Zespół tłumaczy wydania czwartego

pod redakcją Mirosławy Dabert

dr hab. Mirosława Dabert (sekcja B, C, D, E, F, G, N, S)

prof. Artur Jarmołowski (sekcja J, L, M)

dr hab. Katarzyna Nuc (sekcja O, P, Q, R)

prof. Zofia Szweykowska-Kulińska (sekcja A, H, I, K)

Dane oryginału:

BIOS Instant Notes. Molecular biology

fourth edition

Alexander McLenann, Andy Bates, Phil Turner, Mike White

Copyright © Taylor & Francis Group

All rights reserved

Authorised translation from the English language edition published by Taylor & Francis, a member of the Taylor & Francis Group.

Wydanie polskie:

Projekt okładki i strony tytułowej Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Chritoph Burgstedt/Shutterstock

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja Iwona Pisiewicz

Korekta Joanna Forysiak

Produkcja Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w Internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty. Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 1999, 2002, 2010, 2021

ISBN 978-83-01-21908-6

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2021r. (Wydanie IV)

Warszawa 2021

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288; infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Przedmowa do wydania polskiego

Przedstawiamy Państwu nowe polskie wydanie podręcznika Biologia molekularna z serii Krótkie wykłady. Jest to tłumaczenie czwartej edycji BIOS Instant Notes in Molecular Biology autorstwa Alexandra McLennana, Andy’ego Batesa, Phila Turnera i Mike’a White’a, która ukazała się na rynku brytyjskim w 2013 roku.

Najnowsza wersja podręcznika ma zmieniony, bardziej przejrzysty układ treści i została uzupełniona o nowe informacje w niemal każdej sekcji, o czym bardziej szczegółowo piszą autorzy w przedmowie do wydania angielskiego. Biologia molekularna jest dyscypliną naukową, która rozwija się niezmiernie szybko. Rozwój ten najlepiej odzwierciedla ostatnia sekcja podręcznika, omawiająca genomikę funkcjonalną i nowe technologie w biologii molekularnej. Czytelnicy znajdą tam również wprowadzenie do nowo wyłaniającej się dziedziny biologii molekularnej, jaką jest biologia systemów. Ponieważ postęp dokonał się również od czasu, gdy powstała angielska wersja podręcznika, staraliśmy się wprowadzić uaktualnienia w polskim tłumaczeniu wszędzie tam, gdzie było to niezbędne (w formie przypisów tłumacza).

Oddajemy Państwu zaktualizowaną wersję popularnego podręcznika, który z pew-nością będzie przydatny nie tylko zainteresowanym biologią molekularną licealistom, studentom nauk biologicznych, medycznych i przyrodniczych, lecz także ich nauczycielom. Wydanie polskie jest również dopracowane pod względem językowym i redakcyjnym, za co składamy podziękowania redaktorkom Wydawnictwa Naukowego PWN, paniom Iwonie Pisiewicz i Katarzynie Włodarczyk-Gil.

Mirosława Dabert, Artur Jarmołowski, Katarzyna Nuc, Zofia Szweykowska-Kulińska

kwiecień 2021

Przedmowa do wydania czwartego

Niewiele jest dyscyplin naukowych, które rozwinęły się tak szybko, jak biologia molekularna w czasie od ostatniego wydania tego podręcznika. Dlatego nasze nadzieje pokładane w tym, że poprawki wprowadzone do poprzedniego wydania ułatwią wprowadzanie przyszłych zmian, były raczej naiwne. Poprawki i aktualizacje wprowadzone do czwartego wydania są znaczące i obejmują wszystkie sekcje i tematy, co odzwierciedla tempo rozwoju tych dziedzin. Pierwsze dwie sekcje trzeciego wydania zostały połączone i uproszczone, aby ograniczyć powielanie informacji z innych podręczników z serii Krótkie wykłady, podczas gdy pozostałe sekcje zostały zorganizowane na nowo i przebudowane w bardziej logiczny sposób. Stworzyło to przestrzeń do rozważenia postępów w takich dziedzinach jak sekwencjonowanie DNA następnej generacji i genomika, analiza globalnej ekspresji genów, regulatorowe RNA, proteomika, komórki macierzyste, biologia systemów i w wielu innych. Jedną z trudności było ustalenie, co należy pominąć, aby móc uwzględnić nowy materiał. W miarę jak wiedza się poszerza i rozwija technologia, a starsze podejścia eksperymentalne wychodzą z łask, wyzwaniem staje się utrzymanie czytelnika w stanie ekscytacji nowymi odkryciami i potęgą nowych metod przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej ilości tradycyjnej wiedzy, aby umożliwić pełne zrozumienie tematu. Zdajemy sobie również sprawę, że jest to podręcznik wprowadzający, dlatego staraliśmy się unikać niepotrzebnej złożoności i szczegółów. Mamy nadzieję, że osiągnęliśmy nasze cele. Jak zawsze, jesteśmy bardzo wdzięczni wielu recenzentom, którzy zgłosili sugestie ulepszeń do poprzedniego wydania. Szczególnie jesteśmy wdzięczni Liz Owen i Vicki Noyes za ich cierpliwość i pełne zrozumienia podejście w trakcie recenzowania tego podręcznika.

Alexander McLennan, Andy Bates, Phil Turner i Mike White

Bezpłatny fragment

Zespół tłumaczy wydania czwartego

Przedmowa do wydania polskiego

Przedmowa do wydania czwartego

Wykaz skrótów

Sekcja A – Makrocząsteczki informacyjne

A1. Przetwarzanie informacji i biologia molekularna

A2. Budowa i funkcje kwasów nukleinowych

A3. Budowa i funkcje białek

A4. Duże układy makrocząsteczek

A5. Analiza białek

Sekcja B – Właściwości kwasów nukleinowych

B1. Chemiczne i fizyczne właściwości kwasów nukleinowych

B2. Spektroskopowe i termiczne właściwości kwasów nukleinowych

B3. Superzwijanie DNA

Sekcja C – Struktura chromosomów prokariotycznych i eukariotycznych

C1. Struktura chromosomu prokariotycznego

C2. Struktura chromatyny

C3. Struktura chromosomu eukariotycznego

C4. Złożoność genomu

Sekcja D – Replikacja DNA

D1. Replikacja DNA: przegląd

D2. Replikacja DNA bakteryjnego

D3. Replikacja DNA eukariotycznego

Sekcja E – Uszkodzenia, naprawa i rekombinacja DNA

E1. Uszkodzenia DNA

E2. Mutageneza

E3. Naprawa DNA

E4. Rekombinacja i transpozycja

Sekcja F – Transkrypcja u bakterii

F1. Podstawowe zasady transkrypcji

F2. Polimeraza RNA Escherichia coli

F3. Promotor rozpoznawany przez σ^70 E. coli

F4. Inicjacja, elongacja i terminacja transkrypcji

Sekcja G – Regulacja transkrypcji u bakterii

G1. Operon lac

G2. Operon trp

G3. Regulacja transkrypcji przez alternatywne czynniki σ i RNA

Sekcja H – Transkrypcja u eukarioNtów

H1. Trzy polimerazy RNA: charakterystyka i funkcje

H2. Geny transkrybowane przez RNA Pol I: powtórzenia genów rybosomowych RNA

H3. Geny transkrybowane przez RNA Pol III: transkrypcja genów 5S rRNA i tRNA

H4. Geny transkrybowane przez RNA Pol II: promotory i sekwencje wzmacniające

H5. Ogólne czynniki transkrypcyjne i inicjacja transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol II

Sekcja I – Regulacja transkrypcji u eukarioNtów

I1. Eukariotyczne czynniki transkrypcyjne

I2. Przykłady regulacji transkrypcji

Sekcja J – Dojrzewanie RNA i cząstki RNP

J1. Dojrzewanie rRNA i rybosomy

J2. Dojrzewanie tRNA i innych małych RNA

J3. Dojrzewanie mRNA, hnRNP i snRNP

J4. Alternatywne dojrzewanie mRNA

Sekcja K – Kod genetyczny I tRNA

K1. Kod genetyczny

K2. Struktura i funkcja tRNA

Sekcja L – Synteza białka

L1. Synteza białka – wybrane tematy

L2. Mechanizm syntezy białka

L3. Inicjacja u eukariontów

L4. Kontrola translacji i zdarzenia potranslacyjne

Sekcja M – Bakteriofagi i wirusy eukariotyczne

M1. Wprowadzenie do wirusów

M2. Bakteriofagi

M3. Wirusy DNA

M4. Wirusy RNA

Sekcja N – Cykl komórkowy i rak

N1. Cykl komórkowy

N2. Onkogeny

N3. Geny supresorowe transformacji nowotworowej

N4. Apoptoza

Sekcja O – Manipulowanie genami

O1. Klonowanie DNA: wprowadzenie

O2. Przygotowanie plazmidowego DNA

O3. Enzymy restrykcyjne i elektroforeza

O4. Ligacja, transformacja i analiza rekombinantów

Sekcja P – Wektory do klonowania

P1. Budowa wektorów do klonowania

P2. Bakteriofagi, kosmidy, wektory YAC i BAC

P3. Wektory eukariotyczne

Sekcja Q – Biblioteki genowe i ich przeszukiwanie

Q1. Biblioteki genomowe

Q2. Biblioteki cDNA

Q3. Procedury przeszukiwania

Sekcja R – Analiza i zastosowanie klonowanego DNA

R1. Charakterystyka klonów

R2. Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych

R3. Łańcuchowa reakcja polimerazy

R4. Analiza klonowanych genów

R5. Mutageneza klonowanych genów

Sekcja S – Genomika funkcjonalna i nowe technologie

S1. Wprowadzenie do „omik”

S2. Globalna analiza ekspresji genów

S3. Proteomika

S4. Obrazowanie komórkowe i molekularne

S5. Transgenika i technologia komórek macierzystych

S6. Bioinformatyka

S7. Biologia systemów i biologia syntetyczna

Literatura uzupełniająca

Przpisy

Wykaz skrótów

α -TIF

czynnik trans-indukujący α

ADP

adenozyno-5’-difosforan

AIDS

zespół nabytego niedoboru odporności (ang. acquired immunodeficiency syndrome)

ALV

ptasi wirus białaczki (ang. Avian leukosis virus)

AMP

adenozyno-5′-monofosforan

AP

miejsce apurynowe

ARS

autonomicznie replikujące się sekwencje

ATP

adenozyno-5’-trifosforan

BAC

sztuczny chromosom bakteryjny (ang. bacterial artificial chromosome)

BER

naprawa przez wycięcie zasady (ang. base excision repair)

BLAST

algorytm służący do lokalnego przyrównywania sekwencji aminokwasów białek lub nukleotydów DNA (ang. Basic Local Alignment Search Tool)

BRF

podjednostka TFIIIB homologiczna z TFIIB (ang. TFIIB-related factor)

BSE

gąbczasta encefalopatia bydła (ang. Bovine Spongiform Encephalopathy)

BUdR

bromodeoksyurydyna

bZIP

zasadowy zamek leucynowy (ang. basic leucine zipper)

cAMP

cykliczny adenozynomono-fosforan (ang. cyclic adenosinemonophosphate)

CAP

białko aktywujące geny kataboliczne (ang. catabolite activator protein)

cDNA

DNA komplementarny do mRNA (ang. complementary DNA)

CFTR

regulator przewodnictwa błonowego w mukowiscydozie (ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

CHEF

elektroforeza żelowa w pulsującym polu elektrycznym o stałej płaszczyźnie (ang. contour clamped homogenous electric field)

ChIP

immunoprecypitacja chromatyny (ang. chromatin immunoprecipitation)

CJD

choroba Creutzfeldta‒Jakoba (ang. Creutzfeldt‒Jakob disease)

CMP

cytydyno-5’-monofosforan

CRP

białkowy receptor cAMP (ang. cAMP response protein)

CSF

czynnik 1 stymulujący wzrost kolonii (ang. colony stimulating factor-1)

CTD

karboksylowa domena terminalna (ang. carboxyterminal domain)

Da

dalton

dATP

5’-trifosforan deoksyadenozyny

dCTP

5’-trifosforan deoksycytydyny

ddNTP

dideoksynukleotyd

dGDP

5’-difosforan deoksyguanozyny (ang. deoxyguanosine 5’-diphosphate)

dGTP

5’-trifosforan deoksyguanozyny

DNA

kwas deoksyrybonukleinowy

DNAza I

deoksyrybonukleaza I

dNTP

5’-trifosforan deoksyrybonukleozydu

DOP-PCR

reakcja PCR, w której stosuje się zdegenerowane startery oligonukleotydowe (ang. degenerate oligonucleotide primers)

DSB

pęknięcia obu nici (ang. double-strand breaks)

DSCAM

białko adhezyjne zespołu Downa (ang. down syndrom cell-adhesion molecule)

dsDNA

dwuniciowy DNA

dsRNA

dwuniciowy RNA

dTTP

5’-trifosforan deoksytymidyny

EDTA

etylenodiaminotetraoctan sodu

EF

czynnik elongacyjny

eIF

czynnik inicjujący

ENU

etylonitrozomocznik

ER

retikulum endoplazmatyczne

eRF

czynnik uwalniający

ES

zarodkowe komórki macierzyste (ang. embrionic stem)

ESI

jonizacja przez elektrorozpylanie (ang. electrospray ionization)

EST

znaczniki sekwencji ulegających ekspresji (ang. expressed sequence tags)

ETS

zewnętrzne sekwencje transkrybowane (ang. external transcribed spacer)

FADH

dinukleotyd flawinoadeninowy

FASTA

algorytm Fast-All

FIGE

elektroforeza żelowa w pulsującym, odwracanym polu elektrycznym (ang. field inversion gel electrophoresis)

FISH

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization)

GFP

białko zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein)

GMO

organizmy zmodyfikowane genetycznie (ang. genetically modified organisms)

GST

transferaza S-glutationowa

GTP

guanozyno-5′-trifosforan

HAT

acetylotransferaza histonów

HDL

lipoproteina o dużej gęstości (ang. high density lipoprotein)

HIV

ludzki wirus niedoboru odporności (ang. human immunodeficiency virus)

HLH

motyw helisa–pętla–helisa (ang. helix‒loop‒helix)

hnRNA

heterogenne jądrowe RNA

hnRNP

heterogenne cząstki rybonukleoproteinowe

HR

homologiczna rekombinacja

HSP

białko szoku cieplnego

HSV-1

wirus opryszczki pospolitej 1

HSVTK

kinaza tymidynowa wirusa opryszczki pospolitej

ICC

immunocytochemia

ICE

enzym przekształcający interleukinę-1β

IF

czynnik inicjujący (ang. initiation factor)

IgG

immunoglobulina G

IHC

immunohistochemia

Int

integraza

IP

immunoprecypitacja

iPS

indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced pluripotent stem cells)

IPTG

izopropylotiogalaktozyd

IRE

element odpowiedzi na żelazo (ang. iron response element)

IRES

wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (ang. internal ribosome entry site)

ISH

hybrydyzacja in situ (ang. in situ hybridization)

ISP

białko (sensor żelaza) (ang. iron sensing protein)

ITS

wewnętrzne transkrybowane sekwencje (ang. internal transcribed spacer)

kb

kilobajt

kDa

kilodalton

LINES

długie elementy rozproszone

lncRNA

długi niekodujący RNA

LTR

długie powtórzenie końcowe (ang. long terminal repeat)

LUCA

ostatni uniwersalny wspólny przodek (ang. last universal common ancestor)

MALDI

laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization)

MBP

białko wiążące maltozę

MCS

miejsce wielokrotnego klonowania (ang. multiple cloning site)

MDa

megadalton

MFC

wieloczynnikowy kompleks (ang. multifactor complex)

miRNA

mikroRNA

MMS

metylosulfonian metylu

MMTV

mysi (retro) wirus raka sutka (ang. mouse mammary tumor virus)

mRNA

informacyjny RNA

MS

spektrometria mas

NAD+

dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy

ncRNA

niekodujący RNA

NER

naprawa przez wycięcie nukleotydu (ang. nucleotide excision repair)

NHEJ

niehomologiczne łączenie końców (ang. nonhomologous end joining)

NMD

degradacja zależna od obecności kodonu typu nonsens (ang. nonsense mediated decay)

NMN

mononukleotyd nikotynamidowy

NMR

spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. nuclear magnetic resonance)

NTP

nukleozydo-5’-trifosforany

OE-PCR

nakładający się PCR (ang. overlap extension PCR)

OMIM®

baza danych OMIM® (ang. Online Mendelian Inheritance in Man)

ORC

kompleks rozpoznający miejsce inicjacji replikacji (ang. origin replication complex)

ORF

otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame)

PAGE

elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis)

PAP

polimeraza poli(A) (ang. poly(A) polymerase)

PCNA

jądrowy antygen proliferujących komórek

PCR

reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)

PDGF

płytkowy czynnik wzrostu (ang. platelet-derived growth factor)

PFGE

elektroforeza żelowa w pulsującym polu elektrycznym (ang. pulsed field gel electrophoresis)

piRNA

mały RNA występujący w kompleksach z białkami piwi

PMF

odcisk palca masy peptydowej (ang. peptide mass fingerprint)

