialnych. W związku z tym poczyniono intensywne wysiłki w kierunku poprawy efektywności i obniżenia kosztów procesu fermentacji ABE, np. przez wykorzystanie tanich surowców, wzmożenie tolerancji szczepów na stężenie rozpuszczalnika (butanolu) i na obecność tlenu, zwiększenie selektywności produktu i produkcji biomasy komórek oraz trwałej żywotności. Oprócz tego testowano szlak produkcji butanolu na różnych organizmach, np. Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae, w celu zbadania zakresu ich zdolności metabolicznych. Zbadano także produkcję butanolu przez Pseudomonas putida, Lactobacillus brevis i Bacillus subtilis zdolne do potencjalnie wyższej tolerancji na rozpuszczalnik. Ponadto zastosowano sinicę Synechococcus elongatus do bezpośredniej konwersji CO_2 do butanolu. Wyniki tych badań otworzyły nowe możliwości w zakresie ożywienia produkcji 1-butanolu na bazie biologicznej. Jednak z wyjątkiem zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli, który z powodzeniem produkował 1-butanol porównywalny z rodzimymi producentami Clostridium w ilości 15 g/l, wszystkie inne genetycznie zmienione organizmy wytwarzały mniej niż 1 g/l 1-butanolu.

Mikrobiologiczna produkcja izobutanolu, podobnie jak 1-butanolu, jest atrakcyjną opcją dla biopaliw. Jego gęstość energetyczna jest podobna do gęstości 1-butanolu, ale ma wyższą liczbę oktanową, która jest korzystniejsza przy zmieszaniu z benzyną. Po raz pierwszy biologiczną produkcją izobutanolu ze znaczącą wydajnością wykazała się Escherichia coli przy użyciu szlaku niefermentacyjnego. Strategię tej produkcji rozszerzono do szerokiego zakresu innych organizmów, w tym drożdży, cyjanobakterii, beztlenowego, termofilnego i celulolitycznego organizmu.

Natywny szczep Clostridium produkujący rozpuszczalnik wykorzystuje do produkcji 1-butanolu szlak zależny od koenzymu A (CoA). Szlak rozpoczyna się od kondensacji dwóch acetylo-CoA z wytworzeniem acetoacetylo-CoA katalizowanego przez tiolazę. Acetoacetylo-CoA podlega następnie serii dehydratacji i redukcji z wytworzeniem butyrylo-CoA. Te etapy reakcji są zasadniczo odwróceniem procesu β-oksydacji stosowanej do rozkładu kwasów tłuszczowych na jednostki acetylo-CoA. Na uwagę zasługuje redukcja krotonylo-CoA do butyrylo-CoA. W scharakteryzowanych gatunkach Clostridium reakcja ta jest katalizowana przez dehydrogenazę butyrylo-CoA (Bcd) i kompleks flawoprotein przenoszących elektrony (Etf). Ten kompleks białkowy jest enzymem rozwidlającym elektrony, który łączy egzoergiczną redukcję krotonylo-CoA z butyrylo-CoA do endoergicznej redukcji ferredoksyny z NADH. Butyrylo-CoA redukuje się do aldehydu masłowego, a następnie do 1-butanolu, przy udziale dwufunkcyjnej dehydrogenazy alkohol/aldehyd, podobnie jak w redukcji acetylo-CoA do etanolu. Butyrylo-CoA i acetylo-CoA można także hydrolizować odpowiednio do maślanu i octanu, z jednoczesnym wytwarzaniem ATP. Natywny szczep Clostridium generuje kwasy w fazie wzrostu, prawdopodobnie w celu uzyskania przewagi energetycznej. Kwasy te są ponownie reasymilowane z wytworzeniem odpowiedniego acylo-CoA, a następnie alkoholi, jeśli NADH jest w nadmiarze. W tych reakcjach znaczna część grupy CoA jest przekazywana z acetoacetylo-CoA, co prowadzi do powstania acetonu (rys. 9.3).

Rys. 9.3. Szlak metaboliczny fermentacji ABR prowadzony przez Clostridium acetobutylicum; Pfor – oksydoreduktaza pirogronian: ferredoksyna; HydA – hydrogenaza; Fnor – oksydoreduktaza ferredoksyna: NAD(P)+; Pta – fosfotransacetylaza; Ack – kinaza octanowa; Ptb – fosfotransbutyrylaza; Buk – kinaza maślanowa; CtfAB – transferaza acetoacetylo-CoA: acylo-CoA; Adc – dekarboksylaza acetoacetylo-CoA; Thl – tiolaza; Hbd – dehydrogenaza 3-hydroksybutyrylo-CoA; Crt – krotonaza; Bcd – dehydrogenaza butyrylo-CoA; Etf – flawoproteina transferująca elektrony; Fd – ferredoksyna; Aad i AdhE2 – bifunkcjonalna dehydrogenaza alkohol/aldehyd; Aad – główny enzym w produkcji 1-butanolu przez Clostridium acetobutylicum. Źródło: Chen C.T., Liao J.C. 2016. Frontiers in microbial 1-butanol and isobutanol production. FEMS Microbiol. Lett., 363. DOI: 10.1093/fnw020. Open Access.

Rys. 9.4. Produkcja butanolu i izobutanolu szlakiem ketokwasów; Związek pośredni produkcji 1-butanolu, 2-ketowalerianian, można wytwarzać szlakiem citrajabłczanowym lub szlakiem treoninowym. Izobutanol można wytworzyć z pirogronianu przez biosyntezę 2-ketoizowalerianu, a następnie dekarboksylację i redukcję. Objaśnienia enzymów: CimA – syntaza citrajabłczanowa; LeuB – dehydrogenaza 3-isopropylojabłczanowa; LeuCD – izomeraza izopropylojabłczanowa; IlvA – dehydrataza treoninowa; LeuA – syntaza 2-izopropylojabłczanowa; Als – syntaza acetomleczanowa; Kari –reduktoizomeraza ketokwasu; Dhad – dehydrataza dihydroksykwasu; Kdc – dekarboksylaza 2-ketokwasu; Adh – dehydrogenaza alkoholowa. Źródło: Chen C.T., Liao J.C. 2016. Frontiers in microbial 1-butanol and isobutanol production. FEMS Microbiol. Lett., 363. DOI: 10.1093/fnw020. Open Access.

Inna droga produkcji butanolu wykorzystuje szlak 2-ketokwasów (rys. 9.4).

Konwersja 2-ketokwasu do alkoholu to podstawowa reakcja wykorzystywana w przemysłowej produkcji bioetanolu. W tym przypadku pirogronian, trzywęglowy 2-ketokwas, ulega dekarboksylacji do aldehydu octowego, a następnie aldehyd octowy jest redukowany do etanolu. Ten schemat reakcji w syntezie alkoholu omija etapy zależne od CoA. Podobnie 2-ketokwasy o dłuższych łańcuchach można przekształcić w alkohole o dłuższych łańcuchach w sposób niezależny od CoA. Są one prekursorami biosyntezy aminokwasów, a także mogą być wykorzystane do produkcji izobutanolu, 1-butanolu i innych alkoholi o dłuższych łańcuchach. Pierwotnie szczepy Clostridium acetobutylicum i Clostridium beijerinckii stosowano do przemysłowej produkcji 1-butanolu na drodze dwufazowej fermentacji ABE. W pierwszej fazie kwasotwórczej powstają octan, maślan, wodór i CO_2 jako główne produkty fermentacji. Faza kwasotwórcza jest zwykle zbieżna z fazą logarytmicznego wzrostu, służąca do generowania ATP. W drugiej fazie następuje synteza acetonu, butanolu i etanolu z wytworzonych wcześniej kwasów. Badania wykazały, że główną drogą biosyntezy 1-butanolu jest bezpośrednia konwersja acetylo-CoA do 1-butanolu. CoA jest wymagany do konwersji maślanu do butanolu, a strumień acetoacetylo-CoA – do produkcji acetonu. Tak więc znaczna ilość butanolu musi pochodzić z bezpośredniej syntezy acetylo-CoA. Aby zwiększyć produkcję 1-butanolu, konkurencyjne ścieżki syntez zostały stłumione przez zakłócenie genów pta i buk odpowiedzialnych za produkcję octanu i maślanu. Wraz z nadekspresją dehydrogenazy aldehyd/alkohol, skonstruowany szczep Clostridium acetobutylicum wytwarzał 18,9 g/l butanolu z plonem 0,71 mola 1-butanolu na gram glukozy. W porównaniu do dzikiego szczepu ATCC824 (wydajność 1-butanolu: 11,8 g/l, plon: 0,43 mola 1-butanol na gram glukozy), wydajność i plon 1-butanolu uległy poprawie odpowiednio do 60% i 145%. Toksyczność butanolu jest jednym z najważniejszych problemów w fermentacji ABE. Wydajność 1-butanolu rzadko przekracza wartość 13 g/l, którą przypuszczalnie uważa się za limit toksyczności powodowanej zaburzeniem błon komórkowych. Jednak kilka rekombinowanych szczepów było w stanie wyprodukować do 18,5 g/l 1-butanolu, co wskazywałoby, że odpowiedzialne są inne mechanizmy tolerancji 1-butanolu. Przetestowano białka zwiększające tolerancję 1-butanolu przez nadekspresję operonu groESL (operon szoku cieplnego) w komórkach Clostridium acetobutylicum ATCC824. Nadekspresja operonu groESL zwiększała wydajność produkcji 1-butanolu o 30% lub więcej oraz zwiększyła oporność na 1-butanol. Ujawniono, że 1-butanol wywołał ekspresję wszystkich głównych genów białka stresu (groES, dnaKJ, hsp18, hsp90).

Oprócz Clostridium acetobutylicum, innym dobrze przebadanym organizmem zdolnym do produkcji butanolu jest Clostridium beijerinckii. Zmutowany szczep Clostridium beijerinckii BA101 wygenerowano przy użyciu mutagenu N-metylo-N9-nitro-N-nitrozoguanidyny wraz z analogiem glukozy 2-deoksyglukozą do selektywnego namnożenia. Szczep BA101 jest znany z wysokiej produkcji butanolu i zdolności amylolitycznych, które spowodowały dwukrotny wzrost wydajności 1-butanolu (18,6 g/l) i 1,8-krotną lub wyższą aktywność enzymów amylolitycznych w hodowli okresowej z zasilaniem w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Clostridium beijerinckii BA101 jest jednym z organizmów z najwyższą zdolnością wytwarzania butanolu. Badania nad produkcją biobutanolu przez Clostridium beijerinckii BA101 w dużej mierze koncentrują się na optymalizacji procesu i wykorzystania odpadów rolniczych. Butanol był produkowany przy użyciu szczepu o wysokiej wydajności na podłożach ze skrobią kukurydzianą (15,8 g/l), maltodekstryną (18,6 g/l), melasą sojową (18,3 g/l), odpadami rolniczymi (9,8 g/l) i odpadami z orzeszków ziemnych (15,7 g/l). Do opracowania pozostaje skuteczna hydroliza pozostałości bogatych we włókna celulozowe. Jedną z prostych metod odzyskiwania 1-butanolu jest usuwanie z hodowli powstających gazów CO_2 i H_2 z płynu fermentacyjnego w hodowlach okresowych, okresowych z zasilaniem oraz ciągłych – odpowiednio z wydajnością 75,9 g/l, 233 g/l i 460 g/l. Do niedawna etanol i 1-butanol uważano za jedyne dwa realne związki biopaliw. Produkcja izobutanolu została osiągnięta przez wykorzystanie 2-ketoizowalerianu, półproduktu do biosyntezy waliny, w syntezie alkoholu izobutylowego z zastosowaniem konstruktu Escherichia coli z wydajnością 22 g/l i 86% plonem, co jest porównywalne z wydajnością produkcji 1-butanolu przez szczepy Clostridium. Wpływ na uzyskanie wysokiej wydajności produkcji izobutanolu mają dwa enzymy – syntaza acetylomleczanowa pobrana z Bacillus subtilis (gen alsS) w celu zastąpienia pierwszego enzymu szlaku syntezy waliny oraz dekarboksylaza ketoizowalerianowa (KivD) z Lactococcus lactis do dekarboksylacji 2-ketokwasu. Co ciekawe, AlsS wykazuje również aktywność dekarboksylazy, więc izobutanol jest produkowany nawet bez ekspresji KivD. Produkt reakcji katalizowanej przez KivD, aldehyd izomasłowy, jest redukowany do izobutanolu przez różne dehydrogenazy alkoholowe. Najlepsze są dwie opcje: natywna YqhD zależna od NADPH u Escherichia coli i AdhA zależna od NADH z Lactococcus lactis. Co ciekawe, nawet jeśli zmodyfikowana Escherichia coli nie mogła rosnąć, gdy stężenie izobutanolu było większe niż 6–8 g/l, szczep nadal produkował izobutanol długo po osiągnięciu fazy stacjonarnej. Produkcja w fazie stacjonarnej jest w rzeczywistości powszechnie postrzegana w fermentacji mikrobiologicznej jako produkcja etanolu. W rzeczywistości wyewoluował szczep tolerujący izobutanol do stężenia 15 g/l.

1-Butanol można również wytwarzać z 2-ketowalerianianu, prekursora niebiałkowego aminokwasu norwaliny. Metabolit, 2-ketowalerianian, można syntetyzować z 2-ketomaślanu przez wydłużenie łańcucha ketokwasowego katalizowane przez enzymy LeuABCD. 2-Ketomaślan jest syntetyzowany dwiema drogami: poprzez deaminację treoniny lub szlakiem citrajabłczanowym z Methanococcus jannaschii. Wytwarzanie 1-butanolu z wykorzystaniem tego szlaku utrudnia niespecyficzność KivD, który również dekarboksyluje 2-ketomaślan do postaci 1-propanolu. Dlatego wydajne wytwarzanie 1-butanolu z zastosowaniem tego szlaku nadal wymaga wykorzystania inżynierii białek oraz inżynierii metabolicznej.

9.4.2. Produkcja 1-butanolu z biomasy celulozowej

Możliwość bezpośredniej produkcji etanolu z celulozy została potwierdzona wieloma udanymi przykładami. Produkcja izobutanolu i 1-butanolu z celulozy bezpośrednio jest trudniejsza ze względu na dłuższe drogi syntezy, trudniejsze do zoptymalizowania z ograniczonymi narzędziami genetycznymi. Dla izobutanolu zaprojektowano Clostridium cellulolyticum z odwróconym szlakiem syntezy natywnej waliny z krystalicznej celulozy. Clostridium cellulovorans, którego naturalnym produktem metabolicznym jest kwas masłowy, został wzbogacony w dehydrogenazę aldehyd/alkohol (AdhE2) w celu konwersji prekursora butyrylo-CoA do 1-butanolu z celulozy. Wykazano również możliwość wytwarzania 1-butanolu z ksylozy przy użyciu Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

Literatura rekomendowana

Alia K.B., Rasul I., Azeem F., Husain S., Siddique M.H., Muzammil S., Riaz M., Bari A., Liaqat S., Nadeem H. 2019. Microbial Production of Ethanol. Microbial Fuel Cells: Materials &Applications Materials Research Forum LLC. Materials Research Foundations,46: 307–334 12

Aslankoohi E., Rezaei M.N., Vervoort Y., Courtin C.M., Verstrepen K.J. 2015. Glycerol production by fermenting yeast cells is essential for optimal bread dough fermentation.PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0119364.

Azhara S.H.M., Abdull R., Jamboa S.A., Marbawia H., Gansaua J.A., Faika A.A.M., Rodrigues K.F. 2017. Yeasts in sustainable bioethanol production: A review. Biochem. & Biophys. Reports, 10: 52–61.

Chen C.T., Liao J.C. 2016. Frontiers in microbial 1-butanol and isobutanol production. FEMS Microbiol. Lett., 363. DOI: 10.1093/fnw020.

Da Silva G.P., Mack M., Contiero J. 2009. Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology. Biotechnol. Advances, 27: 30–39.

Kang K.E., Chung D.P., Kim Y., Choi GW. 2015. High-titer ethanol production from simultaneous saccharification and fermentation using a continuous feeding system. Fuel, 145: 18–24.

Khan Z., DwivediA.K. 2013. Fermentation of biomass for production of ethanol: A review. Universal J. Environ. Res. Technol., 3: 1–13

Moon H.G., Jang Y.S., Cho C. i wsp. 2016.One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol. Lett., 363. DOI: 10.1093/fnw001.

Sarris D., Papanikolaou S. 2016. Biotechnological production of ethanol: Biochemistry, processes and technologies. Eng. Life Sci., 16: 307–329.

Sauer M. 2016. Industrial production of acetone and butanol by fermentation – 100 years latter. FEMS Microbiology Letters, 363. fnw134.

Steensels J., Verstrepen K.J. 2014. Taming wild yeast: potential of conventional and nonconventional yeasts in industrial fermentations. Annu. Rev. Microbiol., 68: 61–80.

Walker G.W., Stewart G.G. 2016. Saccharomyces cerevisiaein the production of fermented beverages.Beverages, 2: 30.

Wang Z.X., Zhuge J., Fang H., Prior B.A. 2001. Glycerol production by microbial fermentation: A review. Biotechnology Advances, 19: 201–223.

Yang S., Fei Q., Zhang Y., Contreras L.M., Utturkar S.M., Brown S.D., Himmel M.E., Zhang M. 2016. Zymomonas mobilis as a model system for production of biofuels and biochemicals. Microbial Biotechnology, 9: 699–717.

10

Mikrobiologiczna produkcja kwasów organicznych

10.1.Wprowadzenie

Mikrobiologiczna produkcja kwasów organicznych jest doskonałym sposobem pozyskiwania chemikaliów z odnawialnych źródeł węgla. Produkcja niektórych kwasów organicznych rozpoczęła się wiele lat temu. Od tego czasu znacznie podwyższono wydajności procesów w skali przemysłowej dzięki konstrukcji szczepów ulepszonych w drodze selekcji przesiewowej, klasycznej mutacji, a także inżynierii metabolicznej. Pewne kwasy organiczne jak cytrynowy, mlekowy, fumarowy, propionowy, jabłkowy, α-ketoglutarowy, 5-ketoglutarowy, 2-ketoglutarowy, glukonowy, octowy, kojowy i itakonowy są produkowane na drodze mikrobiologicznej w procesie fermentacji w skali przemysłowej. Fermentacja z użyciem mikroorganizmów jest bardzo prostą metodą syntezy wymienionych wyżej kwasów organicznych w formie przyswajalnej. Produkcja kwasów w drodze fermentacji nie wymaga dużych ilości energii i jest dość tania w zależności od zastosowania odpowiedniego podłoża. Kwasy organiczne należą do najbardziej uniwersalnych składników żywności, napojów i farmaceutyków. Ponadto są one szeroko stosowane w produkcji chemikaliów wykorzystywanych w motoryzacji i w przemyśle budowlanym, petrochemicznym, w produkcji tekstyliów, detergentów, gumy, perfum, tworzyw sztucznych, barwników i klejów.

Globalny rynek kwasów organicznych był szacowany na około 12 mld dolarów w 2014 r. i oczekuje się, że do 2023 r. osiągnie ponad 18 mld dolarów, głównie z powodu dużego zapotrzebowania na octan winylu stosowany jako opakowania do żywności i szybkiego rozwoju przemysłu farmaceutycznego (Carboxylic Acid Market 2015).

10.2. Kwas cytrynowy (C_6H_8O_7)

Kwas cytrynowy jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, a w wysokich stężeniach występuje w niektórych owocach i warzywach. Jest wszechobecny jako produkt pośredni w cyklu Krebsa. Sok z limonki zawiera kwas cytrynowy w ilości 70 g/l, sok z cytryny – 56,3 g/l, sok z malin – 24,8 g/l, z pomidorów – 10,18 g/l, a sok z ananasa, truskawek i żurawiny – 2–6,5 g/l. Kwas cytrynowy stosuje się powszechnie w przemyśle spożywczym jako środek zakwaszający, aromatyzujący, konserwant, sekwestrant, emulgator i środek buforujący. Globalny rynek kwasu cytrynowego wynosił 2,6 mld dolarów w 2014 r. i oczekuje się, że do 2020 r. osiągnie 3,6 mld USD (Citric Acid Market 2015).

Kwas cytrynowy po raz pierwszy został wyizolowany z soku cytryny w 1784 r. przez Scheele, a produkcję komercyjną rozpoczęto w Anglii w 1826 r. z cytrusów sprawdzanych z Włoch. Na początku XX w., Włochy miały monopol na produkcję ok. 10 000 t kwasu cytrynowego. W 1893 r. Wehmer zauważył, że niektóre gatunki Penicillium w hodowli na podłożach z cukrem produkują kwas cytrynowy. W 1917 r. odkryto, że produkcja kwasu cytrynowego przez szczepy Aspergillus niger rośnie przy pH 2,5–3,5, co doprowadziło do pierwszej produkcji komercyjnej na drodze fermentacji. W 1934 r. Krebs odkrył, że kwas cytrynowy jest związkiem centralnym w tlenowym metabolizmie organizmów produkowanym w cyklu kwasów trikarboksylowych.

W 1919 r. otwarto pierwszą w skali technicznej fabrykę kwasu cytrynowego w Belgii, a w 1923 r. w USA. W następnych latach otwarto kilka kolejnych zakładów produkujących kwas cytrynowy w hodowlach Aspergillus niger na podłożach zestalonych (metoda powierzchniowa), co stanowiło 10–80% kwasu cytrynowego produkowanego komercyjnie na drodze fermentacji. Po II wojnie światowej zaczęto stosować powszechnie hodowle płynne napowietrzane (zanurzeniowe, wgłębne) Aspergillus niger. W kolejnych latach skoncentrowano się nad konstrukcją tanich podłóż hodowlanych, większą kontrolą procesu fermentacji oraz poszukiwaniem szczepów bardziej wydajnych. Zidentyfikowano kilka szczepów drożdży zdolnych do wytwarzania kwasu cytrynowego, rosnących na podłożach z węglowodanami i węglowodorami, ale produkcja z tego ostatniego podłoża nie była opłacalna. Już w 1997 r. produkowano kwas cytrynowy w ilości 840 000 t rocznie. Kwas cytrynowy ma status GRAS i jest stosowany w wielu gałęziach gospodarki, a największe zastosowanie ma w przemyśle spożywczym oraz do produkcji napojów (70%), jako najbardziej wszechstronny i powszechnie stosowany środek zakwaszający. Charakteryzuje się przyjemnym smakiem, wysoką rozpuszczalnością w wodzie i własnością wzmacniania smaków. Oprócz przemysłu spożywczego kwas cytrynowy wykorzystuje się do produkcji detergentów i środków czyszczących (18%), środków farmaceutycznych i kosmetyków (6%) oraz w zastosowaniach przemysłowych i chemicznych (6%). Obecnie kwas cytrynowy jako produkt fermentacji jest produkowany na największą skalę w Europie Zachodniej, USA i Chinach.

10.2.1. Podstawy fermentacji kwasu cytrynowego

Wydzielanie kwasu cytrynowego przez mikroorganizmy nie jest zjawiskiem normalnym. Pewne gatunki bakterii, drożdży i grzybów strzępkowych mogą gromadzić kwas cytrynowy w bardzo dużych ilościach, gdy rosną w określonych warunkach. Znaczne nagromadzenie kwasu jest wynikiem poważnych nieprawidłowości w metabolizmie, spowodowanych przez niedobory genetyczne lub zaburzenia równowagi metabolicznej. Odpowiednie warunki do maksymalizacji wydajności i stężenia kwasu cytrynowego są bardzo różne w zależności od stosowanego szczepu i źródła węgla. Podstawowe sekwencje metaboliczne związane z syntezą kwasu cytrynowego są dobrze znane (rys. 10.1), ale regulacja i ścieżki syntezy głównych punktów, które prowadzą kontrolę cytrynianu są wciąż dyskutowane. Dzieje się tak dlatego, że w wielu badaniach stosowano różne szczepy oraz różne warunki hodowli, a istnieją dowody, że więcej niż jeden zestaw warunków może prowadzić do akumulacji kwasu cytrynowego.

Rys. 10.1. Metaboliczne przemiany węglowodanów w cyklu kwasów trikarboksylowych

Aspergillus niger tworzy kwas cytrynowy w procesie katabolizmu szlakiem glikolizy z wytworzeniem dwóch moli pirogronianu i jego późniejszą konwersję do szczawiooctanu. Następnie syntaza cytrynianowa kondensuje szczawiooctan z acetylo-CoA z wytworzeniem cytrynianu według schematu

Acetylo-CoA + szczawiooctan ↔ cytrynian + H+ + CoA–SH.

Obecność enzymów cyklu kwasów trikarboksylowych została wykryta w tym organizmie pod różnymi postaciami w różnych warunkach.

Zjawisko kumulacji kwasu cytrynowego w hodowlach mikroorganizmów zachodzi w warunkach braku równowagi między strumieniem metabolicznym węgla w szlaku glikolitycznym a cyklem kwasów trikarboksylowych. Ten brak równowagi jest obserwowany jako wzrost przepływu strumienia węgla w glikolizie wyrażony wysoką aktywnością enzymów glikolitycznych w pewnych warunkach hodowli.

Podsumowując – w idiofazie, w której zachodzi gromadzenie kwasu cytrynowego, w wyniku zmian aktywności enzymów cykl Krebsa zostaje praktycznie zablokowany na etapie przemian kwasu cytrynowego. Aby komórki Aspergillus niger mogły tworzyć dalsze ilości kwasu cytrynowego, pewne reakcje muszą dostarczać prekursorów niezbędnych do jego dalszej syntezy. Taką reakcją wspomagającą jest karboksylacja kwasu pirogronowego do kwasu szczawiooctowego (reakcja anaplerotyczna). Dwie cząsteczki kwasu pirogronowego powstałe w drodze glikolizy ulegają, przy współudziale koenzymu A, przemianom do acetylo-CoA i kwasu szczawiooctowego. Następnie te dwa związki przy udziale syntazy cytrynianowej ulegają kondensacji do kwasu cytrynowego z uwolnieniem CoA. Bilans tego procesu jest następujący:

Niektórzy autorzy sugerują, że w etapach produkcji kwasu cytrynowego cykl kwasów trikarboksylowych jest ograniczony do dehydrogenazy izocytrynianowej. Ale zjawisko regulacji nadprodukcji i akumulacji kwasu cytrynowego jest nadal niejasne, ponieważ zaproponowano kilka różnych mechanizmów, a istniejące dowody nie wystarczają, aby potwierdzić którychś z nich.

10.2.2. Natywne mikroorganizmy zdolne do produkcji kwasu cytrynowego

Najliczniejszymi grupami mikroorganizmów natywnych zdolnych do produkcji kwasu cytrynowego są:

1. 1) grzyby strzępkowe: Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus fumaricus, Aspergillus luchensis, Aspergillus saotoi, Aspergillus usumii, Aspergillus wentii, Penicillium janthinellum, Penicillium luterum, Penicillium purpurogenum, Penicillium restrictum, Penicillium citrinum, Paecilomyces divaricatum, Mucor pyriformis, Trichoderma viride, Sacharomycopsis lipolytica;

2. 2) drożdże: Candida tropicalis, Candida oleophila, Candida guilliermondii, Candida citroformans, Candida intermedia, Candida parapsilopsis, Candida zeylandoides, Candida fibriae, Candida subtropicalis, Candidalipolytica, Hansenula anamola, Yarrowia lipolytica, Torulopsis, Debaromyces, Torula, Pichia, Kloekera, Saccharomyces i Zygosaccharomyces;

3. 3) bakterie: Arthrobacter paraffinens, Bacillus licheniformis i Corynebacterium glutamicum;

4. 4) mutanty: Aspergillus niger C192, Aspergillus niger GCB-75, Aspergillus niger YW-112, Aspergillus niger CBX-209.

10.2.3. Surowce stosowane w fermentacji kwasu cytrynowego

Opracowano kilka warunków prowadzenia procesów fermentacji przez różne szczepy z wykorzystaniem różnych źródeł węgla w podłożach fermentacyjnych. W procesach komercyjnych powszechnie stosowane są Aspergillus niger i Yarrowia lipolytica. Fermentacja kwasu cytrynowego zwykle jest prowadzona w hodowlach płynnych w podłożach z różnymi źródłami węgla organicznego. Osiągnęła wartość rynkową 2 mld dolarów. Około 1 mln ton rocznie kwasu cytrynowego jest produkowane tylko przez Aspergillus niger i drożdże. W hodowlach na powierzchni stałych substratów (solid surface fermentation) stosuje się najczęściej odpady browarnicze, strąki chleba świętojańskiego, odpady bawełniane, kłącza Asphodelus aestivus oraz rzepę wzbogaconą melasą. W hodowlach z surowcami stałymi organicznymi są wykorzystywane wytłoki jabłkowe, strąki chleba świętojańskiego, odpady z marchwi, wytłoki z manioku, hydrolizaty celulozy, łuski z kawy, trzcina cukrowa, kaczan kukurydzy, otręby ryżowe odolejone, wytłoki z winogron, skórka z owoców kiwi, kumara, melasa, odpady z małż, odpady pomarańczowe, odpady ananasa, otręby ryżowe, sacharoza, trzcina cukrowa tłoczona i otręby pszenne. W hodowlach wgłębnych (płynnych) substratami są melasa buraczana, odpady z browaru, melasa z trzciny cukrowej, skrobia kukurydziana, syropy, olej kokosowy, glicerol, olej palmowy, oliwa z oliwek, soja, olej rzepakowy, hemiceluloza drewna, serwatka, permeaty, hydrolizat ksylanu, skrobia z fasoli, n-parafina.

10.2.4. Produkcja kwasu cytrynowego w hodowlach Aspergillus niger

Obfite wydzielanie kwasu cytrynowego do podłoża fermentacyjnego odbywa się w specyficznych warunkach. Wysokie stężenia cukru sprzyjają wysokiemu strumieniowi glikolitycznemu węgla, pozostałe ograniczenia to niski poziom dostępnego azotu lub fosforu oraz bardzo niski poziom niektórych metali ciężkich, w tym żelaza i manganu. Innymi czynnikami przyczyniającymi się do wytwarzania kwasu cytrynowego w dużych ilościach są wysokie wewnątrzkomórkowe stężenie 2,6-bifosforanu fruktozy, hamowanie dehydrogenazy izocytrynianowej i niskie pH środowiska (1,7–2,0). Proponowane są różne składy podłoży hodowlanych do efektywnej produkcji kwasu cytrynowego. Ogólne wymagania dotyczące produkcji kwasu cytrynowego w hodowlach z Aspergillus niger można podsumować w następujący sposób: wysokie stężenie źródła węgla w podłożu fermentacyjnym (60–240 g/l), niski poziom związku azotu (2–3 g/l), niski poziom fosforanów (1,5–3,0 g/l), niedobór manganu (< 0,000001 g/l), niski poziom żelaza (< 0,0013 g/l), niski poziom cynku (0,00025 g/l), wysoki poziom napowietrzenia i niskie pH (2–3).

Melasa z buraków cukrowych i trzciny cukrowej oraz syropy glukozowe są głównymi źródłami węgla na skalę przemysłową. Skład melasy jest zmienny, potrzebne są testy oraz zabiegi, aby stosowano ją w odpowiednich stężeniach. Najtrudniejsze jest utrzymanie niskiego poziomu cynku, żelaza, magnezu i manganu. Stężenie manganu ma krytyczne znaczenie w procesie fermentacji kwasu cytrynowego, gdyż reguluje on kilka enzymów, w tym związanych z eksportem kwasu cytrynowego. Kontrolę poziomu śladowych ilości metali osiąga się przez dodanie sodu lub żelazocyjanku potasu. Można też zredukować ich ilości przez wymianę jonową, ale dotyczy to tylko substratów o niskim stężeniu soli, takich jak namoki kukurydziane.

Zarówno azot, jak i fosfor ograniczają produkcję kwasu cytrynowego. Źródła azotu takie jak siarczan amonu i azotan amonu są powszechnie stosowane w stężeniach 1–3 g/l. Rodzaj i stężenie źródła azotu wpływają na wzrost komórek i tworzenie kwasu cytrynowego. Zawartość fosforu jest ważniejsza w fermentacji, w której stężenie śladowych ilości metali nie jest ściśle kontrolowane, a niskie stężenia fosforanów są zwykle zalecane. Magnez jest potrzebny zarówno do wzrostu, jak i produkcji kwasu cytrynowego. Inne składniki odżywcze, takie jak niższe alkohole (metanol i etanol) i lipidy zawarte w olejach roślinnych zwiększają produkcję kwasu cytrynowego. Podsumowując można stwierdzić, że na produkcję kwasu cytrynowego mają istotny wpływ następujące czynniki:

1. 1) źródło węgla, w tym surowce mające wpływ dodatni – sacharoza, glukoza, fruktoza, galaktoza, lub ujemny – skrobia, ksyloza, arabinoza, sorbitol, kwas pirogronowy;

2. 2) źródło fosforu, wpływ pozytywny ma fosforan jednopotasowy w stężeniu 0,5–5,0 g/l;

3. 3) źródło azotu, pozytywny wpływ mają azotan amonu, pepton, ekstrakt mięsny, mocznik (w stężeniu 0,1–0,4 g/l);

4. 4) pH poniżej 3,0 w zależności od szczepu;

5. 5) mikroelementy obecne w podłożu, pozytywny wpływ mają cynk, miedź, magnez, siarczany (w niskich stężeniach);

6. 6) alkohole, niskie stężenia takich alkoholi jak metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, metylooctan (w stężeniu (1–4% obj./wag.).

Po raz pierwszy fermentację kwasu cytrynowego na skalę przemysłową przeprowadzono na powierzchni podłoża zestalonego. Proces ten jest nadal wykorzystywany w niektórych przypadkach jako łatwiejsza metoda hodowli, ma niższe koszty energii niż hodowle płynne i jest mniej wrażliwy na skład metali śladowych. Jest jednak znacznie bardziej pracochłonny. Strzępki grzybni są hodowane w postaci mat powierzchniowych na dużej liczbie płytkich tac. Podłoża mają pH wartości 5–7, aby umożliwić kiełkowanie zarodników. Podłoże zawierające melasę buraczaną (320–400 g/l), NH_4NO_3 (1,6–3,2 g/l), CaH_2PO_4 (0,3–1,0 g/l), MgSO_4 · 7H_2O (0,2–0,5 g/l), ZnSO_4 (0,01−0,1g/l) i heksacyjanożelazian wapnia (0,4−2,0 g/l) jest sterylizowane i pompowane na tace. Na zestalone podłoże nanosi się zawiesinę zarodników. Sterylne powietrze jest wdmuchiwane do komory fermentacyjnej, w której utrzymuje się temp. 30°C i wilgotność 40–60%. Napowietrzanie zapewnia tlen, a także usuwa wytwarzane ciepło. Wraz z przebiegiem fermentacji i wydzielaniem kwasu cytrynowego pH spada do około 2,0. Fermentacja kończy się w ciągu 7–15 dni z wydajnością około 70%. Sfermentowany płyn oddziela się od grzybni i kieruje do dalszego przetwarzania.

Hodowle Aspergillus niger są także powszechnie prowadzone w podłożach płynnych (hodowle zanurzeniowe) w bioreaktorach z mieszaniem mechanicznym lub fermentorach wieżowych. Fermentory są wyposażone w systemy napowietrzania zdolne do utrzymywania wysokiego poziomu rozpuszczonego tlenu w hodowli, który jest krytyczny dla wysokich wydajności produkcji kwasu cytrynowego. Podłoża zawierają od 15–27% związku węgla organicznego, a także są poddawane opatentowanym procedurom obróbki wstępnej w celu wyeliminowania manganu i zmniejszania poziomu innych krytycznych metali śladowych. Początkowe wartości pH wynoszą 2,5–3,0, temperatura fermentacji 28–35°C, podłoże fermentacyjne szczepi się sporami (5–15 · 10^6 spor/l) lub grzybnią zawieszoną w podłożu uprzednio przygotowaną w stosunku 1 : 10. Jakość przygotowanego inoculum oraz skład podłoża fermentacyjnego wpływają na morfologię hodowli i wydajność produkcji kwasu cytrynowego. W czasie trwania hodowli tworzy się charakterystyczny osad w postaci drobnego peletu o gładkiej powierzchni (to strzępki pleśni) mający dobre właściwości przenoszenia biomasy. Fermentacja trwa 5–10 dni w zależności od składu podłoża i inoculum. Zawiesinę zarodników jako inoculum oraz spory wytwarza sie przez hodowanie grzyba na podłożach stałych w temp. 25°C w szklanych butelkach przez 10–14 dni. Zarodniki są indukowane do kiełkowania w temp. 32°C, w pożywce zawierającej 15% cukru, w której tworzą granulki grzybni (0,2–0,5 mm). Granulki te są wykorzystywane do zaszczepienia pożywki produkcyjnej. Szczepy Aspergillus są genetycznie niestabilne, tak więc ogranicza się do minimum liczbę wstępnych etapów wytwarzania końcowego inoculum, a w niektórych przypadkach do zaszczepienia pożywki produkcyjnej używa się bezpośrednio spory.

Proponowane są hodowle okresowe, ponieważ kumulacja kwasu cytrynowego jest tylko częściowo związana z przyrostem biomasy. Nie są zalecane hodowle z ciągłym przepływem ani hodowle okresowe z zasilaniem. Z powodu dysocjacji między wzrostem a produkcją kwasu w wielu laboratoriach podejmowano próby wielokrotnego wykorzystywania grzybni unieruchomionej w perełkach alginianu, kolagenie lub piance poliuretanowej. Dalsze badania zwane procesem Koji doprowadziły do uzyskania ciała stałego, które służy do wytwarzania kwasu cytrynowego. Pierwotnie proces Koji został opracowany do hodowli na odpadach stałych (resztkach ziemniaków, ryżu i otrębach pszennych, odpadach z trzciny cukrowej) moczonych do 70% wilgotności, sterylizowanych, umieszczonych na tackach i zaszczepionych sporami Aspergillus niger. Obecna w odpadach skrobia jest hydrolizowana przez amylazę wytwarzaną przez grzyb i przekształcana w kwas cytrynowy w czasie trwania hodowli 4–5 dni. Taki typ hodowli jest stosowany dla niewielkich systemów pozyskiwania kwasu cytrynowego.

Proces fermentacji na podłożu stałym, znany również jako „proces Koji”, został po raz pierwszy opracowany w Japonii około lat 50. XX w. W tym procesie stały substrat o odpowiedniej wilgotności działa zarówno jako nośnik (wsparcie fizyczne), jak też źródło składników odżywczych. Istnieją pewne podobieństwa między fermentacją a powierzchniową kwasu cytrynowego. Obecność pierwiastków śladowych może nie wpływać tak silnie na wytwarzanie kwasu z zastosowaniem fermentacji na podłożu stałym, jak ma to miejsce w procesie fermentacji zanurzeniowej. Pozostałości rolno-przemysłowe takie jak odpady słodkich ziemniaków, manioku i kukurydzy zawierające skrobię jako źródło węgla są wykorzystane do praktycznej produkcji kwasu cytrynowego. Do dziś w krajach azjatyckich takich jak Chiny i Japonia małe zakłady produkcyjne nadal stosują proces fermentacji na podłożu zestalonym do produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger.

10.2.5. Produkcja kwasu cytrynowego z zastosowaniem drożdży

Opracowano alternatywne procesy produkcji kwasu cytrynowego z udziałem drożdży Candida z wykorzystaniem węglowodorów jako źródeł węgla i energii. Komórki drożdży tolerują wyższe początkowe stężenie cukru, osiągają wysoki stopień fermentacji i są niewrażliwe na obecność metali, dzięki czemu można pominąć czynności wstępne przed właściwą fermentacją. Opatentowano kilka procesów produkcji kwasu cytrynowego przy udziale drożdży w każdym przypadku w hodowli płynnej (zanurzeniowej). W oryginalnym procesie opatentowanym w 1968 r. pH hodowli utrzymywano za pomocą węglanu wapnia na poziomie powyżej 5,5. W niektórych później opatentowanych procesach dopuszczono obniżenie pH do wartości 3–4 po wzroście biomasy komórek drożdży. Zastosowanie drożdży ma podstawową wadę – jako produkt uboczny tworzy się kwas izocytrynowy. W celu ograniczenia jego produkcji przetestowano różne dodatki podawane do podłoży fermentacyjnych. Jako metodę obniżenia jego produkcji opatentowano m.in. użycie związków z podstawnikami halogenowymi oraz octanu ołowiu. Osmofilne szczepy grzybów są w stanie bez obróbki wstępnej przekształcać w kwas cytrynowy cukier o stężeniu 28% w podłożu fermentacyjnym.

Drożdże Candida są zdolne do przekształcania n-parafin w kwas cytrynowy i izocytrynowy z bardzo wysoką wydajnością – do 225 g/l. Candida oleophila ATCC 20177 produkuje nawet 250 g/l kwasu cytrynowego w hodowlach ciągłych w podłożu płynnym z glukozą jako źródłem węgla. Jako alternatywę opracowano produkcję kwasu cytrynowego z n-alkanów, które są tanim źródłem węgla. W procesie fermentacji wykorzystującej Yarrowia lipolytica na podłożu z parafinami C_14–C_16 uzyskano więcej niż 200 g/l kwasu cytrynowego. Końcowe pH w granicach 2–3 umożliwia odzyskanie wolnego kwasu cytrynowego bez potrzeby wytwarzania soli. System produkcji kwasu cytrynowego z parafin nie jest stosowany komercyjnie, ponieważ nie może konkurować ekonomicznie z zastosowaniem odpadowych substratów węglowodanowych.

W tabeli 10.1 przedstawiono wydajności produkcji kwasu cytrynowego przez dwa szczepy grzybów na surowcach odpadowych jako źródle węgla.

Tabela 10.1. Wydajności produkcji kwasu cytrynowego dwóch szczepów grzybów

Grzyby

Źródło węgla

Wydajność (g/l)

Plon (g/g)

Lit.

Aspergillus niger

glukoza

200

–

[1]

melasa z trzciny cukrowej, melasa buraczana

113,5

0,71

[2]

melasa z trzciny cukrowej

114

0,76

[3]

Yarrowia lipolytica

n-parafiny

40

0,99

[4]

glukoza, kwasy tłuszczowe

42,9

0,56

[5]

sacharoza

140

0,82

[6]

[1] Rehm i wsp. 2001. Biotechnology, Wiley-VCH Weinheim; [2] Lotfy i wsp. 2007. Bioresour. Technol., 98: 3464–3469; [3] Ikram-ul i wsp. 2004. Bioresour Technol., 93: 125–130; [4] Crolla i wsp. 2004. J. Biotechnol., 110: 73–84; [5] Papanikolaou i wsp. 2006. Current Microbiology, 52: 134–142; [6] Forster i wsp. 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 1409–1417.

10.2.6. Odzyskiwanie produktu fermentacji

Z powodu nadmiaru różnych zanieczyszczeń nie można odzyskiwać kwasu cytrynowego przez krystalizację bezpośrednio z fermentowanego podłoża. W klasycznym protokole kwas cytrynowy wytrąca się jako cytrynian wapnia przez dodanie wapna. Przemyty osad traktuje się w wodnej zawiesinie kwasem siarkowym, uzyskując gips jako produkt uboczny. Kwas cytrynowy wydobywa się przez zatężanie roztworu, odparowanie pod próżnią i krystalizację w niskich temperaturach. Można także ekstrahować kwas cytrynowy rozpuszczalnikami, aby uniknąć tworzenia gipsu. Stosuje się do tego rozpuszczalniki takie jak mieszanina alkoholu n-oktylowego i tridodecyloaminy w niskiej temperaturze. Rozpuszczalnik usuwa się za pomocą gorącej wody. Inne przebadane i opatentowane techniki odzyskiwania kwasu cytrynowego obejmują połączenie filtracji membranowej z żywicami adsorpcyjnymi, zastosowanie różnych żywic anionowych oraz elektrodializę.

10.2.7. Zastosowanie kwasu cytrynowego

Kwas cytrynowy ma największe zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym oraz w żywieniu i medycynie.

Przemysł farmaceutyczny i kosmetyczny wykorzystują kwas cytrynowy do produkcji substancji aktywnych farmaceutycznie, farmaceutyków, środków higieny osobistej i produktów kosmetycznych. Wiele testów API i leków zawiera sole cytrynianowe (wodorowęglany lub węglany), które ułatwiają rozpuszczanie i poprawiają smak tabletek. Systemy musujące są szeroko stosowane w produktach do czyszczenia zębów, środkach do łagodzenia bólu i tabletkach witaminowych. Bardzo skuteczny jest system buforujący do kontroli pH w szerokim zakresie w celu poprawy stabilności. Ostry, kwaśny smak kwasu cytrynowego może pomóc w maskowaniu nieprzyjemnego smaku leczniczych środków farmaceutycznych.

Przemysł spożywczy stosuje kwas cytrynowy do wzmocnienia aktywności przeciwutleniających środków konserwujących. W napojach ma zastosowanie jako środek smakowy i stabilizator pH.

W medycynie cytrynian potasu jest stosowany jako diuretyk ze względu na właściwości moczopędne, a jako środek zmniejszający krzepliwość krwi (antykoagulant) ze względu na to, że chelatuje wapń.

Kwas cytrynowy wykorzystuje się też do remediacji środowiska jako środek chelatujący maskujący metale ciężkie, w tym radioaktywne izotopy, a także ułatwiający usuwanie hydrofobowości. Na bazie cytrynianu opracowano silny czynnik chelatujący do wiązania śladowych ilości jonów metali.

10.3. Kwas mlekowy

Kwas mlekowy jest szeroko stosowany w przemyśle spożywczym (w żywności i napojach), a także do produkcji polimerów, produktów farmaceutycznych, środków higieny osobistej i w innych gałęziach przemysłu. Polimer kwasu mlekowego ulega biodegradacji. Jest stosowany w przemyśle farmaceutycznym do produkcji protez i szwów, a także osłonek do wewnętrznego dawkowania leków. Kwas polimlekowy ma kilka zastosowań jako materiał na opakowania, w rolnictwie, jako składnik tworzyw sztucznych wykorzystywanych w przemyśle samochodowym, w służbie zdrowia, elektronice, włókiennictwie i innych gałęziach przemysłu. Oczekuje się, że do 2020 r. globalny rynek produkcji kwasu mlekowego osiągnie wartość 3,8 mld USD (od 2015 do 2020 r. CAGR w wysokości 18,6%), podczas gdy globalny rynek kwasu polimlekowego osiągnie w tym czasie prawie 5,16 USD (CAGR równe 20,9%). Kwas L-mlekowy jest produkowany komercyjnie w procesie fermentacji z użyciem bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus spp. lub grzybów Rhizopus oryzae w hodowlach płynnych (zanurzeniowych). W produkcji kwasu mlekowego preferowane są bakterie, ponieważ ich wydajność produkcji kwasu mlekowego jest bardzo wysoka, dużo większa niż grzybów. Stereochemicznie czysty L-kwas mlekowy jest produkowany wyłącznie przez Rhizopus oryzae. Globalnie głównymi producentami kwasu mlekowego są firmy: BASF SE (Niemcy), CSM N.V. (Holandia), The Dow Chemical Company (USA), Teijin Ltd. (Japonia) i Nature Works LLC (USA) (Lactic Acid Market 2015).

Rys. 10.2. Izomery kwasu mlekowego

Kwas mlekowy odkrył i wyizolował w 1780 r. szwedzki chemik Scheele z kwaśnego mleka. Po raz pierwszy wyprodukował go mikrobiologicznie w 1881 r. Charles E. Avery w Littleton, Massachusetts, USA. Kwas mlekowy jest klasyfikowany jako GRAS (ogólnie uznane za bezpieczne) przez Urząd ds. Żywności i Leków (FDA) w Stanach Zjednoczonych, a jego roczne zużycie szacuje się na 30 000 t. Kwas mlekowy jest stosowany w różnych gałęziach przemysłu. Na rysunku 10.2 przedstawiono wzory strukturalne izomerów kwasu mlekowego.

10.3.1. Inżynieria genetyczna mikroorganizmów produkujących kwas mlekowy

W celu polepszenia tolerancji kwasu mlekowego przez szczepy Lactobacillus sp. produkujące ten kwas dokonano przeglądu całego genomu. W wyniku manipulacji wykorzystujących rekursywną technikę fuzji protoplastów otrzymano konstrukt Lactobacillus rhamnosus ATCC 11443 o zwiększonej tolerancji na stężenie glukozy (160–200 g/l) w podłożu, a jednocześnie zwiększono wytwarzanie kwasu L-mlekowego o 71% w porównaniu ze szczepem dzikim. Konstrukt Lactobacillus otrzymany z przemieszania genów zmutowanego szczepu Lactobacillus delbrueckii NCIM 2025 i Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23842 umożliwił wykorzystywanie skrobi bezpośrednio z manioku do wydajności 40 g/l kwasu mlekowego z 96% konwersją skrobi do kwasu mlekowego. Laseczki kwasu mlekowego wytwarzają więcej tego kwasu niż Rhizopus oryzae, ale w większości szczepów w postaci mieszaniny izomerów L i D. Grzyb wytwarza wyłącznie kwas L(+) mlekowy. Wydajność procesu produkcji kwasu mlekowego wynosi około 60–80% obecnej w podłożu glukozy, a pozostała część ulega przemianie w etanol. Zwiększenie poziomu dehydrogenazy mleczanowej przez transformację plazmidu za pomocą ldhA, sprawia, że powstaje więcej mleczanu z pirogronianu, przy produkcji kwasu mlekowego do 78 g/l, podczas gdy niepożądany produkt etanol zredukowano z 10,6 do 8,7 g/l. Zrekombinowany szczep Saccharomyces cerevisiae zawierający sześć kopii dehydrogenazy L-mleczanowej bydlęcej wytworzył z trzciny cukrowej 122 g/l kwasu mlekowego o czystości optycznej 99,9% lub wyższej. Ekspresja tego samego enzymu bydlęcego i delecja genu dekarboksylazy pirogronianowej w Kluyveromyces lactis dała 109 g/l kwasu mlekowego. Zbudowano rekombinowany szczep Escherichia coli, który wytworzył optycznie aktywny czysty kwas D-mlekowy z glukozy przy wydajności praktycznie równej teoretycznej maksymalnej, to jest dwie cząsteczki z jednej cząsteczki glukozy. Kwas D-mlekowy wytworzono również w ilości 61 g/l z wykorzystaniem rekombinowanego szczepu Saccharomyces cerevisiae zawierającego gen dehydrogenazy D-mlekowej z Leuconostoc mesenteroides.

10.3.2. Warunki produkcji kwasu mlekowego w procesie fermentacji

Fermentacja jest procesem energetycznym, w którym cząsteczki organiczne odgrywają rolę zarówno donorów, jak i akceptorów elektronów. Pobierana jest przy tym cała potencjalna energia metabolizowanych cząsteczek. Dlatego bakterie kwasu mlekowego są szeroko stosowane jako tania metoda konserwacji żywności w drodze fermentacji, zwykle wymagająca niewielkiej energii do prawidłowego przebiegu. Najpierw przygotowuje się inoculum, które stanowi szczepionkę procesu prowadzonego w fermentorze. Wielkość inoculum wynosi zwykle 5–10% objętości cieczy w fermentorze. Fermentacja najczęściej przebiega w temp. 35–45°C przy pH 5,5–6,5 utrzymywanym przez dodanie odpowiedniej zasady, np. wodorotlenku amonu. Fermentacje związane z produkcją kwasu mlekowego prowadzi się w hodowlach okresowych, okresowych z zasilaniem, półciągłych oraz ciągłych. Wyższe stężenia kwasu mlekowego uzyskuje się w hodowlach półciągłych i ciągłych prowadzonych przez długi okres. Kwas L(+) mlekowy jest produkowany komercyjnie w procesach fermentacji przez bakterie kwasu mlekowego lub grzyby takie jak Rhizopus oryzae w hodowli płynnej. Rhizopus oryzae wytwarza kwas L-mlekowy ze skrobi z niską wydajnością w porównaniu do bakterii kwasu mlekowego. Plon 85% kwasu L-mlekowego można uzyskać w hodowli płynnej prowadzonej w bioreaktorze typu Airlift w optymalnych warunkach. Niestety grzybnia Rhizopus oryzae w czasie wzrostu tworzy granulki, które zwiększają lepkość podłoża hodowlanego, a ponadto powodują pewną niedrożność w wirnikach obsługujących ten bioreaktor.

10.3.3. Rola hodowli bakteryjnych w produkcji kwasu mlekowego

Bakterie kwasu mlekowego są ogólnie laseczkami lub laseczko-ziarniakami Gram-dodatnimi, są nieruchliwe, nie tworzą przetrwalników. Bakterie kwasu mlekowego są fakultatywnymi beztlenowcami – rosną zarówno w warunkach beztlenowych, jak też w obecności tlenu, dzięki obecności peroksydaz, które chronią je przed ubocznymi produktami tlenu (np. nadtlenkiem wodoru). Są zdolne do fermentowania heksoz i zgodnie z produktami tych fermentacji dzieli się je na dwie grupy: homofermentatywne i heterofermentatywne. Mikroorganizmy, które mają zdolność szybkiej fermentacji tanich surowców, wymagają niewielkiej ilości azotu w warunkach niskiego pH oraz wysokiej temperatury, wytwarzają niewielkie ilości biomasy i duże ilości wysokiej jakości kwasu mlekowego oraz śladowe ilości produktów ubocznych. Większość wyprodukowanego kwasu mlekowego pochodzi z fermentacji z użyciem bakterii kwasu mlekowego (LAB) lub grzybów strzępkowych takich jak Rhizopus sp. W warunkach tlenowych LAB wykorzystują glukozę, tworząc kwas mlekowy, a gatunki Rhizopus oryzae i Rhizopus arrhizus wykazują aktywność amylolityczną i mogą przekształcać skrobię bezpośrednio w kwas L-mlekowy. Metodami inżynierii metabolicznej udało się poprawić produkcję kwasu mlekowego. Genetycznie zmodyfikowane Saccharomyces cerevisiae zostały wybrane do produkcji kwasu mlekowego, gdyż są bardziej oporne na niskie wartości pH w porównaniu z bakteriami kwasu mlekowego. Hodowle mieszane dwóch gatunków LAB Lactobacillus pentosus i Lactobacillus brevis wykorzystuje się do produkcji kwasu mlekowego na podłożu z hemicelulozami słomy pszenicy.

10.3.4. Optymalizacja procesu fermentacji mlekowej

Na wydajność produkcji kwasu mlekowego w procesie fermentacji mają wpływ temperatura, czas trwania fermentacji i poziom węgla organicznego jako substratu w podłożu hodowlanym. Najwyższą wydajność uzyskano po 7 dniach fermentacji w podłożach zawierających średnio 18% substratu, wydajność procesu produkcji kwasu mlekowego osiąga wartość 77,6 g /l w temp. 42°C. Maksymalny plon wyniósł 78,30% kwasu mlekowego w stosunku do początkowej zawartości cukru (99,1±2,0 g/l). Rhizopus oryzae NRRL 395 unieruchomiony w piance poliuretanowej stosowano do produkcji kwasu mlekowego przy użyciu metodologii czynników wieloskładnikowych. Wydajność produkcji kwasu mlekowego zależy od trzech niezależnych zmiennych – pH, stężenia glukozy i tempa napowietrzania. Maksymalna produkcja 93,2 g/l kwasu mlekowego została osiągnięta w hodowlach płynnych w podłożu zawierającym glukozę w ilości 150 g/l, w warunkach pH 6,39 i szybkości mieszania 147 rpm (obr./min). Szybkość mieszania i stężenie glukozy okazały się być czynnikami ograniczającymi. Tak więc każda ich zmiana ma wpływ na wydajność produkcji kwasu mlekowego. Początkowe pH podłoża nie ma wpływu na produkcję z powodu zobojętniania środowiska przez dodawane składniki w procesie fermentacji. Wytwarzanie kwasu mlekowego w optymalnych warunkach przy użyciu unieruchomionych całych komórek obliczono na około 55%, co przewyższa produkcję kwasu mlekowego w systemie hodowli zawiesinowej. W innym badaniu do unieruchomienia bakterii Lactobacillus delbrueckii wykorzystano alginian wapnia i odpady ananasowe. Inne, równie ważne czynniki takie jak temperatura, pH, stężenie alginianu wapnia, średnica kulek i wielkość inoculum muszą być systematycznie brane pod uwagę, by doprowadzić do udanej produkcji kwasu mlekowego.

10.3.5. Oczyszczanie kwasu mlekowego

Oczyszczanie lub odzyskiwanie produktu to ważny krok w produkcji kwasu mlekowego związany z separacją i oczyszczaniem kwasu mlekowego z płynu fermentacyjnego. Płyn fermentacyjny zawiera szereg zanieczyszczeń, pozostałości takich jak cukry, barwniki, składniki odżywcze i inne kwasy organiczne, biomasa. Do odzyskania i oczyszczenia kwasu L(+) mlekowego wytwarzanego z pożywki fermentacyjnej stosuje się chromatografię jonowymienną. Jest to wyjątkowo selektywna metoda zapewniająca odzysk produktu przy bardzo niskich kosztach w krótkim czasie. Kolejnym wyzwaniem jest uzyskanie odpowiedniej czystości produktu końcowego. Stosuje się do tego filtrację z systemem membran. Dzięki zastosowaniu w odpowiednich proporcjach nanofiltracji i modułów membran mikrofiltracyjnych w stabilnym systemie produkcyjnym uzyskuje się czystość produktu powyżej 95%.

10.4.Kwas itakonowy (IA)

Kwas itakonowy C_5H_6O_4 jest kwasem organicznym, w którym jedna grupa karboksylowa jest połączona z grupą metylenową. Jest to nienasycony kwas dikarboksylowy o masie cząsteczkowej 130,1 g/mol występujący w postaci białego krystalicznego proszku. Różnorodność grup funkcyjnych sprawia, że kwas itakonowy jest efektywnym prekursorem w produkcji wielu złożonych związków organicznych, mających wiele zastosowań. Początkowo jedynie obserwowano szlak metaboliczny produkcji kwasu itakonowego (IA). W 1931 r. Kinoshita zalecił usunięcie CO_2 z akonitanu w kluczowej reakcji przy produkcji IA i odkrył możliwość produkcji IA przy udziale Aspergillus itaconicus. Po tym odkryciu produkcja mikrobiologiczna IA stała się przedmiotem zainteresowania wielu badaczy. Wiele wydajnych procesów produkcji IA opatentowano w latach 60. ubiegłego wieku. Uzyskiwane wydajności procesu produkcji kwasu itakonowego różniły się jednak znacznie w zależności od obecności pierwiastków śladowych i/lub geometrii reaktorów. Najnowsze wyniki opublikowane w literaturze także bardzo różnią się od siebie, nawet między tymi samymi odkształceniami, między hodowlami prowadzonymi w kolbach wstrząsanych czy między bioreaktorami i bioreaktorami typu airlift (tabela 10.2).

Do produkcji IA próbowano stosować dwie grupy mikroorganizmów:

1. 1) drożdże, w tym 37 mutantów Candida sp., Rhodotorula sp., Pseudozyma antarctica;

2. 2) grzyby strzępkowe Ustilago zeae, Ustilago maydis, Helicobasidium mompa, Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus TN-484-M1 82 i Aspergillus terreus SKR1020.

Tabela 10.2. Przykładowe wydajności produkcji kwasu itakonowego przez wybrane szczepy grzybów strzępkowych

Mikroorganizm produkcyjny

Wydajność (g/l)

Plon (g/g)

Dni hodowli

Lit.

Aspergillus terreus NRRL 1960

21,6

18,0

18,4

–

0,18

0,30

8

12

6

[1]

[2]

[3]

Aspergillus terreus NRRL 265

48,7

–

11

[4]

Aspergillus terreus DSM

86,2

0,48

7

[5]

Aspergillus terreus TN484-M1

48,0

0,34

6

[6]

Ustilago maydis MB215

44,5

25,0

0,24

0,25

6

3

[7]

[8]

Ustilago maydis NCIM 983

68,4

97,1

0,85

0,90

5

6

[9]

[10]

[1] Lockwood, Moyer. 1949. US Patent 2,462,981A. [2] Kocabas i wsp. 2014. Ann. Microbiol., 64: 75–84. [3] Petruccioli i wsp. 1999. Lett. Appl. Microbiol., 28: 309–312. [4] Lockwood, Moyer. 1949. US Patent 2,462,981A. [5] Kuenz i wsp. 2012. Appl. Microbiol. Biotechnol., 96: 1209–1216. [6] Dwiarti i wsp. 2007. Bioresour. Technol., 98: 3329–3337. [7] Maassen i wsp. 2013. Eng. Life Sci., 14: 129–134. [8] Klement i wsp. 2012. Microb. Cell Fact., 11: 1–13. [9] Chandragiri i Sastry. 2011. Can. J. Chem. Eng. Technol., 2: 128–135.[10] Chandragiri i Sastry. 2011. Int. J. Chem. Sci. Appl., 2: 200–206.

Jak do tej pory powszechnie jest stosowany Aspergillus terreus. Konieczne są jednak dalsze badania mające na celu określenie czynników wpływających na proces wydajności produkcji IA i obniżenie kosztów produkcji. Zaproponowano kilka teorii dotyczących biosyntezy kwasu itakonowego przez grzyby, jednak wciąż główną drogą produkcji jest glikoliza i cykl kwasów trikarboksylowych. W 1957 r. w ekstraktach komórkowych Aspergillus terreus stwierdzono istnienie dekarboksylazy cis-akonitynianowej (CAD), która przyspiesza reakcję produkcji IA (rys. 10.3).

Węgiel pochodzący z glukozy jest przekształcany w procesie glikolizy w pirogronian. Następnie szlak dzieli się i część węgla jest przekształcana w acetylo-CoA i spalana do CO_2, podczas gdy druga część jest przekształcana w szczawiooctan. We wczesnych etapach cyklu z kwasu cytrynowego wytwarzane są cytrynian i cis-akonitan, w późniejszym etapie, dekarboksylaza cis-akonitynianowa (cadA) tworzy kwas itakonowy, uwalniając ditlenek węgla. Ten szlak został udowodniony za pomocą substratów znakowanych 13C i 14C w eksperymentach ze znacznikami. Kwas itakonowy tworzy się przez dekarboksylację kwasu cis-akonitowego, usuwając węgiel C_1 lub C_5 z wyjściowej cząsteczki kwasu cytrynowego. Określono pewne właściwości enzymu cadA Aspergillus terreus: ma on wartość Km 2,45 mM (37°C i optimum pH 6,2). Przy pH 7,5 aktywność spada znacząco i wynosi poniżej 20% wartości maksymalnej. Aktywność dekarboksylazy kwasu cis-akonitowego jest kluczowa dla zachowania całego szlaku biosyntezy kwasu itakonowego, a produktywność kwasu itakonowego jest bezpośrednio skorelowana z poziomem transkryptu genu cadA. Można wywnioskować, że wysoki poziom transkrypcji tego genu jest niezbędny do optymalnej wydajności produkcji kwasu itakonowego.

