Dane oryginału:

Epigenetics, Nuclear Organization & Gene Function: With implications of epigenetic regulation and genetic architecture for human development and health

Epigenetics, Nuclear Organization & Gene Function: With implications of epigenetic regulation and genetic architecture for human development and health was originally published in United States of America by Oxford University Press. This translation is published by arrangement with Oxford University Press. Polish Scientific Publishers PWN is solely responsible for this translation from the original work and Oxford University Press shall have no liability for any errors, omissions or inaccuracies or ambiguities in such translation or for any losses caused by reliance thereon.

Tłumaczenie: Filip Fierek

Wydanie polskie:

Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce amiavk/123RF

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redakcja i korekta Monika Gołaszewska

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Produkcja Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: Angelika Kuler-Duchnik/Woblink

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w Internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

ISBN 978-83-01-21864-5

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2021 r., (wyd. I)
Warszawa 2021

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288

infolinia: 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl

www.pwn.pl; reklama@pwn.pl

Dedykacja i podziękowania

Niniejszy tekst pragnę zadedykować pamięci Alana Wolffe’a, którego praca pt. Chromatic Structure and Function dała podwaliny współczesnym badaniom nad funkcjonowaniem genów. Książkę tę chciałbym ponadto zadedykować moim przyjaciołom i współpracownikom – Mitzi Kurodzie, Davidowi Allisowi, Jerry’emu Manningowi, Jacques’owi Coté oraz Eugene’owi Kooninowi – oraz nagradzanym i uznanym naukowcom, których prace i badania stanowiły dla mnie inspirację: Peterowi Beckerowi, Tomowi Cline’owi, Jeffowi Hansenowi, Steve’owi Henikoffowi, Johnowi Lisowi, Brianowi Oliverowi, Craigowi Petersonowi, Danny’emu Reinbergowi, Bryanowi Turnerowi oraz Jerry’emu Workmanowi.

Wyrazy wdzięczności niech przyjmą: Gray Crouse, Arri Eisen, Joel Eissenberg, Peng Jin, David Katz, William Kelly, John McCarrey, Sergio Pimpinelli, Daniel Reines, Max Scott, Kevin Van Bortle i Paula Vertino, którzy zgodzili się przeczytać poszczególne rozdziały publikacji i opatrzyli je cennymi komentarzami oraz sugestiami.

Na koniec pragnę podziękować Victorowi Corcesowi za jego wkład w dojrzewanie pomysłu na niniejszą książkę.

O autorze

John Lucchesi otrzymał tytuł doktora genetyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley w roku 1963. Po dwóch latach stażu podoktorskiego w Instytucie Biologii Molekularnej na Uniwersytecie Oregońskim przeniósł się na Uniwersytet Karoliny Północnej w Chapel Hill, gdzie został profesorem biologii i genetyki. W roku 1979 rozpoczął pracę jako wykładowca kontraktowy genetyki na Uniwersytecie Duke’a; w 1983 roku został starszym pracownikiem naukowym w Churchill College na Uniwersytecie Cambridge w Wielkiej Brytanii. Od roku 1990 profesor na Wydziale Biologii Uniwersytetu Emory. Dr Lucchesi brał udział w pracach Narodowych Instytutów Zdrowia, był m.in. przewodniczącym sekcji badań genetycznych zajmującej się przyznawaniem grantów na badania. Jest członkiem AAAS oraz byłym przewodniczącym Amerykańskiego Stowarzyszenia Genetycznego; był także wiceprzewodniczącym XVII Międzynarodowego Kongresu Genetycznego. Jego laboratorium, wspierane regularnie ze środków Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych, skupia się na badaniu regulacji transkrypcji, funkcjonalnych aspektów architektury chromatyny oraz genetycznej regulacji rozwoju organizmu.

Wstęp

Niniejsza książka nie jest prezentacją wszelkiej dostępnej wiedzy zgromadzonej dotąd w obszarze genetyki i epigenetyki. Jej nadrzędnym celem jest dostarczenie zainteresowanym studentom, nauczycielom oraz badaczom pewnych podstaw, dzięki którym zrozumieją zasadnicze mechanizmy regulacji epigenetycznej, ich zależność od genetyki i wzajemny wpływ, jaki wywierają na siebie mechanizmy epigenetyczne i genetyczne. Poza wyjątkowymi sytuacjami nie zawiera ona informacji na temat klasycznego dziedziczenia, zachowywania się chromosomów czy cytogenetyki. Omówiono w niej wyłącznie te zjawiska genetyczne i molekularne, które pozostają w związku i wywierają wpływ na teorię epigenetyki i prowadzone w jej obszarze badania. Kolejnym zadaniem tej książki jest ukazanie znaczenia trójwymiarowej organizacji materiału genetycznego i jego rozmieszczenia w podzielonym funkcjonalnie na segmenty jądrze komórki. Architektura genu odgrywa istotną rolę w odzyskiwaniu, interpretacji i wykonywaniu informacji genetycznej i epigenetycznej. W celu ukazania i podkreślenia rozwoju, jaki dokonał się w teorii zależności między genetyką, epigenetyką a architekturą jądra, od samego jej początku do czasów obecnych, ilekroć będzie to możliwe, podamy odniesienia bibliograficzne do artykułów, w których po raz pierwszy opisano dane zjawisko.

Mniej więcej trzydzieści lat temu większość genetyków sądziła, że mechanizm transkrypcji leżący u podłoża wszystkich aspektów funkcjonowania genów został już dobrze opisany. Proces ten można było bowiem odtworzyć w warunkach in vitro, wraz z towarzyszącymi mu oczyszczonymi czynnikami i enzymami, wykazującymi wśród eukariontów wysoki stopień zakonserwowania, a w konsekwencji – wysoką wymienność. Jednocześnie było jednak oczywiste, że fundamentalne aspekty procesu transkrypcji, choć niezbędne, nie tłumaczą w żadnym razie mechanizmów specjalizacji komórkowej i rozwoju organizmu; parametry opisujące transkrypcję nie wyjaśniały, dlaczego ekspresja genów wykazuje zróżnicowanie w czasie i przestrzeni, podczas embriogenezy i po osiągnięciu dojrzałości. Pierwszej istotnej na tym polu obserwacji dokonali Vincent Allfrey i Alfred Mirsky, którzy stwierdzili, że chemiczna natura materiału genetycznego – kompleks DNA, histonów i białek niehistonowych, nazywany chromatyną – różni się w komórkach aktywnych metabolicznie. Różnica ta, mówiąc konkretnie – acetylacja histonów, wskazywała, że do aktywacji, czyli do umożliwienia odzyskania informacji genetycznej, potrzebna jest „zmiana w strukturze chromatyny i w zdolności DNA do pełnienia funkcji matrycy dla syntezy RNA” (Pogo i in. 1966). Prawie dekadę później Arthur Riggs i Robin Holliday wysunęli hipotezę, że za represję aktywności genów na jednym z dwóch chromosomów X u samic ssaków może być odpowiedzialna metylacja DNA, zjawisko zmieniające interakcje między białkami a DNA i występujące u wielu organizmów eukariotycznych (Holliday i Pugh 1975; Riggs 1975); obserwacja ta sugerowała, że istnieje jakiś ogólny mechanizm, odpowiedzialny za represję tych genów, które powinny pozostać nieaktywne lub które trzeba dezaktywować w określonych okolicznościach procesu różnicowania komórkowego. Różnicę między fizyczną organizacją genów aktywnych i nieaktywnych zaprezentowali po raz pierwszy Harold Weintraub i Mark Groudine, którzy odkryli, że w oczyszczonych jądrach DNA powiązany z genami aktywnymi wykazuje większą podatność na trawienie enzymatyczne (Weintraub i Groudine 1976).

Współczesną epokę badań nad modyfikacjami chromatyny umożliwiającymi i regulującymi ekspresję genów zapoczątkowały osobne odkrycia, z których każde dotyczyło innej kluczowej kategorii mechanizmów regulatorowych. Craig Peterson i Ira Herskowitz dowiedli istnienia kompleksu wielobiałkowego, który, wspomagając aktywatory specyficzne dla genu, pełni ogólną funkcję w transkrypcji wielu genów (Peterson i Herskowitz 1992). Kilka lat później James Brownell i Davis Allis wyizolowali z makrojądra Tetrahymena wykazującego wysoką aktywność transkrypcyjną pierwszą acetylotransferazę histonową i udowodnili, że jest to ortolog kofaktora transkrypcyjnego, o którym już dawno wiedziano, że jest on konieczny do aktywacji wielu genów drożdży (Brownell i Allis 1995; Brownell i in. 1996). Potwierdzeniem dynamicznej roli acetylacji histonów w regulacji funkcjonowania genów było wyizolowanie pierwszej deacetylazy histonowej, czego dokonał Stewart Schriber (Tauton i in. 1996). Odkrycia te dały początek pracom badawczym nakierowanym na identyfikację kolejnych kowalencyjnych modyfikacji histonowych oraz enzymów odpowiedzialnych za ich indukcję lub eliminację. Jednocześnie opisano nowe kompleksy wielobiałkowe odpowiadające za remodeling konformacji chromatyny. Dążenia te w znacznym stopniu ułatwiły techniki bioinformatyczne, dzięki którym poznano rozległe strukturalne i funkcjonalne zakonserwowanie czynników modyfikujących chromatynę. Wraz z pojawieniem się technologii mikromacierzy, a potem sekwencjonowania nowej generacji zaczęto kłaść nacisk na opisywanie ogólnych wzorców epigenetycznych obejmujących całe chromosomy czy całe genomy; wyniki tych badań były niejednokrotnie zaskakujące i prezentowały dużą wartość poznawczą.