PPi

pirofosforan

pre-mRNA

RNA będący bezpośrednim produktem transkrypcji u eukariontów

pri-miRNA

pierwotne transkrypty miRNA

PTH

fenylotiohydantoina

qPCR

ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. quantitative polymerase chain reaction)

RACE

technika szybkiej amplifikacji końców cDNA

RB1

gen retinoblastoma

RBS

miejsce wiązania rybosomu (ang. ribosome-binding site)

RF

czynniki uwalniające (ang. release factor)

RFLP

polimorfizm długości fragmentów restrykcyjny (ang. restriction fragment length polymorphism)

RFP

czerwone białko fluorescencyjne (ang. red fluorescent protein)

RISC

kompleks wyciszający zależny od RNA (ang. RNA-induced silencing complex)

RITS

kompleks wyciszający transkrypcję zależny od RNA (ang. RNA-induced transcriptional silencing)

RNA

kwas rybonukleinowy

RNA Pol I

polimeraza RNA I

RNA Pol II

polimeraza RNA II

RNA Pol III

polimeraza RNA III

RNAi

interferencja RNA

RNP

rybonukleoproteina

ROS

reaktywny związkek tlenu

RP-A

białko replikacyjne A

RRF

czynnik odzyskiwania rybosomu (ang. ribosome recycling factor)

rRNA

rybosomowy RNA

RT

odwrotna transkryptaza (ang. reverse transcriptase)

RT-PCR

reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (ang. reverse-transcription polymerase chain reaction)

SCID

ciężki złożony niedobór odporności (ang. severe combined immunodeficiency)

SCNT

transfer jądra komórki somatycznej (ang. somatic cell nuclear transfer)

SDS

dodecylosiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE

elektroforeza w żelu poliakryloamidowym zawierającym dodecylosiarczan sodu(ang. polyacrylamide gel electrophoresis)

SECIS

sekwencja wprowadzająca selenocysteinę (ang. selenocysteine insertion sequence)

SILAC

znakowanie aminokwasami wyznakowanymi izotopami stabilnymi (ang. stable isotope labeling with amino acids in cell culture)

siRNA

krótki RNA odpowiedzialny za interferencję RNA

SL1

selekcyjny czynnik 1

snoRNA

mały jąderkowy RNA

SNP

polimorfizm pojedynczych nukleotydów

snRNA

mały jądrowy RNA

snRNP

mała jądrowa cząstka rybonukleoproteinowa

sRNA

mały RNA u bakterii

SRP

cząstka rozpoznająca sygnał (ang. signal recognition particle)

Ssb

białko wiążące jednoniciowy DNA

SSB

pęknięcie jednej nici (ang. single strand break)

SSCP

polimorfizm konformacji pojedynczych nici

ssDNA

jednoniciowy DNA

SSLP

polimorfizm długości pojedynczej sekwencji

STR

krótkie powtórzenia tandemowe (ang. short tandem repeats)

SV40

małpi wirus 40

TAF

czynnik towarzyszący TBP (ang. TBP-associated factor)

TBP

białko wiążące kasetę TATA (ang. TATA box binding protein)

TdT

terminalna transferaza deoksynukleotydowa

TLS

synteza ponad miejscem uszkodzenia (ang. translesion DNA synthesis)

Tm

temperatura topnienia

tmRNA

transportująco-informacyjny RNA (ang. transfer-messenger RNA)

TOF

analizator czasu przelotu (ang. time-of-flight)

TRIS

(hydroksymetylo)aminometan

tRNA

transportujący RNA

UBF

czynnik wiążący się z elementem UCE (ang. upstream binding factor)

UCE

element kontrolny położony powyżej miejsca startu transkrypcji (ang. upstream control element)

URE

element regulatorowy położony powyżej genu (ang. upstream regulatory element)

UTP

urydynotrifosforan

UTR

rejon nieulegający translacji (ang. untranslated region)

UV

promieniowanie ultrafioletowe

VNTR

tandemowe powtórzenia o zmiennej liczbie powtórzeń

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolilo-α-D-tiogalaktopiranozyd

Xist

specyficzny transkrypt inaktywujący chromosom X (ang. X-inactive specific transcript)

XP

skóra pergaminowata i barwnikowa (Xeroderma pigmentosum)

XP-V

wariant xeroderma pigmentosum

YAC

sztuczny chromosom drożdżowy (ang. yeast artificial chromosome)

YEp

episomalny plazmid drożdżowy (ang. yeast episomal plasmid)

Sekcja A – Makrocząsteczki informacyjne

Pozostałe rozdziały dostępne w pełnej wersji e-booka.

A1

Przetwarzanie informacji i biologia molekularna

Hasła

Dogmat biologii molekularnej

Główny dogmat biologii molekularnej stanowi, że „z DNA powstają cząsteczki RNA, z których powstają białka”, co zachodzi poprzez, odpowiednio, procesy transkrypcji i translacji. Zasadniczo stwierdzenie to jest poprawne, choć istnieje wiele przykładów, które częściowo temu zaprzeczają. Retrowirusy przepisują RNA na DNA, inne wirusy, replikując swój genomowy RNA, syntetyzują bezpośrednio nowe kopie RNA, a wiele organizmów może redagować sekwencję informacyjnego RNA w taki sposób, że jego sekwencja nie odzwierciedla bezpośrednio sekwencji kodującego ją DNA.

Technologia rekombinacji DNA

Sekwencjonowanie i możliwość manipulowania sekwencjami genomów mikroorganizmów, zwierząt i roślin znacznie poszerzyły nasze rozumienie biologii komórki. Otrzymywanie organizmów transgenicznych niosących DNA z innych źródeł znalazło wiele zastosowań w medycynie, rolnictwie i przemyśle. Możliwość syntetyzowania całych genomów doprowadzi do jeszcze bardziej spektakularnego postępu w tych obszarach.

Tematy pokrewne

Budowa i funkcje kwasów nukleinowych (A2)

Budowa i funkcje białek (A3)

Transkrypcja u bakterii (Sekcja F)

Transkrypcja u eukariontów (Sekcja H)

Kod genetyczny i tRNA (Sekcja K)

Synteza białka (Sekcja L)

Dogmat biologii molekularnej

Biologia molekularna zajmuje się badaniem reakcji chemicznych i oddziaływań międzycząsteczkowych na poziomie molekularnym w odniesieniu do określonych funkcji biologicznych. Z tego względu obszar badań biologii molekularnej pokrywa się z obszarem badań z zakresu biochemii i genetyki. Często uważa się, że biologia molekularna zajmuje się głównie podstawami strukturalnymi i kontrolą przetwarzania informacji genetycznej w komórce, w tym technologiami niezbędnymi do badania cząsteczek i procesów związanych z przepływem informacji genetycznej. Dzięki pionierskim badaniom Avery’ego, MacLeoda, McCarty’ego, Hersheya i Chase’a prowadzonym w latach czterdziestych i pięćdziesiątych ubiegłego wieku wiemy dziś, że instrukcja genetyczna dotycząca budowy komórki znajduje się w jądrze w formie liniowej sekwencji zasad długiego chemicznego polimeru kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Następnie, w 1953 roku, Crick i Watson zaproponowali słynny model struktury DNA w formie podwójnej helisy, który wyjaśniał, jak informacja genetyczna jest przechowywana i przekazywana następnym pokoleniom. Przedstawiając, jak komórki wykorzystują instrukcję zakodowaną w genomie zbudowanym z DNA, Crick zasugerował, że istnieje jednokierunkowy przepływ informacji genetycznej z DNA poprzez cząsteczkę pośredniczącą, kwas rybonukleinowy (RNA), do białka. Innymi słowy, „z DNA powstają cząsteczki RNA, z których tworzą się białka”. Schemat ten, zaproponowany w czasach, gdy nie było eksperymentalnych dowodów na istnienie tego przepływu, stanowi dogmat biologii molekularnej. Obecnie wiemy, że w szerokim znaczeniu dogmat ten jest słuszny, chociaż musimy wprowadzić kilka modyfikacji w oryginalnym schemacie. Na rys. 1 przedstawiono schematyczną wersję przepływu informacji genetycznej. Główny szlak prowadzi od DNA poprzez RNA do białka i dotyczy również DNA zawartego w małych, niezależnych genomach mitochondrialnych i chloroplastowych. We wszystkich komórkach w DNA można wyróżnić jednostki kodujące (geny), które zawierają informację o budowie indywidualnych białek. Ten DNA jest przepisywany, czyli transkrybowany (patrz Sekcje F i H), na cząsteczkę RNA (informacyjny RNA, mRNA), która zawiera tę samą informację zapisaną w sekwencji nukleotydowej. Transkrypty można postrzegać jako „robocze” kopie oryginalnych genów znajdujących się w genomie. Następnie informacja z RNA jest tłumaczona, czyli ulega translacji (patrz Sekcja L), na sekwencję aminokwasową białka zgodnie z zasadami kodu genetycznego (patrz temat K1). Wszystkie te procesy, niezbędne do tego, by rozszyfrować informację genetyczną i uzyskać ostateczny produkt – funkcjonalną cząsteczkę – nazywamy ekspresją genów. Do schematu przedstawionego na rys. 1 możemy również włączyć replikację DNA (patrz Sekcja D), która, przez powielanie informacji w rodzicielskim DNA, prowadzi do powstania dwóch potomnych cząsteczek DNA w celu przepływu i zachowania informacji z pokolenia na pokolenie.

Rys. 1. Przepływ informacji genetycznej

Odkryto jednak pewne wyjątki od ogólnego schematu. Wiele cząsteczek RNA nie ulega translacji do białka, lecz działa jako funkcjonalne cząsteczki RNA (patrz tematy I2, L4 i Sekcja J). Ich geny można nazwać genami RNA. Wiele wirusów ma genomy złożone z cząsteczki RNA (patrz temat M4). U retrowirusów, do których zalicza się ludzki wirus niedoboru odporności (HIV, ang. human immunodeficiency virus), powodujący zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), jednoniciowa cząsteczka RNA jest przepisywana na dwuniciową kopię DNA, która następnie zostaje wprowadzona do genomu komórki gospodarza. Proces ten nazwano odwrotną transkrypcją. Znanych jest również wiele wirusów, których genom RNA jest kopiowany wprost na RNA, bez użycia DNA jako cząsteczki pośredniczącej (replikacja RNA) (patrz temat M4). Przykładami mogą być wirus grypy i wirus zapalenia wątroby typu C. Jak dotąd nie istnieją żadne przykłady białek, które byłyby zdolne do kodowania specyficznej sekwencji RNA lub DNA. Z tego powodu etap translacji w dogmacie biologii molekularnej wydaje się jednokierunkowy. W niektórych organizmach można znaleźć przykłady na to, że sekwencja informacyjnego RNA zostaje zmieniona po przepisaniu jej z DNA w procesie określanym jako redagowanie RNA (ang. RNA editing). Znane są przykłady, głównie wśród eukariontów, gdzie sekwencja RNA ulega zmianie po przepisaniu jej z DNA i żaden jej produkt białkowy, jeśli był to mRNA, nie odpowiada już dokładnie sekwencji DNA (patrz temat J4).

Podstawę dyskusji nad przepływem informacji genetycznej opisanej w tym podręczniku stanowi klasyfikacja biologiczna przyporządkowująca organizmy do jednej z trzech domen życia. W klasyfikacji tej ostatni uniwersalny wspólny przodek (LUCA, ang. last universal common ancestor) wszystkich organizmów najpierw rozdzielił się na dwie linie ewolucyjne prowadzące do bakterii i wspólnego przodka archeowców i eukariontów, które podzieliły się później. Bakterie i archeowce są prokariotyczne, czyli nie mają jądra. Jednak pod wieloma względami archeowce mają więcej cech wspólnych z jądrzastymi eukariontami. Większość przykładów opisanych w tym podręczniku dotyczy bakterii i eukariontów.

Technologia rekombinacji DNA

Główny postęp w biologii molekularnej stał się możliwy w późnych latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku, kiedy to rozwinięto techniki rekombinacji DNA (inżynierię genetyczną). Techniki te umożliwiły izolację, sekwencjonowanie, modyfikowanie oraz przenoszenie genów z jednego organizmu do drugiego i miały najważniejsze znaczenie dla naszego zrozumienia funkcjonowania komórki. Poza tym mikroorganizmy transgeniczne, uzyskiwane w ten sposób, są obecnie powszechnie wykorzystywane do produkcji na dużą skalę ludzkich terapeutyków, podczas gdy transgeniczne zwierzęta i rośliny mają ogromny potencjał zwiększania zakresu pożytecznych produktów, tak by można było uzyskać odmiany o lepszych parametrach wzrostu, odporności na choroby, a także tworzyć zwierzęce modele ludzkich chorób (patrz temat S5). Trwała korekcja choroby genetycznej poprzez terapię genową jest dzisiaj również realistycznym rozwiązaniem. W ostatnich latach znakomicie rozwinęły się technologie sekwencjonowania DNA, a koszty sekwencjonowania bardzo szybko maleją. Daje to nadzieję, że już wkrótce będzie możliwe sekwencjonowanie całych genomów poszczególnych osób, co pozwoli szacować podatność na choroby i wprowadzić takie analizy jako element podstawowej opieki zdrowotnej. Możemy syntetyzować nowe geny i składać je w kompletne genomy. W 2010 roku J. Craig Venter wraz ze współpracownikami odtworzyli kompletny genom małej bakterii, mykoplazmy, wprowadzili go do „pustej” komórki, pozbawionej własnego genomu, odtwarzając w ten sposób funkcjonujący organizm (patrz temat S7). Wprowadzona cząsteczka DNA miała pewne nowe właściwości, torując tym samym drogę do tworzenia „sztucznego życia”, organizmów „na zamówienie”, zawierających sztuczne genomy i zdolnych do pełnienia nowych biochemicznych funkcji, które nie istniały do tej pory w organizmach naturalnych, w celu wyprodukowania nowych leków, paliw i innych produktów. Można śmiało stwierdzić, że biologia molekularna i technologie genetyczne odgrywają kluczową rolę w postępie medycyny, weterynarii, rolnictwa i przemysłu biotechnologicznego, a obecnie muszą sprostać wyzwaniom XXI wieku, takim jak zdrowie na świecie, zmiany klimatyczne i bezpieczeństwo żywności.

A2

Budowa i funkcje kwasów nukleinowych

Hasła

Zasady

W DNA występują cztery heterocykliczne zasady: adenina (A) i guanina (G) oraz cytozyna (C) i tymina (T). Adenina i guanina są purynami, a cytozyna i tymina – pirymidynami. W RNA tyminę zastępuje strukturalnie bardzo podobna pirymidyna – uracyl (U).

Nukleozydy

Nukleozyd jest zbudowany z zasady kowalencyjnie związanej w pozycji 1’ cząsteczki cukru będącego pentozą. W RNA cukrem jest ryboza, dlatego jego składniki nazywa się rybonukleozydami lub nukleozydami, podczas gdy w DNA występuje 2’-deoksyryboza, stąd jego nukleozydy nazywa się 2’-deoksyrybonukleozydami lub deoksynukleozydami. Zasada + cukier = nukleozyd.

Nukleotydy

Nukleotydy są nukleozydami związanymi kowalencyjnie z jedną lub większą liczbą grup fosforanowych w pozycji 3’, 5’, a w rybonukleotydach także w 2’. Zasada + cukier + fosforan = nukleotyd. 5’-trifosforany nukleozydów (NTP lub dNTP) są substratami do syntezy odpowiednio RNA i DNA.

Wiązania fosfodiestrowe

W polimerowych cząsteczkach kwasów nukleinowych cukry – ryboza lub deoksyryboza – są połączone fosforanem usytuowanym między pozycją 5’ jednego cukru a 3’ następnego, tworzącym wiązanie 3’,5’-fosfodiestrowe. A zatem kwasy nukleinowe są zbudowane z ukierunkowanego rdzenia cukrowo-fosforanowego, w którym do każdego cukru w pozycji 1’ jest przyłączona zasada. Jednostką powtarzającą się jest nukleotyd. Kwasy nukleinowe są polimerami o ujemnym ładunku, ponieważ każda reszta fosforanowa jest ujemnie naładowana.

Sekwencje w DNA/RNA

Sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją zasad A, C, G, T/U w łańcuchu DNA lub RNA. Umownie przyjęto zapisywać ją od wolnego końca 5’ do wolnego końca 3’ cząsteczki, np. 5’-ATAAGCTC-3’ (DNA) lub 5’-AUAGCUUGA-3’ (RNA).

Podwójna helisa

DNA występuje przeważnie w postaci dwuniciowej helisy. Dwa oddzielne i antyrównoległe łańcuchy DNA są okręcone wokół siebie prawoskrętnie w sposób helikalny, tak że rdzeń cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz, a sparowane wiązaniami wodorowymi i oddziałujące warstwowo zasady usytuowane są wewnątrz. Adenina tworzy pary z tyminą, a guanina z cytozyną. Te dwa łańcuchy są komplementarne, jeden określa sekwencję drugiego.

Helisy A, B i Z

Poza odkrytą przez Watsona i Cricka „standardową” dwuniciową helisą DNA, znaną jako forma B i uważaną za najczęściej występującą in vivo, kwasy nukleinowe mogą tworzyć również formę prawoskrętną zwaną helisą A, która in vivo występuje także w RNA, oraz lewoskrętną dwuniciową helisę Z, powstającą tylko w specyficznych sekwencjach zasad i przypuszczalnie nieodgrywającą istotnej roli in vivo.