Rys. 10.3. Biosynteza kwasu itakonowego w komórkach Aspergillus terreus.

10.4.1. Inżynieria metaboliczna kwasu itakonowego Aspergillus terreus i Aspergillus niger

Obecnie wydajność produkcji kwasu itakonowego osiągnięta z zastosowaniem szczepu Aspergillus terreus jest ograniczona do 86 g/l (tab. 10.2), a maksymalna teoretyczna wydajność powinna osiągnąć wartość 240 g/l.

Dla porównania produkcja kwasu cytrynowego osiąga wartości powyżej 200 g/l. Wykazano, że gen odpowiedzialny za wydajność wytwarzania kwasu itakonowego u Aspergillus terreus jest kluczowym enzymem glikolizy. Wiadomo, że kinaza 6-fosfofruktozowa jest hamowana przez cytrynian i adenozynotrifosforan (ATP). Jednakże okazało się, że obcięta wersja genu pfkA Aspergillus niger wykazuje wyższą wydajność kwasu cytrynowego z powodu zmniejszonego hamowania przez cytrynian i ATP. Ta obcięta wersja pfkA wklonowana w Aspergillus terreus miała również pozytywny wpływ na akumulację kwasu itakonowego. Kolejne podejście inżynieryjne dotyczy wewnątrzkomórkowego zaopatrzenia w tlen. Wytwarzanie kwasu itakonowego wymaga ciągłego napowietrzania. Nawet krótka przerwa w dostarczaniu tlenu zmniejsza wydajność kwasu itakonowego. W celu zmniejszenia wrażliwości na tlen w komórkach Aspergillus terreus został wklonowany gen hemoglobiny z Vitreoscilla. Rzeczywiście, ekspresja tego genu prowadzi do zwiększonego wytwarzania kwasu itakonowego. Istnieje także możliwość, że struktura genetyczna Aspergillus terreus nie jest wystarczająco wydajna, aby uzyskiwać wyższą wydajność kwasów organicznych. Dlatego strategia polega na genetycznym zmodyfikowaniu szlaku biosyntezy kwasu itakonowego przez wprowadzenie go do innego organizmu gospodarza, o którym wiadomo, że wspiera produkcję wysokich wydajności kwasów organicznych. Jak już wspomniano, takim kandydatem jest Aspergillus niger. Unikalnym i kluczowym krokiem w szlaku biosyntezy jest dekarboksylacja kwasu cis-akonitowego w kierunku tworzenia kwasu itakonowego. Gdy znaleziono gen cadA w Aspergillus terreus, stała się możliwa ścieżka wklonowania go do innego organizmu. Przeniesiono więc gen cadA Aspergillus terreus do komórki szczepu Aspergillus niger AB. W tym celu gen cadA umieszczono pod kontrolą promotora gpdA Aspergillus niger, który umożliwia silną i konstytutywną ekspresję. Szczep Aspergillus niger, który eksprymuje sam gen cadA, ma zdolność do wytwarzania około 0,7 g/l kwasu itakonowego. Ten poziom jest nieporównywalny z obecnymi szczepami produkcyjnymi Aspergillus terreus, ale jest obiecującym punktem wyjścia do dalszych kroków inżynieryjnych. Dalsza próba opisania wydajności polega na ekspresji genów takich jak wyżej wspomniane mitochondrialne białko nośnikowe wraz z genem cadA.

10.4.2. Zoptymalizowane warunki hodowli Aspergillus terreus DSM 23081

Hodowla Aspergillus terreus DSM 23081 przebiega optymalnie w warunkach stałej dostawy tlenu (20% nasycenia tlenem), początkowego stężenia glukozy 180 g/l, KH_2PO_4 – 0,1 g/l, NH_4NO_3 – 3 g/l i CaCl_2 · 2H_2O – 5 g/l. Wydajność produkcji kwasu itakonowego w hodowlach okresowych prowadzonych w kolbach Erlenmeyra w czasie 7–8 dni wynosiła 80,8 g/l. Produkcję kwasu itakonowego przez Aspergillus terreus w zoptymalizowanych warunkach hodowli przetestowano w 15-litorwym bioreaktorze Biostat E o objętości roboczej 10 l w hodowli okresowej. Temperatura hodowli wynosiła 33°C, początkowe pH podłoża 3,1 bez korekty w czasie trwania hodowli, wielkość inoculum 1 · 10^6 spor/ml podłoża. Po 7 dniach hodowli osiągnięto wydajność produkcji kwasu itakonowego 86,2 g/l przy szybkości produkcji IA 0,51 g/(l · godz.) i plon IA 0,62 g/g glukozy.

10.4.3. Zastosowanie kwasu itakonowego

Kwas itakonowy stosuje się do syntezy siatek, włókien, poliestrów, tworzyw sztucznych, sztucznego szkła, porcelany. Jest surowcem do produkcji związków bioaktywnych wykorzystywanych w rolnictwie, farmacji i medycynie. Kwas itakonowy jest również stosowany w detergentach, środkach czyszczących, szamponach, farmaceutykach i herbicydach oraz do ulepszania właściwości papieru, celofanu. IA usuwa nienasycone żywice poliestrowe z linii lakierniczych i pistoletów tnących piankę poliuretanową, większości farb i atramentów. Kwas itakonowy może być stosowany w takich dziedzinach biomedycznych jak dentystyka i okulistyka.

10.5.Kwas octowy

Globalny rynek kwasu octowego jest szacowany w przybliżeniu na 9,0 mld dolarów i oczekuje się, że w 2022 r. osiągnie prawie 12 mld dolarów (Acetic Acid Market 2016). Kwas octowy stosuje się w syntezie produktów chemicznych takich jak bezwodnik octowy, monomer octanu winylu, estry octanowe i oczyszczony kwas tereftalowy. Chemikalia te są następnie stosowane w wielu różnych branżach takich jak tekstylia, budownictwo, motoryzacja, pestycydy, żywność i inne.

Produkcja octu sięga co najmniej 200 lat p.n.e., ale na początku był on postrzegany jako „pozostałość” w produkcji wyrobów fermentowanych. Ocet jest częścią naszej diety jako przyprawa i środek konserwujący żywność. Ustanowione w Unii Europejskiej limity kwasowości i resztkowej zawartości etanolu określają, że kwasowość octu winnego musi wynosić co najmniej 6%, a maksymalna dopuszczalna pozostałość etanolu – 1,5%. Różnorodność produktów zawierających ocet jest bardzo duża – od produktów ubocznych i nadwyżek rolnych po wysokiej jakości najbardziej unikalne i cenione odmiany, takie jak ocet „Sherry” (Hiszpania) i „Aceto Balsamico Tradizionalle” (Włochy). Europejska norma jakości określa dziesięć rodzajów octu, w tym ocet winny, owocowy, jabłeczny, alkoholowy, zbożowy, słodowy, destylat słodowy, balsamiczny (z dodatkiem moszczu winogronowego) oraz „inne octy balsamiczne” wytwarzane z takich surowców jak miód lub ryż. Bez wątpienia ocet winny jest najpopularniejszy w krajach śródziemnomorskich. Jednak na całym świecie w większości jest używany ocet „biały” produkowany bezpośrednio z rozcieńczonego alkoholu.

10.5.1. Systemy produkcji kwasu octowego

Istnieją różne systemy produkcji kwasu octowego. W tradycyjnych octowniach utlenianie etanolu do kwasu octowego odbywa się w hodowli statycznej bakterii kwasu octowego na granicy faz między cieczą a powietrzem. Jest to hodowla powierzchniowa – biofilm utworzony przez bakterie kwasu octowego na powierzchni utlenia etanol do kwasu octowego. Octy produkowane w tym tradycyjnym systemie są ogólnie uważane za wysokiej jakości ze względu na ich złożoność organoleptyczną. W rzeczywistości jakość produktu końcowego wynika z:

1. 1) surowca (wina lub innego substratu);

2. 2) metabolizmu bakterii kwasu octowego, które powodują pewne dodatkowe przemiany (głównie reakcje utleniania, ale także powstawanie estrów);

3. 3) interakcji między wyprodukowanym octem a drewnem z beczek jako naczyń inkubacyjnych;

4. 4) procesu starzenia się octu, który łączy wszystkie wyżej wymienione cechy.

Produkcja octu metodami tradycyjnymi trwa 6–12 miesięcy. Obecnie w ramach projektu WINEGAR proces ten został skrócony do dwóch miesięcy. W celu skrócenia czasu zakwaszania stosuje się też inne metody, np. system Schutzenbacha lub system z hodowlami zanurzeniowymi. W systemie Schutzenbacha bakterie unieruchomione na wiórach drzewnych tworzą solidne złoże, na którym rozprzestrzenia się ocet. Po przejściu przez to złoże, ocet zbiera się do pojemnika na dole, a następnie pompuje z powrotem do tego samego nieruchomego złoża. Kwasowość octu sukcesywnie wzrasta, a po tygodniu można już uzyskać ocet pożądanej jakości. Znacznie szybsze są systemy hodowli zanurzeniowych wykorzystujące odpowiednie turbiny do generowania przepływu pęcherzyków powietrza do wina lub roztworu alkoholowego. Proces utleniania zachodzi na granicy faz ciecz–pęcherzyki powietrza. W systemie bakterie stają się bioreaktorami do przekształcania alkoholu w kwas octowy, przy bardzo ograniczonej produkcji innych metabolitów. Przepływ powietrza przyczynia się również do odprowadzenia niepożądanych związków lotnych obecnych w oryginalnym winie, dzięki czemu produkt ma lepsze właściwości organoleptyczne, a także znacznie niższy koszt produkcji. Obecnie najczęściej stosuje się pojemniki hodowlane ze stali nierdzewnej, które są bardzo higieniczne i odporne na zużycie. Mimo nieco gorszej jakości produktu, metoda ta ma dwie ważne zalety: szybkość (ocet produkowany jest w cyklach 24-godzinnych) i kwasowość (produkt może osiągnąć stężenie kwasu octowego do 23–25% w porównaniu z 6–13% w innych systemach). Wyższa kwasowość (stężenie) obniża koszty transportu, gdyż nie transportuje się wody.

Starzenie octu w beczkach drewnianych znacznie poprawia jego właściwości organoleptyczne. W czasie tego procesu, oprócz interakcji z drewnem, zachodzą różne zjawiska i reakcje chemiczne – parowanie, wytwarzanie estrów, reakcje między kwasami i resztkowymi alkoholami – prowadzące do lepszej integracji aromatów i metabolitów oraz zmniejszenia ostrości kwasu octowego.

Kwas octowy produkują bakterie Gram-ujemne lub Gram-zmienne, elipsoidalne lub cylindryczne. Można je obserwować pod samym mikroskopem w parach lub w agregatach i łańcuchach. Bakterie kwasu octowego żyją w warunkach tlenowych, a tlen jest końcowym akceptorem elektronów. Ich przeżycie w warunkach prawie beztlenowych jakie panują podczas fermentacji wina jest możliwe dzięki temu, że końcowymi akceptorami elektronów mogą być też inne związki. Bakterie te znajdują się na surowcach zawierających cukry/alkohol jak sok owocowy, wino, jabłecznik, piwo itp. W warunkach, gdy cukry i alkohole są niecałkowicie utlenione, następuje akumulacja wytwarzanych kwasów organicznych – octowego z etanolu lub glukonowego z glukozy.

Wraz z zastosowaniem genetycznie zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli wydajność produkcji kwasu octowego wynosiła 53 g/l, a przy użyciu genów mutanta Clostridium thermoaceticum – 83 g/l. Klonowanie genu dehydrogenazy aldehydowej z Acetobacter polyoxogenes na wektorze plazmidowym do Acetobacter aceti subsp. ksylinum zwiększało wydajność produkcji kwasu octowego do 68−97 g/l.

10.5.2. Bakterie kwasu octowego

Niektóre bakterie kwasu octowego mogą spalać etanol w cyklu kwasów trikarboksylowych do CO_2 i wody. Aby zapobiec całkowitemu utlenianiu do ditlenku węgla i wody, należy w podłożu hodowlanym utrzymywać niskie stężenie etanolu, który hamuje ten proces. W rzeczywistości stężenia etanolu 0,5–1% są regularnie utrzymywane w octach. Bakterie kwasu octowego zostały uznane za „wybredne” ze względu na słaby wzrost w podłożach hodowlanych. Wiele szczepów traci zdolność do wytwarzania wyższych stężeń kwasu octowego, gdy rosną na podłożach hodowlanych. Rodzaje Acetobacter i Gluconobacter można rozróżnić na podstawie preferencji alkoholu lub glukozy jako substratu. Stosowane metody molekularne umożliwiły stwierdzenie 14 rodzajów i około 70 gatunków bakterii kwasu octowego. Drzewo filogenetyczne zaproponowane przez Yamada i wsp. (2012) zawiera kilka rodzajów bakterii kwasu octowego:

1. 1) 20 gatunków z rodzaju Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus);

2. 2) 13 gatunków z rodzaju Gluconobacter (Gluconobacter oxydans, Gluconobacter roseus);

3. 3) 7 gatunków Asaia (Asaia bogorensis, Asaia prunellae);

4. 4) 9 gatunków Gluconacetobacter (Gluconacetobacter diazotrophicus, Gluconacetobacter liquefaciens);

5. 5) 11 gatunków Komagataeibacter (Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacter xylinus);

6. 6) inne gatunki mniej zbadane.

Zsekwencjonowano około tuzina gatunków i ponad 40 szczepów bakterii kwasu octowego. Niektóre z najbardziej znanych gatunków w produkcji octu zostały przeniesione do innych rodzajów. Na przykład trzy najstarsze gatunki opisane w produkcji octu zostały początkowo sklasyfikowane jako rodzaj Acetobacter, następnie przeklasyfikowane na Gluconacetobacter, a ostatnio na Komagataeibacter. Gatunki te, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacter hansenii i Komagataeibacter ksylinus, pojawiają się obecnie w literaturze lub podręcznikach pod trzema różnymi rodzajami. Opracowano metody identyfikacji tej grupy fizjologicznej bakterii na poziomie szczepu, które umożliwiły śledzenie populacji bakterii kwasu octowego od winogron poprzez produkcję wina po produkcję octu.

Ocet winny jest wytwarzany przez różne szczepy i gatunki w zależności od stężenia kwasu octowego. Przy niskich stężeniach kwasu octowego dominują gatunki z rodzaju Acetobacter. W octach winnych dominują Acetobacter pasteurianus, a subdominantami są Acetobacter malorum, Acetobacter cerevisiae lub Acetobacter aceti, które mogą również występować w innych octach owocowych. Gdy stężenie kwasu octowego przekracza 5%, dominują gatunki z poprzedniego Gluconacetobacter z przewagą Komagataeibacter europaeus lub Gluconacetobacter intermedius. Zjawisko sukcesji gatunków w procesie produkcji kwasu octowego zaobserwowano również podczas trwania projektu WINEGAR. Kultury starterowe Acetobacter pasteurianus skutecznie inicjowały proces produkcji octu, a potem zostały zastąpione przez Komagataeibacter europaeus. Obecnie sądzi się, że hodowla starterowa powinna być utworzona z mieszanki szczepów bakterii kwasu octowego „szybkiego startu” (Acetobacter pasteurianus lub podobny) i innej o wysokiej tolerancji na kwas octowy (Komagataeibacter europaeus lub podobny), aby zagwarantować szybki start i dobre zakończenie procesu produkcji kwasu octowego.

10.5.3. Skład chemiczny i jakość octu

Ostateczna jakość octu zależy od wyboru odpowiednich szczepów starterowych (ogólnie mieszanych), a także od jakości materiału wyjściowego, metody produkcji, a w niektórych przypadkach – od procesu starzenia octu. Stosunkowo łatwo jest ocenić różnice sensoryczne między produktami wytwarzanymi metodami tradycyjnymi a produktami wytwarzanymi na skalę przemysłową. Dokładna charakterystyka i ocena jakości wymaga określenia zawartości wielu związków i analizy sensorycznej. Ostatnio dokonano znacznego postępu w identyfikacji związków odpowiedzialnych za jakość sensoryczną produktów, a metody produkcji zostały zmienione w celu uzyskania octu o wysokiej akceptacji konsumentów i bardzo konkurencyjnych cenach. Grupa naukowców z Uniwersytetu w Sewilli od 20 lat zajmuje się charakterystyką octu winnego. Ich zdaniem decydujący wpływ na jego jakość mają związki aromatyczne. Aromat jest frakcją złożoną, zawierającą wiele związków o szerokim zakresie lotności, polarności i stężeń od kilku miligramów do nanogramów na litr. Do tej pory zidentyfikowano ponad 100 różnych związków chemicznych w wyprodukowanym occie winnym, w tym związki karbonylowe, etery, acetale, laktony, kwasy, alkohole, fenole i lotne estry, z których wszystkie wpływają w różnym stopniu na końcowy smak produktu. W procesie starzenia kontakt z drewnem powoduje znaczny wzrost złożoności aromatycznej. Nie wszystkie lotne związki są odpowiedzialne za aromat produktu. Muszą nie tylko docierać do receptorów substancji zapachowych, ale także oddziaływać z nimi w nabłonku węchowym, a nie wszystkie lotne związki są aktywnymi substancjami zapachowymi. Charakterystyczny aromat octu Sherry obejmuje kilka lotnych związków – diacetyl, octan izoamylu, kwas izowalerianowy, octan etylu i sotolon. Wszechobecne w produktach roślinnych związki polifenolowe mają działanie antyoksydacyjne i są odpowiedzialne za kolor i cierpkość octu.

Reaktywność związków fenolowych i tlenu jest szczególnie analizowana pod kątem wpływu na brązowienie białych win i reakcji antocyjanów w winach czerwonych. Oczekuje się również, że szybkość acetyfikacji związana z rozpuszczalnością tlenu w środowisku jest decydującym czynnikiem, który może być przydatny do określenia metody wytwarzania octu. Należy podkreślić, że systemy hodowli zanurzeniowych wykorzystują nadmiar tlenu, aby zabezpieczyć i przyspieszyć proces. Dostępność tlenu jest ograniczona w hodowlach powierzchniowych, ponieważ jest on stale pobierany przez bakterie kwasu octowego. Ponadto tlen w różnym stopniu wpływa na klasy związków polifenolowych. Na przykład dostępność tlenu podczas fermentacji wgłębnej ma duży wpływ na zawartość flawonolu w octach. Natomiast ocet pozyskany z hodowli powierzchniowych nie wpływa na aldehydy fenolowe uwalniane z drewnianych beczek do produktu. Badano zmiany związków fenolowych podczas acetylacji w systemach hodowli zanurzeniowych zarówno w fermentorach laboratoryjnych, jak i przemysłowych. W fermentorze laboratoryjnym z czerwonym winem Sherry jako substratem profil fenolowy nie został znacząco zmieniony, ale odnotowano 50-procentowy spadek zawartości związków fenolowych, głównie antocyjanów, w occie z tego wina.

10.5.4. Procesy starzenia octu

Podczas starzenia przebiegają różne reakcję związków – zarówno polimeryzacja, jak i uwalnianie związków z drewna oraz straty w wyniku parowania. Substancje przenikające z drewna zależą od jego gatunku, stosunku powierzchni kontaktu do objętości cieczy i czasu starzenia. Zaobserwowano znaczne różnice w składzie fenolowym octu Sherry w wieku dwóch lub więcej lat w statycznych lub tradycyjnych systemach Solera. Obserwacja ewolucji związków fenolowych w occie Sherry dojrzewającym przez 90 dni w dębowych beczkach wykazała znaczne różnice w składzie pod względem zawartości związków waniliny, aldehydu syringowego, aldehydu koniferylowego i kwasu cynamonowego. Poprawną klasyfikację octu dojrzewającego w różnym czasie osiągnięto za pomocą liniowej analizy dyskryminacyjnej z wykorzystaniem aldehydów fenolowych jako zmiennych. Ponadto niektóre flawonoidy są chemicznymi markerami drewna, z którym ocet miał kontakt; (+)dihydrorobinetin jest charakterystycznym związkiem uwalnianym z nieopalonego drewna akacjowego, a (–)folinis jest zazwyczaj uwalniany z drewna wiśniowego.

10.5.5. Ocena jakości produkowanego octu

Ocet jest produktem trudnym do posmakowania ze względu na intensywne doznania, które wywołuje. Wysoka zawartość ostrego kwasu octowego maskuje inne smaki, a do degustacji jest wymagana pewna znajomość produktu. W rzeczywistości nie ma zgody co do tego, jak smakować ocet. Panel analizy sensorycznej octu wymaga dobrze wyszkolonych degustatorów i wybrania konkretnych atrybutów przydatnych do rozróżnienia próbek. Do trenowania panelu octu sporządza się roztwory o różnych stężeniach związków najczęściej występujących w occie winnym, takich jak kwas octowy, octan etylu i ekstrakt drzewny, otrzymane przez macerację. Dwa ostatnie przygotowuje się w 7% kwasie octowym, aby wywołać wrażenie podobne do octu. Agresywność kwasu octowego ogranicza liczbę próbek, które można zbadać w każdej sesji, a każda próbka jest próbowana cztery razy. Cztery powtórzone próbki należy degustować w różnych dniach, aby uniknąć sensorycznego nasycenia degustatorów. Analizę opisową próbek przygotowuje się na podstawie wcześniej wybranych atrybutów, które mogą być ocenione przez panel. Do atrybutów tych należą kolor, intensywność aromatyczna, zapachy: drzewny, ziołowy, owocowy, octanu etylu i wina oraz cierpkość. Octy wysokiej jakości zawierają wiele związków aromatycznych w stężeniach przekraczających ich wartości progowe, w tym wanilinę, eugenol i benzaldehyd, dlatego tę cechę można wybrać jako atrybut octu wysokiej jakości.

10.6.Kwas glukonowy (GA)

Kwas glukonowyznany jako kwas polihydroksykarboksylowy występuje naturalnie w organizmach żywych, w tym u ludzi. Jest to nietoksyczny, miękki, nielotny, łagodny kwas organiczny szeroko stosowany w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym, skórzanym i innych. W roztworach wodnych przy pH neutralnym kwas glukonowy tworzy jon glukonianowy, którego sole są znane jako glukoniany.

Na skalę przemysłową kwas glukonowy może być produkowany trzema różnymi metodami:

1. 1) przez elektrolityczne przyłączenie tlenu do glukozy w roztworze;

2. 2) przez chemiczne utlenianie glukozy roztworem podchlorynu;

3. 3) w procesie fermentacji z zastosowaniem określonych szczepów produkcyjnych w podłożu zawierającym glukozę lub inne substraty.

Trzy grupy mikroorganizmów: bakterie, drożdże i szczególnie grzyby strzępkowe mają zdolność wytwarzania kwasu glukonowego. Wśród grzybów strzępkowych zdolności te mają gatunki Aspergillus, Gliocladium, Penicillium, Pullularia, Scopulariopsis i Gonatobotrys. Spośród bakterii kwas glukonowy produkują Acetobacter methanolicus, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans oraz Pseudomonas sp., Acetobacter sp., Moraxella sp., Gluconobacter sp. i Enterobacter sp. uczestniczące w szczególnym szlaku przez utlenianie glukozy z dehydrogenazą glukozową. Do komercyjnego wytwarzania kwasu glukonowego stosuje się kilka szczepów drożdży takich jak Aureobasidium pullulans. Wytwarzanie kwasu glukonowego przez grzyby jest prostą reakcją odwodornienia, w której zachodzi konwersja glukozy do kwasu glukonowego, katalizowaną przez enzym oksydazę glukozową (β-D-glukoza: oksydoreduktaza tlenu). Oksydaza glukozowa katalizuje reakcję, w której glukoza jest przekształcana w glukono-δ-lakton z usunięciem cząsteczki wody, a wodór jest przenoszony do FAD. Powstały FADH_2 jest przywracany do FAD przez przeniesienie wodoru na tlen z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Oksydaza glukozowa przenosi dwa atomy wodoru z grupy –CHOH glukozy na tlen jako akceptor elektronów tworząc H_2O_2.

1. glukoza + ½ O_2 + H_2O → glukono-δ-lakton (oksydaza glukozowa)

2. glukono-δ-lakton + H_2O → kwas glukonowy + H_2O_2 (laktonaza lub spontanicznie)

3. H_2O_2 → H_2O + ½ O_2 (katalaza)

Szczep Aspergillus niger jest w stanie wyprodukować kwas glukonowy z glukozy z wydajnością 90–98% odpowiednio: w chemostacie – 230–433 g/l lub w hodowli okresowej z dokarmianiem – 504 g/l. Stężenie glukozy w podłożu fermentacyjnym zmieniało się w zakresie 27,3–54,5% (wag./obj.) przy pH 6,0.

Branże chemiczna, farmaceutyczna i budowlana są zainteresowane produkcją absolutnego kwasu polihydroksykarboksylowego, który ma zarówno reaktywne grupy karboksylowe, jak i hydroksylowe. Kwas glukonowy jest naturalnym składnikiem miodu i soków owocowych. Jego wewnętrzny ester, glukozo-δ-lakton, ma przede wszystkim słodki smak, który z czasem nieco kwaśnieje. Kwas glukonowy ma wiele zastosowań – od przemysłu spożywczego (w produktach mlecznych, mięsnych i piekarniczych) po środek do mycia butelek czy do produkcji betonu w ekstremalnych warunkach klimatycznych.

Inne zastosowania kwasu glukonowego:

1. 1) glukonian wapnia jest wykorzystywany do leczenia oparzeń kwasem fluorowodorowym, a w poważniejszych oparzeniach w celu uniknięcia martwicy tkanek głębokich;

2. 2) glukonian sodu ma wyjątkową zdolność do chelatowania wapnia i innych jonów metali dwu- i trójwartościowych;

3. 3) glukonian chininy, który jest solą kwasu glukonowego i chininy, jest używany do iniekcji domięśniowych w leczeniu choroby malarycznej;

4. 4) glukonian żelaza stosowano w przeszłości do leczenia niedokrwistości;

5. 5) w przemyśle tekstylnym kwas glukonowy służy do usuwania żelaza w różnym zakresie pH, a także zapobiega rdzewieniu;

6. 6) glukonian cynku podawany w zastrzykach służy do leczenia licznych chorób wywołanych niedoborami cynku takich jak zmiany skórne, opóźnione dojrzewanie płciowe i podatność na infekcje.

10.7.Kwas bursztynowy

Metodami inżynierii metabolicznej uzyskano szczep Escherichia coli mający trzy dezaktywowane geny centralnego szlaku metabolicznego – AdhE, ldhA i act-pta – oraz inaktywowany gen iclR, który spowodował aktywację szlaku glioksalowego. Szczep ten produkował kwas bursztynowy w ilości 40 g/l. Dzięki inżynierii metabolicznej skonstruowano szczep Mannheimia succiniciproducens produkujący kwas bursztynowy w ilości 52 g/l z wydajnością 1,16 mol/mol glukozy i tempem produkcji 1,8 g/(l · godz.) w hodowli okresowej z zasilaniem. Metabolicznie modyfikowany szczep Escherichia coli wytwarza kwas bursztynowy w ilości 58 g/l w 59-godzinnej fermentacji półciągłej w warunkach tlenowych.

10.8.Inne kwasy organiczne

Za pomocą inżynierii metabolicznej skonstruowano:

1. 1) szczep fermentacyjny Clostridium tyrobutyricum produkujący kwas masłowy w ilości 80 g/l z plonem 0,45 g/g glukozy;

2. 2) rekombinowany szczep Saccharomyces cerevisiae zawierający sklonowany gen fumarazy wytwarzający kwas jabłkowy z kwasu fumarowego w ilości 125 g/l z wydajnością substratu 90%.

Wydajności procesu fermentacji z zastosowaniem mikroorganizmów niektórych innych kwasów organicznych są następujące: pirogronowego – 135 g/l, fumarowego – 107 g/l, szikimowego – 90 g/l, kwasu dehydroszikimowego – 69 g/l, kwasu propionowego – 106 g/l, szczawiowego – 68 g/l i glicerynowego – 136 g/l. Biokonwersję nasyconych i nienasyconych liniowych alifatycznych węglowodorów C12–22 do ich końcowych kwasów dikarboksylowych w warunkach tlenowych opracowano przez rozbicie odpowiedniego genu i amplifikację innego genu u Candida tropicalis, z wydajnością 200 g/l, bez reakcji ubocznych, takich jak tworzenie kwasów nienasyconych, hydroksylacja czy skrócenie łańcucha.

Literatura rekomendowana

Angumeenal A.R., Venkappayya D. 2013. An overview of citric acid production. Food Sci. Technol., 50: 367–370.

Anastassiadis S., Morgunov I.G. Gluconic Acid Production. Recent Patents on Biotechnology 2007, 1, 000-000 1 Bentham Science Publishers Ltd.

Ciriminna R., Meneguzzo F., Delisi R., Pagliaro M. 2017. Citric acid: emerging applications of key biotechnology industrial product. Chem. Central J., 11: 22.

da Cruz J.C., Sérvulo E.F.C., de Castro A.M. 2017. Microbial Production of Itaconic Acid. [w:] Microbial Production of Food Ingredients and Additives http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-811520-6.00010-6

Demain A.L., Sanchez S. 2018. Advancement of biotechnology by genetic modifications. [w:] Microbial Carotenoids from Fungi: Methods and Protocols, red. Barredo J. Humana. Press/Springer, New York,

Ghaffa T., Irshad M., Anwar Z., Aqil T., Zulifqar Z., Tariq A., Kamran M., Ehsan N., Mehmood S. 2014. Recent trends in lactic acid biotechnology: A brief review on production to purification. J. Radiation Res. Appl. Sci., 7: 222–229.

Khan I., Qayyum S., Maqbool F., Rehman M., Hayati A., Farooqui S. 2017. Microbial organic acids production, biosynthetic mechanism and applications – Mini review. Indian J. Geo Marine Sci., 46: 2165–2174

Kuenz A., Gallenmüller Y., Willke T., Vorlop K.-D. 2012. Microbial production of itaconic acid: developing a stable platform for high product concentrations. Appl. Microbiol. Biotechnol., 96: 1209–1216.

Mas A., Torija M.J., del Carmen Garcia-Parrilla M., Troncoso A.M. 2014. Acetic acid bacteria and the production and quality of wine vinegar. Sci. World J., Article ID 394671.

Meyratha J. 1967. Citric acid production. Process Biochem., 2: 25–27.

Ramachandran S., Fontanille P., Pandey A., Larroche C. 2006. Gluconic acid: properties, applications and microbial production, a review. Food Technol. Biotechnol., 44: 185–195.

Show P.L., Oladele K.O., Siew Q.Y., Zakry F.A.A., Lan J.W., Ling T.C. 2015. Overview of citric acid production from Aspergillus niger. Frontiers in Life Sciences, 8: 271–283.

Singh R., Kumar M., Mittal A., Mentha P.K. 2017. Microbial metabolites in nutrition, healthcare and agriculture. 3 Biotech., 7: 15.

Singh O.V. i Kumar R. 2007. Biotechnological production of gluconic acid: future implications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 713–722.

Steiger M.G., Blumhoff M.L., Mattanovich D., Sauer M. 2013. Biochemistry of microbial itaconic acid production. Frontiers Microbiol., 4 | Article 23 | 1.

Swain M.R., Ray R.C., Patr J.K. 2011. Citric acid: microbial production and applications in food and pharmaceutical industries. [w:] Citric Acid, red. Vargas D.A. i in. Nova Science Publishers, Inc.

Sumitra R., Pierre F., Ashok P., Christian L. 2006. Gluconic acid: A review. Food Technol. Biotechnol., 44: 185–195.

Yamada Y., Yukpan P., Vu H.T.L. i wsp. 2012. Description of Komagataeibacter gen. nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae). J. General Appl. Microbiol., 58: 397–404.

11

Mikrobiologiczna produkcja aminokwasów

11.1.Wprowadzenie

Zainteresowanie aminokwasami, rozwojem technologii ich produkcji rosło z biegiem lat. W 1907 r. Kikunae Ikeda na Cesarskim Uniwersytecie w Tokio rozpoczął badania dotyczące oczyszczania i identyfikacji związków chemicznych wodorostu Laminaria japonica. Po roku badań odkrył, że w ekstrakcie Laminaria japonica znajdują się znaczne ilości glutaminianu monosodowego (MSG). Od czasu tego odkrycia zapotrzebowanie rynku na MSG wciąż rośnie. Aminokwasy są stosowane w wielu gałęziach przemysłu jako związki biochemiczne do produkcji dodatków paszowych dla zwierząt, wzmacniaczy smaku produktów spożywczych, składników kosmetyków i produktów medycznych. Aminokwasy odgrywają ważną rolę jako związki pośrednie w budowaniu białek, biorą udział w regulacji głównych szlaków metabolicznych i w procesach wzrostu i rozwoju organizmów. W szczególności działają prozdrowotnie przez zwiększanie efektywności wykorzystania żywności, zmniejszenie otyłości, regulację metabolizmu białek mięśniowych i kontrolę wzrostu i odporności organizmu. Stwierdzono, że niedobory aminokwasów są przyczyną poważnych chorób u ludzi i zwierząt. Dlatego wciąż rośnie zainteresowanie badaniem i rozwojem nowych technologii wytwarzania aminokwasów.

Globalne zapotrzebowanie na niektóre niezbędne aminokwasy, np. lizynę i metioninę, znacznie wzrosło ze względu na ich szerokie zastosowanie w przemyśle paszowym, spożywczym i farmaceutycznym. Dodatek tych aminokwasów do paszy nie tylko optymalizuje wzrost zwierząt, lecz także poprawia jakość i ilość mięsa. Z kolei dostępność produktów pochodzenia zwierzęcego pomaga w przezwyciężeniu chorób spowodowanych niedoborem niezbędnych aminokwasów, co widać wyraźnie na przykładzie słabo rozwiniętych i przeludnionych obszarów globu, gdzie ludzie mają ograniczony dostęp do żywności zawierającej aminokwasy. Zapotrzebowanie na mniej istotne aminokwasy, np. kwas glutaminowy, również znacznie wzrosło w ostatnich latach ze względu na jego szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym. W 2008 r. całkowity rynek aminokwasów oszacowano na ok. 5,4 mld dolarów, a w 2018 r. wartość ta osiągnęła 9 mld dolarów.

Znanych jest około 500 aminokwasów, z których jedynie 20 buduje białka. W zależności od lokalizacji grup funkcyjnych klasyfikuje się je na α-, β-, γ- i δ- aminokwasy. Inny podział jest związany z polarnością, pH, budową łańcucha: alifatyczne, acykliczne, aromatyczne, zawierające grupą hydroksylową lub siarkową. Aminokwasy są konstruktywnymi składnikami (podjednostkami) białek i peptydów. Ich cząsteczki zawierają wysoki procent azotu (~16%), co odróżnia je od tłuszczów i węglowodanów.

Aminokwasy dzielą się na dwie kategorie:

1. 1) egzogenne, które nie są syntetyzowane przez organizm człowieka (arginina, histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina);

2. 2) endogenne, syntetyzowane przez organizm człowieka (alanina, asparagina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glutamina, cysteina, glicyna, prolina, seryna, tyrozyna).

Produkcja aminokwasów w białej biotechnologii jest pod względem ilości trzecią co do ważności – po etanolu i antybiotykach. Wartość produkcji L-glutaminianu i L-lizyny przekracza 1,5 mld dolarów rocznie. Są one wytwarzane przez różne gatunki z rodzaju Corynebacterium i Brevibacterium. Roczna produkcja przekracza 3 mln ton.

Glutaminian sodu, silny wzmacniacz smaku, to aminokwas produkowany w największych ilościach. Jest wytwarzany na drodze fermentacji przy użyciu różnych szczepów z rodzaju Corynebacterium i Brevibacterium, jak Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum i Brevibacterium lactofermentum. Obecnie dwa ostatnie z wymienionych są klasyfikowane jako podgatunki Corynebacterium glutamicum, tj. Corynebacterium glutamicum ssp. flavum i Corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum.

11.2.Metody pozyskiwania aminokwasów

11.2.1. Ekstrakcja aminokwasów z hydrolizatów białkowych

Aminokwasy mogą być wytwarzane w procesach ekstrakcji z hydrolizatu białkowego, syntezy chemicznej lub w procesach enzymatycznych i fermentacyjnych przy udziale mikroorganizmów. Fermentacja jest jednym z najbardziej obiecujących procesów komercyjnej produkcji aminokwasów. Dzięki technikom inżynierii genetycznej można wpływać na jej wydajność, specyficzność i produktywność związków. Bakteriami najczęściej stosowanymi w przemyśle do wytwarzania aminokwasów są Corynebacterium glutamicum i Escherichia coli.

Metodąekstrakcji z hydrolizatów białkowych w skali przemysłowej można wytwarzać tylko trzy aminokwasy: L-cysteinę, L-leucynę i L-tyrozynę. W metodzie tej wykorzystuje się różnice we właściwościach fizykochemicznych (takich jak powinowactwo chemiczne i pH) aminokwasów do ich rozdzielenia. Zgodnie z zapotrzebowaniem na odpowiedni aminokwas można opracować różne metody ekstrakcji. Na przykład L-cysteina tradycyjnie wytwarzana z keratyny zwierząt i ludzi (z piór, włosów, szczeciny i kopyt) jest ekstrahowana z zastosowaniem aktywnego węgla drzewnego i stężonego kwasu chlorowodorowego. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie przemysłowych produktów ubocznych lub odpadów takich jak włosy, mięso, ekstrakty i hydrolizaty roślinne. Metoda ekstrakcji jest prosta, odczynniki są łatwo dostępne, a proces biotechnologiczny dobrze opracowany. Niemniej w warunkach środowiska alkalicznego może następować degradacja białka, co skutkuje niskim poziomem ekstrakcji aminokwasów. W niepożądanych reakcjach mogą powstawać związki toksyczne obniżające wartość odżywczą produktu. Ponadto niezbędne przemywanie produktu z roztworu alkalicznego generuje duże ilości ścieków. Bardziej skuteczne metody ekstrakcji wykorzystują wodę w wysokich temperaturach: warunki podkrytyczne (100°C < T < 374,2°C) lub warunki nadkrytyczne (T = 374,2°C i ciśnienie 22,05 MPa). Badania wykazały, że wydajność ekstrakcji aminokwasów wzrasta wraz z temperaturą i czasem trwania hydrolizy. W tych warunkach możliwy jest rozpad wiązań peptydowych z wydzieleniem aminokwasów.

Aminokwasy L-leucynę, L-alaninę i L-serynę wytwarza się z odpadów zwierzęcych. Są one ekstrahowane w wodzie w warunkach podkrytycznych w temp. 180–320°C pod ciśnieniem 3–30 MPa. Warunki te są konieczne do uzyskania wysokiej wydajności. Maksymalną wydajność uzyskano w temp. 200-290°C w czasie reakcji 5–10 min. Dzięki temu w procesie zamiast rozpuszczalników organicznych, które nie są przyjazne dla środowiska, wykorzystuje się wodę. Problemem jest dostępność naturalnych surowców bogatych w białko w ilościach potrzebnych do zaspokojenia rosnących zapotrzebowań na aminokwasy.

W metodzie enzymatycznej wykorzystuje się nadaktywność proteolityczną enzymu lub kombinacji kilku enzymów, takich jak enzymy hydrolityczne, liazy amoniakalne, dehydrogenazy aminokwasów zależne od NAD, w celu zhydrolizowania białka do aminokwasów. Większość tych enzymów otrzymuje się z wykorzystaniem mikroorganizmów takich jak Escherichia coli, Pseudomonas dacunhae, Crypotococcus lurendii i Saccharomyces cerevisiae. Głównymi zaletami szlaku enzymatycznego są optyczna czystość i wysokie stężenie wyprodukowanego D- i L-aminokwasu, a przy tym małe stężenia produktów ubocznych. Przykładem takiego procesu w małej skali jest enzymatyczna ekstrakcja aminokwasów z suszonego białka rybnego z zastosowaniem enzymów alkalazy i neutrazy w czasie 24 godz. Wadą tej metody są wysokie koszty enzymów, dlatego też stosuje się unieruchomione na fazie stałej komórki mikroorganizmów. Metodę tę można stosować do ekstrakcji niektórych aminokwasów takich jak kwas L-asparaginowy i L-alanina.

11.2.2. Chemiczna synteza aminokwasów

Historycznie klasyczną drogą wytwarzania achiralnych aminokwasów jak glicyna lub racemiczna mieszanina D-, L-metioniny lub D-, L-alaniny była synteza chemiczna. Pierwsza synteza aminokwasów została opisana w 1850 r. pod nazwą „synteza Streckera”. Zgodnie z tą reakcją następuje konwersja aldehydu lub ketonu i aminy lub amoniaku do α-aminokwasów w środowisku kwaśnym w obecności wody i cyjanku metalu jako katalizatora. W szczególności następuje reakcja aldehydu z cyjanowodorem i D-α-metylobenzyloaminą w metanolu, a następnie hydroliza otrzymanego aminonitrylu z wytworzeniem aminokwasu N-α-metylobenzylowego. Na koniec przeprowadza się katalityczną hydrogenolizę w celu usunięcia grupy metylobenzylowej z cząsteczki aminokwasu. Przykładami syntezy chemicznej są amonoliza trichloroetylenu do glicyny lub amonoliza kwasu chloropropionowego do D-, L-alaniny. Wadą chemicznej syntezy aminokwasów jest powstawanie izomerów D- i L-aminokwasów, z których biologicznie są ważne tylko izomery L-, oraz wysokie koszty katalizatorów. Wydajność procesu (40–78%) zależy od temperatury i czasu trwania reakcji.

11.2.3. Mikrobiologiczna produkcja aminokwasów

Drogą produkcji aminokwasów są też procesy biologiczne takie jak enzymatycznie katalizowana synteza i fermentacja. Synteza biochemiczna aminokwasów wykorzystuje wysoce zróżnicowane szlaki, które zazwyczaj zaczynają się od półproduktów glikolizy, szlaku pentozofosforanowego lub cyklu kwasów trikarboksylowych. W zależności od wspólnych cząsteczek prekursora, drogi biosyntezy aminokwasów można podzielić na sześć głównych grup, które stanowią biosyntetyczne rodziny aminokwasów:

Cząsteczki prekursorowe z cyklu kwasu cytrynowego definiują tzw. rodzinę aminokwasów glutaminianu obejmującą samą argininę, prolinę, glutaminę, glutaminian (i lizynę u grzybów), rodzinę asparaginianową z treoniną, metioniną, asparaginą i asparaginianem (i lizynę u bakterii).

Glikoliza zasila drogi biosyntezy dla dwóch innych grup:

1. 1) rodziny seryny zawierającej glicynę, cysteinę i serynę;

2. 2) rodziny pirogronianowej utworzonej przez izoleucynę, leucynę, walinę i alaninę.

Tyrozyna, fenyloalanina i tryptofan definiują rodzinę aromatyczną i są syntetyzowane z kwasu szikimowego.

Histydyna stanowi własną rodzinę biosyntetyczną przez liniowy szlak, który daje jedynie ten aminokwas (rys. 11.1).

Biosyntezę aminokwasów glukogenicznych – alaniny, glutaminianu, glutaminy, asparaginianu i asparaginy – prowadzi się przez transaminację pirogronianu lub produktów pośrednich cyklu kwasów trikarboksylowych. Animacja (trans) 2-oksoglutaranu w celu uzyskania glutaminianu jest jedną z najważniejszych reakcji anabolicznych wiązania amonu przez drożdże katalizowaną przez dehydrogenazę glutaminianową, syntazę glutaminianową lub aminotransferazę. Przyłączenie kolejnej grupy aminowej z udziałem syntetazy glutaminowej daje glutaminę. Asparaginian jest syntetyzowany w podobny sposób przez transaminację szczawiooctanu i dalej przekształcany w asparaginę przez syntazę asparaginy hydrolizującą glutaminę. Szkielet alaninowy pochodzi od kluczowego związku pośredniego glikolizy – pirogronianu – transaminowanego przez aminotransferazę przy użyciu glutaminianu jako dawcy, w wyniku czego powstaje alanina i 2-oksoglutaran. Biosyntezę glicyny i seryny w drożdżach można prowadzić alternatywnie dwoma sposobami. Początek stanowi 3-fosfoglicerynian zaczynający szlak glikolityczny, który przebiega przez dwa fosforylowane związki pośrednie i prowadzi do utworzenia seryny. Alternatywnie, glioksalan z anaplerotycznego cyklu glioksalanu służy jako związek wyjściowy, który jest bezpośrednio przekształcany w glicynę, tworząc szlak glukoneogenetyczny. Interkonwersję obu aminokwasów przeprowadza się przez działanie transhydroksymetylazy serynowej. Aminokwasy takie jak cysteina, treonina i metionina zawierające siarkę są syntetyzowane niżej opisanymi szlakami.

Rys. 11.1. Uproszczony schemat syntezy aminokwasów

Cysteina zasadniczo może być wytworzona przez dwa szlaki transsulfuracji – jeden przez sulfurylację seryny, a drugi z homoseryny (lub metioniny) przez transsulfurację homocysteiny z produktem pośrednim cystationiną. Biosynteza metioniny i treoniny zaczyna się od fosforylacji asparaginianu i prowadzi w dwóch kolejnych etapach do homoseryny, która jest ostatnim wspólnym związkiem tej rozgałęzionej ścieżki. Homoseryna jest bezpośrednio izomeryzowana do treoniny lub przekształcana przez homocysteinę w metioninę. Drogi prowadzące do rozgałęzionych aminokwasów – izoleucyny, waliny i leucyny – obejmują trzy główne części: najpierw deaminację treoniny w celu uzyskania α-ketomaślanu, który inicjuje tworzenie izoleucyny, następnie połączoną biosyntezę izoleucyny i waliny, w której pirogronian jest kierowany do biosyntezy waliny lub w połączeniu z α-ketomaślanem – w kierunku tworzenia izoleucyny. Przedostatni produkt biosyntezy waliny jest ponownie kierowany do trzeciej części szlaku, aby po czterech kolejnych etapach uzyskać leucynę. Biosynteza lizyny przez grzyby jest całkowicie odmienna od szlaku syntezy u bakterii i większości roślin. Zaczyna się od 2-oksoglutaranu z cyklu kwasów trikarboksylowych i acetylo-CoA, a produkt końcowy powstaje w dziewięciu etapach przy zużyciu jednej cząsteczki glutaminianu. Wyjściowy kwas 2-oksoglutaranowy jest regenerowany na końcu tego szlaku i odpowiada za cykliczny charakter tej biosyntetycznej kaskady. Biosynteza proliny jest prosta i krótka: fosforylacja glutaminianu, a następnie jego redukcja z wytworzeniem semialdehydu glutaminianowego, który jest przekształcany w jednym etapie, w sposób redukcyjny, w cykliczny produkt końcowy. Szlak prowadzący do powstawania histydyny obejmuje dziesięć etapów – począwszy od fosforybozylopirofosforanu, który pochodzi z cyklu fosfopentozowego (PP). Biosynteza argininy odbywa się w pięciostopniowej kaskadzie, z centralnym produktem pośrednim ścieżki – ornityną, z której produkt końcowy jest syntetyzowany w trzech kolejnych etapach. W szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych jak fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan, który rozpoczyna się od fosfoenolopirogronianu i 4-fosforanu erytrozy, powstaje w siedmiu etapach kwas choryzmowy. Kwas szikimowy jest jednym z produktów pośrednich kaskady reakcji. Kwas choryzmowy jest ostatnim pospolitym związkiem na szlaku z wieloma anabolicznymi przemianami wyłaniającymi się z tego centralnego produktu pośredniego. Dwie główne gałęzie ostatecznie prowadzą do utworzenia odpowiednio fenyloalaniny/tyrozyny i tryptofanu. Fenyloalaninę, jak również syntezę tyrozyny, inicjuje konwersja choryzmianu do prefenianu, katalizowana przez mutazę choryzmianową. Z kwasu prefenianowego szlak ponownie odgałęzia się, dając końcowe produkty w dwóch kolejnych etapach – odpowiednio fenyloalaninę i tyrozynę. Biosynteza tryptofanu jest inicjowana przez działanie kompleksu syntazy antranilanowej, który przekształca kwas choryzmianowy w antranilan. Reakcja ta zależy od dwóch aktywności katalitycznych: rzeczywistej syntazy antranilanowej i amidotransferazy glutaminowej. Z antranilanu cztery etapy prowadzą do końcowego produktu tej gałęzi metabolizmu. Schemat mikrobiologicznej syntezy aminokwasów przedstawiono na rys. 11.1 na s. 321.

Obecnie na skalę przemysłową aminokwasy pozyskuje się głównie w drodze fermentacji. W warunkach tlenowych lub beztlenowych hodowane są ulepszone szczepy przemysłowe w podłożu organicznym, w którym obecne cukry są przekształcane do spodziewanych aminokwasów. Proces fermentacji ma kilka zalet w porównaniu z metodami opisanymi powyżej. W procesie fermentacji wytwarzane są tylko aminokwasy konfiguracji L-. Ponadto fermentację prowadzi się w łagodnych warunkach, w których nie następuje degradacja syntetyzowanego aminokwasu. Koszty finansowe fermentacji są znacząco niższe w porównaniu z pozostałymi procesami. Fermentacja ma dwie główne wady:

1. 1) wymaga sterylności i zużywa dużo energii, jeśli jest prowadzona w warunkach tlenowych i/lub jeśli stosuje się mieszanie z użyciem mieszadeł mechanicznych;

2. 2) hodowle w skali przemysłowej są prowadzone w wielkich bioreaktorach, co wymaga wysokich nakładów kapitałowych.

Podczas wyboru najlepszej metody produkcji aminokwasów na skalę przemysłową analizuje się dostępne technologie i inwestycje kapitałowe, wielkość rynku syntetyzowanego produktu i spodziewane przychody, surowce i koszty operacyjne, a także wpływ na środowisko każdego z tych procesów. Fermentacja jest wybierana najczęściej głównie ze względu na korzyści ekonomiczne i ekologiczne.

11.3.Procesy fermentacji związane z produkcją aminokwasów

11.3.1. Bakterie produkujące aminokwasy

Drogą fermentacji z zastosowaniem odpowiednich szczepów produkcyjnych oraz hodowli w optymalnych warunkach uzyskuje się kilkanaście biogennych aminokwasów (tab. 11.1).

Tabela 11.1. Przykłady wydajności produkcji aminokwasów przez wybrane szczepy bakterii w procesie fermentacji

Gatunek bakterii

Aminokwas produkowany

Wydajność (g/l)

Lit.

Corynebacterium glutamicum

L-glutamina

49

[1]

L-izoleucyna

30

[2]

L-lizyna-HCl

170

[3]

L-lizyna-HCl

120

[4]

L-lizyna-HCl

100

[5]

L-tryptofan

58

[6]

L-tyrozyna

26

[6]

L-walina

99

[7]

L-arginina

81,2–92,5

[8]

Brevibacterium lactofermentum

L-glutaminian

88

[9]

L-leucyna

34

[10]

L-walina

31

[17]

L-fenyloalanina

21,7

[20]

L-lizyna

26,1

[21]

Arthrobacter oxydans

L-alanina

75

[11]

Serratia marcescens

L-arginina

96

[7]

L-histydyna

42

[12]

Escherichia coli

L-fenyloalanina

51

[7]

L-treonina

100

[13]

L-tyrozyna

55

[14]

Brevibacterium heali

L-metionina

25

[15]

Clostridium acetoacidophilum

L-prolina

108

[16]

Methylobacterium sp.

L-seryna

65

[7]

Arthrobacter paraffineus

L-glutaminian

82

[18]

Brevibacterium flavum

L-lizyna

41

[19]

[1] Li i wsp. 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol., 74: 563–571. [2] Eggeling i wsp. 1997. J. Biotechnol., 56: 167–182. [3] Kraemer. 2004. Food Biotechnol., 18: 1–46. [4] Becker i wsp. 2011. Metab. Eng., 13: 159–168. [5] Ikeda i wsp. 2006. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 33: 610–615. [6] Ikeda i Katsumata. 1999. Appl. Environ. Microbiol., 65: 2497–2502. [7] Ikeda i Nakagawa. 2003. Appl. Microbiol. Biotechnol., 62: 99–109. [8] Park i wsp. 2014. Nature Communications, 5: 4618. [9] Das i wsp. 1995. Biotechnol. Bioeng., 48: 551–555. [10] Tsuchida i Momose. 1986. Appl. Environ. Microbiol., 51: 1024–1027. [11] Hashimoto i Katsumata. 1998. J. Ferment. Bioeng., 86: 346–351. [12] Sugiura i wsp. 1987. Agric. Biol. Chem., 51: 371–377. [13] Debabov. 2003. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79: 113–136. [14] Patnaik i wsp. 2008. Biotechnol. Bioeng., 99: 741–752. [15] Mondal i Chatterjee. 1994. Acta Biotechnol., 14: 199–204. [16] Nakanishi i wsp. 1987. J. Ferm. Technol., 65: 139–144. [17] Tsuchida i wsp. 1975. Agr. Biol. Chem., 39: 1319–1322. [18] Robertson i wsp. 1987. United States Patent 4696901. [19] Ozaki I Shiio. 1983. Agric. Biol. Chem., 47: 1569–1576. [20] Tsuchida I wsp. 1987. Agric. Biol. Chem., 51: 2095–2101. [21] Fernandez-Gonzalez. 1966. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46: 554–558.

Światowe zużycie aminokwasów paszowych jest szacowane na 6,2 mln ton w 2022 r., tj. przewiduje się wzrost o 6,8% w okresie pięciu lat. Największe ilości aminokwasów dodaje do paszy dla drobiu (43,4%).

Dwa szczepy bakterii Corynebacterium glutamicum oraz Escherichia coli są powszechnie stosowane do produkcji aminokwasów w drodze fermentacji. Genetycznie modyfikowane szczepy Corynebacterium glutamicum są zdolne do produkcji lizyny lub kwasu glutaminowego z wydajnością powyżej 50%, a Escherichia coli jest wykorzystywana do syntezy bardzo interesujących aminokwasów aromatycznych jak L-tryptofan, L-fenyloalanina i L-tyrozyna.

11.3.2. Corynebacterium – „workhorse” w mikrobiologii przemysłowej

Oprócz lizyny i glutaminianu Corynebacterium jest również wykorzystywany do produkcji takich aminokwasów jak L-treonina, L-metionina, L-seryna, L-histydyna, L-walina, L-tryptofan, L-fenyloalanina i L-tyrozyna, L-leucyna i L-izoleucyna oraz wielu związków chemicznych, w tym paliwa (tab. 11.2). Corynebacterium glutamicum ECT-2 w hodowli okresowej z zasilaniem produkuje ektoinę z wydajnością 4,5 g/l po 16 godz. hodowli, a Corynebacterium glutamicum DAP-16 także w hodowli okresowej z zasilaniem produkuje diaminopentan (bionylon) w stężeniu 88 g/l w czasie 50 godz.

Tabela 11.2. Przykładowe maksymalne wydajności produkcji kwasu itakonowego w zależności od typu hodowli

Typ hodowli mikroorganizmu

Wydajność (g/l)

Plon (g/g)

Dni hodowli

Lit.

hodowla okresowa

kolby Erlenmeyera – szczep TN-484

– szczep NRRL 1960

– szczep DSM 23081

82

68

90

0,57

0,34

0,58

6

6

13

[1]

[2]

[3]

bioreaktor STR – szczep DSM 23081

86,2

0,62

7

[3]

bioreaktor typu „Airlift” TN-484

63,7

0,64

4

[4]

hodowla okresowa z zasilaniem

kolby Erlenmeyera – szczep FO-6365

56,0

0,47

5

[5]

bioreaktor typu „Airlift” – szczep FO-6365

48,0

0,37

5,5

[5]

patenty

bioreaktor typu STR – szczep NRRL 1960

– szczep NRRL 1960

70,8

89,6

0,98

0,41

3

7,7

[6]

[7]

[1] Yahiro i wsp. 1997. Biotechnol. Lett., 19: 619–621. [2] Lockwood i Reeves. 1945. Arch. Biochem., 6: 455–469. [3] Kuenz i wsp. 2012. Appl. Microbiol. Biotechnol., 96: 1209–1216. [4] Yahiro i wsp. 1997. Biotechnol. Lett., 19: 619–621. [5] Park i wsp. 1994. J. Ferment. Bioeng., 77: 329–331. [6] Nubel i Ratajak. 1962. US patent 3,044,941 (to Pfizer). [7] Batti i Schweiger. 1963. US patent 3,078,217 (to Miles Laboratories)

Istnieją liczne publikacje dotyczące ekspresji heterologicznej białek/enzymów w Corynebacterium glutamicum. Geny amylaz pobrane z takich bakterii jak Bacillus amyloliquefaciens, Geobacillus stearothermophilus, Streptomyces bovis i Streptomyces griseus z powodzeniem ulegają ekspresji w różnych szczepach Corynebacterium glutamicum. Liczne dane wskazują, że heterologiczna ekspresja poprawia produkcję naturalnych lub nienaturalnych związków produkowanych przez Corynebacterium glutamicum. Na przykład Pseudomonas taetrolens ArgR umożliwił produkcję D-aminokwasów w zmodyfikowanym szczepie Corynebacterium glutamicum. Niedawno powstał syntetyczny gen ektoiny Pseudomonas stutzeri – klaster, który umożliwił produkcję ektoiny, chemicznego chaperonu, działającego stabilizująco na biologiczne cząsteczki produkowane przez Corynebacterium glutamicum.

Biosynteza aminokwasów przez Corynebacterium glutamicum jest ściśle związana z centralnym metabolizmem węgla. Dlatego mikroorganizm ten jest wykorzystywany do produkcji aminokwasów na skalę przemysłową. Corynebacterium glutamicum ma trzy główne cykle metaboliczne węgla: cykl Embden-Meyerhof-Parnasa (glikoliza), szlak pentozofosforanowy (PP) i cykl kwasów trikarboksylowych (TCA). Różne enzymy, takie jak dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa i dehydrogenaza izocytrynianowa, są zaangażowane w konwersję węgla między cyklem TCA i glikolizą. W glikolizie odpowiedzialnej za dalszy katabolizm cukrów następuje przemiana glukozy do pirogronianu i nośników energii, takich jak ATP i NADH.

Wiele technik genetycznych miało istotny wpływ na mikrobiologiczną produkcję aminokwasów. Techniki te obejmują:

1. 1) amplifikację enzymu ograniczającego szybkość syntezy w szlaku;

2. 2) amplifikację pierwszego enzymu po rozgałęzieniach szlaków metabolicznych;

3. 3) klonowanie genu kodującego enzym z większą lub mniejszą regulacją sprzężenia zwrotnego;

4. 4) wprowadzenie genu kodującego enzym z przewagą funkcjonalną lub energetyczną zastępującą normalny enzym;

5. 5) amplifikację pierwszego enzymu prowadzącego od centralnego metabolizmu w celu zwiększenia przepływu węgla do szlaku syntezy produktu;

6. 6) izolację mutanta transportowego zmniejszającego zużycie aminokwasów i kontrolującego sprzężenia zwrotne wewnątrzkomórkowe przy jednoczesnej poprawie wydzielania produktu.

11.3.3. Pozyskiwanie i wykorzystanie substratu węglowego

Corynebacterium glutamicum jest w stanie wykorzystać różne cukry, alkohole cukrowe i kwasy organiczne jako źródła węgla – albo jako pojedynczy substrat, albo w czasie kometabolizmu. Fruktoza, glukoza i sacharoza są pobierane głównie przez specyficzne układy PTS, które fosforylują je do glukozo-6-fosforanu lub fruktozo-6-fosforanu przez przekształcenie fosfoenolopirogronianu w pirogronian. W przypadku sacharozy tylko część glukozy jest fosforylowana za pomocą tego systemu. Fosforylacja fruktozy jest możliwa tylko przy użyciu układu PTS, gdy fruktoza jest transportowana do komórki przez nieznany mechanizm transportowy. Obecność specyficznego dla mannozy układu PTS zasugerowano i potwierdzono przez komplementację w Escherichia coli. Stwierdzono, że fizjologiczna rola tego układu w Corynebacterium glutamicum jest złożona, ponieważ uczestniczy on również w transporcie fruktozy i glukozy podczas stresu osmotycznego. Wzrost Corynebacterium glutamicum w obecności mannozy jako jedynego źródła węgla jest niższy niż wzrost w obecności glukozy. Zidentyfikowano obecność alternatywnego systemu poboru glukozy, a ponadto w organizmie obecna jest kinaza glukozy (glk), stanowiąca alternatywę dla systemu PTS. Substratami dla Corynebacterium glutamicum mogą być różne kwasy organiczne:

1. 1) kwas mlekowy stosowany jako pojedyncze źródło węgla lub z innymi substratami wchodzi w metabolizm przez dehydrogenazę mleczanową przekształcającą mleczan w pirogronian;

2. 2) kwas octowy stosowany jako pojedyncze źródło węgla lub z innymi źródłami węgla wchodzi w cykl TCA jako Acetylo-CoA po połączonych działaniach kinazy octowej (ackA) i fosfotransacetylazy (pta);

3. 3) kwas propionowy stosowany jako pojedyncze źródło węgla lub w połączeniu z innymi źródłami węgla wchodzi do metabolizmu tworząc pirogronian i sukcynian w reakcji ze szczawiooctanem;

4. 4) kwas pirogronowy stosowany jako pojedyncze źródło węgla lub z innymi źródłami bierze udział w metabolizmie energii;

5. 5) kwas glukonowy dostaje się do organizmu za pomocą permeazy glukonianowej, jest fosforylowany przez kinazę glukonianową (gntK) i tworzy 6-fosfoglukonian, który jest związkiem pośrednim w szlaku PP;

6. 6) kwas cytrynowy może być wykorzystany jako jedyne źródło węgla lub równocześnie z glukozą.