Istotnej wiedzy na temat znaczenia modyfikacji epigenetycznej względem ogólnego procesu funkcjonowania genów dostarczyło odkrycie aktywatorów transkrypcyjnych specyficznych dla sekwencji – tzw. czynników pionierskich – które były w stanie dostać się do miejsc je wiążących w upakowanej chromatynie (Cirillo i in. 2002; Natarajan i in. 1999; Neely i in. 1999). Czynniki te rekrutują z kolei kompleksy modyfikujące związane z aktywacją genów i ich represją. Opisane odkrycia pozwoliły na sformułowanie kilku ogólnych zasad regulacji funkcjonowania genów, głoszących, że: oportunistyczne czynniki transkrypcyjne mogą włączać się do genomu, przyciągać inne czynniki i zapoczątkowywać kowalencyjne modyfikacje histonowe, które zmieniają interakcje między nukleosomami, lub też stanowią platformę dla aktywatorów transkrypcji i represorów; kompleksy białkowe zmieniają architekturę chromatyny poprzez przemieszczanie nukleosomów lub modyfikowanie ich związków z DNA. To, jakie mechanizmy odpowiedzialne są za owe dynamiczne zmiany strukturalne w organizacji chromatyny, jest przedmiotem zapoczątkowanych dopiero badań; celem tych prac jest opisanie ich na poziomie biofizycznym i strukturalnym.

Jądro organizmu eukariotycznego to wysoce złożone organellum, które oprócz informacji genetycznej organizmu zawiera także całe mnóstwo osobnych regionów subjądrowych (kompartmentów) i struktur. Nie zaskakuje fakt, że proces uporządkowanego odczytywania informacji genetycznej, niezbędny do podtrzymania komórki przy życiu i jej różnicowania, zależy od wielu aspektów organizacji jądra, na które wpływa również to, że różne procesy odbywające się w jądrze i odpowiedzialne za ekspresję genów zachodzą w określonych miejscach w jego obrębie. Pierwszą wskazówką istnienia przestrzennego aspektu organizacji jądra było stwierdzenie, że aktywne i nieaktywne regiony genomu zajmują w jądrze określone miejsce ‒ te pierwsze zajmują zazwyczaj w jądrze pozycję bliżej środka, a te drugie lokują się z reguły na jego peryferiach i są powiązane z tzw. blaszką jądrową. Krótko po tych obserwacjach zauważono, że aktywność niektórych genów zależna jest od ich powiązań z kompleksami porów jądrowych oraz z ich występowaniem, wraz z innymi genami, w wewnątrzjądrowych ogniskach bogatych we wszystkie elementy maszynerii transkrypcyjnej, zwanej fabryką transkrypcyjną. Ostatnio uzyskano dowody świadczące o tym, że ciałka PML (promyelocytic leukemia, białaczka promielocytowa) mogą odgrywać pewną rolę w transkrypcji i odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Cętki jądrowe (nazywane także skupiskami ziaren interchromatynowych) wzbogacone są w czynniki splicingu RNA i wydają się łączyć z genami aktywnymi.

Jest jasne, że przyporządkowanie jądrowe genów zależy od interakcji między określonymi właściwościami chromatyny, w jakiej się znajdują, a cechami danego organellum. Dobrze zbadanym przykładem jest formowanie klastrów miejsc izolacyjnych, które prowadzi do organizacji genomu w duże, specyficzne dla komórki domeny chromatyny, te zaś uważa się za istotne w procesie ustanawiania określonych programów ekspresji genów.

Nie ma żadnych wątpliwości, iż brak lub nieprawidłowe funkcjonowanie czynników transkrypcyjnych regulowanych w toku rozwoju jest przyczyną chorób człowieka, w tym nowotworów, z których wiele wykazuje różne poziomy dezorganizacji jądra. Jednym z celów niniejszej książki jest ukazanie, jak regulacja transkrypcji i towarzyszące jej modyfikacje epigenetyczne powiązane są i jak zależą od architektury jądra. Poniższe omówienie, prócz dostarczenia podstawowej wiedzy na temat różnicowania komórkowego i rozwoju organizmu, ma też na celu wskazanie nowych dróg dla zastosowań medycznych zgromadzonej wiedzy i opowiada się za intensywniejszym poszukiwaniem sposobów na wykorzystanie informacji o różnicowaniu komórek macierzystych na potrzeby medycyny regeneracyjnej.

Aby zrealizować zadanie, jakie wymusza nadany tej książce tytuł, potrzebna jest pewna doza wybiórczości. Dlatego najważniejsze aspekty regulacji genetycznej i epigenetycznej omawiane są w odniesieniu do wyższych zwierząt wielokomórkowych, ze szczególnym uwzględnieniem ssaków, a przede wszystkim ludzi. Taką samą perspektywę zastosowano, opisując struktury jądrowe. Przykłady zaczerpnięte z organizmów jednokomórkowych i roślin przywoływane są wówczas, gdy dane kwestie dotyczące zjawiska regulacji genów zbadano tylko dla tych form życia.

Spis treści

Okładka

Strona tytułowa

Strona redakcyjna

Część I. Wprowadzenie do epigenetyki i regulacji epigenetycznej

1 Zjawiska epigenetyczne u grzybów, roślin i zwierząt

Selektywna aktywność genów to podstawowe zjawisko warunkujące różnicowanie komórek i tkanek w trakcie rozwoju organizmu

Koncepcja jednego genomu i wielu epigenomów

Pamięć epigenetyczna

Epigenetyka a zdrowie człowieka

Podsumowanie rozdziału

2 Ogólna organizacja chromatyny

Organizacja DNA i histonów w nukleosomie

Składanie włókien chromatynowych

Różne stany kondensacji włókna chromatynowego i zmiany od jednego stanu do drugiego

Różne oblicza chromatyny

Euchromatyna versus heterochromatyna

Ramka 2.1 Sekwencje powtórzone i elementy transpozycyjne

Biologia molekularna heterochromatyny

Euchromatyna i heterochromatyna zajmują określone miejsca w jądrze

Transkrypcja regionów heterochromatynowych jest opóźniona

Podsumowanie rozdziału

3 Ogólny mechanizm transkrypcji genów

Kompleks preinicjacyjny

Inicjacja transkrypcji

Ramka 3.1 Kompleks mediatora

Uwolnienie promotora i wczesna elongacja

Pauzowanie

Elongacja produktywna

Ramka 3.2 Fosforylacja seryny 2

Kotranskrypcyjne przetwarzanie RNA

Czapeczkowanie

Splicing transkryptu

Terminacja transkrypcji i przetwarzanie końca 3’ transkryptu

Ramka 3.3 Dwa przykłady funkcji regulatorowej pełnionej przez splicing alternatywny

Odzyskiwanie polimerazy i reinicjacja transkrypcji

Podsumowanie rozdziału

Część II. Regulacja transkrypcji przez mechanizmy epigenetyczne

4 Modyfikacje i remodeling chromatyny

Transkrypcja genów z uwzględnieniem roli chromatyny

Potranslacyjne modyfikacje histonów (post-translational modifications, PTM)

Acetylacja

Metylacja

Fosforylacja

Ubikwitynacja

Sumoilacja

Glikozylacja

ADP-rybozylacja

Hydroksyizobutyrylacja

Kompleksy remodelujące

Warianty histonowe i rotacja nukleosomów

Warianty histonu H3

Warianty histonu H2A

Warianty histonu H2B

Warianty histonu H1

Modyfikacje DNA

Podsumowanie rozdziału

Ramka 4.1 Przykłady chorób człowieka związanych z modyfikacjami histonowymi i DNA

5 Epigenetyczne zmiany chromatyny i cykl transkrypcji

Rola kompleksów remodelujących

Fosforylacja polimerazy RNA

Rola kowalencyjnych modyfikacji histonowych

Acetylacja histonów

Metylacja histonów

Transkrypcja bez modyfikacji kowalencyjnych

Rola wariantów histonowych

Interakcje pomiędzy czynnikami regulującymi transkrypcję

Zmiany epigenetyczne na wzmacniaczach

Promotory biwalentne

Wiele genów podlega ekspresji monoallelicznej

Heterogeniczna ekspresja genów w komórkach danej tkanki

Represja transkrypcji

Transkrypcyjny układ genomu

Podsumowanie rozdziału

6 Rola RNA niekodujących

Długie niekodujące RNA

lncRNA i lincRNA represjonują lub wzmacniają transkrypcję genów

Niektóre lncRNA transkrybowane ze wzmacniaczy sprzyjają wiązaniu tych modułów regulatorowych z ich genami docelowymi

lincRNA może wywierać wpływ na aktywność genów poprzez bezpośrednie interakcje z kofaktorami transkrypcyjnymi

lincRNA wpływają na organizację topologiczną chromatyny

Krótkie niekodujące RNA

MikroRNA (miRNA)

Endogenne małe interferencyjne RNA (siRNA)

RNA oddziałujące z Piwi (piRNA)

Małe jądrowe RNA (snRNA)