Drugorzędowa struktura RNA

Większość cząsteczek RNA występuje w postaci jednej nici, która zwijając się, może uzyskiwać złożoną konformację poprzez wewnątrzcząsteczkowe parowanie zasad i inne wiązania wodorowe w niektórych regionach cząsteczki. Złożoność struktury RNA ma odzwierciedlenie w różnorodności funkcji pełnionych przez cząsteczki RNA w komórce.

Modyfikacje kwasów nukleinowych

Kowalencyjne modyfikacje kwasów nukleinowych odgrywają określone role w komórce. W DNA są one na ogół ograniczone do metylacji adeniny i cytozyny, natomiast w RNA zakres modyfikacji jest znacznie większy.

Funkcje kwasów nukleinowych

DNA pełni wyłącznie funkcję nośnika informacji genetycznej. Cząsteczki RNA są bardziej wszechstronne i odgrywają liczne role strukturalne i funkcjonalne w mechanizmach oraz regulacji przechowywania, przepływu i przetwarzania informacji.

Tematy pokrewne

Chemiczne i fizyczne właściwości kwasów nukleinowych (B1)

Spektroskopowe i termiczne właściwości kwasów nukleinowych (B2)

Superzwijanie DNA (B3)

Struktura chromosomów prokariotycznych i eukariotycznych (Sekcja C)

Zasady

Rys. 1. Zasady występujące w kwasach nukleinowych

Rys. 2. Nukleozydy

Zasady występujące w DNA i RNA są heterocyklicznymi (zawierającymi węgiel i azot) pierścieniami aromatycznymi z różnymi podstawnikami (rys. 1). Adenina (A) i guanina (G) są purynami o budowie dwupierścieniowej (dwa złączone pierścienie), natomiast cytozyna (C), tymina (T) i uracyl (U) – jednopierścieniowymi pirymidynami. W RNA tymina jest zastąpiona przez uracyl. Tymina różni się od uracylu obecnością grupy metylowej w pozycji 5, a zatem tyminę można inaczej nazwać 5-metylouracylem.

Nukleozydy

W kwasach nukleinowych zasady są kowalencyjnie połączone z pierścieniem cukru – pentozy w pozycji 1’, tworząc nukleozyd (rys. 2). Cukrem w RNA jest ryboza, a w DNA – 2’-deoksyryboza, w której grupa hydroksylowa w pozycji 2’ została zastąpiona wodorem. W pirymidynach miejscem połączenia z zasadą jest pozycja 1 (N-1), a w purynach pozycja 9 (N-9) (rys. 1). Numery atomów w pierścieniu rybozy oznaczono: 1’-, 2’- itd. w celu odróżnienia ich od pozycji w zasadach. Wiązanie pomiędzy cukrami i zasadami nazywa się wiązaniem glikozylowym (lub glikozydowym). Jeżeli cukrem jest ryboza, to nukleozydy (formalnie rybonukleozydy) nazywają się: adenozyna, guanozyna, cytydyna i urydyna. Jeżeli cukrem jest deoksyryboza (jak w DNA), to nukleozydy (2’-deoksyrybonukleozydy) nazywamy deoksyadenozyną itd. Nazwy tymidyna i deoksytymidyna mogą być stosowane zamiennie.

Nukleotydy

Nukleotyd jest nukleozydem mającym jedną lub więcej grup fosforanowych związanych kowalencyjnie w pozycji 3’ albo 5’ lub (tylko w rybonukleotydach) w pozycji 2’. Jeżeli cukrem jest deoksyryboza, to nukleotyd nazywa się deoksyrybonukleotydem lub prościej deoksynukleotydem (rys. 3). Chemicznie związki te są estrami fosforanowymi. W pozycji 5’ mogą być przyłączone aż trzy reszty fosforanowe, tworząc np. adenozyno-5’-trifosforan lub deoksyguanozyno-5’-trifosforan, w skrócie nazywany ATP i dGTP. Podobnie określa się pozostałe nukleotydy: dCTP, UTP i dTTP (odpowiednik TTP). 5’-mono- i -difosforany w skrócie nazywamy AMP i dGDP. Nukleozydo-5’-trifosforany (NTP) i deoksynukleozydo-5’-trifosforany (dNTP) stanowią elementy budowlane, z których są syntetyzowane kwasy nukleinowe. W trakcie syntezy DNA lub RNA dochodzi do odcięcia dwóch reszt fosforanowych w formie pirofosforanu i pozostawienia w każdym nukleotydzie wbudowanym w łańcuch kwasu po jednej reszcie fosforanowej (patrz tematy D1 i F1). Tak więc nukleotyd jest powtarzającą się jednostką łańcucha DNA i RNA.

Wiązania fosfodiestrowe

W cząsteczce DNA lub RNA odpowiednio deoksyrybonukleotydy lub rybonukleotydy są połączone w polimerach łańcuchów kwasów nukleinowych poprzez kowalencyjne wiązanie reszt fosforanowych między grupą 5’-hydroksylową jednej rybozy i 3’-hydroksylową następnej (rys. 4). Tego rodzaju wiązanie nazywa się wiązaniem fosfodiestrowym, ponieważ reszta fosforanowa chemicznie występuje w formie diestru. Wynika z tego, że łańcuch kwasu nukleinowego jest ukierunkowany, czyli polarny. Każdy łańcuch kwasu nukleinowego, niezależnie od długości (o ile nie jest kolisty, patrz temat B3), ma wolny koniec 5’, na którym może się znajdować grupa fosforanowa (lub może jej nie być), oraz koniec 3’, który najczęściej stanowi wolna grupa hydroksylowa. W pH obojętnym każda grupa fosforanowa ma pojedynczy ładunek ujemny, dlatego łańcuchy polinukleotydowe nazywa się kwasami. Są one anionami silnych kwasów. Kwasy nukleinowe stanowią więc polimery o dużym ładunku ujemnym.

Rys. 3. Nukleotydy

Rys. 4. Wiązania fosfodiestrowe w strukturze nici DNA

Sekwencja DNA/RNA

Umownie przyjęto oznaczać powtarzające się monomery DNA i RNA pojedynczymi literami A, T, G, C i U. Przyjęto także zapisywać sekwencję od końca 5’ z lewej strony. Tak więc fragment sekwencji DNA można zapisać następująco: 5’-ATAAGCTC-3’ lub prościej: ATAAGCTC, a RNA – 5’-AUAGCUUGA-3’. Należy zauważyć, że ze względu na polarność łańcucha DNA fragmenty np. ATAAG i GAATA są różnymi związkami.

Dwuiciowa helisa DNA

DNA w naturze występuje przeważnie w postaci dobrze znanej dwuniciowej helisy. Podstawowe cechy tej struktury zostały określone w wyniku dedukcji przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka w 1953 roku. Dwa oddzielne łańcuchy DNA są owinięte wokół siebie w sposób helikalny, tworząc dwuniciową prawoskrętną helisę (rys. 5a). Ujemnie naładowane rdzenie cukrowo-fosforanowe cząsteczek DNA znajdują się na zewnątrz, a płaszczyzny zasad każdej z nici są ułożone jedna nad drugą w centrum helisy (rys. 5b). Pomiędzy rdzeniami cukrowo-fosforanowymi przebiegają mały i duży rowek, które również układają się helikalnie. Łańcuchy są połączone ze sobą niekowalencyjnie wiązaniami wodorowymi pomiędzy zasadami przeciwległych nici tworzącymi pary zasad (pz). Na jeden skręt dwuniciowej helisy DNA przypada około 10 par zasad. Dwa łańcuchy biegną w przeciwnych kierunkach (antyrównolegle) w odniesieniu do ich kierunku 5’→3’ i, co najważniejsze, są komplementarne w odniesieniu do swoich sekwencji. Ta druga cecha wynika ze struktury zasad i przestrzennych ograniczeń cukrowo-fosforanowego rdzenia DNA (patrz temat A3). W sumie powoduje to, że wiązania wodorowe między zasadami mogą się tworzyć tylko w parach puryna–pirymidyna, przy czym utworzone pary mają podobną geometrię i wymiary (rys. 6). Guanina tworzy parę z cytozyną (trzy wiązania wodorowe), a adenina z tyminą (dwa wiązania wodorowe), dlatego każda sekwencja może się ułożyć w regularną dwuniciową strukturę DNA. Sekwencja jednej nici określa specyficzną sekwencję drugiej, co – jak szybko zauważyli Watson i Crick – wpływa również na mechanizmy replikacji DNA (patrz temat D1). Oczywiście leży on również u podstaw mechanizmu transkrypcji sekwencji DNA do RNA (patrz temat F1).

Rys. 5. Dwuniciowa helisa DNA: (a) schematyczny obraz struktury; (b) bardziej szczegółowy obraz struktury z zaznaczeniem zasocjowanych warstwowo par zasad (pogrubione)

Rys. 6. Pary zasad DNA. Wiązania wodorowe zaznaczono liniami przerywanymi; dR = deoksyryboza

Helisy A, B i Z

W rzeczywistości zaobserwowano i zbadano kilka innych form dwuniciowej helisy kwasów nukleinowych, z których każda cechuje się podstawową strukturą dwóch helikalnie zwiniętych nici ułożonych antyrównolegle. Opisana wyżej struktura, zidentyfikowana przez Watsona i Cricka, znana jako helisa B-DNA (rys. 7a), jest uważana za wyidealizowaną formę struktury występującej in vivo praktycznie w każdym DNA. Charakteryzuje się ona helikalnym powtórzeniem 10 pz na skręt, występowaniem par zasad ułożonych w osi helisy, prawie do niej prostopadłych, oraz obecnością dobrze zdefiniowanych głębokich rowków – dużego i małego. Obecnie wiadomo jednak, że w rzeczywistej helisie B-DNA liczba par zasad na skręt helisy jest bliższa 10,5 pz/skręt oraz że w budowie DNA mogą się zdarzyć różne zaburzenia strukturalne, zależne od sekwencji nukleotydowej.

W warunkach niskiej wilgotności DNA może tworzyć dwuniciową helisę znaną jako forma A (rys. 7b). Podobnie jak forma B jest ona prawoskrętna, ale jej struktura jest szersza i krótsza, a pary zasad są odchylone względem osi helisy i w rzeczywistości leżą poza osią (w przekroju poprzecznym w środku helisy A znajduje się otwór). Na całkowity skręt helisy A przypada około 11 pz. Jakkolwiek istnieje możliwość, że w nadzwyczajnych warunkach cząsteczka DNA przyjmie in vivo formę A lub formę do niej zbliżoną, to jednak forma A odgrywa główną rolę w budowie RNA (patrz niżej) i hybrydach DNA-RNA; wynika to z tego, że w RNA grupa 2’-OH nie może się dopasować do teoretycznie bardziej stabilnej struktury formy B.

Rys. 7. Alternatywne helikalne formy podwójnej helisy DNA (opis w tekście)

DNA może tworzyć jeszcze inną niezwykłą strukturę helikalną. Lewoskrętny Z-DNA (rys. 7c) stanowi stabilną strukturę w syntetycznym dwuniciowym DNA składającym się z następujących po sobie na przemian reszt pirymidynowych i purynowych (np. 5’-CGCGCG-3’, oczywiście w drugiej nici występuje sekwencja komplementarna). Dzieje się tak dlatego, że w tej strukturze nukleotydy pirymidynowe i purynowe przyjmują bardzo odmienne konformacje od tych występujących w formach A i B, w których każdy nukleotyd ma zasadniczo taką samą strukturę przestrzenną. W formie Z nukleotydy purynowe przyjmują natomiast konformację syn, w której zasada purynowa leży bezpośrednio nad pierścieniem deoksyrybozy (na rys. 3 należy sobie wyobrazić rotację o 180° zasady purynowej względem wiązania glikozydowego; przedstawione na nim nukleotydy mają konformację anty). Nukleotydy pirymidynowe i wszystkie nukleotydy w formach A i B przyjmują konformację anty. Forma Z-DNA, w której na jeden skręt przypada 12 pz, ma zygzakowaty kształt. Choć można uznać za sensowne stwierdzenie, że jeden skręt składa się z 6 „dimerów par zasad”, to jednak jednostką powtarzalności wzdłuż każdej nici jest faktycznie dinukleotyd. W normalnym DNA forma Z nie tworzy się łatwo, nawet w regionach z powtórzeniami sekwencji CGCGCG, ponieważ miejsca formy Z graniczące z otaczającymi ją formami B byłyby bardzo niestabilne. Prawdopodobnie forma Z-DNA nie pełni in vivo istotnej funkcji biologicznej, chociaż sugeruje się, że może ona odgrywać rolę w usuwaniu napięć torsyjnych (patrz temat B3) w DNA podczas transkrypcji. Porównanie helis A, B i Z przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Zestawienie głównych cech form A, B i Z-DNA

Forma A

Forma B

Forma Z

Kierunek skręcenia

prawoskrętna

prawoskrętna

lewoskrętna

Średnica

~2,6 nm

~2,0 nm

~1,8 nm

Liczba par zasad na skręt helisy (n)

11

10

12 (6 dimerów)

Skręt helisy na parę zasad (= 360/n)

33°

36°

60° (na dimer)

Wzrost długości helisy na parę zasad (= h)

0,26 nm

0,34 nm

0,37 nm

Skok helisy (= nh)

2,8 nm

3,4 nm

4,5 nm

Odchylenie zasad od osi helisy

20°

6°

7°

Duży rowek

wąski/głęboki

szeroki/głęboki

płytki

Mały rowek

szeroki/płytki

wąski/głęboki

wąski/głęboki

Konformacja wiązania glikozydowego

anty

anty

anty (pyr)

syn (pur)

Drugorzędowa struktura RNA

RNA na ogół występuje jako cząsteczka jednoniciowa i dlatego nie ma długiej, regularnej struktury helikalnej takiej jak dwuniciowy DNA. Przyjmuje natomiast względnie globularne konformacje, w których lokalnie powstają regiony o strukturze helikalnej poprzez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe i ułożenie warstwowe zasad w obrębie jednego łańcucha kwasu nukleinowego. Regiony te mogą powstawać w miejscach, gdzie jedna część łańcucha RNA jest komplementarna wobec drugiej, dając w efekcie struktury spinki do włosów i ramię–pętla (patrz temat F1, rys. 3 i temat K2, rys. 2). Ta różnorodność konformacyjna została odzwierciedlona w bardziej zróżnicowanych funkcjach pełnionych w komórce przez RNA w porównaniu z DNA (patrz niżej).

Modyfikowane kwasy nukleinowe

Chemiczne modyfikacje zasad lub nukleotydów w kwasach nukleinowych występują powszechnie i odgrywają określone role. W komórkowym DNA modyfikacje ograniczają się do metylacji grupy aminowej związanej w pozycji N-6 adeniny oraz grupy N-4 i pozycji 5 cytozyny (rys. 1), chociaż bardziej złożone modyfikacje występują w DNA niektórych fagów. Metylacje te odgrywają dużą rolę w modyfikacjach miejsc restrykcyjnych (patrz temat O3), naprawie błędnie sparowanych zasad (patrz temat E3) oraz w strukturze i ekspresji genomu eukariotycznego (patrz tematy C2 i C3). Znacznie bardziej zróżnicowanym modyfikacjom ulega RNA po transkrypcji, co odzwierciedla różnorodność jego funkcji pełnionych w komórce. Są one omówione szczegółowo w tematach J3 i K2.

Funkcje kwasów nukleinowych

Rolą DNA jest wyłącznie przenoszenie informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie, a także służenie jako matryca podczas syntezy komplementarnej cząsteczki RNA. Cząsteczki RNA, chociaż też działają w niektórych przypadkach jak genom lub matryca (np. wirusy RNA, RNA telomerazy; patrz tematy M4 i D3) i służą jako pośrednik w przepływie informacji genetycznej od DNA do białka (mRNA, patrz temat A1), są mniej wiarygodnym (gdy chodzi o wierność zapisu) nośnikiem informacji genetycznej z uwagi na chemiczną niestabilność (patrz temat B1). Jednak ze względu na swoją budowę mogą zarówno układać się w bardzo różne formy przestrzenne, jak i parować się z DNA. Z powodu tych właściwości cząsteczki RNA pełnią w komórce szereg dodatkowych funkcji, podobnych do funkcji białek. Te RNA, występujące w bardzo dużych ilościach w komórce, nazywamy niekodującymi RNA (ncRNA), a to dlatego, że ich sekwencja nie jest tłumaczona na sekwencję aminokwasową białka. Ich geny nazywamy genami RNA. Wiele z nich stanowi strukturalne i funkcjonalne elementy składników maszynerii przeprowadzającej dojrzewanie pre-mRNA i translację (np. snRNA, tRNA, rRNA i 7SL RNA; patrz Sekcje J i L), podczas gdy inne, zwane rybozymami, mają aktywność katalityczną (jeszcze raz rRNA i RNaza P; patrz tematy J2 i L2). Niedawno okazało się, że zdumiewająco duża część genomu eukariotycznego koduje jeszcze inne niekodujące RNA, istotne w kontroli ekspresji genów. Podzielono je na długie lncRNA (> 200 nt) biorące udział przede wszystkim w kontroli transkrypcji (patrz temat I2) i krótkie (< 200 nt) miRNA, siRNA i piRNA, zaangażowane głównie w kontrolę translacji (patrz temat L4). Należy jednak podkreślić, że długość nie jest wartością absolutną, decydującą o funkcji danej klasy cząsteczek. Z uwagi na to, że cząsteczki RNA mogą stanowić magazyn informacji genetycznej, jak i katalizować oraz kontrolować reakcji chemiczne, uważa się, że cząsteczka RNA mogła być tą cząsteczką, która poprzedzała życie oparte na DNA, RNA i białkach.

