Dane oryginału:

Molecular Ecology

This third edition first published 2020

© 2020 John Wiley & Sons Ltd

Edition History

John Wiley and Sons (2e, 2011)

All Rights Reserved. Authorised translation from the English language edition published by John Wiley & Sons Limited. Responsibility for the accuracy of the translation rests solely with Polish Scientific Publishers PWN and is not the responsibility of John Wiley & Sons Limited. No part of this book may be reproduced in any form without the written permission of the original copyright holder, John Wiley & Sons Limited.

Tłumaczenie: Filip Fierek

Wydanie polskie:

Projekt okładki i strony tytułowej Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Jan Mach/123RF, Evgeny Gromo/123RF

Redakcja Joanna Forysiak

Korekta Agnieszka Janowska

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Produkcja Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA, Warszawa 2021

ISBN 978-83-01-21670-2

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2021r. (Wydanie II)

Warszawa 2008, 2021

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288; infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Bezpłatny fragment

Rozdział 1. Genetyka molekularna w ekologii

Czym jest ekologia molekularna?

DNA, RNA i białka

Allozymy

DNA – niewyczerpane źródło informacji

Mutacja i rekombinacja

Znaczniki epigenetyczne

Genomy

DNA mitochondrialny (mtDNA)

DNA chloroplastowy (cpDNA)

Chromosomy haploidalne

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy

Źródła DNA

Pozyskiwanie danych metodą PCR

Rozmiar fragmentów

Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe

Podsumowanie

Streszczenie rozdziału

Rozdział 2. Markery molekularne w ekologii

Zrozumieć markery molekularne

Markery neutralne kontra markery adaptacyjne

Genomy

DNA mitochondrialny zwierząt (mtDNA)

DNA mitochondrialny roślin (mtDNA)

DNA chloroplastowy (cpDNA)

Chromosomy haploidalne

Markery jednorodzicielskie: zastrzeżenia końcowe

Markery molekularne

Wczesne fazy rozwoju markerów molekularnych

Allozymy

PCR-RFLP

Losowo amplifikowany polimorficzny DNA (RAPD)

Markery ISSR

Polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP)

Modyfikacja AFLP – polimorfizm wrażliwy na metylację (MSAP)

Mikrosatelity

Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie pojedynczego regionu DNA

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP)

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe (HTS)

Sekwencjonowanie RAD

Genotypowanie przez sekwencjonowanie (GBS)

Wychwytywanie sekwencji docelowej

Sekwencjonowanie pełnogenomowe

Podsumowanie

Streszczenie rozdziału

Rozdział 3. Gatunki

Koncepcje gatunku

Barkodowanie DNA

Zastosowania barkodowania

Barkodowanie i jego ograniczenia

Metabarkodowanie

Metagenomika

Barkodowanie i metabarkodowanie eDNA (DNA środowiskowego)

Podsumowanie

Streszczenie rozdziału

Rozdział 4. Filogeografia

Czym jest filogeografia?

Rozwój filogeograficznych zbiorów danych

Zegary molekularne

Drzewa dychotomiczne rozgałęzione

Koalescencja

Sieci

Analizy filogeograficzne oparte na modelach

Zmiany klimatyczne w długiej perspektywie

Okresy lodowcowe i międzylodowcowe

Ostoje morskie

Długofalowe skutki zlodowaceń

Dyspersja i wikariancja

Sortowanie linii genetycznych

Hybrydyzacja

Filogeografia stosowana: inwazje

Podsumowanie

Streszczenie rozdziału

Rozdział 5. Analiza genetyczna pojedynczych populacji

Po co badać pojedynczą populację?

Co to jest populacja?

Obliczanie różnorodności genetycznej

Równowaga Hardy’ego-Weinberga

Wskaźniki różnorodności genetycznej

Różnorodność haplotypowa

Wybór markera i genomu

Co wpływa na różnorodność genetyczną?

Dryf genetyczny

Co to jest efektywna wielkość populacji?

Cenzusowa wielkość populacji (Nc)

Efektywna liczba rozmnażających się osobników (Nb)

Obliczanie Ne na podstawie danych demograficznych

Obliczanie Ne na podstawie danych genetycznych

Obliczanie Ne – zastrzeżenia

Efektywna wielkość populacji, dryf genetyczny i różnorodność genetyczna

Wąskie gardło i efekt założyciela

Wielkość populacji i jej spadek

Selekcja naturalna

Rozmnażanie

Chów wsobny (kojarzenie krewniacze)

Ekologia i rozwój osobniczy

Podsumowanie

Streszczenie

Rozdział 6. Dyspersja, przepływ genów i genetyka krajobrazowa

Co to jest przepływ genów?

Po co obliczać przepływ genów?

Obliczanie przepływu genów między odrębnymi populacjami

Statystyka F

Testy przypisania

Analiza pokrewieństwa i rodzicielstwa

Identyfikacja populacji metodami nie a priori

Genetyka i genomika krajobrazowa

Analiza danych w genetyce krajobrazowej

Izolacja przez dystans (IBD)

Izolacja przez opór (IBR)

Związki genotypu i środowiska

Współczesne i historyczne czynniki wpływające na przepływ genów

Zróżnicowanie populacji: przepływ genów, dryf genetyczny i przystosowanie

Przepływ genów i dryf genetyczny

Adaptacja lokalna i przepływ genów

Dryf kontra selekcja

QST i FST

Podsumowanie

Streszczenie

Rozdział 7. Ekologia behawioralna

Jak dane genetyczne pomagają zrozumieć zachowanie?