Niekodujące RNA pochodzące z tRNA

Antysensowne niekodujące RNA to częsty produkt uboczny transkrypcji

Edytowanie RNA

Podsumowanie rozdziału

Ramka 6.1 Elementy transpozycyjne

7 Utrzymywanie stanu aktywnego i nieaktywnego

Produkty PcG zapobiegają niewłaściwej ekspresji genów HOX

W aktywności PcG pośredniczą represyjne kompleksy białkowe

Mechanizm represji PcG

PRC2

PRC1

Białka PcG zmieniają trójwymiarową strukturę genomu

Represja zachodzi także bez udziału kompleksów PRC

Odpowiednie poziomy ekspresji genów homeotycznych utrzymują geny TrxG

Działanie kompleksów TrxG polega na zapobieganiu wyciszaniu przez PcG

Białka TrxG uczestniczą w ogólnym procesie transkrypcji

Rola kohezyny

Transwekcja

Paramutacje – specyficzny przypadek transwekcji u roślin

Podsumowanie rozdziału

8 Metylacja DNA a ekspresja genów

Ramka 8.1 Zespół Retta

Wyciszanie przez metylację DNA

Rola metylacji DNA w regulacji genów jednokopiowych

Związek metylacji DNA z modyfikacjami histonów

Imprinting genomowy

Ramka 8.2 Choroby związane z imprintingiem

Epigenetyczne mechanizmy imprintingu

Transmisja alleli imprintowanych

Losowa ekspresja monoalleliczna

Podsumowanie rozdziału

9 Regulacja domen i całych chromosomów

Regulacja transkrypcji klastrów genów

Geny β-globiny

Geny rRNA i jąderko

Geny histonowe

Regulacja transkrypcji całych chromosomów

Kompensacja dawki u Drosophila melanogaster

Kompensacja dawki u Caenorhabditis elegans

Kompensacja dawki u ssaków

Ramka 9.1 Aneuploidalność u człowieka

Kompensacja dawki u ptaków

Następstwem kompensacji dawki jest duplikacja genów

Podsumowanie rozdziału

Część III. Zależności między procesem transkrypcji a strukturami jądrowymi

10 Architektura genomu

Dowody potwierdzające istnienie terytoriów chromosomowych

Ułożenie CT w jądrze

Domeny chromatyny

Promotory łączą się fizycznie z odległymi od nich wzmacniaczami

Ramka 10.1 Techniki 3C

Izolatory ograniczają aktywność wzmacniaczy

Izolatory dzielą genom na jednostki funkcjonalne

Domeny powiązane topologicznie (TAD)

Ramka 10.2 Multipleksowy test reporterowy

Wypętlanie jako podstawowy mechanizm powstawania TAD

Wizualizowanie TAD w chromosomach politenicznych Drosophila

Powstawanie TAD w początkowych fazach rozwoju organizmu

Ciała izolatorowe i ciała PcG

Regulacja transkrypcji i replikacji DNA może odbywać się przez relokację genów w inne obszary jądra

Podsumowanie rozdziału

11 Otoczka jądrowa

Błony wewnętrzna i zewnętrzna

Otoczka jądrowa w kontekście cyklu komórkowego

Blaszka jądrowa

Blaszka to siatka włókien białkowych składająca się głównie z lamin

Połączenie genomu z blaszką jądrową

Transkrypcyjne i epigenetyczne własności genów związanych z blaszką jądrową

LAD fakultatywne

Kompleksy porów jądrowych

Kompleksy porów jądrowych (NPC) to duże struktury wielobiałkowe

Pory jądrowe biorą udział w regulacji ekspresji genów

Podsumowanie rozdziału

12 Jąderko

Biogeneza rybosomu

Jąderko jako środowisko wyciszania genów

Jąderko jako miejsce wielu zróżnicowanych procesów molekularnych

Składanie telomerazy

Regulacja stabilności p53

Modyfikacje i przetwarzanie RNA nierybosomowych

Podsumowanie rozdziału

13 Ciałka jądrowe

Przedział okołojąderkowy

Ciałka Cajala

Bliźniacze ciałka Cajala (Gems) i ciałka związane z genami histonowymi (HLB)

Nadmiar czy współpraca? Przechowywanie czy aktywne przetwarzanie?

Cętki jądrowe

Paracętki

Ciałka jądrowe PML

Jądrowe ciałka stresu

Fabryki transkrypcyjne

Dynamiczny związek między polimerazami a jednostkami transkrypcji

Kolokalizacja genów w fabrykach transkrypcyjnych może prowadzić ich koregulacji

Jak powstają fabryki transkrypcyjne?

Podsumowanie rozdziału

Część IV. Dziedziczenie struktury chromatyny i stany funkcjonalne

14 Replikacja chromatyny

Ogólny opis replikacji DNA

Koordynacja replikacji DNA za pomocą syntezy histonów i składania nukleosomów

Błędy zachodzące podczas replikacji DNA

Odpowiedź na uszkodzenie DNA

Replikacja chromosomów w kontekście organizacji jądra

Podsumowanie rozdziału

15 Naprawa DNA i stabilność genomowa

Naprawa niesparowanych zasad

Naprawa przez wycinanie zasady i naprawa przez wycinanie nukleotydu

Pęknięcia DNA

Naprawa pęknięcia jednej nici

Naprawa pęknięcia obu nici

Wykrycie pęknięcia obu nici

Szlak niehomologicznego łączenia końców

Szlak rekombinacji homologicznej

Modyfikacje epigenetyczne zachodzące podczas naprawy pęknięcia obu nici

Konformacja chromatyny w miejscu pęknięcia obu nici

Trójwymiarowa struktura pęknięcia obu nici

Podsumowanie rozdziału

16 Dziedziczenie modyfikacji chromatyny w kontekście cyklu komórkowego

Czynniki i kofaktory transkrypcyjne

Metylacja DNA

Modyfikacje histonowe

Odtworzenie krajobrazu chromatyny w komórkach potomnych

Pozycjonowanie nukleosomów po replikacji DNA

Transmisja domen pętlowych z komórki rodzicielskiej do komórek potomnych

Epigenetyczna charakterystyka centromerów

Podsumowanie rozdziału

17 Komórki macierzyste

Cechy komórek macierzystych

Komórki totipotencjalne

Komórki pluripotencjalne

Multipotencjalne dojrzałe komórki macierzyste

Koncepcja niszy komórek macierzystych

Utrzymanie pluripotencjalności podczas proliferacji komórek macierzystych

Znaczniki epigenetyczne właściwe dla różnicowania i samoodnawiania komórek macierzystych

Rola RNA niekodujących

Dezaktywacja chromosomu X w żeńskich komórkach macierzystych

Architektura chromatyny w komórkach macierzystych

Podsumowanie rozdziału

18 Reprogramowanie jądra i indukowana pluripotencjalność

Metody reprogramowania komórek somatycznych

Molekularne aspekty procesu reprogramowania

Zmiany epigenetyczne zachodzące w procesie reprogramowania

Modyfikacje histonów

Metylacja DNA

Terapeutyczne zastosowania iPSC

Podsumowanie rozdziału

19 Dziedziczenie transgeneracyjne cech epigenetycznych

Następstwa w życiu dorosłym ekspozycji płodu na określone czynniki środowiskowe

Ramka 19.1 Parametry epigenetycznego dziedziczenia transgeneracyjnego

Transgeneracyjna transmisja epigenetyczna

Stres fizjologiczny i przewlekłe choroby metaboliczne

Dysruptory endokrynne

Efekty neurorozwojowe, behawioralne i psychiatryczne

Mechanizmy dziedziczenia transgeneracyjnego

Metylacja DNA

Modyfikacje histonowe

Dziedziczenie epigenetyczne musi przezwyciężyć zjawisko reprogramowania

Małe niekodujące RNA

Podsumowanie rozdziału

Część V. Epigenetyka, zdrowie i rozwój człowieka

20 Starzenie, starzenie komórkowe i nowotwory: znaczenie niestabilności genomowej, homeostazy komórkowej i telomerów

Niestabilność genomu

DNA mitochondrialny (mtDNA)

Zmiany homeostazy komórkowej

Telomery

Biogeneza telomeru

Ochrona telomeru

Kontrola poziomu telomerazy i długości telomerów

Rola telomerów w procesie starzenia i procesach nowotworowych

Podsumowanie rozdziału

21 Starzenie, starzenie komórkowe i nowotwory: zmiany epigenetyczne i remodeling jądra

Zmiany w metylacji DNA

Zmiany w modyfikacjach histonowych

Zmiany w wariantach histonów

Remodeling chromatyny

Zmiany w architekturze jądra

Zmiany w rozmiarze i kształcie jądra

Zmiany w aranżacji chromosomów

Zmiany w kompartmencie A (aktywnym) i B (nieaktywnym)

Zmiany w rozmiarze jąderka

Zmiany w organizacji topologicznej genomu

Rola niekodujących RNA

Starzenie komórkowe (replikacyjne) jako wrodzona strategia ochrony przez nowotworem

Podsumowanie rozdziału

22 Rozwój i jego dysfunkcje

Regulacja neuronalna procesu uczenia i zapamiętywania

Rozwój układu nerwowego

Uczenie i zapamiętywanie

Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za wytworzenie i konsolidację pamięci

Zmiany epigenetyczne związane z uczeniem i zapamiętywaniem

Metylacja DNA

Remodeling chromatyny

Niekodujące RNA

Topologia genomu

Choroby umysłowe

Rozwój i dysfunkcje układu sercowo-naczyniowego

Regulacja epigenetyczna różnicowania serca

Choroby układu sercowo-naczyniowego

Epigenetyka a choroby układu odpornościowego

Toczeń rumieniowaty układowy (SLE)

Ramka 22.1 Interferony i interleukiny

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS)

Podsumowanie rozdziału

Literatura

CZĘŚĆ I

Wprowadzenie do epigenetyki i regulacji epigenetycznej

ROZDZIAŁ 1

Zjawiska epigenetyczne u grzybów, roślin i zwierząt

Jedno z głównych pytań, jakie stawiają nauki biologiczne, dotyczy różnicowania się komórek, rozwoju organizmów i przystosowywania się ich do środowiska. Informacje niezbędne zarówno do różnicowania komórek i zachodzenia zmian morfologicznych w toku rozwoju, jak również informacje warunkujące wszelkie reakcje fizjologiczne i mechanizmy zachowań zawarte są w materiale genetycznym – twierdzenie to odnosi się do wszystkich organizmów jedno- i wielokomórkowych. W XX wieku wiele uwagi poświęcono poznaniu istoty, funkcji i sposobów transmisji tego rodzaju informacji, poczynając od zagadnienia dziedziczenia prostych cech, przez molekularną i fizyczną strukturę DNA i odkrycie kodu genetycznego, aż po – już współcześnie – sekwencjonowanie genomów organizmów i produktów genów. Euforia, jaką ów postęp wywoływał w środowisku intelektualnym, była od czasu do czasu przyćmiewana faktem, że pewnych zjawisk nie można było wytłumaczyć w kategoriach genetycznych. Zjawiska te to przykłady regulacji epigenetycznej – w odróżnieniu od regulacji genetycznej. Powyższego pojęcia po raz pierwszy użył biolog ewolucyjny Conrad Waddington w celu opisania wszystkich czynników zewnętrznych, które wraz z genami miały wpływać na rozwój zwierząt (Waddington 1942). Waddington zasugerował również, że zmiany rozwojowe wywołane czynnikami środowiskowymi w pewnych okolicznościach mogą być dziedziczne.