A3

Budowa i funkcje białek

Hasła

Budowa aminokwasów

20 aminokwasów występujących w białkach ma chiralny węgiel α połączony z atomem wodoru, grupą aminową, grupą karboksylową i specyficznym dla każdego aminokwasu łańcuchem bocznym decydującym o właściwościach fizykochemicznych. Łańcuchy boczne mogą mieć charakter zasadowy (naładowane dodatnio), kwasowy (naładowane ujemnie), hydrofobowy (zarówno alifatyczne, jak i aromatyczne) lub mieć jeszcze inne, specyficzne grupy funkcyjne, np. grupy hydroksylowe, amidowe, tiolowe. Aminokwasy zachowują się w roztworze jak jony obojnacze. Z wyjątkiem dwóch niestandardowych aminokwasów pozostałe niestandardowe aminokwasy obecne w białku powstają w wyniku potranslacyjnych modyfikacji.

Wielkość i kształt białek

Białka globularne, wśród nich większość enzymów, zachowują się w roztworze jak zwarte, w przybliżeniu sferyczne cząsteczki. Białka fibrylarne mają kształt wydłużony i pełnią często funkcje strukturalne. Przykładami mogą być fibroina i keratyna. Wielkość białek waha się w granicach od kilku tysięcy do kilku milionów daltonów. Niektóre białka mają część niebiałkową, np. lipidy, węglowodany lub małe kofaktory.

Struktura pierwszorzędowa

Aminokwasy są połączone w białku wiązaniami peptydowymi powstającymi między grupami α-karboksylowymi i grupami α-aminowymi. Nowo powstała sekwencja polipeptydowa ma koniec N i koniec C. Zazwyczaj polipeptydy zawierają od 100 do 1500 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi.

Oddziaływania niekowalencyjne

Strukturę przestrzenną białka utrzymuje duża liczba słabych oddziaływań. Obejmują one oddziaływania typu ładunek–ładunek, ładunek–dipol i dipol–dipol pomiędzy atomami noszącymi cząstkowe lub całkowite ładunki. Ważne są również wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe, które wykluczają wodę.

Struktura drugorzędowa

Polipeptydy mogą się zwijać w regularne struktury. Prawoskrętna helisa α ma 3,6 aminokwasów na skręt i jest stabilizowana wiązaniami wodorowymi tworzącymi się między grupami N–H i C=O wiązań peptydowych, oddzielonych od siebie trzema resztami aminokwasowymi. Równoległe i antyrównoległe struktury harmonijki β są stabilizowane wiązaniami wodorowymi utworzonymi między różnymi częściami łańcucha polipeptydowego.

Struktura trzeciorzędowa

Różne odcinki struktur drugorzędowych oraz rejony łączące te struktury zwijają się w dobrze zdefiniowaną strukturę trzeciorzędową, w której większość aminokwasów hydrofilowych znajduje się na powierzchni struktury, a większość aminokwasów hydrofobowych – w jej wnętrzu. Struktura jest stabilizowana wiązaniami niekowalencyjnymi i czasami mostkami disiarczkowymi. Denaturacja prowadzi do utraty struktury drugo- i trzeciorzędowej.

Struktura czwartorzędowa

Wiele białek zawiera więcej niż jeden polipeptyd. Hemoglobina ma dwa łańcuchy α i dwa łańcuchy β. Duże kompleksy, takie jak mikrotubule, tworzą się przez czwartorzędowe asocjacje pojedynczych łańcuchów polipeptydowych. Efekty allosteryczne zależą zazwyczaj od oddziaływań między podjednostkami białkowymi.

Grupy prostetyczne

Niektóre białka są związane z cząsteczkami niebiałkowymi (grupy prostetyczne) wnoszącymi dodatkowe funkcje chemiczne. Do małych grup prostetycznych należą dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+), hem oraz jony metali, np. Zn2+.

Domeny tworzą częściowo niezależne strukturalne i funkcjonalne jednostki w obrębie jednego łańcucha polipeptydowego. Nowe białka mogą ewoluować poprzez nowe kombinacje domen. Motywy są grupami struktur drugorzędowych lub sekwencji aminokwasowych występujących często w danej rodzinie białek. Rodziny białek powstają wskutek duplikacji genów, a następnie poprzez niezależną ewolucję zduplikowanych genów.

Funkcje białek

Białka pełnią wiele różnorodnych funkcji. Mogą działać jako enzymy, przeciwciała, elementy strukturalne wewnątrz i na zewnątrz komórki, receptory i transportery chemicznych ligandów, regulatory i zapasy substancji odżywczych.

Tematy pokrewne

Duże układy makrocząsteczek (A4)

Synteza białka (Sekcja L)

Budowa aminokwasów

Białka są polimerami L-aminokwasów. Z wyjątkiem proliny wszystkie pozostałe aminokwasy występujące w białkach mają wspólną strukturę, w której atom węgla (węgiel α) jest połączony z grupą karboksylową, pierwszorzędową grupą aminową, atomem wodoru i łańcuchem bocznym (R), różnym w każdym z aminokwasów (rys. 1). Z wyjątkiem glicyny atom węgla α wszystkich aminokwasów jest chiralny (asymetryczny), to znaczy, że ma cztery różne chemicznie podstawniki. W związku z tym aminokwasy mogą występować jako pary optycznie czynnych stereoizomerów (D- i L-). W białkach występują jednak tylko L-izomery. W roztworach wodnych aminokwasy wykazują właściwości jonów dipolarnych (jonów obojnaczych) i zachowują się jak kwas i jak zasada (są związkami amfoterycznymi). Łańcuchy boczne różnią się wielkością, kształtem, ładunkiem i reaktywnością chemiczną. Jest to powodem różnic we właściwościach różnych białek (rys. 2). Wiele białek zawiera niestandardowe aminokwasy, np. kolagen 4-hydroksyprolinę i 5-hydroksylizynę. Aminokwasy te powstają w wyniku potranslacyjnych modyfikacji wyjściowego aminokwasu, np. proliny i lizyny (patrz temat L4) w nowo syntetyzowanym białku. Jednak selenocysteina (znajdowana w szeregu enzymów), w której Se zastępuje S cysteiny, i pirolizyna (modyfikowana lizyna występująca w przypadku kilku białek archeowców) są włączane do rosnącego łańcucha polipeptydowego poprzez subtelne manipulacje w kodzie genetycznym (patrz temat K1); niektórzy nazywają je 21. i 22. aminokwasem „standardowym”.

Niektóre aminokwasy mają w łańcuchach bocznych grupy zdolne do jonizacji, które w pH 7 dostarczają dodatkowego ładunku dodatniego lub ujemnego. „Kwasowe” aminokwasy, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, zawierają dodatkowe grupy karboksylowe, które są zazwyczaj zjonizowane (obdarzone ładunkiem ujemnym). „Zasadowe” aminokwasy mają dodatnio naładowane grupy – lizyna zawiera drugą grupę aminową związaną z atomem węgla ε, a arginina – grupę guanidynową. Grupa imidazolowa histydyny ma pKa niemal obojętne. Odwracalna protonacja tej grupy w warunkach fizjologicznych często stanowi część mechanizmu katalitycznego wielu enzymów. Kwasowe i zasadowe aminokwasy są razem zdolne tworzyć ważne w białkach mostki solne.

Polarne, nienaładowane łańcuchy boczne zawierają grupy, które tworzą wiązania wodorowe z cząsteczkami wody. Aminokwasy obdarzone ładunkiem i aminokwasy z polarnymi łańcuchami nieobdarzonymi ładunkiem są często opisywane jako aminokwasy hydrofilowe („lubiące wodę”). Seryna i treonina zawierają grupy hydroksylowe, a asparagina i glutamina są pochodnymi amidowymi kwasów asparaginowego i glutaminowego. Cysteina ma grupę tiolową (sulfhydrylową) i jest często utleniana do cystyny, w której dwie cysteiny połączone są ze sobą mostkiem disiarczkowym.

Fenyloalanina, tyrozyna (które również mogą ulegać fosforylacji) i tryptofan mają duże, hydrofobowe („nielubiące wody”) łańcuchy boczne, które uczestniczą w oddziaływaniach hydrofobowych utrzymujących strukturę białka (patrz niżej). To właśnie aromatyczna struktura tyrozyny i tryptofanu jest odpowiedzialna za absorpcję światła ultrafioletowego (UV) przez białka (z maksimum absorbcji przy 280 nm). Fenolowa grupa hydroksylowa tyrozyny może dodatkowo brać udział w tworzeniu wiązań wodorowych. Inne niepolarne hydrofobowe łańcuchy boczne obejmują alkilowe grupy alaniny, waliny, leucyny, izoleucyny i metioniny. Ta ostatnia zawiera atom siarki połączony z resztą aminokwasu wiązaniem tioeterowym. Prolina zawiera pierścień i stanowi nietypowy aminokwas ze względu na to, że jest iminokwasem, zwanym często aminokwasem drugorzędowym.

Rys. 1. Ogólna budowa L-aminokwasu. R oznacza łańcuch boczny

Rys. 2. Łańcuchy boczne (R) 20 aminokwasów powszechnie występujących w białkach. Standardowe skróty trójliterowe i jednoliterowe nazw aminokwasów podano w nawiasach.

*Pełną budowę proliny (aminokwasu z drugorzędową grupą aminową) przedstawiono, dlatego że jest iminokwasem

Wielkość i kształt białek

Wyróżnia się dwie duże klasy białek. Białka globularne są upakowane w sposób zwarty i zachowują się w roztworze podobnie jak cząstki sferyczne; większość naturalnych enzymów należy do klasy białek globularnych. Białka fibrylarne mają wydłużony kształt (duży stosunek długości do szerokości) i często pełnią bardzo ważne funkcje strukturalne, np. fibroina jedwabiu czy keratyna we włosach i wełnie. Masa cząsteczkowa białek może się wahać w granicach od kilku tysięcy daltonów (Da) – np. hormon insulina o długości 51 reszt aminokwasowych ma masę cząsteczkową 5734 Da (5,7 kiloDa, kDa) – do przynajmniej 4 milionów Da (4 MDa) w przypadku białka mięśni tytyny. Niektóre białka zawierają składową niebiałkową, czy to w formie małej grupy prostetycznej mogącej działać jako kofaktor w reakcjach enzymatycznych, czy też w formie dużych grup (np. lipidy w lipoproteinach lub węglowodany w glikoproteinach, patrz temat A4).

Struktura pierwszorzędowa

Grupa α-karboksylowa jednego aminokwasu jest związana kowalencyjnie wiązaniem amidowym, zwanym w białkach wiązaniem peptydowym, z grupą α-aminową następnego aminokwasu. Jeśli reszty dwóch aminokwasów zostaną w ten sposób ze sobą związane, powstanie dipeptyd. Wiele aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi tworzy polipeptyd (rys. 3). Powtarzająca się sekwencja atomów węgla α i wiązań peptydowych tworzy łańcuch główny (szkielet) polipetydu, podczas gdy łańcuchy boczne różnych aminokwasów decydują o funkcji białka. Aminokwas na jednym końcu białka ma wolną grupę α-aminową, a aminokwas na drugim końcu białka – wolną grupę α-karboksylową. Wynika z tego, że polipeptydy są w pewien specyficzny sposób zorientowane: mają koniec N i koniec C. Czasami koniec N białka jest zablokowany, np. grupą acetylową. Kolejność aminokwasów od końca N do C określa się mianem struktury pierwszorzędowej polipetydu. Typowa długość polipeptydu waha się w granicach 100–1500 reszt aminokwasowych, choć istnieją przykłady krótszych i dłuższych łańcuchów, np. tytyna ma około 34 000 reszt aminokwasowych.

Rys. 3. Fragment łańcucha polipeptydowego. Wiązanie peptydowe jest zaznaczone prostokątnym polem. W α helisie grupa CO n-tej reszty aminokwasowej jest połączona wiązaniem wodorowym z grupą NH reszty aminokwasowej n+4

Oddziaływania niekowalencyjne

Struktura przestrzenna białek, a także duże kompleksy zawierające białka (patrz temat A4) utrzymywane są dzięki wielu różnym oddziaływaniom niekowalencyjnym. Oddziaływania elektrostatyczne ładunek–ładunek (mostki solne) działają w fizjologicznym pH poprzez grupy zjonizowane o przeciwnym ładunku. Przykładem mogą być oddziaływania pomiędzy dodatnio naładowanymi łańcuchami bocznymi lizyny i argininy a ujemnie naładowanymi łańcuchami bocznymi kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego lub też ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi DNA w przypadku białek wiążących DNA, takich jak histony (patrz temat C2). Oddziaływania ładunek–dipol i dipol–dipol są słabsze i pojawiają się tylko wtedy, kiedy jedna cząsteczka lub obie są dipolem. W przypadku tych oddziaływań bowiem niezbędne jest, by przynajmniej jedna cząsteczka miała asymetryczny rozkład ładunku (rys. 4a). Nawet grupy nieobdarzone ładunkiem, takie jak grupa metylowa, mogą się przyciągać poprzez obecność chwilowych dipoli wynikających z ruchu elektronów (siły dyspersyjne).

Rys. 4. Przykłady: (a) sił van der Waalsa, (b) wiązań wodorowych

Wiązania niekowalencyjne między elektrycznie obojętnymi cząsteczkami nazywane są łącznie oddziaływaniami van der Waalsa. Duże znaczenie mają wiązania wodorowe. Tworzą się pomiędzy kowalencyjnie związanym atomem wodoru w grupie donorowej (np. –O-H lub –N-H) a parą niezwiązanych elektronów na grupie akceptorowej (np. O = C– lub N–) (rys. 4b). Wiązania wodorowe i inne oddziaływania z udziałem dipoli mają charakter kierunkowy, a zatem pomagają zdefiniować kształty makrocząsteczkowe i specyfikę oddziaływań cząsteczkowych. Obecność substancji nienaładowanych i niepolarnych, np. lipidów, w środowisku wodnym wymusza wysoce uporządkowaną strukturę otaczających je cząsteczek wody. Jest to niekorzystne energetycznie, ponieważ zmniejsza entropię układu. W związku z tym niepolarne cząsteczki i grupy funkcyjne, takie jak łańcuchy boczne aminokwasów alifatycznych i aromatycznych, mają tendencję do zlepiania się, zmniejszając całkowitą powierzchnię wystawioną na działanie wody. To przyciąganie jest określane jako oddziaływanie hydrofobowe i stanowi główną siłę stabilizującą w oddziaływaniach białko–białko i białko–lipid oraz w utrzymaniu struktury kwasów nukleinowych (patrz temat A2).

Struktura drugorzędowa

Wysoce polarne właściwości grup C=O i N–H wchodzących w skład wiązania peptydowego nadają wiązaniu C–N charakter wiązania częściowo podwójnego. To sprawia, że wiązanie peptydowe jest sztywne i płaskie, a główny łańcuch może się obracać jedynie z każdej strony tego wiązania. Polarny charakter grup C=O i N–H faworyzuje tworzenie wiązań wodorowych między odpowiednio oddalonymi i zorientowanymi jednostkami wiązań peptydowych. Wymienione właściwości wiązań peptydowych powodują, że łańcuch peptydowy jest zdolny zwijać się w określoną liczbę regularnych struktur, stabilizowanych wyżej wymienionymi wiązaniami wodorowymi. Najbardziej znaną strukturą drugorzędową jest struktura helisy α (rys. 5a). Łańcuch główny polipeptydu tworzy prawoskrętną helisę zawierającą 3,6 reszt aminokwasowych na skręt, a wiązania wodorowe stabilizujące tę strukturę powstają między grupami N–H i C=O oddzielonymi trzema resztami aminokwasów (rys. 3). Odcinki helisy α obserwuje się często w białkach globularnych i w niektórych białkach fibrylarnych. Rzadziej występująca helisa 3_10 jest podobna, ale ma inne wymiary.

Rys. 5. Struktura drugorzędowa typu helisy α. Dla jasności rysunku przedstawiono tylko węgle α, atomy węgla i azotu wiązań peptydowych, pochodzące z łańcucha głównego (a). Fragment drugorzędowej struktury typu β (b)

Struktury typu harmonijki β (struktury β) tworzą się poprzez wiązania wodorowe pomiędzy grupami N–H i C=O wiązań peptydowych a komplemetarnymi grupami wiązań peptydowychznajdujących się w innych rejonach łańcucha polipeptydowego (rys. 5b). Kilka odcinków łańcucha polipeptydowego może być ułożonych jeden obok drugiego, tworząc tzw. strukturę β-dywanową, w której łańcuchy boczne reszt aminokwasowych (R) występują naprzemiennie nad lub pod płaszczyzną struktury. Jeśli ułożone obok siebie odcinki polipeptydu biegną w tym samym kierunku (tzn. N→C i N→C), to taką strukturę nazywamy równoległą. Jeżeli natomiast biegną w kierunkach przeciwnych (tzn. N→C i C→N), struktura jest antyrównoległa. Czasami występują również mieszane struktury β, w których spotyka się zarówno struktury ułożone równolegle, jak i antyrównolegle. Struktury β-dywanowe są stabilne, sztywne i odgrywają ważną rolę w białkach strukturalnych, np. w fibroinie. Kolagen – białko tkanki łącznej – ma nietypową strukturę drugorzędową potrójnej helisy, w której trzy łańcuchy polipeptydowe okręcają się wokół siebie, zapewniając białku odporność na rozciąganie.