11.3.4. Metabolizm azotu

Corynebacterium glutamicum może wykorzystywać azot nieorganiczny jako jon amonowy, organiczny z mocznika lub z aminokwasów. Jon amonowy jest pobierany drogą dyfuzji, gdy jego stężenie jest wysokie, lub przez aktywne systemy poboru, gdy stężenie azotu jest niskie. Dotyczy to również mocznika. Niektóre aminokwasy mogą również służyć jako donory azotu dla Corynebacterium glutamicum, np. L-glutamina, L-glutaminian i L-seryna oraz inne (chociaż jak dotąd nie przeprowadzono żadnych systematycznych badań). Główną drogą asymilacji jonu amonowego w wysokich stężeniach u Corynebacterium glutamicum jest dehydrogenaza glutaminianowa (gdh: EC 1.4.1.4):

Równanie dla (gdh):

α-ketoglutaran + NADPH + NH_4+ → glutaminian + NADP+

Przy niższych stężeniach jonu amonowego (≤ 0,1 mM) aktywnie funkcjonuje system o wysokim powinowactwie GS/GOGAT, obejmujący dwie kolejne reakcje katalizowane przez syntazę glutaminową (glnA: EC 6.3.1.2),

Równanie dla (glnA):

glutaminian + ATP + NH_4+ → glutaminian + ADP + Pi

i syntazę glutaminianową (gltBD: EC 1.4.1.13),

Równanie dla (gltBD):

glutamina + α-ketoglutaran + NADPH → 2 glutaminian + NADP+

W odpowiednich warunkach fermentacji stężenie jonu amonowego jest zawsze wysokie (≥ 0,5 mM), co sprawia, że najważniejszy przy asymilacji jonu amonowego podczas produkcji aminokwasów jest system gdh.

11.3.5. Metabolizm fosforu

W komórkach bakterii fosfor występuje w postaci nieorganicznej, najczęściej w ortofosforanie (Pi), pirofosforanie (PPi) lub polifosforanach (poliPi), oraz w postaci organicznej – głównie jako składnik biomasy (RNA i DNA). Ponadto fosfor odgrywa główną rolę w metabolizmie energetycznym, ponieważ energia biochemiczna uzyskana przez utlenianie substratów jest wykorzystywana do tworzenia ATP z ADP i Pi. Najważniejszym źródłem fosforu dla Corynebacterium glutamicum jest fosforan. Trzy różne systemy (pitA, nptA i pst) służą do wychwytywania nieorganicznego fosforu u Corynebacterium glutamicum na podstawie opisanego genomu. System pitA jest transporterem o niskim powinowactwie i dużej pojemności z wykorzystaniem siły napędowej protonu; jest stosowany, gdy stężenie fosforu jest wysokie. System nptA jest systemem transportu zależnym od symportera Na+. Ostatnim układem jest system transportowy o wysokim powinowactwie typu ABP, prawdopodobnie stosowany w warunkach, w których stężenie fosforu jest niskie.

11.3.6. Metabolizm siarki

Siarka jest wykorzystywana do wielu składników biomasy, z których dominujące są metionina i cysteina. Głównym źródłem siarki dla drobnoustrojów w przyrodzie i podczas fermentacji jest jon siarczanowy. Siarczan dostaje się do komórki przez systemu transportu zależny od ATP i jest redukowany do biodostępnego siarczku (H_2S). Etapy te obejmują aktywację do 5’-fosfosiarczanu adenozyny (APS), a następnie redukcję do siarczynu i dalszy etap redukcji do siarczku. Alternatywą dla asymilacji siarki nieorganicznej jest degradacja aminokwasów zawierających siarkę. Cysteinę można rozkładać do pirogronianu, H_2S i NH_3 przez desulfhydrazę cysteiny (aecD).

11.3.7. Przemysłowa produkcja L-lizyny w aspekcie historycznym

Rodzaj Corynebacterium, który ma obecnie ponad 110 zwalidowanych gatunków, jest bardzo zróżnicowany. Obejmuje gatunki o znaczeniu medycznym, weterynaryjnym lub biotechnologicznym. Na przykład Corynebacterium glutamicum ma zdolność do produkcji i sekrecji wielu ważnych dla przemysłu aminokwasów i nukleotydów stosowanych w szczególności do produkcji aminokwasów na skalę przemysłową, w tym glutaminianu i L-lizyny. Systematyczne badania mające na celu zbadanie możliwości produkcji aminokwasów przez mikroorganizmy rozpoczęły się w późnych latach 40. ubiegłego wieku, a kilka sukcesów odnotowano w drugiej połowie lat 50. Wielu badaczy potwierdziło, że L-lizynę można syntetyzować z kwasu α-aminoadypinowego z wykorzystaniem drożdży i grzybów pleśniowych jak Neurospora lub z kwasu diaminopimelinowego (DAP) z wykorzystaniem Escherichia coli. Produkcja lizyny przez dekarboksylację DAP z wykorzystaniem Escherichia coli została uznana za pierwszą produkcję na skalę przemysłową w USA. Następnie odkryto i opisano zmodyfikowany proces wykorzystujący pojedynczy organizm, który wytworzył DAP i przekształcił go w L-lizynę. Pierwsze kroki w kierunku przemysłowej produkcji lizyny zostały poczynione w Japonii w latach 50. ubiegłego wieku. Firma Kyowa Hakko Co. Ltd. w Tokio rozpoczęła wówczas program badawczy mający na celu znalezienie mikroorganizmu zdolnego do produkcji glutaminianu. Jednym z jego rezultatów tego było wyizolowanie promieniowca Micrococcus glutamicus, później nazwanego Corynebacterium glutamicum, który był zdolny do produkcji glutaminianu. Wprowadzenie fermentacji kwasu L-glutaminowego za pomocą Corynebacterium glutamicum miało ogromne znaczenie ekonomiczne w dziedzinie fermentacji L-lizyny. Dalsze badania w tym kierunku (lata 1957–1958) doprowadziły do opracowania wydajnego mutanta Corynebacterium glutamicum do komercyjnej produkcji L-lizyny. Następnie podczas mutagenezy i badań przesiewowych odkryto mutanty wytwarzające lizynę, a także opracowano warunki do produkcji lizyny. W ciągu kilku lat uruchomiono pierwszy zakład produkujący lizynę na skalę przemysłową, a popyt na opłacalną produkcję wzrósł wraz ze spadkiem cen produktów. Wraz z pojawianiem się nowych podejść i narzędzi biotechnologicznych więcej uwagi poświęcano ulepszaniu szczepów i zastosowaniu sztucznie pozyskanych mutantów auksotroficznych i regulatorowych, opornych na hamowanie zwrotne. Dzięki zastosowaniu tych genetycznie zmodyfikowanych organizmów zwiększono wytwarzanie L-lizyny przez kontrolowanie szlaków biosyntezy.

Obecnie produkcję lizyny na drodze fermentacji prowadzi się w bardzo dużych bioreaktorach fermentacyjnych, często przekraczających setki metrów sześciennych, w których trudno jest uzyskać homogenność środowiska i utrzymać wystarczającą szybkość transferu biomasy. Najczęściej stosuje się tradycyjne reaktory z mieszadłem mechanicznym, których konstrukcja umożliwia uzyskanie wysokich szybkości przenoszenia tlenu. Proces fermentacji składa się z wielu etapów, z których kilka to etapy propagacji (tworzenia większej ilości inoculum), aby uzyskać wystarczającą biomasę do głównego procesu fermentacji. Liczba kroków propagacji może być różna, ale najczęściej stosuje się proporcję 1 : 10 między każdym etapem. W celu zoptymalizowania wydajności lizyny proces prowadzi się jako hodowlę okresową z zasilaniem lub z hodowlę półciągłą. Podjęto także próby opracowania hodowli ciągłych, które jednak nie przyjęły się w skali przemysłowej ze względu na liczne aspekty praktyczne, takie jak sterylność i trwałość szczepów.

Lizyna jest dla zwierząt aminokwasem niezbędnym, a jej zawartość w kukurydzy, jęczmieniu i pszenicy – głównych składnikach tradycyjnych pasz – często jest zbyt mała i ogranicza przyrost biomasy zwierząt. Dodawanie do paszy L-lizyny w ilości 0,5–1% poprawia przyrost masy zwłaszcza świń i drobiu nawet o 20%. Oprócz ekonomicznej korzyści ze zwiększonej produktywności do środowiska jest uwalniane mniej azotu, co w ostatnich latach stało się niezwykle ważne. Dzięki ciągłej optymalizacji procesu koszty produkcji lizyny zostały obniżone, cena lizyny zmalała i wzrósł popyt, a roczna produkcja wzrosła z 1,7 mln ton w 2011 r. do 2,5 mln ton lizyny-HCl w 2018 r. (feedinfo.com). Ponieważ popyt na białe mięso wieprzowe i drobiowe wzrasta, spodziewany jest dalszy wzrost popytu na lizynę o ok. 8% rocznie (feedinfo.com). Z powodu wzrostu zapotrzebowania na lizynę na całym świecie producenci starają się wciąż udoskonalać jej produkcję, co dotyczy również szczepu, aby pozostać konkurencyjnymi na rynku.

11.3.8. Produkcja L-lizyny przez genomy szczepów Corynebacterium glutamicum

W biotechnologicznym procesie produkcyjnym jakim jest produkcja lizyny za pomocą Corynebacterium wykorzystuje się samodzielnie rozmnażające się organizmy żywe jako komórki fabryki do konwersji związków chemicznych obejmujących złożoną sieć enzymów, substratów i produktów wewnątrz i na zewnątrz komórki. Strategia wyboru organizmu producenta polega na opracowaniu i optymalizacji szczepów produkcyjnych za pomocą mutagenezy losowej, a następnie poddaniu ich rozległym programom badań przesiewowych w celu znalezienia i wyizolowania najlepszych mutantów. Nowe możliwości optymalizacji szczepów przez ukierunkowanie ich modyfikacji genetycznych otworzyły się wraz z szybkim rozwojem metod inżynierii metabolicznej. Obecnie dostępne są protokoły eksperymentalne dla prawie każdej manipulacji genetycznej w Corynebacterium glutamicum. Wyzwanie nie polega na tym, jak zastosować manipulacje genetyczne, ale gdzie je zastosować. Żywe organizmy to bardzo złożone układy, w których oddziałują wzajemnie na siebie tysiące reakcji i wiele czynników. Stosowanie tradycyjnych metod redukcjonistycznych koncentrujących się na generowaniu informacji o poszczególnych komponentach komórkowych często nie wystarcza do przeanalizowania tak złożonych sieci powiązań. Należy zastosować bardziej całościowe podejście koncentrujące się na systemie, a nie na poszczególnych reakcjach. Wraz z rozwojem genomiki wzrosło zainteresowanie zachowaniem się kompletnych systemów biologicznych, co doprowadziło do rozwoju biologii systemów. Dane biologiczne z różnych poziomów metabolizmu jak genom fluksom, transkryptom, metabolom, proteom i interaktom są integrowane w celu analizy organizmu. Ważną rolę w rozwoju biologii systemów odegrał rozwój modeli matematycznych służących do ich opisu, bez których trudno byłoby poradzić sobie z tak dużą ilością generowanych danych. Dzięki ostatnio przeprowadzonemu wysiłkowi sekwencyjnemu udostępniono teraz całe genomy, w tym genom Corynebacterium glutamicum. Informacje te można wykorzystać do tworzenia modeli matematycznych, które mogą służyć jako platformy dla całych modeli komórkowych zdolnych do przewidywania fenotypów komórkowych. W dziedzinie inżynierii metabolicznej można wykorzystać moc predykcyjną modeli matematycznych, aby znaleźć i wybrać cele strategii inżynierii metabolicznej.

Spośród szczepów Corynebacterium glutamicum stosowanych najczęściej do przemysłowego wytwarzania aminokwasów, kwasów nukleinowych i kwasów organicznych, zostały zsekwencjonowane dwa historyczne szczepy: R (3 314 179 pz) i ATCC 13032 (3 309 401 pz lub 3 282 708 pz). Próby rekonstrukcji szczepów do ich przemysłowego wykorzystania rozpoczęto biorąc całe sekwencje genomu. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 to fakultatywny beztlenowiec, heterotrof, mezofil, wolno żyjący, niepatogenny, 53,8% GC, genom wielkości 3 309 401 pz, 3180 genów, 5 operonów RNA, 81 genów RNA i 3099 białek, 211 szlaków białek kompleksowych, 936 enzymów, 146 transporterów, 1172 związków organicznych. W Chinach zsekwencjonowano kompletnie genom Corynebacterium glutamicum B253, ważny szczep wytwarzający lizynę. Genom ten składa się z okrągłego chromosomu (3 159 203 pz) i plazmidu (24 775 pz) kodującego w sumie 2767 białek i zawiera wszystkie geny biosyntezy lizyny. Niektóre mutacje potencjalnie istotne w produkcji lizyny zostały porównane z sekwencją innych szczepów Corynebacterium glutamicum. Chromosom Corynebacterium glutamicum S9114 ma długość 3 292 392 pz, przy średniej zawartości G + C 53,93%. W sekwencji genomu zidentyfikowano 3098 ORF, 54 geny tRNA i 1 fragment rRNA. Wykryto również 14 pseudogenów, co zbiegło się z faktem, że Corynebacterium glutamicum S9114 wybrano w procesie losowej mutagenezy. Co więcej, znaleziono cztery potencjalne miejsca profagów przy użyciu Prophage Finder. Szczep ten wykazuje wysoką oporność na wysokie stężenia cukru oraz wyprodukowanego glutaminianu. Obecnie doliczono się 26 szczepów produkujących aminokwasy, a zsekwencjonowano tylko kilkanaście z nich, m.in.: ATCC 12032, ATCC 13869, ATCC 13870, ATCC 14067, S9114, B1, B253, AS1.299, AS1.542, T6-13. Według danych NCBI Taxonomy ID 1718 opisano 343 szczepy Corynebacterium glutamicum z 198 patentami.

11.3.9. Szlak syntezy L-lizyny przez Corynebacterium glutamicum

Szlak syntezy L-lizyny przez fabryki komórkowe Corynebacterium glutamicum pokazano na rysunku 11.2.

Rys. 11.2. Szlak biosyntezy L-lizyny w hodowli Corynebacterium glutamicum włączający geny związane z modyfikacjami szlaku biosyntezy; lysC – kinaza asparaginianowa; asd – dehydrogenaza semialdehydu asparaginianowego; dapA – syntaza dihydrodipikolinianowa; dapB – reduktaza dihydrodipikolinianowa; dapD – sukcynylaza tetrahydrodipikolinianowa; dapC – transaminaza sukcynylo-amino-keto-pimelinowa; dapE – desukcynylaza sukcynylo-diaminopimelinowa; ddh – dehydrogenaza mezo-diaminopimelinowa; dapF – epimeraza diaminopimelinowa; lysA – dekarboksylaza diaminopimelinowa; lysE – permeaza lizyny

Corynebacterium glutamicum wytwarza lizynę w siedmiu lub dziesięciu etapach począwszy od jej prekursora szczawiooctanu, w zależności od zastosowanej drogi. Pierwszym krokiem syntezy lizyny jest konwersja szczawiooctanu do asparaginianu przez przyłączenie grupy aminowej z glutaminianu, reakcji katalizowanej przez produkt genu aspB. Kolejno asparaginian jest fosforylowany do L-4-aspartylofosforanu w reakcji katalizowanej przez produkt genu lysC, który następnie przekształca się w 4-semialdehyd L-asparaginianu za pomocą produktu genu asd. Fosforan L-4-aspartylu jest dalej przekształcany w dehydrodipikolinian przez produkt genu dapA. W następnym etapie powstaje 2,6-dikarboksylan L-piperydyny przy udziale dapB. Na poziomie 2,6-dikarboksylanu L-piperydyny istnieją dwie możliwości konwersji do mezo-2,6-diaminopimelinianu, ostatniego etapu przed lizyną. Wykorzystywana do tego jest reakcja bezpośrednia przyłączenia drugiej grupy aminowej w jednym pojedynczym etapie (ddh), znana jako odmiana dehydrogenazy, albo cztery kolejne reakcje, nazwane wariantem sukcynylowym. Wariant zawierający sukcynylazę obejmuje produkty genów dapD, dapC, dapE i dapF i jest w nim włączony sukcynylo-CoA pośredni związek powstający w cyklu TCA. Ostatnim etapem jest dekarboksylacja mezo-2,6-diaminopimelinianu do lizyny (lysA), która ostatecznie wycieka z komórki przy udziale permeazy lizyny (lysE). Ze względu na komercyjne znaczenie produkcji lizyny w Corynebacterium glutamicum, ten szlak syntezy był silnie modyfikowany w kierunku nadprodukcji lizyny, co doprowadziło do imponującej listy patentów i zgłoszeń patentowych.

11.3.10. Maksymalna wydajność produkcji lizyny w hodowlach Corynebacterium glutamicum

Maksymalna teoretyczna wydajność lizyny w hodowli Corynebacterium glutamicum wyraża określenie istniejącego potencjału produkcyjnego tego organizmu. Wcześniejsze obliczenia stechiometryczne wykazały, że maksymalna wydajność lizyny na glukozie wynosiła 0,75 mol/mol substratu dla tego organizmu, gdy nie wytwarzano żadnej biomasy. Obecnie obliczona maksymalna wydajność wynosi 0,82 mol/mol substratu. W tym obliczeniu uwzględnia się cykl działania między trzema enzymami: karboksylazą pirogronianową (EC 6.4.1.1), dehydrogenazą jabłczanową (EC 1.1.1.37) i dehydrogenazą jabłczanową (EC 1.1.1.40), który tworzy reakcję podobną do transhydrogenazy, przyczyniając się znacząco do tworzenia NADPH. Dehydrogenaza jabłczanowa katalizuje reakcję (S)-jabłczan + NADP+ → pirogronian + CO_2 + NADPH. W obu obliczeniach wydajności nie uwzględniono żadnej aktywności cyklu TCA i zastosowano wyłącznie wariant dehydrogenazy (ddh) szlaku syntezy lizyny. W procesie fermentacji lizyny powstaje biomasa, dlatego dyskusja o teoretycznie możliwych wydajnościach bez uwzględnienia całego metabolizmu organizmu, w tym reakcji zaangażowanych w tworzenie biomasy, jest bezużyteczna. Tego rodzaju obliczenia wymagają uwzględnienia złożonej sieci reakcji, informacji i szacunków, żeby uzyskane wartości maksymalnego osiągalnego plonu były bardziej wiarygodne, a przy tym mogły dostarczyć informacji na temat reakcji i przepływu metabolitów podczas optymalnej produkcji lizyny. Maksymalne plony osiągane przez wykorzystywane obecnie odmiany produkcyjne nie są publikowane z powodu ochrony przed konkurencją. Jednak w literaturze odnotowano plony do 55% i można się spodziewać, że intensywne wysiłki, które zostały poczynione w ostatnich latach, jeszcze bardziej je zwiększyły. Za pomocą systemów inżynierii metabolicznej dokonano rozwoju genetycznie zdefiniowanego szczepu Corynebacterium glutamicum typu dzikiego wykazującego nadprodukcję L-lizyny. Wdrożenie tylko 12 zdefiniowanych genomowych zmian w genach kodujących centralne enzymy metaboliczne przekierowało główne strumienie węgla zgodnie z oczekiwaniami w kierunku optymalnego wykorzystania szlaku przewidzianego przez modelowanie in silico. Ostatecznie zmodyfikowany szczep Corynebacterium glutamicum jest w stanie wytworzyć lizynę z wysokim plonem 0,55 g/g glukozy, wydajnością 120 g/l i szybkością produkcji 4,0 g/(l · godz.) w hodowlach półciągłych. Jest to pierwszy raport racjonalnie uzyskanego szczepu lizyny, który może być konkurencyjny w zastosowaniach przemysłowych. Przedstawiona tu strategia inżynierii metabolicznej oparta na projektowaniu mogłaby służyć za ogólną koncepcję racjonalnego rozwoju mikroorganizmów jako wydajnych fabryk komórkowych do bioprodukcji. Listę szczepów Corynebacterium glutamicum produkujących L-lizynę przedstawiono w tabeli 11.3.

Tabela 11.3. Przykłady bioproduktów produkowanych drogą fermentacji przez rekombinanty/dziki szczep Corynebacterium glutamicum

Produkt

Producent rekombinant/dziki szczep

Wydajność (g/l)

Plon

(g/g)

Lit.

L-alanina

R ΔldhAΔppcΔalr+alaD+gapA

98

0,83

[1]

L-arginina

ATCC21831 ΔargRΔfarR pgi(A1G)Psod-tktΔNCgl1221 Psod-carABargF(rev.)Peftu-argGH

92,5

0,4

[2]

L-glutaminian

GDK-9 ΔldhA

120

–

[3]

L-histydyna

F81/pCH99

22,5

0,20

[4]

L-izoleucyna

DR17/pECM3::ilvA38

21

0,24

[5]

L-leucyna

ATCC13032 ΔltbRΔleuA::Ptuf-leuA_B018+IlvN(G20D,I21D,I22F)

ΔiolR PdapA-L1gltA

23,7

0,3

[6]

L-lizyna

ATCC13032+lysCT311I+2xddh+Δpck+Psod-dapB+2.lysA+Psod-lysC+homV59A

+Psod-pycAP485S+Psod-pycA+icdGTG+ Ptuf-fbp+Psod-tkt-tal-zwf-opcA-pgl

120

0,55

[7]

L-ornityna

ATCC13032 ΔproB ΔargF ΔargR pgiGTG zwfATG Ptkt::Psod +pSY223

51,5

0,24

[8]

L-fenyloalanina

KY10865+pKF1

28

0,47

[9]

L-seryna

SYPS-062 ΔserAΔsdaA ΔalaT ΔavtA ΔC-T ilvN

42,6

0,21

[10]

L-tyrozyna

KY10865+pKY1

26

0,43

[11]

L-tryptofan

KY9218+pIK9960

58

0,25

[12]

L-walina

KY10865+pKY1

149,8

0,57

[13]

γ-aminomaślan GABA

ATCC13032+ pHGmut

38,6

0,56

[14]

etanol

R ΔldhA Δppc+pgi+pfkA+gapA+pyk+glk+fba+tpi+pdc+adhB

119

0,48

[15]

izobutanol

R Ptac-SD-gapA+Ptac-SD-pyk+Ptac-SD-pfk+Ptac-SD-gpi+PgapA-ilvBNCTM

+PldhA-kivd+PgapA-adhP+PgapA-ilvD

73

2,6

[16]

2-ketoglutaran

HH109 Δgdh ΔgltB ΔaceA

47,5

–

[17]

L-mleczan

R

95,6

0,71

[18]

D-mleczan

R ldhA+pCRA720-ldhA

120

0,83

[19]

[1] Jojima i wsp. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol., 87: 159–165. [2] Park i wsp. 2014. Nat. Commun., 5: 4618. [3] Zhang i wsp. 2014. Braz. J. Microbiol., 45: 147–1483. [4] Mizukami i wsp. 1994. Biosci. Biotechnol. Biochem., 58: 635–638. [5] Kelle i wsp. 1996. J. Biotechnol., 50: 123–136. [6] Vogt i wsp. 2014. Metabol. Eng., 22: 40–52. [7] Becker i wsp. 2011. Metabol. Eng., 13: 159–168. [8] Kim i wsp. 2015. Biotechnol. Bioeng., 112: 416–421. [9] Ikeda i Katsumata. 1992. Appl. Environ. Microbiol., 58: 781–785. [10] Zhu i wsp. 2015. Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 1665–1673. [11] Ikeda i Katsumata R. 1992. Appl. Environ. Microbiol., 58: 781–785. [12] Ikeda i Katsumata. 1999. Appl. Environ. Microbiol., 65: 2497–2502. [13] Hasegawa i wsp. 2013. Appl. Environ. Microbiol., 79: 1250–1257. [14] Choi i wsp. 2015. Microb. Cell Fact.,14: 21; [15] Jojima i wsp. 2015. Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 1165–1172. [16] Yamamoto i wsp. 2013. Biotechnol. Bioeng., 110: 2938–2948. [17] Jo i wsp. 2012. Can. J. Microbiol., 58: 278–286. [18] Okino i wsp. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol., 68: 475–480. [19] Okino i wsp. 2008. Appl. Microbiol. Biotechnol., 78: 449–454.

11.3.11. Inżynieria metaboliczna w Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum poddano wielu procesom inżynierii metabolicznej w celu poprawy wydajności i produktywności pożądanego produktu. Wysiłki inżynierskie dotyczyły różnych części metabolizmu, ale głównym przedmiotem wielu starań do tej pory był szlak syntezy lizyny Corynebacterium glutamicum (rys. 11.3). Badania koncentrowały się na optymalizacji procesu przez zmianę enzymów lub aktywności enzymatycznych tego szlaku. Dużą uwagę skupiono na kinazie asparaginianowej (lysC) ze względu na jej znaczenie w regulacji szlaku w kierunku biosyntezy lizyny, metioniny i treoniny. W szczepie typu dzikiego reakcja ta jest hamowana przez lizynę i treoninę, co czyni ten proces kluczowym etapem w regulacji biosyntezy lizyny. U większości szczepów Corynebacterium glutamicum wytwarzających nadmiar lizyny w skali produkcyjnej zastosowano mutacje genu lysC, które spowodowały oporność na sprzężenie zwrotne („feedback”).

Innym genem w szlaku syntezy lizyny zaangażowanym w produktywność, jest syntaza dihydrodipikolinianowa (dapA). Nadekspresja tego genu doprowadziła do wytworzenia lizyny w szczepie typu dzikiego. Ponadto zaobserwowano wzrost wytwarzania lizyny po zastosowaniu tej samej strategii w szczepie DG 52-5. Z kolei w Corynebacterium glutamicum ATCC 21253 regulacja genu lysC wpływała pozytywnie na wytwarzanie lizyny, podczas gdy dapA nie wykazywał żadnego działania. Równoczesna regulacja genów dapA i lysC spowodowała dalszy wzrost produkcji lizyny w porównaniu z sytuacją, w której geny były regulowane indywidualnie. Tylko regulacje genów lysC i dapA przyniosły oczekiwane rezultaty. Mutacje genów asd (de-hydrogenazy aspartosemialdehydowej), dapB (dihydrodipikolinianu), ddh (dehydrogenazy diamonopimelinowej), lysA (dekarboksylazy diaminopimelanowej) nie zwiększyły produkcji lizyny, a zmiana genu ddh negatywnie wpływała na akumulację lizyny.

Rys. 11.3. Przegląd manipulacji inżynierii metabolicznej mających znaczenie w optymalizacji produkcji lizyny przez Corynebacterium glutamicum

Badano również szlak sukcynylazy produkcji lizyny, próbując zlikwidować „wąskie gardła” w produkcji lizyny. Nadekspresja genów dapF lub dapC u producenta lizyny (Corynebacterium glutamicum DSM5715) zwiększyła akumulację, podczas gdy zakłócenie dapE nie miało wpływu na wytwarzanie lizyny w Corynebacterium glutamicum ATCC 21253. Wypływ lizyny z cytosolu bakterii jest powodowany przez permeazę lizyny transportowego białka (LysE). Ten eksporter jest ściśle kontrolowany w szczepie typu dzikiego, co czyni go oczywistym kandydatem do optymalizacji produkcji lizyny. Wypływ lizyny z komórek szczepu dzikiego typu ATCC 13032 został pięciokrotnie powtórzony przez nadekspresję lysE, co potwierdziło największą wagę tej reakcji w optymalizacji wytwarzania lizyny.

Tabela 11.4. Przykłady szczepów Corynebacterium glutamicum produkujących L-lizynę w hodowlach okresowych

Szczep

Wydajność (g/l)

Plon (%)

Lit.

Lys-12

120

55

[1]

H-8241

45

–

[2]

AJ 3781

35

35

[3]

AJ 3610

45

45

[3]

AJ 12568

45

45

[3]

P1-13

50

37

[3]

FML 8611

79

44

[3]

ATCC 21526

42

42

[3]

ZIMET 11266

55

39

[3]

TM-1101

49

45

[3]

B-6

105*

40–50

[4]

AHP-3

80

30

[5]

APG-4

90

36

[6]

AGM-5

100

40

[6]

ATCC 21513 (Hom- Leu-)

110,6*

70

[7]

KK11

–

90±7*–110±5*

[8]

* hodowla ciągła

[1] Becker i wsp. 2011. Metabolic Engineering, 13: 159–168. [2] Ikeda. 2003. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79: 1–35. [3] Leuchtenberger 1996. Amino acids – Technical production and use. s. 465–502. [w:] Biotechnology, vol. 6., red. Rehm H.J., Reed G., Puhler A., Stadler P. VCH, Weinheim, Germany. [4] Hirao i wsp. 1989. Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 269–273. [5] Ohnishi i wsp. 2002. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 217–223. [6] Ikeda i wsp. 2006. J. Ind, Microbiol. Biotechnol., 33: 610–615. [7] Sassi i wsp. 1998. Biochem. Eng. J., 1: 85–90. [8] Kjeldsen K.R. 2008. Optimization of an industrial L-lysine producing Corynebacterium glutamicum strain. Industrial Ph.D. Thesis. Center for Microbial Biotechnology Department of Systems Biology Technical University of Denmark and Agro&Ferm A/S.

11.3.12. Inżynieria metaboliczna w produkcji NADPH

Z wyników dotychczasowej badań nad metabolizmem NADPH w Corynebacterium glutamicum można wywnioskować, że produkcja lizyny jest najprawdopodobniej ograniczona podażą NADPH. Gdy produkcja lizyny jest wysoka, cykl PP jest głównym szlakiem dostarczania NADPH w tym organizmie. Ze strategii optymalizacji metabolizmu NADPH do produkcji lizyny wynika, że dwie z czterech cząsteczek NADPH uczestniczą w biosyntezie jednej cząsteczki lizyny i są związane z włączeniem aminy do α-ketoglutaranu z wytworzeniem glutaminianu. Corynebacterium glutamicum może wytwarzać NADPH w czterech różnych reakcjach: dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (zwf); dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej (gnd); dehydrogenazy izocytrynianowej (icd) i dehydrogenazy jabłczanowej (mez). Analiza przepływu węgla ujawniła krytyczne znaczenie szlaku pentozofosforanowego (PP) podczas syntezy lizyny, dlatego bardzo dokładnie zostały zbadane dwa enzymy wytwarzające NADPH obecne w szlaku PP kodowane przez geny zwf i gnd. Badania enzymatyczne wykazały, że oba enzymy są silnie hamowane przez NADPH, ale stwierdzono oporność na sprzężenie zwrotne na produkty genów zwf i gnd i indywidualną nadekspresję produktów tych genów na produkcję lizyny przez szczepy Corynebacterium glutamicum. Efektem był wzrost produkcji lizyny.

Inną strategią zwiększania strumienia przepływu węgla przez cykl PP jest usunięcie izomerazy glukozo-6-fosforanowej (pgi) konkurującej w reakcji z glukozo-6-fosforanem, dalsze badania wykazały zwiększony przepływ strumień węgla w cyklu PP i w konsekwencji zwiększoną produkcję lizyny. Na podstawie analiz strumienia przepływu węgla zaproponowano deregulację innego genu, fruktozo-1,6-bisfosfatazy (fdp). Nadekspresja tego genu w szczepie Corynebacterium glutamicum wytwarzającym lizynę (dziki typ z mutacją lysCT311I) doprowadziła do zwiększenia wydajności lizyny w podłożu z glukozą, fruktozą lub sacharozą. Inne badanie wykazało, że nadekspresja fdp w szczepie Corynebacterium glutamicum dzikiego typu z określonymi mutacjami (pycP458S, homV59A, lysCT311I, zwfA243T) doprowadziła do poprawy wydajności lizyny, gdy użyto mieszaniny glukozy i fruktozy lub sacharozy jako źródła węgla. Nie zaobserwowano żadnej zmiany, gdy użyto glukozy lub fruktozy oddzielnie. W wyniku analizy strumienia metabolicznego węgla stwierdzono 19-procentowy wzrost strumienia przepływu węgla w cyklu PP w szczepie z nadmiernie wyrażoną reakcją fdp, co wskazuje, że zwiększona wydajność lizyny była w rzeczywistości spowodowana wzrostem podaży NADPH.

W celu poprawy wydajności produkcji lizyny zasugerowano też inną reakcję generującą NADPH związaną z dehydrogenazą jabłczanową (mez). W tym celu należało zastosować kofaktory NADH i ATP oraz dehydrogenazę jabłczanową zależną od NAD (mdh) i karboksylazę pirogronianową (pyc), aby umożliwić reakcję między pirogronianem, szczawiooctanem i jabłczanem, tworzącą NADPH. Nie zaobserwowano wpływu na wydajność lizyny, gdy (mez) była nadmiernie wyrażana w szczepie Corynebacterium glutamicum wytwarzającym lizynę (dziki typ z wprowadzonymi określonymi mutacjami pycP458S, homV59A, lysCT311l, zwfA243T), a glukoza, fruktoza, glukoza i fruktoza lub sacharoza były stosowane jako substrat. Zaobserwowano aktywności enzymatyczne około trzykrotnie wyższe w porównaniu z negatywnymi kontrolami. Uważa się, że fizjologiczną rolę (mez) w Corynebacterium glutamicum odgrywa podczas wzrostu na źródłach glukoneogennych węgla, takich jak octan lub cytrynian lub mleczan.

Dehydrogenaza izocytrynianowa (icd) również wywołuje reakcję otrzymywania NADPH w Corynebacterium glutamicum. Reakcja ta jest częścią cyklu TCA. Generowanie NADPH przy użyciu tej reakcji nie jest tak wydajne (1 NADPH na CO_2), jak w przypadku pozostałych dwóch reakcji w cyklu PP (2 NADPH na CO_2). W związku z tym, gen (icd) nie został dotychczas uwzględniony w strategiach inżynierii metabolicznej związanych z produkcją lizyny.

Podsumowując, można powiedzieć, że L-lizyna stała się ważnym produktem przemysłowym, gdyż większość spożywanych na świecie produktów mącznych pochodzących ze zbóż wykazuje duży niedobór tego aminokwasu niezbędnego. Szlak biosyntezy lizyny jest bardzo ściśle kontrolowany w organizmie Escherichia coli i w organizmach wytwarzających lizynę (np. mutantach Corynebacterium glutamicum i szczepach pokrewnych). Istnieje tylko jedna kinaza asparaginianowa (AK), której aktywność jest regulowana hamowaniem zwrotnym przez treoninę i lizynę. W Corynebacterium glutamicum zastosowano techniki inżynierii metabolicznej, aby poprawić wydajność produkcji L-lizyny. Chimeryczna kinaza asparaginowa (AK) złożona z N-końcowego regionu katalitycznego z Bacillus subtilis AKII i regionu C-końcowego z Thermus thermophilus, została skonstruowana metodą mutagenezy losowej. Uzyskano mutant BT3 wykazujący 160-procentowy wzrost aktywności in vitro w porównaniu z enzymem szczepu dzikiego. Porównawcza analiza genomu szczepu typu dzikiego i szczepu Corynebacterium glutamicum wytwarzającego L-lizynę wykazała trzy mutacje, które zwiększają wytwarzanie L-lizyny po wprowadzeniu do szczepu typu dzikiego. Wprowadzenie mutacji gnd (dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa) zwiększyło wydajność o 15%. Dalszą poprawę osiągnięto wprowadzając mutację mqo (oksydoreduktaza jabłczanowo-chinonowa), co spowodowało wzrost wydajności lizyny do 95 g/l w hodowli okresowej z zasilaniem. Analiza transkryptomu wykazała, że szczep B-6, w porównaniu z typem dzikim, jest regulowany dodatnio w genach szlaku pentozofosforanowego i w genach biosyntetycznych aminokwasów, a ujemnie – w genach cyklu TCA. Wydajność lizyny-HCl osiągnęła 170 g/l. Dalsze badania metaboliczne Corynebacterium glutamicum typu dzikiego i ulepszonych mutantów wykazały, że wydajność lizyny wzrosła z 1,2 do 24,9% w stosunku do wykorzystania glukozy. W celu zwiększenia produkcji lizyny przez mutanty Corynebacterium glutamicum dokonano różnych mutacji, w tym:

1. 1) delecji różnych genów ścieżki glikolitycznej;

2. 2) polepszenia dostępności pirogronianu przez eliminację aktywności dehydrogenazy pirogronianowej;

3. 3) nadekspresji karboksylazy pirogronianowej lub dehydrogenazy DAP;

4. 4) nadekspresji genu NCg10855 kodującego metylotransferazę lub operonu amtA-ocd-soxA.

Genetycznie zdefiniowany szczep produkujący L-lizynę Corynebacterium glutamicum został opracowany przez inżynierię genetyczną systemu metabolicznego typu dzikiego. Wdrożenie tylko dwunastu zdefiniowanych genomowych zmian w genach kodujących centralne enzymy metaboliczne przekierowało główny strumień węgla zgodnie z oczekiwaniami w kierunku optymalnego wykorzystania szlaku przewidzianego przez modelowanie in silico. Ostatecznie zmodyfikowany szczep Corynebacterium glutamicum jest w stanie produkować lizynę z wysokim plonem 0,55 g/g glukozy, przy wydajności lizyny 120 g/l i tempie produkcji 4,0 g/(l · godz.).

11.3.13. Kwas glutaminowy produkowany przez Corynebacterium glutamicum

Kwas L-glutaminowy jest jednym z najważniejszych aminokwasów. Jony karboksylowe i sole kwasu glutaminowego są znane jako glutaminiany. W 1907 r. na Uniwersytecie Cesarskim w Tokio Kikunae Ikeda dokonał pierwszej komercyjnej produkcji kwasu glutaminowego. Opracował on i opatentował metodę wytwarzania krystalicznej soli kwasu glutaminowego, glutaminianu sodu (MSG). Następnie MSG został opatentowany przez japońską korporację Ajinomoto w 1909 r. Punktem zwrotnym w historii produkcji kwasu glutaminowego było odkrycie Micrococcus glutamicus (zidentyfikowanego jako Corynebacterium glutamicum w 1957 r.), który wytwarzał kwas L-glutaminowy w ilości 30 g/l w podłożu fermentacyjnym z glukozą. Przyczyną dużego zainteresowania fermentacyjną produkcją L-glutaminianów jest duże zapotrzebowanie na MSG, który był i nadal jest stosowany jako środek wzmacniający smak. Kwas glutaminowy i jego sól MSG stanowią największy segment produktów na rynku aminokwasów (1,6 mln ton w 2007 r., a w 2012 r. – 2,2 mln ton). Zapotrzebowanie rynku stale rośnie, co stanowi wyzwanie dla producentów do zwiększenia wydajności istniejących linii produkcyjnych lub wdrażania nowych technologii wykorzystujących zaawansowane narzędzia biotechnologiczne w celu zwiększenia produkcji przez poprawę szczepu lub modyfikację podłoża fermentacyjnego. Biosynteza kwasu L-glutaminowego w Corynebacterium glutamicum obejmuje względnie proste szlaki metabolizmu. Glukoza jest metabolizowana głównie szlakiem glikolitycznym. Pirogronian i fosfoenolopirogronian odgrywają ważną rolę w produkcji szczawiooctanu, a następnie α-ketoglutaranu, który przekształca się w kwas L-glutaminowy w obecności enzymu dehydrogenazy glutaminianowej. Etap fosforylacji jest dość ważny, ponieważ geny kontrolujące ten proces konwersji znajdują się w sąsiedztwie genów syntezy ściany komórkowej i podziału komórki. Dlatego każde zaburzenie tych mechanizmów, synteza ściany komórkowej lub podział komórki, może hamować aktywność dehydrogenazy α-ketoglutaranu. W rezultacie może to wpłynąć na jego konwersję do kwasu glutaminowego.

11.3.14. Biosynteza kwasu glutaminowego przez Corynebacterium glutamicum

Kwas glutaminowy jest produkowany z α-ketoglutaranu pochodzącego z cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA) szlakiem redukcji przez NADPH+ przy udziale dehydrogenazy glutaminianowej (rys. 11.4 i 11.5).

Rys. 11.4. Schemat biosyntezy kwasu L-glutaminowego przez Corynebacterium glutamicum na podłożu z glukozą

Rys. 11.5. Schemat produkcji kwasu glutaminowego z α-ketoglutarowego przy udziale NADH lub NADPH + H+ katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową

Glutaminian syntetyzuje się z 2-oksoglutaranu w jednoetapowej reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową (GDH), która jest główną drogą tworzenia glutaminianu, gdy stężenie amonu jest wystarczająco wysokie. 2-Oksoglutaran jest produktem pośrednim cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA), a zatem centralnego metabolizmu węgla, w tym szlaku glikolitycznego, szlaku pentozofosforanowego i szlaków anaplerotycznych. Do wzrostu komórek Corynebacterium glutamicum jest wymagana biotyna. Dziki szczep Corynebacterium glutamicum nie produkuje glutaminianu, gdy biotyna jest obecna w podłożu w nadmiernym stężeniu hodowlanym, natomiast produkuje znaczące ilości glutaminianu, gdy biotyna występuje w niewielkich ilościach. Nadmiar biotyny można zlikwidować przez dodanie środka detergentowego takiego jak „Tween 40” lub „Tween 60”. Dodatek penicyliny, jednego z antybiotyków β-laktamowych, zwiększa również nadprodukcję glutaminianu przez Corynebacterium glutamicum. Ponieważ biotyna jest kofaktorem karboksylazy acetylo-CoA, która jest niezbędna do syntezy kwasów tłuszczowych, uważano, że przepuszczalność błony komórkowej wzrasta, gdy biotyna jest w małych ilościach w podłożu fermentacyjnym. Podobnie dodatek detergentu czy penicyliny modyfikuje skład błony komórkowej lub ściany komórkowej tego mikroorganizmu. W związku z tym uważano, że przepuszczalność błony komórkowej i ściany komórkowej powinna się zmienić z powodu tych zabiegów. To wyjaśnienie nazwano leak model w produkcji glutaminianu. Jednak z punktu widzenia bilansu materiałowego glutaminianu wewnątrzkomórkowego i pozakomórkowego trudno wytłumaczyć w tym modelu tylko wysoką akumulację glutaminianu do ponad 60-80 g/l. Zaproponowano takie wyjaśnienie, że Corynebacterium glutamicum wytwarza glutaminian, ponieważ może mu brakować kompleksu dehydrogenazy 2-oksoglutaranu (ODHC), a cały strumień z izocytrynianu do 2-oksoglutaranu jest kierowany do produkcji glutaminianu. Okazało się, że Corynebacterium glutamicum wykazuje aktywność ODHC, scharakteryzowano geny kodujące podjednostki ODHC. Potwierdzono, że kontrola aktywności ODHC może mieć kluczowe znaczenie dla produkcji glutaminianu oraz szlaku transdukcji sygnału do regulacji ODHC, który obejmuje kinazę białkową PknG i specyficzne białko hamujące Odh.

11.3.15. Produkcja przemysłowa kwasu glutaminowego

Wielu naukowców wykorzystało dostępne narzędzia biotechnologiczne, mając wiedzę na temat fizjologii mikroorganizmów, aby zmodyfikować szczepy w celu zwiększenia produkcji kwasu glutaminowego, zwłaszcza przez Corynebacterium glutamicum. W ciągu ostatnich kilku dekad dokonano postępów w odniesieniu do możliwości wytwarzania kwasu glutaminowego przez różne szczepy Corynebacterium glutamicum. Wykorzystano do tego wszechstronną wiedzę na temat biologii, szlaków biosyntezy, mutacji, wymagań żywieniowych i przepływu węgla. Mikrobiologiczne wytwarzanie kwasu L-glutaminowego zostało obszernie zbadane przez wielu badaczy wykorzystujących różne szczepy maczugowców, a konkretne procesy z określonymi szczepami zostały opatentowane.

Do najpopularniejszych gatunków wytwarzających kwas glutaminowy należą Corynebacterium glutamicum (= dawniej także Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divarticum, Corynebacterium lilium), Corynebacterium herculis, Brevibacterium flavum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium thiogenetalis, Brevibacterium saccharoliticum i Brevibacterium roseum. Inne organizmy wytwarzające kwas glutaminowy to Escherichia coli, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus cereus i Sarcina lutea. Przemysłowo kwas glutaminowy wytwarza się zwykle w procesach fermentacji prowadzonych w hodowlach okresowych lub okresowych z zasilaniem w podłożach płynnych napowietrzanych i mieszanych mechanicznie przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie szczepów Corynebacterium lub Brevibacterium. Produkcja na skalę przemysłową odbywa się w dużych fermentorach wyposażonych we wszystkie urządzenia do kontroli różnych parametrów i optymalizacji produkcji, takich jak system chłodzenia, pomiaru rozpuszczonego tlenu i pH i innych.

Typowy przykład procesu fermentacji w skali laboratoryjnej do wytwarzania kwasu L-glutaminowego wykorzystującego zmutowany szczep Corynebacterium glutamicum przebiega następująco. Organizmy są zazwyczaj utrzymywane na skosach agarowych zawierających hydrolizat wołowy, chlorek sodu, fosforan dipotasowy i agar. Po 24-godzinnej hodowli biomasę szczepu stosuje się do zaszczepienia 25 ml sterylnej pożywki w 250 ml kolbach Erlenmeyera w trzech powtórzeniach. Można stosować następujący skład podłoża: glukoza (8%), NH_4Cl (0,5%), mąka kukurydziana (0,3%), K_2HPO_4 (0,5%), KH_2PO_4 (0,5%), MgSO_4 · 7H_2O (0,03%), CaCO_3 (1,0%) i woda dejonizowana do 100%, pH pożywki 7,2. Zaszczepione pożywki w kolbach Erlenmeyera inkubuje się w orbitalnym inkubatorze wytrząsarki w temp. 30°C przy 230 obr./min przez 15 godz. Całą zawartość jednej kolby przenosi się następnie do 2-litrowego fermentora „Eyla Mini Jar” z 500 ml jałowej pożywki zawierającej melasę (20%), KH_2PO_4 (0,5%), KH_2PO_4 (0,5%), MgSO_4 · 7H_2O (0,3%), mocznik (0,8%), CaCO_3 (1,0%) i dopełnia wodą dejonizowaną do 100%. Optymalne jest pH podłoża 7,0. Fermentację zwykle rozpoczyna się ciągłym mieszaniem i napowietrzaniem przez 48 godz. w temp. 30°C. Pod koniec okresu inkubacji podłoże hodowlane oddziela się od komórek przez odwirowanie z prędkością 10 000 obr./min przez 5 min w temp. 4°C i supernatant rozcieńcza się 50-krotnie przy użyciu lodowatego kwasu octowego o stężeniu 7% obj. W ten sposób uzyskano wysoką wydajność produkcji kwasu glutaminowego wynoszącą 93 g/l w hodowli okresowej (w tempie 3,8 g/(l · godz.)) oraz 73 g/l w hodowli ciągłej (w tempie 29,1 g/(l · godz.). Możliwa jest też hodowla unieruchomionych ulepszonych mutantów Corynebacterium glutamicum, w której uzyskuje się zadawalające wydajności produkcji kwasu glutaminowego (48,5 g/l). W tabeli 11.5 przedstawiono wydajności produkcji kwasu glutaminowego przez różne szczepy bakterii, pochodzące głównie z hodowli okresowych prowadzonych w warunkach laboratoryjnych.

11.3.16. Zastosowanie przemysłowe i rola terapeutyczna kwasu glutaminowego

Kwas glutaminowy i jego sól mają największe zastosowanie w przemyśle spożywczym jako wzmacniacz smaku. Znaczne ilości wolnego kwasu glutaminowego lub jego soli MSG są obecne w różnych produktach spożywczych, np. w różnych rodzajach serów i sosów sojowych. Ponadto, jako główny związek w metabolizmie komórkowym, jest unikalnym paliwem mózgowym i spełnia kilka innych ważnych funkcji, takich jak detoksykacja amoniaku, hepatoprotekcja (glutamina) w celu wspomagania gojenia się wrzodów przewodu pokarmowego. W farmaceutykach, a także w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) kwas glutaminowy odgrywa rolę neuroprzekaźnika. Ponadto może mieć stymulujący wpływ na metabolizm kory mózgowej, poprawiając tym samym sprawność umysłową i funkcję pamięci. Stężenie kwasu glutaminowego w OUN jest wyższe niż w jakimkolwiek innym powszechnie rozpoznawanym neuroprzekaźniku.

Tabela 11.5. Wydajności produkcji kwasu glutaminowego przez różne szczepy bakterii

Nazwa szczepu

Typ hodowli

Wydajność (g/l)

Plon (%)

Produktywność (g/(l · godz.))

Lit.

Brevibacterium sp.

okresowa

41,42

53,0

1,2

[1]

C. glutamicum ATCC 13022

okresowa

ciągła

93,0

73,0

–

75.5

3,8

29,1

[2]

Brevibacterium sp.

ciągła

96,25

55,0

8,3

[3]

C. glutamicum ATCC 14067 F172-8

okresowa

53,70

53,7

–

[4]

Brevibacterium sp. NAB SS-67

okresowa

60,8

61,0

2,1

[5]

C. glutamicum NCIM 2168

okresowa

13,026±0247

–

–

[6]

C. glutamicum NCIM 2168

P. reptilivora NCIM 2598

okresowa

16,026±0,475

–

–

C. glutamicum GDK-9

C. glutamicum GDK-9_ldhA

okresowa

okresowa

64,5±1,33

70,4±1,91

–

–

–

–

[7]

C. glutamicum CECT690

okresowa

142,25

–

–

[8]

[1] Sun-Uk i wsp. 2004. J. Biosci., Bioeng., 98: 211–213. [2] Amin i Al-Talhi 2007. World Appl. Sci. J., 2: 62–67. [3] Yoshioka i wsp. 1999. USA Patent 5869300. [4] Aoki i wsp. 2005. Biol. Sci. Biotechnol. Biochem., 69: 1466–1472. [5] Nadeem i wsp. 2011. Pakistan J. Zool., 43: 285–290. [6] Shyamkumar i wsp. 2014. Avicenna J. Med. Biotech., 6: 163–168. [7] Zhang i wsp. 2014. Brazil. J. Microbiol., 45: 1477–1483. [8] Tavakkoli i wsp. 2012. Food Bioprocess Technol., 5: 92–99.

Literatura rekomendowana

Ikeda M. i Takeno S. 2013. Amino acid production by Corynebacterium glutamicum. Microbiol. Monogr., 23: 107–147.

Ikeda M. i Nakagawa S. 2003. The Corynebacterium glutamicum genome: features and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 62: 99–109.

Kjeldsen K.R. 2008. Optimization of an industrial L-lysine producing Corynebacterium glutamicum strain. Industrial Ph.D. Thesis. Center for Microbial Biotechnology Department of Systems Biology Technical University of Denmark and Agro&Ferm A/S.

Burkovski A. 2015. Trends in Corynebacterium glutamicum research and application. Chapter 1 s. 1–10. [w:] Corynebacterium glutamicum: From Systems Biology to Biotechnological Applications, red. Andreas Burkovski, Caister Academic Press, U.K.

D’Este M.M., Alvarado-Morales M., Angelidaki I. 2018. Amino acids production focusing on fermentation technologies – A review. Biotechnol. Adv., 36: 14–25.

Kind S., Neubauer S., Becker J., Yamamoto M., Volkert M., Abendroth Gv., Zelder O., Wittman C. 2014. From zero to hero – Production of bio-based nylon from renewable resources using engineered Corynebacterium glutamicum. Metabolic Engineering, 25: 113–125.

Becker J., Schafer R., Kohlstedt M., Harder B.J., Borchert N.S., Stoveken N., Bremer., Wittman C. 2013. Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of the chemical chaperone ectoine. Microbial Cell Factories, 12: 110.

Yang J. i Yang S. 2017. Comparative analysis of Corynebacterium glutamicum genomes: a new perspective for the industrial production of amino acids. BMC Genomics, 18 (Suppl. 1): 940.

Hermann T. 2003. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria. J. Biotechnol., 104: 155–172.

12

Mikrobiologiczna produkcja antybiotyków

12.1.Wprowadzenie

Spośród metabolitów wtórnych najbardziej znane są antybiotyki. Jest to niezwykła grupa związków tworząca różnorodne skupiska aktywnych biologicznie cząsteczek o różnych strukturach i mechanizmach działania. Antybiotyki zwykle są produktami wtórnego metabolizmu o małej masie cząsteczkowej (1500 kDa) wytwarzanymi w fazie późnego wzrostu (idiofazie) przez stosunkowo małą grupę mikroorganizmów. Atakują praktycznie wszystkie rodzaje aktywności metabolicznej mikroorganizmów takie jak synteza DNA, RNA i białek, funkcje błon, transport elektronów, sporulację, kiełkowanie zarodników i wiele innych. W latach 1940–1970 nastąpił niezwykle szybki postęp w odkrywaniu nowych istotnych antybiotyków, które są szeroko wykorzystywane w medycynie, rolnictwie oraz badaniach podstawowych. Poszukiwania nowych antybiotyków są wciąż kontynuowane w celu zwalczania ewoluujących patogenów, naturalnie opornych na bakterie i grzyby, a wcześniej wrażliwych na mikroorganizmy. Ponadto nowe związki są konieczne do poprawienia właściwości środków farmakologicznych do walki z rakiem, wirusami i pasożytami oraz do opracowania leków bezpieczniejszych i silniejszych. Opisano około 6000 antybiotyków, 4000 produkowanych przez Actinobacteria, w tym liczne przez szczepy Streptomyces (tab. 12.1). Niektóre gatunki i szczepy są godne uwagi ze względu na ich zdolność do produkowania wielorakich związków.

Lata 1940–1960 to era antybiotyków w biotechnologii. Odkrywcą pierwszego antybiotyku – penicyliny – był szkocki bakteriolog i lekarz Alexander Fleming (1928 r.), za co w 1945 r. otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny. Mówił skromnie „To natura wyprodukowała penicylinę, ja ją tylko odkryłem”. W tym okresie miała miejsce masowa produkcja antybiotyków w skali przemysłowej – penicyliny, streptomycyny i wielu innych (tab. 12.2). W 1939 r. Fleming, Florey i Boris uruchomili pierwszą wytwórnię penicyliny. Był to także okres transformacji steroidów (kortyzonu, testosteronu, estrogenu) przy udziale mikroorganizmów jako czynników katalitycznych.

Tabela 12.1. Procentowy udział wykrytych antybiotyków wytwarzanych przez różne grupy mikroorganizmów

Lata

Procentowy udział produkcji antybiotyków w poszczególnych grupach mikroorganizmów

bakterie

grzyby

Streptomyces

inne

1950

31

55

24

0

1951–1955

31

41

28

0

1956–1960

11

23

65

1

1961–1965

11

14

72

3

1966–1970

11

15

69

4

1971–1975

12

25

58

5

1976–1980

15

25

51

9

1981–1985

14

20

48

18

1986–1990

13

22

48

17

1991–1995

15

30

40

15

1996–2000

20

48

22

10

2001

18

50

26

6

Źródło: na podstawie Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot., 58: 1–26, zmienione.

Tabela 12.2. Kluczowe daty odkrytych ważnych antybiotyków

Lata

Antybiotyk

Mikroorganizm/synteza chemiczna

1940–1949

penicylina

Penicillium chrysogenum

streptomycyna

Streptomyces griseus

grizeofulwina

Penicilium griseofulvum

cefalosporyny

Streptomyces clavuligerus, Cephalosporium acremonium

bacytracyna

Bacillus licheniformis

nitrofurantoina

synteza chemiczna

polimyksyna

Bacillus polymyxa

chloramfenikol

Streptomyces venezuelae

chlorotetracyklina

Streptococcus aureus

neomycyna

Streptomyces fradiae

1950–1959

tetracyklina

Streptomyces aureofaciens

nystatyna

Streptomyces noursei

wiomycyna

Streptomyces vinaceus, Streptomyces caproleus

izoniazyd

synteza chemiczna

virginiamycyna

Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces virginiae

erytromycyna

Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces erythreus

linkomycyna

Streptomyces lincolnensis

cykloseryna

Streptomyces garyphalus

wankomycyna

Streptomyces orientalis

novobiocyna

Streptomyces niveus

ryfamycyna

Amylotopsis mediterranei

kanamycyna

Streptomyces kanamyceticus

tinizadole

synteza chemiczna

1960–1969

kwas nalidyksowy

synteza chemiczna

kwas fuzydowy

Fusarium coccineum

gentamycyna

Micromonospora purpurea

trimetoprim

synteza chemiczna

fosfomycyna

Streptomyces fradiae

rybostamycyna

Streptomyces ribosidificus

1970–2000

muciprocyna

Pseudomonas fluorescens

linezolid

synteza chemiczna

2000 …

daptomycyna

Streptomyces roseosporus

platenzimycyna

Streptomyces platensis

Źródło: na podstawie de Lima Procópio R.E., da Silva I.R., Martins M.K., de Azevedo J.L., de Araújo J.M. 2012. Antibiotics produced by Streptomyces. Braz J. Infect. Dis., 16: 466–471, zmienione.

W pogoni za antybiotykami bardziej efektywnymi tworzy się chemiczne modyfikacje antybiotyków naturalnych; proces ten nazywa się półsyntezą. Typowymi przykładami są półsyntetyczne penicyliny i cefalosporyny, erytromycyny (azytromycyna, klarytromycyna), a niedawno wprowadzono nową tetracyklinę, tzw. tygecyklinę. W ostatnich latach przygotowano tysiące półsyntetycznych penicylin, cefalosporyny, tetracyklin i ryfamycyn. Nowe lub zmodyfikowane antybiotyki otrzymuje się technikami rekombinacji DNA w celu wprowadzenia genów kodujących syntetazy antybiotyków do szczepów produkcyjnych lub do innych szczepów nieprodukujących antybiotyków, tak aby uzyskać zmodyfikowane lub hybrydowe antybiotyki.

Ostatnio zatwierdzony antybakteryjny preparat to daptomycyna – lipopeptyd wytwarzany przez Streptomyces roseosporus. Działa na bakterie Gram-dodatnie, w tym oporne na wankomycynę enterokoki, oporny na metycylinę Staphylococcus aureus i oporny na penicylinę Streptococcus pneumoniae. Daptomycyna zakłóca funkcje błon cytoplazmatycznych bakterii bez wnikania na teren cytoplazmy. Octan kaspofunginy, który hamuje tworzenie ściany komórkowej przez blokowanie β-1,3-syntazy glukanowej, został zatwierdzony do celów komercyjnych w 2000 r. Jest on pozajelitowym kardinem typu przeciwgrzybiczego. Podaje się go w postaci aerozolu przeciwko Pneumocystis carinii, który jest główną przyczyną zgonów u pacjentów z HIV z Ameryki Północnej i Europy. Preparat jest również aktywny wobec Candida, Aspergillus i Histoplasma.

Niektóre gatunki i szczepy promieniowców są godne uwagi ze względu na ich zdolność do produkowania wielorakich związków. Szczepy Streptomyces griseus produkują ponad 40 różnych antybiotyków, szczepy Bacillus subtilis – ponad 60 różnych związków. Szczepy Streptomyces hygroscopicus wytwarzają prawie 200 antybiotyków. Jeden szczep Micromonospora może wyprodukować 48 antybiotyków aminocyklitolowych. Antybiotyki różnią się wielkością jak cząsteczki cykloseryny (102 Da) i bacilizyny (270 Da), do polipeptydów takich jak takich jak nizyna, która zawiera 34 reszty aminokwasowe. Na rynku znajduje się około 160 antybiotyków i ich pochodnych takich jak β-laktamowe antybiotyki peptydowe, makrolidowe poliketydy, tetracykliny, aminoglikozydy i inne. Wartość rynku antybiotyków w USA w 2019 r. szacuje się na 100 mld dolarów. Kategorie antybiotyków produkowanych przez mikroorganizmy przedstawiono w tabeli 12.3.

Badania trendów oraz czynników powodujących wzrost zużycia antybiotyków w 76 krajach wykazały, że w latach 2000–2015 zużycie antybiotyków wyrażone w zdefiniowanych dawkach dziennych (DDD) wzrosło o 65% (21,1–33,8 mld DDD), a wskaźnik zużycia antybiotyków wzrósł o 39% (11,3–15,7 DDD na 1000 mieszkańców). Wzrost ten był wyraźny w krajach o niskich i średnich dochodach i był skorelowany ze wzrostem PKB na jednego mieszkańca (P = 0,004). W krajach o wysokim PKB ogólne zużycie antybiotyków spadło w przeliczeniu na 1000 mieszkańców dziennie o 4%, a spadek ten nie był skorelowany z PKB. Zanotowano wzrost zużycia antybiotyków ostatniej szansy, takich jak glicylocykliny, oksazolidynony, karbapenemy i polimyksyny. Prognozy globalnego zużycia antybiotyków w 2030 r. przewidują wzrost do 200% w stosunku do 2015 r. Najwyższe zużycie antybiotyków występuje w Turcji i Tunezji, najniższe w Dominikanie, Meksyku i Ameryce Środkowej Polska plasuje się na 23. miejscu na 76 badanych krajów.

Tabela 12.3. Podział antybiotyków ze względu na budowę chemiczną

Pochodne

Antybiotyki

Przykłady

pochodne aminokwasowe

antybiotyki β-laktamowe

penicyliny, cefalosporyny

modyfikowane aminokwasy

cykloseryna

antybiotyki polipeptydowe

polimyksyna, cyklosporyna

glikopeptydy

bleomycyna, wankomycyna

depsypeptydy

walinomycyna

lipopeptydy

daptomycyna

chromopeptydy

aktynomycyna

pochodne cukrowe

czyste cukry

nojirymycyna

aminoglikozydy

streptomycyna, gentamycyna

C-glikozydy

wankomycyna

glikolipidy

moenomycyna

antybiotyki makrocykliczne

makrolidy właściwe

erytromycyna, oleandomycyna

makrolidy polienowe

amfoterycyna, nystatyna

ansamycyny

ryfamycyny

makrotetrolidy

tetranaktyna

a,b-diketoamidolaktony

tacrolimus

chinony i ich pochodne

antracykliny

daunorubicyna, aklarubicyna

tetracykliny

chlorotetracyklina, oksytetracyklina

naftochinony

aktynorodyna

benzochinony

mitomycyna

antybiotyki inne

cykloalkany

cykloheksimid

nukleozydy

polioksyna

polietery

monenzyna

związki aromatyczne

chloramfenikol, gryzeofulwina, nowobiocyna

związki fosforoorganiczne

fosfomycyna

związki polieteroidowe

monenzyna

związki steroidowe

kwas fusydowy

W ubiegłym wieku antybiotyki pojawiły się jako cudowne leki, które nie tylko uratowały miliony istnień ludzkich, ale także zrewolucjonizowały pewne działy nauk medycznych. Leki te zmniejszyły śmiertelność podczas rutynowych operacji i w czasie porodu, a także zmniejszyły piętno związane z HIV, które kiedyś uważano za śmiertelną chorobę. W ostatnim czasie z powodu stosowania różnych ksenobiotyków/środków antybakteryjnych, wśród bakterii rozwinęła się oporność na antybiotyki/środki przeciwbakteryjne. Bakterie te stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia. Rozwój oporności ogranicza stosowanie dotychczasowych środków antybakteryjnych oraz zwiększa zapotrzebowanie na nowe związki. Kiedy zaobserwowano wczesną oporność na penicylinę, pozyskano antybiotyki drugiej generacji – metycylinę, cefalotynę i imipenem. W 1961 r. zaobserwowano szczep Staphylococcus aureus oporny na metycylinę (MRSA), a obecnie szacuje się, że 2 miliardy ludzi ma jakąś odmianę Staphylococcus aureus, z czego do 53 milionów to nosiciele MRSA.