Jednym z pierwszych zjawisk dziedziczenia epigenetycznego był przypadek kukurydzy opisany przez Alexandra Brinka (Brink i in. 1968). Zauważył on, że allele typu dzikiego wybranych genów odpowiadających za syntezę antocyjanów i zaangażowanych w produkcję barwnika podlegają paramutacjom – dziedzicznym zmianom na poziomie ekspresji wynikającym z ich powiązania z określonymi allelami zmutowanymi, nazywanymi allelami paramutagennymi. U grzybów Neurospora odkryto kilka przypadków zmutowanych alleli, które wpływały na funkcjonowanie alleli typu dzikiego w diploidalnej fazie wegetatywnej. Związek z allelem zmutowanym wpływał na ekspresję allelu typu dzikiego po kilku podziałach mitotycznych, mimo że allele te oddzieliły się od siebie o wiele wcześniej w drodze mejozy. Zjawiska te zdołano wyjaśnić – dowiedziono, że aby allel podlegał właściwej ekspresji, musi być fizycznie sparowany, nawet jeśli drugim elementem pary miałby być niefunkcjonalny allel tego samego genu, byleby tylko ich sekwencje były wystarczająco do siebie podobne. Jeśli allelu zmutowanego nie było lub był on w dużej mierze usunięty, allel typu dzikiego nie zostawał aktywowany.

Waddington zgromadził dane eksperymentalne, dzięki którym zdołał opracować pojęcie epigenezy. W kanonicznym już liście do „Nature” opisał wyniki badań polegających na selekcjonowaniu na przestrzeni kilku pokoleń muchówek ze specyficzną modyfikacją skrzydeł wywołaną szokiem cieplnym (heat-shock), jakim oddziałano na nie w fazie ich rozwoju. Nietypowy fenotyp, kiedy już pojawił się w kulturach muchówek, przetrwał z wysoką częstością w wielu kolejnych pokoleniach, mimo iż na muchówki już nie oddziaływano (Waddington i in. 1952).

Nieoczekiwane zjawiska „paragenetyczne” były oznakami istnienia uniwersalnych mechanizmów regulacji, których znaczenie dla różnicowania komórkowego i rozwoju organizmu jest trudne do przecenienia.

Selektywna aktywność genów to podstawowe zjawisko warunkujące różnicowanie komórek i tkanek w trakcie rozwoju organizmu

Wszystkie komórki składające się na dany organizm zawierają tę samą informację genetyczną. Jednakże każdy z typów komórek charakteryzuje się określonym wzorcem ekspresji genów, który to wzorzec przekazywany jest komórkom potomnym.

Zjawisko zróżnicowanej ekspresji genów polega na aktywowaniu określonych genów i utrzymywaniu ich w stanie aktywności, przy jednoczesnej represji innych genów i utrzymywaniu ich w tym stanie w różnych częściach rozwijającego się zarodka oraz w określonych tkankach organizmu dorosłego. Tego rodzaju ekspresję genów wykorzystują także organizmy jednokomórkowe: np. komórki drożdży dzielą się na dwie kategorie rozrodcze (a oraz α), w zależności od których ekspresji podlegają różne podzestawy genów.

Ekspresja genów warunkująca różnicowanie komórek polega na selektywnym udziale czynników transkrypcyjnych oraz na tzw. regulacji epigenetycznej – zjawisku zachodzącym między poziomami genotypu a fenotypu. Regulacja epigenetyczna sprowadza się do modyfikowania funkcji genów niepociągającego za sobą zmian w sekwencjach kodujących. Omawiany poziom regulacji, odpowiadający za selektywną ekspresję genotypu, ma podstawowe znaczenie dla wszelkich aspektów różnicowania komórkowego, rozwoju, fizjologii i aspektów behawioralnych. Regulacja epigenetyczna jest możliwa dzięki takiej, a nie innej organizacji materiału genetycznego. DNA nie występuje w komórkach w formie czystej – jest on ściśle związany z histonami i mnóstwem innych białek, cechujących się przede wszystkim funkcjami regulatorowymi; razem wzięte tworzą one kompleks zwany chromatyną. Niektóre z tych białek regulatorowych występują w chromatynie komórek różnych rodzajów, niemniej w zależności od typu komórki mogą podlegać różnym modyfikacjom; inne natomiast są unikatowe dla danego rodzaju komórki.

Inna obserwacja sugerująca konieczność występowania poziomu regulatorowego, bez którego odzyskanie informacji genetycznej w celu wygenerowania danego fenotypu nie byłoby możliwe, dotyczy podobieństwa w rozmiarach genomów organizmów znacznie się od siebie różniących, w szczególności swą złożonością. Na przykład genom nicienia Caenorhabditis elegans i genom człowieka są mniej więcej porównywalne – na każdy z tych genomów składa się około 20 000 genów kodujących białka. Jednocześnie jest rzeczą oczywistą, że zarówno złożoność rozwoju człowieka, wielość wyspecjalizowanych tkanek osobnika dorosłego, jak również złożoność zachowania naszego gatunku i właściwe nam procesy fizjologiczne znacznie przekraczają te same parametry w przypadku nicienia. Znacznie bardziej zróżnicowany efekt genetyczny, jaki wykazuje nasz gatunek, wynika w dużej mierze z większego zróżnicowania ekspresji genów i modyfikacji produktów kodowanych przez geny (Bulger i Groudine 2011).

Koncepcja jednego genomu i wielu epigenomów

Jak można się domyślać, parametry epigenetyczne związane z aktywacją takiego a takiego zestawu genów i z jednoczesną dezaktywacją innego zestawu genów są odrębne dla różnych genów w różnych komórkach. Selektywna ekspresja genomu, której towarzyszą modyfikacje epigenetyczne charakterystyczne wyłącznie dla danego rodzaju komórki, to tzw. epigenom. Złożone organizmy wielokomórkowe posiadają wiele typów komórek, wobec czego można o nich powiedzieć, że mają one jeden genom, a wiele epigenomów. Zważywszy że informacja genetyczna jest identyczna we wszystkich komórkach zarodka rozwijającego się drogą podziałów mitotycznych w organizm wielokomórkowy, epigenomy pojawiają się za sprawą szerokiego wachlarza czynników wewnętrznych i zewnętrznych, które to czynniki w różny sposób oddziałują na różne obszary rozwijającego się zarodka.

Gdy w procesie oogenezy syntetyzowana jest cytoplazma przyszłej komórki jajowej, składane są w niej w sposób stopniowy różne morfogeny (Turing 1952; Wolpert 1969). Niezróżnicowane komórki rozwijającego się zarodka odpowiadają na różnice w stężeniach wzdłuż gradientu morfogenu, a aktywacji zaczynają podlegać różne geny, za sprawą których komórki stają się odrębne względem komórek sąsiadujących. Klasycznego przykładu zróżnicowanego powstawania epigenomów dostarcza morfogen Bicoid odpowiedzialny za wykształcenie osi przód–tył w zarodku Drosophila (Grimm i in. 2010; Porcher i in. 2010). Do chwili obecnej udało się odkryć wiele morfogenów występujących u różnych organizmów, w tym także u kręgowców (Tabata i Takei 2004). W dalszej kolejności tożsamość komórki może być kształtowana także przez sygnały międzykomórkowe. Sygnały te składają się z cząsteczek produkowanych przez określone komórki i wchodzących w interakcje z określonymi receptorami na powierzchni innych komórek. Zmiany konformacyjne receptorów wywołują kaskadę interakcji molekularnych, co prowadzi do aktywacji określonych genów. Jednoczesne występowanie na różnych grupach komórek różnych rodzajów receptorów cechujących się osobnymi właściwościami przekłada się na istnienie wielu sieci regulacji genów. Istnienie dodatkowych wzorców zróżnicowanej aktywności genów wynika ponadto z działania sygnałów międzykomórkowych polegającego na bezpośrednich interakcjach komórek z komórkami sąsiadującymi i odpowiedzialnych za zbiorcze przemieszczanie się komórek podczas morfogenezy.

Czynniki i bodźce z zewnątrz zarodka mogą wywierać trwały, a często też dziedziczny wpływ na wzorce aktywacji genów w trakcie rozwoju zarodkowego. Badania przeprowadzone z udziałem szczurów wykazały, że stres zmienia ich zachowanie, wywołując represję epigenetyczną określonych genów warunkujących neuroprzekaźnictwo (Youngson i Whitelaw 2008). Staje się coraz bardziej oczywiste, że sposób odżywiania rozwijającego się zarodka przekłada się na metabolizm powstającego zeń osobnika dorosłego, zaś otyłość matki może powodować cukrzycę ciążową i otyłość u dziecka (Alfaradhi i Ozanne 2011).

Pamięć epigenetyczna

Zarówno różnicowanie różnych obszarów w toku rozwoju, jak i utrzymanie istnienia tkanek osobnika dorosłego wymaga niezliczonych podziałów komórek somatycznych. W przypadku wszystkich tych podziałów materiał genetyczny komórki rodzicielskiej zostaje zduplikowany i przekazany komórkom potomnym. W większości przypadków informacja epigenetyczna warunkująca funkcjonalną specjalizację komórki rodzicielskiej również zostaje przekazana komórkom potomnym. Dobrym przykładem jest szczególny rodzaj komórek należących do nabytego układu odpornościowego. Limfocyty T, które uległy ekspozycji na elementy jakiegoś patogenu, np. wirusa lub bakterii, zostają aktywowane i zmuszone do szybkiej proliferacji, tak by atak mógł zostać odparty. Po zwalczeniu infekcji większość limfocytów T umiera; nieliczne, które zostają zatrzymane, nazywa się komórkami pamięci. Stają się one coraz mniej aktywne transkrypcyjnie i dzielą się wolniej. Niemniej limfocyty te zachowują pamięć o ekspozycji na patogen, reagując na ponowną infekcję o wiele szybciej, niż udało się to limfocytom T podczas pierwszej infekcji; aktywują one wszystkie geny niezbędne do odzyskania swojej tożsamości i narzucenia szybkiego tempa podziału aktywowanych komórek T.