Systemy rozrodcze

Monogamia

Poligamia

Analiza rodzicielstwa

Zapłodnienie pozapartnerskie

EPF i dostosowanie samców

EPF z perspektywy samicy – argumenty odwołujące się do adaptacji

EPF z perspektywy samicy – argumenty nieodwołujące się do adaptacji

Społeczne wychowywanie potomstwa

Wychowywanie kooperacyjne – korzyści pośrednie

Wychowywanie kooperacyjne – korzyści bezpośrednie

Eusocjalność

Dyspersja zależna od płci

Dyspersja zależna od płci – analizy na poziomie populacji

Genetyczne zróżnicowanie samców i samic

Markery dziedziczone w różny sposób

Pokrewieństwo

Dyspersja zależna od płci – analizy na poziomie osobniczym

Indeksy przypisania

Autokorelacja przestrzenna

Analiza rodzicielstwa

Zgodność wyników

Ekologia żerowania

Podsumowanie

Streszczenie

Rozdział 8. Genetyka konserwatorska

Taksonomia

Podgatunki

Taksony niższe niż podgatunek

Jednostki ochrony i przystosowanie

Różnorodność genetyczna

Różnorodność genetyczna i potencjał ewolucyjny

Transkryptomika i epigenetyka

Różnorodność genetyczna a chów wsobny

Depresja wsobna

Selekcja oczyszczająca i selekcja równoważąca

Pomiar depresji wsobnej

Zróżnicowanie genetyczne i ratunek genetyczny

Depresja outbredowa

Reintrodukcje

Hybrydyzacja

Genetyka zespołów

Podsumowanie

Streszczenie

Słownik

Literatura

Rozdział 1

Genetyka molekularna w ekologii

Czym jest ekologia molekularna?

W ciągu kilku ostatnich dekad za sprawą biologii molekularnej doszło do rewolucji w dziedzinie badań ekologicznych. W okresie tym odnotowano imponujące tempo ulepszania metod genetycznego opisu osobników, populacji i gatunków; do dziś dzięki tym metodom zyskujemy wiedzę i wiele nowych informacji dotyczących ekologii i ewolucji roślin, zwierząt, grzybów, glonów i bakterii. Dzięki markerom molekularnym możemy między innymi określać różnorodność genetyczną, śledzić przemieszczanie się osobników, analizować kojarzenie krewniacze, identyfikować skamieliny, opisywać nowe gatunki i odtwarzać rozprzestrzenianie się ich w przeszłości. W ostatnim czasie coraz bardziej wyrafinowane techniki w obszarze genomiki pozwoliły dokładnie przyjrzeć się funkcjonowaniu różnych genów, a także zrozumieć, w jaki sposób przystosowania ewolucyjne (lub ich brak) przyczyniają się do przetrwania organizmów w zmieniającym się środowisku. Wszystkie te zastosowania cieszą się dużym zainteresowaniem środowisk akademickich, a jednocześnie często przydają się do szukania odpowiedzi na praktyczne pytania ekologiczne, jak choćby: jakie zagrożone populacje są narażone na ryzyko chowu wsobnego czy też w jakim stopniu zaszła hybrydyzacja między genetycznie modyfikowanymi uprawami a ich dzikimi odpowiednikami. Każdego roku prostsze i tańsze staje się pozyskiwanie molekularnych danych genetycznych, a laboratoria na całym świecie obecnie są w stanie osiągać wyniki, które wcześniej wydawały się nie do pomyślenia, takie jak opisywanie całych populacji jedynie na podstawie pozostałości DNA pozyskanych z próbek wody czy porównywanie zestawu genów funkcjonalnych osobników należących do różnych populacji.

Niniejsze – trzecie – wydanie Ekologii molekularnej zostało zasadniczo przeorganizowane, a to dlatego, że w ciągu kilku ostatnich lat doszło do olbrzymich przemian w tym obszarze badań. Można przyjąć, że najistotniejszym przełomem ostatniej dekady było pojawienie się sekwencjonowania wysokoprzepustowego, które jednocześnie stawało się coraz tańsze; na początku technologia ta zarezerwowana była dla kilku laboratoriów dysponujących pokaźnym budżetem, później stała się dostępna dla dużej społeczności badaczy, którzy obecnie pozyskują dane sekwencyjne, o jakich wcześniej mogli tylko pomarzyć (ryc. 1.1). W momencie publikacji pierwszej edycji niniejszej książki w 2005 roku ekologią molekularną ekscytowano się głównie z uwagi na łatwość, z jaką badacze mogli pozyskiwać dane genetyczne z populacji naturalnych. Choć nadal tak jest, różnica między tamtym okresem a czasem obecnym polega na tym, że badania prowadzone przed 2005 rokiem były oparte na zaledwie kilku loci (obszarach chromosomu), podczas gdy współczesna ekologia molekularna bazuje na o wiele większej ich liczbie, a w niektórych przypadkach – na całych genomach. W rezultacie dysponujemy obecnie większą wiedzą na temat wszystkich zagadnień poruszanych w niniejszej książce, w tym genetyki populacyjnej, zmian ewolucyjnych, genetyki konserwatorskiej i ekologii behawioralnej. Niniejszy rozdział stanowi wprowadzenie do zagadnienia sekwencjonowania wysokoprzepustowego, do którego powrócimy także później. Do innych technologii znajdujących coraz większe zastosowanie w badaniach ekologicznych, o których również powiemy w kolejnych rozdziałach, zaliczają się: analiza DNA środowiskowego, metabarkodowanie, transkryptomika i epigenetyka. Ten rozdział rozpoczniemy od krótkiego wprowadzenia w podstawowe zasady genetyki oraz przybliżenia powszechnie stosowanych technik, co będzie niezbędne do zrozumienia istoty ekologii molekularnej.