Z czasem stało się jasne, że bakterie mogą rozwinąć oporność na prawie każdy antybiotyk. Z wyjątkiem kilku antybiotyków, np. erytromycyny i wankomycyny, oporność została zaobserwowana w stosunku do większości środków przeciwbakteryjnych zaledwie kilka lat po ich wprowadzeniu do użytku klinicznego.

Istnieją trzy strategie rozwoju oporności u bakterii:

1. 1) nadekspresja enzymów, które mogą modyfikować antybiotyk, powodując, że staje się on nieaktywny;

2. 2) mutacja bakteryjnego miejsca docelowego, w wyniku której zachowuje ono swoją funkcję, a lek nie może przejść przez ścianę komórkową bakterii;

3. 3) eksport antybiotyków z komórki do środowiska pozakomórkowego za pomocą pomp wypływowych opornych na wiele leków (MDR) lub utrata kanałów porinowych, co skutkuje niższą przepuszczalnością antybiotyków.

Na przykład leki takie jak β-laktamy są inaktywowane przez nadmierną ekspresję β-laktamaz hydrolizujących antybiotyki. Z kolei antybiotyki takie jak linezolid i streptogramina stają się nieskuteczne przez modyfikację 23S rybosomalnego RNA, a białka pompy wypływowej takie jak AcrB w Escherichia coli eksportują antybiotyki (cyprofloksacynę i tetracyklinę) z komórek bakteryjnych.

12.2.Podstawowa lista dziesięciu typów antybiotyków

Na rynku znajduje się około 160 antybiotyków i ich pochodnych, takich jak β-laktamowe, peptydowe, makrolidowe poliketydy, tetracykliny, aminoglikozydy i inne. Na liście znajduje się dziesięć klas najważniejszych antybiotyków. Klasa antybiotyków to grupa leków, które mają podobne właściwości chemiczne i farmakologiczne. Ich struktury chemiczne mogą być także podobne i mogą zabijać te same lub pokrewne gatunki bakterii. Antybiotyki są specyficzne dla bakterii, które zabijają.

12.2.1. Penicyliny

Penicyliny to antybiotyki pozyskiwane z grzybów należących do rodzaju Penicillium. Penicylina G (penicylina benzylowa) została odkryta przypadkowo w 1928 r. przez Alexandra Fleminga. Zaobserwował on, że na powierzchni odkrytej szalki Petriego wyrosła pleśń z zarodnikami, która hamowała wzrost gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus). Fleming wyizolował z pleśni substancję, która zabijała bakterie, i nazwał ją penicyliną (penicylina G). Naturalna penicylina V została później wyizolowana także z tej samej pleśni Penicillium. Wszystkie inne penicyliny to półsyntetyczne modyfikacje struktury oryginalnych naturalnie występujących penicylin. Modyfikacje rozszerzają spektrum działania penicylin, umożliwiają ich przyjmowanie doustnie i zwiększają ich oporność na penicylinazę, enzym wytwarzany przez niektóre bakterie, który inaktywuje penicylinę.

Działanie penicylin polega na hamowaniu sieciowania łańcuchów aminokwasów w ścianach komórkowych nowo powstających komórek bakterii, które są jeszcze słabe i łatwo pękają. Penicyliny nie mają wpływu na wcześniej powstałe (starsze) komórki bakterii.

Podstawowa struktura penicyliny to kwas 6-aminopenicylinowy (6-APA), który składa się z pierścienia tiazolidynowego ze skondensowanym pierścieniem β-laktamu (rys. 12.1). Penicyliny różnią się resztami acylowymi w pozycji 6. Półsyntetyczne penicyliny tworzy się, wprowadzając grupę acylową do pierścienia 6-APA albo z podłoża produkcyjnego w procesie biosyntezy penicyliny, albo dołącza się ją chemicznie do pierścienia 6-APA otrzymanego przez deacetylację penicyliny przez amylazy. Penicyliny wytworzone bez dodatku jakichkolwiek prekursorów w łańcuchu bocznym są określone jako naturalne. Penicylina G i penicylina V to ważne naturalne penicyliny.

Rys. 12.1. Chemiczna struktura penicyliny

Klasę penicylin nazywa się antybiotykami β-laktamowymi w związku z ich formułą strukturalną. Klasa ta zawiera pięć grup antybiotyków: aminopenicyliny, penicyliny przeciw bakteriom z rodzaju Pseudomonas, inhibitory β-laktamaz, naturalne penicyliny i penicyliny oporne na penicylinazę. Typowe antybiotyki w klasie penicylin to: penicylina V sól sodowa, amoksycylina i kwas klawulanowy (augmentyna).

Aminopenicyliny to bakteriobójcze antybiotyki β-laktamowe, które hamują syntezę ściany komórkowej bakterii. Są chemicznie podobne do penicyliny, ale mają szersze spektrum działania. Aminopenicyliny nie ulegają dezaktywacji przez hydrolizę kwasową, więc można je podawać doustnie, natomiast są podatne na hydrolizę przez β-laktamazę, dlatego czasami są podawane z inhibitorami β-laktamazy. Aminopenicyliny są skuteczne w zwalczaniu większości bakterii Gram-dodatnich oraz infekcji Gram-ujemnych, takich jak Escherichia coli i Hemophilus influenzae. Są one stosowane w leczeniu infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych, zapalenia wsierdzia, infekcji dróg moczowych, infekcji skóry itp.

Penicyliny przeciw bakteriom z rodzaju Pseudomonas to czynniki antybakteryjne, które wykazują aktywność penicylin i aminopenicylin, a ponadto działają na zakażenia rzekome powodowane przez Pseudomonas, Enterococcus i Klebsiella. Zwykle podaje się je razem z inhibitorami β-laktamaz, ponieważ podobnie jak inne penicyliny są podatne na hydrolizę przez β-laktamazy (dlatego nie zawsze są skuteczne przeciwko Staphylococcus, niektórym Gram-ujemnym pałeczkom i niektórym bakteriom beztlenowym wytwarzającym β-laktamazę). Penicyliny te podawane z aminoglikozydami działają skutecznie i unikają rozwoju szczepów oporowych bakterii.

Inhibitory β-laktamazy to leki blokujące aktywność enzymów, zapobiegające rozkładowi antybiotyków β-laktamowych. Enzymy β-laktamazy są wytwarzane zarówno konstytutywnie, jak i adaptacyjnie przez niektóre szczepy i gatunki bakterii: Bacteroides spp., Enterococcus spp., Hemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae i Staphylococcus spp. Rozszczepiają one pierścień β-laktamowy wrażliwych penicylin i cefalosporyn, inaktywując antybiotyk. Aktywność β-laktamów jak amoksycylina, ampicylina, piperacylina i tikarcylina można przywrócić, łącząc je z inhibitorem β-laktamazy. Inhibitorami β-laktamaz są: kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam.

Naturalne penicyliny oparte na oryginalnej strukturze penicyliny G były pierwszymi antybiotykami stosowanymi w praktyce klinicznej. Hamują one syntezę ściany komórkowej bakterii i są skuteczne wobec bakterii Gram-dodatnich, takich jak gronkowce, paciorkowce i bakterii Gram- ujemnych, takie jak meningokoki, Treponema, Borrelia i Leptospira.

Penicyliny oporne na penicylinazę to antybiotyki, które nie ulegają inaktywacji pod wpływem enzymu penicylinazy. Niektóre bakterie wytwarzają penicylinazę enzymatyczną, która niszczy pierścień β-laktamowy antybiotyku, czyniąc penicylinę nieskuteczną. Penicyliny oporne na penicylinazę stosuje się w leczeniu opornych szczepów gronkowców.

Teiksobaktyna jest inhibitorem syntezy ściany komórkowej. Działa przede wszystkim przez wiązanie z lipidem II, prekursorem peptydoglikanu. Lipid II jest również atakowany przez antybiotyk wankomycynę. Wiązanie teiksobaktyny z prekursorami lipidów hamuje wytwarzanie warstwy peptydoglikanu, prowadząc do lizy wrażliwych bakterii, a także do ich zabijania przez działanie uwolnionych autolizyn. Stwierdzono, że teiksobaktyna in vitro działa przeciwko wszystkim badanym bakteriom Gram-dodatnim, w tym Staphylococcus aureus i trudnym do leczenia enterokokom, przy czym Clostridium difficile i Bacillus anthracis są wyjątkowo wrażliwe. Zabija także prątki gruźlicy Mycobacterium tuberculosis. Antybiotyk ten jest skuteczny in vivo w leczeniu myszy zakażonych Staphylococcus aureus opornym na metycylinę (MRSA) i Streptococcus pneumoniae. Teiksobaktyna jest produkowana przez niehodowalną bakterię Gram-ujemną Eleftheria terrae (tymczasowa nazwa organizmu), która została odkryta jesienią 2014 r. i jest przedmiotem badań naukowych. Odkrycie Eleftheria terrae może oznaczać nową erę antybiotyków, ponieważ teiksobaktyna jest pierwszym nowym antybiotykiem odkrytym od czasów antybiotyków syntetycznych w latach 80. ubiegłego wieku.

12.2.2. Tetracykliny

Tetracykliny zostały odkryte w 1940 r. Po raz pierwszy zostały uzyskane lub pochodziły ze szczepów Streptomyces griseus (rys. 12.2). Tetracykliny hamują syntezę białek. Proces translacji mRNA zachodzi w trzech fazach: inicjacji, wydłużenia i zakończenia z udziałem cytoplazmatycznych rybosomów i innych składników. Rybosom składa się z dwóch podjednostek (50S i 30S) będących celami głównego antybiotyku, który hamuje syntezę białek. Tetracyklina działa przez blokowanie dostępu do rybosomu aminoacylo-tRNA podjednostki 30S, zapobiegając tworzeniu się łańcucha peptydowego; spektynomycyna zaburza stabilność wiązania peptydylo-tRNA z rybosomem.

Nazwa

R_1

R_2

R_3

R_4

chlorotetracyklina

Cl

CH_3

OH

H

oxytetracyklina

H

CH_3

OH

OH

tetracyklina

H

CH_3

OH

H

doksycyklina

H

CH_3

H

OH

minocyklina

NMe_2

H

H

H

Rys. 12.2. Wzór strukturalny tetracykliny

Tetracykliny zapobiegają namnażaniu się bakterii, ale niekoniecznie je zabijają. Mają szerokie spektrum działania przeciwko wielu bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym, chlamydiom, mikoplazmom, pierwotniakom i riketsjom. Tetracykliny są szeroko stosowane do zapobiegania malarii, w leczeniu trądziku, wąglika, zakażeń oka, przewodu pokarmowego, dróg moczowo-płciowych, dziąseł, dróg oddechowych i skóry, zakażeń spowodowanych przez wszy, roztocza lub kleszcze (takie jak gorączka plamista Gór Skalistych, gorączka tyfusu), zakażeń wywołanych przez Campylobacter, Chlamydiae, Yersinia pestis (dżuma), Vibrio cholerae (cholera), zakażeń dróg oddechowych wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Klasa tetracyklin dzieli się na:

1. 1) naturalne jak chlorotetracyklina, tetracyklina i oksytetracyklina;

2. 2) półsyntetyczne jak doksycyklina, minocyklina, rolitetracyklina i metacyklina.

Dobrze znane leki tej klasy to: doksycyklina, tetracyklina, minocyklina.

12.2.3. Cefalosporyny

Cefalosporyny (rys. 12.3) to duża grupa antybiotyków pochodzących z hodowli grzybów strzępkowych z rodzaju Acremonium (poprzednio zwanej Cephalosporium acremonium). Po raz pierwszy prekursory cefalosporyn zostały wyizolowane z hodowli grzyba Cephalosporium acremonium w 1948 r. przez włoskiego naukowca z Sardynii Giuseppe Brotzu.

Cefalosporyny działają w podobny sposób jak penicyliny. Wiążą się i blokują aktywność enzymów odpowiedzialnych za wytwarzanie peptydoglikanu, ważnego składnika ściany komórkowej bakterii. Nazywa się je antybiotykami o szerokim spektrum działania, ponieważ są skuteczne przeciwko wielu bakteriom.

Od czasu odkrycia pierwszej cefalosporyny naukowcy udoskonalili strukturę cefalosporyn, aby zwiększyć ich skuteczność w stosunku do różnych bakterii. Wraz ze zmianą strutury powstają nowe „generacje” tych antybiotyków. Cefalosporyny to grupa półsyntetycznych antybiotyków β-laktamowych. Są to pochodne kwasu 7-aminocefalosporynowego (7-ACA). Zawierają w swojej cząsteczce dwupierścieniową strukturę cefemu, który wykazuje większą oporność na działanie β-laktamaz. Cefalosporyny, tak jak wszystkie antybiotyki β-laktamowe, hamują tworzenie mostków łączących podjednostki peptydoglikanu (mureiny) w integralną całość.

Istnieje pięć generacji cefalosporyn o rosnącym zasięgu obejmującym infekcje bakterii Gram-ujemnych. Cefalosporyny leczą wiele infekcji, w tym anginę, infekcje ucha, dróg moczowych, skóry i zapalenie opon mózgowych. Cefalosporyna piątej generacji (Teflaro) jest aktywna przeciwko opornym na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA). Typowe leki w tej klasie, to: cefuroksym, ceftriakson i cefdinir.

12.2.4. Chinolony

Chinolony (rys. 12.4 na s. 358) to grupa syntetycznych antybiotyków o szerokim spektrum działania. Istnieje pięć klas chinolonów. Ponadto inne antybiotyki zwane fluorochinolonami mają strukturę chinolonów modyfikowaną za pomocą fluoru. Działanie chinolonów i fluorochinolonów polega na hamowaniu działania dwóch enzymów wytwarzanych przez bakterie – topoizomerazy IV i gyrazy DNA – wskutek czego nie mogą już naprawiać DNA bakterii ani pomagać w jego wytwarzaniu.

Rys. 12.3. Wzory strukturalne cefalosporyn

a)

b)

c)

Rys. 12.4. Chinolony: a) ogólny wzór strukturalny (R – zazwyczaj reszta piperazyny, F – atom fluoru), b) kwas nalidyksowy, c) cyprofloksacyna

Tabela 12.4. Klasyfikacja fluorochinolonów

Generacja

Nazwa antybiotyku

Działanie antybiotyku

pierwsza

kwas nalidyksowy

kwas oksolinowy

kwas pipemidowy

aktywny przeciw pewnym bakteriom Gram-ujemnym

silnie wiążący się z białkami

krótki okres półtrwania

druga

norfloksacyna

enoksacyna

cyprofloksacyna

ofloksacyna

lomefloksacyna

wiąże białka (50%)

dłuższy czas trwania niż antybiotyków niższych generacji

poprawiona aktywność przeciwko bakteriom Gram-ujemnym

trzecia

temafloksacyna

sparafloksacyna

grepafloksacyna

aktywny przeciwko bakteriom Gram-ujemnym

aktywny także przeciwko bakteriom Gram-dodatnim

czwarta

klinafloksacyna

trovafloksacyna

moksyfloksacyna

gatifloksacyna

rozszerzona aktywność przeciwko różnymi szczepom

aktywny przeciwko beztlenowcom i bakteriom atypowym

Źródło: na podstawie Sharma P.C., Jain A., Jain S. 2009. Fluoroquinolone antibacterials: A review on chemistry, microbiology and therapeutic prospects. Acta Polonica Pharmaceutica – Drug Research, 66: 578–604). Za zgodą CCC.

Chinolony i fluorochinolony są względnie nową klasą syntetycznych antybiotyków o silnym działaniu bakteriobójczym, o szerokim spektrum działania przeciwko wielu klinicznie ważnym patogenom, które są odpowiedzialne za różne infekcje, w tym infekcje dróg moczowych, żołądkowo-jelitowe, dróg układu oddechowego, a także choroby przenoszone drogą płciową i infekcje skóry, bakteryjne zapalenie gruczołu krokowego oraz wąglika lub dżumę. Nowe chinolony stanowią ważną alternatywę terapii antybakteryjnej, szczególnie w obszarach, w których często występują mikroorganizmy oporne na penicylinę i makrolidy. W 2016 r. FDA (U.S. Food & Drug) ostrzegła przed nieuzasadnionym stosowaniem tej klasy antybiotyków. FDA poinformowała, że nie są one odpowiednie dla typowych schorzeń, takich jak zapalenie zatok, zapalenie oskrzeli i nieskomplikowane infekcje dróg moczowych. Powinny być stosowane tylko wówczas, gdy leczenie innymi, mniej toksycznymi antybiotykami jest nieskuteczne (tab. 12.4).

12.2.5. Linkomycyny

Pochodne linkomycyny (rys. 12.5) to niewielka grupa antybiotyków, które hamują syntezę białek bakteryjnych niezbędnych do przetrwania bakterii. Mechanizm działania polega na blokowaniu biosyntezy białka przez wiązanie się z podjednostką 50S rybosomów. Ta klasa wykazuje aktywność przeciwko Gram-dodatnim tlenowcom i beztlenowcom, jak również niektórym beztlenowcom Gram-ujemnym. Leki: linkomycyna i klindamycyna.

Rys. 12.5. Wzór strukturalny linkomycyny

Linkomycyna jest produktem fermentacji Streptomyces lincolniensis. W zależności od stężenia i wrażliwości drobnoustrojów wywiera działanie bakteriostatyczne lub bakteriobójcze. Na linkomycynę są wrażliwe bakterie rodzajów Actinomyces, Propionibacterium, Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus, w tym Streptococcus pneumoniae, pneumokoki. Jedna z pochodnych linkomycyny jest wskazana do leczenia Plasmodium falciparum (malarii). Pochodne linkomycyny można stosować w leczeniu ciężkich zakażeń, takich jak zapalenie narządów miednicy mniejszej, zakażenia wewnątrzbrzuszne, infekcje dolnych dróg oddechowych oraz zakażenia kości i stawów.

12.2.6. Makrolidy

Makrolidy to klasa antybiotyków produkowanych przez różne gatunki Streptomyces. Są to naturalne laktony o dużym pierścieniu składającym się z 14–20 atomów (rys. 12.6). Makrolidy wiążą się z podjednostką 50S rybosomu bakteryjnego i hamują jego translokację, dezaktywują tRNA powodując przedwczesne zakończenie syntezy łańcucha peptydowego (zahamowanie translokacji peptydylotransferazy), co prowadzi do zahamowania syntezy białek bakteryjnych. Ich działanie jest głównie bakteriostatyczne, ale może być bakteriobójcze w wysokich stężeniach lub w zależności od rodzaju mikroorganizmu.

Rys. 12.6. Wzór strukturalny erytromycyny

Makrolidy mogą być stosowane w leczeniu pozaszpitalnego zapalenia płuc, krztuśca (kokluszu), a także nieskomplikowanych infekcji skóry. Ketolidy to nowa generacja antybiotyków opracowanych w celu przezwyciężenia oporności bakterii makrolidowych. Często stosowane makrolidy w leczeniu to: azytromycyna, erytromycyna i klarytromycyna.

12.2.7. Sulfonamidy

Sulfonamidy to sztuczne (syntetyczne) leki, które zawierają sulfonamidową grupę chemiczną (rys. 12.7). Często używa się terminu „sulfonamid” nieprecyzyjnie w stosunku tylko do antybiotyków, istnieje bowiem kilka nieantybiotycznych sulfonamidów, które zostały opracowane przez wykorzystanie obserwacji uzyskanych podczas klinicznej oceny antybiotyków sulfonamidów. Są one stosowane w różnych stanach, takich jak cukrzyca i łagodzenie bólu. Antybakteryjne środki sulfonamidowe są bakteriostatyczne (powstrzymują bakterie przed rozmnażaniem, ale niekoniecznie je zabijają) i zakłócają syntezę kwasu foliowego u bakterii, który jest niezbędny do tworzenia kwasów nukleinowych, a ostatecznie do DNA i RNA.

Rys. 12.7. Ogólny wzór sulfonamidów: R_1 – dowolna grupa organiczna; R_2, R_3 – H lub grupa organiczna

Sulfonamidy są skuteczne przeciwko niektórym bakteriom Gram-dodatnim i wielu Gram-ujemnym, ale oporność bakterii na sulfonamidy jest powszechna. Typowe zastosowania sulfonamidów obejmują leczenie lub profilaktykę pneumocystycznego zapalenia płuc oraz infekcje ucha (zapalenie ucha środkowego). Znane antybiotyki to: sulfametoksazol-trimetoprim, sulfasalazyna oraz sulfizoksazol (w połączeniu z erytromycyną). Uważa się, że sulfonamidy nieantybiotykowe mają właściwości przeciwzapalne lub immunomodulujące, ale dokładny sposób ich działania w pewnych warunkach nie jest znany.

Przykłady niektórych stanów, które można leczyć sulfonamidami obejmują: infekcje bakteryjne, chorobę Leśniowskiego-Crohna, cukrzycę, retencję płynów, dnę moczanową, wysokie ciśnienie krwi, ból i stan zapalny, reumatoidalne zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie jelita grubego.

12.2.8. Glikopeptydy

Antybiotyki glikopeptydowe hamują tworzenie ściany komórkowej bakterii przez hamowanie syntezy peptydoglikanów (rys. 12.8). Są stosowane w leczeniu zakażeń wielolekoopornych Staphylococcus aureus (MRSA) oraz zakażeń Streptococcus lub Enterococcus takich jak zapalenie wsierdzia, które jest oporne na β-laktamy i inne antybiotyki, powikłane infekcje skóry, biegunka związana z Clostridium difficile, zapalenie jelita grubego, szpitalne zapalenie płuc nabyte podczas pobytu w szpitalu lub podczas korzystania z respiratora, ciężkie infekcje skóry i struktury skóry. Typowe nazwy leków: dalbawancin, oritawancyna, telawancyna i wankomycyna.

Rys. 12.8. Wzór strukturalny wankomycyny

12.2.9. Aminoglikozydy

Aminoglikozydyhamują syntezę bakterii przez wiązanie z rybosomem 30S i działają szybko jako antybiotyki bakteriobójcze (zabijające bakterie). Leki te są zwykle podawane dożylnie. Typowymi przykładami antybiotyków w tej klasie są: streptomycyna, gentamycyna, kanamycyna, tobramycyna i amikacyna (rys. 12.9). Kanamycyna jest wytwarzana przez Szczep Streptomyces kanamyceticus (kana – oznacza barwę złotą kolonii), izolowany z hodowli mieszanej bakterii glebowych w 1956 r. przez japońskich badaczy.

a)

b)

Rys. 12.9. Wzory strukturalne: a) streptomycyny, b) kanamycyny

Aminoglikozydy są klasą antybiotyków stosowanych głównie w leczeniu infekcji wywołanych tlenowymi bakteriami Gram-ujemnymi, ale są one również skuteczne przeciwko Staphylococcus i Mycobacterium tuberculosis. Są często stosowane w połączeniu z innymi antybiotykami.

12.2.10. Karbapenemy

Karbapenemy (rys. 12.10) mają zdolność hamowania enzymów β-laktamowych (zwanych także penicylinazą) – rodzaju enzymów, które znacznie zmniejszają aktywność antybiotyków, takich jak penicyliny i cefamycyny. Karbapenemy hamują syntezę ściany komórkowej bakterii przez wiązanie z białkami, które wiążą penicylinę, i zakłócają tworzenie ściany komórkowej. Ze wszystkich antybiotyków β-laktamowych, karbapenemy mają najszersze spektrum działania i największą siłę działania przeciwko różnym patogenicznym bakteriom. Z tego powodu najczęściej stosuje się je do naprawdę ciężkich zakażeń i używa jako środków „ostatniej linii” w stanach zagrażających życiu, takich jak infekcje żołądka, zapalenia płuc, infekcje nerek, zakażenia szpitalne oporne na wiele leków i wiele innych chorób bakteryjnych. Znane leki tej klasy to: tienamycyna, imipenem, meropenem, dorypenem, ertapenem. Tienamycyna była pierwszym karbapenemem odkrytym w 1976 r.

Rys. 12.10. Ogólny wzór strukturalny karbapemów

12.3.Przemysłowa produkcja penicylin, cefalosporyn i cefamycyny

Szlaki biosyntezy penicylin, cefalosporyn i cefamycyny są dobrze scharakteryzowane zarówno genetycznie i biochemicznie. Uogólnioną ścieżkę pokazano na rysunku 12.11. Większość ważnych genów została sklonowana.

12.3.1. Przemysłowa produkcja penicyliny

Główne etapy komercyjnej produkcji penicyliny są następujące:

1. 1) przygotowanie inoculum;

2. 2) przygotowanie i sterylizacja podłoża;

3. 3) szczepienie podłoża fermentacyjnego inoculum w fermentorze;

4. 4) wymuszone napowietrzanie sterylnym powietrzem podczas inkubacji oraz dokarmianie;

5. 5) usuwanie grzybni pleśni po fermentacji;

6. 6) ekstrakcja i oczyszczanie penicyliny.

Rys. 12.11. Schemat biosyntezy penicylin, cyklosporyny i cefamycyny; ACV – tripeptyd δ-(L-α-aminoadipinolo-L-cysteinylo-D-walina) Źródło: na podstawie Kreisberg-Zakarin R., Borovok I., Yanko M., Ahronowitz Y., Cohen G. 1999. Recent advances in the structure and function of isopenicillin N synthase. Antonie van Leeuwenhoek, 75: 33–39. Za zgodą CCC.

Proces fermentacji i produkcja penicyliny G lub V są prowadzone w hodowlach półciągłych w warunkach aseptycznych w bioreaktorach wykonanych ze stali nierdzewnej o pojemności 30 000−100 000 galonów (galon angielski 1 gal = 4,5 l), poprzedzone zwykle trzema kolejnymi pasażami hodowli w coraz większych bioreaktorach. Hodowla produkcyjna trwa 120–200 godz. Proces fermentacji penicyliny jest podzielony na dwa etapy – etap pierwszy to faza wzrostu grzybni, a drugi etap – faza produkcji penicyliny. W fazie wzrostu trwającej około 40−50 godz. zwiększa się masa komórek (czas podwojenia co 6 godz.). W tej fazie zapotrzebowanie na tlen jest bardzo wysokie. Po zakończeniu fazy wzrostu rozpoczyna się faza produkcji penicyliny, w której produkcja biomasy jest znacznie mniejsza (właściwa szybkość wzrostu μ = 0,01), a rośnie szybkość produkcji penicyliny. Różne składniki podłoża podawane w fazie syntezy penicyliny pozwalają na produkcję penicyliny w czasie 120–180 godz. Obecne hodowle penicyliny są skomputeryzowane, a substraty podawane automatycznie. Temperatura, pH, rozpuszczony tlen, dwutlenek węgla, cukier, prekursor, amoniak i inne są ściśle monitorowane i kontrolowane pod kątem optymalnej produkcji antybiotyku (rys. 12.12).

Rys. 12.12. Wpływ różnych czynników na produkcję penicyliny w hodowlach stacjonarnych Penicillium chrysogenum

W procesie fermentacji penicylin stosuje się różne źródła węgla – glukozę, sacharozę oraz inne surowce zawierające cukry. Cukier i prekursor są podawane w sposób ciągły. Cukier jest również stosowany w celu regulacji pH procesu fermentacji (6,4–6,8) podczas aktywnej fazy produkcji penicyliny. Około 65% węgla dodawanego do fermentacji zostaje metabolizowane w celu utrzymania procesów życiowych komórek, 20–25% – w celu przyrostu biomasy oraz 10–12% – w celu produkcji penicylin. Głównymi źródłami azotu są namok kukurydziany i mączka z nasion bawełny lub soi, amoniak i siarczan amonu. Podstawowymi substancjami prekursorowymi są kwas fenylooctowy lub kwas fenoksyoctowy odpowiednio w produkcji penicyliny G i penicyliny V. W procesie fermentacji część podłoża w warunkach sterylnych ulega wymianie (20–40%). Procedurę można powtarzać kilkakrotnie podczas fermentacji w celu otrzymania wysokiej wydajności produkcji penicyliny. Stężenia penicyliny G ~100 000 U/ml uzyskali naukowcy w Panlabs.

W pozyskiwaniu penicyliny G brzeczkę pofermentacyjną schładza się i przepuszcza przez filtr w celu usunięcia biomasy. Przesącz zakwasza się i ekstrahuje octanem butylu. Penicylinę ekstrahuje się z rozpuszczalnika (octanu butylu) wodnym buforem o pH 7,0. Frakcję wodną zakwasza się do pH 2,0–2,5 w H_2SO_4 i ponownie ekstrahuje octanem butylu. Do ekstraktu dodaje się octan potasu, który powoduje powstawanie kryształów penicy-liny G + sole przez szereg kolejnych etapów ekstrakcji i krystalizacji. Tak utworzoną sól przemywa się acetonem przez odwirowanie i suszy pod próżnią. Pigmenty i zanieczyszczenia są eliminowane przy użyciu aktywnego węgla drzewnego. Penicylina krystalizuje po dodaniu octanu potasu i jest w postaci soli potasowej. Zwykle końcowym produktem jest kwas 6-amino-penicylinowy (6-APA). W tabeli 12.5 przedstawiono liczne zmiany wprowadzone w procesie fermentacji penicyliny zarówno w fazie upstream jak i downstream w ciągu pięciu dekad.

Tabela 12.5. Zmiany technologii w procesie fermentacji penicyliny

Fermentacja

Rok 1950

Rok 2000

źródło węgla

laktoza

glukoza/sacharoza

typ hodowli bakterii

stacjonarna

stacjonarna z dokarmianiem

sterylizacja podłoża

w bioreaktorze

w sposób ciągły

sterylizacja powietrza

filtr

filtr membranowy

dożywianie w hodowli

brak

wielokrotne

morfologia grzyba

strzępki

kulki

czas cyklu hodowlanego

120 godz.

120-200 godz

objętość bioreaktora (gal)

(1000 gal = 4540 l)

10 tys.-20 tys.

20 tys.-60 tys.

test

biotest

HPLC

kontrola

temperatura

skomputeryzowany

miano

0,5–1,0

> 40

etapy ekstrakcji

liczne

pojedyncza do kilku

odzyskiwanie prekursorów

brak

odzyskiwane i wykorzystane

wydajność procesu (%)

70–80

90

kwestie ochrony środowiska

kilka

liczne

koszt kg produktu

275–300 $

15–20 $

Źródło: na podstawie Elander R.P. 2003. Industrial production of β-lactam antibiotics. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61: 385–392). Za zgodą CCC.

W 1949 r. Stany Zjednoczone były głównym producentem penicyliny G (~ 83 t). W 1982 r. globalnie wyprodukowano 12 000 t, a w 1995 już ~33 000 t penicyliny w postaci 6-APA, która posłużyła do produkcji głównie półsyntetycznych penicylin i cefalosporyn.

12.3.2. Półsyntetyczne β-laktamy

Jądro penicyliny (6-APA) umożliwiło naukowcom wytworzenie wielu doskonałych półsyntetycznych penicylin. Może ono być także pierścieniem chemicznie ekspandowanym do 7-ADCA, z którego powstaje wiele ważnych doustnie aktywnych cefalosporyn (cefaleksyna, cefradyna, cefadroksyl). Obecnie penicylina 6-APA jest β-laktamem sprzedawanym luzem w największych ilościach. Wiele z tych ważnych antybiotyków wyprodukowanych na bazie wykorzystania „jądra” penicyliny przedstawiono w tabeli 12.6.

Tabela 12.6. Produkowane antybiotyki β-laktamowe komercyjne i oraz eksperymentalne

Podtypy

Antybiotyki eksperymentalne

Antybiotyki komercyjne

penicyliny

penicylina G, penicylina V, ampicylina, bakampicilina, cloksacylina, floksacylina, mezlolicyna, nafcilina, oksacylina,

amoksycylina

penicyliny oporne na penicylinazy

dikloksacylina

metycylina

antypseudomonas penicyliny

karbenicylina, indanyl piperacyliny

tikarcylina

I generacji cefalosporyny

cefalotyna, cefradyna, cefadroksyl, cefazolina

cefaleksyna

II generacji cefalosporyny

cefotetam, cefmetazol, cefonicyd

cefuroksyna, cefaklor

III generacji cefalosporyny

cefizoksym, ceftriakson, cefotaksym, proksetil, ceftazymid, cefpodeksym

cefiksym, ceftibuten, cefprozyl

IV generacji cefalosporyny

cefepim

oksycefamy

flomoksel, latamoksel

cefamy

cefoksytyn

karbapenemy

lorakarbel, meropenem, panipenem

imipenem

monobaktamy

aztreonam, karumonam

klawamy (inhibitory β-laktamaz)

sulbaktam, tazobaktam

kwas klawulanowy

penicyliny/inhibitory β-laktamaz

ampicylina/sulbaktam, piperycylina/tazabaktam, trikarcylina/kwas klawulanowy

amoksycylina/kwas klawulanowy

Źródło: na podstawie Elander R.P. 2003. Industrial production of β-lactam antibiotics. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61: 385–392. Za zgodą CCC.

12.4.Streptomycyna

Streptomycynajest antybiotykiem o szerokim spektrum działania, należącym do oligosacharydowych antybiotyków z rodziny aminoglikozydów (rys. 12.13).

Rys. 12.13. Budowa cząsteczki streptomycyny

Streptomycyna została wyizolowana w 1943 r. przez ucznia Waksmana, Alberta Schatza, który zauważył, że szczep Streptomyces griseus wytwarza związek aktywny wobec bakterii Gram-ujemnych i prątków gruźlicy. W 1952 r. za odkrycie streptomycyny Waksman otrzymał Nagrodę Nobla. Antybiotyk ten jest aktywny głównie wobec bakterii Gram-ujemnych Mycobacterium tuberculosis (czynnik powodujący gruźlicę), jak również hamuje wzrost pewnych bakterii Gram-dodatnich. Streptomycyna jest stosowana przede wszystkim do walki z patogennymi bakteriami opornymi na penicyliny, a także z innymi, które wywołują takie choroby jak dżuma (Pasteurella pestis), bruceloza (Brucella abortus), tularemia (Francicella tulariensis). Antybiotyk ten zakłóca funkcjonowanie nerwów czaszkowych, a także może powodować głuchotę oraz uszkodzenie nerek. Streptomycyna również jest stosowana w leczeniu chorób roślin, ponieważ jest to antybiotyk ogólnoustrojowy (transportowany do wszystkich części rośliny przez tkanki).

12.4.1. Mechanizm działania streptomycyny

Streptomycyna wiąże się z białkiem małej podjednostki rybosomu S12, która wiąże się z m-RNA podczas translacji. Istnieje konkurencja między streptomycyną i m-RNA o miejsca wiązania. Antybiotyk ten przeszkadza w tworzeniu kompleksu inicjacji. Następuje wadliwy odczyt kodu genetycznego i są syntetyzowane wadliwe białka, powodujące śmierć bakterii.

12.4.2. Produkcja streptomycyny

Obecnie do produkcji streptomycyny wykorzystuje się mutanty Streptomyces. Na początku (1940 r.) szczepy Streptomyces były mało wydajne – otrzymywano tylko 50 jednostek streptomycyny na 1 ml pożywki. Nowe szczepy opracowane drogą mutacji dają plon wielkości 25 000 jednostek na 1 ml. Przemysłową produkcję streptomycyny prowadzi się w hodowlach wgłębnych (płynnych) w fermentorach (rys. 12.14).

Rys. 12.14. Zużycie substratów oraz zmiany przyrostu biomasy i stężenia streptomycyny w hodowli Streptomyces sp.

Zarodniki mutantów Streptomyces są utrzymywane w glebie lub w postaci liofilizowanej, ponieważ szczepy te są genetycznie niestabilne. Zarodniki z gleby są wykorzystywane do zaszczepiania podłoży sporulacyjnych, przenoszonych następnie do fermentora, w którym wytwarza się biomasę do zaszczepienia fermentora, w którym tworzy się szczepionkę (inoculum). Podłoże hodowlane zawiera glukozę, skrobię, dekstrynę, mączkę sojową, namok kukurydziany, podstawowe sole mineralne (sodu, wapnia, magnezu, fosforu) oraz mikroelementy takie jak molibden, cynk, miedź i mangan. Fermentacja streptomycyny wymaga silnego napowietrzania i mechanicznego mieszania. Fermentacja prowadzona się w temp. 28–30°C w środowisku o pH 7,6−8 daje dobrą wydajność. Fermentacja trwa 5−7 dni z wydajnością 1–3 g/l brzeczki fermentacyjnej.

Fermentacja streptomycyny przebiega w trzech etapach. W pierwszym etapie, który trwa 24 godz., organizm produkuje proteazy trawiące śrutę sojową uwalniając amoniak, białka i węglowodany wykorzystywane do przyrostu biomasy. Wykorzystanie glukozy jest powolne, wskaźnik ilości streptomycyny produkowanej w tej fazie jest niewielki. Rośnie alkaliczność podłoża – pH wzrasta od 6,7–6,8 do 7,5 lub więcej. Kolejnym etapem jest produkcja streptomycyny, która trwa od 34 godz. do 6–7 dni. Następuje szybkie wykorzystanie glukozy i amoniaku, powstają znaczne ilości streptomycyny. Nie ma wzrostu grzybni i pH na tym etapie pozostaje na stałym poziomie około 7,6–8,0. Jest to tzw. idiofaza lub faza stacjonarna produkcji streptomycyny (metabolit wtórny). W ostatnim etapie (etap śmierci) cukry zostają całkowicie wyczerpane w pożywce, a produkcja streptomycyny całkowicie ustaje. Amoniak uwalniany z powodu rozpadu komórek podnosi średnie pH brzeczki fermentacyjnej. Brzeczkę zwykle zbiera się przed rozpoczęciem ostatniej fazy.

Streptomycyna pochodzi bezpośrednio z glukozy jako prekursora. Enzymy zaangażowane w syntezę N-metyloglukozaminy nie są jeszcze znane, ale oczekuje się, że około 28 enzymów bierze udział w konwersji glukozy do streptomycyny, jak to pokazano na rysunku 12.15.

Rys. 12.15. Schemat syntezy streptomycyny

12.4.3. Odzyskiwanie streptomycyny

Po zakończeniu fermentacji oddziela się grzybnię od brzeczki przez filtrowanie, a streptomycynę odzyskuje się przez przepuszczenie przez kolumny jonowymienne. Streptomycyna zostaje adsorbowana na jonitach, skąd jest eluowana w postaci siarczanu streptomycyny. Zanieczyszczenia usuwa się za pomocą podchlorynu sodu, EDTA i węgla aktywowanego. Oczyszczony roztwór siarczanu streptomycyny zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy w warunkach aseptycznych. Kolumny z żywicą jonowymienną zastąpiły tradycyjne metody ekstrakcji rozpuszczalnikami stosowane do ekstrakcji i oczyszczania streptomycyny, co znacznie obniżyło koszty jej produkcji.

Literatura rekomendowana

Ball P. 2000. Quinolone generation: natural history or natural selection. J. Antimicrobial Chemotherapy, 46: 17–24.

Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot., 58: 1–26.

De Lima Procópio R.E., da Silva I.R., Martins M.K., de Azevedo J.L., de Araújo J.M. 2012. Antibiotics produced by Streptomyces. Braz J. Infect. Dis., 16: 466–471.

Demain A.L. i Elander R.P. 1999. The b-lactam antibiotics: past, present and future. Antonie van Leeuwenhoek, 75: 5–19.

Demain AL, Martin JF, Elander RP. 1998. Penicillin Biochemistry and genetics. [w:] Penicillin: a paradigm for biotechnology, red. Candida Mateles R.I., Chicago, s. 98–114

Elander R.P. 2003. Industrial production of β-lactam antibiotics. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61: 385–392.

Hopwood D.A. 2008. Streptomyces in Nature and Medicine. The Antibiotic Makers. Oxford University Press, New York.

Jakubiak M. 2014. Historia pędzlaka, czyli początek antybiotyków. Gazeta Lekarska, nr 11.

Klein E.Y., van Boeckel T.P., Martinez E.M., Pant S., Gandra S., Levin S.A., Goossens H., Laxminarayan R. 2018. Global increase and geographic convergence in antibiotic consumption between 2000 and 2015. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1717295115

Kreisberg-Zakarin R., Borovok I., Yanko M., Ahronowitz Y., Cohen G. 1999. Recent advances in the structure and function of isopenicillin N synthase. Antonie van Leeuwenhoek, 75: 33–39.

Ling i 21 wsp. 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature, 517: 455–459.

Sharma P.C., Jain A., Jain S. 2009. Fluoroquinolone antibacterials: a review on chemistry, microbiology and therapeutic prospects. Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, 66: 587–604.

Ubysz J. i Tobiasz E. 2016. Penicylina – pleśń, która ratuje życie (Penicillin – mold which saves lives). Analit., 2: 152–154.

13

Mikrobiologiczna produkcja witamin i prowitamin

13.1.Wprowadzenie

Brak witamin w diecie człowieka może być przyczyną wielu groźnych chorób. W dawnych czasach po 10–12 tygodniach długich rejsów żeglarze zwykle chorowali na szkorbut, chorobę charakteryzującą się osłabieniem, bólami stawów, wypadaniem zębów i plamami pojawiającymi się na całym ciele, a w końcu nagłym zgonem „w środku zdania” z powodu pęknięcia głównej tętnicy. Okazało się jednak, że bardzo chorzy żeglarze wracali do zdrowia po 10 dniach pobytu na lądzie, gdzie jedli świeże owoce i warzywa, do których nie mieli dostępu na statku. Inną chorobą związaną z ograniczoną dietą była choroba beri-beri objawiająca się najpierw słabością i utratą czucia w stopach i nogach, a następnie obrzękiem tułowia i wreszcie trudnościami w oddychaniu. Śmierć następowała z powodu niewydolności serca. Odkryto, że na tę chorobę zapadali szczególnie ludzie spożywający biały łuskany ryż jako główny składnik diety. Zaczęto się interesować składnikiem zawartym w łuskach ryżu. Jednym z badaczy był Casimir Funk, biochemik urodzony w Polsce, kształcony w kilku krajach europejskich. W celu prowadzenia badań związanych z chorobą beri-beri przeprowadził się w 1910 r. do Londynu. Po roku wyizolował aktywny czynnik należący do klasy chemicznej amin, który nazwał „witaminą”. Inną groźną chorobą była pelagra. U chorych na skórze części ciała narażonych na silne działanie promieni słonecznych pojawiały się trudne do wyleczenia wykwity. U wielu z nich pojawiała się też biegunka i zmiany psychiczne, jak otępienie, agresja, bezsenność oraz zaburzenia koordynacji ruchów ciała. Choroba ta charakteryzowała się wysoką śmiertelnością. Pelagra, jak sądzono, była związana ze spożywaniem mączki kukurydzianej pozbawionej niacyny (witaminy B_3), której brak powoduje chorobę skóry. Odkrywano kolejne witaminy jak witaminę D odpowiedzialną za równowagę wapnia i fosforu w organizmie, jej brak był przyczyną krzywicy – poważnego problemu u niemowląt w dużych miastach przemysłowych. Pierwsza Nagroda Nobla została przyznana w 1929 r. Chrystianowi Eijkmanowi za odkrycie witaminy B_1. W sumie jak do tej pory przyznano 17 Nagród Nobla za badania związane z odkryciem witamin oraz ich syntezą.

Witaminy są definiowane jako związki organiczne konieczne do normalnego wzrostu i rozwoju, które są niezbędne w małych ilościach w diecie, ponieważ nie mogą być syntetyzowane przez organizm człowieka. Zgodnie z charakterem chemicznym można je podzielić na dwie grupy: witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i witaminy rozpuszczalne w wodzie. Witaminy niezbędne dla metabolizmu wszystkich żywych organizmów są naturalnie syntetyzowane przez mikroorganizmy i rośliny (tab. 13.1). Brak wystarczających ilości witamin w diecie prowadzi do różnych problemów zdrowotnych, co jest szczególnie ważne w społecznościach, których dieta jest uboga. Problem ten dotyczy także zwierząt gospodarskich. Obecnie witaminy są produkowane przemysłowo i szeroko stosowane nie tylko jako dodatki do żywności i pasz, ale także jako kosmetyki i środki terapeutyczne.

Istnieją trzy sposoby dostarczania witamin do organizmu:

1. 1) stosowanie preparatów witamin syntetyzowanych chemicznie jako suplementów diety;

2. 2) spożywanie ekstraktów z roślin lub bezpośrednio roślin bogatych w witaminy;

3. 3) stosowane preparatów witamin syntetyzowanych w procesie fermentacji z zastosowaniem odpowiednich mikroorganizmów – producentów witamin – zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej i metabolicznej.

Większość preparatów witaminowych jest nadal produkowana drogą syntez chemicznych, ale liczba preparatów produkowanych mikrobiologicznie na skalę przemysłową rośnie.

Do produkcji witamin stosuje się następujące metody:

1. 1) fermentację z zastosowaniem mikroorganizmów: β-karoten (prowitamina A), kwas γ-linolowy, kwas orotowy (witamina B_13), kwas pantotenowy, prowitamina D_3, ryboflawina (witamina B_2), tiamina (witamina B_1), cyjanokobalamina (witamina B_12), witamina F (nienasycone kwasy tłuszczowe) – tabela 13.2;

2. 2) ekstrakcję: β-karoten (prowitamina A), kwas foliowy, niacyna, kwas pantotenowy, prowitamina D_3, pirydoksyna, tiamina (witamina B_2), tokoferol, witamina E, witamina F (nienasycone kwasy tłuszczowe);

3. 3) syntezę chemiczną: biotyna (witamina H), β-karoten (prowitamina A), kwas foliowy, niacyna, kwas pantotenowy, prowitamina D_3, pirydoksyna (witamina B_6), tiamina (witamina B_2), tokoferol, witamina A (retinol), witamina C (kwas askorbinowy), witamina E i witamina K_2.

4. 4) biokonwersję: tylko witamina C (kwas askorbinowy).

Tabela 13.1. Witaminy grupy B produkowane przez bakterie jelitowe i inne

Witamina

Forma aktywna

Bakterie produkujące witaminy

Lit.

B_1

pirofosforan tiaminy

Bacteroides fragilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium difficile, Fusobacterium varium, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Prevotella copri, Ruminococcus lactaris

[1] [2] [3] [4]

B_2

FAD (adeninodinukleotydowa)

FMN (mononukleotydowa)

Bacteroides fragilis, Clostridium difficile, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Prevotella copri, Ruminococcus lactaris

[1] [5] [6] [7]

B_3

kwas nikotynowy

Bacteroides fragilis, Bifidobacterium infantis, Clostridium difficile, Fusobacterium varium, Helicobacter pylori, Prevotella copri, Ruminococcus lactaris

[1] [3]

B_5

kwas pantotenowy

Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori, Prevotella copri, Ruminococcus lactaris, Ruminococcus torques, Salmonella enterica

[1]

B_6

fosforan pirydoksalu

Bacteroides fragilis, Bifidobacterium longum, Collinsella aerofaciens, Helicobacter pylori, Prevotella copri

[1] [3]

B_7

biotyna

Bacteroides fragilis, Campylobacter coli, Fusobacterium varium, Lactobacillus helveticus

[1] [8]

B_9

kwas tetrahydrofoliowy

Bacteroides fragilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Clostridium difficile, Fusobacterium varium, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Prevotella copri, Salmonella enterica, Streptococcus thermophilus

[1] [9] [10] [11] [12]

B_12

adenozylokobalamina

Bacteroides fragilis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Clostridium difficile, Faecalibacterium prausnitzii, Fusobacterium varium, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Propionibacterium freundenreichii, Ruminococcus lactaris

[1] [3] [4] [13] [14] [15] [16]

[1] Magnusdottir i wsp. 2015. Front. Genet., 6: 148. [2] Drywień i wsp. 2015. Rocz. Panstw. Zakl. Hig., 66: 373–377. [3] Deguchi i wsp. 1985. Agric. Biol. Chem., 49: 13–19. [4] Masuda i wsp. 2012. Biosci. Biotechnol. Biochem., 76: 2061–2067. [5] Levit i wsp. 2016. Benef. Microbes, 8: 65–72. [6] Juarez Del Valle i wsp. 2016. Brit. J. Nutr., 116: 1229–1235. [7] Russo i wsp. 2014. Appl. Microbiol. Biotechnol., 98: 3691–3700. [8] Shah i Patel. 2014. Intern. J. Food Ferment. Technol., 4: 79–85. [9] Rossi i wsp. 2011. Nutrients, 3: 118–134. [10] Homayouni i wsp. 2016. Dairy Sci. Technol., 96: 427–441. [11] Crittenden i wsp. 2003. Intern. J. Food Microbiol., 80: 217–222. [12] D’Aimmo i wsp. 2012. J. Appl. Microbiol., 112: 975–984. [13] Song i wsp. 2016. J. Allergy Clin. Immunol., 137: 852–860. [14] Piwowarek i wsp. 2015. Appl. Microbiol. Biotechnol., 102: 515–538. [15] Gu i wsp. 2015. Intern. J. Food Microbiol., 206: 56–59. [16] Lee i O’Sullivan. 2010. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 74: 378–416.

Tabela 13.2. Witaminy produkowane przez mikroorganizmy w procesie fermentacji na skalę przemysłową

Witamina

Mikroorganizm

Metoda

Lit.

E (α-tokoferol)

Euglena gracilis

fermentacja na podłożu z glukozą

[1]

K_2

Bacillus subtilis mutant

fermentacja na podłożu z soją

[2]

B_7 (biotyna)

Serratia marcescens mutant

fermentacja na podłożu z glukozą

[3]

B_2 (ryboflawina)

Ashbya gossypii

Bacillus subtilis

fermentacja na podłożu z glukozą

[4]

B_12

Propionibacterium shermanii, Pseudomonas denitrificans

fermentacja na podłożu z glukozą

[5]

[1] Takeyama i wsp. 1997. Biotechnol. Bioeng., 53: 185–190. [2] Sato i wsp. 2001. J. Biosci. Bioeng.,91: 16–20. [3] Gloeckler i wsp. 1990. Gene, 87: 63–70. [4] Horiuchi i Hiraga, 1999. J. Biosci. Bioeng. 87: 365–371. [5] Marwaha i wsp. 1983. Enzyme Microb. Technol., 5: 454–456.

13.2.Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

13.2.1. Witamina A i prowitamina A

W tłuszczach rozpuszczają się cztery witaminy – A, D, E i K.

Grupę witaminy A tworzą różne retinoidy, retinol, retinal, kwas retinowy i estry retinylu. Prowitamina A składa się z różnych karotenoidów, z których najważniejszy jest β-karoten, a pozostałe to α-karoten i β-kryptoksantyna. W organizmie człowieka prowitaminy te mogą być przekształcone w retinol lub kwas retinowy, które są aktywnymi formami witaminy A. Witamina A uczestniczy w takich funkcjach, jak system odpornościowy, widzenie, rozmnażanie, komunikacja komórkowa, wzrost i różnicowanie komórek. Ma też kluczowe znaczenie dla normalnego rozwoju i utrzymania pracy serca, płuc, nerek i innych narządów. Jest głównym składnikiem receptorów siatkówki odpowiedzialnych za wzrok.

Na skalę przemysłową witamina A jest produkowana głównie chemicznie, podobnie jak β-karoten. Do biotechnologicznej produkcji β-karotenu można wykorzystać halofilną zielenicę Duneliella i grzyb strzępkowy Blakeslea trispora. W optymalnych warunkach Dunaliella może gromadzić więcej niż 0,1 g/g s.m. komórek, a Blakeslea trispora – 0,2 g/g s.m. komórek. Całe komórki zielenicy lub grzyba stosuje się jako suplement do pasz. Odpowiednio zmodyfikowane genetycznie Candida utilis i Saccharomyces cerevisiae wykorzystano do produkcji karetenoidów z efektem 0,1–0,4 g/g s.m. komórek. Escherichia coli poddana bioinżynierii z wklonowaniem genów z Enterococcus faecalis i Streprococcus pneumoniae produkuje witaminę A w ilości prawie 500 mg/l.

13.2.2. Witamina D

W naturze witamina D pochodzi z rozszczepienia cholesterolu i ergosterolu przy udziale promieniowania UV. Z cholesterolu powstaje 7-dehydrocholesterol tworzący cholekalcyferol (witaminę D_3). Ergosterol może zostać przekształcony w ergokalcyferol (witaminę D_2). Obie formy D_2 i D_3 nie są aktywne i u ludzi muszą przejść dwie hydroksylacje. Formę D_2 przekształca wątroba w 25-hydroksywitaminę D (kalcydiol) a nerki przekształcają ją w 1,25-dihydroksywitaminę D (kalcytriol). Witamina D jest niezbędna w procesie wchłaniania wapnia i i mineralizacji kości. Witamina D jest syntetyzowana u większość ludzi podczas ekspozycji na światło słoneczne. Jednak nadmierne promieniowanie może być rakotwórcze, dlatego rozsądne jest wystawienie skóry na działanie światła słonecznego po pobraniu dawki dziennej witaminy D. Witamina ta występuje naturalnie głównie w tłuszczach wątroby, serze i żółtkach. Chemicznie jest syntetyzowana ze steroli, ergosterolu i cholesterolu pod działaniem promieniowania UV. Ergosterol jest wytwarzany w procesie fermentacji przez (GRAS) drożdże takie jak Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum i Candida utilis (10–30 mg/g suchej masy komórek). Ergosterol gromadzi się w komórkach grzybów takich jak Trichoderma, Cephalosporium i Fusarium. Zmodyfikowane genetycznie szczepy Saccharomyces cerevisiae są zdolne do nadprodukcji ergosterolu (52,6 mg/g suchej masy) na podłożu z melasą. Skonstruowano szczep Saccharomyces cerevisiae zdolny do wytwarzania cholesterolu zamiast ergosterolu. Obecnie trwają prace nad dwoma gatunkami drożdży Pichia pastoris i Yarrowia lipolytica produkującymi karotenoidy.

13.2.3. Witamina E

Grupę witaminy E tworzą różne cząsteczki o właściwosciach antyoksydacyjnych. Istnieje osiem form chemicznych witaminy E: cztery tokoferolu i cztery tokotrienolu. Jednak jedynie α-tokoferol spełnia wymagania organizmu człowieka. Tokoferol jest rozpuszczalnym w tłuszczach przeciwutleniaczem zaangażowanym w regulację reaktywnych form tlenu (ROS) wytwarzanych podczas utleniania tłuszczów. Aktywność α-tokoferolu zmniejsza uszkodzenia komórek powodowane przez wolne rodniki tlenu, które mogą prowadzić do rozwoju chorób układu krążenia lub raka. Witamina E pełni również funkcje w układzie odpornościowym, sygnalizacji komórkowej i regulacji ekspresji genów. Występuje naturalnie w wielu powszechnie stosowanych produktach spożywczych, a w największych ilościach w orzechach, nasionach i olejach roślinnych. Witamina ta jest obecnie stosowana jako suplement diety dla ludzi, konserwant żywności, do produkcji kosmetyków i do wzbogacania paszy dla zwierząt. Syntetyzuje się ją głównie na drodze chemicznej z izofytolu i trimetylohydrochinonu. Uznano, że Euglena gracilis jest najlepszym organizmem produkującym 7,35 mg/g suchej masy komórek, w których 97% stanowi α-tokoferol. Większość zabiegów inżynierii genetycznej i metabolicznej związanych z ulepszaniem szczepu mających na celu produkcję α-koferolu dotyczyło Synechocystis sp., niestety system produkujący witaminę E nie został przeniesiony do najlepszego producenta Euglena gracilis.

13.2.4. Witamina K

Witamina K to rodzina chemicznie powiązanych naftochinonów. Istnieją dwa rodzaje naftochinonów: filochinony produkowane przez rośliny i cyjanobakterie oraz menachinony produkowane przez bakterie. Witamina K odgrywa głównie rolę w krzepnieciu krwi, a także w utrzymaniu zdrowych kości, naczyń krwionośnych i zastawek serca, działa przeciwzapalnie i chroni układ nerwowy oraz pomaga w leczeniu torbielowatości, raka wątroby i trzustki, osteoporozy. Ponad 90% witaminy K czerpiemy z pokarmów roślinnych (zwłaszcza warzyw). Niewielkie ilości witaminy K produkują bakterie jelitowe. Za silnego producenta witaminy K wśród bakterii zostały uznane Flavobacterium sp., Bacillus subtilis i Propionibacterium freudenreichii oraz zmodyfikowana Escherichia coli.

13.3.Witaminy rozpuszczalne w wodzie

13.3.1. Witamina B_1

W wodzie rozpuszczają się witaminy z grupy B oraz witamina C.

Witamina B_1 zwana tiaminą występuje w postaci pięciu pochodnych fosforanowych: monofosforanu, difosforanu, trifosforanu, adenozyno-difosforanu i adenozyno-trifosforanu tiaminy. Pochodne fosforylowane są uważane za aktywne formy witaminy, podczas gdy sama tiamina jest głównie formą transportu. Tiamina spełnia zasadnicze funkcje metaboliczne, a jej niedobory są związane z brakiem równowagi w metabolizmie węglowodanów. Można ją znaleźć w kiełkach pszenicy, soi, suszonej fasoli i grochu. Jest powszechna w środkach spożywczych, ale gotowanie niszczy witaminę B_1. Witamina B_1 jest produkowana chemicznie przez kondensację pierścieni pirymidyny i tiazolu oraz przez konstrukcję pierścienia tiazolowego na wstępnie uformowanej części pirymidynowej. Ostatni patent opisuje akumulację dużej ilości tiaminy w podłożach hodowlanych przy użyciu zmutowanych genów deregulujących produkcję tiaminy i powodujących, że jest ona uwalniana z komórek Bacillus subtilis oraz innych gatunków należących do rodziny Bacillaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Corynebacteriaceae i Brevibacteriaceae.

13.3.2. Witamina B_2

Witamina B_2 nazywana ryboflawiną jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania wszystkich białek, ponieważ jest głównym składnikiem kofaktorów FAD i FMN. Są one zaangażowane w kluczowe reakcje utleniania i redukcji w metabolizmie energetycznym węglowodanów, tłuszczów, ciał ketonowych i białka. Witamina B_2 jest również zaangażowana w metabolizm innych witamin takich jak B_6, B_3 i A, a także w recykling glutationu i metabolizm homocysteiny. Najwięcej ryboflawiny zawierają szpinak, szparagi, zielona fasola, jogurt i mleko krowie. Na skalę przemysłową witamina B_2 jest produkowana z D-glukozy przez kilka mikroorganizmów takich jak workowce (Ashbya gossypii i Eremothecium ashbyii), drożdże (Candida flaeri i Candida famata), a także bakterie (Bacillus subtilis i Corynebacterium ammoniagenes). W genomie Bacillus subtilis dokonano kilku metabolicznych nadekspresji genów zaangażowanych w syntezę ryboflawiny, w tym ich amplifikację. Dokonywano także ekspresji heterologicznych genów zaangażowanych w akumulację ryboflawiny. Pewne modyfikacje doprowadziły do produkcji witaminy B_2 w ilości 15 g/l, ale większość strategii bioinżynierii metabolicznej przeprowadzono w głównym przemysłowym producencie witaminy Ashbya gossypii. Wszystkie sześć genów szlaku syntezy ryboflawiny zostało nadeksprymowane i wykorzystane do ulepszonej opatentowanej produkcji ryboflawiny. Te zmiany genetyczne prowadzą do wzrostu akumulacji od 1,4 do 10-krotnego w stosunku do typu dzikiego. Uzyskane szczepy są zdolne do wytwarzania witaminy B_2 w ilości 13 g/l. W ostatnich latach skierowano wysiłki bioinżynierii metabolicznej na prace ze szczepem Candida famata.

Produkcję ryboflawiny prowadzi się w hodowlach płynnych, a wszystkie czynniki takie jak szczep produkcyjny, źródło węgla, minerały oraz pH mają wpływ na wydajność produkcji. Do produkcji ryboflawiny rekomenduje się kilka szczepów Ashbya gossypii, Bacillus subtilis, Corynebacterium ammoniagenes i Lactococcus lactis (tab. 13.3 s. 380). Obecnie cała produkcja witaminy B_2 pochodzi z mikrobiologicznego wykorzystania Bacillus subtilis lub Ashbya gossypii.

13.3.3. Witamina B_3

Witamina B_3 zwana niacyną lub kwasem nikotynowym to grupa związków takich jak kwas nikotynowy, nikotynamid oraz heksanikotynian inozytolu, wykazujących pokrewne biologiczne właściwości. Bierze ona udział w metabolizmie węglowodanów, tłuszczów i białek, jest odpowiedzialna za zdrową skórę, włosy, oczy, wątrobę i układ nerwowy. Jest stosowana w terapii przeciwko wysokiemu cholesterolowi, miażdżycy i chorobie serca, cukrzycy, zwyrodnieniu stawów. Występuje w mięsie wołowym i drobiowym, wątrobie, niektórych rybach, nasionach, grzybach i drożdżach.

Nikotynamid i kwas nikotynowy są produkowane zarówno chemicznie, jak i mikrobiologicznie. Stosuje się je do wzbogacania pasz (50%) i żywności oraz w przemyśle farmaceutycznym. Chemicznie jest syntetyzowany przez utlenianie 5-etylo-2-metylopirydyny lub przez całkowitą hydrolizę 3-cyjanopirydyny. Ta ostatnia transformacja może również mieć miejsce w bioprocesie wykorzystującym nitrylazę (do produkcji kwasu nikotynowego) lub hydratazę nitrylową (do produkcji nikotynamidu). Nitrylaza ulega nadmiernej ekspresji w Rhodococcus rodochrous – szczepie zdolnym do konwersji prawie całej 3-cyjanopirydyny do kwasu nikotynowego. Hydrataza nitrylowa u Rhodococcus rodochrous przekracza 50% całkowitego białka komórkowego, umożliwiając wysoką produkcję nikotynamidu z 3-cyjanopirydyny. Obie reakcje są prawie stechiometryczne, gdy stosuje się bardzo wysokie stężenia substratu i nie ma znaczącego wytwarzania produktów ubocznych. Witamina B_3 jest również syntetyzowana z tryptofanu przez bakterie jelitowe Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Ruminococcus lactaris i Clostridium difficile (Firmicutes), Bifidobacterium infantis (Actinobacteria), Helicobacter pylori (Proteobacteria) i Fusobacterium varium (Fusobacteria).