Jak wyraźnie widać, do utrzymania zróżnicowanej aktywności genów specyficznej dla danego typu komórki niezbędne jest przekazywanie epigenetycznych elementów regulatorowych. Aby to się udało, trzeba jednak przezwyciężyć zmiany, jakie zachodzą podczas przejścia od interfazy do mitozy, polegające na zahamowaniu aktywności genów i gwałtownych przekształceniach struktury chromosomów, które to zjawiska służą w pierwszym rzędzie możliwości wiernego przekazania genomu.

Epigenetyka a zdrowie człowieka

Zrozumienie mechanizmów regulacji epigenetycznej pozwala na lepszy wgląd w wiele złożonych zjawisk, takich jak starzenie, nowotwory, nabyta odporność, procesy poznawcze, zachowanie czy choroby psychiczne. Starzenie to wieloaspektowy proces wpływający na większość szlaków fizjologicznych zarówno w organizmach jednokomórkowych, jak i u wielokomórkowych roślin i zwierząt. U podłoża związanych z wiekiem zmian leży nagromadzenie mutacji somatycznych (Wallace 2010) i istotne, postępujące przekształcanie się krajobrazu epigenetycznego oraz sposobu organizacji jądra komórkowego (Shin i in. 2011). Zmiany epigenetyczne mogą prowadzić bądź do aktywacji lub nadekspresji protoonkogenów, bądź do wyciszenia genów supresorowych, co w obu przypadkach daje początek chorobie nowotworowej (Chi i in. 2010). Procesy różnicowania komórkowego i neurogenezy są w dużej mierze regulowane na poziomie modyfikacji chromatyny (Barber i Rastegar 2010). Regulacja epigenetyczna odpowiedzialna jest za tworzenie pamięci i przechowywanie wspomnień (Miller i in. 2008), choroby neurologiczne, takie jak zespół Retta czy choroba Huntingtona (Urdinguio i in. 2009), a także za zaburzenia psychiczne w rodzaju uzależnienia od kokainy (Zhou i in. 2014). Z modyfikacjami chromatyny związane są wszystkie aspekty odporności nabytej (Green i in. 2006; Jhunjhunwala i in. 2009; Placek i in. 2009).

Wiedza na temat regulacji epigenetycznej wyposaża nas w narzędzia, dzięki którym zjawisko różnicowania komórek macierzystych można wykorzystać w celach medycznych. Wiele genów niezbędnych do procesu różnicowania zarodkowych komórek macierzystych wykazuje modyfikacje histonowe związane zazwyczaj z transkrypcją aktywną i represją. Występowanie modyfikacji biwalentnych uważa się zazwyczaj za parametr wprowadzania genów komórek macierzystych w stan gotowości na szybką odpowiedź na pozakomórkowe morfogeny (Landera i in. 2010). Jeśli uda się lepiej zrozumieć rolę tych modyfikacji, jak i epigenetycznych mechanizmów regulatorowych, znajdzie to ogromne przełożenie na wykorzystywanie komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej.

Podsumowując, modyfikacje epigenetyczne są niezbędnym mechanizmem regulacji różnicowania komórkowego i rozwoju organizmu; polegają one zarówno na modyfikowaniu struktury i organizacji chromatyny, jak również na sterowaniu ekspresją genów. Następne rozdziały części I niniejszej książki opisują podstawową strukturę chromatyny i omawiają ogólne mechanizmy transkrypcji genów.

Podsumowanie rozdziału

Informacja dotycząca wszystkich cech fizycznych i fizjologicznych organizmu, od jego narodzenia przez cały cykl życiowy, zapisana jest w DNA. Kwas deoksyrybonukleinowy nie występuje w formie czystej – związany jest z szeregiem białek, które wraz z nim tworzą kompleks nazywany chromatyną. W początkowym, podstawowym stanie genom jako taki jest poddany represji. Indywidualizacja rodzajów komórek organizmów wielokomórkowych w toku rozwoju wymaga zróżnicowanej aktywacji genów – jest to proces wynikający z nierównomiernego rozmieszczenia czynników transkrypcyjnych w zapłodnionej komórce jajowej. Zapoczątkowanie i utrzymywanie transkrypcji wybranych genów wiąże się z istnieniem modyfikacji białek związanych z DNA, a także z remodelingiem związków między białkami a DNA. Jako że zmiany wpływające na aktywność genów nie pociągają za sobą modyfikacji samego DNA, określa się je jako modyfikacje epigenetyczne. Z uwagi na zróżnicowaną aktywność genów rodzaje komórek opisuje się w odniesieniu do ich różnych rozmieszczeń modyfikacji epigenetycznych, stąd też można powiedzieć, że wykazują one odrębne epigenomy. Dzieląc się i dając początek różnym tkankom, komórki muszą przekazać komórkom potomnym informacje niezbędne do utrzymania określonej dystrybucji genów aktywnych. Owa pamięć epigenetyczna można dotyczyć zarówno przekazywania czynników transkrypcyjnych, jak i modyfikacji epigenetycznych obecnych w chromatynie komórki rodzicielskiej.

ROZDZIAŁ 2

Ogólna organizacja chromatyny

Organizacja DNA i histonów w nukleosomie

W jądrach komórkowych DNA występuje w obrębie chromatyny, która oprócz DNA zawiera RNA oraz dwa główne typy białek: histony i białka niehistonowe. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom składający się z fragmentu DNA owiniętego wokół oktameru, który zbudowany jest z histonów czerech rodzajów: H2A, H2B, H3 oraz H4. Histony te noszą nazwę histonów „rdzeniowych” (lub – czasem – „kanonicznych”), jako że zorganizowane są w nukleosom łączący się z nowo zreplikowanym DNA. Histony rdzeniowe są silnie zakonserwowane; H3 i H4 należą do najlepiej zakonserwowanych białek ze wszystkich białek występujących u eukariontów. Inkorporacja do nukleosomu wariantów histonowych różniących się sekwencją od tychże histonów następuje, gdy zachodzą określone procesy jądrowe, takie jak transkrypcja czy naprawa uszkodzonego DNA. W przypadku eukariontów wielokomórkowych geny histonowe można podzielić na podtypy według kryterium wzorca ekspresji i organizacji genomu. Geny histonów rdzeniowych podlegają ekspresji wyłącznie w fazie S cyklu komórkowego; nie posiadają one intronów i przyjmują postać klastrów występujących w wielu kopiach. Histony te tworzą nukleosomy wiążące się z nowo zreplikowanym DNA ‒ stąd nazwa histony sprzężone z replikacją (replication-coupled, RC). Geny kodujące warianty histonowe występują w genomie w jednej bądź w kilku kopiach i podlegają stałej, tyle że słabej ekspresji na każdym etapie cyklu komórkowego i w komórkach zróżnicowanych. Warianty histonowe określa się jako histony niezależne od replikacji (replication--independent, RI). Niektóre histony podlegają ekspresji specyficznej dla tkanki. W procesie spermatogenezy większość histonów zostaje zastąpiona protaminami; niewielki odsetek nukleosomów utrzymuje się jednak i niektóre z tych nukleosomów zawierają warianty histonowe specyficzne dla jąder. Uważa się, że owe nukleosomy plemników posiadają specjalną funkcję epigenetyczną z uwagi na fakt, że są znacząco wzbogacone w pobliżu genów odpowiedzialnych za rozwój organizmu, takich jak klastry genów imprintowanych, klastry mikroRNA czy klastry genu HOX, omawiane w następnych rozdziałach. Wszystkie histony rdzeniowe i ich warianty posiadają tzw. zawinięcie histonowe na motywie C-końcowym (trzy α-helisy połączone dwiema pętlami) i wydłużone ogony N-końcowe. Histon H2A zawiera także domenę ogona C-końcowego (ryc. 2.1).

Zawinięcia histonowe łączą się ze sobą, tworząc heterodimery H2A‒H2B i heterotetramery H3‒H4. Oktamery rdzeniowe mają po dwie cząsteczki H2A, H2B, H3 i H4 (ryc. 2.2); w warunkach in vitro z wysokim stężeniem soli i białek, poprzez powolne oddzielanie soli, mogą się one łączyć. Tetramery H3‒H4 mogą w warunkach in vitro łączyć się z DNA. Po dodaniu H2A i H2B histony te rekrutowane są do tetramerów H3‒H4.

Piąty rodzaj histonu, tzw. histon łącznikowy (H1, H5 itd., w zależności od danego organizmu), łączy się z DNA w miejscach początkowym i końcowym owinięcia wokół nukleosomu (ryc. 2.3). Histony łącznikowe wykazują wysoką zmienność ewolucyjną; większość organizmów posiada różne ich warianty w różnych rodzajach komórek i na różnych etapach rozwoju. Większość histonów łącznikowych ma krótką sekwencję N-końcową, centralną domenę globularną z miejscami wiążącymi DNA i wydłużony ogon C-końcowy.

Ryc. 2.1 Struktura czterech histonów rdzeniowych. (A) Wyróżnione zostały regiony cechujące się zawinięciem histonowym oraz ogony N-końcowe, na których zachodzi większość modyfikacji kowalencyjnych. (B) Zawinięcie histonowe. (C) Histony H2A i H2B tworzą dimer; histony H3 i H4 wchodzą w taki sam rodzaj interakcji.