Struktura trzeciorzędowa

Strukturę trzeciorzędową polipeptydu tworzy wzajemne przestrzenne ułożenie głównych struktur drugorzędowych: helis α, struktur β, innych pomniejszych struktur drugorzędowych i pętli łączących wyżej wymienione elementy (rys. 6). Struktura trzeciorzędowa polipeptydu wynika ze struktury pierwszorzędowej. Jeśli warunki są odpowiednie, większość polipeptydów zwija się spontanicznie w poprawną strukturę trzeciorzędową, jako że jest to zazwyczaj struktura o najniższej energii konformacji dla danej sekwencji aminokwasowej. Proces zwijania się białka in vivo przebiega w obecności białek zwanych czaperonami (białkami opiekuńczymi), zapobiegających błędnemu zwijaniu się nowych polipeptydów, których synteza (struktura pierwszorzędowa) nie została jeszcze dokończona. Zwijanie się przebiega w ten sposób, że reszty hydrofilowe łańcuchów bocznych znajdują się głównie na zewnątrz białka, gdzie mogą one oddziaływać z cząsteczkami wody lub jonami roztworu, podczas gdy hydrofobowe reszty aminokwasów są chowane do wnętrza białka ulegającego zwijaniu, skąd cząsteczki wody są wypierane. Daje to ogólną stabilność powstałej strukturze. Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana różnego typu oddziaływaniami niekowalencyjnymi między łańcuchami bocznymi. Są to siły van der Waalsa, wiązania wodorowe, elektrostatyczne mostki solne tworzące się między przeciwnie naładowanymi grupami i oddziaływania hydrofobowe powstające między niepolarnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów alifatycznych i aromatycznych. Dodatkowo mogą się tworzyć kowalencyjne mostki disiarczkowe między resztami dwóch cystein odległych od siebie w strukturze pierwszorzędowej, lecz zbliżonych do siebie w upakowanej strukturze trzeciorzędowej. Zniszczenie struktury drugo- i trzeciorzędowej przez podgrzanie lub ekstremalne pH prowadzi do denaturacji białka i utworzenia konformacji typu statystyczny kłębek. Po denaturacji aktywność biologiczna białka zostaje zazwyczaj utracona, a cząsteczki mają tendencję do łączenia się i tworzą nierozpuszczalne agregaty, ponieważ w formie zdenaturowanej białka prezentują na powierzchni reszty hydrofobowe dążące do oddziaływania ze sobą, by wykluczyć cząsteczki wody.

Rys. 6. Schemat fragmentu trzeciorzędowej struktury białka

To, jak ważne jest prawidłowe zwinięcie białka, ilustruje fakt, że schorzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, są związane z gromadzeniem się nierozpuszczalnych agregatów białkowych w neuronach, zwanych złogami amyloidowymi, zbudowanych głównie ze struktur β. W przypadku choroby owiec zwanej kołowacizną, gąbczastej encefalopatii bydła (BSE, choroby wściekłych krów) i choroby Creutzfeldta-Jakoba (CID, choroby ludzkiej) czynnikiem chorobotwórczym jest prion zbudowany głównie z błędnie zwiniętych cząsteczek białka. W momencie wniknięcia prionu do neuronu dochodzi do związania się prionu z powiązanym z prionem białkiem komórkowym, co wywołuje denaturację (nieprawidłowe zwinięcie) tego ostatniego. Wiązanie uruchamia reakcję łańcuchową denaturacji białka komórkowego i tworzenie się amyloidu, prowadząc do utraty funkcji przez komórkę.

Struktura czwartorzędowa

Wiele białek składa się z dwóch lub więcej łańcuchów polipeptydowych (podjednostek) i tworzy oligomery – z kilku podjednostek lub multimery – z wielu podjednostek. Podjednostki mogą być identyczne (homomery) lub różne (heteromery). Na przykład hemoglobina ma dwa łańcuchy α-globinowe i dwa łańcuchy β-globinowe (α_2β_2). Te same siły, które stabilizują strukturę trzeciorzędową, utrzymują razem podjednostki białka. Wśród tych wiązań są również mostki disiarczkowe między dwiema cysteinami należącymi do różnych polipeptydów. Ten poziom organizacji nazywa się strukturą czwartorzędową. Tworzenie takiej struktury powoduje pewne implikacje. Po pierwsze, umożliwia tworzenie bardzo dużych cząsteczek białkowych, takich jak mikrotubule cytoszkieletu (patrz temat A4, rys. 1). Po drugie, może zapewnić białku większą funkcjonalność poprzez połączenie różnych aktywności w jedną całość, tak jak w przypadku holoenzymu polimerazy DNA III i replisomu (patrz temat D2). Często oddziaływania między podjednostkami są modyfikowane poprzez związanie małych cząsteczek, co z kolei może prowadzić do efektów allosterycznych, ważnych w regulacji aktywności enzymów. Znanych jest również wiele przykładów przejściowych kompleksów białkowych, szczególnie w przypadku ścieżek sygnalizacji komórkowej. W takich kompleksach modyfikacje potranslacyjne (takie jak fosforylacja, patrz temat L4) jednego z białek kompleksu wywołują krótkie oddziaływanie białek ze sobą, a to doprowadza do zmiany konformacyjnej w drugim białku, co aktywuje lub inaktywuje to białko.

Grupy prostetyczne

Wiele białek złożonych zawiera związane kowalencyjnie bądź niekowalencyjnie małe cząsteczki zwane grupami prostetycznymi, które wnoszą do białka właściwości chemiczne, jakich nie mogą mu dostarczyć boczne łańcuchy reszt aminokwasowych. Wiele z grup prostetycznych to kofaktory reakcji katalizowanych przez enzymy. Przykładami mogą być dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+) w wielu dehydrogenazach, fosforan pirydoksalu w transaminazach, hem w hemoglobinie i cytochromach oraz jony metali, np. Zn2+, a także grupy acylowe kwasów tłuszczowych, które kotwiczą białka w błonie komórkowej poprzez oddziaływania hydrofobowe. Takie białka nazywamy koniugatami białek, a białko bez swojej grupy prostetycznej określamy mianem apoproteiny. Inne białka złożone są zasocjowane z makrocząsteczkami i tworzą z nimi duże kompleksy. Przykładami tego typu makrocząsteczek są węglowodany (glikoproteiny), tłuszcze (lipoproteiny) czy kwasy nukleinowe (nukleoproteiny) (patrz temat A4).

Domeny, motywy, rodziny i ewolucja

Wiele białek jest zbudowanych ze strukturalnie niezależnych jednostek, domen. Domeny wchodzą w skład jednego polipeptydu i są ze sobą połączone krótkimi odcinkami aminokwasowymi, tworząc razem strukturę wyższego rzędu. Krótkie odcinki łącznikowe mogą działać jak zawiasy, pozwalając indywidualnym domenom przemieszczać się względem innych domen. Ograniczona proteoliza białka prowadzi często do zerwania łączników i rozdzielenia domen, które zachowują się wtedy jak niezależne globularne białka. Czasami rowek powstający między dwiema domenami otaczającymi substrat tworzy miejsce aktywne enzymu, oddziałując ze związanym substratem. Domeny mogą wykazywać pewne specyficzne funkcje, takie jak wiązanie powszechnie wykorzystywanej w procesach metabolicznych cząsteczki, np. ATP. Jeśli tego typu aktywność występuje w wielu różnych białkach, często można w nich zidentyfikować ten sam typ domeny odpowiedzianej za tę funkcję. U eukariontów domeny są zwykle kodowane przez oddzielne części genów, zwane eksonami (patrz temat J3). Z tego względu sugerowano, że w czasie ewolucji nowe białka powstawały przez duplikacje i rearanżacje genomowe eksonów kodujących domeny. Proces ten prowadził do pojawienia się w nowych polipeptydach kombinacji miejsc wiązań substratów, centrów katalitycznych i elementów strukturalnych. Taki proces mógł znakomicie zwiększyć tempo ewoluowania nowych funkcjonalnych białek.

Motywy strukturalne (zwane też strukturami naddrugorzędowymi) są zespołami elementów struktur drugorzędowych, które często występują w białkach globularnych. Motywy strukturalne mają zwykle znaczenie funkcjonalne i stanowią istotne części miejsc wiązania i centrów katalitycznych, zachowanych w trakcie ewolucji rodziny białek (od czasu rozejścia się dróg ewolucyjnych od wspólnego przodka). Alternatywnie motywy te mogą reprezentować najlepsze rozwiązanie dla wymogów strukturalno-funkcjonalnych i pojawić się niezależnie w niespokrewnionych białkach. Typowym przykładem takiego motywu jest motyw βαβ, w którym helisa α łączy dwa równoległe łańcuchy struktury β (rys. 7). Dwa częściowo nachodzące na siebie motywy βαβ (βαβαβ) tworzą miejsce wiązania dinukleotydu (np. NAD+) w wielu skądinąd niespokrewnionych białkach. Motywy sekwencyjne składają się z liniowych sekwencji kilku konserwowanych, funkcjonalnie ważnych reszt aminokwasowych, a nie z powodu tworzenia struktur naddrugorzędowych. Często są to miejsca wiązania lub katalizy.

Rys. 7. Model motywu βαβ. Helisę α przedstawiono w formie zwiniętej wstążki, a rejony β jako płaskie strzałki

Rodziny białek powstały w wyniku sukcesywnych duplikacji genu-przodka i ewolucji dywergentnej utworzonych duplikatów. Mioglobina, białko magazynujące tlen w mięśniach, łańcuchy α i β (oraz występujący w małych ilościach łańcuch δ) hemoglobiny dorosłych osobników i łańcuchy γ (gamma), ε (epsilon), ζ (zeta) globin hemoglobiny embrionalnej i płodowej są polipeptydami należącymi do rodziny białek globinowych (rys. 8). Uznaje się, że geny i białka z rodziny białek globinowych są homologami. Geny tej samej rodziny, których produkty zachowały u różnych gatunków tę samą funkcję i to samo znaczenie biochemiczne (np. mioglobina szczura i myszy), nazywamy ortologami. Natomiast geny, których produkty często pełnią podobne funkcje (np. α-globiny i β-globiny), ale ewoluowały niezależnie, nazywamy paralogami. Stopień podobieństwa między sekwencjami aminokwasowymi ortologów w różnych organizmach zależy od tego, kiedy drogi ewolucyjne porównywanych organizmów się rozeszły i na ile ważne są poszczególne reszty aminokwasowe dla funkcji białka. Funkcja białka, strukturalna lub katalityczna, jest nierozerwalnie związana z jego strukturą. Jak wspomniano wyżej, podobne struktury i funkcje powstają również w wyniku ewolucji konwergentnej. W tym przypadku niespokrewnione ze sobą geny ewoluują niezależnie, ale ich produkty są białkami wykazującymi podobną strukturę i podobną aktywność katalityczną. Dobrym tego przykładem mogą być dwa enzymy proteolityczne: subtylizyna (enzym bakteryjny) i chymotrypsyna (enzym zwierzęcy). Chociaż sekwencja aminokwasowa obu białek jest bardzo różna i są one zbudowane z różnych motywów strukturalnych, to w obu białkach powstała identyczna triada katalityczna, czyli orientacja przestrzenna trzech aktywnych katalitycznie aminokwasów – seryny, histydyny i kwasu asparaginowego. Oba enzymy wykorzystują ten sam mechanizm katalityczny w celu hydrolizowania wiązań peptydowych. Takie białka określamy mianem funkcjonalnych analogów. Jeśli podobne motywy strukturalne białka wyewoluowały niezależnie, takie białka są nazywane strukturalnymi analogami.

Rys. 8. Ewolucja białek globinowych wywodzących się od pierwotnej globiny

Funkcje białek

• Enzymy: Z wyjątkiem kilku aktywnych katalitycznie cząsteczek RNA (patrz temat J2) wszystkie enzymy są białkami. Enzymy mogą zwiększać szybkość reakcji biochemicznej o kilka rzędów wielkości. Wiązanie substratu przez enzym odbywa się przez oddziaływania niekowalencyjne z łańcuchami bocznymi specyficznych aminokwasów. Wśród oddziaływań tych znajdują się siły van der Waalsa, wiązania wodorowe, mostki solne i oddziaływania hydrofobowe. Specyficzność wiązania może być niezwykle duża – taka, że z enzymem wiąże się tylko jeden rodzaj substratu (np. oksydaza glukozowa wiąże tylko glukozę), lub mniejsza – z enzymem wiąże się specyficznie wiele rodzajów substratów (np. heksokinaza wiąże różne heksozy). Łańcuchy boczne aminokwasów mogą być bezpośrednio zaangażowane w katalizę, działając jako grupy nukleofilowe lub jako dawcy albo biorcy protonów.

• Sygnalizacja: Białka receptorowe błon komórkowych mogą wiązać ligandy (np. hormony) z zewnętrznego otoczenia i wskutek powstałej konformacyjnej zmiany białka inicjować w komórce reakcje będące odpowiedzią na związanie liganda. Wiązanie liganda przypomina wiązanie substratu, tyle tylko, że ligand pozostaje niezmieniony. Niektóre hormony same są małymi białkami, np. insulina i hormon wzrostu. Kinazy białkowe, które modyfikują właściwości innych białek przez przyłączanie do nich grup fosforanowych pochodzących z ATP, są kluczowymi enzymami sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

• Transport i magazynowanie: Hemoglobina przenosi tlen w krwinkach czerwonych, a transferyna przenosi żelazo do wątroby. Gdy żelazo znajdzie się już w wątrobie, zostaje związane z białkiem ferrytyną i jest w ten sposób przechowywane. Spożywane tłuszcze są przenoszone we krwi przez lipoproteiny. Wiele innych cząsteczek i jonów jest przenoszonych i magazynowanych w formie związanej z białkiem. Taka forma zwiększa rozpuszczalność i redukuje reaktywność przechowywanych substancji do momentu wystąpienia zapotrzebowania na te cząsteczki czy jony.

• Struktura i ruch: Kolagen jest głównym białkiem skóry, kości i tkanki łącznej, podczas gdy włosy są zbudowane głównie z keratyny. Wiele białek pełni funkcje strukturalne w komórkach, np. jako składniki cytoszkieletu. Dwa główne białka mięśni – aktyna i miozyna – tworzą filamenty mogące się ślizgać względem siebie, a zjawisko to jest podstawą skurczu mięśni.

• Odżywianie: Kazeina jest głównym składnikiem mleka, a owalbumina – „białka” jaj; są wykorzystywane jako źródła aminokwasów w czasie rozwoju i wzrostu potomstwa. Białka zapasowe znajdujące się w nasionach również stanowią źródło pokarmowe dla kiełkujących roślin.

• Odporność: Przeciwciała, które rozpoznają i wiążą bakterie, wirusy i inne obce substancje (antygeny), są białkami.

• Regulacja: Czynniki transkrypcyjne wiążą się z DNA i regulują proces transkrypcji. Wiele innych białek reguluje funkcje różnych cząsteczek poprzez wiązanie się z nimi.

A4

Duże układy makrocząsteczek

Hasła

Duże kompleksy białkowe

Białka mogą ze sobą asocjować w wyjątkowo duże struktury. Cytoszkielet komórek eukariotycznych składa się z różnych kompleksów białkowych: mikrotubuli (utworzonych z tubuliny), mikrofilamentów i włókien mięśniowych (zbudowanych z aktyny i miozyny), rzęsek i wici. Kompleksy te nadają komórkom i organellom subkomórkowym właściwy dla nich kształt i umożliwiają ruch komórki i organelli.

Białka złożone

Glikoproteiny i proteoglikany (mukoproteiny) reprezentują białka związane kowalencyjnie z węglowodanami i zazwyczaj występują na powierzchni zewnętrznej komórki oraz w przestrzeni międzykomórkowej. Lipoproteiny pełnią funkcje transporterów związków lipidowych w środowisku wodnym. Mieszane kompleksy, jak te omówione wyżej, mają znacznie szerszy zakres funkcji niż ich pojedyncze składniki.

Nukleoproteiny

Bakteryjne rybosomy 70S składają się z dużej podjednostki 50S, zawierającej cząsteczki 23S rRNA, 5S rRNA i 31 białek, oraz małej podjednostki 30S, w skład której wchodzą cząsteczka 16S rRNA i 21 białek. Rybosomy eukariotyczne 80S również składają się z podjednostek zawierających białka i rRNA: dużej (60S, zawierającej 28S, 5,8S i 5S rRNA) i małej (40S, zawierającej 18S rRNA). Chromatyna zawiera DNA i zasadowe białka histonowe. Kompleksami nukleoproteinowymi są także wirusy.