Ryc. 1.1. Liczba wyników dla każdego roku otrzymanych po wpisaniu do przeglądarki Web of Science zapytania o „sekwencjonowanie nowej generacji” czy „sekwencjonowanie wysokoprzepustowe” przy jednoczesnym ograniczeniu wyszukiwania do kategorii: „ekologia”, „ochrona bioróżnorodności” lub „biologia morska i słodkowodna”

DNA, RNA i białka

Niniejszy podrozdział stanowi krótki przegląd zależności między pojęciami DNA, genów i białek – przegląd niezbędny do zrozumienia, w jaki sposób markery molekularne są używane w badaniach ekologicznych. DNA prokariontów, pozbawionych jądra komórkowego, jest zorganizowany w zamkniętą dwuniciową pętlę ulokowaną luźno w cytoplazmie komórki. Z kolei DNA eukariontów występuje przede wszystkim w postaci chromosomów znajdujących się w jądrze komórki – jest to genom jądrowy (nazywany również DNA jądrowym lub nDNA). Każdy z chromosomów zawiera pojedynczą cząsteczkę DNA podzieloną na jednostki funkcjonalne zwane genami. Miejsce zajmowane przez gen w obrębie danego chromosomu to tzw. locus (liczba mnoga: loci). Dany locus może być zajęty przez różne wersje tego samego genu, tzw. allele.

Każdy allel zawiera określoną sekwencję DNA. O sekwencji DNA decyduje ułożenie względem siebie czterech nukleotydów, z których każdy zawiera odrębny składnik chemiczny, tzw. zasadę. Wśród zasad DNA wyróżniamy adeninę (A), tyminę (T), guaninę (G) i cytozynę (C), które połączone są ze sobą za pomocą szkieletu cukrowo-fosforanowego i tworzą nić DNA. W podstawowej postaci DNA jest zorganizowany w dwie nici komplementarnych sekwencji związane ze sobą wiązaniami wodorowymi i tworzące podwójną helisę. Nie istnieją takie dwa allele tego samego genu, których sekwencja DNA byłaby identyczna, choć podobieństwo między nimi może być w istocie bardzo wysokie.

Funkcja genu polega na kodowaniu białek, a proces, w wyniku którego informacja genetyczna przekształcana jest z DNA w RNA, a następnie w białko, to tzw. ekspresja genu. Sekwencja DNA przynależąca do kodującego białko genu określa strukturę syntetyzowanego białka. Pierwszym etapem syntezy białka jest transkrypcja kodującego odcinka DNA w kwas rybonukleinowy (RNA). W efekcie transkrypcji dochodzi do powstania transkryptu pierwotnego, pojedynczej nici RNA komplementarnej z sekwencją DNA. RNA jest złożony z tych samych zasad co DNA, z wyjątkiem uracylu (U) zastępującego tyminę (T). W przypadku prokariontów transkrypt ten to jednocześnie RNA przekaźnikowy (mRNA). W przypadku eukariontów dochodzi do wycięcia intronów (tj. niekodujących odcinków DNA) w procesie zwanym splicingiem RNA, w wyniku czego powstaje dojrzały mRNA komplementarny z eksonem (kodującym odcinkiem DNA). Sekwencje mRNA są następnie tłumaczone na sekwencje białkowe w procesie zwanym translacją (ryc. 1.2). Translację umożliwia fakt, że każda cząsteczka RNA może być podzielona na triplety (zwane również kodonami), z których większość koduje jeden z 20 aminokwasów stanowiących składnik białek (tabela 1.1).

Ryc. 1.2. W procesie transkrypcji dochodzi do przekształcenia DNA w RNA. Następnie dojrzały mRNA jest używany w procesie translacji, podczas którego powstaje białko. Cały ten proces to centralny dogmat biologii molekularnej

Tabela 1.1. Kod genetyczny w jądrze komórkowym eukariontów (sekwencje RNA). 61 kodonów określa 20 aminokwasów, 3 dodatkowe kodony stop (UAA, UAG, UGA) sygnalizują koniec translacji. Kod genetyczny jest niemal uniwersalny, z zaledwie niewielkimi odstępstwami występującymi u niektórych mikroorganizmów i w DNA mitochondrialnym (mtDNA) zwierząt i grzybów

Dzięki określonym kombinacjom aminokwasów powstają polipeptydy będące częścią danego białka albo stanowiące jego całość lub też – w kombinacji z innymi cząsteczkami – tworzące kompleks białkowy. Jeśli sekwencje DNA z dwóch lub więcej alleli zajmujących ten sam locus są od siebie wystarczająco różne, odpowiadające im triplety RNA będą kodować różne aminokwasy, co przyczyni się do powstania alternatywnych form tego samego białka. Niemniej nie wszystkie różnice w sekwencjach DNA prowadzą do powstania osobnych białek. Jak pokazano w tabeli 1.1, w kodzie genetycznym występuje pewna doza redundancji, na przykład leucynę koduje aż sześć różnych kodonów. Redundancja oznacza, że dwie różne sekwencje DNA mogą prowadzić do powstania tego samego polipeptydu. W kodzie genetycznym zawarte są również funkcje „start” i „stop”: kodon stop (UAA, UAG, UGA) sygnalizuje zakończenie transkrypcji, podczas gdy kodon start (AUG, kodujący też aminokwas metioninę) wyznacza początek translacji. Kodony start i stop są kluczowe dla funkcjonowania genu, ponieważ stanowią jeden z mechanizmów kontroli jego ekspresji. Na ekspresję genu mogą mieć wpływ również fizyczne modyfikacje cząsteczek DNA, co omówimy w podrozdziale poświęconym epigenetyce.