[Na podstawie: Molecular Biology of the Cell, 4th ed.]

Ryc. 2.2 Schemat przedstawiający strukturę oktameru histonowego.

[Na podstawie: Molecular Biology of the Cell, 4th ed.]

Twierdzenie, że chromatyna zorganizowana jest na wzór łańcucha nukleosomów, sformułowano na podstawie następujących obserwacji. W procesie elektroforezy DNA cytoplazmatyczny, pojawiający się prawdopodobnie w następstwie rozkładu jądra po śmierci komórki, wykazywał równo ułożone prążki (Williamson 1970). Częściowe trawienie chromatyny przez endogenne endonukleazy lub enzymy bakteryjne typu MNazy przyniosło szereg fragmentów DNA będących wielokrotnością 200 par zasad (Hewish i Burgoyne 1973) (ryc. 2.4). Rozleglejsze trawienie doprowadziło do powstania fragmentów DNA o średniej długości 145 par zasad (pz). Początkowo MNaza przecina DNA między nukleosomami, do którego to materiału enzym ma dostęp; w trakcie trawienia pozostałość tegoż DNA zostaje zdegradowana, w wyniku czego powstają fragmenty DNA chronione przez dalszym trawieniem za sprawą ich powiązania z histonami. Trawienie deoksyrybonukleazą I (DNazą I), tj. enzymem dokonującym przecięć pojedynczej nici, wykazało, że miejsca wrażliwe występują co 10 par zasad wzdłuż DNA związanego z nukleosomem (Noll 1974; Simpson i Whitlock 1976). Gdy zastosowano rodnik hydroksylowy rozcinający szkielet cukrowo-fosforanowy, wykryto periodyczność podwójnej helisy DNA na powierzchni nukleosomu: od 10,7 pz na obrót w regionie centralnym do 10,0 pz na obrót w regionie flankującym (Hayes i in. 1990; Pugl i Behe 1993). Obserwacje te doprowadziły naukowców do wniosku, że DNA nie jest owinięty wokół oktameru histonowego wszędzie w ten sam sposób – ta jego właściwość może mieć istotne znaczenie w kontekście dostępności DNA nukleosomowego dla czynników transkrypcyjnych.

Ryc. 2.3 Schematy przedstawiające interakcję cząsteczki histonu łącznikowego (na obu rycinach zaznaczonej kolorem zielonym) z nukleosomem i DNA łącznikowym.

[Na podstawie: Caterino i Hayes 2011]

Ryc. 2.4 Organizacja chromatyny. Trawienie chromatyny MNazą przez coraz dłuższy czas; trawienie 1-minutowe prowadzi do powstania drabinki ze „szczebelkami” DNA oznaczającymi mono-, di-, trinukleosomy itd. Po prawej stronie przedstawiono skalę wielkości fragmentów DNA wyrażoną w parach zasad (pz).

[Na podstawie: Bio-Protocol 2017, 7, 6]

Polimery rekonstytuowane, zawierające cztery histony rdzeniowe i DNA, wytworzyły wzorzec dyfrakcji rentgenowskiej podobny do tego, który wykazuje chromatyna natywna (Kornberg 1974; Kornberg i Thomas 1974). Badania nad dyfrakcją rentgenowską z rozdzielczością równą 20 Å ujawniły istnienie struktury w kształcie dysku o średnicy 110 Å i grubości 57 Å, wokół której DNA wykonuje 1,75 obrotu (Finch i in. 1977). Kolejne badania, z rozdzielczością równą 2,8 Å, wykazały, że ‒ uśredniając ‒ DNA wykonuje 1,65 obrotu wokół nukleosomu, co daje 147 pz kontaktujących się z oktamerem w wielu różnych miejscach na zasadzie oddziaływania ładunek‒dipol i za pomocą wiązań wodorowych (Luger i in. 1997) (ryc. 2.5). DNA zawarty między dwoma sąsiadującymi nukleosomami – DNA łącznikowy – przyjmuje długość od 20 do 90 pz, w zależności od gatunku i tkanki tegoż gatunku.

Ryc. 2.5 Schemat po lewej stronie przedstawia strukturę krystalograficzną nukleosomu; cztery rodzaje histonów rdzeniowych różnią się od siebie kolorami. [Na podstawie: Wikipedia]. Schemat po prawej stronie przedstawia z kolei DNA owinięty wokół oktameru histonowego (czerwona wstążka).

[Na podstawie: LibreTexts, Biology]

Składanie włókien chromatynowych

Istotne procesy komórkowe, w których udział bierze DNA, takie jak replikacja, naprawa uszkodzeń czy transkrypcja, wymagają rozerwania chromatyny i usunięcia lub zaniku nukleosomów. W odtworzeniu struktury chromatyny udział biorą białka opiekuńcze (chaperony) histonu. W warunkach in vivo histony przed złożeniem w nukleosomy są wysoce acetylowane; prawdopodobnie po to, by obniżyć kontakt między DNA a białkami i zwiększyć kontakt między białkami a innymi białkami. Nukleosomy połączone DNA łącznikowym tworzą strukturę nazywaną „sznurem koralików”, którego średnica wynosi 10 nm. Podczas replikacji DNA (w fazie S) histony wyjściowe segregowane są losowo w dwie powstające cząsteczki DNA, a w celu uzupełnienia nukleosomu syntetyzowane są nowe histony rdzeniowe. Najpierw deponowane są stare i nowe tetramery H3‒H4, które rekrutują stare i nowe dimery H2A‒H2B. Proces ten wymaga udziału białek opiekuńczych histonu. Białka te zapobiegają interakcjom między podstawowymi histonami a DNA i innymi makrocząsteczkami o ładunku ujemnym, które to interakcje nastąpiłyby przed utworzeniem nukleosomów. Wykazano, że w komórkach tetramery H3‒H4 wiążą się z czynnikiem składania chromatyny 1 (chromatin assembly factor 1, CAF-1). Kompleks ten trafia do nowo zsyntetyzowanych dupleksów DNA w widełkach replikacyjnych dzięki wiązaniu się z jednym ze składników kompleksu replikacyjnego – jądrowym antygenem komórek proliferujących (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) – który tworzy „zacisk” wokół DNA i zapewnia wydajność przetwarzania kompleksowi polimerazy DNA. Inne białko opiekuńcze, czynnik Asf1 (antisilencing factor 1, czynnik przeciwwyciszeniowy 1), wiąże się z dimerami H3–H4 i, jak się sądzi, stymuluje aktywność CAF-1 poprzez przekazanie swego ładunku H3‒H4, by mogło dojść do depozycji tetramerów. Heterodimery H2A‒H2B są związane z nukleoplazminą bądź białkami opiekuńczymi Nap1 (nucleosome assembly protein 1). Histony, o czym będzie mowa w kolejnych rozdziałach, odgrywają istotną rolę także w procesach innych niż replikacja, by wymienić transkrypcję, naprawę DNA, utrzymywanie heterochromatyny oraz kontrolę cyklu komórkowego.

Ryc. 2.6 Zdjęcia z mikroskopu elektronowego przedstawiające: (A) rozwinięte włókno 10-nm, nazywane czasami „sznurem koralików”, oraz (B) włókno chromatynowe o średnicy 30 nm.

[Na podstawie: Molecular Cell Biology, 7th ed.]

Pozycjonowanie nukleosomów wzdłuż włókien chromatynowych zależy w pewnym stopniu od sekwencji DNA, ale przede wszystkim od działania czynników remodelujących wykazujących odrębne efekty. Niektóre sekwencje DNA zawierają miejsca o wysokim powinowactwie sprzyjającym depozycji nukleosomów; stąd też szeroko używano ich do generowania serii nukleosomów o różnych częstotliwościach w warunkach in vitro. Jedną z takich sekwencji wyizolowano z genu rybosomowego 5S RNA w kurzych erytrocytach (Simpson i Stafford 1983); inną uzyskano drogą złożonej z wielu rund selekcji spośród dużej puli losowo zsyntetyzowanych fragmentów – jest to sekwencja pozycjonująca 601 (Lowary i Widom 1998). Inne sekwencje, np. odcinki poli(dA:dT), wydają się występować często w tych regionach DNA, gdzie nukleosomów jest niewiele.

Istnieje wiele kompleksów wielobiałkowych, zachowanych od drożdży po człowieka, których funkcją jest pozycjonowanie nukleosomów w równomiernych odstępach. Kompleksy, takie jak ACF (assembly of core histones factor, czynnik składania histonów rdzeniowych), CHRAC (chromatin accessibility complex, kompleks dostępności do chromatyny), NURF (nucleosome remodeling factor, czynnik remodelowania nukleosomów) i RSF (remodeling and spacing factor, czynnik remodelowania i rozmieszczania), wykorzystują do katalizy tworzenia nukleosomów w równych odstępach, których efektem może być większy stopień upakowania, energię z hydrolizy adenozynotrifosforanu (ATP) uwalnianą przez podjednostkę ATPazy – ISWI (imitation switch independent). Niektóre z tych kompleksów mogą też wpływać na transkrypcję genów, modyfikując dystans między nukleosomami (patrz rozdział 4). W warunkach fizjologicznych włókno chromatynowe o średnicy 10 nm ulega kondensacji w strukturę drugorzędową o średnicy 30 nm (Kruithof i in. 2009), którą powszechnie uważa się za naturalny stan występowania chromatyny w jądrze (ryc. 2.6). Włókno stabilizowane jest za pomocą histonów łącznikowych. W komórkach na jeden nukleosom przypada średnio jedna cząsteczka histonu łącznikowego. Poza ich rolą w kontekście architektury genomu histony łącznikowe oddziałują też z wieloma białkami niehistonowymi.