Błony

Błonowe fosfolipidy i sfingolipidy tworzą dwuwarstwę, w której grupy polarne są ulokowane na zewnątrz, a łańcuchy węglowodorowe pozostają skierowane do wnętrza struktury. Białka błonowe mogą być peryferyczne lub wbudowane w błonę. Działają jako receptory, enzymy, przenośniki lub cząsteczki pośredniczące w interakcjach pomiędzy komórkami.

Tematy pokrewne

Budowa i funkcje białek (A3)

Struktura chromatyny (C2)

Dojrzewanie rRNA i rybosomy (J1)

Bakteriofagi i wirusy eukariotyczne (Sekcja M)

Duże kompleksy białkowe

Niewiele makrocząsteczek działa w pojedynkę jako monomery. Zazwyczaj asocjują one z innymi makrocząsteczkami, tej samej lub różnych klas, w stabilne lub słabe, przejściowe kompleksy w celu wykonania odpowiednich zadań. Niektóre z tych kompleksów są wyjątkowo duże. Na przykład wiele podstawowych struktur i elementów lokomocyjnych komórki jest zbudowanych z kompleksów dużych białkowych. Cytoszkielet stanowi układ filamentów białkowych organizujących kształt komórki, jej ruch oraz wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie organelli. Mikrotubule są długimi polimerami (200–25 000 nm długości) tubuliny, białka globularnego o masie 110 kilodaltonów (kDa), które samo jest dimerem różnych podjednostek α i β (patrz temat A3) (rys. 1). Stanowią one główny składnik cytoszkieletu, wrzeciona mitotycznego (patrz temat C3) oraz eukariotycznych rzęsek i wici. Rzęski i wici są włosowatymi strukturami występującymi na powierzchni wielu komórek; ich bijące ruchy umożliwiają przemieszczanie się komórek lub wymuszanie przepływu cieczy względem powierzchni komórek. Rzęski zawierają też białka: neksynę i dyneinę. Mikrofilamenty składające się z białka aktyny tworzą razem z innym białkiem, miozyną, kurczliwe układy umożliwiające ruch cytoplazmy. Aktyna i miozyna są też głównymi składnikami włókien mięśniowych.

Rys. 1. Budowa mikrotubuli: (a) tubulina zbudowana jest z podjednostek α i β; (b) protofilament tubuliny składa się z wielu połączonych podjednostek; (c) mikrotubulę tworzy 13 ułożonych równolegle protofilamentów; (d) przekrój poprzeczny mikrotubuli

Za: Hames and Hooper (2011) Instant Notes in Biochemistry, 4th edn, Garland Science

Białka złożone

Szereg białek złożonych (patrz temat A3) obejmuje kompleksy białek z jedną lub większą liczbą innych głównych klas makrocząsteczek – węglowodanów, lipidów lub kwasów nukleinowych. Złożoność kompleksów zwiększa ich zakres funkcji lub możliwości strukturalnych.

Glikoproteiny zawierają zarówno składniki białkowe, jak i węglowodanowe (te ostatnie w ilości od < 1% do > 90% wagowo); glikozylacja jest najpowszechniejszą formą potranslacyjnych modyfikacji białek (patrz temat L4). Część cukrowcowa w glikoproteinach zawsze jest kowalencyjnie przyłączona do białka, zlokalizowana na zewnątrz, a nigdy wewnątrz jego cząsteczki, i często wykazuje zmienny skład, powodując mikroheterogenność glikoprotein (rys. 2), co jest powodem trudności w badaniach tych związków. Funkcje glikoprotein obejmują cały zakres aktywności, jakie mogą podejmować białka. Zwykle występują na zewnątrz komórek, jako białka wydzielnicze, lub pozostają zanurzone w błonie komórkowej (patrz niżej), gdzie uczestniczą we wzajemnym rozpoznawaniu się komórek lub działają jako receptory. Przeciwciała i niektóre białkowe hormony są glikoproteinami.

Proteoglikany (mukoproteiny) są dużymi kompleksami (> 10^7 Da) białek i mukopolisacharydów (glikozaminoglikanów) oraz ważnymi składnikami macierzy pozakomórkowej – materiału, który łączy i organizuje komórki w tkankach. Ich jednostki cukrowcowe często zawierają reszty kwasu siarkowego (siarczan chondroityny, siarczan heparyny), co decyduje o ich silnym ładunku i wysokiej hydratacji. Właściwość ta oraz ich długość (> 1000 jednostek monomerycznych) nadają roztworom mukoprotein dużą lepkość. W tkance łącznej proteoglikany spełniają podobne funkcje jak smar i amortyzatory w przestrzeni międzykomórkowej.

Lipoproteiny zawierają składniki lipidowe niekowalencyjnie związane z białkiem. Ponieważ lipidy słabo rozpuszczają się w wodzie, ich transport we krwi przebiega w formie lipoprotein. Transportowane lipidy to zazwyczaj triglicerydy i estry cholesterolu opłaszczone warstwą fosfolipidów, cholesterolu i białka. Zarówno średnica tych cząstek, jak i skład białkowy są bardzo różne. Ich wielkość i zawartość białka wahają się odpowiednio od 500 nm i 1–2% zawartości białka (chylomikrony) do 10 nm i 35% zawartości białka (lipoproteina wysokiej gęstości, HDL). Budowa apolipoprotein (białka pozbawionego części lipidowej) jest znamienna: hydrofobowe reszty aminokwasowe kontaktują się z częścią lipidową ukrytą wewnątrz cząstki, a obdarzone ładunkiem i polarne reszty aminokwasowe (patrz temat A3) są eksponowane na zewnątrz cząstki i kontaktują się z wodnym środowiskiem zewnętrznym. Dzięki takiej organizacji cząstki te są rozpuszczalne w wodzie.

Rys. 2. Struktura glikoproteiny. Symbole o różnych kształtach przedstawiają reszty różnych monosacharydów (galaktozy, N-acetyloglukozoaminy itp.)

Nukleoproteiny

Nukleoproteiny składające się z białek i kwasów nukleinowych są przykładem szczególnie ważnych białek złożonych w biologii molekularnej. Jednymi z małych rybonukleoprotein są telomeraza (patrz tematy C3 i D3) i rybozym rybonukleaza P (patrz temat J2). Obie cząstki zawierają RNA. Dużymi cytoplazmatycznymi kompleksami rybonukleoproteinowymi są rybosomy, na których zachodzi synteza białek (patrz Sekcja L). Bakteryjne rybosomy 70S składają się z dwóch podjednostek: dużej (50S) i małej (30S), o łącznej masie 2,5 × 10^6 Da (wielkość S, np. 50S, jest liczbową wartością współczynnika sedymentacji s i opisuje szybkość, z jaką makrocząsteczki lub cząstki sedymentują w polu grawitacyjnym wirówki; wartość współczynnika sedymentacji zależy od masy i kształtu cząsteczki lub cząstki, dlatego wartości S są nieaddytywne). Podjednostka 50S zawiera cząsteczki 23S i 5S RNA (rRNA) oraz 31 różnych białek, a podjednostka 30S składa się z cząsteczki 16S rRNA i 21 różnych białek. Eukariotyczne rybosomy 80S mają podjednostki 60S (zawierające 28S, 5,8S i 5S rRNA) i 40S (zawierające 18S rRNA). W odpowiednich warunkach in vitro mieszanina cząsteczek rRNA i białek, łącząc się w uporządkowanej kolejności, zrekonstruuje funkcjonalny rybosom. Cząsteczki rRNA nie są tylko rusztowaniem do przyłączenia białek rybosomowych, lecz biorą udział zarówno w wiązaniu mRNA, jak i katalizie wiązania peptydowego (patrz temat L2).

Chromatyna stanowi materiał, z którego są tworzone chromosomy eukariotyczne. Jest to kompleks deoksyrybonukleoproteinowy, złożony w przybliżeniu z równych (wagowo) ilości DNA i małych zasadowych białek zwanych histonami. Powtarzającymi się jednostkami chromatyny są nukleosomy (patrz temat C2). Histony neutralizują odpychanie się ujemnych ładunków cukrowo-fosforanowego rdzenia łańcucha DNA i umożliwiają ciasne upakowanie DNA w postaci skondensowanych chromosomów. Histony pełnią także inną bardzo ważną funkcję kontroli ekspresji genów. Innym przykładem kompleksów nukleoproteinowych są bakteriofagi i wirusy, omówione w Sekcji M.

Błony

Fosfolipidy i sfingolipidy umieszczone w środowisku wodnym spontanicznie tworzą dwuwarstwę lipidową, w której ich grupy polarne są skierowane na zewnątrz, a niepolarne łańcuchy węglowodorowe – do wewnątrz dwuwarstwy. Układ taki stanowi strukturalną podstawę wszystkich błon biologicznych. Błony tego rodzaju tworzą granice komórek oraz organelli i są selektywnie przepuszczalne dla cząsteczek niezawierających ładunku. Skład lipidowy błon zmienia się od komórki do komórki i od organelli do organelli. Ważnym składnikiem błon są także białka (rys. 3). Peryferyczne białka błonowe w luźny sposób wiążą się z zewnętrzną powierzchnią błony i pozostają zakotwiczone w niej za pomocą związanego z białkiem lipidu lub glikozylofosfatydyloinozytolu; białka takie można stosunkowo łatwo usunąć. Integralne białka błonowe są zagłębione w błonie i nie można ich usunąć z błony bez jej rozerwania. Niektóre z nich wystają tylko poza zewnętrzną lub wewnętrzną powierzchnię błony, natomiast białka transbłonowe przenikają całą dwuwarstwę i zawierają domeny zarówno zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowe (patrz temat A3). Regiony transbłonowe tych białek zawierają głównie aminokwasy hydrofobowe. Wiele białek błonowych jest glikoproteinami. Białka błonowe pełnią rozmaite funkcje, np.:

Rys. 3. Główne makrocząsteczkowe składniki błony komórkowej

• receptorów cząsteczek sygnałowych, jak hormony i neuroprzekaźniki,

• enzymów degradujących zewnątrzkomórkowe cząsteczki w celu pobrania uzyskanych z nich produktów,

• porów lub kanałów do selektywnego transportu małych polarnych cząsteczek i jonów,

• mediatorów w oddziaływaniach komórka–komórka (głównie glikoproteiny).

A5

Analiza białek

Hasła

Produkcja rekombinowanych białek

Oczyszczanie białek na potrzeby analiz ze źródeł naturalnych jest często niewydajne i pracochłonne. Obecnie białka otrzymuje się poprzez insercję genu kodującego białko do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, ulegającego ekspresji w odpowiedniej komórce gospodarza. Do rekombinowanego białka można dodać etykietkę (tag), co znacznie upraszcza oczyszczanie i detekcję, a także wspomaga rozpuszczanie białka. Prawidłowe modyfikacje potranslacyjne mogą wymagać wykorzystania eukariotycznego układu gospodarz–wektor.

Sekwencjonowanie białek

Łańcuch polipeptydowy rozcina się na mniejsze fragmenty, stosując specyficzne proteazy lub odczynniki, a następnie sekwencjonuje się te fragmenty metodami chemicznymi przy zastosowaniu spektrometrii mas. Wyjściową kolejność aminokwasów w białku odtwarza się na podstawie nachodzących na siebie sekwencji aminokwasowych krótszych peptydów, powstałych po hydrolizie białka przez proteazy o różnej specyficzności trawienia. Jednak przewidywanie sekwencji białka na podstawie sekwencji genu lub jego komplementarnego DNA (cDNA) jest prostsze.

Metody biofizyczne

Wiele białek można uzyskać w postaci kryształów i rozwiązać ich strukturę przestrzenną, stosując dyfrakcję promieni X. Można również ustalić strukturę małych białek znajdujących się w roztworach, wykorzystując technikę jądrowego rezonansu magnetycznego, zwłaszcza gdy zastąpi się zwykłe atomy 12C i 14N atomami 13C i 15N. Istnieje wiele różnych technik badania budowy białek i oddziaływań między nimi.

Oznaczenie masy cząsteczkowej i spektrometria mas

Przybliżoną wielkość masy cząsteczkowej można uzyskać, stosując elektroforezę żelową w obecności siarczanu dodecylu sodu. Spektrometria mas z zastosowaniem jonizacji przez elektrorozpylanie pozwala ustalić precyzyjnie masę cząsteczkową białka z dokładnością do 0,01%. Spektrometria mas pozwala również wykryć modyfikacje potranslacyjne.

Metody z zastosowaniem przeciwciał

Przeciwciała są białkami syntetyzowanymi przez układ odpornościowy kręgowców w odpowiedzi na obecność obcej cząsteczki (antygenu), którą może być wstrzyknięte do krwiobiegu obce białko. Charakteryzują się bardzo wysokim powinowactwem i specyficznością w stosunku do białek-antygenów, dlatego są użytecznym narzędziem laboratoryjnym do detekcji białek i analizy białek metodami immunofluorescencji, techniki western i immunoprecypitacji.

Analiza funkcjonalna

Analiza funkcjonalna białka polega na jego izolacji i badaniach in vitro połączonych z badaniami zachowań zmutowanego organizmu, w którym badane białko nie jest aktywne wskutek mutacji lub delecji jego genu. Funkcje badanego białka można czasami przewidzieć na podstawie porównania jego sekwencji aminokwasowej i struktury z sekwencjami i strukturami znanych białek.

Tematy pokrewne

Budowa i funkcje kwasów nukleinowych (A2)

Budowa i funkcje białek (A3)

Proteomika (S3)

Bioinformatyka (S6)

Produkcja rekombinowanych białek

Typowa komórka eukariotyczna zawiera tysiące różnych białek, z których pewne występują w bardzo dużych ilościach, a inne tylko w kilku kopiach. Aby przeanalizować budowę i funkcje danego białka, należy wydzielić je spośród innych białek i innych niebiałkowych cząsteczek i oczyścić, otrzymując równocześnie satysfakcjonującą ilość danego białka. Klasyczne metody oczyszczania białek obejmują chromatografię jonowymienną, filtrację żelową, oddziaływania hydrofobowe i chromatografię powinowactwa, a także różne techniki elektroforetyczne. Techniki te nie będą omawiane w tym podręczniku, ponieważ zazwyczaj charakteryzują się niską wydajnością i stopniem oczyszczenia poniżej 100%. Z tego względu oczyszczanie białek z ich naturalnego źródła zostało w dużym stopniu zastąpione techniką produkcji białek rekombinowanych. Aby w pełni docenić walory tego podejścia i zrozumieć procedury klonowania, należy przeczytać Sekcje O i P.

W skrócie: aby wyprodukować rekombinowane białko, należy gen lub komplementarny DNA (cDNA) kodujący to białko wprowadzić do wektora ekspresyjnego, którym jest zazwyczaj zmodyfikowany plazmid lub DNA wirusa (patrz Sekcja P). Wektor następnie wprowadza się do komórki gospodarza, np. Escherichia coli. Gen zawarty w wektorze ulega transkrypcji i translacji z wykorzystaniem maszynerii gospodarza. Wprowadzając do wektora odpowiednie sekwencje kontrolne, takie jak silny promotor (patrz temat F3), można uzyskać białko rekombinowane w ilościach stanowiących do 30% całkowitego białka komórki. Proces oczyszczania można znacznie uprościć, jeśli to białko odpowiednio oznaczy się etykietą, złożoną np. z sześciu histydyn, wprowadzając do jego genu (na końcu 5’ lub 3’; patrz temat K1) sześć kodonów histydynowych. W takim przypadku syntetyzowane białko zawiera sześć reszt histydynowych na końcu N lub C, co pozwala oczyścić je w jednym podejściu za pomocą chromatografii powinowactwa, wykorzystując kolumnę, w której znajduje się nośnik z unieruchomionymi jonami niklu Ni+2 lub Co+2, specyficznie wiążącymi histydynę. Białka bez etykiety histydynowej nie zatrzymają się na kolumnie. Związane białko można następnie wymyć z kolumny roztworem zawierającym histydynę. Przyłączenie do białka opisanej etykiety rzadko ma wpływ na jego strukturę i funkcję.