Tabela 13.3. Produkcja ryboflawiny przez grzyby i bakterie

Mikroorganizm

Źródło węgla

Wydajność (g/l)

Lit.

grzyby

Ashbya gossypii

melasa lub olej roślinny

15,0

[1]

namok kukurydziany, osseocolla, olej sojowy

6,38

[2]

olej rzepakowy

8,70

[3]

olej sojowy

2,5

[4]

Candida famata

różne źródła węgla

20,0

[5]

Candida famata

różne źródła węgla

20,0

[6]

Pichia guilliermondii

ksylitol

14,4

[7]

bakterie

Bacillus subtilis

glukoza

15,0

[8]

Corynebacterium ammoniagenes

namok kukurydziany, glukoza

15,3

[9]

[1] Stahmann i wsp. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol., 42: 121–127. [2] Wei i wsp. 2012. Braz. J. Microbiol., 43: 441–448. [3] Park i wsp. 2007. J. Appl.Microbiol.,103: 468–476. [4] Lim i wsp. 2003. Food Technol. Biotechnol.,41:137–144. [5] Heefner i wsp. 1988. Patent WO 88/09822. [6] Stahmann i wsp. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 509–516. [7] Leathers i Gupta. 1997. Appl. Microbiol., Biotechnol., 47: 58-61. [8] Sauer i wsp. 1998. Biotechnol. Bioeng., 59: 227–238. [9] Koizumi i wsp. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 674–679.

13.3.4. Witamina B_5

Witamina B_5 (kwas pantotenowy) jest prekursorem koenzymu A (CoA), który jest niezbędnym kofaktorem w cyklu TCA i utleniania kwasów tłuszczowych. Podobnie jak witaminy B_1 i B_2 witamina B_5 bierze udział w kontroli odporności gospodarza w drodze wytwarzania energii przez komórki odpornościowe. Niedobór witaminy B_5 powoduje choroby immunologiczne, takie jak zapalenie skóry, jak również brak odporności na zmęczenie i bezsenność. Aby utrzymać poziom witaminy B_5 w czasie niedoboru, CoA jest konwertowany z powrotem do witaminy B_5. Witamina B_5 występuje w wysokich stężeniach jako CoA lub fosfopantetina w wątrobie, jajach, mięsie drobiowym i fermentowanej soi. CoA i fosfopantetina są przekształcane w wolny kwas pantotenowy przez endogenne enzymy takie jak fosfataza i panteteinaza w jelicie cienkim. Wreszcie wolny kwas pantotenowy jest konwertowany z powrotem w CoA i rozprowadzany po całym organizmie, szczególnie do wątroby i nerek. Bakteryjna witamina B_5 jest syntetyzowana z 2-dihydropantoatu i β-alaniny szlakiem syntezy de novo. Występuje jako wolny kwas pantotenowy, który jest bezpośrednio wchłaniany w jelicie grubym, przekształcany w CoA i dystrybuowany w taki sam sposób jak witamina B_5. Zdolne do syntezy witaminy B_5 są bakterie jelitowe takie jak Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Ruminococcus lactaris i Ruminococcus torques (Firmicutes), Salmonella enterica i Helicobacter pylori (Proteobacteria).

13.3.5. Witamina B_6

Witamina B_6 występuje w kilku formach, w tym jako pirydoksyna, pirydoksal i pirydoksamina. Formy te są prekursorami koenzymów fosforanu pirydoksalu (PLP) i fosforanu pirydoksaminy (PMP), które biorą udział w różnych komórkowych procesach metabolicznych, w tym aminokwasów, lipidów i węglowodanów. Niedobór witaminy B_6 jest związany z rozwojem stanu zapalnego chorób takich jak alergia i reumatoidalne zapalenie stawów, a także z dysfunkcją neuronalną. Witamina B_6 występuje w mięsie ryb i drobiu, a także w słodkich ziemniakach i awokado. Dietetyczna witamina B_6 istniejąca jako PLP lub PMP jest przekształcana w wolną witaminę B_6 przez takie endogenne enzymy jak fosfataza pirydoksalu, a następnie absorbowana przez jelito cienkie. Po wchłonięciu wolna witamina B_6 wchodzi do krwi i jest konwertowana z powrotem do PLP lub PMP.

Mikrobiologiczna witamina B_6 jest syntetyzowana jako PLP z dezoksyksylulozo-5-fosforanu i 4-fosfohydroksy-L-treoniny lub z 3-fosfoaldehydu glicerynowego i 5-fosforanu D-rybulozy. W jelicie grubym PLP pochodzenia bakteryjnego ulega konwersji w witaminę B_6, która jest wchłaniana przez transport bierny, przetransportowana do krwi i rozprowadzona po całym organizmie. Analiza metagenomiczna wykazała, że do biosyntezy witaminy B_6 są zdolne Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Bifidobacterium longum i Collinsella aerofaciens (Actinobacteria) i Helicobacter pylori (Proteobacteria). Prawdopodobnie Bacteroidetes i Proteobacteria produkują witaminę B_6 z 5-fosforanu-deoksyksylulozy i 4-fosfohydroksy-L-treoniny, podczas gdy prawdopodobnie Actinobacteria z 3-fosfo-aldehydu glicerynowego i D-rybulozo-5-fosforanu.

13.3.6. Witamina B_7

Witamina B_7 zwana biotyną jest kofaktorem kilku karboksylaz niezbędnych do metabolizmu glukozy, aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Na przykład jest niezbędnym kofaktorem karboksylazy acetylo-CoA i syntazy kwasów tłuszczowych, które są enzymami zaangażowanymi w biosyntezę kwasów tłuszczowych. Tak więc witamina B_7 prawdopodobnie wpływa na immunometabolizm oraz działa przeciwzapalnie przez hamowanie ekspresji genów kodujących cytokininy prozapalne w sygnalizacji NF-kB. Niedobór witaminy B_7 w diecie wywołuje reakcje zapalne przez zwiększone wydzielanie pozapalnych cytokin. Witamina B_7 występuje obficie w takich produktach jak orzechy, fasola i nasiona oleiste, ale surowe białko jaja kurzego zawiera dużą ilość awidyny, która silnie wiąże się z witaminą B_7 i uniemożliwia jej wchłanianie w jelitach. Dlatego nadmierne spożywanie surowego białka jaja kurzego może również być przyczyną niedoboru witaminy B_7. Biotyna dietetyczna istnieje jako wolna postać związana z białkiem lub jako biocytina. W jelicie cienkim biotynidaza uwalnia z białka wolną biotynę, która jest absorbowana przez transporter biotyny SMVT.

Witamina B_7 jest wytwarzana przez bakterie jelitowe jako wolna biotyna syntetyzowana z malonylo-CoA lub z pimelinianu przez pimelilo-CoA. Bakteryjna wolna biotyna jest wchłaniana przez SMVT w okrężnicy. Metagenomiczna analiza wykazała, że Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Fusobacterium varium (Fusobacteria) i Campylobacter coli (Proteobacteria) posiadają szlak syntezy witaminy B_7. Tak więc wolna biotyna może wpływać na skład flory jelitowej, ponieważ jest niezbędna do jej wzrostu i utrzymania żywotności. Niedobór biotyny prowadzi do dysbiozy jelit i nadmiernego wzrostu Lactobacillus murinus. Ponadto wydaje się, że produkcja witaminy B_7 postępuje w sposób kooperacyjny wśród różnych bakterii jelitowych: Bifidobacterium longum wytwarza w jelicie pimelinian, który jest prekursorem witaminy B_7 zwiększającym produkcję witaminy B_7 przez inne bakterie jelitowe.

Szlak biosyntezy biotyny

Szlak biosyntezy biotyny opracowano wraz z enzymami u kilku szczepów Escherichia coli, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis i Sphingomonas sp. Duży wkład w poznanie szlaku metabolicznego syntezy biotyny z pimelilo-CoA miał pierwotnie opisany szlak dla Escherichia coli. Szlak syntezy biotyny przechodzi przez trzy półprodukty: kwas 7-keto-8-aminopelargonowy (KAPA), kwas 7,8-diaminopelargonowy(DAPA) i detiobiotynę (DTB). Te półprodukty są indywidualnie lub łącznie określane jako witamery. Szlak biosyntezy biotyny przedstawiono na rysunku 13.1.

Rys. 13.1. Szlak biosyntezy biotyny

Głównym problemem w syntezie biotyny jest represja na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez biotynę wszystkich enzymów syntetyzujących ją. Z badań nad szczepami syntetyzującymi biotynę wynika, że Bacillus sphaericus w przeciwieństwie do Escherichia coli może wydzielać do podłoża znaczne ilości syntetycznej biotyny oraz prekursora kwasu pimelinowego. Tak więc przeniesiono geny odpowiedzialne za syntezę biotyny (bio) z Bacillus sphaericus do Escherichia coli, ponieważ Bacillus sphaericus nie jest zdolny do metabolizowania glukozy jako źródła węgla, a wykorzystuje bardziej złożone związki organiczne. Konstrukt Escherichia coli C268 o genotypie bioA poddano działaniu różnych warunków fizykochemicznych mających wpływ na wydajność produkcji biotyny i witamerów. Badano takie parametry jak wielkość bioreaktora, typ hodowli, etap inokulacji, pH, temperatura, rozpuszczony tlen, zmienność składników pokarmowych i dodanie prekursora. Największą wydajność produkcji biotyny uzyskano w 20-litrowym fermentorze z glicerolem jako źródłem węgla, z dodatkiem hydrolizatu kazeiny w temp. 37°C w podłożu płynnym o pH 7,0. Dodawany do podłoża prekursor – kwas pimelinowy – w stężeniu 300 mg/l nie powodował zahamowania syntezy biotyny. Wyższe stężenia kwasu pimelinowego powodują powstawanie większej liczby witamerów, ale nie dodatkowej ilości biotyny. Po fermentacji na podłożu płynnym (hodowla okresowa) przy ilości biomasy komórek 18–50 g/l uzyskiwano biotynę w ilości 30–45 mg/l. Inna modyfikacja genetyczna Escherichia coli umożliwiała produkcję biotyny w ilości 110 mg/l w podłożu zawierającym kwas diaminononanowym jako prekursor. Z innych badań wynika, że Sphingomonas sp. pSP304 w optymalnych warunkach produkuje 66 mg/l biotyny na podłożu płynnym z glicerolem jako źródłem węgla.

13.3.7. Witamina B_9

Witamina B_9 – kwas foliowy – w formie aktywnej jako tetrahydrofolian jest kofaktorem kilku reakcji metabolicznych, w tym syntezy DNA i aminokwasów. Wysokie zapotrzebowanie na witaminę B_9 przez krwinki czerwone powoduje, że jej niedobór prowadzi do niedokrwistości megaloblastycznej. Niedobór witaminy B_9 hamuje również proliferację ludzkich komórek T CD8+ in vitro przez zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie S i zwiększenie częstotliwość uszkodzeń DNA. Ponadto witamina B_9 przyczynia się do utrzymania homeostazy immunologicznej. Bogatym źródłem witaminy B_9 są wątroba wołowa, zielone warzywa liściaste i szparagi. Bakterie jelitowe syntetyzują witaminę B_9 jako THF z GTP, fosfoenolopirogronianu i erytrozo-4-fosforanu. Bakteryjne THF jest bezpośrednio absorbowane w okrężnicy i rozprowadzane przez krew na cały organizm. Metagenomiczna analiza wykazała, że do syntezy kwasu foliowego są zdolne bakterie jelitowe Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Clostridium difficile, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus (Firmicutes), niektóre gatunki Bifidobacterium adolescentis i Bifidobacterium pseudocatenulatum (Actinobacteria), Fusobacterium varium (Fusobacteria) oraz Salmonella enterica (Proteobacteria).

13.3.8. Witamina B_12

Witamina B_12 (kobalamina) jest jedną z najciekawszych i najbardziej fascynujących cząsteczek w świecie nauki i medycyny. Została odkryta jako czynnik przeciw niedokrwistości złośliwej na początku lat 20. XX w. przez dwoje amerykańskich lekarzy Minota i Murphy’ego. Leczy ona niedokrwistość złośliwą, zaburzenie opisane po raz pierwszy w 1835 r. leczone dietą zawierającą surową wątrobę. Witamina B_12 jest wymagana w ilościach śladowych (w przybliżeniu 1 mg/dzień), aby wspomóc akcję tylko dwóch enzymów – syntazy metioniny i (R)–mutazy metylomalonylo-CoA. W 1934 r. przyznano Nagrodę Nobla Minotowi, Murphy’emu i Whipple’owi za badania dotyczące zastosowania terapii wątrobowej w przypadkach anemii złośliwej. Identyfikacja czynnika wątrobowego nie udawała się przez następne 20 lat do czasu badań przeprowadzonych przez dwie przodujące kompanie farmaceutyczne: Mercka w USA (badania prowadzone przez Folkersa) oraz Glaxo w Wielkiej Brytanii (badania prowadzone przez Smith’a). Obie firmy jednocześnie wyizolowały z wątroby czerwony, krystaliczny związek chemiczny, który był w stanie leczyć anemię złośliwą. Nazwano go witaminą B_12. Ostatnio poznano krystaliczną strukturę syntazy metioniny i mutazy metylomalonowej CoA, w skład których wchodzi witamina B_12. Syntezy witaminy B_12 dokonali Woodward i Eschenmoser w latach 60. i 70. XX w. (z 11-letnią przerwą) przy udziale wielu innych naukowców. Chemiczna ścieżka syntezy kobalaminy u Pseudomonas denitrificans została przedstawiona w 1993 r. Zwierzęta (oraz ludzie) i pierwotniaki nie są w stanie wytwarzać kobalaminy, a potrzebują jej do funkcjonowania. Rośliny i grzyby także nie są zdolne do syntezy kobalaminy. W przyrodzie witaminę tę syntetyzują de novo prokariotyczne mikroorganizmy (bakterie i archeony), a w każdej tkance zwierzęcej jest ona obecna w postaci adenozyno- lub metylokobalaminy (w wątrobie w ilości 1 ppm).

Termin witamina B_12 jest szeroko stosowany do nazywania związków grupy kobalaminy. Naturalne formy to adenozylokobalamina, metylokobalamina i hydroksykobalamina. Cyjanokobalamina, z definicji witamina B_12, jest produkowana przemysłowo jako stabilna forma kobalaminy, która nie występuje w naturze. Witaminę B_12 otrzymuje się wyłącznie w procesie fermentacji. Jest produkowana przez liczne firmy farmaceutyczne na całym świecie. Merck rozpoczął jej produkcję z zastosowaniem Pseudomonas denitrificans w 1952 r. i poprawił wydajność kultury ponad 30-krotnie w stosunku do wydajności pierwotnych izolatów gleby przez różne manipulacje genetyczne. W ostatnich dwóch – trzech – dekadach wykorzystano kilka mikroorganizmów do wydajnej produkcji witaminy B_12. Kobalaminą jest zwana witamina zawierająca w cząsteczce kobalt, która w aktywnych formach jako metylokobalamina i adenozylokobalamina katalizuje syntezę metioniny. Razem z witaminami B_6 i B_9 witamina B_12 odgrywa ważna rolę w tworzeniu czerwonych krwinek i syntezie kwasów nukleinowych, zwłaszcza w neuronach. Niedobór witaminy B_12 wywołuje niedokrwistość megaloblastyczną oraz objawy ze strony układu nerwowego jak drętwienie nóg i stóp. Niedobór witaminy B_12 zmniejsza liczebność komórek T CD8+ i tłumi aktywność bójczą komórek T u myszy. Podanie metylokobalaminy poprawia stan myszy, co może świadczyć o tym, że witamina B_12 poprawia odpowiedź immunologiczną komórek T CD8+ i aktywność bójczą komórek T. Witamina B_12 nie jest syntetyzowana przez rośliny wyższe, brak jej w warzywach i owocach, ale występuje w dużych ilościach w wątrobie wołowej, mięsie kurcząt oraz w jajach, małżach i rybach. W preparatach jest w postaci związanej z białkiem, a uwalnia się w postaci wolnej witaminy B_12 po strawieniu przez pepsynę w żołądku. Wolna witamina B_12 jest wchłaniana przez nabłonkowe komórki jelita cienkiego z udziałem czynnika wewnętrznego (IF), glikoproteiny. Wewnątrz komórek nabłonkowych kompleks IF-witamina B_12 jest rozkładany przez lizosom do wolnej witaminy B_12, która następnie jest uwalniana do krwi, gdzie jest przekształcana w formę aktywną i rozprowadzana po całym organizmie. Bakteryjna witamina B_12 jest syntetyzowana z prekoryny-2 do adenozylokobalaminy, która jest wchłaniana bezpośrednio przez jelito grube i rozprowadzana po całym organizmie. Analiza metagenomiczna wskazuje, że szlaki metaboliczne syntezy witaminy B_12 posiadają Bacteroides fragilis i Prevotella copri (Bacteroidetes), Clostridium difficile, Faecalibacterium prausnitzii i Ruminococcus lactaris (Firmicutes), Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium infantis i Bifidobacterium longum (Actinobacteria), Fusobacterium varium (Fusobacteria). Naturalnymi producentami cyjanokobalaminy są mikroorganizmy występujące w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, a także w glebie, nawozach naturalnych i ściekach komunalnych. Do efektywnej biosyntezy witaminy B_12 są zdolne bakterie z rodzajów: Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Serratia, Streptomyces oraz Xanthomonas. Ze względu na naturalnie wysoką zdolność wytwarzania witaminy B_12 oraz szybki wzrost w przemysłowej produkcji stosuje się głównie bakterie należące do gatunków Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium shermanii oraz Pseudomonas denitrificans.

Kluczem powodzenia fermentacji witaminy B_12 jest uniknięcie zwrotnej represji. Istotne znaczenie ma dodanie betainy do hodowli P. denitrificans. Nadprodukcja witaminy B_12 jest całkowicie zależna od betainy, ale zależy także od mechanizmu kontroli, który jest nieznany. Propionibacterium freundenreichii może produkować witaminę B_12 w ilości 206 mg/l, ale nie jest wykorzystywany do produkcji na skalę przemysłową. Pseudomonas denitrificans wytwarza witaminę B_12 w ilości 300 mg/l.

Cząsteczka cyjanokobalaminy (C_88H_88O_14N_14PCo) składa się z czterech sprzężonych pierścieni pirolowych (A-D) połączonych wiązaniami w pozycji α, tworzących pierścień makrocykliczny. Trzy spośród tych wiązań łączą trzy pierścienie pirolowe przez mostek metionowy. Pierwszy pierścień z czwartym (A i D) jest sprzężony bezpośrednio przez wiązanie Cα–Cα. Układ ten łączy się z centralnie umiejscowionym atomem kobaltu znajdującym się na trzecim stopniu utlenienia. Nad układem makrocyklicznym znajduje się prostopadle ułożona grupa cyjanowa, a pod nim, 5,6-dimetylobenzimidazolyl (5,6-dimetylobenzimidazolo-rybozolo-3’-fosforan). Oba te ligandy są skoordynowane z atomem kobaltu (rys. 13.2).

Specyficzna syntetaza witaminy B_12 konwertuje witaminę B_12(Co+2) do witaminy B_12(Co+), która tworzy koenzymy różnych enzymów katalizujących rozszczepienie wiązań C–C, C–O i C–N i przenosi grupę metylową. U ludzi witamina B_12 jest wymagana w małych ilościach (prawdopodobnie 1 µg/doba) i uczestniczy w akcji dwóch istotnych enzymów: syntazy metioninowej i mutazy (R)-metylomalonylo-CoA.

Produktywność witaminy B_12 z zastosowaniem Propionibacterium freudenreichii, została zwiększona przez dokonanie ekspresji genów należących do rodzin hem, cob i cbi biorących udział w procesie biosyntezy kobalaminy. Rekombinowany konstrukt Propionibacterium freudenreichii zawierający wektor ekspresyjny pPK705 z insertem cobA, cbiLF lub cbiEGH produkował prawie dwukrotnie więcej witaminy B_12 niż Propionobacterium freundenreichii przed zmianami genetycznymi. W przeciwieństwie do Propionibacterium, proces biosyntezy witaminy B_12 przez Pseudomonas denitrificans odbywa się całkowicie w warunkach tlenowych. W wyniku połączenia zabiegów mutagenizacji z jednoczesnym zastosowaniem narzędzi inżynierii genetycznej, grupa naukowców z firmy Rhône–Poulenc Rorer (RPR) skonstruowała wysoce efektywny szczep Pseudomonas denitrificans, za pomocą którego jest możliwa produkcja witaminy B_12 na poziomie 300 mg/l. Grupa RPR opisuje amplifikację 8 genów operonu cobF-cobM, w wyniku której zanotowano 30-procentowy wzrost produkcji kobalaminy. Dodatkowo wzrost liczby kopii genu cobA i cobE powoduje zwiększenie wydajności witaminy B_12 o kolejne 20%. Wykorzystanie genetycznie modyfikowanych mutantów Pseudomonas denitrificans umożliwiło naukowcom z RPR opracować proces efektywnej produkcji witaminy B_12 pokrywający 80% światowego zapotrzebowania. W tabeli 13.4 przedstawiono przykłady bakterii produkujących witaminę B_12.

Rys. 13.2. Chemiczna struktura podstawowej formy witaminy B_12 (kobalaminy): R = –CN (cyjano-kobalamina), R = –OH (hydroksykobalamina), R = –CH_3 (metylokobalamina)

Biosynteza witaminy B12 de novo

W biosyntezę witaminy B_12 de novo zaangażowanych jest ponad 30 genów, które są obecne u 1/3 zsekwencjonowanych genomów bakterii. Znane są dwa odmienne szlaki biosyntezy kobalaminy wśród bakterii:

1. 1) synteza tlenowa charakterystyczna dla Pseudomonas denitrificans, w którym aktywacji ulegają geny cob;

2. 2) synteza beztlenowa charakterystyczna dla Bacillus megaterium, Propionibacterium shermanii i Salmonella enterica serovar typhimurium, w których ekspresji ulegają geny cbi.

Tabela 13.4. Przykłady mikroorganizmów produkujących witaminę B_12

Mikroorganizm

Warunki hodowli

Wydajność (mg/l)

Lit.

Propionibacterium freundenreichii

glukoza, 5,6-dimetylo-benzymidazol, warunki beztlenowe

206

[1]

Propionibacterium shermanii

glukoza, 5,6-dimetylo-benzymidazol

60

[1]

Rhodopseudomonas protamicus

glukoza, 5,6-dimetylo-benzymidazol

135

[1]

Pseudomonas denitrificans

sacharoza, betaina, warunki beztlenowe

60

[1]

Escherichia coli konstrukt

podłoże płynne LB

307

[2]

Butyribacterium

methylotrophicum

pepton

92,5

[3]

Propionibacterium shermanii

glukoza

52

[3]

Propionibacterium freundenreichii

pepton z dodatkiem hydrolizatów

kazeiny

19

[4]

Pseudomonas denitrificans

glukoza, betaina,

177,49

[5]

Pseudomonas denitrificans

podłoże PS4

300

[6]

Propionibacterium shermanii

glukoza, 5,6-dimetylo-benzymidazol

206

[7]

Pseudomonas denitrificans

melasa, namok kukurydziany, betaina, sacharoza

214

[8]

[1] Survase i wsp. 2006. Food Technol. Biotechnol., 44: 381–396. [2] Fang i wsp. 2018. Nature Communications,9, Article number: 4917. [3] Hatanaka i wsp. 1998. Appl. Microbiol. Biotechnol., 27: 470–473. [4] Miyano i wsp. 2000. J. Biochem Eng., 6: 207–214. [5] Li i wsp. 2008. Biores. Technol., 99: 8516–8520. [6] Blanche i wsp. 1995. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34: 383–411. [7] Sych i wsp. 2016. Vitamin B_12 physiology, production and application. [w:] Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants. Wiley-VCH Verlag s. 129–159. [8] Li i wsp. 2008. Bioprocess Biosyst. Eng., 31: 605–610. [9] Cai i wsp. 2018. BMC Biotechnol., 18: 27.

Adenozylokobalamina jest syntetyzowana z uroporfirynogenu III. Ten niesymetryczny makrocykliczny izomer powstaje z ośmiu cząsteczek kwasu 5-amino-lewulionowego przy udziale trzech enzymów: dehydratazy kwasu 5-aminolewulinowego (HemB), deaminazy porfobilinogenu (HemC) oraz syntazy uroporfirynogenu III (HemD). W pierwszym etapie procesu rozpoczyna się dimeryzacją cząsteczek kwasu 5-aminolewulinowego, czego efektem jest powstanie monopirolu, porfobilinogenu (PBG). W wyniku polimeryzacji czterech cząsteczek PBG powstaje liniowa postać tetrapirolu, preuroporfirynogen (hydroksymetylobilan), który następnie ulega inwersji i cyklizacji, w wyniku czego powstaje aktywny fizjologicznie uroporfirynogen III – prekursor układu korynowego. W wyniku działania metylotransferazy uroporfirynogenu III, związek ten ulega metyzacji w pozycji C-2 i C-7, tworząc „prototyp” pierścienia korynowego. Od tego momentu biosynteza witaminy B_12 w warunkach tlenowych oraz beztlenowych jest odmienna. W warunkach tlenowych przy udziale Pseudomonas denitrificans pierścień ten ulega metyzacji w pozycji C-20. Szlak beztlenowy z udziałem szczepów z rodzaju Propionibacterium rozpoczyna się od włączenia do pierścienia jonów kobaltu. W obecności tlenu wytworzenie tego chelatu następuje dopiero po kolejnych dziewięciu reakcjach. Istnieją dwa rodzaje chelataz. Chelataza kobaltu zależna od tlenu ulega aktywacji przy udziale ATP, chelataza kobaltu działająca w warunkach beztlenowych nie wymaga aktywacji przy udziale ATP. Kolejnym etapem biosyntezy witaminy B_12 jest kontrakcja pierścienia korynowego związana z usunięciem węgla C-20. W warunkach tlenowych atom węgla C-20, zostaje utleniony przez tlen cząsteczkowy i wydalony w postaci octanu. W warunkach beztlenowych usunięcie węgla C-20 z pierścienia jest możliwe dzięki obecności w centrum struktury jonu kobaltu zdolnego do przyjęcia różnych stopni utlenienia. Uczestniczy on w procesie oksydacji węgla i wydzielenia w postaci aldehydu octowego. Efektem kontrakcji pierścienia korynowego, zarówno w szlaku tlenowym, jak i beztlenowym jest konwersja do kobinamidu przez związanie aminopropanolu z resztą kwasu propionowego, znajdującą się przy łańcuchu bocznym pierścienia D. Powstanie nukleotydu znajdującego się pod pierścieniem makrocyklicznym następuje przez przeniesienie reszty fosforybozylowej mononukleotydu kwasu nikotynowego na cząsteczkę 5,6-dimetylobenzimidazolu. Powstały w wyniku tych przemian α-rybazol zostaje kowalentnie związany z aktywowanym przez guanozynodifosforan (GDP) adenozylokobinamidem, w następstwie czego uwalnia się guanozynomonofosforan (GMP). Efektem wszystkich tych przemian jest powstanie kompletnej formy adenozylokobalaminy (koenzymu B_12). Uproszczony schemat syntezy witaminy B_12 przedstawiono na rysunku 13.3.

Rys. 13.3. Schemat biosyntezy witaminy B_12

Fermentacja przy użyciu Propionibacterium freudenreichii

Propionibacterium freudenreichii (ATCC6207) i Propionibacterium shermanii (ATCC13673) oraz niektóre mutanty są stosowane do produkcji witaminy B_12 w dwuetapowym procesie fermentacji okresowej, celem nadprodukcji witaminy. Pierwszym etapem jest proces beztlenowy trwający 2–4 dni, w czasie których 5-deoksyadenozylokobinamid gromadzi się jako prekursor witaminy B_12, witamina B_12 nie jest syntetyzowana. Drugi etap – tlenowy – trwa 3–4 dni, w czasie których zachodzi synteza 5,6-dimetylobenzimidazolu lub jest on dodawany do podłoża hodowlanego, które w końcu łączy się z 5-deoksyadenozylokobinamidem, wytwarzając witaminę B_12 (5-deoksyadenozylokobalaminę). Pożywka fermentacyjna jest wzbogacana w kobalt (10–100 mg/l). Alternatywnie do fermentacji okresowej, dwa etapy fermentacji witaminy B_12 mogą być przeprowadzone w sposób ciągły w dwóch fermentorach kaskadowo.

Fermentacja przy użyciu Pseudomonas denitrificans

Pseudomonas denitrificans jest najbardziej produktywnym gatunkiem spośród dotychczas zgłoszonych produkujących witaminę B_12. Płynne podłoże fermentacyjne do produkcji witaminy B_12 zawiera 10% melasy buraczanej, 0,2% ekstraktu drożdżowego, 0,5% (NH_4)2HPO_4; 0,3% MgSO_4 · 7H_2O; 0,02% MnSO_4 · H_2O; 0,0188% Co(NO)3 · 6H_2O; 0,0025% 5,6-dimetylobenzimidazolu, 0,002% ZnSO_4 · 7H_2O; 0,0005% Na_2MO_4 · 2H_2O. Fermentację przeprowadza się w środowisku o pH 7,4, przy prędkości 420 obr./min, napowietrzaniu 1 vvm, w temp. 29°C przez 90 godz. (Merck i Co, Inc., 1971). Wydajność produkcji witamin B_12 wynosi do 60 mg/l. Większość kobalaminy syntetyzowanej przez mikroorganizm jest wydzielana do podłoża, ale 20% pozostaje związana z komórkami. Podłoże pofermentacyjne ogrzewa się przez 10–30 min w temp. 80–120°C przy pH 6,5–8,5 w celu ekstrakcji całej witaminy B_12. Ogrzewane podłoże traktuje się cyjankiem lub tiocyjanianem w celu wytworzenia cyjanokobalaminy, którą następnie wydziela się na wymieniaczu kationowym (Amberlite IRC 50). Inną metodą jest ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym (fenolem lub krezolem lub w mieszaninie z benzenem, butanolem, tetrachlorkiem węgla czy chloroformem) lub wytrącanie przez odparowanie albo krystalizację witaminy B_12 w takich rozpuszczalnikach jak krezol lub tanina. Łącznie 98% witaminy B_12 jest odzyskiwana z płynu pofermentacyjnego. Witaminę B_12 o czystości 80% stosuje się jako dodatek do paszy, wysokiej czystości preparaty są stosowane w preparatach farmaceutycznych.

13.4.Kwas askorbinowy

Historia odkrycia witaminy C wiąże się ściśle ze szkorbutem, poszukiwaniem przyczyn tej choroby, sposobu jej leczenia i zapobiegania. Pierwsze objawy szkorbutu zostały opisane w egipskich papirusach w czasach starożytnych. Już w średniowieczu łączono wpływ sposobu odżywiania na pojawianie się symptomów szkorbutu. Najostrzejszy przebieg choroba ta miała na terenach Europy Północnej, gdzie przez większość roku był znikomy dostęp do świeżych warzyw i owoców. Szkorbut dotykał również marynarzy i innych członków załóg odbywających dalekomorskie podróże, którzy pozbawieni byli przez dłuższy czas dostępu do świeżych produktów roślinnych. Witamina C jest ważnym metabolitem dla większości organizmów żywych. Kwas askorbinowy ma silne właściwości redukujące, ponieważ ugrupowanie między C-2 i C-3 (w miejscu, gdzie są dwie grupy OH przy wiązaniu podwójnym), zwane endiolowym, łatwo oddaje po dwa protony i elektrony, przechodząc w ugrupowanie diketonowe kwasu dehydroaskorbinowego. Obecność tego ugrupowania warunkuje silne właściwości redukcyjne i kwasowy charakter kwasu L-askorbinowego. Kwas L-askorbinowy dzięki swoim właściwościom redukującym może w organizmie przekształcać się w kwas L-dehydroaskorbinowy. Obie formy – zredukowana i utleniona – to cząsteczki biologicznie czynne, mające taką samą aktywność witaminową. U ludzi pełni ona konieczne funkcje fizjologiczne, a zatem jest niezbędnym składnikiem odżywczym. Najważniejszą funkcją kwasu askorbinowego jest ochrona tkanek przed szkodliwym utlenianiem. Kwas L-askorbinowy znajduje zastosowanie głównie w przemyśle spożywczym, gdyż jest witaminą, a także przeciwutleniaczem. W przybliżeniu 50% syntetycznego kwasu askorbinowego stosuje się jako suplementy witamin i preparaty farmaceutyczne. Jego właściwości przeciwutleniające i potencjał do stymulowania produkcji kolagenu są wykorzystywane w kosmetykach.

Rys. 13.4. Reakcja utleniania i redukcji kwasu askorbinowego

Kwas askorbinowy jest pochodną sacharydów, powstaje z D-glukozy lub D-galaktozy. Kwas L-askorbinowy o wzorze sumarycznym C_6H_8O_6 jest γ-laktonem kwasu 2,3-dehydro-L-gulonowego (rys. 13.4). W centrum cząsteczki znajduje się pięcioczłonowy pierścień γ-laktonowy, który stabilizuje strukturę. Jego rozerwanie prowadzi do oksydatywnego rozpadu kwasu L-askorbinowego na dwa związki – kwas szczawiowy (dwuwęglowy) i kwas L-treonowy (czterowęglowy). Witamina C została wyodrębniona po raz pierwszy z papryki przez węgierskiego biochemika Alberta Szenta-Gorgyiego w 1928 r., za co został uhonorowany Nagrodą Nobla. Organizm człowieka nie ma szlaków metabolicznych prowadzących do syntezy tej witaminy, w związku z czym musi być ona dostarczana na bieżąco z pożywieniem.

Obecnie większość produkowanego komercyjnie kwasu L-askorbinowego jest syntetyzowana w procesie Tadeusza Reichsteina, szwajcarskiego uczonego polskiego pochodzenia, przy użyciu D-glukozy jako materiału wyjściowego. Proces Reichsteina obejmuje sześć etapów chemicznych i jeden etap fermentacji utleniania D-sorbitolu do L-sorbozy. Całkowita wydajność kwasu L-askorbinowego z D-glukozy uzyskana w procesie Reichsteina wynosi ok. 50%. Jest to proces bardzo energochłonny, ponieważ wymaga wysokiej temperatury i/lub ciśnienia w kolejnych etapach syntezy. Ponadto większość procesów chemicznych wymaga znacznej ilości rozpuszczalników organicznych i nieorganicznych oraz odczynników takich jak aceton, kwas siarkowy i wodorotlenek sodu. Czynniki ekonomiczne oraz ochrona środowiska spowodowały zainteresowanie wykorzystaniem mikroorganizmów do produkcji kwasu L-askorbinowego. Najnowsze innowacje w procesach fermentacji i postępy w biochemii i technologii rekombinacji DNA poszerzają dostępne opcje wykorzystania mikroorganizmów w produkcji kwasu L-askorbinowego.

13.4.1. Szlaki syntezy kwasu askorbinowego

Opisano kilka dróg biosyntezy kwasu askorbinowego lub jego prekursora 2-KLG (kwasu 2-keto-L-gulonowego), takich jak

1. 1) szlak L-sorbozy,

2. 2) szlak D-sorbitolu,

3. 3) szlak 2-keto-D-glukonowy,

4. 4) szlak kwasu 2,5-diketo-D-glukonowego,

5. 5) szlak D-glukonowy,

ale jedynie dwa procesy proekologiczne są stosowane w sposób profesjonalny – proces Reichsteina i dwustopniowy proces syntezy kwasu askorbinowego.

Proces syntezy Reichsteina

W latach 30. ubiegłego wieku wdrożono nowy proces syntezy kwasu askorbinowego zwany procesem Reichsteina. W tym procesie materiałem wyjściowym jest D-glukoza, którą przekształca się w D-sorbitol przez katalityczne uwodornienie. D-sorbitol przekształca się w L-sorbozę przy użyciu szczepu bakteryjnego Gluconobacter sp. (wcześniej nazwanego Acetobacter suboxydans). L-sorboza jest utleniana do 2-KLG w kilku etapach chemicznych. Na koniec 2-KLG przekształca się w kwas askorbinowy w procesie laktonizacji. W procesie Reichsteina konwersja D-sorbitolu do L-sorbozy jest jedynym etapem konwersji biologicznej z użyciem mikroorganizmu, który odgrywa ważną rolę w ekonomicznej syntezie kwasu askorbinowego. Obecnie na skalę przemysłową D-sorbitol jest utleniany do L-sorbozy przez Gluconobacter oxydans z prawie 100-procentowym stopniem konwersji (rys. 13.5).

Rys. 13.5. Kolejne etapy syntezy kwasu askorbinowego w reakcjach Reichsteina

Dwustopniowy proces syntezy kwasu askorbinowego

Opracowano metodę syntezy kwasu askorbinowego z udziałem dwóch szczepów bakteryjnych z rodzaju Bacillus i Gluconobacter. W tym procesie fermentacja odbywa się w dwóch etapach – w pierwszym etapie następuje fermentacyjna konwersja D-sorbitolu do L-sorbozy z udziałem Gluconobacter oxydans, a w drugim – fermentacja 2-KLG przy udziale dwóch szczepów bakterii Ketogulonicigenium vulgare i Bacillus sp. (Bacillus megaterium, Bacillus cereus lub Bacillus thuringensis). Największa różnica między tymi dwoma procesami polega na tym, że 2-KLG jest wytwarzany w dwustopniowym procesie fermentacji zamiast konwersji chemicznej w procesie Reichsteina. Współczynnik konwersji L-sorbozy do 2-KLG wynosi 90–92%. Dwustopniowy proces fermentacji kwasu askorbinowego można w pewnym sensie uznać za ulepszony proces Reichsteina.

Przemysłowa produkcja kwasu askorbinowego

Obecnie w nowej technologii uwodornienia D-glukozy stosowanej przez producentów uzyskuje się produkt D-sorbitol o stężeniu 50–80%. Roztwór glukozy oraz wodór wstrzykuje się do reaktora kolumnowego zawierającego stały katalizator. Katalizator znajduje się w stanie stacjonarnym w reaktorze, bez mieszania i wstrząsania. Roztwór glukozy i wodór stale przechodzą przez powierzchnię katalizatora, reagując całkowicie z wytworzeniem D-sorbitolu.

Dominuje proces fermentacji dwustopniowej (rys. 13.6). Pierwszy etap to konwersja D-sorbitolu do L-sorbozy. Liczne szczepy wykazują zdolność do przekształcania D-sorbitolu w L-sorbozę, np. Gluconobacter suboxydans, Acetobacter suboxydans i Gluconobacter oxydans, które należą do rodziny Acetobacteraceae. W tym procesie fermentacja pierwszego etapu prowadzona przez Gluconobacter oxydans trwa ok. 24 godz., a podłoże fermentacyjne zawiera wysokie stężenie L-sorbozy (25–28%), przy wydajności fermentacji okresowej wynoszącej 12–13 g/(l · godz.). Fermentację prowadzi się w temp. 32°C przy naturalnym pH i szybkości transferu tlenu 300–500 mmol/(l · godz.) w fermentorze z zainstalowanym wyciągiem powietrza.

Rys. 13.6. Dwustopniowa fermentacja kwasu askorbinowego

Drugi etap fermentacji to konwersja kwasu L-sorbozowego w kwas 2-keto-L-gulonowy. Stymulowanie wzrostu i wytwarzanie 2-KLG odbywa się z udziałem dwóch szczepów – Ketogulonicigenium vulgare i szczepu towarzyszącego. W ciągu ostatnich 30 lat izolowano wiele szczepów i stosowano jako szczepy towarzyszące, np. Pseudomonas striata, Bacillus megaterium, Bacillus thuringensis, Bacillus cereus i Xanthomonas maltophilia. Wszystkie szczepy tworzące zarodniki hodowane w optymalnych warunkach mogą być szczepami towarzyszącymi. Obecnie Bacillus megaterium i Bacillus cereus wydają się być preferowanymi szczepami towarzyszącymi. Ketogulonicigenium vulgare zawiera kompletny system enzymów potrzebnych do konwersji L-sorbozy do 2-KLG, ale jego wzrost jest bardzo słaby, gdy jest hodowany sam, dlatego system współhodowli z dwoma szczepami Ketogulonicigenium vulgare i szczepem towarzyszącym jest konieczny do skutecznej produkcji 2-KLG. Ketogulonicigenium vulgare jest Gram-ujemnym, fakultatywnym beztlenowym, chemoheterotroficznym mikroorganizmem glebowym o optymalnym zakresie temperatur 27–31°C i pH 7,2–8,5. Dehydrogenaza L-sorbozy/L-sorbozonu (SSDH) i dehydrogenaza L-sorbozonu (SNDH) są głównymi enzymami katalizującymi utlenianie L-sorbozy do 2-KLG. W przeciwieństwie do pierwszego etapu, mieszana hodowla dwóch szczepów trwa znacznie dłużej (40–70 godz.) i osiąga niską wydajność oraz współczynnik konwersji. Dlatego większość wysiłków na rzecz poprawy wydajności fermentacji skupia się głównie na drugim etapie fermentacji kwasu askorbinowego. W przeciwieństwie do pierwszego etapu, mieszana hodowla dwóch szczepów w optymalnych warunkach trwa 40–65 godz. i daje końcowe stężenie 2-KLG wynoszące 90–110 g/l. W mieszanej fermentacji do produkcji 2-KLG składniki podłoża i ich stężenia mają decydujący wpływ zarówno na wzrost bakterii, jak i na wydajność 2-KLG. Glukoza obecna we właściwym stężeniu skutecznie wpływa na wzrost bakterii, konwersję 2-KLG i skraca czas fermentacji. Znacząco zwiększają wydajność kwas foliowy, glutation, aminokwasy (takie jak L-glicyna, L-prolina, L-treonina i L-izoleucyna), 5’-trifosforan adenozyny (ATP), zasady azotowe oraz jony Fe3+, Mg2+ i Mn2+ stymulujące wytwarzanie 2-KLG przez zwiększenie aktywności kluczowych enzymów (SDH i SNDH) Ketogulonicigenium vulgare.

Drożdże produkujące kwas askorbinowy

Drożdże nie mają endogennego biochemicznego szlaku syntezy witaminy C, ale mogą syntetyzować kwas D-erytroaskorbinowy. Związek ten spełnia podobne funkcje antyoksydacyjne u drożdży. Komórki drożdży mogą jednak gromadzić kwas L-askorbinowy po inkubacji z L-galaktozą, L-galaktono-1,4-laktonem lub L-galaktono-1,4-laktonem. Prawdopodobnie biosynteza kwasu L-askorbinowego z tych substratów w drożdżach zachodzi na skutek aktywności enzymów szlaku kwasu D-erytroaskorbinowego. Ponadto ekspresja oksydazy D-arabinono-1,4-laktonowej z Saccharomyces cerevisiae w komórkach Escherichia coli prowadzi do nadprodukcji kwasów D-erytroaskorbinowego i L-askorbinowego, gdy w podłożu są obecne odpowiednio D-arabinono-1,4-lakton i D-galaktono-1,4-lakton. Saccharomyces cerevisiae i Zygosaccharomyces balii mogą gromadzić kwas L-askorbinowy wewnątrzkomórkowo po inkubacji z L-galaktozą.

Zastosowanie witaminy C

Witamina C jest wykorzystywana w wielu gałęziach przemysłu:

1. 1) przemysł farmaceutyczny produkuje preparaty do leczenia szkorbutu, plamicy idiopatyczno-trombocytopenicznej, niedotlenienia noworodków, wirusowego zapalenia mięśnia sercowego, przewlekłego i ostrego wirusowego zapalenia wątroby, kolki żółciowej spowodowanej pylicą, owrzodzenia przewodu pokarmowego, oparzenia rogówki i spojówki, uszkodzenia oczu, grzybicy, wirusa grypy miażdżycy, raka oskrzeli;

2. 2) przemysł spożywczy stosuje witaminę C do hamowania procesów utleniania owoców i warzyw, hamowania zmian w produktach spożywczych, utrzymania koloru żywności, zapobiegania utlenianiu lipidów;

3. 3) przemysł napojów stosuje witaminę C do konserwacji antyseptycznej i jako suplement diety dla organizmu ludzkiego;

4. 4) przemysł paszowy stosuje witaminę C jako dodatek do pasz w celu wzmocnienia reakcji antystresowych zwierząt, wzmocnienia funkcji odpornościowych; przyspieszenia wzrostu, zwiększenia tempa reprodukcji;

5. 5) przemysł kosmetyczny wykorzystuje witaminę C jako składnik preparatów mających na celu promowanie tworzenia kolagenu, wzmożone tworzenie melaniny, wzmacniających odporność na uszkodzenia skóry przez utlenianie komórkowe organizmu, zwiększenie elastyczności skóry.

Literatura rekomendowana

Kośmider A. i Czaczyk K. 2010. Witamina B_12 – budowa, biosynteza, funkcje i metody oznaczania. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 5: 17–32.

Saito I., Honda H., Kawabe T., Mukumoto F., Shimizu M., Kobayashi T. 2000. Comparison of biotin production by recombinant Sphingomonas sp. under various agitation conditions, Biochem. Eng. J., 5: 129–136.

Survase S.A., Bajaj I.B., Singhal R.S. 2006. Biotechnological production of vitamins. Food Technol. Biotechnol., 44: 381–396.

Tsiminis G., Schartner E.P., Brooks J.L., Hutchinson M.R. 2017. Measuring and tracking vitamin B_12: A review of current methods with a focus on optical spectroscopy, Appl. Spectr. Rev., 52: 439–455,

Yang W., Xu H. 2016. Industrial Fermentation of Vitamin C. [w:] Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants, red. Vandamme E.J. i Revuelta J.L. Wiley VCH Verlag GmbH&Co.

Yoshii K., Hosomi K., Sawane K., Kunisawa J. 2019. Metabolism of dietary and microbial vitamin B family in the regulation of host immunity. Frontiers in Nutrition, 6: art. 48.

14

Pigmenty produkowane przez mikroorganizmy

14.1.Wprowadzenie

Kolory mają znaczenie w każdym aspekcie życia człowieka – w estetyce ubioru, wystroju wnętrz (kolor ścian i mebli), motoryzacji (kolor samochodu). Kolor odgrywa szczególną rolę także w żywieniu – nieuchronnie jemy naszymi oczami. A jakie byłoby pożywienie bez chlorofilu, karotenoidów lub hemoglobiny? Można powiedzieć, że życie na Ziemi jest związane z pigmentami. Pigmenty jako środki barwiące stosowano już w czasach prehistorycznych. Archeolodzy odkryli, że już pierwotni ludzie używali farb do celów estetycznych. Pigmenty są używane od dawna w różnych częściach świata. Naturalne barwniki i barwienie są tak stare jak same tkaniny wytwarzane przez ludzkość. Najwcześniejszy zapis (z 2600 r. p.n.e.) o zastosowaniu naturalnych barwników pochodzi z Chin. W Egipcie znaleziono mumie owinięte w kolorowe sukna, w których wykazano obecność alizaryny. W starożytnym Egipcie barwniki dodawano do jedzenia, głównie do słodyczy. Były to naturalne ekstrakty z roślin. Podobnie naturalnych barwników dodawano do żywności w Japonii w okresie Nara (VIII w.), głównie do barwienia soi i ciast z fasoli adzuki. Znano już wtedy kilka barwników jak madera, indygo, brazylijskie drewno, barwnik czerwonofioletowy oraz żółtawy (weld), hennę. Bardziej wyrafinowane techniki zostały z czasem opracowane przez Azteków i Majów w Ameryce Środkowej i Północnej. Stosowano je do barwienia tkanin naturalnymi barwnikami odpornymi na światło i wodę otrzymanymi z rozdrobnionych owoców, jagód i innych części roślin. W Europie barwienie było praktykowane w epoce brązu, a o szafranie są wzmianki w Starym Testamencie. Badania możliwości wykorzystania pigmentów naturalnych są silnie stymulowane przez ich liczne funkcje. Przed nadejściem ery pigmentów syntetycznych naturalne pigmenty były jedynymi dostępnymi barwnikami, szeroko sprzedawanymi i stosowanymi, stanowiącymi główne źródło tworzenia dobrobytu. Stosowano je przede wszystkim do barwienia naturalnych włókien (wełny, bawełny, jedwabiu) oraz skór. Wykorzystywano je również do barwienia produktów kosmetycznych oraz do produkcji atramentu, akwareli i farb wykorzystywanych przez malarzy artystów.

Od czasu wprowadzenia pierwszego syntetycznego barwnika – moweiny (aniliny purpurowej) – przez brytyjskiego chemika Williama Henry’ego Perkina w 1856 r. pojawiło się wiele wygodnych i tanich pigmentów syntetycznych, a użycie barwników naturalnych zmniejszyło się ze względu na ich stosunkowo wysoki koszt. Od tego czasu nastąpiła era przemysłowa pigmentów syntetycznych. W ubiegłym wieku naturalne pigmenty organiczne zostały prawie całkowicie wyparte przez związki syntetyczne, takie jak ftalocyjaniny (od niebieskiego do zielonego), arylidy (od żółtego do jasnozielonego lub czerwonawożółtego) po chinakrydyny (od pomarańczowego do fioletu). Pigment syntetyczny zdobył rynek ze względu na łatwość produkcji, mniejszy koszt i lepsze właściwości barwiące. W krótkim czasie zaoferowano ponad 80 sztucznych barwników, a pigmenty stosowane jako dodatki do żywności nie były wówczas testowane pod względem toksyczności lub wywoływania niepożądanych skutków. Obecnie pigmenty syntetyczne stosuje się w przemyśle tekstylnym, w garbarstwie, papiernictwie, do produkcji ogniw fotoelektrycznych, preparatów do farbowania włosów, kosmetyków i farmaceutyków, a także w przemyśle spożywczym i rolnictwie.

Nie ma wiarygodnych opublikowanych statystyk dotyczących wielkości rynku produkcji pigmentów i barwników syntetycznych. Analitycy globalnego przemysłu oszacowali ją na prawie 10 mln t do 2017 r. Wartość produkcji samych tylko karotenoidów osiągnęła około 1,4 mld dolarów w 2018 r. Mikrobiologiczna produkcja β-karotenu kosztuje w przybliżeniu 1000 USD/kg, a produkcja barwników syntetycznych – 500 USD/kg. Naturalne pigmenty produkowane przez mikroorganizmy są dwukrotnie droższe, ale mogą konkurować z barwnikami syntetycznymi ze względu na to, że są bezpieczne.

14.2.Barwniki syntetyczne a naturalne pigmenty

Niektóre barwniki syntetyczne, które zostały zatwierdzone przez Food and Drug Administration (FDA) do stosowania w żywności, w środkach farmaceutycznych i preparatach kosmetycznych, później okazały się rakotwórcze. Niektóre barwniki syntetyczne zostały wycofane z użytku zewnętrznego ze względu na oczywiste zagrożenia. Na przykład okazało się, że barwniki benzydynowe powodują raka jelit, a pigment drukarski również jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Barwniki syntetyczne takie jak tartrazyna, czerwień koszenilowa i żółcień pomarańczowa mogą wywoływać alergie samodzielnie lub w połączeniu z innymi barwnikami. Ponadto odpady pochodzące z produkcji pigmentów syntetycznych oraz zużyte pigmenty powodują skażenie środowiska naturalnego. Wszystkie te wady pigmentów syntetycznych spowodowały globalne zwiększenie zapotrzebowania na pigmenty naturalne.

Naturalne pigmenty pochodzące z organizmów są uważane za bezpieczne, gdyż nie są toksyczne ani rakotwórcze, a także ulegają biodegradacji. Barwnikami naturalnymi są karotenoidy, flawonoidy i antrachinon, wytwarzane przez mikroorganizmy, rośliny wyższe i zwierzęta. Naturalne ekstrahowane pigmenty pochodzą także z rud różnych minerałów. Spośród mikroorganizmów największy potencjał do tworzenia różnorodnych pigmentów mają bakterie i grzyby. Pigmenty bakteryjne i grzybicze mają szerokie zastosowanie i ogromną przewagę nad pigmentami roślinnymi, gdyż są łatwe i szybkie w pozyskaniu stosunkowo tanim kosztem i niezależnie od warunków pogodowych. Zastosowanie pigmentów roślinnych ma wiele wad, takich jak brak dostępności przez cały rok, mała stabilność pigmentu oraz jego rozpuszczalność. Z tych powodów proces ich produkcji może nie być opłacalny. Od niepamiętnych czasów naturalne karotenoidy, izoprenoidy, alkaloidy i flawonoidy były używane jako barwniki, środki polepszające smak potraw oraz aromaty dodawane do ciast i deserów. Obecnie klienci coraz częściej żądają produktów naturalnych, bojąc się toksyczności niektórych związków syntetycznych. Wytwarzanie i stosowanie pigmentów bakteryjnych jako naturalnych barwników dotyczy różnych gałęzi przemysłu i gospodarstw domowych.

14.3.Pozyskiwanie mikroorganizmów produkujących pigmenty

Barwne bakterie pochodzące z różnych środowisk naturalnych, głównie z gleb, środowisk skrajnych, a także z powietrza, są izolowane i hodowane w warunkach laboratoryjnych. Do izolacji bakterii wytwarzających pigmenty można stosować różne podłoża hodowlane, zwykle zestalone agarem.

W skali przemysłowej do hodowli mikroorganizmów są rekomendowane tanie podłoża dające w procesie fermentacji duże ilości pigmentów przy niskich nakładach finansowych. Wytworzone przez bakterie pigmenty ekstrahuje się i rozdziela za pomocą rozpuszczalników, a następnie identyfikuje różnymi technikami analitycznymi, takie jak TLC, UV-vis, FTIR, ESI-MS, NMR, HPLC i chromatografia żelowa. Ekstrakcja i oczyszczanie pigmentów bakteryjnych w stosunkowo czystych i skoncentrowanych formach stanowi główne wyzwanie technologiczne. Generalnie bakterie produkują dwa rodzaje pigmentów:

1. 1) pozostające związane z biomasą bakterii,

2. 2) wydzielane do podłoża hodowlanego.

O ile pigmenty należące do pierwszej grupy można w prosty sposób odzyskiwać z biomasy, zwykle z hodowli prowadzonych na podłożu stałym (hodowli powierzchniowych), za pomocą acetonu, o tyle pigmenty wydzielone do podłoża fermentacyjnego (z hodowli wgłębnych) są zwykle odzyskiwane przez ekstrakcję dużymi ilościami rozpuszczalników organicznych, takich jak octan etylu. Ze względu konieczność utylizacji zużytych rozpuszczalników, przed ekstrakcją pigmentów z płynu hodowlanego usuwa się nadmierną ilość wody przez odparowanie lub suszenie rozpyłowe (szeroko rozpowszechnione w przemyśle spożywczym i paszowym). Obecnie niektóre technologie fermentacji są wykorzystywane do produkcji naturalnych pigmentów bakteryjnych, które dodaje się jako suplementy do farmaceutyków, produktów żywnościowych i preparatów wykorzystywanych w rolnictwie (pasze).

Dużym wyzwaniem mikrobiologii przemysłowej jest potrzeba zwiększenia produkcji pigmentów z wykorzystaniem bakterii, tak aby była ona ekonomicznie opłacalna. Mogą być w tym przydatne najnowsze osiągnięcia w dziedzinie biologii molekularnej. Sklonowano geny odpowiedzialne za biosyntezę wielu pigmentów, a do wytworzenia tych pigmentów wykorzystano technologię rekombinacji DNA. Na przykład naukowcy uzyskali w bioreaktorach fermentacyjnych powszechnie stosowany bezpieczny szczep Escherichia coli zdolny do nadprodukcji pigmentu indygo, który tradycyjnie otrzymywano wyłącznie z rośliny indygowca farbiarskiego Indigofera tinctoria L. Szlaki biosyntetyczne różnych barwników można również zmieniać w celu opracowania odpowiedniej struktury molekularnej pigmentu, a w konsekwencji także jego barwy. Dzięki modyfikacji genetycznej Streptomyces coelicolor, który wytwarza niebieski pigment – aktynorodynę, może wytwarzać pokrewny jasnożółty poliketyd – kalafunginę.

Alternatywnie biosyntezę aktynorodyny można również zmodyfikować, aby wytworzyć pomarańczowe lub żółtoczerwone antrachinony. Pigmenty bakteryjne muszą być stabilne chemicznie na działanie środowiska, zwłaszcza promieniowania ultrafioletowego (UV). Inicjuje ono niepożądane reakcje rodnikowe, które ostatecznie prowadzą do degradacji różnych związków organicznych, w tym pigmentów. Różnorodne absorbery UV (takie jak cząsteczki na bazie benzotriazolu i triazyny) i związki wolnorodnikowe (takie jak aminy) są już stosowane w przemyśle i są dostępne w handlu, natomiast ich skuteczność w połączeniu z pigmentami bakteryjnymi pozostaje do zbadania.

14.4.Nowatorskie strategie wzmacniające produkcję pigmentów bakteryjnych

Przemysł biotechnologiczny nieustannie dąży do odkrywania nowych pigmentów bakteryjnych i zwiększania ich produktywności, aby utrzymać globalną konkurencyjność. Tradycyjne metody stosowane do osiągnięcia tych celów obejmują selekcję szczepów mikroorganizmów, ulepszanie metod ich hodowli, opracowywanie optymalnego składu podłoża fermentacyjnego oraz projektowanie bioreaktorów i modelowanie procesów. W ciągu ostatniej dekady wprowadzono dwie nowe strategie nadprodukcji przemysłowo pożądanych produktów bakteryjnych (pigmentów, enzymów). Strategie te opierają się na odpowiedzi bakterii na docierające do nich sygnały chemiczne (quorum sensing) oraz na otaczające je środowisko (stresy). Badania zjawiska quorum sensing w skali laboratoryjnej nadal mają imponujące tempo, głównie w obszarach biomedycznych. Istnieje ogromny potencjał do wykorzystania tego procesu komunikacji w produkcji pigmentów bakteryjnych do celów przemysłowych. Wiadomo, że za pomocą systemów quorum sensing jest kontrolowana produkcja pigmentów bakteryjnych, w tym prodigiozyny i wiolaceiny. Komórka bakteryjna wykrywa gęstość komórek przez akumulację cząsteczek sygnałowych. I tak w hodowli na agarze G bakteria Pantoea agglomerans przy wysokiej gęstości komórek wytwarza pigmenty ciemnoniebieskie. Wyniki te sugerują, że produkcja niebieskiego pigmentu może być regulowana przez quorum sensing. Wytwarzanie pigmentów bakteryjnych przez quorum sensing niesie potencjalną nadzieję na zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i biotechnologicznym, w którym można wykorzystać komunikację bakteryjną do nadprodukcji bioproduktów pożądanych z handlowego punktu widzenia.

14.5.Rodzaje pigmentów produkowanych przez mikroorganizmy

Spośród licznych pigmentów produkowanych przez mikroorganizmy niektóre są istotne z biotechnologicznego punktu widzenia (tab. 14.1).

Tabela 14.1. Lista przykładowych barwników produkowanych przez mikroorganizmy (glony, bakterie i grzyby)

Nazwa pigmentu

Kolor

Mikroorganizm

Działanie

Status

Lit.

astaksantyna

różowoczerwony

Haematococcus pluvialis,

Chlorella zofingiensis,

Neochloris vimmeri,

Paracoccus carotinifaciens,

Agrobacterium aurantiacum,

Xanthophyllomyces dendrorhous,

Thraustochytrium sp. CHN-3,

Phaffia rhodozyma

antyoksydacyjne, antyrakowe,

przeciwzapalne,

fotoochronne

PB

[1]

[2]

kantaksantyna

pomarańczowy

Bradyrhizobium spp.,

Monascus roseus,

Dietzia natronolimnaea HS-1,

Haloferax alexandrinus

antyoksydacyjne,

antyrakowe

PB

[3]

[1]

[4]

[5]

zeaksantyna

żółty

Staphylococcus aureus,

Paracoccus zeaxanthinifaciens,

Flavobacterium spp.

-

SB

[6]

stafyloksantyna

złoty

Staphylococcus aureus

antyoksydacyjne

-

[6]

prodigiozyna

czerwony

Alteromonas rubra,

Vibrio gazogenes,

Rugamonas rubra,

Streptovercillium rubrireticuli, Serratia marcescens,

Serratia rubidaea, Pseudoalteromonas rubra,

Vibrio psychroerythrus

antyrakowe,

immunosupresyjne

PP

[7]

[12]

[6]

cykloprodigiozyna

czerwony

Pseudoalteromonas denitrificans

antyrakowe,

antymalaryczne

PB

[6]

undecylo-prodigiozyna

czerwony

Streptomyces coelicolor

antybakteryjne, antyoksydacyjne,

antyrakowe,

UV-ochronne

-

[6]

β-karoten

pomarańczowy

Blakeslea trispora,

Fusarium sporotrichoides,

Mucor circinelloides,

Neurospora crassa,

Phycomyces blakesleeanus,

Dunaliella salina,

antyrakowe,

antyoksydacyjne,

hamowanie syntezy cholesterolu

PP

[6]

[7]

wiolaceina

purpurowy

Janthinobacterium lividum,

Chromobacterium lividum,

Pseudoalteromonas tunicate,

Pseudoalteromonas spp.

antyoksydacyjne

-

[6]

[7]

ksantomonadyna

żółty

Xanthomonas oryzae

ochronne na UV

-

[6]

ryboflawina

żółty

Ashbya gossypi,

Dunaliella spp.,

Spirulina platensis,

Serratia marcescens, Agrobacterium tumefaciens, Rhodococcus maris,

Rhodobacter sphaeroides

antyoksydacyjne, antyrakowe, ochronne przeciw chorobom naczyniowo-sercowym

PP

[6]

[7]

[8]

likopen

czerwony

Fusarium sporotrichoides,

Blakeslea trispora,

Chlorococcum sp.

antyoksydacyjne, antyrakowe

PB

[6]

[7]

antrachinon

czerwony

Penicillium oxalicum

antyfungicyjne

PP

[6]

naftochinon

głęboka czerwień

Cordyceps unilateralis

antybakteryjne, antyrakowe, trypanonobójcze

SB

[6]

torularodyna

pomarańczowożółte

Rhodotorula spp.,

Rhodotorula glutinis

antyoksydacyjne, antybakteryjnej

-

[6]

piocyjanina

niebieski, zielony

Pseudomonas aeruginosa

cytotoksyczne,

zabójcze dla neutrofili, przeciwzapalne

PP

[9]

rubropunktatyna

pomarańczowy

Monascus spp.

antyrakowe

PP

[10]

ankaflawina

żółty

Monascus spp.

antyrakowe, antyzapalne

PP

[10]

melanina

czarny

Saccharomyces neoformans,

Kluyveromyces marxianus, Streptomyces chibanensis,

Streptomyces kathirae

Cryptococcus neoformans, Aspergillus sp.,

Wangiella dermatitidis, Sporothrix schenckii, Burkholderia cepacia

antyoksydacyjne, antyrakotwórcze,

wirusobójcze

PP

[11]

[12]

[13]

PB – projekt badawczy; SB- status badawczy; PP – produkcja przemysłowa.