Allozymy

Ekologia to dziedzina biologii, której głównym przedmiotem zainteresowania jest sposób, w jaki organizmy w środowisku naturalnym wchodzą w interakcje ze sobą i z otoczeniem. W przeszłości interakcje te badano za pomocą obserwacji i eksperymentów. W ich wyniku powstawały opisy fenotypów, czyli cech organizmu w ujęciu morfologicznym, fizjologicznym, biochemicznym i behawioralnym (ryc. 1.3). To, co nazwalibyśmy dziś klasycznymi badaniami ekologicznymi, znacząco podniosło naszą wiedzę na temat wielu różnych gatunków, a także pomogło zrozumieć, jak działają procesy regulujące ekosystemy. Niemniej do lat 60. XX wieku wiedzieliśmy niewiele na temat genetyki naturalnych populacji; mówiąc ściślej – nasza wiedza na temat zmienności genetycznej populacji, podobieństw genetycznych między populacjami a gatunkami, powiązań fenotypu i genotypu (tj. pełnego zestawu lub podzestawu genów danego osobnika) oraz roli genów funkcjonalnych była bardzo niewielka albo zerowa. Na przykład często pozostawało niejasne, czy różne fenotypy osobników należących do tej samej populacji lub tego samego gatunku wynikają z różnic genetycznych, czy są rezultatem plastyczności fenotypowej; ta ostatnia pojawia się, gdy w zależności od uwarunkowań środowiskowych z tego samego genotypu może wyłonić się kilka różnych fenotypów (ryc. 1.4). W latach 60. XX wieku – kiedy metoda elektroforezy żelowej białek allozymowych umożliwiła biologom uzyskanie bezpośredniej wiedzy na temat niektórych cech osobników, populacji, gatunków czy wyższych taksonów – rozumienie genetyki populacyjnej zaczęło się poszerzać. Przez ostatnie dekady wspomniane markery białkowe, najczęściej nazywane allozymami, wykorzystywano na szeroką skalę, dzięki czemu dokonano kilku istotnych odkryć na wyłaniającym się polu ekologii molekularnej, jako że pozwoliły one badaczom scharakteryzować w ujęciu genetycznym osobniki niemal każdego gatunku.

Ryc. 1.3. Przykład danych ekologicznych i ewolucyjnych uzyskanych z porównania fenotypów Nucella lapillus. Do analizy morfometrycznej wykorzystano punkty na muszlach oznaczone liczbami. Muszla z lewej strony została pobrana z miejsca w dużym stopniu chronionego przed falami wodnymi, podczas gdy muszla po prawej – lepiej rozwinięta – pochodzi z miejsca wystawionego na mocne falowanie. Zastosowanie takich metod, jak wspólny eksperyment ogrodowy, wzajemne przeniesienie organizmów do przeciwnych środowisk czy oszacowanie odziedziczalności, pozwoliło autorom badania na wyciągnięcie wniosku, że kształt muszli wynika zarówno z wpływu genetycznego, jak i plastyczności fenotypowej. Rycina przedrukowana z Pascoal i in. (2012)

Ryc. 1.4. Szarańcza pustynna (Schistocerca gregaria) to przykład skrajnej plastyczności fenotypowej. W warunkach niskiego zagęszczenia populacji szarańcza pozostaje w fazie samotnej (górna część ilustracji), co ma wpływ na jej utajone zachowanie i wygląd – unika wówczas innych osobników gatunku. Kiedy populacja się zagęszcza, szarańcza wchodzi w fazę stadną, zmieniając kolor na brązowy lub żółty (dolna część ilustracji) i tworząc gęste migrujące roje, stanowiące niejednokrotnie ogromne niebezpieczeństwo dla upraw. Między tymi dwiema formami występuje wiele różnic, do których zalicza się na przykład większy mózg u szarańczy w fazie stadnej (Ott, Rogers 2010). Różnice między obiema formami można wytłumaczyć odmiennymi wzorcami ekspresji genu (Badisco i in. 2011). Zdjęcie NASA, https://commons.wikimedia.org/wiki/File:DesertLocust.jpeg.

Allozymy stanowią alleliczne formy (allele) tego samego locus kodującego białko (Lewontin, Hubby 1966); był to pierwszy rodzaj markera molekularnego, który pozwolił ustalić poziom zmienności genetycznej osobników i populacji. Na poziomie osobniczym organizm diploidalny, posiadający dwie kopie tego samego allela w określonym locus, jest homozygotyczny dla tego locus, czyli w jego obrębie nie wykazuje zmienności (choć może wykazywać ją w innych loci). Na poziomie populacji stosunkowo wysoka liczba alleli w populacji (tj. suma wszystkich różnych alleli wszystkich badanych osobników) oznacza, że wykazuje ona wysoką zmienność genetyczną. Na kartach tej książki wielokrotnie będziemy podkreślać różnicę między pojęciami osobnika i populacji, gdyż jest ona kluczowa dla wielu zastosowań w ramach ekologii molekularnej. Pamiętajmy, że dane pozyskujemy zazwyczaj od osobników, przy czym jeśli rozmiar próby pobranej z danej populacji jest wystarczająco duży, przyjmujemy, że osobniki stanowią odpowiednią reprezentację cech genetycznych tej populacji.