Często białko pochodzące z organizmu eukariotycznego nie ulega wydajnej ekspresji w E. coli. Przyczyną może być niezgodność w częstości wykorzystania kodonów synonimicznych między organizmem gospodarza i organizmem eukariotycznym, z którego pochodzi badany gen (patrz temat K1). Takie kodony można wymienić w badanym genie na kodony wykorzystywane często przez maszynerię translacyjną E. coli drogą ukierunkowanej mutagenezy (patrz temat R5) lub przez zastosowanie jako gospodarza wyspecjalizowanych komórek E. coli, w których ekspresji ulegają eukariotyczne transportujące RNA (tRNA). Obce białka poddawane ekspresji w E. coli są często nierozpuszczalne, a powodem jest brak właściwych modyfikacji potranslacyjnych lub też fakt, że czaperony gospodarza są „przeciążone” lub niespecyficzne względem obcego białka (patrz tematy A3 i L4). Białka te mogą tworzyć w cytoplazmie agregaty, zwane ciałami inkluzyjnymi, które czasami daje się ponownie rozpuścić pod wpływem dodania mocznika. Rozpuszczalność białka można polepszyć, stosując ekspresję obcego białka w formie fuzji z innym, łatwo rozpuszczalnym białkiem. W takim przypadku umieszcza się sekwencje kodujące obu białek jedna za drugą w wektorze i usuwa się kodon stop sekwencji kodującej wprowadzonej jako pierwsza do wektora. W ten sposób po translacji otrzymujemy jeden łańcuch polipeptydowy (patrz temat L1). Częstymi białkami wykorzystywanymi do tworzenia białek fuzyjnych, ułatwiających rozpuszczanie badanego białka, są tioredoksyna, białko wiążące maltozę (MBP) i enzym transferaza glutationowa (GST). MBP i GST można również wykorzystać jako etykiety w procesie oczyszczania właściwego białka, stosując chromatografię powinowactwa z unieruchomioną na nośniku chromatograficznym odpowiednio maltozą lub glutationem. Inne etykiety, których można użyć, kodując je wraz z badanym białkiem, to etykiety służące jako epitop, rozpoznawane przez przeciwciała (patrz niżej), lub etykiety wprowadzające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez zadany enzym proteolityczny, taki jak czynnik Xa, trawiący specyficznie białka po sekwencji IleGluGlyArg. Jeśli taka sekwencja znajdzie się między dwoma białkami fuzyjnymi, to po oczyszczeniu umożliwi ona rozdzielenie ich od siebie w wyniku proteolizy.

Czasami próby ekspresji obcego białka w E. coli się nie udają. Wtedy należy zastosować jeden z licznych systemów wykorzystujących eukariotycznego gospodarza i odpowiednie wektory, co pozwala uzyskać poprawnie zwinięte białka z modyfikacjami potranslacyjnymi (patrz tematy P3 i L4). Tak jak można produkować białka rekombinowane na potrzeby analiz laboratoryjnych, tak też można tę technologię zastosować na skalę przemysłową do produkcji białek terapeutycznych, takich jak insulina i czynniki krzepliwości krwi. Obecnie ponad 130 różnych białek rekombinowanych jest dopuszczonych do stosowania jako leki.

Sekwencjonowanie białek

Do zrozumienia, jak białko spełnia swoje funkcje, istotne jest poznanie jego struktury pierwszorzędowej. Skład aminokwasowy białka można ustalić przez hydrolizę wszystkich wiązań peptydowych kwasem i rozdział chromatograficzny uzyskanych aminokwasów. To wskaże, ile w białku znajduje się glicyn, seryn itd. Nadal jednak nie będzie znana kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Wczesne metody ustalania sekwencji aminokwasowej wymagały podzielenia białka na pewną liczbę krótszych peptydów i wykorzystywały specyficzne enzymy proteolityczne lub odczynniki, które niszczą tylko określone wiązania peptydowe. Na przykład trypsyna rozcina wiązania peptydowe tylko za lizyną lub argininą, a proteaza V8 tylko za kwasem glutaminowym. Z kolei bromek cyjanogenu rozcina wiązania peptydowe tylko za resztami metioninowymi. Każdy z peptydów był następnie poddawany degradacji Edmana w aparacie nazywanym automatycznym sekwenatorem białek. Fenyloizotiocyjanian reagował z N-końcowym aminokwasem, który po potraktowaniu kwasem uwalniał się jako pochodna fenylotiohydantoiny (PTH), a na końcu N białka znajdował się następny aminokwas. Pochodną PTH aminokwasu identyfikowano chromatograficznie przez porównanie ze standardami, a cykl opisanych wyżej reakcji powtarzano, by zidentyfikować kolejny aminokwas na końcu N białka. Kolejność peptydów uzyskanych po proteolizie w oryginalnym białku może zostać ustalona przez sekwencjonowanie peptydów po trawieniu białka proteazami o różnej specyficzności i wyszukiwanie nakładających się sekwencji aminokwasowych. Metoda ta jest droga i pracochłonna, stąd też obecnie większość sekwencji aminokwasowych białka poznaje się w sposób pośredni, poprzez sekwencjonowanie DNA genu lub komplementarnego DNA (cDNA) (patrz temat R2) i przetłumaczenie sekwencji trójek kodonowych zgodnie z zasadami kodu genetycznego (patrz tematy K1 i S6). Metoda ta jest szybsza i prostsza, nie pozwala jednak na obserwację potranskrypcyjnych modyfikacji mRNA (np. redagowanie RNA, patrz temat J4), jak i potranslacyjnych modyfikacji białka (patrz temat L4). Nadal zatem istnieje potrzeba sekwencjonowania białek. Obecnie do tego celu wykorzystuje się spektrometrię mas (patrz niżej). W organizmach, których genomy nie zostały jeszcze w pełni zsekwencjonowane, stosuje się częściowe sekwencjonowanie białka, by uzyskać informacje wystarczające do konstrukcji sondy oligonukleotydowej (patrz temat Q3), w celu umożliwienia poszukania genu lub cDNA, a z tych sekwencji – pełnej sekwencji białka.

Metody biofizyczne

Istnieje wiele metod pozwalających na określenie struktury drugo- i trzeciorzędowej, jak i właściwości fizycznych białka. Dichroizm kołowy, technika wykorzystująca spektroskopię UV, pozwala określić względne proporcje różnych struktur drugorzędowych i jest przydatna w pomiarach zmian konformacji białka (kształtu) pod wpływem różnych warunków. Z uwagi na to, że białka mają dobrze zdefiniowaną budowę trzeciorzędową, wiele białek globularnych udało się skrystalizować i określić ich budowę przestrzenną technikami krystalografii rentgenowskiej. Promienie X oddziałują z elektronami substancji, przez którą przechodzą. Mierząc wzór dyfrakcji wiązki promieni X podczas przechodzenia przez kryształ, można obliczyć pozycje atomów w krysztale. Krystalizując enzym w obecności substratu, można precyzyjnie wyznaczyć oddziaływania międzycząsteczkowe odpowiedzialne za wiązanie i katalizę. Możliwości i rozdzielczość nowoczesnych technik krystalografii rentgenowskiej, wykorzystującej promieniowanie synchrotronowe, są tak duże, że można obecnie poznać szczegółową budowę dużych kompleksów makrocząsteczkowych, takich jak nukleosomy i rybosomy.

Budowę małych białek globularnych znajdujących się w roztworze można ustalić, stosując dwu- lub trójwymiarową spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR, ang. nuclear magnetic resonance). W technice NMR mierzy się relaksację protonów po uprzednim wzbudzeniu ich falami o częstotliwościach fal radiowych w obecności silnego pola magnetycznego. Czasy relaksacji protonów zależą od względnej ich lokalizacji w cząsteczce. W przypadku białek należy zastosować podejście wielowymiarowe, by móc „zobaczyć” i rozdzielić nakładające się na siebie sygnały dużej liczby protonów. Podstawienie w białku normalnych izotopów 12C i 14N ich ciężkimi wariantami 13C i 15N w znaczący sposób polepsza rozdzielczość uzyskanych danych poprzez eliminację „niechcianych” rezonansów. Metoda ta umożliwia rozwiązanie szczegółowej budowy białek o ciężarze cząsteczkowym do 40 kDa, a w przypadku większych białek pozwala na uzyskanie częściowych informacji. Technika NMR jest szczególnie przydatna w przypadku białek, które bardzo trudno krystalizują, co często zdarza się w białkach zawierających nieustrukturyzowane domeny. Z kolei technikę NMR ciała stałego wykorzystuje się w przypadku nierozpuszczalnych białek błonowych. Jeśli dla danego białka udało się ustalić jego budowę przestrzenną, zarówno techniką rozpraszania promieni X, jak i NMR, to dane te najczęściej w znacznym stopniu się pokrywają. W takim przypadku możemy przypuszczać, że uzyskane dane odzwierciedlają prawdziwą budowę białka in vivo.

Kriomikroskopia elektronowa jest techniką, która wymaga zastosowania wyjątkowo niskich temperatur, a uzyskane dane są mniejszej rozdzielczości niż te otrzymane technikami rozpraszania promieni X czy NMR. Jej zaletą jest jednak możliwość dostarczenia informacji na temat budowy znacznie bardziej skomplikowanych układów, takich jak wirusy czy organelle. Z kolei izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne i powierzchniowy rezonans plazmonowy stosuje się do pomiaru parametrów kinetyki oddziaływań białko–ligand, w tym również układów białko–białko i białko–DNA.

Oznaczenie masy cząsteczkowej i spektrometria mas

Aby poznać szacunkową masę cząsteczkową białka, można do tego celu wykorzystać technikę elektroforezy w żelach poliakryloamidowych zawierających jonowy detergent – siarczan dodecylu sodu (SDS), zwaną SDS-PAGE (SDS, ang. polyacrylamide gel electrophoresis). SDS wiąże się z białkami, denaturuje je i nadaje im ładunek ujemny, skutkiem czego wszystkie białka migrują podczas elektroforezy w kierunku anody z szybkością zależną wyłącznie od ich masy. Masę białka określa się, odnosząc szybkość migracji białka do szybkości migracji standardu o znanej masie. Struktura czwartorzędowa ulega zniszczeniu pod wpływem SDS, białka składające się z wielu podjednostek rozpadają się zatem na poszczególne polipeptydy. Technika SDS-PAGE jest tania i łatwa, jednak niezbyt dokładna (5–20% błędu). Spektrometria mas (MS) stanowi niezwykle dokładną metodę analizy białek. Spektrometr mas składa się ze źródła jonów, które pozwala na uzyskanie w fazie gazowej charakterystycznych, wielokrotnie naładowanych, zjonizowanych fragmentów cząsteczek badanej próbki, analizatora mas, który mierzy stosunek masy do ładunku (m/z) w zjonizowanej próbce, i detektora, który zlicza liczbę jonów przy każdej wartości m/z. W badaniach małych cząsteczek zazwyczaj próbki przeprowadza się w stan pary i jonizuje wiązką atomów Xe lub Ar. Stopień odchylenia jonów w polu elektromagnetycznym zależy od masy i może być zmierzony, dając widmo masowe (lub „odcisk palca”), pozwalające na identyfikację wyjściowej cząsteczki. Jednak takie metody mają ograniczenia dotyczące wielkości cząsteczek, które można badać: mogą być zmierzone tylko cząsteczki o masie cząsteczkowej rzędu kilku kDa, i są zbyt destrukcyjne do analizy białek. Stąd do poszerzenia zakresu mierzonych mas konieczne są nieinwazyjne techniki jonizacji.

W technice zwanej jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI, ang. electrospray ionization) jony powstają poprzez wytworzenie bardzo drobnej, rozpylonej zawiesiny mocno naładowanych kropelek białka, które następnie odparowuje się w celu uzyskania naładowanych jonów białka w fazie gazowej. W innej z technik spektrometrii mas, zwanej laserową desorpcją/jonizacją z wykorzystaniem matrycy (MALDI, ang. matrix-assisted laser desorption/ionization), jony będące w fazie gazowej są wytwarzane poprzez laserowe odparowanie stałego podłoża zawierającego białko, wykonanego z jednej z kilku substancji chemicznych („matryca”). Takie generatory jonów można sprząc z całą gamą różnych analizatorów mas i detektorów, odpowiednio do różnych zamierzonych celów. Na przykład generator jonów ESI można połączyć z kwadrupolowym detektorem. W kwadrupolu wykorzystuje się zestaw czterech prętów i przykłada do nich prąd zmienny o określonej częstotliwości i napięciu, który filtruje jony o różnym stosunku m/z, które przybywają do detektora i są zliczane jednostkowo w różnym czasie. Generatory jonów MALDI są zazwyczaj sprzęgane z analizatorami czasu przelotu (TOF, ang. time-of-flight). Jony ulegają przyspieszeniu w czasie przelotu przez tubę przelotową i są rozdzielane na podstawie ich prędkości. Detektor zlicza różne jony w momencie ich przybywania. Tak zbudowany układ nazywa się MALDI-TOF i jest wykorzystywany do identyfikacji białek poprzez mapowanie odcisków palca masy peptydowej poszczególnych peptydów powstałych wskutek proteolizy badanego białka (patrz temat S3).

Najwyższej jakości dane dotyczące określenia masy otrzymuje się, wykorzystując spektrometr mas ESI-Q-TOF, zbudowany z analizatorów kwadrupolowego i TOF. Ponieważ białka mają wiele reszt, które mogą być protonowane (np. lizyna, arginina, histydyna), ich poziom dodatniego naładowania jest do pewnego stopnia nieprzewidywalny. Na przykład stopień uprotonowania białka zawierającego 20 zasadowych reszt aminokwasowych może wynosić od 8 do 18 protonów. Z uwagi na to, że spektrometry mas analizują jony, obliczając stosunek m/z, każdy z różnie uprotonowanych wariantów białka będzie dawać inny sygnał (masa, m, pozostanie prawie bez zmian, lecz ładunek, z, wzrasta o wartości całkowite +1, +2 itd.). Z profilu wartości m/z można wyliczyć ciężar cząsteczkowy białka. Dokładność tej techniki wynosi 0,01%. Mierzona masa białka 50 kDa będzie zatem ustalona z dokładnością ±5 Da. Technikę tę stosuje się również do badania kompleksów białkowych, których masa jest rzędu MDa.

Metody z zastosowaniem przeciwciał

Przeciwciała są bardzo przydatnym narzędziem do badania struktury i funkcji białek. Są one glikoproteinami wytwarzanymi przez układ odpornościowy kręgowców w odpowiedzi na wstrzykniętą do organizmu makrocząsteczkę (antygen), taką jak np. białko, które jest obce dla zwierzęcia. Rolą fizjologiczną przeciwciał jest związanie antygenów znajdujących się na powierzchni atakujących wirusów lub bakterii. Stanowi to część odpowiedzi zwierzęcia mającej na celu zabić i wyeliminować czynnik infekcyjny. Przeciwciała grupuje się w kilka klas, z których wszystkie mają kształt litery Y i składają się z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich połączonych mostkami disiarczkowymi (rys. 1). Najbardziej przydatna w badaniach jest klasa immunoglobulin G (IgG), ponieważ przeciwciała z tej klasy są syntetyzowane w limfocytach B jako białka rozpuszczalne. Przeciwciała z klasy IgG charakteryzują się bardzo wysokim powinowactwem i specyficznością w stosunku do odpowiedniego antygenu i mogą być wykorzystane do jego identyfikacji oraz oceny ilościowej w komórce lub w ekstraktach komórkowych. Swoją specyficzność przeciwciała zawdzięczają rejonowi zmiennemu cząsteczki, który powstaje poprzez rekombinację (patrz temat E4). Rejon zmienny rozpoznaje i wiąże krótką sekwencję 5–8 aminokwasów na powierzchni antygenu (epitop). Zazwyczaj pojedynczy antygen powoduje wytwarzanie kilku różnych przeciwciał, które są syntetyzowane w różnych klonach limfocytów B. Każde z tych przeciwciał rozpoznaje inny epitop tego samego antygenu (poliklonalna mieszanina przeciwciał). Możliwe jest jednak wyizolowanie klonów limfocytów B (zazwyczaj z myszy) i utrzymanie ich w hodowli po fuzji z komórkami nowotworowymi; powstałe linie komórkowe, nazywane hybrydoma, wydzielają przeciwciała monoklonalne, które wiążą tylko jeden rodzaj epitopu i są z reguły bardziej specyficzne niż przeciwciała poliklonalne. Przeciwciała można wykorzystać do identyfikacji białek w komórce metodami immunocytochemicznymi, szczególnie immunofluorescencję (patrz temat S4). Można je również wykorzystać do detekcji białek po rozdziale ekstraktów komórkowych w wyniku elektroforezy SDS-PAGE, która frakcjonuje białka w zależności od ich masy cząsteczkowej (rys. 2) (należy zauważyć, że SDS rozbija białka składające się z wielu podjednostek na pojedyncze polipeptydy). Białka po rozdziale przenosi się z żelu na membranę z zastosowaniem procedury podobnej do techniki Southerna (patrz temat R1). Membranę, w tak zwanej technice western, inkubuje się ze specyficznym dla badanego białka przeciwciałem (przeciwciałem pierwszorzędowym), a następnie z przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje i wiąże przeciwciało pierwszorzędowe (przeciwciało drugorzędowe można wyznakować, co ma wiele znaczeń praktycznych, w tym amplifikację sygnału). Ponieważ przeciwciało drugorzędowe jest połączone z enzymem lub związkiem chemicznym, które mogą generować kolor lub sygnał świetlny, pozwala to uwidocznić pozycję polipeptydu na membranie, gdy zastosuje się odpowiedni detektor. Można w ten sposób zaobserwować, czy białko jest obecne lub nie, czy jego ilość wzrasta, czy też maleje w komórce w określonych warunkach, np. pod wpływem stymulacji hormonalnej. Jeśli pozycja białka na membranie ulega zmianie, może to oznaczać, że białko uległo potranslacyjnej modyfikacji lub też częściowej degradacji.