[1] Ambati i wsp. 2014. Mar. Drugs, 12: 128–152. [2] Johnson i An 1991. Critical Rev. Biotechnol., 11: 297–326. [3] Dufosse 2009. Applied Microbiology: Industrial, 457–471. [4] Hojjati i wsp. 2012. J. Food Sci. Technol., DOI 10.1007/s13197-012-0713-0. [5] Asker i Ohta 2002. Intern. J. System. Evolution. Microbiol., 52: 729–738. [6] Tuli i wsp. 2015. J. Food Sci. Technol., 52: 4669–4678. [7] Malik i wsp. 2012. Intern. J. Microbial Resour. Technol., 361–365. http://ijmrt.inpressco.com ISSN 2278–3822. [8] Bogacz-Radomska i Harasym 2018. Food Quality and Safety, 2: 69-74. [9] Muller i Merrett 2014. Antimicrobial. Agents Chemother., 58: 5492–5499. [10] Blanc i wsp. 1994. J. Food Sc., 59: 862–865. [11] Tarangini i Mishra 2013. Res. J. Eng. Sci., 2: 40–46. [12] Pombeiro-Sponchiado i wsp. 2016. InTech. http://dx.doi.org/10.5772/67375; [13] Guo i wsp. 2014. FEMS Microbiol. Letters, 357: 85–91.

14.5.1. Pigmenty bakteryjne

Wykorzystanie bakterii do produkcji pigmentów ma przewagę nad wykorzystaniem grzybów z powodu krótkiego czasu generacji i łatwości modyfikacji genetycznej, ale produkcja większości z nich jest nadal na etapie badań rozwojowych. Bakterie wytwarzające pigmenty są wszechobecne w różnych niszach ekologicznych, takich jak gleba i strefa ryzosferowa, piasek pustyni, świeża woda, próbki morskie, środowiska ekstremalne: zasolone, o niskiej i wysokiej temperaturze. Produkcja pigmentów jest bardziej prawdopodobna wśród promieniowców (Actinobacteria). Gatunki należące do Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Thermomonospora, Actinoplanes, Microbispora, Streptosporangium, Actinomadura, Rhodococcus i Kitasatospora wytwarzają szeroką gamę pigmentów, najliczniej gatunki z rodzaju Streptomyces jak Streptomyces griseus, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces cyaneus, Streptomyces vietnamensis, Streptomyces peucetius, Streptomyces echinoruber, Streptomyces shaanxiensis i Streptomyces caeruleatus.

Podobnie jak grzyby, bakterie wytwarzają także różne pigmenty, takie jak karotenoidy, melaninę, wiolaceinę, prodigiozynę, piocyjaninę, aktynodynę i zeaksantynę. Do wytwarzania pigmentów mikrobiologicznych są stosowane dwa podstawowe podejścia biotechnologiczne: najpierw szukanie nowego źródła szczepów produkujących pigmenty, a następnie ulepszanie tych szczepów w celu zwiększenia produkcji pigmentów. Nowe szczepy bakteryjne produkujące pigmenty wykrywa się przez przesiewanie kilku ekologicznych nisz. Mutacje z zastosowaniem UV 2,8-krotnie zwiększyły produkcję prodigiozyny w porównaniu ze szczepem macierzystym. Produkcję pigmentów przez Serratia marcescens zwiększyło zastosowanie promieniowania UV i metanosulfonianu etylowego w procesie mutagenizacji. Wzrost produkcji pigmentu spowodowały też optymalizacja warunków hodowli i składu podłoża hodowlanego. Bacillus sp. wykazał znaczącą produkcję pigmentu, gdy hodowlę prowadzono w pH 7,0±0,1 i temp. 34°C. Podobnie Duganella sp. B2 zareagował na zastosowanie optymalnego źródła azotu i pH 4,8-krotnym wzrostem produkcji pigmentu. Ostatnio zmiany genetyczne z zastosowaniem inżynierii spowodowały wzrost wytworzenia pigmentu niebieskiego przez Streptomyces coelicolor, a dalsze modyfikacje genetyczne – produkcję pigmentów jasnożółtego (kalafunginy) i pomarańczowego lub żółtoczerwonego (antrachinonu).

14.5.2. Pigmenty grzybicze

Grzyby strzępkowe produkują wiele pigmentów, takich jak karotenoidy, melaniny, flawiny, fenazyny, chinony, monascyny, wiolaceiny i indygo. Wykorzystanie pigmentów syntetyzowanych przez Monascus do produkcji czerwonego ryżu (ang-kak) jest najstarszym zarejestrowanym użyciem pigmentów pochodzenia grzybowego. Szczepy Monascus produkują następujące pigmenty: żółty (ankaflawina, monascyna), pomarańczowy (rubropunktatyna, monaskorubrina), i fioletowe (rubropunktamina, monaskorubramina), które są często dodawane do żywności w krajach orientalnych, zwłaszcza na południu Chin, Japonii i Azji Południowo-Wschodniej. Na całym świecie istnieje 50 patentów dotyczących użycia pigmentów produkowanych przez szczepy Monascus w przemyśle spożywczym. Pigmenty te mają właściwości antydrobnoustrojowe, antynowotworowe i antymutagenne oraz przeciwdziałają otyłości. Istnieje ponad 200 gatunków grzybów zdolnych do produkcji karotenów. Spośród grzybów należących do rzędu Mucorales karoteny produkują Phycomyces, Blakeslea i Mucor, gatunki Basidiomycota, takie jak Rhodosporidium, Sclerotium, Sclerotinia, Sporidiobolus i Ustilago, a z gatunków Ascomycota – Aspergillus, Cercospora, Penicillium i Aschersonia. Pigmenty takie jak antrachinony, naftochinony, melanina dihydroksynaftalenowa, flawiny, antrachinon, chrysofanol, cynodontyna, helmintosporyna, tritisporyna i erytroglaucyny są produkowane przez szczepy grzybów z rodzajów Eurotium, Fusarium, Curvularia i Drechslera. Istnieje wiele morskich nisz ekologicznych nadal nieodkrytych, których wody mają niskie temperatury, brak światła oraz wysokie ciśnienie i zasolenie. Warunki te indukują morskie mikroorganizmy do produkcji unikatowych substancji. Izolaty morskie należące do rodzajów takich jak Aspergillus, Penicillium, Trichoderma oraz Eurotium są zdolne do produkcji pigmentów.

Pigmenty grzybów bytujących w środowiskach morskich są na ogół podobne do pigmentów grzybów pochodzenia lądowego, ale niektóre pigmenty zostały uzyskane tylko od szczepów grzybów morskich. Żółty pigment (asperflawinorybofuranozyd antracenoglikozydowy) wyprodukowany przez Microsporum sp. pojawia się tylko u grzybów morskich. Do produkcji pigmentu jest zdolnych kilka morskich grzybów endofitycznych, takich jak Eurotium rubrum, Halorosellinia sp., Hortaea sp., Phaeotheca sp. i Trimmatostroma sp. Oprócz roślin, grzyby morskie również kojarzą się z glonami i koralowcami. Raporty sugerują, że morskie grzyby endofityczne wytwarzają pigmenty, które pomagają naśladować i często zwiększają piękno skojarzonych form życia. Pigmenty grzybowe stosowane do celów spożywczych muszą być nietoksyczne, stabilne i zatwierdzone do użytku przez organy regulacyjne. W wielu krajach nadal zabrania się stosowania pigmentów produkowanych przez grzyby. Najlepszym przykładem są pigmenty Monascus, które były używane w Azji od wieków jako barwniki spożywcze, ale są zabronione w Europie i Stanach Zjednoczonych ze względu na obecność mikotoksyny.

Opracowano kilka metod unikania produkcji toksyn przez grzyby:

1. 1) wybór niepatogennych szczepów;

2. 2) kontrola biosyntezy metabolitu i wytwarzania;

3. 3) wybór stosownego podłoża hodowlanego, aby szczep nie produkował toksyny.

Zauważono, że obecność lub brak jonów metali, źródeł węgla i źródeł azotu może wpływać na produkcję toksyn.

Pigmenty mikrobiologiczne powinny być oporne na ekstremalne wartości pH i temperaturę, aby spełniać standardy przemysłowe. Wiele pigmentów produkowanych przez grzyby jest stabilnych w szerokim zakresie pH. Pigmenty wytwarzane przez Monascus purpureus, Isaria farinosa, Emericella nidulans, Fusarium verticillioides i Penicillium purpurogenum wykazują lepszą zdolność barwienia przy kwaśnym pH (pH 5). Pigment produkowany przez Thermomyces sp. jest trwały w zakresie pH 5,1–8,0. Pigment wytwarzany przez Penicillium aculeatum stosowany do barwienia napojów bezalkoholowych jest stabilny przy obojętnym pH. Pigment wyprodukowany przez Monascus purpureus jest stabilny nawet przy pH 11.

Pigmenty grzybicze są stabilne w różnych temperaturach. Uznano za stabilne w wysokich temperaturach pigmenty Monascus purpureus, Isaria spp., Emericella spp., Fusarium spp. i Penicillium spp. używane do wstępnego barwienia garbowanej próbki skóry. Pigment Monascus użyty do barwienia kiełbasy wykazał trwałość 92–98% w temp. 4°C przez trzy miesiące. Mimo że wiele grzybów zostało zbadanych i uznanych za nietoksyczne, a ich barwniki za stabilne, produkcja tych barwników na drodze fermentacji wymaga dużych inwestycji kapitałowych. Najlepszym przykładem jest produkcja β-karotenu przez mikroorganizmy. Mikrobiologiczne wytwarzanie β-karotenu jest około dwukrotnie droższe niż na drodze syntezy chemicznej. Aby obniżyć koszty produkcji, proponuje się stosowanie do konstrukcji podłoża fermentacyjnego surowców odpadowych pochodzących z produkcji rolniczej. Wiele grzybów jest zdolnych do produkcji pigmentów kosztem tanich surowców. Monascus ruber produkuje pigmenty wykorzystując namok kukurydziany jako źródło azotu zamiast ekstraktu drożdżowego. Monascus purpureus produkuje pigmenty z wykorzystaniem odpadów z winogron. Mimo wielu przeszkód, pigmenty produkowane przez grzyby przedostały się na rynek i konkurują z barwnikami syntetycznymi. Są to pigmenty z Monascus, Arpink redTM z Penicillium oxalicum, ryboflawina z Ashbya gossypii, likopen i β-karoten z Blakeslea trispora i są dostępne na rynku. Wiele pigmentów grzybowych jest już produkowanych na skalę przemysłową, podczas gdy niektóre są w fazie rozwoju.

14.6.Cechy pigmentów produkowanych przez mikroorganizmy

Pigmenty produkowane przez mikroorganizmy, oprócz zdolności do barwienia tkanin i żywności, mają właściwości antydrobnoustrojowe, antyoksydacyjne, antynowotworowe, a także jako wskaźniki biologiczne, dzięki którym znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym.

14.6.1. Pigmenty stosowane w przemyśle farmaceutycznym

Z badań nad pigmentami pochodzenia naturalnego produkowanymi przez mikroorganizmy wynika, że mogą być one stosowane w leczeniu wielu chorób, a niektóre z nich wykazują właściwości antybiotyczne, przeciwrakowe i immunosupresyjne. W związku z tym liczba związków wyodrębnionych z bakterii rośnie szybciej w porównaniu z innymi źródłami. Antocyjany biorą udział w szerokim zakresie aktywności biologicznych. Wpływają one pozytywnie na właściwości zdrowotne i zmniejszają ryzyko wystąpienia raka, zmniejszają nasilenie stanu zapalnego i modulują odpowiedź immunologiczną. Bakterie z rodzaju Streptomyces lub Serratia mogą wytwarzać w szkielecie czerwoną substancję, w której znajduje się pyrolylopyrometen, który jest w jednej z następujących substancji: prodigiozyna, metacykloprodigiozyna, desmetoksyprodigiozyna i prodigiozyna 25-C. Wiadomo, że substancje te mają działanie antybiotyczne i przeciwmalaryczne, zwłaszcza prodigiozyna 25-C, która wykazuje działanie immunosupresyjne. Aktywność immunosupresyjna prodigiozyny została po raz pierwszy opisana przez Nakamura i wsp. w 1989 r. Prodigiozyna i metacykloprodigiozyna obecne w płynie hodowlanym bakterii z rodzaju Serratia powodowały selektywne hamowanie poliklonalnej proliferacji komórek T w porównaniu z komórkami B. Ponadto badano także siłę cytotoksyczną prodigiozyny w standardowych panelach linii komórkowej 60 ludzkich komórek nowotworowych pochodzących z nowotworów płuc, okrężnicy, nerek, jajników, mózgu, czerniaka i białaczki. W tych liniach komórkowych obserwowano hamowanie proliferacji komórek, jak również indukcję śmierci komórkowej. Doniesiono również o aktywności przeciwnowotworowej in vitro dla różnych analogów prodigiozyny i syntetycznej pochodnej indolowej prodygiozyny. Antyproliferacyjne i cytotoksyczne działanie prodigiozyny obserwowano nie tylko w hodowanych liniach komórek nowotworowych, ale także w ludzkich pierwotnych komórkach nowotworowych od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową z limfocytów B.

Hwanmook i wsp. (2003) podjęli badania nad leczeniem cukrzycy prodigiozyną. Okazało się, że prodigiozyna jest aktywnym biologicznie związkiem użytecznym w zapobieganiu i leczeniu cukrzycy. Wiolaceina jest wytwarzana przez kilka gatunków bakterii, w tym przez Gram-ujemny gatunek Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium lividum, Pseudoalteromonas luteoviolacea, Pseudoalteromonas sp. 520P1 i Pseudoalteromonas sp. 710P1. Stwierdzono, że wiolaceina jest aktywnym biologicznie związkiem o właściwościach antypierwotniaczych, antyrakowych, antywirusowych, antybakteryjnych i antyutleniających. Opisano aktywność przeciwprątkową dwóch pigmentów wiolaceiny, fioletowoniebieskiego pigmentu z Janthinobacterium sp. Ant5-2 (J-PVP) i fleksirubiny, żółtopomarańczowego pigmentu z Flavobacterium sp. Ant342 (F-YOP), które mogą być cennymi związkami w chemioterapii gruźlicy. Te cechy zapewniają możliwe zastosowania wiolaceiny do celów terapeutycznych.

14.6.1.1. Pigmenty jako środki antydrobnoustrojowe

Rośnie wciąż liczba bakterii opornych na wiele leków i na całym świecie brakuje antybiotyków do zwalczania patogenów. Jest to poważny problem dla medycyny. Do walki przeciwko szerokiej gamie patogenów mogą być wykorzystywane pigmenty mikrobiologiczne mające dobre właściwości antydrobnoustrojowe – karotenoidy, melaniny, flawiny, chinony, monascyny, wiolaceina i indygo. Z kolei piocyjanina i piorubina uzyskane z Pseudomonas aeruginosa wykazują aktywność przeciwbakteryjną przeciwko Citrobacter sp., który jest przyczyną infekcji dróg moczowych i zranień. Pigmenty wytworzone z Micrococcus luteus KF532949 wykazują obiecujące działanie antydrobnoustrojowe przeciwko towarzyszącym ranom patogenom takim jak Staphylococcus sp., Klebsiella sp. i Pseudomonas sp. Pigment otrzymany z Streptomyces hygroscopicus wykazuje działanie antydrobnoustrojowe przeciwko patogenom lekoopornym, takim jak oporne na metycylinę i wankomycynę szczepy Staphylococcus aureus i szczepy Escherichia coli wytwarzające β-laktamazę, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella sp. Wykazano, że pigment z Monascus ruber wykazuje działanie antydrobnoustrojowe przeciwko bakteriom przenoszonym przez żywność. Zaobserwowano hamowanie wzrostu ludzkich patogennych bakterii takich jak Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae i Vibrio cholera przez pigment grzybów endofitycznych gatunku Monodictys castaneae. Działanie przeciwbakteryjne prodigiozyny wytwarzanej z Vibrio sp. DSM 14379 oceniono na komórkach Escherichia coli. Stwierdzono, że komórki Escherichia coli traktowane prodigiozyną wykazywały wycieki przez membrany, spadek tempa oddychania i hamowanie syntezy białka i RNA. Widać więc, że pigmenty mikrobiologiczne mogą być stosowane zarówno do barwienia tkanin, jak też jako leki nowej generacji.

14.6.1.2. Pigmenty jako antyoksydanty

Wzrost wolnych rodników w organizmie zwiększa ryzyko występowania chorób przewlekłych, takich jak rak, cukrzyca, zaburzenia sercowo-naczyniowe i autoimmunologiczne. Aby ich uniknąć, stosuje się przeciwutleniacze. Są to cząsteczki, które opóźniają lub hamują uszkodzenie komórek przez utratę elektronów na rzecz wolnych rodników i neutralizują je przez ich zdolności do wychwytywania wolnych rodników. Pigmenty mikrobiologiczne, takie jak karotenoidy i naftochinon wykazują aktywność przeciwutleniającą. Jako przeciwutleniacze są traktowane również antrachinony z grzybów endofitycznych Stemphylium lycopersici i melaniny ze Streptomyces glaucescens NEAE-H. Ksantomonadyna wykazuje aktywność przeciwutleniającą i ochronną przed fotouszkodzeniem. Podobnie, karotenoidy, pigmenty produkowane przez bakterie antarktyczne Pedobacter wykazują aktywność przeciwutleniającą. Pigmenty te mają silne właściwości przeciwutleniające i ochronne przeciwko uszkodzeniom oksydacyjnym. Z informacji tych wynika, że mikrobiologiczne barwniki antyoksydacyjne mogą zapobiegać występowaniu wielu chorób, takich jak rak i choroby serca.

14.6.1.3. Pigmenty jako czynniki antynowotworowe

Nowotwory są jedną z najczęstszych chorób śmiertelnych człowieka. Większość istniejących terapii nie jest wystarczająco skuteczna, aby zapewnić pełną ochronę. Działanie antynowotworowe wykazuje wiele pigmentów produkowanych przez drobnoustroje. Pigmenty takie jak prodigiozyna pozyskana z Pseudoalteromonas sp. 1020R wykazują cytotoksyczność przeciw komórkom białaczki U937. Melanina Streptomyces glaucescens NEAE-H wykazuje działanie antynowotworowe przeciwko linii komórkowej raka skóry. Pochodne antrachinonu z mangrowców grzyba endofitycznego Alternaria sp. ZJ9-6B wykazują aktywność antynowotworową przeciw liniom komórek ludzkiego raka sutka. Pigmenty otrzymane z Monascus spp. wykazują niezwykłą aktywność antynowotworową przeciwko różnym komórkom nowotworowym. Pigmenty Monascus takie jak monascyna wykazywały działanie hamujące przeciwko kancerogenezie skóry myszy, a ankaflawina hamuje linie komórek nowotworowych Hep G2 i A549 u ludzi. Podobnie mononiton A i monafilon B wykazują działanie antyproliferacyjne przeciwko ludzkiej linii komórek raka krtani HEp-2. Prodigiozyna została przetestowana pod kątem aktywności antynowotworowej przeciwko ponad 60 liniom komórek rakowych i wykazywała wysoką aktywność antynowotworową. Z informacji tych wynika, że pigmenty drobnoustrojowe mogą stanowić potencjalne środki terapeutyczne do leczenia raka.

14.6.1.4. Pigmenty jako wskaźniki biologiczne

Oprócz zastosowania do barwienia, w charakterze antyoksydantów, czynników antydrobnoustrojowych i antynowotworowych, barwniki mikrobiologiczne stosuje się jako wskaźniki biologiczne. Pigmenty fluorescencyjne bakterii mogą być użyte do kontroli określonych reakcji. Najlepszym przykładem jest fikoerytryna używana do przewidywania tempa wychwytywania rodników w ludzkim osoczu. Pigment początkowo wykazuje fluorescencję, ale pojawiają się ciemne plamy, gdy pigment wchodzi w reakcjęz rodnikami. Pigmenty są używane do wykrywania metali ciężkich. W normalnych warunkach wzrostu Vogesella indigofera wytwarza niebieski pigment, ale w obecności metalu ciężkiego jak sześciowartościowy chrom produkcja pigmentów jest wstrzymana. Pigmenty mikrobiologiczne mogą być również używane do monitorowania zmian temperatury. Pantoea agglomerans wytwarza ciemnoniebieski pigment tylko w temp. 10°C, dlatego może być stosowany jako wskaźnik temperatury do przechowywania żywności i materiałów klinicznych w niskiej temperaturze.

14.6.2. Pigmenty jako barwniki stosowane w przemyśle włókienniczym

Przemysł włókienniczy wykorzystuje około 1,3 mln ton barwników, pigmentów i prekursorów barwników rocznie, z czego prawie wszystkie są wytwarzane syntetycznie. Podczas procesu barwienia ogromna część barwników jest odprowadzana ze ściekami. Większość z nich opuszcza biologiczne oczyszczalnie ścieków (nie są dostatecznie usuwane), przedostaje się do środowiska i utrzymuje w nim z powodu ich wysokiej stabilności wobec światła, wody, temperatury, detergentów, chemikaliów, mydła oraz wybielaczy. Syntetyczne barwniki mają pewne ograniczenia:

1. 1) w ich procesie produkcyjnym stosuje się niebezpieczne chemikalia stwarzające zagrożenie życia i zdrowia pracowników;

2. 2) ich proces produkcyjny może generować niebezpieczne odpady;

3. 3) barwniki te są nieprzyjazne dla środowiska.

Jak już wspominano, do drugiej połowy XIX wieku wszystkie barwniki stosowane w przemyśle tekstylnym pochodziły z natury. Jednak dzięki syntezie moweiny przez Williama Henry’ego Perkina w 1856 r., chemika brytyjskiego, syntetyczny przemysł barwników rozwijał się w szybkim tempie i całkowicie wykorzenił stosowanie naturalnych barwników. O kreatywności i innowacyjności chemików zatrudnionych w przemyśle tekstylnym świadczy duża liczba używanych obecnie barwników syntetycznych, które z powodzeniem mogą być wykorzystane w prostych, powtarzalnych procesach barwienia, aby pokrywać zapotrzebowanie konsumentów na produkty wysokiej jakości po rozsądnej cenie. Obecnie stosowane barwniki są prawie wyłącznie wytwarzane z zasobów nieodnawialnych, takich jak olej kopalny. Mimo że mają barwy w całym spektrum kolorów, a ich produkcja jest ekonomicznie wydajna i zaawansowana technicznie, to wykorzystuje ona nieodnawialne zasoby ropy naftowej i jest szkodliwa dla środowiska, a także istnieją obawy dotyczące niekorzystnego działania niektórych barwników syntetycznych na zdrowie człowieka. W związku z tym ostatnio coraz większym zainteresowaniem cieszy się biosynteza barwników (naturalnych). Barwniki otrzymane w procesach biosyntezy na drodze fermentacji prowadzonych przez mikroorganizmy mogą służyć jako główne barwniki do dalszych modyfikacji chemicznych mających na celu zwiększenie spektrum ich kolorów. Pigmenty mikrobiologiczne są przyjazne dla środowiska. Do barwienia tkanin można stosować różne typy tych barwników. Prodigiozyna pozyskana z hodowli Vibrio spp. może być wykorzystana do barwienia wełny, nylonu, akryli i jedwabiu. Używany jako zaprawa tamaryndowiec, pigment z Serratia marcescens, może barwić pięć rodzajów tkanin, w tym akrylowe: mikrofibra poliestrowa, poliester, jedwab i bawełna. Antrachinon pozyskany z Fusarium oxysporum można stosować do barwienia tkanin wełnianych. Czerwony pigment z Talaromyces verruculosus ma ton barwy odpowiedni dla tkanin bawełnianych bez żadnego efektu cytotoksycznego. Pigmenty mikrobiologiczne tworzą różne odcienie kolorów na różnych tekstyliach. Pigment z Janthinobacterium lividum ma odcień niebieskiej purpury na jedwabiu, bawełnie i wełnie, a ciemnoniebieski – na nylonie i winylonie. Podobną zdolność barwienia ma żółty pigment z Thermomyces zastosowany do tkanin bawełnianych, jedwabnych i wełnianych. Zaobserwowano, że tkaniny jedwabne mają wysokie powinowactwo do pigmentów Thermomyces w porównaniu z innymi tkaninami. Barwniki pozyskiwane ze szczepów Streptomyces NP2 i NP4 mogą dawać głęboki błękit i czerwień w zależności od rodzaju materiału farbowanego – uzyskano żywe zabarwienie włókien poliamidowych i akrylowych, a słabe zabarwienie bawełny i włókien celulozowych. Ponadto, tkaniny barwione mikrobiologicznie mają właściwości antydrobnoustrojowe. Tkaniny farbowane prodigiozyną uzyskaną z hodowli Vibrio sp. wykazały działanie przeciwbakteryjne przeciwko Staphylococcus aureus i Escherichia coli. W związku z szeroką dostępnością pigmentów pozyskiwanych z mikroorganizmów, ich powinowactwem do różnych tkanin, skutecznością i nietoksycznym charakterem ich atrakcyjność rynkowa rośnie i wkrótce mogą zastąpić barwniki syntetyczne toksyczne dla ludzi i środowiska.

14.6.3. Pigmenty jako barwniki spożywcze

Celem przemysłu spożywczego jest produkcja zdrowej żywności o atrakcyjnym wyglądzie. Aby to osiągnąć, stosuje się pigmenty naturalne lub syntetyczne. Ostatnio obserwuje się zamianę barwników syntetycznych na naturalne, z powodu szkodliwości niektórych barwników syntetycznych.Barwniki naturalne produkowane przez mikroorganizmy odgrywają istotną rolę w przemysłowym barwieniu żywności, ponieważ ich produkcja jest tańsza, są łatwiejsze w ekstrakcji i mają wysoką wydajność procesu fermentacji z surowców dostępnych przez cały rok. Wiele pigmentów pochodzenia mikrobiologicznego, takich jak czerwony pigment z Monascus sp., astaksantyna z Xanthophyllomyces dendrorhous, Arpink redTM z Penicillium oxalicum, ryboflawina z Ashbya gossypii, β-karoten z Blakeslea trispora oraz likopen z Erwinia uredovora i Fusarium sporotrichioides dodaje się do żywności, aby zwiększyć jej atrakcyjność. Kantaksantyną barwi się sery, słodycze, mięso ryb i zwierząt, owoce, napoje, przekąski, piwo i wino. Ryboflawiną (witamina B_2) barwi się napoje, desery i lody. Odporne na działanie promieni słonecznych karotenoidy mogą przedłużać jakość żywności wystawionej na działanie światła.

Kontrowersyjny temat stosowania syntetycznych barwników w żywności jest dyskutowany od wielu lat. Analiza i negatywna ocena syntetycznych barwników spożywczych wzbudziła duże zainteresowanie naturalnymi pigmentami produkowanymi przez organizmy. Niektóre firmy zdecydowały się na barwienie żywności głównie ekstraktami lub pigmentami roślinnymi, np. kolorem czerwonym z papryki, buraków, jagód lub pomidora, żółtym – z szafranu lub nagietka, pomarańczowym annato – z nasion arnoty, zielonym – z liści warzyw. Stosowanie w przemyśle spożywczym różnych barwników pochodzących z fermentacji rośnie rok po roku. Przykładami są: środki żelujące (ksantan, kurdlan, gellan), polepszacze smaku (hydrolizat drożdżowy, glutaminian monosodowy), związki smakowe (γ-dekalakton, diacetyl, metyloketony), środki zakwaszające (kwas mlekowy, kwas cytrynowy). Zostały opracowane pigmenty pochodzące z fermentacji i dopuszczone do użycia w przemyśle spożywczym – β-karoten z grzyba Blakeslea trispora w Europie lub pigment monascyny przez Monascus w Azji.

14.7.Lista pigmentów spożywczych

Tabele Billa Stathama zawierają listę związków chemicznych naturalnych i syntetycznych dopuszczonych do stosowania jako dodatki do żywności ( E100−E199 – barwniki). Autor wyróżnia cztery kategorie barwników stosowanych do „malowania” żywności:

1. 1) bezpieczne,

2. 2) niebezpieczne,

3. 3) podejrzane,

4. 4) o zalecanej ostrożności.

14.7.1. Pigmenty spożywcze bezpieczne dla zdrowia

14.7.1.1. E100 – kurkumina

Kurkuminę otrzymuje się przez ekstrakcję rozpuszczalnikami z kłączy ostryżu długiego (Curcuma longa) zwanego także kurkumą.

14.7.1.2. E191 – ryboflawina

Ryboflawina to witamina B_2 koloru żółtego rozpuszczalna w wodzie, produkowana przez wiele mikroorganizmów. Ryboflawina jest stosowana w żywieniu i leczeniu ludzi oraz jako dodatek do pasz dla zwierząt. Jej niedobór u ludzi objawia się utratą włosów, stanem zapalnym skóry, pogorszeniem widzenia i brakiem wzrostu. Ta witamina okazała się również skuteczna w leczeniu migreny i malarii. Ryboflawina jest produkowana komercyjnie na drodze syntezy chemicznej, fermentacji oraz połączenia fermentacji i syntezy chemicznej. Ostatnio szlak fermentacji jest szeroko stosowany, ponieważ produkuje witaminę w jednym etapie, co powoduje znaczne oszczędności. Natomiast procesy chemiczne są wieloetapowe i wymagają wielu nakładów finansowych. Do drobnoustrojów syntetyzujących znaczące ilości ryboflawiny należą: Clostridium acetobutylicum (97 mg/l), Escherichia coli (505 mg/l), Candida flareri (567 mg/l), Eremothecium ashbyii (2480 mg/l) oraz Ashbya gossipii (6420 mg/l).

Do produkcji ryboflawiny z powodzeniem używa się drożdży Candida flareri (Candida famata). Według amerykańskiego patentu (1988) można otrzymać ryboflawinę w ilości 21 g/l podłoża po 200 godzinach hodowli mutagenizowanych drożdży Candida flareri zdolnych do nadprodukcji witaminy B_2. Ulepszone szczepy do produkcji ryboflawiny zostały skonstruowane za pomocą inżynierii metabolicznej przy użyciu technik rekombinacji DNA w Corynebacterium ammoniagenes. W szczepie o największej zdolności produkcyjnej ryboflawina jest wytwarzana na poziomie 15,3 g/l po 72 godzinach w 5-litrowym fermentorze bez żadnego hamowania produktu końcowego.

Dwa najbliżej spokrewnione gatunki grzybów, Eremothecium ashbyii i Ashbya gossypii, są uważane za najlepszych producentów ryboflawiny. Ashbya gossypii produkuje 40 000 razy więcej witaminy niż potrzebuje do własnego wzrostu. Jon żelaza(2+) hamuje wytwarzanie ryboflawiny przy niskich jego stężeniach. Zdolność Eremothecium ashbyii i Ashbya gossypii do tłumienia działania żelaza jest odpowiedzialna za nadprodukcję ryboflawiny. U normalnych mikroorganizmów żelazo tłumi prawie wszystkie biosyntetyczne enzymy biorące udział w produkcji ryboflawiny, podczas gdy ryboflawina lub jej pochodna hamują pierwszy enzym szlaku 5’-trifosforan guanozyny (GTP II). Fermentacyjna produkcja ryboflawiny jest prowadzona w hodowli płynnej mieszanej. Czynniki, takie jak odpowiedni szczep, źródło węgla, sole mineralne i pH wpływają na fermentacyjną produkcję ryboflawiny. Do produkcji ryboflawiny zostały zastosowane różne źródła węgla takie jak olej palmowy, owsianka kukurydziana, glukoza, melasa, serwatka. Wydajność ryboflawiny wynoszącą ponad 15 g/l płynu hodowlanego uzyskuje się w sterylnej tlenowej fermentacji płynnej Ashbya gossypii z pożywką zawierającą melasę lub olej roślinny jako główne źródło węgla. Do produkcji ryboflawiny wykorzystano również przemysłowe odpady, takie jak aktywowaną ziemię bielącą (odpady odprowadzane z rafinerii ropy naftowej) oraz produkty uboczne z przemysłu rolniczego, takie jak moszcz gronowy, melasę buraczaną i placek z orzeszków ziemnych. Po użyciu aktywowanej ziemi (odpadu ziemi bielącej zawierającej 40% oleju palmowego) do produkcji ryboflawiny przez Ashbya gossypii, stężenie ryboflawiny osiągnęło 2,1 g/l przez 10 dni. Produkcję ryboflawiny w hodowli Ashbya gossypii zwiększono 1,6 razy po 4 dniach (2,5 g/l) z dodatkiem 1% podłoża mineralnego z zaadsorbowanym olejem sojowym do pożywki.

14.7.1.3. E160a – karotenoidy

Karotenoidy należą do najpowszechniejszych spośród wszystkich naturalnych pigmentów dostępnych na rynku, a wśród nich komercyjnie wykorzystywane są β-karoten, likopen, astaksantyna, kantaksantyna, luteina i kapsantyna. Karotenoidy są zwykle ekstrahowane z marchwi, skórek owoców cytrusowych, pomidorów i glonów. Bakterie i karotenogenne gatunki grzybów również mogą je wytwarzać (tab. 14.2). Karotenoidy mają w strukturze chemicznej skoniugowany układ podwójnego wiązania, który działa jako chromofor dla absorpcji o selektywnej długości fali (światła), nadając tym związkom atrakcyjny kolor od jasnożółtego do czerwonego. Pochłaniana energia prowadzi do wzbudzenia elektronów i zmian rozmieszczenia ładunku. Każda reakcja desaturacji barwnika powoduje przesunięcie maksimów absorpcji w kierunku dłuższych fal, co jest przyczyną różnych kolorów karotenoidów, od żółtego do czerwonego. Te podwójne wiązania w strukturze karotenoidu mogą istnieć w postaci trans i cis, ale w naturze mają one zazwyczaj postać trans. Transformację z trans do cis można przeprowadzić za pomocą kwasu, ciepła, tlenu i ekspozycji na światło.

Tabela 14.2. Mikroorganizmy produkujące β-karoten

Mikroorganizmy

Rodzaje/gatunki

drożdże

Phaffia rhodozyma, Rhodotorula acheniorum, Rhodotorula glutinis,

Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula rubra (mucilaginosa), Rhodosporidium diobovatum, Sporidiobolus pararoseus, Sporobolomyces ruberrimus, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces patagonicus, Sporobolomyces pararoseus, Sporobolomyces shibatanus, Sporobolomyces roseus, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae

grzyby strzępkowe

Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Mucor circinelloides, Phycomyces blakesleeanus

glony

Dunaliella salina, Dunaliella bardawil, Dunaliella tertiolecta, Erythrotrichia carnea, Laurencia obtusa, Prochloron sp., Spirulina platensis, Mallomonas sp.

bakterie

Escherichia coli, Serratia marcescens, Agrobacterium tumefaciens, Rhodococcus maris, Rhodobacter sphaeroides,

Źródło: na podstawie Bogacz-Radomska L. i Harasym J. 2018. β-Carotene – properties and production methods. Food Quality and Safety, 2: 69–74. Open Access.

W 1928 r. Szwajcar Paul Karrer stwierdził, że β-karoten jest głównym prekursorem witaminy A. Produkowany jest on także przez liczne mikroorganizmy. Komisja Europejska uważa, że β-karoten produkowany w procesie fermentacji przez Blakeslea trispora jest ekwiwalentny do chemicznie syntetyzowanego produktu i może być stosowany do „malowania” żywności.

Na skalę przemysłową β-karoten otrzymuje się z hodowli Blakeslea trispora lub Dunaliella salina. Fermentację prowadzi się w trzech etapach: namnażanie inoculum, biosynteza biomasy i ekstrakcja karotenoidów. W przypadku zastosowania Blakeslea trispora jako źródło węgla stosuje się mąkę kukurydzianą i pszenną, namok kukurydziany, glukozę, ekstrakty warzyw i owoców, a nawet ciekłe węglowodory jak oczyszczona ropa naftowa lub dodatek olejów roślinnych celem zwiększenia stężenia β-karotenu. Proces krystalizacji jest prowadzony z użyciem alkoholi zawierających od jednego do sześciu atomów węgla, np. n-propanolu w temp. 60°C. Uzyskany β-karoten można następnie wykorzystać jako dodatek do barwienia żywności po wymieszaniu z żelatyną, sacharozą, skrobią lub olejami roślinnymi.

Dunaliella salina jest głównym komercyjnym źródłem naturalnych β-ka-rotenów pochodzenia mikrobiologicznego. Hodowla Dunaliella jest prowadzona w słonej wodzie (24% chlorku sodu) z dodatkiem soli mineralnych, w obecności intensywnego światła słonecznego, w otwartych zbiornikach, w których w ciągu doby powstaje biomasa w ilości 30–40 g s.m./m^2 zbiornika. Izolowany β-karoten jest określony jako produkt handlowy i sprzedawany w postaci proszku zawierającego 3% β-karotenu. Można też otrzymać emulsję karotenoidu rozpuszczonego w olejach roślinnych. Na skalę przemysłową β-karoten pozyskuje się w hodowlach bakterii, drożdży lub grzybów workowych (mutant Bacillus subtilis, Candida flareri, Eremothecium ashbyii i Ashbya gossypii).

14.7.1.4. E140 – chlorofil

Barwnik zielony chlorofil pozyskuje się przezekstrakcję z roślin zielonych.

14.7.1.5. E141 – kompleksy miedzi z chlorofilem i/lub jego pochodnymi

Kompleksy miedzi z chlorofilem i/lub jego pochodnymi uzyskuje się przez ekstrakcję z roślin i ich chemiczną modyfikację.

14.7.1.6. E160c – kapsorubina, kapsantyna i ekstrakt z papryki

Kapsorubina, kapsantyna i ekstrakt z papryki są naturalnymi barwnikami pozyskiwanymi z papryki odmiany chilli. Ekstrakt z papryki, oprócz nadania barwionym produktom ciemnoczerwonego koloru, ma również właściwości przyprawy.

14.7.1.7. E160d – likopen

Likopen to barwnik naturalny z grupy karotenoidów. Na skalę przemysłową jest ekstrahowany z pomidorów i czerwonych grejpfrutów.

14.7.1.8. E160e – β-apo-8’-karotenal

β-apo-8’-karotenal tonaturalny lub syntetyczny związek organiczny z grupy apokarotenoidów (podgrupa karotenoidów) barwy pomarańczowożółtej. Do celów przemysłowych wykorzystuje się głównie odmianę syntetyczną.

14.7.1.9. E160f – ester etylowy kwasu β-8’-karotenowego

Ester etylowy kwasu β-8’-karotenowego w celach przemysłowych jest wytwarzany z E160e lub wyodrębniany z roślin.

14.7.1.10. E161b – luteina

Luteina tozwiązek organiczny, żółty barwnik należący do ksantofili (podgrupa karotenoidów), alkoholowa pochodna α-karotenu. Do zastosowań przemysłowych otrzymuje się ją z traw.

14.7.1.11. E163 – antocyjany

Antocyjany stanowią grupę organicznych związków chemicznych z klasy flawonoidów, będących glikozydami, w których barwnymi aglikonami są antocyjanidyny (zazwyczaj cyjanidyna, pelargonidyna, delfinidyna). Do celów spożywczych otrzymuje się je przez ekstrakcję z liści czerwonej kapusty lub skórek winogron.

14.7.1.12. E170 – węglan wapnia

Węglan wapnia to nieorganiczny związek szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, stanowiący podstawowy składnik wielu minerałów: kalcytu, aragonitu i skał: dolomitu, kredy i koralu. Używany jako utwardzacz i biały barwnik spożywczy, dodawany do pieczywa, herbatników, wyrobów cukierniczych, lodów, cukierków, konserwowanych owoców i warzyw. W niewielkich ilościach jest uznawany za nieszkodliwy, ale jego nadmiar może powodować bóle brzucha i zaparcia.

14.7.1.13. E175 – złoto

Złoto w postaci listków i proszków ma zastosowanie do powierzchniowego barwienia ciast oraz w produkcji likierów (Goldwasser).

14.7.2. Pigmenty spożywcze niebezpieczne dla zdrowia

Przedstawiona w tym rozdziale lista pigmentów niebezpiecznych dla zdrowia została sporządzona na podstawie: Bill Statham: E213: Tabele dodatków i składników chemicznych. Wydawnictwo RM, Warszawa 2006.

14.7.2.1. E102 – tartrazyna

Tatrazyna to cytrynowożółty barwnik chemiczny azowy produkowany głównie do celów spożywczych. Należy do syntetycznych barwników kwasowych z grupy barwników pirazolowych. Jest dodawana do produktów w proszku, takich jak napoje, zupy czy polewy do deserów, a także do wyrobów cukierniczych, groszku i kukurydzy konserwowanej, krakersów serowych, napojów bezalkoholowych, sosu miętowego, galaretek (głównie miętowych), likierów owocowych, dżemów, marcepanu, sosów brązowych, płatków zbożowych, kasz, sztucznego miodu czy musztardy. Tartrazyna jest czynnikiem uwalniającym histaminę. Po jej spożyciu u astmatyków i uczulonych na aspirynę mogą wystąpić skurcz oskrzeli, katar sienny, depresja, wysypka, swędzenie warg i języka, bezsenność.

14.7.2.2. E104 – żółcień chinolinowa

Żółcień chinolinowa to zielonkawożółty barwnik chinolinowy. Wytwarza się ją syntetycznie lub pozyskuje od zwierząt. Jest używana jako barwnik do lodów, napojów gazowanych, galaretek i cukierków na kaszel. Powoduje reakcje alergiczne skóry.

14.7.2.3. E110 – żółć pomarańczowa FCF

Żółć pomarańczowa FCF to żółtopomarańczowy, syntetyczny barwnik azowy, stosowany do barwienia żywności. Wykorzystuje się ją do barwienia artykułów spożywczych jak likiery owocowe, marcepan, produkty w proszku, płatki zbożowe, kasze, wyroby cukiernicze, konserwy rybne. Może wywołać reakcje alergiczne, pokrzywkę, duszność.

14.7.2.4. E120 – kwas karminowy

Kwas karminowy (koszenila) to ciemnoczerwony barwnik pozyskiwany z wysuszonych, zmielonych owadów, zwanych czerwcami. Koszenilą barwi się napoje alkoholowe, sosy owocowe, nadzienia do ciast i mięsa, wypieki, jogurty, polewy. Może wywołać wstrząs anafilaktyczny, pokrzywkę, katar sienny.

14.7.2.5. E122 – azorubina

Azorubina to syntetyczny czerwony barwnik z grupy barwników azowych. Stosowany jako dodatek do żywności w wyrobach cukierniczych (serniki, rolady), budyniach, galaretkach, kisielach, cukierkach, marcepanie, dżemach, marmoladach, konfiturach, jogurty, winie i napojach. Powoduje obrzęki.

14.7.2.6. E123 – amarant

Amarant to barwnik syntetyczny z grupy barwników azowych, nieziarnisty, ciemnoczerwony spożywczy smołowy. Można go znaleźć w ciastach i galaretkach w proszku, płatkach śniadaniowych, bezalkoholowych i niskoprocentowych napojach alkoholowych, kawiorze, przetworach z czarnej porzeczki. Wykazuje działanie mutagenne, a spożywany przez kobiety w ciąży może powodować wady rozwojowe u płodu.

14.7.2.7. E124 – czerwień koszenilowa

Czerwień koszenilowa to syntetyczny czerwony barwnik z grupy organicznych barwników azowych. Stosuje się ją do ciast i galaretek w proszku, dżemów, polew deserowych, zup pomidorowych, lodów i barwienia skorupek jaj. Wywołuje alergie, szkodzi osobom uczulonym na aspirynę, jest rakotwórcza, powoduje nadpobudliwość.

14.7.2.8. E127 – erytrozyna

Erytrozyna to wiśniowoczerwony smołowy barwnik spożywczy. Dodawany do owoców konserwowanych i koktajlowych, osłonkach (kiszkach) kiełbas, herbatnikach i ciastach w proszku. Może powodować dekoncentrację, trudności w nauce, jest także niebezpieczna dla osób z chorą tarczycą. W niektórych krajach jest zakazana.

14.7.2.9. E128 – czerwień 2G

Czerwień 2G to czerwony, organiczny, spożywczy barwnik azowy. Jest stosowana do barwienia wyrobów z gotowanego mięsa, kotletów mielonych i kiełbas. Przypuszcza się jej szkodliwość, ponieważ jest metabolizowana do aniliny, która jest znana z właściwości rakotwórczych.

14.7.2.10. E129 – czerwień allura AC

Czerwień allura AC to ciemnoczerwony, spożywczy, smołowy barwnik azowy stosowany do barwienia napojów gazowanych i niegazowanych, wyrobów cukierniczych (głównie ciast biszkoptowych) i galaretek w proszku, a także płatków zbożowych, kasz i herbatników czekoladowych. Wywołuje alergie, szkodzi osobom uczulonym na aspirynę i chorym na astmę.

14.7.2.11. E131 – błękit patentowy

Błękit patentowy to syntetyczny, niebieskofioletowy związek azowy, czasem dodawany do żelków spożywczych. Powoduje wydzielanie histaminy, przez co być może niebezpieczny dla alergików. Z powodu jego szkodliwości jest wycofywany z użycia. Barwnik ten jest stosowany w stomatologii do barwienia płytki nazębnej, aby ją w ten sposób uwidocznić.

14.7.2.12. E132 – indygotyn

Indygotyn to disulfonowa pochodna indyga, niebieski organiczny barwnik syntetyczny, wskaźnik pH i wskaźnik redoks. Jest stosowany do barwienia słodyczy, gumy do żucia, deserów, lodów, napojów bezalkoholowych. Jest podejrzany o działanie rakotwórcze. Z powodu wiązania się tego barwnika z białkami, może wywołać reakcje alergiczne. Jest on także zdolny do uwalniania histaminy. Może być przyczyną nadpobudliwości i problemów z sercem.

14.7.2.13. E133 – błękit brylantowy FCF

Błękit brylantowy FCF to związek organiczny, syntetyczny, barwy niebieskiej. Jest stosowany do barwienia artykułów spożywczych, Jego zadaniem jest zmiana oraz wzmocnienie barwy produktu. Występuje praktycznie w większości produktów (napojach, słodyczach) o niebieskim zabarwieniu. Dodaje się go do żelatyny, groszku konserwowego, nabiału, płatków zbożowych, kasz, deserów, kremów do wyrobów ciastkarskich, a także do pastylek owocowych i miętowych. Jest szkodliwy dla osób z zespołem jelita drażliwego i innymi schorzeniami przewodu pokarmowego.

14.7.2.14. E142 – zieleń S

Zieleń S to organiczny związek chemiczny, trifenylometanowy barwnik smołowy. Jest stosowana w przemyśle spożywczym jako dodatek do groszku konserwowego, sosu miętowego, serników w proszku, galaretek. W stosowanych stężeniach barwnik ten rzadko jest szkodliwy dla zdrowia, ale w większych ilościach może powodować astmę, nadpobudliwość, bezsenność, reakcje alergiczne, wysypkę i anemię.

14.7.2.15. E150a – karmel prosty

Karmel prosty to sacharoza poddana działaniu wysokiej temperatury, w której tworzy karmel o barwie brązowej. Jest głównym składnikiem cukierków, barwnikiem do napojów cola, pieczywa, czekolad, deserów, dżemów i jogurtów. Może powodować dolegliwości żołądkowo-jelitowe.

14.7.2.16. E150b – karmel siarczynowy

Karmel siarczynowy to syntetyczny brązowy barwnik spożywczy otrzymywany przez ogrzewanie sacharozy w ditlenkiem siarki. W przemyśle spożywczym jest używany głównie do barwienia whisky, lodów, fermentowanych napojów mlecznych oraz jako aromat. Może negatywnie wpływać na wątrobę, powodować nadpobudliwość oraz problemy żołądkowe.

14.7.2.17. E150c – karmel amoniakalny

Karmel amoniakalny to syntetyczny brązowy barwnik spożywczy otrzymywany w wyniku działania amoniaku na sacharozę. Jest stosowany do barwienia ciemnego pieczywa, herbatników, sosów sojowego i ostrygowego, czekolad, polew, deserów mlecznych, dżemów i marynat. Może wpływać negatywnie na wątrobę, żołądek, powodować nadpobudliwość oraz wywoływać konwulsje.

14.7.2.18. 150d – karmel amoniakalno-siarczynowy

Karmel amoniakalno-siarczynowy to syntetyczny brązowy barwnik spożywczy, stosowany do barwienia piwa typu porter, napojów typu cola, czekolady, deserów, wyrobów cukierniczych, sosu do mięs. W większych dawkach powoduje nadpobudliwość i rozdrażnienie. U królików hamuje syntezę witaminy B_6.

14.7.2.19. E151 – czerń brylantowa

Czerń brylantowa to organiczny spożywczy barwnik dwuazowy, który rozpuszczony w wodzie daje granatowo fioletowe zabarwienie. Znajduje zastosowanie w barwieniu niektórych wyrobów cukierniczych oraz napojów spirytusowych. Jest zakazany w USA. Używany do barwienia ciast w proszku z czarną porzeczką, jogurtów, ajerkoniaków, sosu brązowego lub kawioru. W jelitach może być przekształcany przez bakterie w niebezpieczne związki rakotwórcze i szkodliwe dla nerek.

14.7.2.20. E154 – brąz FK

Brąz FK to syntetyczny barwnik spożywczy brązowy rozpuszczalny w wodzie. Jest mieszaniną sześciu barwników azowych, chlorku sodu lub siarczanu sodu oraz innych barwników. Zakazany w wielu krajach, w Polsce nie. Stosowany głównie do barwienia przetworów rybnych oraz ryb wędzonych, do konserw rybnych, można też go znaleźć w chipsach i gotowej szynce. Może wywoływać skutki podobnie jak inne barwniki azowe i niektóre czynniki mutagenne. Spożywany nadmiernie odkłada się w nerkach i naczyniach limfatycznych.

14.7.2.21. E155 – brąz HT

Brąz HT tosyntetyczny azowy barwnik spożywczy dodawany do przypraw korzennych, wypieków, deserów, wyrobów imitujących czekoladę. W jelitach ulega redukcji bakteryjnej do innego związku azowego – kwasu naftiolowego. Kwas ten należy do amin aromatycznych, ale jego działanie genotoksyczne nie zostało potwierdzone (ryzyko jest małe lub żadne). Jest częstą przyczyną biegunek i pokrzywek, może odkładać się w nerkach i naczyniach limfatycznych. Może wywołać astmę i reakcję alergiczne. Nie powinny go spożywać osoby uczulone na aspirynę i dzieci.

14.7.2.22. E160b – annato (biksyna, norbiksyna)

Annato (biksyna, norbiksyna)nadaje kolor żółtoróżowy takim produktom jak: margaryny, dekoracje i powłoki na słodyczach, pieczywo cukiernicze i wyroby ciastkarskie, lody, likiery, sery topione (aromatyzowane lub z dodatkami smakowymi), sery dojrzewające pomarańczowe i żółte, ryby wędzone, aromatyzowane płatki śniadaniowe. Spożywane w nadmiarze prawdopodobnie może spowodować alergię i egzemę. Podejrzewa się także, że wywołuje spadek ciśnienia oraz jest przyczyną nadpobudliwości i bólów głowy u dzieci.

14.7.2.23. E180 – czerwień litolowa

Czerwień litolowa to syntetyczny organiczny związek chemiczny z grupy barwników azowych, barwnik spożywczy koloru czerwonawego. W niektórych krajach jest zabroniona. Stosowana do barwienia jadalnych powłok serów dojrzewających (Edam), produkcji kosmetyków i środków farmaceutycznych. Może wywoływać problemy żołądkowo-jelitowe, bezsenność, a także katar sienny.

14.7.2.24. E172 – tlenki i wodorotlenki żelaza

Tlenki i wodorotlenki żelaza należą do barwników pochodzenia naturalnego, są pozyskiwane ze sproszkowanego żelaza. Są to: czarny tlenek żelaza E172(I), czerwony tlenek żelaza E172(II,) oraz żółty tlenek żelaza E172(III). Są dodawane do aromatyzowanych napojów bezalkoholowych, kandyzowanych owoców, wyrobów cukierniczych, lodów, musztardy, past rybnych z owoców morza, łososia i wędzonych ryb, zup oraz win. Są one stosowane także w karmach przeznaczonych dla zwierząt domowych. Prawdopodobnie wszystkie tlenki żelaza są w pewnym stopniu toksyczne dla człowieka. Przekroczenie dziennej dawki może stanowić zagrożenie dla zdrowia.

14.7.2.25. E173 – aluminium

Aluminium to naturalnie występujący metal uzyskiwany z boksytów. Wykorzystywane jest głównie w cukiernictwie do zdobienia ciast. Może powodować chorobę Alzheimera, choroby nerek i płuc, jest także toksyczne dla układu krwionośnego, rozrodczego i nerwowego.

14.7.3. Barwniki spożywcze o zalecanej ostrożności

14.7.3.1. E162 – Betaina

Betaina to spożywczy organiczny związek chemiczny z grupy glikozydów, koloru od ciemnoczerwonego do fioletowego, otrzymywany z buraków ćwikłowych. W zastosowaniach spożywczych jest nieszkodliwa (zostaje całkowicie wydalona z organizmu wraz z moczem). Barwnik ten wykorzystuje się głównie w cukiernictwie przy produkcji deserów, galaretek, dżemów, do barwienia napojów bezalkoholowych oraz kosmetyków.

14.7.4. Barwniki spożywcze podejrzane

14.7.4.1. E153 – węgiel roślinny

Węgiel roślinny, jak sama nazwa wskazuje, składa się z drobnych cząsteczek zwęglonej materii roślinnej. Daje barwy od szarej do czarnej w zależności od zastosowanego dozowania. Używany jest jako barwnik przy produkcji soków owocowych, dżemów, żelków, sosów warzywnych, lukrecji, serów, lodów, pieczywa oraz innych wyrobów cukierniczych. Jest stosowany w medycynie jako środek przeciwbiegunkowy. Limity dozowania: barwnik nielimitowany w produktach spożywczych.

14.7.4.2. E161g – kantaksantyna

Kantaksantyna jest produkowana jako główny pigment karotenoidowy przez szczepy zawierające bakteriochlorofil z rodzaju Bradyrhizobium (fotosyntetyczna), szczepy izolowane z brodawek łodygi wodnej rośliny gatunku Aschynomene i Halobacterium spp. Karotenoidy te pomagają w zbieraniu energii świetlnej i przenoszeniu jej na bakteriochlorofil a (BCh a) oraz działają jako wygaszacze rodników tlenowych. Kantaksantyna tozwiązek organiczny z grupy ksantofili (podgrupa karotenoidów), naturalny różowy barwnik spożywczy. Jest obecny w małych ilościach w wielu gatunkach roślin i grzybów oraz w piórach niektórych ptaków. Można go produkować syntetycznie z β-karotenu, ale na skalę przemysłową jest otrzymywany z piór flamingów. Jego użycie do celów spożywczych jest zakazane w niektórych krajach. Kantaksantyny są silnymi przeciwutleniaczami i hamują utlenianie lipidów w liposomach.

14.7.4.3. E171 – ditlenek tytanu

Ditlenek tytanu jest najpowszechniejszym i najtrwalszym tlenkiem tytanu. Nie jest rozpuszczalny w wodzie. Jest stosowany w tradycyjny już sposób jako pigment (biel tytanowa) do produkcji papieru, żywności, tworzyw sztucznych, kosmetyków, farmaceutyków, porcelany, farb i emalii oraz jako barwnik spożywczy.

14.7.4.4. E174 – srebro

Srebro jest naturalnym, mineralnym barwnikiem i konserwantem, produktom nadaje srebrnoszary kolor. Dozwolone wyłącznie do stosowania w polewach słodyczy, dekoracji pralinek i zewnętrznych elementów wypieków cukierniczych, a także do barwienia likierów. Srebro jest jednak bardzo rzadko stosowane. Przy zbyt dużej ilości odkłada się ono w tkankach i skórze, prowadząc do srebrzycy. Powoduje także uszkodzenie nerek, gdyż niezwykle wolno wydziela się z moczem.

14.8.Pigmenty powszechnie produkowane na drodze mikrobiologicznej w skali przemysłowej

14.8.1. Karotenoidy

Karotenoidy zostały wyizolowane po raz pierwszy przez Heinricha Wilhelma Ferdynanda Wackenrodera. Znanych jest ponad 700 karotenoidów, wszystkie są tetraterpenoidami. Dzieli się je na dwie klasy: ksantofile (zawierające tlen) i karoteny (czyste węglowodory niezawierające tlenu). Spośród nich najważniejsze są; α- i β-karoteny, kryptoksantyna, luteina, likopen, wiolaksantyna, neoksantyna, zeaksantyna i kantoksantyna. Handlowe karotenoidy są albo ekstrahowane z roślin, albo wytwarzane na drodze syntezy chemicznej. Ekstrakcja karotenoidów z roślin może się odbywać sezonowo i zależy od położenia geograficznego. Z kolei synteza chemiczna produkuje niebezpieczne odpady, które mogą negatywnie wpływać na środowisko. Metoda mikrobiologiczna produkcji karotenoidów wydaje się optymalna. Szczepy mikroorganizmów wytwarzających karotenoidy należą do Flavobacterium multivorum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodotorula mucilaginosa, Sphingomonas sp., Dunaliella sp., Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Mucor circinelloides, Fusarium sporotrichioides, Agrobacterium aurantiacum, Paracoccus carotinifaciens, Gordonia jacobea, Sporidobolus salmoncolor, Rhodosporium paludigenum i Rhodotorula glutinis.

Najważniejszą funkcją karotenoidów jest ich zdolność do gromadzenia energii świetlnej. Absorbują światło i przekazują kwanty energii na chlorofil, a tym samym przedłużają zakres długości fal zebranego światła. Chronią chlorofil przed uszkodzeniem Są one stosowane jako suplementy witaminowe i odgrywają ważną rolę w ochronie przed stresem oksydacyjnym. Spożywanie karotenoidów może zapobiec fotouczuleniu i poparzeniom słonecznym oraz zmniejsza ryzyko raka płuc. Karotenoidy są stosowane komercyjnie jako pigmenty do „malowania” żywności, suplementy karmy dla zwierząt i w leczeniu otyłości. Niedawno zostały użyte do produkcji kosmetyków i farmaceutyków.

14.8.2. Melaniny

Melaniny są klasyfikowane jako polimery indolowe – eumelaniny, feomelaniny i allomelaniny. Melanina powszechnie występuje we wszystkich żywych organizmach. Wytwarza ją też wiele mikroorganizmów, takich jak Colletotrichum lagenarium, Magnaporthe grisea, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii, Aspergillus fumigatus, Vibrio cholerae, Shewanella colwelliana, Alteromonas nigrifaciens i wiele gatunków z rodzaju Streptomyces. Melanina nadaje odporność na promieniowanie UV przez absorpcję szerokiego zakresu promieniowania elektromagnetycznego. Jest szeroko stosowana w kosmetykach, fotoochronnych kremach, okularach przeciwsłonecznych, a także w inaktywowanych odpadach radioaktywnych, takich jak uran. Bakteryjne geny melaniny zostały użyte jako geny reporterowe do badania rekombinowanych szczepów bakteryjnych.

14.8.3. Prodigiozyna

Prodigiozyna jest pigmentem czerwonym. Po raz pierwszy została wyizolowana z Serratia marcescens przez Bogera i Patela w 1987 r. Nazwa prodigiozyna została przypisana izolatowi z Bacillus prodigiosus, który później został przemianowany na Serratia marcescens. Oprócz Serratia marcescens, zdolność do wytwarzania prodigiozyny mają Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra i Streptoverticillium rubrireticuli. Prodigiozynę produkują mikroorganizmy izolowane z próbek morskich, z próbek wody z płytkiego zbiornika i piasku plażowego. Jest silnym związkiem terapeutycznym, zwłaszcza immunosupresyjnym i antynowotworowym. Wykazuje również działanie owadobójcze, antygrzybicze, antybakteryjne i antymalaryczne.

14.8.4. Wiolaceina

Wiolaceinajest pigmentem fioletowym, po raz pierwszy opisanym u Gram-ujemnej bakterii Chromobacterium violaceum izolowanej z Amazonki w Brazylii. Oprócz Chromobacterium violaceum pigment ten produkują różne mikroorganizmy, takie jak Collimonas sp., Duganella sp., Janthinobacterium lividum, Microbulbifer sp., Pseudoalteromonas luteoviolacea, Pseudoalteromonas tunicata i Pseudoalteromonas ulvae, zamieszkujące różne środowiska, Wiolaceina wykazuje działanie antywirusowe, antybakteryjne, antywrzodowe, antybiotyczne, antynowotworowe oraz modulujące właściwości enzymów.

14.8.5. Ryboflawina

Ryboflawina zwana również witaminą B_2 wykazuje silną żółtozieloną fluorescencję, jest rozpuszczalna w wodzie. Po raz pierwszy została wyizolowana przez angielskiego chemika Alexandra Wyntera Blyth’a. Ryboflawina składa się z dwóch różnych części:z jednostki cukru rybozy i trójpierścieniowej struktury flawiny znanej jako lumichrom. Jest niezbędną witaminą, którą należy uzupełnić w diecie człowieka w stężeniu 1,1–1,3 mg na dzień. Działa jako składnik strukturalny koenzymów mononukleotydu flawiny i dinukleotydu adenino-flawinowego. Oba koenzymy katalizują nieenzymatyczne reakcje utleniania i redukcji przez funkcjonowanie jako przenośniki wodorowe w układzie transportowym zaangażowane w produkcję ATP. Suplementy ryboflawiny są wykorzystane jako część fototerapii w leczeniu żółtaczki noworodków. Ryboflawina w połączeniu z β-blokerami jest stosowana w atakach migreny. Okazało się też, że w połączeniu ze światłem UV jest skuteczna w redukcji szkodliwych patogenów występujących w płynach krwiopochodnych.

14.8.6. Piocyjanina

Piocyjanina to niebieski pigment wytwarzany przez Pseudomonas aeruginosa. Składa się z dwóch podjednostek N-metylo-1-hydroksyfenylozyny. Piocyjanina jest używana jako czynnik biologiczny o właściwościach antybakteryjnych i antygrzybicznych. Jest produkowana na skalę przemysłową.