Trudno przecenić rolę, jaką odegrały allozymy, będące pierwszym narzędziem określania różnorodności genetycznej odmiennych grup taksonomicznych na poziomach osobniczym i populacyjnym (Allendorf 2017). Choć w przeszłości były one niezwykle przydatne, dziś już rzadko używa się ich w obszarze ekologii molekularnej (ryc. 1.5) – z wielu powodów. Po pierwsze, nie zawsze jest tak, że zmienność występująca w sekwencji DNA kodującej białko przekłada się na zmienność uzyskiwanego produktu białkowego, ponieważ – jak zauważyliśmy wcześniej – ten sam aminokwas może być kodowany przez wiele sekwencji. Po drugie, w genomie każdego organizmu zawarte jest całe mnóstwo informacji, allozymy zaś wychwytują zaledwie niewielką ich część, ponieważ dostarczają tylko informacje z genów kodujących białka; podajmy jako przykład, że w ramach projektu poznania genomu ludzkiego odkryliśmy, iż białka koduje mniej niż 2% z 3,3 miliarda nukleotydów składających się na genom człowieka (Lander i in. 2001). Po trzecie, w wielu przypadkach pozyskiwanie danych na podstawie allozymów jest zarówno niewygodne, jak i niehumanitarne, ponieważ przed pobraniem tkanki trzeba niejednokrotnie uśmiercić dany organizm, sama zaś tkanka musi być przechowywana w bardzo niskich temperaturach (< –70°C); w większości badań terenowych niełatwo temu sprostać pod względem logistycznym. Wszystkie te niedogodności można pokonać dzięki użyciu odpowiednich markerów i sekwencji DNA, które stanowią obecnie najpowszechniejsze źródło danych pozyskiwanych w obszarze ekologii molekularnej, jako że dają możliwość pozyskiwania danych w nieograniczonych ilościach, a jednocześnie są bardziej humanitarne, gdy idzie o pozyskiwanie próbek z badanych organizmów.

Ryc. 1.5. Liczba wyników dla każdego roku otrzymanych po wpisaniu do wyszukiwarki Web of Science zapytania o „allozymy” przy jednoczesnym ograniczeniu wyszukiwania do kategorii: „ekologia”, „ochrona bioróżnorodności” lub „biologia morska i słodkowodna”

DNA – niewyczerpane źródło informacji

Nawet bardzo mały organizm może zawierać bardzo złożony genom. Jednokomórkowe drożdże (Saccharomyces cerevisiae) są tak małe, że w łyżeczce zmieściłyby się ich 4 miliardy, podczas gdy rozmiar ich genomu wynosi 12 milionów par zasad (Goffeau i in. 1996). Największy znany nam genom należy do Paris japonica, rzadkiej japońskiej rośliny, i wynosi w przybliżeniu 149 miliardów par zasad (Pellicer i in. 2010). Widać wyraźnie, że różnice są ogromne: w przypadku eukariontów rozmiar najmniejszego genomu może być 200 tysięcy razy mniejszy niż rozmiar największego genomu (Gregory 2001); w przypadku zwierząt – 7 tysięcy razy mniejszy (Palazzo, Gregory 2014). Co więcej, okazuje się, że w przypadku eukariontów rozmiar genomu nie wpływa na złożoność organizmu (Hjelmen i in. 2017); nawet organizmy pozostające w bliskim pokrewieństwie mogą mieć genomy bardzo różnych rozmiarów – jako przykład przywołajmy gatunek muszki owocowej Drosophila: genom D. orena jest 1,6 razy większy niż genom D. melanogaster (Boulesteix i in. 2005).

Każdy genom, bez względu na rozmiar, reprezentuje ogromną różnorodność DNA. Po części wynika ona z różnych genów kodujących białka. Wspomnieć tu należy rodziny genów będące zestawem kilku podobnych do siebie genów powstających w wyniku duplikacji pojedynczego genu pierwotnego. Dobrze zbadanym przykładem rodziny genów jest główny układ zgodności tkankowej (MHC), kodujący występujące na powierzchni komórek białka, które odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej u kręgowców, ponieważ dzięki nim organizmy są w stanie rozpoznać obce cząsteczki. Dla kontrastu scnDNA (jednokopiowy jądrowy DNA) występuje w genomie pojedynczo. Większość DNA – pomijając różne geny kodujące białka – nie koduje białek. Niekodujący DNA zawiera elementy funkcjonalne odpowiedzialne za kluczowe funkcje, takie jak regulacja ekspresji genu. Wyróżnić można także introny (sekwencje rozdzielające; ryc. 1.2) i pseudogeny; te ostatnie powstały z genów funkcjonalnych, ale przeszły mutacje, które wykluczają proces transkrypcji. Innym wartym uwagi źródłem DNA niekodującego są włączone do genomu elementy retrowirusowe i transpozony. Niektóre sekwencje DNA można określić jako motywy powtórzone, krótkie, powtarzające się sekwencje, w tym minisatelity (motywy o długości 10–100 pz występujące po sobie wiele razy) i mikrosatelity (motywy powtórzone o długości 1–6 pz; bardziej szczegółowo omawiamy je w rozdziale 2).