Różne stany kondensacji włókna chromatynowego i zmiany od jednego stanu do drugiego

Jak sugerują wyniki kilku eksperymentów, kondensacja włókna o średnicy 10 nm do struktury o średnicy 30 nm wiąże się z neutralizacją ładunku elektrycznego; wiadomo też, że skondensowana chromatyna stabilizowana jest przez histony łącznikowe. Jeden z często wykorzystywanych paradygmatów badawczych opiera się na włóknach chromatynowych odtworzonych w warunkach in vitro na cząsteczce DNA zawierającej sekwencję pozycjonującą nukleosom (5S lub 601) występującą w równych odstępach. Konformację tego włókna w różnych warunkach można badać, określając wartość stałej sedymentacji podczas wirowania (współczynnik ten jest wypadkową masy cząsteczkowej i kształtu cząsteczki; jako że masa jest wartością stałą, zmiany w sedymentacji stanowią odzwierciedlenia zmian w kształcie). Wraz ze wzrostem stężenia soli obserwuje się także wzrost stałej sedymentacji włókien chromatynowych, odzwierciedlający jej strukturę trzeciorzędową, przekraczającą poziom upakowania włókien o średnicy 30 nm (Puhl i Behe 1993). Obserwacje te pozostają w zgodzie z obecnymi twierdzeniami na temat organizacji topologicznej chromatyny w jądrze (patrz rozdział 10). Podobne wyniki uzyskuje się, podnosząc stężenie dwuwartościowych kationów magnezu (Mg2+) (Schwarz i Hansen 1994). Włókna chromatynowe odtworzone z wykorzystaniem histonów pozbawionych ogonów N-końcowych mogą ulec upakowaniu poprzez dodanie Mg2+, ale nie do stopnia obserwowanego w przypadku normalnych histonów, co sugeruje, że ogony są unikalnym czynnikiem strukturalnym warunkującym upakowanie (Fletcher i Hansen 1995). Ogony histonowe zawierają znaczącą liczbę podstawowych reszt, takich jak lizyny (K) i argininy (R), które obdarzają je ładunkiem ujemnym; niektóre z tych ogonów biorą także udział w interakcjach między nukleosomami: jeden z dwóch ogonów N-końcowych histonu H4 występującego w jednym nukleosomie wiąże się z łatą tworzoną przez kwaśny łańcuch boczny globularnej części H2A i H2B nukleosomu sąsiadującego (Luger i in. 1997). Wpływ tej interakcji na kondensację włókien wynika z badań, które ukazują, że włókna chromatynowe złożone z acetylowanych nukleosomów nie podlegają indukowanemu przez Mg2+ ekstremalnemu upakowaniu, mającemu miejsce w przypadku nukleosomów niepoddanych modyfikacjom (Tse i in. 1998). Różne zwinięte formy, które przyjmują włókna chromatynowe wraz ze wzrostem stężenia dwuwartościowych kationów, nie są stabilne. Warunkiem koniecznym stabilności są nie tylko kationy nieorganiczne, ale i histony łącznikowe (Carruthers i in. 1998). Umożliwiają one samoasocjację włókien chromatynowych przy o wiele niższym stężeniu soli i tworzenie stabilnych struktur 30-nm (McBryant i in. 2012). Omówione badania wskazują, iż zmiana ładunków elektrostatycznych składowych chromatyny może oddziaływać także na nią samą.

Ryc. 2.7 Mechaniczne manipulowanie włóknami chromatynowymi. (A) Seria nukleosomów przyłączona do mikrosfery przytrzymywanej przez szczypce optyczne oraz do szkiełka; przesuwanie szkiełka powoduje rozciągnięcie nukleosomów. (B) Krzywa siły–rozciągnięcia ukazująca następujące po sobie uwalnianie nukleosomów; każdy wierzchołek odpowiada uwolnieniu pojedynczego nukleosomu.

[Na podstawie: Brower Toland i in. 2002]

Do analizy mechanicznych właściwości włókien chromatynowych 10-nm i 30-nm zastosowano zupełnie inne podejście. Składanie nukleosomów w serię na cząsteczce zawierającej powtórzenia tandemowe pozycjonujące nukleosomy następuje tu z wykorzystaniem oczyszczonych oktamerów histonowych; jedna strona DNA znakowana jest biotyną, a drugą – digoksygeniną. Jeden koniec serii przyczepiany jest do płytki pokrytej antydigoksygeniną, natomiast drugi – do pokrytej awidyną kulki magnetycznej lub do mikroskopijnej kulki polistyrenowej wiążącej biotynę. Siła wywierana jest poprzez przytrzymywanie kulki pęsetą magnetyczną, a mikroskopijnej kulki pęsetą optyczną, przy jednoczesnym odsuwaniu płytki w celu rozciągnięcia DNA nukleosomowego. Takie właśnie badania pozwoliły określić zarówno siłę potrzebną do rozbicia pojedynczych nukleosomów (ryc. 2.7), jak również rolę ogonów histonowych w kontekście stabilności mechanicznej włókien 30-nm (ryc. 2.8) (Brower-Toland i in. 2002; Cui i Bustamante 2000; Kruithof i in. 2009). Eliminacja ogona histonu prowadzi do ogólnego obniżenia w nukleosomach powinowactwa histonów do DNA; acetylacja lizyn powoduje przekształcenie grupy aminowej do amidu nieobdarzonego ładunkiem, a także obniża ogólne powinowactwo histonów do DNA (Brower-Toland i in. 2005). Spostrzeżenia te potwierdzają omawiane już wyniki uzyskane drogą analiz sedymentacji i dotyczące wpływu acetylacji histonów na upakowanie włókien chromatynowych.

Różne oblicza chromatyny

Jedno z zadań, jakie ma do spełnienia chromatyna z jej fizyczną i molekularną architekturą, polega na tym, by bardzo długie cząsteczki DNA były w stanie zmieścić się w jądrze komórkowym podczas interfazy, a także – już po replikacji DNA – aby ich rozmieszczenie między komórki potomne przebiegło łatwiej. Kolejnym jej zadaniem jest ochrona materiału genetycznego przed atakami molekularnymi i fizycznymi oraz odtworzenie jego integralności, gdy taki atak ma miejsce. Trzecim celem jest dopuszczanie materiału genetycznego do użytku na potrzeby stabilności komórki, różnicowania i funkcjonowania. Stan upakowania niezbędny, by zrealizować zadanie pierwsze, nie sprzyja z reguły ekspresji genów, wobec czego komórki wykształciły mechanizmy pozwalające na dynamiczne modyfikowanie i wykorzystywanie właściwości danego stanu upakowania chromatyny do regulowania funkcjonowania genów. Ogólne omówienie cech właściwych regionom aktywnym i nieaktywnym jest dobrym wprowadzeniem do tej tematyki. Stanowi także pierwszy przykład zależności funkcjonalnej między materiałem genetycznym a architekturą jądra.

Ryc. 2.8 Analiza włókien chromatynowych metodą spektroskopii sił. (A) Wydłużanie krótkich 30-nm włókien odtworzonych w warunkach in vitro można zmierzyć, umieszczając je pomiędzy szklaną powierzchnią a paramagnetyczną kulką, którą można przemieszczać za pomocą pęsety magnetycznej. (B) Zależności między użytą siłą a odległością dla włókien różniących się liczbą nukleosomów. W przypadku każdego odtworzonego włókna, gdy kulka jest podnoszona, wzrasta siła wywierana na włókna, nukleosomy wyskakują ze swoich miejsc, a cząsteczka DNA rozwija się, wobec czego wzrasta też długość włókna. Technika ta pozwala na określanie wpływu różnych modyfikacji histonowych na upakowanie włókien chromatynowych.

[Na podstawie: Kruithof i in. 2009]

Euchromatyna versus heterochromatyna

Ze względów praktycznych chromatynę można podzielić na regiony aktywne i nieaktywne, nazywane – odpowiednio – euchromatyną i heterochromatyną; zabarwiają się one inaczej w jądrze interfazowym (Heitz 1928). To rozróżnienie natury morfologicznej jest nadal przydatne, choć wraz z poszerzaniem wiedzy na temat molekularnej charakterystyki chromatyny należy poddać je pewnej rewizji. Euchromatyna z wyglądu jest rozproszona; obejmuje ona zdecydowaną większość genów aktywnych bądź genów, które zostaną aktywowane w określonych grupach komórek podczas różnicowania i rozwoju tkanek. Regiony heterochromatynowe są natomiast nieaktywne transkrypcyjnie. Niektóre z tych regionów, ulokowane zazwyczaj wokół centromerów i w obrębie telomerów chromosomów, pozostają skondensowane przez cały cykl życia komórki; jest to tzw. heterochromatyna konstytutywna. Regiony te zawierają liczne, często się powtarzające sekwencje DNA i elementy transpozycyjne, takie jak transpozony DNA i retrowirusy (ramka 2.1). Jedną z właściwości heterochromatyny konstytutywnej jest występowanie w niej nukleosomów z trimetylacją lizyny 9 histonu H3 na N-końcu (H3K9me3). Inne regiony genomu są skondensowane i nieaktywne w pewnych liniach komórkowych, ale w innych już nie; mamy wówczas do czynienia z tzw. heterochromatyną fakultatywną. Występujące w tych regionach nukleosomy cechują się trimetylacją lizyny 27 histonu H3 (H3K27me3). Szersze omówienie modyfikacji histonowych znajduje się w rozdziale 4. Heterochromatyna fakultatywna może obejmować całe chromosomy, jak to jest np. w przypadku nieaktywnego chromosomu X u ssaków (patrz rozdział 9), bądź nawet ich zestawy, czego przykładem może być genom ojcowski u niektórych owadów (Scarbrough i in. 1984). Pojęcie heterochromatyny fakultatywnej można odnieść także do dezaktywacji genów, takich jak geny homeotyczne, w tych regionach rozwijającego się zarodka, w których ich ekspresja jest niepożądana, czy też do dezaktywacji określonych alleli w zależności od płci rodzica (zjawisko to omówiono w rozdziałach 7 i 8).