14.9.Mikrobiologiczna produkcja karotenoidów na skalę przemysłową

Większość karotenoidów to terpenoidy C40, które działają ochronnie, wychwytujące rodniki tlenu i nadtlenku. Opisano ponad 700 rodzajów karotenoidów, a tylko około 50 to prekursory witaminy A. Karotenoidy mogą zmniejszać ryzyko chorób zwyrodnieniowych, takich jak rak, choroby układu sercowo-naczyniowego, zwyrodnienie plamki żółtej i zaćmy. Aktywność biologiczna, zwłaszcza jako antyoksydantów, zależy od ich struktury chemicznej: liczby sprzężonych podwójnych wiązań, struktury grup końcowych i podstawników zawierających tlen. Karotenoidy występują w układach fotosyntetycznych wyższych roślin, glonów i bakterii fototroficznych. W roślinach karotenoidy są osadzone w błonach chloroplastów i chromoplastów. Barwy tych pigmentów są maskowane przez chlorofil, ale wchodzą w skład kolorów wielu kwiatów i owoców.

Głównymi karotenoidami produkowanymi przez grzyby są β-karoten, torulen, torularodyna i astaksantyna, bakterie zaś są producentami kantaksantyny, a glony luteiny, β-karotenu i astaksantyny. Kolor piór niektórych ptaków, np. flamingów, również pochodzi z diety bogatej w karotenoidy. Karotenoidy są produktami wewnątrzkomórkowymi, a ich dostępność jest warunkowana stosowaniem fizykochemicznych technik ekstrakcji (maceracja i ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi).

14.9.1. Główne szlaki biosyntezy karotenoidów

Karotenoidy są zwykle wytwarzane ze związków: geranylo-geranylo-difosforanu (GGPP) i farnezylo-difosforan (FPP), podobnie jak inne metabolity wtórne, takie jak seskwiterpenoidy i sterydy. Najczęściej za pomocą kondensacji dwóch jednostek GGPP – najpierw do difosforanu prefitoenu, a następnie do fitoenu – 40-węglowego wielonienasyconego prekursora, który jest bezbarwny. Prekursor ten przekształca się w likopen, a następnie w kilka pochodnych karotenoidów, takich jak β-karoten i pochodne utlenione, takie jak luteina. Kondensacja dwóch jednostek FPP prowadzi do prekursorów 30-węglowych, które są przekształcane w steroidy lub apokarotenoidy, takie jak stafyloksantyna. Można również wytwarzać apokarotenoidy przez rozszczepianie karotenoidów związane z utlenieniem. Większość karotenoidów wykazuje maksymalną absorpcję w zakresie widma widzialnego od fioletowego do zielonego, pojawiając się jako czerwone lub żółte pigmenty.

14.9.2. Naturalne źródła karotenoidów

Listę źródeł naturalnych karotenoidów stosowanych w żywności i produkcji kosmetyków syntetyzowanych przez mikroorganizmy najczęściej wykorzystywanych na skalę przemysłową przedstawiono w tabeli 14.3 na s. 426.

14.9.3. Pozyskiwanie pigmentów karotenoidowych po fermentacji

Tabela 14.3. Produkcja karotenoidów z wykorzystaniem wybranych mikroorganizmów.

Karotenoid

Mikroorganizm

Biomasa (g/l)

Stężenie karotenoidu

Lit.

w mg/l

w mg/g

β-karoten

Blakeslea trispora

20

8

800

1360

40

70

[1]

[2]

Sporobolomyces roseus

4,71

2,58

0,55

[1]

Coelastrella striolata

–

–

7

[3]

Rhodotorula glutinis

5,7

1,08

0,19

[1]

Dunaliella salina

28,1

–

14

[4]

Coccomyxa onubensis

1,6

–

2,88

[5]

astaksantyna

Chlorella zofingiensis

10,2

10

–

–

1,0

1,25

[6]

[7]

Haematococcus pluvialis

2,2

2,0

1,6

2,25

–

–

–

–

13,5

12–15

47,02

54,78

[8]

[9]

[10]

[10]

Phaffia rhodozyma

8,6

2,98

0,35

[11]

Paracoccus carotinifaciens

25–40

[12]

Coelastrella striolata v. multistriata

–

–

1,5

[3]

kantaksantyna

Dietzia natronolimnaea

3,29

2,87

0,87

[13]

Coelastrella striolata

2,7

–

47,5

[3]

luteina

Coccomyxa onubensis

–

–

6,48

[5]

Muriellopsis sp.

5,37

–

6,51

[14]

torularodyna

Sporobolomyces ruberrimus

30

3,7

0,12

[15]

[1] Marova i wsp. 2012. J. Environ. Manag., 95: 338–342. [2] Lin i wsp. 2010. Proc. Nat. Acad. Sci., 107: 21337–21342. [3] Abe i wsp. 2007. Food Chem., 100: 656–661. [4] Kleinegris i wsp. 2011. Enzyme Microb. Technol., 48: 253–259. [5] Vaquero i wsp. 2012. Process Biochem., 47: 694–700. [6] Ip i Chen. 2005. Process Biochem., 40: 733–738. [7] Ip i wsp. 2004. Process Biochem., 39:1761–1766. [8] Harker i wsp. 1996. Bioresour. Technol., 55: 207–217. [9] Garcıa-Malea i wsp. 2005. Biochem. Eng. J., 26: 107–114. [10] Hong i wsp. 2012. Process Biochem., 47: 1972–1979. [11] Yang i wsp. 2011. Agri. Eng. International, 13:1–6. [12] Hirschberg i Harker. 1999. U.S. Patent 5,935,808. [13] Khodaiyan i wsp. 2008. Biochem. Eng. J., 40: 415–422. [14] Del Campo i wsp. 2000. J. Biotechnol., 76: 51–59. [15] Razavi i Marc. 2006. Iranian J. Chem. Chem. Eng., 25: 59–64.

Karotenoidy są niepolarnymi cząsteczkami, które akumulują się wewnątrzkomórkowo w tkankach roślinnych i mikroorganizmach. Dlatego produkcja zazwyczaj polega na wstępnym pozyskaniu biomasy, jej maceracji, a następnie ekstrakcji substancji stałych i ciekłych składników komórek (ługowaniu) z odpowiednim rozpuszczalnikiem o niskiej polarności. Powstały roztwór może być produktem końcowym, może być nierozpuszczalny i może być dalej oczyszczony, w zależności od przeznaczenia ekstraktu. Pierwszym krokiem w produkcji karotenoidów jest pozyskanie surowej biomasy, zwykle przez jej suszenie i mielenie. Suszenie jest wygodne, ponieważ zmniejsza wagę obrabianego materiału, ułatwia dostęp rozpuszczalników do biomasy i redukuje zanieczyszczenia, które mogą być ekstrahowane w micelach wodnych rozpuszczalnikiem. Etap mielenia jest również ważny, ponieważ zwiększa pole powierzchni biomasy, ułatwiając kontakt z rozpuszczalnikiem. Mielenie suchej biomasy jest mniej powszechne. Z suchej biomasy ekstrahuje się barwnik przy użyciu niepolarnego rozpuszczalnika, takiego jak heksan lub olej roślinny, w którym rozpuszczają się karotenoidy. Można zastosować rozpuszczalnik o wyższej polarności, taki jak aceton. W obu przypadkach lipidy są ekstrahowane w mieszance. Po ekstrakcji roztwór zawierający karotenoidy należy zatężyć i usunąć rozpuszczalniki. Właśnie dlatego są stosowane rozpuszczalniki o niskiej temperaturze wrzenia, które łatwo odparowują, są bardziej powszechnymi ekstrahentami niż oleje. Karotenoidy znajdujące się w skoncentrowanym ekstrakcie mogą być dalej oczyszczane lub nie, w zależności od potrzeb. Na przykład β-karoten, który będzie stosowany jako prekursor witaminy A, musi zostać oczyszczony, a oleożywica z papryki, która jest mieszanką karotenoidów wykorzystywaną głównie jako barwnik i dodatek smakowy, nie wymaga dalszego oczyszczania. W odniesieniu do całkowicie oczyszczonych karotenoidów, stosowane są następujące zabiegi techniczne: adsorpcja, chromatografia, krystalizacja, zależnie od właściwości docelowych cząsteczek i zanieczyszczeń w mieszaninie, takich jak temperatura topnienia, polarność, rozpuszczalność. Wszystkie rodzaje niepolarnych związków ekstrahuje się rozpuszczalnikiem, takim jaki stosuje się do obojętnych i lekko polarnych lipidów, steroidów i wosków. Po ekstrakcji i oczyszczeniu karotenoidy muszą być poddane formulacji zależnej od zamierzonego zastosowania.

14.9.4. Przykłady pigmentów karotenoidowych, ich zastosowanie oraz aktywność biologiczna

Pigmentami karoteinoidowymi są:

1. 1) luteina – żółty pigment stosowany m.in. do paszy dla drobiu jako składnik odżywczy oraz jako antyoksydant;

2. 2) kantaksantyna – pomarańczowy pigment, dodawany jako barwnik do paszy dla drobiu oraz paszy dla ryb, stosowany w wyrobach kosmetycznych, o działaniu antyoksydacyjnym oraz antynowotworowym;

3. 3) likopen – pigment czerwony, stosowany jako suplement w żywności, jako dodatek do kosmetyków o działaniu antyoksydacyjnym i antynowotworowym;

4. 4) β-karoten – prekursor witaminy A, pomarańczowoczerwony pigment, stosowany jako dodatek do żywności, w przemyśle paszowym oraz dodatek do kosmetyków;

5. 5) astaksantyna – różowoczerwony pigment, dodawany do karmy dla ryb, stosowany w przemyśle kosmetycznym, działa jako antyoksydant, fotoprotektant, czynnik antyrakowy i przeciwzapalny.

14.10. Podsumowanie

Preferencja barwników naturalnych w stosunku do syntetycznych rozpoczęła się od Ruchu Zielonych w latach 60. ubiegłego wieku i nie maleje do dziś. Z jednej strony wynika ona z niepokoju ze strony konsumentów, że barwniki syntetyczne są niebezpieczne, z drugiej zaś z tego, że łatwiej uzyskać pozwolenie na użycie barwników naturalnych do „malowania” żywności wydawane przez odpowiednie agencje rządowe. Ekologiczne pigmenty drobnoustrojowe wytworzone w procesie fermentacji są stosowane w przemyśle tekstylnym, produkcji żywności, oraz w przemyśle farmaceutycznym jako przeciwutleniacze, wskaźniki biologiczne, środki antydrobnoustrojowe i antynowotworowe. Badania produkcji pigmentów na drodze fermentacji są szeroko zakrojone, ale jeszcze nie pozwalają na taką produkcję, żeby zaspokoić popyt rynkowy i wycofać barwniki syntetyczne. W celu wyeliminowania toksycznych barwników syntetycznych poszukuje się wciąż nowych drobnoustrojów jako źródeł pigmentów i próbuje zmniejszać koszty biosyntezy przez optymalizację, ulepszanie szczepów z użyciem inżynierii genetycznej. Jako źródła składników odżywczych do konstrukcji podłóż fermentacyjnych stosuje się bezużyteczne produkty odpadowe z przemysłu rolno-spożywczego, które mogą być wykorzystane także do produkcji pigmentów naturalnych. Produkcja pigmentów na drodze fermentacji ma wiele zalet: jest tania, łatwa w przeprowadzeniu, ma wysoką wydajność procesu, wykorzystuje łatwo dostępne surowce do konstrukcji podłoża i można ją prowadzić niezależnie od pory roku. Istnieje rosnące zainteresowanie pigmentami produkowanymi przez mikroorganizmy we wszystkich obszarach działalności gospodarczej: w produkcji żywności, farmacji, tekstyliach i rolnictwie.

Literatura rekomendowana

Dufosse L. 2006. Food grade pigments, Food Technol. Biotechnol., 44: 313–321.

Dyrektywa Komisji 95/45/WE z dnia 26 lipca 1995 r. ustanawiająca szczególne kryteria czystości dotyczące barwników stosowanych w środkach spożywczych (Dz.Urz. WE L 226 z 22.09.1995, s. 1; Dz.Urz. UE Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 15, s. 218).

Dyrektywa Komisji 98/66/WE z dnia 4 września 1998 r. zmieniająca dyrektywę nr 95/31/WE ustanawiającą szczególne kryteria czystości dotyczące substancji słodzących stosowanych w środkach spożywczych (Dz.Urz. WE L 257 z 19.09.1998, s. 35; Dz.Urz. WE Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 21, s. 54).

Dyrektywa Komisji 1999/75/WE z dnia 22 lipca 1999 r. zmieniająca dyrektywę Komisji 95/45/WE ustanawiającą szczególne kryteria czystości dotyczące barwników stosowanych w środkach spożywczych (Dz.Urz. WE L 206 z 05.08.1999, s. 19; Dz.Urz. UE Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 24, s. 190).

Dyrektywa Komisji 2001/50/WE z dnia 3 lipca 2001 r. zmieniająca dyrektywę 95/45/WE ustanawiającą szczególne kryteria czystości dotyczące barwników stosowanych w środkach spożywczych (Dz.Urz. WE L 190 z 12.07.2001, s. 14; Dz.Urz. UE Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 26, s. 361).

Dyrektywa Komisji 2006/33/WE z dnia 20 marca 2006 r. zmieniająca dyrektywę 95/45/WE w zakresie żółcieni pomarańczowej FCF (E 110) i ditlenku tytanu (E 171) (Dz.Urz. UE L 82 z 21.03.2006, s. 10).

Dyrektywa Komisji 2006/128/WE z dnia 8 grudnia 2006 r. zmieniająca i poprawiająca dyrektywę 95/31/WE ustanawiającą szczególne kryteria czystości dotyczące substancji słodzących stosowanych w środkach spożywczych (Dz.Urz. UE L 346 z 09.12.2006).

Efsa, 2010. Scientific opinion on the appropriateness of the food azo-colours Tartrazine (E102), Sunset Yellow FCF (E110), Carmoisine (E122), Amaranth (E123), Ponceau 4R (E124), Allura Red AC (E129), Brilliant Black BN (E151), Brown FK (E154), Brown HT (E155) and Litholrubine BK (E180) for inclusion in the list of food ingredients set up in Annex IIIa of Directive 2000/13/EC. EFSA J. 8, 1778.

Efsa, 2010. Scientific opinion statement on the divergence between the risk assessment of lycopene by EFSA and the joint FAO/WHO expert committee on food additives. EFSA J. 8, 1676.

Heer K. i Sharma S. 2017.Microbial pigments as a natural color: a review. Intern. J. Pharmaceut. Sci. Res., 8: 1913–1922.

Joshi V.K., Attri D., Bala A., Bhushan S. 2003. Microbial pigments. Indian J. Microbiol., 2: 362–369.

Krzyśko-Łupicka T., Kręciło M., Kręciło Ł. 2016. Barwniki w żywności a zdrowie konsumentów. Kosmos, 65: 543–552.

Nelis H.J. i De Leenheer A.P. 1991. Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds. J. Appl. Bacteriol., 70: 181–191.

Odpowiedź sekretarza stanu w Ministerstwie Zdrowia – z upoważnienia ministra na interpelację nr 956 w sprawie niektórych barwników używanych do produkcji artykułów spożywczych.

Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 22 listopada 2010 r. w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych. (Dz.U. z 2010 r., nr 136, poz. 914 oraz nr 182, poz. 1228).

Sen T., Barrow C.J., Deshmukh S.K. 2019. Microbial pigments in the food industry – challenges and the way forward. Fronties in Nutrition, 6: art. 7.

Tuli H.S., Chaudhary P., Benival V., Sharma A.K. 2015. Microbial pigments as natural color sources: current trends and future perspectives. J. Food Sci. Technol., 52: 4669–4678.

15

Polimery produkowane przez mikroorganizmy i ich zastosowanie

15.1.Wprowadzenie

Biopolimery, zwane również polimerami odnawialnymi, to określenie polimerów wytwarzanych przez systemy biologiczne i polimerów, które są syntetyzowane chemicznie z biologicznych materiałów wyjściowych, takich jak aminokwasy, cukry i tłuszcze naturalne. W konsekwencji biopolimery można klasyfikować jako polimery syntetyczne lub naturalne. Biopolimery są biokompatybilne, biodegradowalne oraz przyjazne dla środowiska i człowieka. Polimery pozyskiwane na bazie ropy naftowej mają negatywny wpływ na środowisko i ludzi, są toksyczne, trudne do biodegradacji. Biopolimery otrzymywane na skalę przemysłową są odpowiednią alternatywą syntetyzowanych chemicznie. Zidentyfikowano mikroorganizmy zdolne do produkcji biopolimerów w różnego typu hodowlach. Polimery te można wyekstrahować z powierzchni komórki lub z podłoża fermentacyjnego. Bakterie syntetyzują biopolimery do ochrony komórki w odpowiedzi na pewne stresy środowiskowe. Polisacharydy wytwarzane przez mikroorganizmy i wydzielane z komórek definiuje się jako egzopolisacharydy (EPS). W naturze odgrywają istotną rolę w ochronie komórki, adhezji bakterii do powierzchni stałej i w interakcjach między komórkami. Ostatnio obserwuje się duże zainteresowanie EPS, ponieważ mają one różne ciekawe właściwości strukturalne i funkcjonalne. Jako hydrokoloidy EPS są ważnymi surowcami w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, chemicznym i wielu innych gałęziach. Ze względu na swoiste właściwości fizykochemiczne i reologiczne o nowej funkcjonalności, mikrobiologiczne EPS są wykorzystywane do produkcji tekstyliów, detergentów i klejów, a także w browarnictwie, przetwórstwie, kosmetologii i farmakologii oraz jako dodatki do żywności i oczyszczania ścieków. Ksantan, dekstran i pullulan są przykładami polisacharydów mających duży rynek ze względu na ich wyjątkowe właściwości. Polisacharydy pochodzenia roślinnego i glonowego, takie jak skrobia, pektyny, galaktomannany, karageniny i alginian, nadal stanowią główną część rynku hydrokoloidów. Mikrobiologiczne EPS można uzyskiwać szybko w wysokowydajnych procesach fermentacyjnych w kontrolowanych warunkach, więc mogą one konkurować ekonomicznie z polisacharydami pochodzenia roślinnego i glonowego, na których produkcję mają wpływ klimatologiczne i geologiczne warunki środowiskowe.

Istnieje zwiększone zainteresowanie EPS w obszarach przemysłowych i medycznych, ale jak do tej pory ze względu na wysokie koszty produkcji jedynie niektóre bakteryjne EPS są produkowane na skalę przemysłową. Są to ksantan, gelan i dekstran. Rosnące znaczenie EPS w mikrobiologii przemysłowej i medycznej wymaga przestudiowania wzajemnych powiązań między szlakami metabolicznymi a mechanizmami biosyntezy w celu kontrolowania procesu produkcji i poprawy wydajności w procesie fermentacji. Techniki omiczne, takie jak sekwencjonowanie genomu, genomika funkcjonalna, analiza struktury białek i nowe narzędzia bioinformatyczne, zostały wykorzystane do identyfikacji nowych ścieżek biosyntezy EPS i poznania mechanizmów ich tworzenia. Modelowanie, które łączyło dane omiczne z symulacją zmiennej ekspresji i aktywności enzymów, dostarczyło informacji o metabolizmie komórek. Konstrukcje metaboliczne oparte na genomie i skali genomu można wykorzystać, aby zrozumieć i przewidzieć fenotypy gatunków mikroorganizmów. Dlatego podejście biologii systemowej stanowi ważny krok w kierunku poznania mechanizmów wzajemnego oddziaływania między metabolizmem a biosyntezą EPS mikroorganizmów i dodatkowo umożliwia zwiększenie jego metabolicznej wydajności w zastosowaniach przemysłowych.

Polimery wytwarzane przez mikroorganizmy, zwane biopolimerami, zostały podzielone na trzy główne grupy: poliestry, poliamidy i polisacharydy.

15.2.Poliestry

Poliestry alifatyczne produkowane przez niektóre mikroorganizmy są materiałem zapasowym występującym w cytoplazmie bakterii w postaci granulek. Są one syntetyzowane przy niedoborze składników odżywczych takich jak azot i fosfor. Polimery te właściwościami są podobne do syntetycznych i ulegają biodegradacji. Kwas poli-3-hydroksymasłowy (3PHB) odkryty jako związek zapasowy w komórkach Bacillus megaterium w 1926 r. był przez wiele lat jedynym znanym składnikiem bakteryjnych kwasów polihydroksyalkanowych (PHA). Na początku lat 80. ubiegłego wieku przypadkowo wykryto kwasy 3-hydroksywalerianowy (3HV) i 3-hydroksyheksanowy (3HHx) jako składniki PI-L4 nagromadzone w hodowlach Bacillus sp. lub Alcaligenes eutrophus, a kwas 3-hydroksyoktanowy (3HO) został wykryty jako składnik PI-IA nagromadzony w hodowli Pseudomonas oleovorans. Niedawno ukierunkowane badania, w których głównie stosowano podawanie substratów prekursorowych, ujawniły nadmierne wydzielanie i nieoczekiwanie dużą liczbę nowych kwasów hydroksyalkanowych (HA) jako składników biosyntetycznych PI-IA, poliestrów.

Polihydroksyalkaniany (PHA) to poliestry syntetyzowane przez liczne mikroorganizmy. Różne mikroorganizmy gromadzą odmienne PHA, w tym kwasy (R)-hydroksykarboksylowe, mające na końcu grupy karboksylową i hydroksylową w pozycji 3-, 4-, 5- lub 6. Do tej pory znaleziono ponad 150 rodzajów kwasów hydroksykarboksylowych będących monomerami PHA. Ze względów na wygodę badacze podzielili PHA na dwie grupy w zależności od całkowitej liczby atomów węgla w monomerze: PHA o krótkim łańcuchu (SCL) mające 3–5 atomów węgla i PHA o średniej długości łańcucha (MCL) mające 6–14 atomów węgla. Monomery SCL-PHA mają właściwości termoplastyczne podobne do polipropylenu, a MCL-PHA mają właściwości materiału elastycznego podobnego do gumy. Co ciekawe, niektóre mikroorganizmy syntetyzują PHA mające zarówno monomery SCL, jak i MCL. Takie SCL-MCL-PHA są pod względem właściwości podobne do polietylenu niskiej gęstości. Ostatnio udało się wyprodukować z udziałem metabolicznie modyfikowanych bakterii niektóre homopolimery i kopolimery blokowe PHA, co dodatkowo zwiększyło ich różnorodność. W ten sposób można wytwarzać zróżnicowaną rodzinę PHA o właściwościach materiałowych podobnych do wielu obecnie stosowanych polimerów. Jednym z najczęściej wykorzystywanych w przemyśle polimerów krótkołańcuchowych PHA (polihydroksyalkanianów) jest termoplastyczny polihydroksymaślan (poli-PHB). Jest on bardziej sztywny i łamliwy niż polipropylen (PP) z powodu większej krystaliczności. W celu zmniejszenia krystaliczności i poprawienia właściwości fizycznych hydroksymaślanianu (poli-PHB) tworzy się jego kopolimery z hydroksywalerianianem (poli-3HV) lub dodaje plastyfikatory. Uzyskanie właściwości termoplastycznych osiąga się przez dodanie do PHB monomerów 3HV. Najlepiej zbadany z nich jest poli-3-hydroksyoktanian (poli-3HO), który zawiera około 90% 3-hydroksyoktanianu. Ten biopoliester został wyprodukowany w skali pilotażowej i jest obecnie wykorzystywany w kilku aplikacjach eksperymentalnych. Średnia masa cząsteczkowa kwasu poli-3-hydroksymasłowego, głównego przedstawiciela PHA wynosi od 6 · 10^5 do 1,6 · 10^6 g/mol. Właściwości fizyczne i chemiczne PHA zależą od mikroorganizmu stosowanego do produkcji oraz od składu podłoża fermentacyjnego i źródła węgla. Oprócz homopolimerów mikroorganizmy są zdolne do kumulowania kopolimerów, czyli polihydroksykwasów zawierających przynajmniej dwa różne mery. Homopolimery i kopolimery PHA są produkowane przez odpowiednie szczepy bakterii hodowane w odpowiednich warunkach.

15.2.1. Mikroorganizmy produkujące PHA

Polihydroksykwasy produkują bakterie, w tym sinice oraz archeony. Zdolność do syntezy PHA mają bakterie z rodzaju Rhizobium oraz Azotobacter (Azotobacter beijerinckii, Azotobacter macrocytogenes, Azotobacter vinelandii), gatunki należące do rodzaju Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Citrobacter, Cupriavidus, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Sphingobacterium i Yorkenella. Pewne mikroorganizmy syntetyzują PHA w warunkach nadmiaru źródła węgla, i deficytu azotu, a także obniżonej zawartości tlenu w środowisku (warunki stresowe), jak np. Cupriavidus necator, Mycobacterium extorquens czy Pseudomonas oleovorans. Inne mikroorganizmy syntetyzują PHA w fazie logarytmicznego wzrostu bez limitacji związków odżywczych, są to: Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, rekombinowany szczep Escherichia coli. Także autotroficzne Cyanobacteria (sinice) są zdolne do produkcji PHB. Spirulina platensis UMACC 161 i Synechocystis sp. PCC6803 mogą gromadzić PHB w ilości ok. 10% suchej masy komórek. Wśród archeonów produkujących PHA są halofile, zdolne do wzrostu przy wysokich stężeniach soli mineralnych: Haloferax, Haloarcula, Halococcus, Haloalkalicoccus, Halopiger, Haloquadratum, Natrinema i Natronobacterium.

W skali przemysłowej wykorzystuje się tylko takie mikroorganizmy, które magazynują ponad 80% PHA w suchej masie. Są to: Cupriavidus necator (dawniej Ralstonia eutropha), Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas putida, rekombinowana genetycznie Escherichia coli i Methylobacterium organophilum. Bakterie te rosną w podłożach fermentacyjnych zawierających kwasy organiczne, cukry, związki zawarte w serwatce lub melasie, Methylobacterium organophilum syntetyzuje kwas poli-3-hydroksymasłowy w podłożu z metanolem. Substratem dla Pseudomonas putida mogą być cukry proste lub glicerol. Do konstrukcji podłoża fermentacyjnego w skali przemysłowej do produkcji PHA wykorzystuje się różne źródła węgla, głównie odpady z przemysłu rolno-spożywczego. Są to:

1. 1) melasa z buraków cukrowych (produkcja 36 g PHA/L przez Azotobacter vinelandii) lub z trzciny cukrowej (60% suchej masy komórek Pseudomonas aeruginosa);

2. 2) serwatka i jej hydrolizaty (produkcja 96,2 g PHA/l przez rekombinowaną Escherichia coli CGSC 4401 posiadającą geny z Alcaligenes latus);

3. 3) odpadowe materiały ligninocelulozowe (siano, otręby, trociny, łupiny), wymagające wstępnej obróbki celem uwolnienia prostszych źródeł węgla jak cukry;

4. 4) glicerol odpadowy powstający przy produkcji biopaliw;

5. 5) kwasy tłuszczowe, będące odpadami przemysłu spożywczego, takie jak olej kokosowy, palmowy, olej kukurydziany i oliwa.

15.2.2. Genetyczna regulacja produkcji PHA

O produkcji odpowiednich biopolimerów decyduje system genetyczny odpowiedzialny za syntezę i kumulację PHA. Istnieją trzy główne typy loci PHB. Locus typu I składa się z trzech genów kodujących odpowiednio: polimerazę PHA (phbC), β-ketotiolazę (phaA) katalizującą syntezę acetylokoenzymu A i reduktazę acetylokoenzymu A (phbB), która redukuje acetylokoenzym A do R-3-hydroksymaślanokoenzymu A. Locus typu II składa się z dwóch różnych genów kodujących odpowiednio polimerazę PHA (phaC1 i phaC2), przedzielonych genem kodującym depolimerazę PHA (phaZ). Typ ten jest charakterystyczny dla bakterii z rodzaju Pseudomonas. Locus typu III składa się z dwóch genów (phbE i phbC) kodujących dwie podjednostki polimerazy PHA; ten typ jest charakterystyczny dla Chromatium vinosum, Thiocystis violacea. Mikroorganizmy mające locus PHA typu I i III gromadzą polihydroksykwasy o krótkim łańcuchu węgla, których monomery zawierają w swojej budowie 3–5 atomów węgla, natomiast należące do typu II – kumulują polihydroksykwasy o średniej długości łańcucha, których monomery zawierają od 6–16 atomów węgla.

15.2.3. Produkcja PHA przez Cupriavidus necator

Cupriavidus necator (dawniej Ralstonia eutropha) to gatunek bakterii należący do głównych producentów PHA. W skali przemysłowej komórki Cupriavidus są namnażane wstępnie na podłożu z glukozą jako źródłem węgla przez dwa tygodnie w niskiej temperaturze, a dwanaście godzin przed rozpoczęciem procesu syntezy PHA hodowle przenosi się do podłoża z glukozą i inkubuje w temp. 30°C. Po inkubacji inoculum przenosi się do fermentora z napowietrzaniem zawierającego podłoże z glukozą, na kolejne dwanaście godzin w temp. 30°C. Namnożone inoculum przenosi się do bioreaktora przemysłowego. Proces fermentacji przebiega w dwóch etapach prowadzonych w ściśle określonych warunkach (napowietrzanie, dostawiane pH, dostępne źródło węgla, azotu, fosforu):

1. 1) wzrostu mikroorganizmów,

2. 2) produkcji biopolimeru.

W tych warunkach komórki zawierają 45–80% PHA w suchej masie. Jeżeli źródłem węgla jest glukoza, syntetyzowany jest PHB, a jeśli kwas propionowy – w komórkach Cupriavidus necator powstają 3-hydroksymaślan i 3-hydroksywalerianian (3HB-co-3HV). Kopolimer jest bardziej elastyczny niż homopolimer PHB.

15.2.4. Produkcja PHA przez rekombinant Escherichia coli

Rekombinowana Escherichia coli zawiera geny szlaku biosyntezy PHA pochodzące od Cupriavidus necator przeniesione przez odpowiedni wektor. Rekombinowane komórki Escherichia coli mogą metabolizować zarówno glukozę, jak i kwas propionowy w homopolimery i/lub kopolimery PHA. Prowadzi to do zwiększenia wydajności procesu i uzyskania w suchej masie aż 90% PHB.

15.2.5. Zastosowanie PHA

Do PHA dodaje się komonomery takie jak 3HV (3-hydroksywalerianianu). PHA o niskiej zawartości komonomerów (HV do 5%) i względnie niskiej masie cząsteczkowej Mn = 500 000 g/mol są stosowane do produkcji materiałów opakowaniowych, takich jak: tacki, kubeczki jednorazowe, łyżeczki, talerzyki. PHA o masie cząsteczkowej Mn = 600 000 g/mol są wykorzystywane do produkcji włókien, nici chirurgicznych i odzieży wykorzystywanej na sali operacyjnej (biodegradowalnej). Kopolimery o zawartości HV ponad 10%, ze względu na swoje właściwości termoplastyczne, mogą być stosowane do produkcji folii w ogrodnictwie. Poliestry o Mn = 600 000–700 000 g/mol są stosowane do produkcji butelek i worków na odpady. Biopolimery, z zawartością HV w kopolimerze z HB powyżej 15%, są wykorzystać jako kleje lub do produkcji folii elastycznych.

15.3.Poliamidy

Klasycznym przykładem poliamidów jest kwas poli-γ-glutaminowy (γ-PGA). Jest on niezwykłym anionowym homopoliamidem zsyntetyzowanym z jednostek kwasu D- i L-glutaminowego połączonych wiązaniem amidowym pomiędzy grupami α-amino- jednego aminokwasu i grupą γ-karboksylową drugiego aminokwasu. Jest to wiązanie peptydowe. W zależności od obecnych reszt glutaminianu γ-PGA może być sklasyfikowane jako γ-L-PGA (tylko reszty kwasu L-glutaminowego), γ-D-PGA (tylko reszty kwasu D-glutaminowego) i γ-LD-PGA (reszty kwasu L- i D-glutaminowego). γ-PGA zawierające tylko izomer L- lub D- są rozpuszczalne w etanolu, podczas gdy zawierające równomolowe ilości izomeru L- i D- – wytrącają się w etanolu. Masa cząsteczkowa i stosunek kwasu D-L-glutaminowego γ-PGA zależą od gatunku bakterii i warunków wzrostu. Na przykład Bacillus anthracis wytwarza γ-PGA z kwasu D-glutaminowego [γ-(D)-PGA]; Natrialba aegyptiaca wytwarza γ-PGA z kwasu L-glutaminowego [γ-(L)-PGA]; Staphylococcus epidermidis wytwarza γ-(D, L)-PGA w stosunku 40% (D) i 60% (L); Bacillus licheniformis wytwarza różne rodzaje γ-(D, L)-PGA o zawartości D-glutaminianu w zakresie 10–100%; Bacillus megaterium wytwarza γ-PGA o zawartości D- i L- odpowiednio 30% i 70% (tab. 15.1).

Tabela 15.1. Przykładowe formy L/D g-PGA produkowane przez różne szczepy bakterii

Aminokwasy

Skład procentowy γ-PGA

Szczep produkujący

Lit.

D-glutaminian

100

Bacillus anthracis

[1]

L-glutaminian

100

Natrialba aegyptiaca

[2]

D-/L-glutaminian

60/40

Bacillus subtilis

[3] [4]

30/70

Bacillus megaterium

[5]

40/60

Staphylococcus epidermidis

[6]

10–100/10–90

Bacillus licheniformis

[7] [8]

[1] Hanby i Rydon. 1946. Biochem. J., 40: 297. [2] Hezayen i wsp. 2001. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51: 1133–1142. [3] Ashiuchi i wsp. 2003. J. Mol. Catal. B Enzym., 23: 101–106. [4] Choi i wsp. 2004. Agric. Chem. Biotechnol., 47: 60–64. [5] Shimizu i wsp. 2007. Appl. Environ. Microbiol., 73: 2378–2379. [6] Kocianova i wsp.2005. J. Clin. Investig., 115: 688–694. [7] Cromwick i Gross. 1995. Int. J. Biol. Macromol., 17: 259–267. [8] Thorne i wsp. 1958. J. Biol. Chem., 233: 1109–1112.

Manipulowanie składem zawartości izomerów w γ-PGA w celu zmiany jego właściwości jest zatem możliwe. Masa cząsteczkowa γ-PGA może również wpływać na jego właściwości i skuteczność dla określonych zastosowań. Pochodzący z syntezy przez mikroorganizmy γ-PGA ma na ogół stosunkowo dużą masę cząsteczkową (Mw od ok. 10^5 do 8 · 10^6 Da), wysoką lepkość i jest trudny do modyfikacji, co może ograniczać jego przemysłowe zastosowania. Ostatnio próbuje się różnych technik zmiany masy cząsteczkowej γ-PGA, głównie przez zastosowanie ultradźwięków. Istnieją cztery metody produkcji γ-PGA: synteza chemiczna, synteza peptydów, biotransformacja i fermentacja mikrobiologiczna. Fermentacja jest najbardziej opłacalna i ma wiele zalet – wykorzystuje tanie surowce, warunki reakcji są łagodne, wpływa minimalnie na zanieczyszczenie środowiska, pozyskuje się wysoką czystość produktów naturalnych. γ-PGA został odkryty w 1937 r. przez Brucknera i współpracowników jako część otoczki Bacillus anthracis. Od tego czasu znaleziono go w innych gatunkach we wszystkich trzech domenach życia (archeony, bakterie i eukarioty). Fizjologiczna funkcja γ-PGA u producentów nie jest do końca poznana, zależy od środowiska, w którym żyje organizm, oraz od tego, czy jest on związany z peptydoglikanem. Peptydoglikan związany γ-PGA może chronić komórki bakteryjne przed infekcjami fagowymi i zapobiega uzyskaniu dostępu do przeciwciał bakterii. γ-PGA syntetyzuje Staphylococcus epidermidis w celu ucieczki przed fagocytozą oraz wzmocnieniem zjadliwości. Co ważniejsze, γ-PGA mogą być uwalniane do środowiska, aby sekwestrować toksyczne jony metali, obniżać stężenie soli, zapewniać źródło węgla i chronić przed niekorzystnymi warunkami. γ-PGA może również poprawiać tworzenie biofilmów i wspomagać wchłanianie podstawowych składników odżywczych ze środowiska. Większość komercyjnych γ-PGA jest obecnie produkowana w drodze fermentacji mikrobiologicznej. W przeciwieństwie do większości materiałów białkowych, γ-PGA jest syntetyzowany w sposób niezależny od rybosomu. Substancje hamujące translację białek (takie jak chloramfenikol) nie mają wpływu na wytwarzanie γ-PGA. Jest on odporny na proteazy rozszczepiające wiązania α-aminowe. Co ważniejsze, ten biodegradowalny, rozpuszczalny w wodzie, jadalny i nietoksyczny biopolimer oraz jego pochodne mogą być bezpiecznie stosowane jako zagęszczacze, humektanty, środki łagodzące gorycz, krioprotektanty, materiały o przedłużonym uwalnianiu, nośniki leków, absorbery metali ciężkich i dodatki do pasz dla zwierząt.

15.3.1. Biosynteza mikrobiologiczna γ-PGA

Ostatnie informacje na temat genów i enzymów zaangażowanych w syntezę γ-PGA przyczyniły się do zaprojektowania systemów produkcyjnych ten polimer. Proponowany mikrobiologiczny szlak biosyntezy γ-PGA obejmuje jednostki kwasu L-glutaminowego dostępne egzogennie lub endogennie z zastosowaniem kwasu α-ketoglutarowego jako bezpośredniego prekursora. Biosynteza może być podzielona na trzy różne etapy:

1. 1) racemizacja,

2. 2) polimeryzacja,

3. 3) regulacja.

Ogólnie, γ-PGA jest syntetyzowany z izomerów D- lub L-glutaminianu samodzielnie lub z obu izomerów, ale włączenie L-glutaminianu (egzogennego lub endogennego) najpierw jest związane z uprzednim przekształceniem aminokwasu w D-glutaminian w reakcji racemizacji. W chromosomie Bacillus subtilis zidentyfikowano dwa homologi genu racemazy glutaminianowej (racE/glr i yrpC), a glr jest niezbędny do przekształcenia L-glutaminianu w D-glutaminian do syntezy γ-PGA. Co ciekawe, geny RacE i yrpC kodują enzymy cytozolowe o wysokiej selektywności dla glutaminianu i preferencji dla formy L, ale nie są odpowiedzialne za syntezę γ-PGA. Funkcje tych enzymów pozostają nieznane. Syntaza poliglutaminianowa (pgs) jest kodowana przez cztery geny (pgsB, C, A i E), a ich homologami w gatunkach rodzaju Bacillus są ywsC, ywtAB i capBCA. Ostatnio gen pgsBCA został zidentyfikowany jako jedyna maszyna odpowiedzialna za polimeryzację γ-PGA w miejscu aktywnego kompleksu syntazy (PgsBCA) w reakcji zależnej od ATP. PgsB i PgsC tworzą główne części miejsca katalitycznego, podczas gdy wydłużony łańcuch PgsA usuwa się z miejsca aktywnego, co jest konieczne do dodania następnego monomeru i transportu γ-PGA przez zwartą błonę komórkową. Stwierdzono, że rola genu pgsE w produkcji γ-PGA może być zbędna, a wysokie stężenia pgsB, pgsC i pgsA są zdolne do tworzenia γ-PGA w sytuacji braku pgsE. Odkryto, że pgsE jest niezbędne do produkcji γ-PGA w obecności jonów Zn2+ u Bacillus subtilis. Być może dlatego, że unikalna membrana związana z kompleksem PgsBCA jest wysoce niestabilna i hydrofobowa, co może wpłynąć na jego izolację. Synteza γ-PGA jest regulowana przez dwa systemy transdukcji sygnału: regulator ComP-ComA i dwuczęściowy system DegS-DegU, DegQ i SwrA. Rola DegQ została dokładnie zbadana, a zmieniony DegQ zapobiega syntezie γ-PGA i skutecznie obniża produkcję enzymów degradacyjnych. Jednak związek między SwrA i DegU nie jest dobrze poznany. Obecność zarówno SwrA, jak i ufosforylowanego DegU (DegU-P) może w pełni aktywować operon pgs do produkcji γ-PGA, wpływ obu genów na operon sgs w transkrypcji i produkcji γ-PGA jest znikomy. Wykazano, że wysoki poziom DegU-P może bezpośrednio aktywować ekspresję pgs do produkcji γ-PGA zamiast swrA. Ogólnie wydaje się, że DegSU, DegQ i ComPA biorą udział w regulacji transkrypcji w odpowiedzi na wykrywanie quorum sensing, osmolarność i sygnały zmienności fazy, podczas gdy SwrA wydaje się działać na poziom potranskrypcyjny.

15.3.2. Produkcja γ-PGA

Obecnie poliamid γ-PGA może być syntetyzowany przez gatunki Bacillus, Fusobacterium nucleatum, niektóre archeony i eukarioty, ale gatunki z rodzaju Bacillus są najczęściej stosowane w badaniach nad biologiczną produkcją γ-PGA. Bakterie jako producenci γ-PGA są albo zależne od obecności L-glutaminianu jak Bacillus subtilis CGMCC 0833 i Bacillus licheniformis P-104 lub niezależne od L-glutaminianu jak u Bacillus subtilis C1 i Bacillus amyloliquefaciens LL3. Do zwiększonej wydajności produkcji γ-PGA bakterie zależne od obecności kwasu L-glutaminowego można zachęcić przez zwiększenie stężenia L-glutaminianu, ale powoduje to znaczne zwiększenie kosztów produkcji. Zatem bakterie niezależne od L-glutaminianu są bardziej pożądane w przemysłowej produkcji γ-PGA ze względu na niski koszt produkcji i prosty proces fermentacji, mimo że ich wydajność redukcji γ-PGA jest na niższym poziomie. Głównym ograniczeniem produkcji γ-PGA są koszty. Do zwiększonej produkcji γ-PGA ostatecznie propaguje się Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis i Escherichia coli (tab. 15.2). Bacillus subtilis ogólnie uznano za posiadający status bakterii bezpiecznej (GRAS), dlatego można go wykorzystywać do produkcji enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym i medycznym, takich jak α-amylaza i proteazy. Izolacja szczepów Bacillus subtilis z doskonałymi zdolnościami produkcyjnymi γ-PGA została osiągnięta dzięki ich wszechobecności i zdolności do tworzenia przetrwalników. Jak pokazano w tabeli 15.2, wiele szczepów Bacillus subtilis jest szeroko stosowanych w produkcji γ-PGA. Bacillus subtilis szczep CGMCC 1250 wytwarza γ-PGA w ilości 101,1 g/l, co potwierdza jego potencjał metabolizmu do produkcji γ-PGA. Bacillus licheniformis, jest także organizmem niepatogennym stosowanym do produkcji γ-PGA. Szczepy rodzime bez manipulacji genetycznych mogą wytwarzać γ-PGA w ilości ponad 20 g/l.

Tabela 15.2. Wydajności produkcji poliamidu γ-PGA przez różne szczepy bakterii na podłożach syntetycznych lub półsyntetycznych w hodowlach laboratoryjnych w bioreaktorach w skali ułamkowej

Mikroorganizm

Źródło izolacji

Wydajność (g/l)

Lit.

Bacillus subtilis ZJU-7

sfermentowana fasola

101,1

[1]

Bacillus subtilis NX-2

z próbki gleby

71,2

[2]

52,1

[3]

Bacillus subtilis HB-1

z próbki gleby

28,1

[4]

Bacillus subtilis BL53

z próbki gleby

17,0

[5]

Bacillus subtilis Z15

China Center of Industrial Culture Collection

42,92±0,23

[6]

Bacillus amyloliquefaciens

brak informacji

111,2

[7]

[1] Huang i wsp. 2011. Eng Life Sci., 11: 291–297. [2] Xu i wsp. 2014. Bioresour. Technol., 155: 8–14. [3] Zhang i wsp. 2012. Bioresour Technol., 114: 583–588. [4] Zhu i wsp. 2014. J. Chem. Technol. Biotechnol., 89: 616–622. [5] Da Silva i wsp. 2013. Bioprocess Biosyst. Eng., DOI 10.1007/s00449-013-1016-1. [6] Zhang i wsp. 2018. Sci. Reports, 8: art. 17934. [7] Jose i wsp. 2018. Indian J. Biotechnol., 17: 44–49.

15.4.Polisacharydy bakteryjne

Polisacharydy bakteryjne EPS to polimery o dużej masie cząsteczkowej produkowane przez pewne typy mikroorganizmów:

1. 1) bakterie mezofilne takie jak Bacillus spp., Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Acetobacter spp., Escherichia coli oraz grzyby z rodzaju Aureobasidium;

2. 2) bakterie termofilne Thermococcus spp. i Sulfolobus spp.;

3. 3) bakterie halofilne: Haloferax spp., Halobacterium spp., Halococcus spp. i Halomonas spp.

Ponieważ biopolimery mikrobiologiczne służą jako materiał zapasowy lub jako część systemu ochronnego, mikroorganizmy będące producentami biopolimerów są lepiej przystosowane do pewnych warunków środowiskowych. Dekstran był pierwszym bakteryjnym polimerem odkrytym w winie przez Pasteura w połowie XIX w., a bakteria produkująca dekstran została nazwana Leuconostoc mesenteroides. Polisacharydy bakteryjne syntetyzowane i wydzielane przez różne mikroorganizmy do środowiska pozakomórkowego, jako rozpuszczalne albo nierozpuszczalne polimery, są nazywane EPS. Ich skład, funkcje, właściwości chemiczne i fizyczne, które ustalają ich pierwotną konformację, różnią się w zależności od gatunku bakterii. EPS składają się głównie z węglowodanów (różne reszty cukrowe) i pewnych podstawników niebędących węglowodanami (octan, pirogronian, bursztynian i fosforan). Polisacharydy produkowane przez mikroorganizmy można podzielić na:

1. 1) wewnątrzkomórkowe, zlokalizowane wewnątrz komórek i pełniące funkcje materiału zapasowego jak glikogen;

2. 2) polisacharydy otoczkowe jak antygen Escherichia coli O157:H7;

3. 3) pozakomórkowe, tworzone w komórce i wydzielane poza komórkę, zabezpieczające komórki przed stresami środowiskowymi, pełniące rolę materiału energetycznego;

4. 4) strukturalne (lipopolisacharydy, peptydoglikany, kwasy tejchowe) jako element ściany komórkowej, podtrzymujące jej sztywność i elastyczność lub zewnętrznej błony cytoplazmatycznej.

Generalnie polisacharydy strukturalnie zbudowane są z powtarzających się jednostek monosacharydów (pentoz, heksoz, aminocukrów lub kwasów uronowych) połączonych wiązaniami glikozydowymi (tab. 15.3).

Tabela 15.3. Gatunki bakterii/grzybów produkujące polisacharydy stosowane w różnych gałęziach gospodarki

Mikroorganizm

Polisacharyd

Monomer

Lit.

Leuconostoc mesenteroides

dekstran

glukoza

[1]

Xanthomonas sp.

ksantan

glukoza, mannoza, kwas glukuronowy

[2]

Leuconostoc dextranicum

glukan

glukoza

[3]

Gluconacetobacter xylinum

celuloza

glukoza

[4]

Sphingomonas elodea

gellan

glukoza, ramnoza, kwas glukuronowy

[5]

Sphingomonas paucimobilis

[6]

Halomonas eurihalina

lewan

fruktoza

[7]

Zymomonas mobilis

[8]

Pseudomonas aeruginosa

alginian

kwas guluronowy, kwas mannuronowy

[9]

Pseudomonas putida

[10]

Agrobacterium tumefaciens

sukcynylo--glukan

glukoza, galaktoza

[11]

Agrobacterium radiobacter

Rhizobium meliloti

[12]

Aureobasidium pullulans

pullulan

maltotrioza

[13]

[1] Falconer i wsp. 2011. Carbohydr. Polym., 364: 280–284. [2] Sanderson. 1982. Progress Food Nutrition Sci., 6: 77–87. [3] Majumder i Goyal. 2009. Food Res. Intern., 42, 525–528. [4] Huang i wsp. 2010. Bioresour. Technol., 101: 6084–6091. [5] Goncalves i wsp. 2009. Carbohydr. Polym., 77: 10–19. [6] Wu i wsp. 2011. J. Appl. Microbiol., 110: 422–430. [7] Béjar i wsp. 1998. J. Biotechnol., 61: 135–141. [8] Bekers i wsp. 2005. Process Biochem., 40: 1535–1539. [9] Schurks i wsp. 2002. Intern. J. Biol. Macromolec., 30: 105–111. [10] Celik i wsp. 2008. Carbohydr. Polym., 73: 178–182. [11] Kanedai wsp. 2002. Polymers, 43: 1301–1305. [12] Chouly i wsp. 1995. Intern. J. Biol. Macromolec., 17: 357–363. [13] Deshpande M.S., Rale V.B., Lynch J.M. 1992. Enzyme Microbial Technol., 14: 514–527.

Glikogen jest szeroko rozpowszechnionym rozpuszczalnym w wodzie jednorodnym polisacharydem z wiązaniami α-1,4-glikozydowymi w liniowych łańcuchach i wiązaniami α-1,6-glikozydowymi w punktach rozgałęzienia. Jako rezerwa węgla i energii glikogen dotychczas zidentyfikowano w archeonach, bakteriach i heterotroficznych eukariotach. Zwykle gromadzi się w ograniczonych warunkach wzrostu z nadmiernymi ilościami źródeł węgla przy niedoborze innych składników odżywczych. W niesprzyjających warunkach glikogen jako materiał zapasowy węgla i energii zostaje katabolizowany w celu utrzymania organizmów przy życiu. Wyniki analizy 55 genomów bakteryjnych wskazują, że utrata możliwości metabolizmu glikogenu może być związana z pasożytniczym trybem życia. Dalsze analizy genomu bakteryjnego 1202 gatunków potwierdziły, że bakterie niosące klasyczne geny metabolizmu glikogenu zajmują bardziej zróżnicowane nisze ekologiczne. Tak więc glikogen jest potencjalnym wskaźnikiem bakteryjnego stylu życia. Różnorodne badania eksperymentalne powiązały również glikogen z metabolizmem energii bakteryjnej, trwałością środowiska i wirulencją. To sugeruje, że glikogen odgrywa główną rolę w fizjologii bakterii przez szerokie powiązania między różnymi szlakami metabolizmu komórek.

W zależności od składu wyróżnia się dwie klasy EPS – homopolisacharydy i heteropolisacharydy.

1. 1) Homopolisacharydy są syntetyzowane z jednego typu monosacharydów takich jak D-glukoza lub α-fruktoza, tworząc pullulan, kurdlan, lewan lub rozgałęzione łańcuchy jak dekstran. Należą do nich:

a) α-D-glukany produkowane przez Leuconostoc mesenteroides;

b) β-D-glukany, syntetyzowane przez Pediococcus spp. i Streptococcus spp.;

c) fruktany, syntetyzowane przez Streptococcus salivarius;

d) poligalaktany, polisacharydy składające się ze spolimeryzowanej galaktozy.

1. 2) Heteropolisacharydy, takie jak jak ksantan, gellan, alginian i kwas hialouronowy, są zbudowane z dwóch lub więcej powtarzających się jednostek monosacharydów takich jak D-glukoza, D-galaktoza, L-ramnoza, L-fruktoza, a niektóre z nich powstają z N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc), N-acetylogalaktozoaminy (GalNAc) lub kwasu glukuronowego (GlcA).

EPS zostały również sklasyfikowane w siedmiu kategoriach na podstawie ich funkcjonalności jako:

1. 1) konstruktywne lub strukturalne (pomagają w retencji wody i ochronie komórek);

2. 2) sorpcyjne (złożone z naładowanych polimerów);

3. 3) aktywne powierzchniowo (w tym cząsteczki o zachowaniu amfifilowym, koloidalnym);

4. 4) aktywne;

5. 5) informacyjne;

6. 6) redoks aktywne;

7. 7) odżywcze.

EPS zapewnia ochronę komórek przed wysuszeniem, działaniem antybiotyków, substancji przeciwbakteryjnych, bakteriofagów i przyleganiem do innych bakterii, zwierząt i tkanek roślinnych w różnych warunkach stresowych, takich jak stresy biotyczne, konkurencja i stresy abiotyczne, w tym temperatura, natężenie światła lub pH. Dodatkowo EPS zapewnia agregację bakterii, przytwierdzanie do powierzchni i symbiozę mikroorganizmów z roślinami. Ponadto wytwarzane EPS sprzyja tworzeniu kłaczków osadu czynnego, biofilmu oraz granul osadu w różnych systemach oczyszczania ścieków oraz tworzeniu agregatów w glebie. Z produkcją otoczkowego EPS jest związana patogenność drobnoustroju. Stabilność biofilmu o ogromnej liczbie komórek, z którym często są związane mikroorganizmy, jest kontrolowana przez EPS przez interakcje między łańcuchami polisacharydowymi biofilmu. Ponadto różnorodność mikrobiologiczna jest wspierana przez EPS będący substratem dla wzrostu różnych mikroorganizmów. Tworzenie biofilmu odgrywa dużą rolę zarówno w adhezji, jak i w adaptacji bakterii do warunków fizykochemicznych środowiska. Czynniki środowiskowe i specyficzne warunki hodowli, takie jak pH, temperatura, stosunek węgla do azotu (C/N), tempo metabolizmu i źródła węgla, mogą wpływać na wytwarzanie EPS. Skład EPS może być zmieniany przez zmiany środowiskowe (różne monosacharydy lub stosunek molowy monosacharydów). Na przykład wykazano, że Lactobacillus casei zmienia skład chemiczny swojego EPS ze względu na źródło węgla. Bakteryjne EPS mają swoiste złożone struktury chemiczne, z których wynikają ich korzystne funkcje bioaktywne, biokompatybilność i biodegradowalność. Dzięki temu znajdują one szerokie zastosowanie w przemyśle chemicznym, spożywczym, farmaceutycznym, kosmetycznym, opakowaniowym, w rolnictwie i medycynie. Mogą być stosowane do produkcji klejów, absorbentów, smarów, kosmetyków, kapsuł do leków, tekstyliów, materiałów o wysokiej wytrzymałości, emulgatorów, środków zwiększających lepkość, środków zawiesinowych i chelatujących oraz środków poprawiających strukturę gleby. Ostatnio wyizolowano i zidentyfikowano kilka nowych bakteryjnych EPS, a niektóre z nich osiągnęły znaczącą wartość handlową. Bakteryjne EPS, takie jak ksantan, gellan, dekstran i kurdlan, o doskonałych właściwościach fizycznych i chemicznych są stosowane w różnych branżach zamiast polisacharydów roślinnych (gumy guar, pektyny) lub glonowych (karageniny lub alginianu).

Kolejne bakteryjne EPS o wyjątkowych właściwościach i aktywności biologicznej, takie jak lewan, pullulan i welan, znalazły nowe zastosowania komercyjne. GalactoPol, który jest syntetyzowany przez Pseudomonas oleovorans składa się głównie z galaktozy, a FucoPol, syntetyzowany przez Enterobacter A47 i zawiera fukozę. Prawie 30 gatunków bakterii kwasu mlekowego (LAB) produkuje polisacharydy, ale niskie wydajności produkcji nie pozwalają na komercyjne wykorzystanie gatunków LAB. Jeden z komercyjnych producentów dekstranu EPS – Leuconostoc mesenteroides – należy do bakterii kwasu mlekowego. Bakterie z rodzaju Lactobacillus są GRAS (ogólnie uznawane za bezpieczne), a ich EPS mogą być wykorzystywane w produkcji żywności.

15.4.1. Ksantan

15.4.1.1. Wiadomości ogólne

Ksantan – komercyjnie najważniejszy bakteryjny EPS – jest wytwarzany przez szczep patogeniczny roślin należących do Proteobacteria, Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Jest to heteropolisacharyd złożony z powtarzalnych jednostek pentasacharydowych składających się z jednostek monomerycznych: dwóch reszt glukozy, dwóch mannozy i jednej reszty kwasu glukuronowego oraz częściowo zestryfikowanych kwasów octowego i pirogronowego. Ksantan znalazł szerokie zastosowanie jako środek zagęszczający lub stabilizujący w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i wiertniczym. Został opisany jako „produkt wzorcowy” w zastosowaniach spożywczych i niespożywczych, które obejmują produkty mleczne, napoje, wyroby cukiernicze, produkty piekarnicze, syropy i karmę dla zwierząt domowych, a także oleje. Ksantan jest również stosowany do produkcji farmaceutyków, opatrunków i kosmetyków, w przemyśle papierniczym, jako dodatek do farb i tekstyliów, jako stabilizator dodatków paszowych dla bydła, substytutów mleka cielęcego, herbicydów rolniczych, fungicydów, pestycydów i nawozów, pasty do zębów. Biorąc pod uwagę komercyjne znaczenie ksantanu, przeprowadzono badania omiczne i rekonstrukcje modeli metabolicznych w celu wyjaśnienia mechanizmu jego biosyntezy. Zsekwencjonowano genomy pięciu szczepów Xanthomonas: szczep Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC 33913i 8004, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 85-10, Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331 i MAFF 311018, Xanthomonas axonopodis pv. citri 306. Kompletna sekwencja genomu szczepu Xanthomonas campestris pv. campestris B100 pozwoliła na zbadanie produktów genów i szlaków metabolicznych do polimeryzacji ksantanu. Produkty genów gumJ, gumC, gumD, i gumE zostały przeanalizowane w celu ustalenia szczegółowych funkcji w procesie polimeryzacji ksantanu. Ustalono model mechanistyczny biosyntezy ksantanu.

15.4.1.2. Mikrobiologiczna produkcja gumy ksantanowej

Przemysłowa produkcja gumy ksantanowej rozpoczęła się w 1970 r. Z biegiem lat stała się ona jednym z najważniejszych produkowanych przemysłowo anionowych heteropolisacharydów mającym szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, papierniczym, medycznym, farbiarskim i naftowym. Jest ona stosowana jako emulgator, zagęszczacz oraz pochłaniacz wody. Guma ksantanowa jest wygodniejsza w użyciu w porównaniu z innymi polisacharydami ze względu na właściwości, takie jak odporność na zmiany pH, odporność na obecność soli, stabilność wobec wielu enzymów, lepkość przy niskich stężeniach i odporność na degradację pod wpływem sił ścinania. Guma ksantanowa jest wytwarzana przemysłowo w procesie fermentacji. Techniki rekombinacji DNA służą zwiększeniu jej produkcji. Jest ona produkowana głównie przez bakterie z rodzaju Xanthomonas, np. szczepy Xanthomonas campestris NRRL B-1003, NRRL B1454, NRRL B-1043 i Sphingomonas sp. Składa się z powtarzających się jednostek pentasacharydu złożonych z glukozy, mannozy i kwasu glukuronowego w stosunku molowym 2 : 2 : 1 (rys. 15.1).

Rys. 15.1. Wzór jednostek pentasacharydu wchodzących w skład ksantanu, zbudowanych z dwóch reszt z glukozy, dwóch reszt mannozy i jednej reszty kwasu glukuronowego

Podstawowy łańcuch gumy ksantanowej składa się z monomerów β-D--glukozy, a jego łańcuch drugorzędowy obejmuje jeden kwas glukuronowy między dwiema cząsteczkami mannozy. Łańcuch drugorzędowy łączy łańcuch podstawowy w co drugiej części glukozy. Prekursory wymagane do wytwarzania gumy ksantanowej obejmują UDP-glukozę (urydynodifosforan glukozy), kwas UDP-glukuronowy (kwas urydyno-5′-difosfo-D-glukuronowy), i GDP-mannozę (glukozynodifosforan mannozy). Ugrupowania glikozylowe są przenoszone do nośników lipidowych za pomocą glikozylotransferazy. Po przeniesieniu ugrupowań glikozylowych do nośnika lipidowego dodaje się do nich reszty acetylowe i pirogronowe.

Wytwarzanie gumy ksantanowej przez Xanthomonas jest katalizowane przez system wieloenzymatyczny. Powtarzająca się jednostka gumy ksantanowej powstaje przez dodanie monosacharydu włączającego acetylo-CoA i fosfoenolopirogronian. Biosynteza gumy ksantanowej obejmuje następujące etapy:

1. 1) syntezę i pobieranie pochodnych nukleotydów;

2. 2) połączenie podjednostek pentasacharydu z izopentylem pirofosforanu;

3. 3) polimeryzację powtarzanych jednostek pentasacharydu.

Glukoza wchodzi do komórek Xanthomonas sp. zazwyczaj przez aktywny transport i w następnym etapie ulega fosforylacji z wytworzeniem glukozo-6-fosforanu (Glc-6P). Część Glc-6-P przekształca się w glukozo-1-fosforan (Glc-1-P) i fruktozo-1-fosforan (Fru-1-P) i w kolejnych etapach w polimery ksantanowe. W tym samym czasie niektóre Glc-6-P na ścieżce Entnera–Doudoroffa ulegają przekształceniu w fosfoenolopirogronian (PEP), który następnie ulega defosforylacji do pirogronianu. Reszty acetylu i pirogronianu łączą się z pentasacharydem. Biopolimer jest uwalniany z błony cytoplazmatycznej komórki przez zewnętrzną warstwę membrany. Proces ten wymaga energii i zachodzi za pośrednictwem określonego systemu transportowego. Długość łańcucha ksantanu zmienia się w zależności od:

1. 1) właściwości stosowanego szczepu bakteryjnego;

2. 2) składu podłoża fermentacyjnego;

3. 3) procesu downstream.

Średnia masa cząsteczkowa gumy ksantanowej wynosi 2 ⋅ 10^6 Da. Guma ksantanowa może być wytwarzana w procesie fermentacji glukozy, sacharozy i laktozy. Może zastąpić powszechnie stosowaną żelatynę w przemyśle spożywczym do wyrobów, które służą do przygotowywania potraw dla wegetarian.

15.4.1.3. Przemysłowa produkcja gumy ksantanowej

Produkcja ksantanu może być prowadzona w trzech typach hodowli:

1. 1) w hodowli na podłożu płynnym (zanurzeniowej, fermentacji wgłębnej);

2. 2) w hodowli na podłożu stałym;

3. 3) w hodowli na podłożu półpłynnym.

Hodowla na podłożu płynnym jest najdroższa, gdyż wymaga dużej ilości wody i ciągłego dostarczania powietrza, a w procesie ekstrakcji ksantanu dużej ilości etanolu lub alkoholu izopropylowego. Stosowanie hodowli na podłożu stałym lub półstałym jest znacznie tańsze, bo nie wymaga napowietrzania, zużywa znacznie mniej wody oraz odczynników do ekstrakcji ksantanu. W tabeli 15.4 przedstawiono wydajności produkcji ksantanu przez różne szczepy w różnych warunkach hodowli.