Podczas gdy struktury genów i ich funkcje różnią się między gatunkami, w obrębie jednego gatunku pozostają zazwyczaj takie same – nie oznacza to jednak, że wszystkie osobniki danego gatunku są identyczne pod względem genetycznym. Zmienność zarówno kodujących, jak i niekodujących sekwencji DNA oznacza, że nie istnieją dwa osobniki, których genom byłby identyczny. Wynika to z faktu, że sekwencje DNA podlegają strukturalnym zmianom w procesie replikacji, takim jak rekombinacja, duplikacja i mutacja, oraz zmianom funkcjonalnym rozumianym epigenetycznie. Warto przybliżyć, jak zachodzą te procesy, ponieważ bez znajomości mechanizmów przyczyniających się do powstawania zmienności DNA nie zyskalibyśmy kompletnej wiedzy na temat różnorodności genetycznej.

Mutacja i rekombinacja

Nowe genotypy powstają w wyniku dwóch procesów: mutacji i rekombinacji. Większość mutacji zachodzi podczas replikacji DNA, kiedy to sekwencja cząsteczki DNA staje się matrycą, dzięki której powstają nowe sekwencje DNA lub RNA w toku istotnych procesów, takich jak reprodukcja, ekspresja genu czy rozwój komórki. Podczas replikacji wiązania wodorowe łączące dwie nici macierzystego dupleksu DNA ulegają rozerwaniu, w wyniku czego powstają dwie osobne nici będące matrycą służącą do syntezy nowych nici DNA. Mechanizm replikacji komplikuje fakt, że synteza nowych nici zachodzi wyłącznie w kierunku 5ʹ → 3ʹ (ryc. 1.6). Do syntezy tej niezbędny jest enzym zwany polimerazą DNA, za pomocą którego na podstawie matrycowej nici DNA dodawane są pojedyncze nukleotydy w takim porządku, by zachować komplementarność sekwencji – zasada G parowana jest z C, a zasada A z T (lub U w przypadku RNA). Dopóki proces nie dobiegnie końca, dodawane są nowe nukleotydy, a po jego zakończeniu macierzysty dupleks DNA (dwuniciowy segment) zostaje zastąpiony przez dwa nowe dupleksy, z których każdy zawiera jedną nić starą i jedną nową.

Ryc. 1.6. W trakcie replikacji DNA dzięki enzymowi zwanemu polimerazą DNA dodawane są po kolei nukleotydy komplementarne do zdenaturowanej (jednoniciowej) matrycy DNA, w wyniku czego powstaje nowa nić, przyrastająca w kierunku 5’ → 3’. U eukariontów replikacja przebiega dwukierunkowo i może być zapoczątkowana w wielu miejscach naraz za pomocą primeru (krótkiego odcinka DNA, na ilustracji oznaczonego szarymi literami)

Błędy zachodzące w procesie replikacji DNA mogą prowadzić do substytucji nukleotydu, kiedy jeden nukleotyd zastąpiony zostaje przez inny. Do tej kategorii zaliczają się zarówno tranzycje, w przypadku których puryna zastąpiona zostaje inną puryną (A i G) albo pirymidyna inną pirymidyną (C i T), jak też transwersje, gdzie dochodzi do zastąpienia puryną pirymidyny lub na odwrót. Ogólnie tranzycje zachodzą o wiele częściej niż transwersje. Gdy substytucja nie prowadzi do zmiany kodowanego aminokwasu, mówi się o substytucji synonimicznej, ponieważ mimo zmiany sekwencji DNA nie zmienia się kodowany produkt (tabela 1.1). Odwrotnie jest w przypadku substytucji niesynonimicznych, kiedy substytucja prowadzi do kodowania innego aminokwasu, a zatem zmienia się funkcja danego odcinka DNA. Z substytucją nonsensowną mamy do czynienia wtedy, gdy substytucja nukleotydu prowadzi do pojawienia się kodonu stop, sprawiającego, że nie dojdzie do pełnej transkrypcji sekwencji DNA, a kodowane białko będzie niekompletne. Choć pojedyncze podstawienia nukleotydów (kiedy są synonimiczne) zazwyczaj nie przekładają się na zmiany w fenotypie, mogą przynosić bardzo poważne skutki. Anemia sierpowata występująca u ludzi jest wynikiem zmiany jednej pary zasad, gdzie kwas glutaminowy zastąpiony zostaje waliną, co kończy się śmiercią ludzi wykazujących homozygotyczność dla allela anemii sierpowatej.

Do błędów zachodzących w procesie replikacji DNA zaliczamy również insercje i delecje nukleotydu (występujące pod zbiorczą nazwą indeli), kiedy jeden nukleotyd (lub więcej) zostaje dodany do sekwencji lub z niej usunięty. Gdy do indelu dochodzi w obszarze kodującym, zazwyczaj zostaje przesunięta ramka odczytu dla wszystkich następujących po nim kodonów – jest to tzw. mutacja ramki odczytu. W takim przypadku sekwencja genu staje się często wadliwa. Do mutacji zalicza się też błędne parowanie nici opóźnionej, które zachodzi, gdy nowa nić DNA zostaje tymczasowo oddzielona od nici matrycowej. Jeśli wydarzy się to we fragmencie zawierającym sekwencje powtórzone, na przykład w obszarze powtórzeń mikrosatelitowych, nić potomna może zgubić miejsce i przyłączyć się do „niewłaściwego” powtórzenia. W rezultacie powstała nić potomna będzie albo dłuższa, albo krótsza od nici matrycowej, będzie bowiem zawierać inną liczbę powtórzeń (zob. podrozdział rozdziału 2 poświęcony mikrosatelitom).