Ramka 2.1 Sekwencje powtórzone i elementy transpozycyjne

Genom większości organizmów eukariotycznych zawiera dużą liczbę sekwencji DNA, które posiadają zdolność włączania się w inne miejsce w chromosomie. Owe elementy transpozycyjne (transposable elements, TE) można podzielić na dwie ogólne kategorie: retrotranspozony oraz transpozony DNA. Do retrotranspozonów zalicza się elementy oflankowane z obu stron długimi sekwencjami powtórzonymi (transpozony LTR) oraz elementy nieposiadające takich powtórzeń (transpozony non-LTR). Transpozony LTR występują u kręgowców. Transpozony non-LTR można podzielić na dwie główne grupy: długie rozproszone elementy jądrowe (long interspersed nucleotide elements, LINE) o średniej długości 5–7 tysięcy par zasad (kpz) oraz krótkie rozproszone elementy jądrowe (short interspersed nucleotide elements, SINE), których długość z reguły nie przekracza 500 pz.

Transpozony DNA oflankowane są odwróconymi powtórzeniami, a do ich uwolnienia potrzebna jest kodowana przez nie transpozaza dokonująca odpowiednich niesymetrycznych cięć. Ten sam enzym wykonuje cięcia również w innym miejscu genomu, dzięki czemu możliwe staje się włączenie transpozonu w nowe miejsce w genomie. Miejsce insercji charakteryzuje się występowaniem krótkich sekwencji powtórzonych powstałych na skutek wypełnienia cięć niesymetrycznych przez polimerazę DNA (ryc. 2B.1A).

Biogeneza i rozprzestrzenianie się retrotranspozonów wymaga pośrednictwa RNA syntetyzowanego przez polimerazę RNA II. W przypadku transpozonów LTR transkrypt ten ulega translacji w cytoplazmie do postaci kilku białek, w tym odwrotnej transkryptazy, dzięki której powstaje komplementarna nić DNA, a następnie – za sprawą polimerazy DNA – dupleks. Inne białko kodowane przez transpozon zamyka go w podobnej do wirusa cząstce. Trzecie białko, integraza, dokonuje cięć w losowych miejscach genomu i umożliwia włączenie postaci DNA transpozonu. Wyjściowy transpozon pozostaje na swoim miejscu, a genom kolonizowany jest przez nowe transpozony (ryc. 2B.1B). Transpozony non-LTR kodują białko zachowujące się jednocześnie jak odwrotna transkryptaza i endonukleaza. Dokonuje ono cięcia pojedynczych nici w określonych miejscach genomu w celu przygotowania do odwrotnej transkrypcji RNA jako przedłużenia jednej nici DNA genomu. Syntezy drugiej nici DNA dokonuje ten sam enzym bądź też przebiega ona w drodze mechanizmu naprawy DNA (ryc. 2B.1C).

NA POPRZEDNIEJ STRONIE:
Ryc. 2B.1 (A) Transpozony DNA. (B) Retrotranspozony LTR. (C) Retrotranspozony non-LTR. Białka kodowane przez autonomiczne retrotranspozony non-LTR mogą mobilizować także RNA retrotranspozonów nieautonomicznych.

[Na podstawie: Levin i Moran 2011, zmodyf.]

Biologia molekularna heterochromatyny

Obecna wiedza na temat biologii molekularnej powstawania i utrzymywania się heterochromatyny została zapoczątkowana badaniami nad wariegacyjnym efektem pozycji (position-effect variegation, PEV) u Drosophila. Termin ten wywodzi się z obserwacji, że geny przeniesione w wyniku rearanżacji chromosomów w sąsiedztwo heterochromatyny konstytutywnej mogą nie ulec transkrypcji w tych komórkach, w których w normalnych warunkach byłyby aktywne. Ich dezaktywacja to efekt nowej pozycji na chromosomie, co prowadzi do sytuacji, w której w tkance znajdują się zarówno przedziały (klony) komórek, gdzie gen jest nieaktywny, jak i przedziały, gdzie pozostaje on aktywny; w ten sposób powstaje fenotyp wariegacyjny. Jedna z pierwszych hipotez głosiła, że specjalne białka odpowiedzialne za odrębną strukturę upakowania heterochromatyny konstytutywnej przenikają do euchromatyny i wpływają na ekspresję zestawionych ze sobą genów; proces ten jest jednak losowy, w jednych komórkach zarodkowych i komórkach potomnych bowiem zachodzi, a w innych nie. W celu identyfikacji tych białek przeprowadzono obrazowanie genów Drosophila, w ramach którego wykryto mutacje wpływające na konkretny przykład PEV (Elgin i Reuter 2013). Dowiedziono, że wiele mutacji tłumi wariegację [mutacje Su(var)], co prowadzi do dużej ekspresji relokowanego allelu typu dzikiego. Mutacje te dotyczą genów kodujących białka heterochromatynowe, np. HP1a (heterochromatin protein 1a, białko heterochromatynowe 1a), lub kodujących enzymy nakładające na histony modyfikacje kowalencyjne właściwe heterochromatynie: Su(var)4-20 metylujący lizynę 20 na ogonie N-końcowym histonu H4 (H4K20me), Su(var)3-64B usuwający grupę acetylową z lizyny 9 histonu H3 (H3K9) i Su(var)3-9 metylujący lizynę 9 histonu H3 (H3K9me). Mutacje wywołujące wzrost liczby klonów, w których relokowany gen jest dezaktywowany, i tym samym wzmacniające poziom wariegacji dotyczyły z reguły genów kodujących powszechne czynniki transkrypcyjne; redukcja ich poziomu prowadziła do obniżenia częstotliwości aktywacji relokowanego allelu typu dzikiego i ułatwiała jego dezaktywację. PEV ma miejsce u eukariontów, poczynając od drożdży (Grunstein i Gasser 2013), a skończywszy na człowieku (Fodor i in. 2010). W organizmach tych występuje wiele kluczowych białek i czynników odkrytych u Drosophila.

Główną rolą heterochromatyny jest blokowanie aktywności elementów transpozycyjnych występujących w genomach wszystkich eukariontów. W wyciszaniu tych elementów w linii zarodkowej bierze udział mały niekodujący RNA, który indukuje depozycję metylowanego H3K9 (patrz rozdział 6). U Drosophila histon łącznikowy H1, który wydaje się występować częściej w regionach heterochromatynowych, może rekrutować metylotransferazę Su(var)3-9, metylującą lizynę 9 histonu H3 (Lu i in. 2013).

Euchromatyna i heterochromatyna zajmują określone miejsca w jądrze

W latach 50. XX wieku badania nad strukturą jądra z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej ujawniły, że regiony chromatyny skondensowanej powiązane są zazwyczaj z peryferiami jądra, podczas gdy chromatyna rozproszona zajmuje miejsce bliżej środka. Od tamtego czasu zdołano zgromadzić wiele danych na poziomie molekularnym dotyczących tego zróżnicowanego powiązania i jego znaczenia dla regulacji procesu transkrypcji (kwestie te omówiono w rozdziałach 11 i 12).

Transkrypcja regionów heterochromatynowych jest opóźniona

Replikacja DNA wielokomórkowych eukariontów inicjowana jest w tysiącach określonych miejsc zawierających bogate w C motywy konsensusowe (Cayrou i in. 2011). W fazie S cyklu komórkowego nie wszystkie potencjalne miejsca inicjacji transkrypcji zostają wykorzystane, niektóre z miejsc origin (ORI) są aktywne w pewnym rodzaju komórki, a w innym już nie. Co więcej, średni czas replikacji regionów genomu we wszystkich komórkach zależy od statusu transkrypcyjnego danego regionu – fragmenty aktywne transkrypcyjnie, wykazujące H3K4me3, K3K36me3, H4K20me1, H3K79me2, H3K9ac i H3K27ac, podlegają replikacji jako pierwsze; regiony poddane represji, wykazujące H3K27me3 (patrz rozdziały 4 i 5), replikują się później; na końcu replikowane są natomiast regiony heterochromatynowe, cechujące się modyfikacjami H3K9me3 i HP1 (Julienne i in. 2013).

Podsumowanie rozdziału

DNA nie występuje w komórkach w formie czystej. Powiązany jest on z histonami, białkami niehistonowymi oraz RNA, tworząc chromatynę. Cztery rodzaje histonów tworzą oktamery (nukleosomy), wokół których owinięty jest DNA, tworząc włókno chromatynowe o układzie znanym jako „sznur koralików”. Demontaż tej struktury, po którym następuje jej ponowne składanie, zachodzi podczas replikacji, naprawy DNA i transkrypcji. Pozycjonowanie nukleosomów na włóknie chromatynowym nie jest ani jednolite, ani regularne; biorą w nim udział kompleksy remodelujące chromatynę i odzwierciedla on stan funkcjonalny danego regionu wzdłuż włókna. Do analiz fizycznych powiązań między nukleosomami a DNA wykorzystuje się wiele metod biofizycznych.

Chromatynę można sklasyfikować na podstawie aktywności genów występujących w danym regionie. Heterochromatyna, do której należą nieaktywne lub poddane represji fragmenty genomu, wykazuje wyższy stopień kondensacji niż euchromatyna, oznaczająca luźniej zwinięte regiony zawierające geny aktywne. Te dwa rodzaje chromatyny można od siebie odróżnić na podstawie występowania lub nadmiernej obecności sekwencji powtarzalnych, odmiennych modyfikacji epigenetycznych i lokalizacji w odrębnych miejscach jądra.

Chromatyna wpływa na trzy podstawowe zjawiska składające się na metabolizm DNA – transkrypcję, replikację i naprawy uszkodzeń. Mechanizmowi transkrypcji oraz jego usytuowaniu w środowisku chromatyny poświęcone są rozdziały: 3 (część I) i 5 (część II). Z kolei replikacja DNA i naprawa uszkodzeń DNA stanowią przedmiot rozdziałów 14 i 15 (część IV).