15.4.1.4. Mikroorganizmy produkujące ksantan

Guma ksantanowa może być wytwarzana w procesie fermentacji tlenowej przez bakterie Xanthomonas campestris oraz mieszankę szczepów Xanthomonas campestris z innymi szczepami Xanthomonas, takimi jak Xanthomonas carotae, Xanthomonas translucens, Xanthomonas vasculosum i Xanthomonas hederae. Korzystne do produkcji ksantanu są szczepy Xanthomonas campestris NRRL B-1459, NRRL B-1003, NRRL B-1043. Organizmy te namnaża się w hodowli wyjściowej (inoculum) przez 3–4 dni przed zaszczepieniem pożywki produkcyjnej. Wiadomo, że Xanthomonas campestris X59-1232 (ATCC-55258) znacznie zwiększa wydajność produkcji. Rekombinanty można uzyskać z następujących gatunków bakterii: Xanthomonas campestris, Xanthomonas albilineans, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas juglandis, Xanthomonas mannihotis, Xanthomonas gummoscidans i Xanthomonas aranopodis. Przygotowane sekwencje DNA wstawiane do wektora – plazmidu pRK 290-H336, są wklonowane do komórek biorcy lub dokonuje się wklonowania wielu kopii z wektora klonującego pRK293 i plazmidu pomocniczego pRK2013 (ATCC-37159). Genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy można stosować do zwiększonej produkcji gumy ksantanowej w celu poprawy jakości oraz ilości wytwarzanego egzopolisacharydu.

Tabela 15.4. Wydajność produkcji ksantanu przez wybrane szczepy bakterii

Mikroorganizm

Warunki hodowli

Wydajność (g/l)

Lit.

Xanthomonas campestris MO-03

40 g/l melasy z buraków + 4 g/l peptonu z piór kurcząt; temp. 30°C, 200 obr./min; czas hodowli 60 godz.

20,5

[1]

Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae 1230

50 g/l sacharozy; temp. 28±2°C; pH 7,0; 180 obr./min; czas hodowli 96 godz.

8,93

[2]

Xanthomonas campestris pv. campestris 254

9,49

Xanthomonas campestris pv. campestris 1078

9,69

Xanthomonas campestris NRRL B-1459

40 g/l glukozy + 2.1 g/l kwasu cytrynowego; temp. 28°C, pH 7,2, czas hodowli 72 godz.

11,19

[3]

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

10,96

Xanthomonas campestris NRRL B-1459

24 g/l glukozy + 0,8 g/l peptonu; bioreaktor obj. 2 l z mieszadłem; temp. 29°C; pH 7,0; tlen 70% ±10%; 200 obr./min; czas hodowli 18 godz.

600 obr./min przez 18–24 godz.;

700 obr./min do końca hodowli;

czas hodowli 48–54 godz.

10

[4]

Xanthomonas campestris pv. campestris 13 izolatów

3,4–15,3

Xanthomonas campestris pv. juglandis

7,3

Xanthomonas campestris pv. manihotis

9,0

Xanthomonas campestris pv. pruni

7,4

Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459

30 g/l glukozy; 30°C, 200 obr./min; czas hodowli 72 godz.

13,31

[5]

Mutant XC1473E2

17,30

Mutant XC1473E3

16,18

Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459

60 g/l glukozy; pH 7,0; czas hodowli 48 godz.; 180 obr./min

24,5

[6]

Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459

20 g/l glukozy; pH 7,0; 25°C; czas hodowli 96 godz.; 250 obr./min

30

[7]

Xanthomonas campestris ATCC 1395

175 g/l melasy; czas hodowli 24 godz.

53

[8]

[1] Ozdal i Karbanoglu. 2019. Fermentation, 5: 9. [2] Rottava i wsp. 2009. Carbohydr. Polym., 77: 65–71. [3] Demirci i wsp. 2017. Electr. J. Biotechnol., 30: 18–23. [4] Sanchez i wsp. 1997. World J. Microbiol. Biotechnol., 13: 443–451. [5] Kamal i wsp. 2003. Iranian Biomed. J., 7: 91–98. [6] Sahal i wsp. 2011. J. Food Process Eng., 34: 457–474. [7] Souw i Demain. 1979. Appl. Environ. Microbiol., 37: 1186–1192. [8] Kalogiannis i wsp. 2003. Process Biochem., 39: 249–256.

Rys. 15.2. Synteza ksantanu i metabolizm glukozy przez Xanthomonas campestris NRRL-1459; P – fosforan, Glc – glukoza, Man – mannoza Źródło: na podstawie Hsu C.H. i Lo Y.M. 2003. Characterization of xanthan gum biosynthesis in a centrifugal, packed-bed reactor using metabolic flux analysis. Process Biochemistry, 38: 1617–1625, zmienione.

15.4.1.5. Podłoże fermentacyjne do namnażania inoculum

Podłoże stosowane do fermentacji tlenowej zawiera co najmniej jedno źródło węgla (glukozę, maltozę lub skrobię), rozpuszczalne w wodzie źródło azotu (pepton lub ekstrakt drożdżowy), sól magnezową, jony fosforanowe i inne makro- i mikroelementy. Dodaje się także środek chelatujący taki jak kwas cytrynowy, aby utrzymać stabilność podłoża w obecności żelaza i innych pierwiastków śladowych. Optymalne pH wynosi 5,5–9,0. Podłoże do inoculum (1000 ml) przygotowuje się z 5 g glukozy, 5,4 g odtłuszczonej śruty sojowej, 2,1 g azotanu amonu, 0,05 g mikroelementów oraz dopełnia wodą do 1000 ml.

15.4.1.6. Inoculum

Procedurę fermentacji rozpoczyna się od przygotowania inoculum przez wprowadzenie pewnej ilości szczepu produkcyjnego z rodzaju Xanthomonas do podłoża fermentacyjnego pobranego ze skosu agarowego. Po uzyskaniu odpowiedniej gęstości komórek (po upływie 2–4 dni hodowli, w zależności od składu podłoża) całą zawartość inoculum przenosi się do podłoża fermentacyjnego (inoculum stanowi 5–10% całkowitej objętości podłoża fermentacyjnego). Hodowlę wytrząsaną (500 obr./min) prowadzi się w warunkach tlenowych w temp. 28°C.

15.4.1.7. Hodowla płynna (fermentacja zanurzeniowa, wgłębna)

Podłoże fermentacyjne (1000 ml) zawierające 50 g glukozy, 0,32 g azotanu amonu, fosforany i siarczan magnezu, 0,05 g mikroelementów i wodę do objętości 1 litra przed zaszczepieniem jest sterylizowane. Po zaszczepieniu podłoża produkcyjnego fermentacja przebiega w warunkach tlenowych z wytrząsaniem ~ 500 obr./min. Po uzyskaniu biomasy komórek większej niż 1 g/l, zwiększa się tempo wytrząsania z 500 do 800 obr./min. Po uzyskaniu biomasy komórek większej niż 2 g/l dodaje się świeże podłoże, usuwając wcześniej znaczną część płynu hodowlanego. Wytworzoną gumę ksantanową wytrąca się z użyciem alkoholu etylowego lub izopropylenowego. Dalej jest ona oddzielana albo przez filtrację, albo przez wirowanie. Obecność gumy ksantanowej potwierdza się analizą spektroskopii mas lub NMR. Pozostałość w płynie fermentacyjnym może służyć jako pasza dla zwierząt. Serwatka z odpadów mleczarskich może być stosowana do wytwarzania gumy ksantanowej. Serwatka powinna być wolna od białek globularnych, takich jak laktoglobulina, które usuwa się przez odpowiednie filtry. Realnie permeat zawiera laktozę oraz niewielkie ilości ciał stałych (około 5%). Do wytwarzania gumy ksantanowej z serwatki stosuje się bakterie zdolne do wykorzystania laktozy i wytwarzania gumy ksantanowej. Są to najczęściej bakterie genetycznie zmodyfikowane, zdolne do transformacji laktozy w gumę ksantanową. W procesie fermentacji powierzchniowej do konstrukcji podłoża produkcyjnego stałego lub półstałego zwykle stosuje się odpadowe źródła węgla, takie jak: ziemniaki lub odpady ziemniaczane, wytłoki jabłkowe, zużyte ziarna słodu, odpady cytrusowe, odpady z młynów oliwnych i wysłodki buraczane. Jeśli są stosowane ziemniaki, jest to podłoże skrobiowe. Podłoże stałe przygotowuje się przez pocięcie ziemniaków lub odpadów ziemniaczanych na małe kawałki wielkości do 2 cm. Nie dodaje się wody. W razie potrzeby podłoże jest nawodnione tylko do pewnego poziomu. W przypadku podłoża półstałego całkowita zawartość substancji stałych w medium powinna wynosić powyżej 6,5%, a hodowla powinna być napowietrzana przez wytrząsanie (100 obr./min). Podłoże zawierające odpady ziemniaczane i 0,25 g fosforanu dipotasowego w stosunku 20 : 1 nie zawiera innych dodatków oraz dodatkowej wody. Podłoże półpłynne dodatkowo zawiera niewielkie ilości wody. Przed zaszczepieniem podłoża są sterylizowane.

15.4.1.8. Fermentacja na podłożu stałym

Po zaszczepieniu hodowlę prowadzi się od przez ok. 72–144 godz., ponieważ wzrost organizmów nie zaczyna zwalniać aż do 72 godz. i nie ma znaczącego spadku tempa wzrostu przed upływem 144 godz. Hodowlę prowadzi się na wytrząsarce obrotowej lub wewnątrz bioreaktora walcowego i 5 obr/min. Po zakończeniu procesu fermentacji podłoże przemywa się, aż cała wytworzona guma ksantanowa zostanie w nim rozpuszczona. Wydajności produkcji ksantanu przez różne szczepy przedstawiono w tab. 15.4.

15.4.1.9. Odzyskiwanie ksantanu

Podczas izolowania z podłoża fermentacyjnego guma ksantanowa jest najpierw całkowicie rozpuszczana, a następnie wytrącana przy użyciu alkoholi. Podczas rozpuszczania najczęściej nie uzyskuje się klarownego roztworu. Dlatego po rozpuszczeniu można zastosować proteazy trawiące białka i następczo lizozym. Pomaga to w całkowitym odzyskaniu gumy ksantanowej bez żadnych strat. Płyn fermentacyjny jest wstępnie podgrzewany do odpowiedniej temperatury przed dodaniem proteazy, a następnie lizozymu. Guma jest następnie wytrącana przy użyciu etanolu lub izopropanolu. Wytrącający się osad oddziela się od płynu przez wirowanie lub filtrację. Skład oraz strukturę wytwarzania gumy ksantanowej sprawdza się za pomocą spektroskopii masowej lub NMR.

15.4.2. Lewan

Lewan to naturalnie występujący polimer, który składa się z β-D-fruk-tofuranozy z wiązaniami β (2→6) między pierścieniami fruktozy (rys. 15.3). Jest on syntetyzowany przez działanie wydzielanej lewansacharazy (EC 2.4.1.10), która bezpośrednio przekształca sacharozę w polimer. Jako homopolisacharyd o wielu wyróżniających właściwościach, takich jak wysoka rozpuszczalność w oleju i wodzie, silna adhezja, dobra kompatybilność i zdolność tworzenia błon, ma on wielki potencjał jako nowy funkcjonalny biopolimer w produkcji żywności, pasz, kosmetyków, farmaceutyków i przemyśle chemicznym.

Rys. 15.3. Reakcje stechiometryczne produkcji lewanu z sacharozy

Obecnie uważa się, że lewan razem z ksantanem, kurdlanem i pullulanem to polisacharydy najbardziej obiecujące do wykorzystania w różnych sektorów przemysłowych. Lewan jest wytwarzany jako EPS z substratów zawierających sacharozę przez wiele mikroorganizmów, w tym przez halofilną bakterię Halomonas smyrnensis AAD6T, która została opisana jako pierwszy producent lewanu. Ta Gram-ujemna halofilowa bakteria wydzielajaca duże ilości lewanu została wyizolowana z Camalti Saltern Area w Turcji.

Dzięki temu systemowi mikrobiologicznemu wydajności zostały dodatkowo poprawione przez zastosowanie tanich substytutów sacharozy, takich jak melasa. Dalsze badania nad potencjalnymi zastosowaniami lewanu produkowanego przez Halomonas smyrnensis AAD6T dotyczyły jego właściwości jako czynnika bioflokulującego, zdolności do tworzenia nanostrukturalnych cienkich biofilmów, przydatności jako nanonośnika dla leków oraz jego przylepności. Dalsze odkrycia ujawniły, że mannitol jest istotnym metabolitem do biosyntezy lewanu. Wydajność produkcji lewanu uzyskana z hodowli okresowej w bioreaktorze wynosi niecałe 2 g/l na podłożu zawierającym sacharozę jako jedyne źródło węgla. Dodanie mannitolu zwiększyło wydajność produkcji lewanu prawie czterokrotnie. Stosunkowo długa jest lista mikroorganizmów produkujących lewan, przy czym szczepy dzikie produkują jego niewielkie ilości lub ilości nieprzekraczające kilkunastu gramów na litr. W hodowli okresowej w optymalnych warunkach szczep Bacillus licheniformis jest w stanie wyprodukować 18 g/l lewanu w czasie 68 godz. trwania hodowli. Bakterie produkujące lewan należą do gatunków Acetobacter pasteurianum,Achromobacter sp.,Aerobacter aerogenes, Aerobacter levanicum,Arthrobacter ureofaciens,Azotobacter chroococcum,Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium,Bacillus methylotrophicus, Paenibacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus, Gluconobacter oxydans, Gluconacetobacter diazotrophicus, Leuconostoc mesenteroides,Mycobacterium levaniformans,Pantoea agglomerans,Pseudomonas aureofaciens,Pseudomonas chlororaphis,Pseudomonas fluorescens, Serratia levanicum, Streptococcus sp.,Streptococcus salivarius,Xanthomonas sp.,Xanthomonas campestris pv. pruni,Zymomonas mobilis oraz kilku gatunków promieniowców jak Actinomyces viscosus,Corynebacterium levaniformans i Rothia dentocariosa. Do producentów lewanu należą też grzyby strzępkowe: Aspergillus sydowi i Aspergillus versicolor. Większość strategii stosowanych do tej pory w celu zwiększenia produkcji lewanu była ograniczona do optymalizacji warunków fizykochemicznych procesu fermentacji, a ze strategii inżynierii metabolicznej do poprawy produkcji lewanu zostało wykorzystanych tylko kilka. Wpływ zakłócenia pozakomórkowego genu sacharazy Zymomonas mobilis (sacC) na produkcję lewanu wykazał, że szczep mutanta genu sacC uzyskał trzykrotnie wyższą aktywność lewansacharazy (SacB) niż szczep dziki, a wydajność produkcji lewanu wzrosła z 15,5 g/l do 21,2 g/l. Podobną modyfikację genetyczną przeprowadzono u Lactobacillus reuteri, wykazując, że rozerwanie genu scrP fosforylazy sacharozy (kodującego enzym hydrolizy sacharozy) również zwiększyło wytwarzanie lewanu. Inną metodą poprawy produkcji lewanu jest nadekspresja genu sacB. Nadekspresja genu sacB przy użyciu plazmidu pLSD19 w szczepie Zymomonas mobilis Zsuc1 mutanta sacharozy spowodowała, że produkcja lewanu wzrosła z 5 g/l do 10,7 g/l w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Szczep NK-ΔLP Bacillus amyloliquefaciens może wytwarzać lewan o wysokiej czystości i małej masie cząsteczkowej, ale jego produkcja jest stosunkowo niska. Aby zwiększyć produkcję lewanu, sześć zewnątrzkomórkowych genów proteazy (bpr, epr, mpr, vpr, nprE i aprE) wraz z genem tasA (kodującym główne białko macierzy biofilmu TasA) i klastrem pgsBCA (odpowiedzialnym za syntezę kwasu poli-γ-glutaminowego (γ-PGA)) zostało wklonowane do szczepu NK-1 Bacillus amyloliquefaciens. Najwyższą produkcję lewanu (31,1 g/l) otrzymano ze szczepu NK-Q-7 (ΔtasA, Δbpr, Δepr, Δmpr, Δvpr, ΔnprE, ΔaprE i ΔpgsBCA), którego wydajność produkcji lewanu była o 103% wyższa niż NK-ΔLP szczepu (ΔpgsBCA) (15,3 g/l).

Tabela 15.5. Wydajność produkcji lewanu przez wybrane szczepy bakterii w hodowlach okresowych na podłożach zawierających sacharozę lub pochodne

Szczep/gatunek bakterii

Substrat

Wydajność (czas trwania hodowli)

Lit.

Bacillus amyloliquefaciens NK-DLP

250 g/l sacharozy

22,6 g/l (48 godz.)

[1]

Bacillus amyloliquefaciens NK-Q-7

250 g/l sacharozy

31,1 g/l (48 godz.)

[2]

Bacillus lentu V8

250 g/l sacharozy

57,85 g/l (60 godz.)

[3]

250 g/l melasy z trzciny cukrowej

49,86 g/l (60 godz.)

Bacillus licheniformis NS032

196,8 g/l sacharozy

397,6 g/l sacharozy

47,8 g/l (96 godz.)

99,2 g/l (96 godz.)

[4]

Bacillus methylotrophicus SK21.002

300 g/l sacharozy

100 g/l (120 godz.)

[5]

Bacillus subtilis (natto) Takahashi

250 g/l sacharozy

250 g/l sacharozy + pulsowe dokarmianie (30 mg/ml)

61,46 g/l (24 godz.)

100 g/l (120 godz.)

[6]

Bacillus subtilis (natto) CCT7712

400 g/l

111,6 g/l (16 godz.)

[7]

Paenibacillus polymyxa EJS-3

188 g/l sacharozy

35,26 g/l (60 godz.)

[8]

Serratia levanicum NN

200 g/l sacharozy

50 g/l (178 godz.)

[9]

Zymomonas mobilis CCT-4494 zimmobilizowane

300 g/l sacharozy

112,5 g/l (18 godz.)

[10]

[1] Feng i wsp. 2015. FEMS Microbiol. Lett., 362: 1–7. [2] Feng i wsp. 2015. Sci. Rep., 5, 13814. http://dx.doi.org/10.1038/srep13814. [3] Abou-talebi wsp. 2015. Br. Microbiol. Res. J., 5: 22–32. [4] Kekez i wsp. 2015. Appl. Biochem. Biotechnol., 175: 3068–3083. [5] Zhang i wsp. 2014. Carbohydr. Polym., 101: 975–981. [6] Wu i wsp. 2013. J. Taiwan Inst. Chem. Eng., 44: 846–853. [7] dos Santos i wsp. 2013. Rom. Biotechnol. Lett., 18: 8413–8422. [8] Liu i wsp. 2010. Carbohydr. Polym., 79: 206–213. [9] Kikuchi i wsp. 2010. J. Biosci. Bioeng., 109: 240–243. [10] Lorenzetti i wsp. 2015. J. Food Process Eng., 38: 31–36.

Lewan jest produkowany z substratów zawierających sacharozę i wydzielany pozakomórkowowo przez różne bakterie (tab. 15.5). Na wytwarzanie lewanu znaczący wpływ mają warunki fermentacji, takie jak temperatura, pH, stężenie tlenu, budowa bioreaktora i skład podłoża fermentacyjnego. Ogólnie produkcja lewanu jest związana ze wzrostem mikroorganizmów. Po enzymatycznym rozszczepieniu sacharozy, do rosnącego łańcucha lewanu jest dodawane ugrupowanie fruktozy. Część uwolnionej glukozy jest metabolizowana w czasie wzrostu mikroorganizmów, reszta gromadzi się w podłożu fermentacyjnym. Do produkcji można stosować zarówno wolne, jak i unieruchomione komórki, a fermentację można prowadzić w hodowli okresowej (wsadowej), półciągłej lub ciągłej. Syropy i melasy są tanimi substytutami sacharozy często stosowanymi jako substraty do fermentacyjnej produkcji polisacharydów mikrobiologicznych. Komórki Bacillus lentus V8 produkują lewan na podłożu z melasą z trzciny cukrowej, a komórki Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 – na podłożu z melasą z buraków cukrowych i syropie z trzciny cukrowej.

15.4.3. Pullulan

15.4.3.1. Właściwości i produkcja pullulanu

Został opisany po raz pierwszy przez Bauera w 1938 r. Jest polimerem polisacharydowym produkowanym głównie przez grzyb Aureobasidium pullulans w postaci amorficznego osadu. Regularnie powtarzającą się jednostką strukturalną pullulanu jest trimer maltotriozy α-(1→4)Glup-α-(1→4)Glup-α-(1→6)Glup- wytwarzany pozakomórkowo przez Aureobasidium pullulans – grzyb mitosporyczny znany wcześniej jako Pullularia pullulans (Syn: Dematium pullulans de Bary). W polimerowym łańcuchu pullulanowym mogą występować także inne struktury, w szczególności tetramer lub maltotetrozan α-(1→4)-Glup-α-1→4)Glup-a-(1→4)Glup-α-(1→6)Glup- (rys. 15.4).

Rys. 15.4. Wzór strukturalny cząsteczki pullulanu

Masa cząsteczkowa pullulanu (C_6H_10O_5)n kształtuje się w zakresie od 4,5 · 10^4 do 6 · 10^5 Da w zależności od parametrów procesu fermentacji. Bioaktywność pullulanu zależy od jego średniej masy cząsteczkowej i rozkładu masy cząsteczkowej. Dzięki unikalnemu wzorowi łączenia pullulan ma swoiste właściwości fizyczne, takie jak zdolność klejenia, zdolność do tworzenia włókien oraz cienkiej i biodegradowalnej folii, która jest przezroczysta i nieprzepuszczalna dla tlenu. W rezultacie pullulan jest od dawna stosowany jako substytut osocza krwi, dodatek do żywności, dodatek adhezyjny i flokulant. Zainteresowanie nim rośnie z powodu nowych zastosowań związanych ze zdrowiem człowieka.

[α-D-glukoza-(1→4)-α-D-glukoza-(1→4)-α-D-glukoza-(1→6)]n

Aureobasidium pullulans istnieje w pięciu różnych formach morfologicznych. Są to komórki drożdżopodobne, młode blastospory, spęczniałe blastospory, chlamydospory i strzępki grzybni. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że wydajność pullulanu zależy od morfologii grzyba, nie ma zgody co do tego, który typ morfologiczny komórek jest odpowiedzialny za jego produkcję. Komórki drożdżopodobne, komórki spęczniałe i chlamydospory były uważane za głównych producentów pullulanu, ale sprawa nie została przesądzona. Pullulan jest syntetyzowany wewnątrzkomórkowo na błonie ściany komórkowej i wydzielany na powierzchnię komórek w postaci warstwy śluzu. Mimo intensywnych badań cech cytologicznych i fizjologicznych Aureobasidium pullulans nie poznano jeszcze dokładnie mechanizmu biosyntezy pullulanu. Do produkcji pullulanu Aureobasidium pullulans wykorzystuje różne cukry jak glukozę, sacharozę, mannozę, galaktozę, maltozę, fruktozę, a nawet odpady rolnicze jako źródła węgla. Najlepszymi źródłami węgla są glukoza, sacharoza i dekstryna. Alternatywnie można też stosować podłoża płynne zawierające różne odpady z warzyw i owoców z różną wydajnością (tab. 15.6).

Tabela 15.6. Wydajności produkcji pullulanu przez różne szczepy Aureobasidium pullulans w podłożach z różnymi odpadami rolniczymi

Szczep

Wydajność g/l

Rodzaj odpadów rolniczych

Typ fermentacji

Lit.

Aureobasidium pullulans

38,3

woda kokosowa

SmF

[1]

58,0

mleczko kokosowe

SmF

A. pullulans AP329

29,35

słodkie ziemniaki

SmF

[2]

A. pullulans NRRLY 6220

22,3

ekstrakt z miazgi skórek winogron

SmF

[3]

30,8

hydrolizat skrobi ziemniaczanej

A. pullulans NRRLY 6220

58,0

hydrolizat skrobi ziemniaczanej

SmF

[4]

A. pullulans RBF 4A3

83,98

odolejone nasiona jatrofy

SmF

[5]

A. pullulans RBF 4A3

66,25

mieszanka odolejonych nasion jatrofy, jaggery i wyciągu z kukurydzy

SmF

[6]

A. pullulans P56

32,0

melasa buraczana

SmF

[7]

11,0

odbiałczona serwatka

SmF

[8]

A. pullulans MTTC 1991

27,5

odpady skrobi kassawy

SSF

[9]

A. pullulans 2552140B i 142

12–14

hydrolizat buraczany

SmF

[10]

A. pullulans NRRL Y-2311-1 i NRRL Y-6220

19–30

sacharoza + olej sojowy

SmF

[11]

A. pullulans NCIM 1049

34,22

nasiona jackfruit

SSF

[12]

SmF – fermentacja wgłębna, SSF – fermentacja powierzchniowa

[1] Thirumavalavan i wsp. 2009. Afr. J. Biotechnol., 8: 254–262. [2] Wu i wsp. 2009. Carbohydr. Polym., 76: 645–649. [3] Israilides i wsp. 1998. Appl. Microbiol. Biotechnol., 49: 613–617. [4] Barnett i wsp. 1999. Carbohydr Polym., 38: 203–20. [5] Choudhury i wsp. 2012. Microb Cell Factories, 11: 39. [6] Mehta i wsp. 2014. Int. J. Biol. Macromol., 64: 252–256. [7] Roukas. 1998. Process Biochem., 33: 805–810. [8] Roukas. 1999. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22: 617–621. [9] Ray i Moorthy. 2007. J. Sci. Ind. Res., 66: 252–255. [10] Leduy i Boa. 1977. Can. J. Microbiol., 29: 143–146. [11] Sena i wsp. 2006. Braz. J. Chem. Eng., 23: 507–515. [12] Sugumaran i wsp. 2013. Carbohydr. Polym., 98: 854–860.

Pobrane lub przekształcone cząsteczki cukrów przetworzone w cząsteczki glukozy są wykorzystywane do syntezy pullulanu. W fazie przygotowawczej glukoza jest fosforyzowana do glukozo-6-fosforanu przy udziale enzymu heksokinazy, glukozo-6-fosforan jest konwertowany do glukozo-1-fosforanu przy udziale fosfoglukomutazy. W procesie syntezy pullulanu Aureobasidium pullulans wykorzystuje trzy enzymy – mutazę α-fosfoglukozową, pirofosforylazę glukozo-fosforanową urydyny (pirofosforylazę UDPG) i glukozylotransferazę, które biorą udział w polimeryzacji jednostek glukozy podczas biosyntezy pullulanu (rys. 15.5).

Rys. 15.5. Schemat biosyntezy prekursorów pullulanu Źródło: Duan X.H., Chi Z.M., Wang L., Wang X.H. 2008. Influence of different sugars on pullulan production and activities of a-phosphoglucose mutase, UDPG-pyrophosphorylase and glucosyltransferase involved in pullulan synthesis in Aureobasidium pullulans Y68. Carbohydr. Polym., 73: 587–593. Za zgodą CCC.

Pierwszym ważnym etapem w syntezie pullulanu jest utworzenie kompleksu UDPG (urydynodifosforanu glukozy) przez połączenie urydyno-5′-difosforanu z glukozą przy udziale pirofosforylazy UDPG. Związek ten niesie glukozę i przyłącza ją do cząsteczki lipidu (LPh) za pomocą mostka fosfoestrowego, z czego powstaje kompleks LPh-Glc. W drugim etapie, kolejna cząsteczka UPDG przenosi cząsteczkę glukozy do kompleksu LPh-Glc, tworząc izomaltozyl (LPh-Glc-(6←1)-Glc), który po przyjęciu następnej cząsteczki glukozy tworzy izopanozyl (LPh-Glc-(6←1)-Glc-(4←1)-Glc) będący prekursorem pullulanu. Reszty izopanozylu są polimeryzowane w łańcuch pullulanu. Schemat ten dotyczy powstawania pullulanu, gdy podłoże fermentacyjne zawiera glukozę lub/oraz cukry zbudowane tylko z glukozy lub glukozy i fruktozy (sacharozy). Nie wszystkie szczepy Aureobasidium pullulans są zdolne do produkcji pullulanu. Pullulan jest produkowany przez saprofityczny grzyb Tremella mesenterica, pasożytnicze grzyby Cytaria harioti i Cytaria darwinii oraz przez grzyb powodujący zarazę kasztanowca Cryphonectria parasitica. Ponadto do produkcji pullulanu zdolne są Teloschistes flavicans i Rhodotorula bacarum.

Większość prac dotyczy kontroli syntezy pullulanu oraz jednoczesnej morfologii komórek. Wiele uwagi poświęcono źródłom węgla oraz składnikom odżywczym stosowanym w podłożach do produkcji oraz warunkom fizykochemicznym fermentacji, takim jak pH, temperatura, obecność jonów Zn+2, Fe+2, Mn+2, Ca+2 i Cu+2. Znaczne przeszkody napotykane podczas produkcji pullulanu są powodowane przez wysoką lepkość podłoża fermentacyjnego i pigmentacji melaniny. Po zakończeniu fermentacji płyn fermentacyjny składa się z komórek grzybów Aureobasidium pullulans i resztek komórkowych, resztkowych składników odżywczych i metabolitów pozakomórkowych wytwarzanych i wydalanych podczas fermentacji. Izolaty Aureobasidium pullulans wymagają do produkcji pullulanu określonych optymalnych warunków. Cukry takie jak sacharoza, glukoza, fruktoza, maltoza, skrobia lub maltooligosacharydy wspomagają produkcję pullulanu przez Aureobasidium pullulans. Cukry, takie jak ksyloza, arabinoza, mannoza, galaktoza, ramnoza i laktoza, choć stosowane rzadziej, również wspierają produkcję pullulanu, ale z obniżoną wydajnością. Stwierdzono korelację między morfologią Aureobasidium pullulans a produkcją pullulanu, ale jej przyczyna nie jest jeszcze poznana. Pullulan jest wytwarzany w późnej fazie logarytmicznego wzrostu i wczesnej fazie stacjonarnej hodowli głównie przez komórki drożdżopodobne, a szybkość jego syntezy nie zależy od wartości pH. Dla porównania, w warunkach laboratoryjnych mieszanina 50% komórek drożdżopodobnych i strzępkowych sprzyja produkcji pullulanu. Produkcja pullulanu w hodowlach okresowych jest związana z tworzeniem komórek drożdżopodobnych, zwłaszcza w obecności soli amonowych. Optymalną wydajność pullulanu uzyskano w hodowli przy początkowym pH 6,0. Produkcję pullulanu prowadzić można w hodowlach okresowych, fermentacji półciągłej oraz w hodowli ciągłej na podłożu płynnym w postaci zawiesiny lub z komórkami unieruchomionymi na fazie stałej w postaci kulek żelowych wyprodukowanych na bazie alginianu wapnia.

15.4.3.2. Zastosowanie pullulanu

Pullulan dostarcza niewiele kalorii i jest traktowany jako błonnik dla ludzi, ponieważ jest odporny na amylazy ssaków. Pullulan w diecie działa jako prebiotyk, promując wzrost pożytecznych szczepów z rodzaju Bifidobacterium. Może być wprowadzany zarówno do stałej, jak i płynnej żywności, zastępując skrobię, lub częściowo jako zamiennik w makaronach i wypiekach. Pullulan poprawia trwałość żywności, ponieważ nie jest łatwo przyswajalnym źródłem węgla dla bakterii, pleśni i grzybów odpowiedzialnych za psucie się żywności. Może być stosowany jako wypełniacz o niskiej lepkości w napojach i sosach, do stabilizacji jakości i tekstury majonezu. Ogrzewanie, zmiany pH, obecność jonów metali, w tym chlorku sodu, nie wpływają na zmianę lepkości roztworów pullulanu. Można go stosować jako środek wiążący i stabilizator w pastach spożywczych, do przyklejania orzechów do ciastek, a także jako spoiwo do tytoniu, powłok nasion i nawozów roślinnych.

Folie pullulanowe są przezroczyste i wysoce nieprzepuszczalne dla tlenu, mają doskonałe właściwości mechaniczne. Folia pullulanowa zawiera zwykle 5–10% pullulanu i może być tak cienka, jak 5–60 µm. Folie łatwo rozpuszczają się w wodzie, dzięki czemu mają właściwości topienia się w ustach jako jadalne powłoki żywnościowe. Odporność na tlen folii pullulanowych jest wykorzystywana do ochrony łatwo utleniających się tłuszczów i witamin w żywności. Folie pullulanowe można stosować jako materiał do powlekania lub pakowania suszonej żywności, w tym orzechów, makaronów, wyrobów cukierniczych, warzyw i mięs lub jako szkliwo ochronne. Pullulan jest określany jako powoli trawiony węglowodan, ponieważ ludzkie enzymy stopniowo przekształcają go w glukozę, co powoduje powolny wzrost poziomu glukozy we krwi. Może być włączony do dietetycznych przekąsek przeznaczonych dla diabetyków, dla pacjentów z upośledzoną tolerancją glukozy.

Pullulan i jego pochodne można stosować jako klej do protez. Kleje lub pasty wytwarza się przez rozpuszczenie lub dyspergowanie jednorodnego estru pullulanu i/lub eteru pullulanowego w wodzie lub w mieszaninie wody i acetonu. Powlekane kompozycje farmaceutyczne, takie jak tabletki, pigułki, granulki zawierają w warstwie cukru pullulan, który zabezpiecza je przed zmianą koloru w czasie. Pullulan można stosować do powłok farmaceutycznych, w tym preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Produkty do pielęgnacji jamy ustnej zostały skomercjalizowane na bazie folii pullulanu. Bezbarwna, przezroczysta i jadalna folia pullulanowa wzbudziła również duże zainteresowanie jako materiał opakowaniowy niezanieczyszczający. Pochodne pullulanu są nietoksycznymi koniugantami do szczepionek. Pullulan może dostarczać liposomy. Frakcje pullulanu o masie cząsteczkowej 30 000–90 000 Da można stosować jako ekspandery osocza krwi zamiast dekstranu. Pullulan jest stosowany w płynach kosmetycznych, pudrach, kremach pod oczy, kremach do twarzy, szamponach, a także do wyrobu specjalnych opatrunków i proszków do zębów, ponieważ nie działa drażniąco na ludzkie ciało. Pullulan można formować w postaci włókna przypominającego nylon lub sztuczny jedwab przez przędzenie na mokro lub na sucho. Wyroby przypominające polistyren lub alkohol poliwinylowy można wytworzyć z pullulanu przez sprasowanie lub wytłaczanie. Powierzchnia uformowanej żywicy typu pullulan jest pokryta termoutwardzalną folią żywiczną. Formowane żywice typu pullulan są przezroczyste, odporne na obciążenia dynamiczne, nieprzepuszczalne dla gazów i zanieczyszczeń. Nowy materiał do powlekania papieru zawierający pullulan ma doskonały połysk, połysk druku, wytrzymałość kleju i stabilną lepkości podczas przechowywania. Pullulan ma doskonałe właściwości jako klej do powlekania papieru. Papier pullulanowy ma wysoką wytrzymałość i odporność na składanie, jest twardszy niż papier z pulpy drzewnej. Sprzyja przyjmowaniu atramentu ze względu na jego wysoką hydrofilowość, dzięki czemu nadaje się do drukowania i pisania. Pullulan i jego pochodne mają również zastosowania w fotografii, litografii i elektronice. Żele pullulanowe są stosowane do unieruchamiania enzymów, które zachowują wysoką aktywność. Pullulan cyjanoetylowany ma dużą odporność cieplną, jest rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych, tworzy folie i można go sklejać z metalami.

15.4.4. Dekstran

15.4.4.1. Właściwości dekstranu

Nazwa „dekstran” została po raz pierwszy użyta przez Scheiblera w 1874 r., który odkrył, że soki z trzciny cukrowej i buraków były tajemniczo zagęszczone przez węglowodan o empirycznym wzorze C_6H_10O_6. Wcześniej, w 1861 r. Pasteur wykazał, że śluzy te były spowodowane aktywnością mikroorganizmów, a van Tieghem nazwał bakterię produkującą dekstran Leuconostoc mesenteroides. Późniejsi badacze wykazali, że dekstran może też być produkowany przez kilka innych gatunków bakterii. Dokładna struktura każdego rodzaju dekstranu zależy od specyficznego szczepu mikroorganizmów.

Hehre w 1941 r. doniósł o pierwszej bezkomórkowej syntezie dekstranu z użyciem sacharozy jako substratu z dodatkiem dekstranu enzymatycznego. Dekstranosacharaza jest głównym enzymem, który katalizuje syntezę dekstranu z sacharozy. Dekstrany na ogół różnią się masą cząsteczkową, rozmieszczeniem przestrzennym, typem oraz długością rozgałęzień, w zależności od szczepu i warunków hodowli. Badania dekstranów produkowanych przez 96 szczepów (głównie Leuconostoc mesenteroides) wykazały, że liczba wiązań α-(1→6) w określonym dekstranie może zmieniać się od 50% do 97% całkowitej liczby wiązań glikozydowych. Oprócz wiązań (1→6) w łańcuchu głównym, dekstrany zawierają również wiązania α-(1→2), α-(1→3) i α-(1→4). Rozgałęzione dekstrany są prebiotykami i potencjalnymi czynnikami antynowotworowymi. Dekstrany są zewnątrzkomórkowymi homopolisacharydami bakteryjnymi zbudowanymi z liniowych jednostek powtarzalnych D-glukopiranozylu. Istnieją cztery różne typy α-D-glukanu produkowane przez LAB:

1. 1) dekstran, zawierający ponad 50% wiązań α-(1→6) w łańcuchu głównym oraz wiązania rozgałęzione α-(1→2), α-(1→3) lub α-(1→4), syntetyzowany przy udziale dekstransacharazy (E.C. 2.4.1.5) przez Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus, Weissella i Pediococcus;

2. 2) mutan zawiera większość wiązań α-(1→3) w łańcuchu głównym, syntetyzowany przy udziale mutansacharazy (E.C.2.4.1.5) przez gatunki Streptococcus;

3. 3) alternan zawierający naprzemienne wiązania α-(1→3) i α-(1→6), syntetyzowany przy udziale alternansacharazy (EC 2.4.1.140) tylko przez Leuconostoc mesenteroides;

4. 4) reuteran zawierający wiązania α-(1→4) występujący tylko w Lactobacillus reuteri.

Dekstran występuje naturalnie w małych ilościach w żywności, takiej jak rafinowany cukier krystaliczny, syrop klonowy, sok z kapusty kiszonej i miód, a także jako składnik płytki nazębnej. Jedyny enzym przemysłowy stosowany w komercyjnej produkcji dekstranu jest wytwarzany przez bakterie z kilku rodzajów LAB, a mianowicie Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus i Weissella. Struktura każdego typu dekstranu zależy od szczepu bakterii, a tym samym od konkretnej transdukcji. Do tej pory komercyjnie dekstran jest wytwarzany z Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F i służy jako model do badania struktury dekstranu i mechanizmu jego biosyntezy przez dekstransacharazę. Ilość wytwarzanego dekstranu jest jednak praktycznie niewystarczająca, aby sprostać wymaganiom różnych gałęzi przemysłu, stąd istnieje potrzeba izolacji i charakterystyki szczepów LAB wytwarzających dekstran w dużych ilościach. W tabeli 15.7 wymieniono kilka przykładów dekstranu i wzory ich wiązań z LAB wyizolowanych z różnych źródeł żywności.

Enzym dekstransacharaza syntetyzuje dekstran z sacharozy z jednoczesnym uwalnianiem fruktozy i przeniesieniem reszty glikozydowej do łańcucha i polimeryzacji z [(1→6)-α-D-glukozyl]n według reakcji:

lub

sacharoza + [(1→6)-α-D-glukozyl]n ⇒ D-fruktoza + [(1→6)-α-D-glukozyl]n+1

W pierwszym etapie reakcji wiązanie glikozydowe α-(1→2) sacharozy jest rozszczepiane z uwolnieniem fruktozy i wytworzeniem pośrednio glukozylenzymu, w którym jednostka glukozylowa jest kowalencyjnie przyłączona do katalitycznego nukleofila przez wiązanie β-glikozydowe. W drugim etapie reakcji kowalencyjnie związane ugrupowanie glukozylowe przenosi akceptowalne nieredukujące sprzężone łańcuchy glukanowe z utworzeniem wiązania α-glikozydowego.

Dekstran produkowany przez Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F i Leuconostoc mesenteroides NRRL B1299 został dobrze scharakteryzowany i sklasyfikowany. Dekstran z Leuconostoc mesenteroides B512F zawiera 95% wiązań α-(1→6) i 5% wiązań rozgałęzionych α-(1→3), natomiast nierozpuszczalny dekstran produkowany przez Leuconostoc mesenteroides 1299 zawiera 63% α-(1→6), 27% α-(1→2) i 8% wiązań α-(1→3). Szczepy Gluconobacter oxydans ATCC 11894 i Gluconobacter oxydans ATCC 11895 hodowane na podłożach zawierających dekstrynę (grupę złożonych węglowodanów, zbudowanych z pochodnych cukrów prostych, połączonych wiązaniami α-1→4-glikozydowymi, o długości od 3 do około 12–14 m, powstającą w wyniku enzymatycznej hydrolizy skrobi), ale niehodowane na innych pospolitych węglowodanach, wytwarzają obfite ilości materiału polisacharydowego, które mają właściwości serologiczne podobne do dekstranu wytworzonego z sacharozy przez Leuconostoc mesenteroides. Okazało się, że hydrolizat polisacharydu Gluconobacter składa się prawie wyłącznie z glukozy. Wysoka skręcalność optyczna i widmo absorpcji w podczerwieni wskazywały na wiązania α-glikozydowe. Występował również pik absorpcji z wiązaniami α-(1→6), ale nie wykryto absorpcji związanej z wiązaniami α-(1→3). Analiza metylacji ujawniła trzy składniki: 2,3,4,6-tetra-, 2,3,4-tri- i 2,3-di-o-metylo-D-glukozę. Wykazano zatem, że polisacharyd składa się zasadniczo z α-(1→6) łańcuchów, zawierających punkty rozgałęzienia α-(1→4), z których średnia długość łańcucha połączonego z α-(1→6) wynosiła około 13 jednostek glukozy. Dekstran produkowany na podłożu z hydrolizatem skrobi przez Gluconobacter składa się z 90% α-(1→6) wiązań i 10% wiązań α-(1→4) oznaczonych metodą utleniania nadjodanu.

15.4.4.2. Produkcja dekstranu

Dekstran jest produkowany komercyjnie w hodowlach szczepów Leuconostoc mesenteroides in situ i in vitro w podłożu produkcyjnym zawierającym sacharozę. Dekstran o pożądanej masie cząsteczkowej można osiągnąć przez bezpośrednią syntezę enzymatyczną z zastosowaniem oczyszczonej dekstransacharazy, która pozwala na większą kontrolę warunków reakcji w porównaniu z syntezą na drodze fermentacji. Na produkcję dekstranu przez dekstransacharazę z LAB mają wpływ takie czynniki, jak temperatura, napowietrzanie, stężenie i rodzaj składników odżywczych w podłożu produkcyjnym. Na produkcję dekstranu wpływa również lepkość podłoża, zawartość azotu, fosforu i innych soli w podłożu. Liczne cukry są wykorzystywane jako źródło węgla dla bakterii, jedynie sacharoza indukuje produkcję dekstransacharazy. Tak więc do produkcji dekstranu podłoże musi zawierać sacharozę oraz różne pozostałe składniki odżywcze. Wszystkie szczepy Leuconostoc mesenteroides są auksotrofami i wymagają w podłożu witamin, jak np. kwas nikotynowy, tiamina i kwas pantotenowy, oraz innych składników, jak np. cysteina, kwas glutaminowy, izoleucyna i walina. W praktyce dodaje się do podłoża ekstrakt drożdżowy, kwaśny hydrolizat kazeiny lub mięsny, ekstrakt słodowy lub pepton lub trypton. Konieczna jest obecność różnych kationów, jak np. sole fosforanowe w stężeniu 0,5% (fosforan disodowy). Zdaniem różnych autorów optymalna jest ilość fosforu w postaci fosforanu jednopotasowego w stężeniu 3,5%, choć w biomasie znajduje się 0,1–1% fosforu. Masa cząsteczkowa dekstranu jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia enzymu i wprost proporcjonalna do stężenia sacharozy. Ponadto wzrasta ona wraz ze wzrostem temperatury od 20°C do 30°C. Różne techniki mutagenezy zostały zastosowane do zwiększenia produkcji enzymu dekstransacharazy i produkcji dekstranu przez różne szczepy LAB, jak np. promieniowanie, sulfonian etylometanu i N-metylo-N0-nitro-N-nitrozoguanidyna. Wykazano, że niektóre szczepy bakteryjne wytwarzają dekstrany o różnych strukturach. Dekstran jest charakterystyczny dla specyficznej dekstransacharazy wytwarzanej przez specyficzny szczep bakteryjny (tab. 15.7). Analiza strukturalna dekstranu rozpoczyna się od jego izolacji w czystej postaci.

Tabela 15.7. Dekstrany i ich wzory sprzężenia z różnymi LAB izolowanymi z żywności

Gatunek bakterii

Typ wiązania glikozydowego

Źródło izolacji

Lit.

Leuconostoc mesenteroides AA1

tylko α-(1→6)

sfermentowana kapusta

[1]

Leuconostoc mesenteroides CMG713

100% α-(1→6)

winogrona

[2]

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F

95% α-(1→6)

5% α-(1→3)

sacharoza 40 g/l,

ekstrakt drożdżowy 20 g/l

[3]

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742

73% α-(1→6)

16% α-(1→4)

sacharoza

[4]

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299

63% α-(1→6)

27% α-(1→2)

8% α-(1→3)

sacharoza 40 g/l

ekstrakt drożdżowy 20 g/l

[5]

Leuconostoc mesenteroides NRRL. B-1355

95% α-(1→6)

5% α-(1→3)

sacharoza

[6]

Lactobacillus plantarum DM5

86,5% α-(1→6)

13,5% α-(1→3)

napój sfermentowany

[7]

Lactobacillus satsumensis NRRL B-59839

44% α-(1→3)

37% α-(1→6)

woda z ziaren kefiru

[8]

Pediococcus pentosaceus CRAG3

75% α-(1→6)

25% α-(1→3)

sfermentowany ogórek

[9]

Weissella cibaria JAG8

93% α-(1→6)

7% α-(1→3)

skórki z jabłek

[10]

Weissella cibaria CMGDEX3

96,6% α-(1→6)

3,4% α-(1→3)

kapusta

[11]

Weissella confusa Cab3

97% α-(1→6)

3% α-(1→3)

sfermentowana kapusta

[12]

[1] Aman i wsp. 2012. Carbohydr. Polym., 87: 910–915. [2] Sarwat i wsp. 2008. Int. J. Biol. Sci., 4: 379–386. [3] Vettori i wsp. 2012. Carbohydr. Polym., 88: 1440–1444. [4] Seymour i wsp. 1979. Carbohydr. Res., 68: 113–121. [5] Dols i wsp. 1997. Appl. Biochem. Biotechnol., 62: 47–59. [6] Cote i Robyt. 1982. Carbohydr. Res., 101: 57–74. [7] Das i Goyal. 2014. J. Sci. Food Agric., 94: 683–690. [8] Cote i wsp. 2012. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 7265–7263. [9] Shukla i Goyal. 2013. Int. J. Biol. Macromol., 62: 352–357. [10] Rao i Goyal. 2013. Int. J. Food. Sci. Nutr., 64: 346–354. [11] Ahmed i wsp. 2012. Carbohydr. Polym., 90: 441–446.[12] Shukla i wsp. 2014. Carbohydr. Polym., 101: 554–564.

Izolacja dekstranu i jego oczyszczanie z podłoża hodowlanego lub enzymatycznej mieszaniny reakcyjnej na ogół obejmuje następujące etapy:

1. 1) usuwanie biomasy komórek przez odwirowanie lub filtrację w przypadku podłoża hodowlanego;

2. 2) wytrącanie dekstranu z pozbawionego komórek supernatantu lub enzymatycznej mieszaniny reakcyjnej przez dodanie mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych jak etanolu, acetonu;

3. 3) ponowne wytrącanie i dializa dekstranu;

4. 4) chromatograficzne oczyszczanie (SEC) dekstranu.

Dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej może być oczyszczony chromatograficznie, a dekstran o niskiej masie cząsteczkowej można oczyścić przez ultrafiltrację. Masa cząsteczkowa α-glukanów waha się od 2 · 10^6 do 4,3 · 10^7 Da.

15.4.4.3. Zastosowanie dekstranów

Dekstrany są polisacharydami ważnymi handlowo. Opisano liczne zastosowania dekstranów natywnych, częściowo zdegradowanych dekstranów i ich pochodnych. Naturalny dekstran o masie cząsteczkowej około 5 · 10^8 Da jest nieodpowiedni jako substytut osocza krwi. Optymalny rozmiar dekstranu w osoczu krwi, tzw. dekstran kliniczny, wynosi 4 · 10^4–10^5 Da. Dekstran o zbyt niskiej masie cząsteczkowej jest szybko usuwany z krążenia przez nerki, a zatem jest nieskuteczny terapeutycznie, a dekstran o zbyt wysokiej masie cząsteczkowej może zakłócać normalne procesy krzepnięcia krwi. Frakcje kliniczne dekstranu o masie cząsteczkowej 70 000, 60 000 i 40 000 Da (oznaczonych odpowiednio jako dekstran 70, 60 i 40) są obecnie dostępne do zastąpienia osocza krwi w umiarkowanej ilości. Dekstran o takiej masie cząsteczkowej jest zatrzymywany w układzie krwionośnym w porównaniu z krystaloidami, które szybko penetrują. Każdy gram dekstranu zatrzymuje w obiegu około 20 g wody. Dekstran 40 oprócz roztworu plazmowego, poprawia przepływ krwi, przypuszczalnie za pośrednictwem obniżenia lepkości krwi i hamuje agregację erytrocytów. Dekstran wytwarzany przez Leuconostoc mesenteroides B-512F jest materiałem wybranym jako kliniczny, ponieważ ma wysoki odsetek (95%) wiązań α-glikozydowych i niską antygenowość. Obecność w strukturze dekstranu wiązań α-glikozydowych jest ważna, ponieważ enzymy w organizmie ludzkim mogą powoli hydrolizować wiązania α-(1→6) w przeciwieństwie do wiązań α-(1→4) skrobi i glikogenu, które są szybko hydrolizowane przez ludzkie α-amylazy. Ponadto połączenie α-(1→6) nadaje cząsteczce wysoką rozpuszczalność w wodzie, w przeciwieństwie do materiału mającego wiązania α-(1→3) lub wiązania β-. Tak więc dekstran B-512F ma niską antygenowość, wysoką rozpuszczalność w wodzie i stabilność biologiczną wymaganą dla odpowiedniego substytutu osocza krwi. Dekstrany o wyższych masach cząsteczkowych i/lub z większymi proporcjami wiązań innych niż α-(1→6) powodują większą częstość występowania reakcji alergicznych. Około 20% populacji daje odpowiedź anafilaktyczną, co jest czynnikiem ograniczającym w rutynowym stosowaniu dekstranu klinicznego jako substytutu osocza krwi. Niemniej podczas katastrof, kiedy potrzeba dużo osocza krwi, a zapasy są zbyt małe, kliniczny dekstran jako substytut osocza krwi może uratować życie. Różne typy estrów i eterów dekstranu nadają makrocząsteczkom różnorodne właściwości oraz ładunki ujemne, dodatnie lub obojętne. Ich właściwości zależą od rodzaju podstawnika, stopnia podstawienia i masy cząsteczkowej dekstranu. Najczęściej stosowana pochodna dekstranu jest uzyskiwana w reakcji alkalicznego roztworu dekstranu z epichlorohydryną w celu uzyskania usieciowanych łańcuchów. Produktem jest żel używany jako sito molekularne. Usieciowany dekstran znany pod nazwą Sephadex® stosuje się do rozdzielania i oczyszczania białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów. Dekstrany są również istotnym składnikiem pochodnych sefadeksu, w tym karboksymetylo-(CM)-Sephadex, dietyloaminoetylo-(DEAE)-Sephadex, dietylo-(2-hydroksypropylo)-aminoetylo-(QAE)-Sephadex, sulfopropylo-(SP)-Sephadex i inne nowoczesne żele separacyjne, takie jak Sefakryl i Superdex.

Dożylnie podawany dekstran żelaza jest stosowany w celu złagodzenia niedokrwistości związanej z niedoborem żelaza. Doustna suplementacja żelaza jest ograniczona z powodu słabej zdolności przewodu pokarmowego do jego wchłaniania. Kompleks dekstran-żelazo o nazwie Infed został dopuszczony do ogólnego stosowania w USA. Ester siarczanowy dekstranu ma właściwości przeciwzakrzepowe podobne do heparyny. Siarczan dekstranu może się wiązać z kwasami nukleinowymi i być silnym inhibitorem rybonukleazy. Ostatnio siarczan dekstranu badano jako środek w leczeniu ludzkiego wirusa upośledzenia odporności (HIV). Zastosowanie siarczanu dekstranu jako leku przeciw HIV opiera się na badaniach laboratoryjnych, wykazujących hamowanie odwrotnej transkryptazy. Ponadto doustny siarczan dekstranu jest stosowany przeciwko miażdżycy od 20 lat w Japonii bez szkodliwych skutków ubocznych. Merkaptodekstran ma wyższe powinowactwo do jonów metali ciężkich, takich jak jony srebra, rtęci, miedzi i złota, niż większość innych tioli i środki chelatujące. W połączeniu z niską toksycznością ta właściwość merkaptodekstranu sugeruje możliwe zastosowania w ostrym zatruciu metalami ciężkimi i zanieczyszczeniu środowiska. Dekstrany są również stosowane w preparatach do pielęgnacji oczu i skóry. Stosuje się je jako składniki kosmetyków, gdyż są biokompatybilne, mają właściwości nawilżające i stabilizują roztwory. Dekstran dodaje się do produktów piekarniczych w celu poprawy miękkości, tekstury miękiszu i objętości bochenka. Jest stosowany w żywieniu klinicznym, w syropie fruktozowym i jako dodatek do cukierków i lodów. Dekstrany produkowane przez Leuconostoc mesenteroides są bezpieczne, gdyż bakteria ta ma status GRAS i jest obecna w wielu fermentowanych produktach żywnościowych. Dekstrany są stosowane jako środki emulgujące i zagęszczające, lepiszcze o wysokiej lepkości, do produkcji materiałów wybuchowych, produktów papierniczych, wtórnego odzyskiwania ropy naftowej, do płuczek wiertniczych ropy naftowej oraz środków poprawiających strukturę gleby. Ponadto dekstrany pochodzą ze źródeł odnawialnych i są degradowane przez systemy biologiczne. Zastosowanie dekstranu w przemyśle spożywczym:

1. 1) do poprawiania struktury ciast i zatrzymywania wody oraz poprawiania lepkości oraz hamowania krystalizacji cukru;

2. 2) jako materiał do produkcji żelków, gum i cukierków;

3. 3) w fermentowanych produktach mlecznych celem zwiększania ich lepkości i kremowości;

4. 4) do tworzenia osłon i konserwacji produktów mrożonych i suszonej żywności;

5. 5) do wytwarzania serów o obniżonej zawartości tłuszczu (poprawiają wiązanie wody i zwiększają zawartość wilgoci w substancjach tłuszczowych).

Sacharoza jest środkiem inicjującym próchnicę (niszczy szkliwo zębów i zębinę) u osób żyjących w technologicznie zaawansowanych społecznościach. W zębach trzonowych próchnica może rozwijać się w włóknach okluzyjnych w wyniku bakteryjnej fermentacji materiału spożywczego. Mikroorganizmy próchnicotwórcze wydzielają zewnątrzkomórkowe glukozylotransferazy, które polimeryzują glukozę z sacharozy w polimery glukanu, tworząc błonkę na powierzchni zębów. Głównym organizmem występującym w próchnicy zębów jest Streptococcus mutans, którego potencjał próchnicowy polega na zdolności do wytwarzania z sacharozy glukanów rozpuszczalnych w wodzie (dekstranów) i nierozpuszczalnych w wodzie (mutanów). Polisacharydy te tworzą płytkę nazębną, która przylega do szkliwa zębów, trzymając liczne komórki Streptococcus mutans w pobliżu szkliwa. Polisacharydy zapewniają również wzrost i rozwój bakterii beztlenowych. Dekstrany i mutany pobudzają więc proces próchnicy, ułatwiając kolonizację bakterii próchnicowych na powierzchni zębów. Stopniowy podział rezerwowych węglowodanów na fermentowalne cukry i ich przekształcenie w kwasy organiczne są głównymi czynnikami procesu próchnicotwórczego, ponieważ umożliwiają utrzymanie niskiego pH na powierzchni zęba przez dłuższy czas i wobec braku węglowodanów egzogennych. Kwasy utrzymywane są w bliskim kontakcie z zębami, atakując szkliwo i powodując uszkodzenia zębów.

Problemy z powstawaniem dekstranu mają rafinerie cukru. Lactobacillus i/lub Leuconostoc atakują surowce – trzcinę cukrową i buraki cukrowe – z wytworzeniem dekstranu, który znacznie zmniejsza skuteczność ich przetwarzania. Nierozpuszczalne dekstrany zatykają filtry, rurociągi i zbiorniki, mogą też poważnie zakłócać usuwanie zawiesiny na etapie klasyfikacji surowego cukru. Lepkość surowych soków i syropów sacharozy zwiększa się wskutek obecności rozpuszczalnych dekstranów, co jest niepożądane w procesach filtracji, klarowania, wrzenia i krystalizacji cukru. Rozpuszczalne dekstrany opóźniają szybkość krystalizacji sacharozy, a także niekorzystnie wpływają na kształt kryształów. Dekstrany produkowane w pewnych grupach żywności powodują jej psucie się, np. źle ukiszona kapusta, ogórki, mięso peklowane, gdyż pewne szczepy wykazują tolerancję na kwas, chmiel, alkohol i kwas octowy. Organizmami powodującymi psucie piwa są Acetobacter viscosum NCTC 7216 (obecnie Gluconobacter oxydans ATCC 11895) i Acetobacter capsulatum NCTC 1942 (obecnie Gluconobacter oxydans 11894), wytwarzające dekstran z maltodekstryn piwa.

Literatura rekomendowana

Ahmad N.H., Shuhaimi M.S., Man Y.B.C. 2015. Microbial polysaccharides and their modification approaches: A Review. Intern. J. Food Properties, 18: 332–347.

Abed S.M., Noman A., Niazi S., Ammar A.F., Zhang T., Bakrey A.M. 2016. Production of dextrans and their applications in human health and nutrition – Review. European Acad. Res., 4: 3962–3988.

Ahmad N.H., Mustafa S., Man Y.B.C. 2015. Microbial polysaccharides and their modification approaches: A review. Intern. J. Food Properties, 18: 332–347.

Ates O. 2015. Systems biology of microbial exopolysaccharides production. Front. Bioeng. Biotechnol., 3: 200.

European patent application number: 0 624 651 A1 (produkcja ksantanu z serwatki).

Feng J., Gu Y., Quan Y., Zhang W., Cao M., Gao W., Song C., Yang C., Wang S. 2015. Recruiting a new strategy to improve levan production in Bacillus amyloliquefaciens. Scientific Reports | 5:13814 | DOI: 10.1038/srep13814.

Freitas F., Alves V.D., Reis M.A.M. 2011.Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol., 29: 388–398.

Ghaly A.E.F. Arab N.S.M., Higgins J. 2007. Production of levan by Bacillus licheniformis for use as a soil sealant in earthen manure storage structures. Amer. J. Biotechnol. Biochem., 3: 47–54.

Hsueh Y.H., Huang K.Y., Kenene S.C., Lee T.Y. 2017. Review poly-γ-glutamic acid synthesis, gene regulation, phylogenetic relationships, and role in fermentation. Int. J. Mol. Sci., 18: 2644; DOI:10.3390/ijms18122644.

Jindal N. i Khattar J.S. 2018. Microbial Polysaccharides in Food Industry. Biopolym. Food Design, s. 95–123. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-811449-0.00004-9.

Kaur V., Bera M.B., Panesar P.S., Kumar H., Kennedy J.F. 2014. Welan gum: Microbial production, characterization, and applications. Intern. J. Biol. Macromolec., 65: 454–461.

Koller M. i Braunegg G. 2018. Advanced approaches to produce polyhydroxyalkanoate (PHA) biopolyesters in a sustainable and economic fashion. The EuroBiotech. J. Bioprocess Eng., 2: 89–103.

Koller M., Salerno A., Muhr A., Reiterer A., Chiellini E., Casella S., Horvat P., Braunegg G. Whey lactose as a raw material for microbial production of biodegradable polyesters. http://dx.doi.org/10.5772/48737.

Koller M. 2017. Advances in polyhydroxyalkanoate (PHA) production. Bioengineering, 4: 88.

Kotharia D., Das D., Patek S., Goyal A. 2014. Dextran and food application. Polysaccharides. DOI: 10.1007/978-3-319-03751-6_66-1.

Kumar M.M.M., Raj J., Gopalan X.S., Ramana K.V., Sharma R.K. 2018. Poly (γ-) Glutamic acid: A promising biopolymer. Defence Life Sci. J., 3: 301–306.

Luo Z., Guo Y., Liu J., Zhao M., Zou W., Li S. 2016. Microbial synthesis of polyγglutamic acid: current progress, challenges, and future perspectives. Biotechnol. Biofuels, 9: 134. DOI: 10.1186/s13068-016-0537-7

Naessens M., Cerdobbel A., Soetaert W., Vandamme E.Y. 2005. Leuconostoc dextransucrase and dextran: production, properties and applications. Chem. Technol. Biotechnol., 80: 845–860.

Rehm B.H. 2010. Bacterial polymers: biosynthesis, modifications and applications. Nat. Rev. Microbiol., 8: 578–592.

Schmid J., Sieber V., Rehm B. 2015. Bacterial exopolysaccharides: biosynthesis pathways and engineering strategies. Front. Microbiol., 6: 496.

Srikanth R., Reddy C.H.S., Siddartha G., Ramaiah M.J., Uppuluri K.B. 2014. Review on production, characterization and applications of microbial levan. Carbohydrate Polym., 120: 102–114.

Vettori M.H. P.B., Blanco K.C., Cortezi M., de Lima C.J.B., Contiero J. 2012. Dextran: effect of process parameters on production, purification and molecular weight and recent applications. Dialogos & Ciencia, 3: 171–186.