Zjawisko mutacji w żadnym razie nie ogranicza się do jednego czy kilku nukleotydów. Do konwersji genu dochodzi, gdy allel w danym locus zmienia drugi allel do swojej własnej postaci. W latach 40. XX wieku Barbara McClintock odkryła inny przykład modyfikacji genetycznej – transpozony, czyli sekwencje mogące się przemieszczać w obrębie genomu. Przemieszczeniu ulegają jednak nie tylko określone transpozony, mogą one bowiem zabierać ze sobą również geny sąsiadujące, co prowadzi do obszernego przeorganizowania genów w obrębie chromosomu lub między chromosomami. Transpozony mogą również przerywać funkcje, jeśli trafią w środek innych genów, oraz podlegać replikacji, w wyniku czego wzrasta liczba ich kopii w obrębie genomu. Materiał genetyczny może przemieszczać się także między osobnikami tego samego lub innego gatunku w procesie zwanym poziomym transferem genów. Proces ten różni się diametralnie od dziedziczenia materiału genetycznego rodziców przez potomstwo (co nazywamy transferem pionowym) i stanowi jeden z głównych procesów ułatwiających rozprzestrzenianie się genów lekooporności bakterii.

Innym kluczowym procesem, w wyniku którego dochodzi do zmiany sekwencji DNA, jest rekombinacja. Życie większości osobników zaczyna się od jednej komórki, która – aby organizm się rozwinął – musi się wielokrotnie powielić. Ten rodzaj replikacji, nazywany mitozą, polega na duplikacji pełnego zestawu chromosomów osobnika – innymi słowy, nowa komórka ma tyle samo takich samych chromosomów co komórka macierzysta. Mitoza zachodzi w komórkach somatycznych (niepełniących funkcji płciowej). Mitoza, choć niezbędna do rozwoju organizmu, nie przydałaby się zbytnio do produkcji komórek płciowych. Rozmnażanie płciowe polega zazwyczaj na połączeniu jaja i nasienia, w wyniku czego powstaje zarodek. Gdyby jajo i nasienie powstały w procesie mitozy, każde z nich zawierałoby pełen zestaw chromosomów każdego z rodziców, zarodek zaś miałby ich dwukrotnie więcej. Liczba ta podwajałaby się z pokolenia na pokolenie, w szybkim tempie prowadząc do powstania coraz większych ilości DNA w każdym osobniku. Zapobiega temu zjawisko mejozy, sposób replikacji komórki występujący jedynie w gametocytach (komórkach, z których powstają jaja, nasienie, zalążki, pyłek i zarodniki). U gatunków diploidalnych (ramka 1.1) mejoza prowadzi do powstania gamet mających tylko jeden zestaw chromosomów (n), które po połączeniu tworzą diploidalny zarodek (2n). Rekombinacja w procesie mejozy zachodzi w wyniku wymiany materiału genetycznego między chromosomami homologicznymi. Prowadzi to do powstania nowych kombinacji genów w jednym chromosomie (ryc. 1.7), co w znaczącym stopniu przyczynia się do występowania różnorodności genetycznej u taksonów rozmnażających się płciowo.

Ryc. 1.7. Przykład rekombinacji na poziomie genu, ukazujący, w jaki sposób sekwencja genu w chromosomie 1 ulega zmianie z ABC do AbC. Rekombinacja prowadzi zazwyczaj do powstania nowych kombinacji alleli w chromosomie

Znaczniki epigenetyczne

Jak stwierdzono wyżej, najważniejszym źródłem zmienności genetycznej są zmiany zachodzące w sekwencjach nukleotydów następujące wskutek mutacji DNA, z zaznaczeniem, że istotną rolę w powstawaniu różnorodności genetycznej odgrywa także rekombinacja. Niemniej zmienność w fenotypach może wynikać także ze zmian epigenetycznych wpływających na ekspresję genu bez modyfikacji sekwencji genu. „Epigenetyczny” oznacza „powyżej genomu” – do tych zjawisk zalicza się między innymi metylacja DNA polegająca na dodaniu grupy metylowej (CH_3) do cytozyny. Nadmierna metylacja prowadzi zazwyczaj do ograniczenia transkrypcji, a w konsekwencji – ograniczenia ekspresji genu. Drugi istotny mechanizm zmiany epigenetycznej to modyfikacja histonu. Białka histonowe pełnią funkcję szpul, wokół których owinięty jest DNA, a ich modyfikacje powodują, że chromatyna (DNA + histon) jest upakowana ciaśniej lub luźniej, co z kolei przekłada się na podatność DNA na transkrypcję i w konsekwencji wpływa na stopień ekspresji genu. Genetyka medyczna żywo interesuje się problemem wpływu zmian epigenetycznych na choroby. Badacze zwykli sądzić, że na poziomie zarodka wszelkie znaczniki epigenetyczne zostają „wymazane” oraz że wszelkie zmiany epigenetyczne osobnik nabywa w ciągu życia; obecnie jednak wiemy, że niektóre znaczniki epigenetyczne mogą być przekazywane z pokolenia na pokolenie. Nie pojmujemy dobrze dziedziczenia epigenetycznego, na przykład nie rozumiemy, ile pokoleń może obejmować, niemniej stanowi ono fascynujące uzupełnienie o wiele lepiej rozumianych mutacji dziedzicznych w sekwencjach DNA. Epigenetyka – będąca pierwotnie przedmiotem zainteresowania genetyki medycznej – cieszy się obecnie coraz większą popularnością w ekologii, ponieważ w niektórych przypadkach zdarza się, że modyfikacje epigenetyczne zmieniające schematy ekspresji różnych genów mogą pomagać osobnikom tych samych gatunków przystosowywać się do różnych środowisk, nawet jeśli ogólne podobieństwo genetyczne tych osobników względem siebie jest wysokie. W rozdziale 2 przyjrzymy się, w jaki sposób markery molekularne pomagają badać zmiany epigenetyczne wśród osobników pochodzących z populacji dzikich.