Rys. 1. Budowa przeciwciała

Rys. 2. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE) i technika western. Zestaw standardów masy cząsteczkowej (ścieżka 1) i próba ekstraktu białkowego uzyskanego z wątroby szczura (ścieżka 2) zostały zagotowane w buforze zawierającym SDS, który denaturuje białka i nadaje im ładunek ujemny proporcjonalny do ich masy cząsteczkowej. Białka następnie rozdzielono elektroforetycznie na żelu poliakryloamidowym i uwidoczniono, wybarwiając żel barwnikiem Coomassie Blue. Wartości mas cząsteczkowych białek zawartych w standardzie podano w kiloDaltonach (kDa). Niewybarwioną próbę białek ekstraktu z wątroby szczura rozdzieloną identycznie jak ta przedstawiona w ścieżce 2 przeniesiono na membranę nitrocelulozową i inkubowano z przeciwciałem króliczym IgG specyficznie rozpoznającym enzym trifosfatazę nukleotydową (NTPazę). Następnie membranę inkubowano z kozimi przeciwciałami IgG rozpoznającymi przeciwciała królicze. Przeciwciała kozie były kowalencyjnie połączone z enzymem peroksydazą. Ostatecznie membranę traktowano substratem peroksydazy, który po reakcji dawał barwny produkt. Obecność NTPazy (masa cząsteczkowa 46 kDa) w ekstrakcie z wątroby szczura jest wyraźnie potwierdzona w ścieżce 3

Teoretycznie wykrywanie różnych białek wymaga stosowania różnych przeciwciał. Jednak używanie białek rekombinowanych, posiadających przyłączoną etykietę służącą jako epitop, rozwiązuje ten problem. Ta krótka, dodatkowa, kilkuaminokwasowa sekwencja (epitop) jest rozpoznawana tylko przez jedno przeciwciało, co pozwala wykorzystywać to samo przeciwciało do identyfikacji różnych białek opatrzonych daną etykietką (patrz temat S4). Takie podejście oszczędza czas i koszty. Innym bardzo ważnym sposobem wykorzystania przeciwciał jest detekcja białek oddziałujących z DNA czy białek oddziałujących ze sobą poprzez immunoprecypitację (patrz tematy S2 i S3).

Analiza funkcjonalna

Dzięki wysoko przepustowym analizom strukturalnym (patrz temat A3) znamy obecnie struktury trójwymiarowe wielu białek. Znajomość ich struktury przestrzennej ma ogromne znaczenie w produkcji nowych leków przeznaczonych do specyficznego, silnego wiązania wybranych białek i, w połączeniu z analizą funkcjonalną, pozwala na ustalenie zależności strukturalno-funkcjonalnych. Nadal jednak liczba białek, dla których struktura przestrzenna została rozwiązana, w porównaniu z liczbą sekwencji polipeptydów opracowanych na podstawie poznanych sekwencji genomowych (patrz tematy R2 i S6) jest niewielka. Obecnie duży nacisk kładzie się na rozwój technik komputerowych, które pozwolą przewidzieć zarówno strukturę, jak i funkcję białka na podstawie sekwencji aminokwasowej. Metody te opierają się głównie na mapowaniu sekwencji aminokwasowych nowych białek w obrębie struktur trzeciorzędowych znanych białek z podobną sekwencją aminokwasową oraz modelowaniu struktury białka ab initio, które stara się budować struktury trójwymiarowe, biorąc pod uwagę prawa fizyki, bez opierania się na znanych już strukturach białek (patrz temat S6). Nadal jednak zrozumienie prawdziwej funkcji białka wymaga analiz biochemicznych i genetycznych. Techniki rekombinacyjne DNA pozwalają na produkcję niemal każdego białka, dla którego znana jest sekwencja DNA. Dzięki temu właściwości białka mogą być badane in vitro (patrz wyżej i temat P1). Identyfikacja białek, które oddziałują z badanym białkiem w komórce, to kolejny ważny aspekt analizy funkcjonalnej (patrz temat S3). Jeśli gen kodujący badane białko można inaktywować poprzez mutagenezę lub usunąć z komórki technikami rekombinacji DNA, to analiza fenotypu takiej komórki będzie bardzo przydatna w określeniu funkcji tego białka. W powiązaniu z informacjami dostępnymi z analiz biochemicznych zmiany fenotypowe zmutowanej komórki pozwolą wskazać na funkcje białka in vivo. Około 6000 genów kodujących białka drożdży Saccharomyces cerevisiae zostało obecnie po kolei usuniętych z komórek. Uzyskano zestaw mutantów, który powinien pomóc w zdefiniowaniu roli poszczególnych białek u tego stosunkowo prostego organizmu eukariotycznego. Stosując mutagenezę transpozonową, uzyskano zestaw około 20 000 zmutowanych linii rośliny modelowej Arabidospis thaliana, w których uszkodzone zostały pojedyncze geny (patrz temat E4). Podobnie uzyskanie transgenicznych i znokautowanych myszy ostatecznie doprowadzi do określania funkcji białek ssaków (patrz temat S5). Wreszcie prostym i alternatywnym podejściem do mutagenezy jest supresja ekspresji poszczególnych genów przy użyciu siRNA, która pozwala obserwować fenotypy mutantów w niemal każdym układzie biologicznym (patrz tematy J2 i S2).

Sekcja B – Właściwości kwasów nukleinowych

Pozostałe rozdziały dostępne w pełnej wersji e-booka.

B1

Chemiczne i fizyczne właściwości kwasów nukleinowych

Hasła

Stabilność kwasów nukleinowych

Jakkolwiek mogłoby się wydawać oczywiste, że dwuniciowe struktury DNA i RNA są stabilizowane przez wiązania wodorowe, w rzeczywistości tak nie jest[1]. Wiązania wodorowe pomagają określić specyficzność parowania zasad, ale stabilność helisy kwasu nukleinowego wynika głównie z oddziaływań hydrofobowych i typu dipol–dipol między ułożonymi warstwowo parami zasad.

Wpływ środowiska kwasowego

Silnie kwasowe warunki mogą powodować hydrolizę kwasów nukleinowych do ich składników: zasad, cukru i fosforanu. Umiarkowanie kwaśne środowisko powoduje hydrolizę wiązań glikozydowych między cukrem a zasadami purynowymi, prowadząc do powstania kwasu zdepurynowanego. Można zastosować bardziej złożone odczynniki chemiczne, aby usunąć określone zasady.

Wpływ środowiska zasadowego

W pH wysokim DNA i RNA ulegają denaturacji przez zmianę tautomerycznego stanu zasad i rozerwanie specyficznych wiązań wodorowych. RNA jest również podatny na hydrolizę w wysokim pH, na skutek udziału grupy 2’-OH w hydrolizie wewnątrzcząsteczkowych wiązań fosfodiestrowych.

Denaturacja chemiczna

Niektóre związki chemiczne, takie jak mocznik czy formamid, mogą denaturować DNA i RNA w pH obojętnym przez zerwanie oddziaływań hydrofobowych między ułożonymi warstwowo zasadami.

Lepkość

DNA jest cząsteczką bardzo długą i cienką, a jego roztwory mają dużą lepkość. Długie cząsteczki DNA są łamliwe i mogą ulec rozerwaniu w roztworze. Proces ten można wykorzystać do wytworzenia fragmentów DNA o określonej średniej długości.

Gęstość pławna

Gęstość DNA wynosi około 1,7 g · cm–3. DNA można analizować oraz oczyszczać, stosując jego zdolność do wyrównywania gęstości podczas równowagowego wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu. Gęstość konkretnego DNA jest funkcją zawartości par G + C, co powoduje, że ta technika może być wykorzystana do analizy cząsteczek DNA różniących się składem zasad.

Tematy pokrewne

Budowa i funkcje kwasów nukleinowych (A2)

Spektroskopowe i termiczne właściwości kwasów nukleinowych (B2)

Stabilność kwasów nukleinowych

Na pierwszy rzut oka mogłoby się wydawać, że dwuniciowa helisa DNA i drugorzędowe struktury RNA są stabilizowane przez wiązania wodorowe pomiędzy parami zasad. W istocie tak nie jest. Podobnie jak w białkach (patrz temat A3) obecność wiązań wodorowych w strukturze na ogół nie nadaje jej stabilności. W przypadku DNA trzeba wziąć pod uwagę różnicę energii pomiędzy jednoniciowym statystycznym kłębkiem i konformacją dwuniciową. W przypadku jednoniciowego DNA (ssDNA) w roztworze wodnym wiązania wodorowe, które występowały pomiędzy parami zasad w dwuniciowym DNA (dsDNA), są zastępowane przez równie silne i energetycznie uprzywilejowane wiązania wodorowe z cząsteczkami wody. Wiązania wodorowe razem z kształtami zasad mają udział w specyficzności wymaganej do parowania zasad w dwuniciowej helisie (dsDNA utworzy się tylko wówczas, gdy nici są komplementarne; patrz temat A2), ale nie uczestniczą w ogólnej stabilizacji tej helisy. Przyczyna stabilności znajduje się gdzie indziej, w oddziaływaniach warstwowych pomiędzy ułożonymi nad sobą parami zasad (patrz temat A2, rys. 5b). Płaskie powierzchnie zasad aromatycznych swobodnie występujących w roztworze nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z wodą, a zatem są hydrofobowe. Sieć wiązań wodorowych w wodzie ulega destabilizacji w kontakcie z powierzchnią hydrofobową, ponieważ nie wszystkie cząsteczki wody mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych, i dlatego stają się one bardziej uporządkowane. Usunięcie wody z powierzchni par zasad w wyniku ich ułożenia warstwowego jest więc energetycznie uprzywilejowane, gdyż więcej cząsteczek wody przechodzi do puli cząsteczek tworzących sieć wiązań wodorowych. To również zwiększa oddziaływania między ładunkami dipoli zasad (patrz temat A3). Zasady nawet w jednoniciowym DNA mają tendencję do układania się warstwami jedna nad drugą, ale w dwuniciowym DNA oddziaływania warstwowe są znacznie silniejsze, ponieważ efekt hydrofobowy sprawia, że takie ułożenie jest energetycznie uprzywilejowane. To złożone zjawisko przedstawiono tutaj w sposób uproszczony, ale pełniejsze wyjaśnienie przekroczyłoby ramy tego podręcznika.

Wpływ środowiska kwasowego

Kwasy nukleinowe w roztworach silnych kwasów i w wysokich temperaturach, jak np. w kwasie nadchlorowym (HClO_4) i w temperaturze powyżej 100°C, ulegają całkowitej hydrolizie do podstawowych składników: zasad, rybozy lub deoksyrybozy i fosforanu. W bardziej rozcieńczonym kwasie, np. w pH 3–4, selektywnie są zrywane wiązania najłatwiej ulegające hydrolizie. To wiązania glikozydowe łączące zasady purynowe z pierścieniem rybozy, stąd kwas nukleinowy staje się zdepurynowany (patrz temat E1). Bardziej złożona metoda chemiczna umożliwia usuwanie zasad z pewną specyficznością, co stanowiło podstawę dawnej metody sekwencjonowania DNA, jednak obecnie została ona zastąpiona przez lepsze metody (patrz temat R2).

Wpływ środowiska zasadowego

DNA

Wzrost pH powyżej zakresu fizjologicznego (pH 7–8) ma bardziej subtelny wpływ na strukturę DNA. Efekt środowiska zasadowego polega na zmianie tautomerycznych form zasad. Można to obserwować na przykładzie modelowego związku cykloheksanonu (rys. 1a). Tautomeryczne formy cząsteczki – ketonowa (1) i enolowa (2) – są w równowadze. W pH obojętnym dominuje forma ketonowa (1). Wzrost pH powoduje przesunięcie równowagi w kierunku formy enolowej (3), gdyż cząsteczka traci proton, a ładunek ujemny jest stabilnie zlokalizowany na elektroujemnym atomie tlenu. Podobnie równowaga struktur guaniny w wysokim pH jest przesunięta w kierunku formy enolowej (rys. 1b). Analogiczne przesunięcie ma miejsce w przypadku pozostałych zasad, jeśli pH wzrośnie. Taka zmiana ma wpływ na specyficzne wiązania wodorowe pomiędzy parami zasad, powodując rozbicie dwuniciowej struktury DNA i w efekcie denaturację DNA (rys. 1c).

Rys. 1. Denaturacja DNA w wysokim pH: (a) środowisko zasadowe przesuwa równowagę w kierunku formy enolowej; (b) tautomeryczne przesunięcie deoksyguanozyny; (c) denaturacja dwuniciowej helisy DNA

RNA

W podwyższonym pH w RNA zachodzi taka sama denaturacja rejonów helikalnych, ale efekt ten tuszowany jest podatnością RNA na hydrolizę w środowisku zasadowym. Wynika to z obecności w RNA grupy 2’-OH, której pozycja jest bardzo dogodna do udziału w zrywaniu cukrowo-fosforanowego rdzenia RNA przez wewnątrzcząsteczkowy atak na resztę fosforanową wiązania fosfodiestrowego (rys. 2). Reakcję tę ułatwia wysokie pH, ponieważ jon OH– działa jak ogólna zasada, dążąc do usunięcia protonu z grupy 2’-OH i czyniąc ją bardziej nukleofilową. Powstałe produkty zawierają wolną grupę 5’-OH i 2’-, 3’-cykliczny fosfodiester, który następnie hydrolizuje do 2’- lub 3’-monofosforanu. RNA nawet w obojętnym pH jest znacznie bardziej podatny na hydrolizę niż DNA, który oczywiście nie zawiera grupy 2’-OH. To jest prawdopodobny powód, dla którego DNA ewoluował w kierunku wbudowania 2’-deoksyrybozy, jego funkcja wymaga bowiem wyjątkowo dużej stabilności.

Rys. 2. Wewnątrzcząsteczkowe rozrywanie wiązań fosfodiestrowych RNA w środowisku alkalicznym

Denaturacja chemiczna

Wiele związków chemicznych w obojętnym pH powoduje denaturację DNA i RNA; najlepiej znanymi przykładami są mocznik (H_2NCONH_2) i formamid (HCONH_2). Stosunkowo duże stężenie tych związków (kilka moli/dm^3) powoduje rozerwanie wiązań wodorowych większości cząsteczek wody. Dochodzi wówczas do zmniejszenia stabilizacji energetycznej drugorzędowej struktury kwasu nukleinowego, wynikającej z wyeliminowania wody pomiędzy ułożonymi warstwowo hydrofobowymi zasadami, co prowadzi do denaturacji dwuniciowych struktur kwasów nukleinowych.

Lepkość

Komórkowy DNA jest bardzo długi i cienki, technicznie rzecz biorąc, ma wysoki współczynnik osiowy. Średnica DNA wynosi około 2 nm, a jego długość mierzy się w mikrometrach, milimetrach, a nawet w centymetrach, jak w przypadku chromosomów eukariotycznych. Dla przybliżenia, gdyby DNA miał średnicę makaronu spagetti, to chromosom E. coli (4,6 miliona par zasad) miałby długość około 1 km. Ponadto DNA jest cząsteczką stosunkowo sztywną; używając tej samej analogii, jej sztywność mogłaby być podobna do częściowo ugotowanego spagetti. Konsekwencją tego jest duża lepkość roztworów DNA. Co więcej, długie cząsteczki DNA łatwo ulegają uszkodzeniu na skutek sił rozrywających lub przez sonikację (działanie ultradźwiękiem o dużej intensywności), co prowadzi do zmniejszenia lepkości. Wrażliwość na rozrywanie staje się problemem, gdy trzeba wyizolować bardzo duże, nienaruszone cząsteczki DNA, natomiast sonikację można stosować w celu uzyskania cząsteczek DNA o określonej przeciętnej długości (patrz temat C4). Należy zauważyć, że zarówno rozrywanie, jak i sonikacja nie denaturują DNA, a jedynie zmniejszają długość dwuniciowych cząsteczek w roztworze.

Gęstość pławna

Analizę i oczyszczanie DNA można przeprowadzić, wykorzystując jego gęstość. W stężonych roztworach zawierających wysokocząsteczkowe sole, np. w 8 M chlorku cezu (CsCl), gęstość DNA jest podobna do gęstości całego roztworu i wynosi około 1,7 g · cm–3. Jeżeli taki roztwór podda się wirowaniu przy wysokich obrotach, to chlorek cezu migruje w kierunku dna próbówki wirówkowej, tworząc gradient gęstości (rys. 3). W efekcie próbka DNA przemieści się w postaci wyraźnego prążka w położenie, w którym gęstość rozpuszczalnika jest równa gęstości DNA. Technika ta nazywa się wirowaniem równowagowym w gradiencie gęstości lub wirowaniem izopiknicznym (patrz temat O2). Ponieważ w tych warunkach RNA osiada na dnie próbówki, a białka się unoszą (flotują), wspomniana metoda może być skutecznym sposobem oczyszczania DNA z tych dwu zanieczyszczeń (patrz temat O2). Można ją również wykorzystać w celach analitycznych, ponieważ gęstość pławna DNA (ρ) jest funkcją liniową zawartości G + C:

ρ = 1,66 + 0,098 × częstość par GC

Stąd sedymentacja DNA może być użyta do oznaczenia w nim średniej zawartości par G + C lub, w niektórych przypadkach, do rozdzielenia fragmentów DNA o różnej zawartości G + C.

Rys. 3. Wirowanie równowagowe DNA w gradiencie gęstości

Przypisy

[1] Inni autorzy nie podzielają tego poglądu. Porównaj też zależność Tm kwasu nukleinowego od zawartości par G+C omówioną w Sekcji C, temat C3 (przyp. tłum.).