Ramka 1.1. Chromosomy i poliploidalność

Kariotyp (komplet chromosomów w komórce somatycznej) wielu gatunków zawiera zarówno autosomy, zazwyczaj identyczne pod względem zestawu i uporządkowania w przypadku obu płci, i chromosomy płciowe. Liczba kopii pełnego zestawu chromosomów określa ploidalność osobnika. Gatunki diploidalne mają dwa zestawy chromosomów (2n), a podczas rozmnażania płciowego dziedziczą po jednym zestawie od każdego z rodziców. Człowiek to gatunek diploidalny, posiadający 22 pary autosomów i 2 chromosomy płciowe (2 chromosomy X w przypadku płci żeńskiej, a 1 chromosom X i 1 chromosom Y w przypadku płci męskiej), co oznacza, że jego kariotyp wynosi 2n = 46 (22 autosomy i 1  chromosom płciowy pomnożone przez 2 z uwagi na diploidalność). Liczba chromosomów różni się w zależności od gatunku (ryc. 1.8). Organizmy poliploidalne mają więcej niż 2 pełne zestawy chromosomów. W przypadku osobników autopoliploidalnych wszystkie chromosomy pochodzą od jednego gatunku ancestralnego, jako że chromosomy nie oddzieliły się w toku mejozy. W ten sposób osobnik diploidalny (2n) może dać początek osobnikowi tetraploidalnemu, posiadającemu 4 kopie pierwotnego zestawu chromosomów. Inaczej jest w przypadku allopoliploidów, których chromosomy pochodzą z różnych gatunków za sprawą hybrydyzacji. Powstanie nowych poliploidów skutkuje czasem utworzeniem nowego gatunku, przy czym na jeden gatunek może składać się wiele ras, czyli cytotypów.

Ryc. 1.8. Kariotyp osobnika żeńskiego Dasypus novemcinctus. Standardowy kariotyp gatunku diploidalnego, jak wynika z ryciny, zawiera 31 par autosomów i 1 parę chromosomów płciowych (w tym przypadku to dwa chromosomy X) i oznacza się go jako 2n = 64

Źródło: ryc. przedrukowana z pracy Svartman i in. (2006).

Poliploidalność występuje bardzo często u okrytonasiennych, a w mniejszym stopniu u grzybów, kręgowców (głównie ryb, gadów i płazów), także bezkręgowców (w tym owadów i skorupiaków). Poliploidalność jest zjawiskiem istotnym z ekologicznego i ewolucyjnego punktu widzenia z wielu powodów, między innymi dlatego, że poliploidy występują licznie w populacjach roślin inwazyjnych. Skuteczność biologicznej inwazji poliploidów bierze się być może stąd, że choć niewielkie populacje kolonizujące często podlegają kojarzeniu krewniaczemu, co z kolei przekłada się na spadek zdolności dostosowawczych, dodatkowe chromosomy, obecne z uwagi na poliploidalność, zapewniają bufor chroniący przed niską różnorodnością genetyczną i czynią niektóre gatunki nierodzime bardziej odpornymi na zjawisko chowu wsobnego. Dla przykładu poliploidalne populacje chabra nadreńskiego (Centaurea stoebe) narażone były na mniejsze ryzyko depresji wsobnej niż diploidalne populacje rodzime o porównywalnych rozmiarach (Rosche i in. 2017). Innym przykładem ukazującym, jak zjawisko poliploidalności odnosi się do sfery ekologii, jest zdolność współżycia poliploidalnych i diploidalnych osobników tego samego gatunku dzięki różnicowaniu się siedlisk. Na przykład diploidalne i tetraploidalne populacje storczyka koślaczka stożkowatego Anacamptis pyramidalis są odizolowane od siebie rozrodczo z wielu powodów, z których jeden to zajmowanie osobnych mikrosiedlisk, co najprawdopodobniej należy tłumaczyć dostępnością grzybów, z którymi mogą wytworzyć mikoryzę (Pegoraro i in. 2016). Na kartach tej książki czytelnik znajdzie więcej przykładów uwidaczniających znaczenie zjawiska poliploidalności dla badań prowadzonych w ramach ekologii molekularnej.

Genomy

Mówiąc o DNA, zazwyczaj przyjmujemy, że mamy na myśli DNA jądrowy dziedziczony od obojga rodziców, dobrze znaną koncepcję, zgodnie z którą osobniki dziedziczą połowę DNA od matki, a połowę od ojca. W istocie potomstwo organizmów rozmnażających się płciowo dziedziczy w przybliżeniu po połowie DNA od każdego z rodziców. W przypadku diploida, organizmu rozmnażającego się płciowo, oznacza to, że w obrębie genomu jądrowego jeden allel w każdym locus pochodzi od matki, a drugi allel od ojca. Mówimy wówczas o dziedziczeniu dwurodzicielskim. Należy jednak zaznaczyć, że nawet w przypadku organizmów rozmnażających się płciowo DNA nie jest w całości dziedziczony od obojga rodziców. Godne wspomnienia wyjątki stanowią dziedziczone jednorodzicielsko genomy organellowe w mitochondriach (DNA mitochondrialny, mtDNA) oraz plastydach (DNA chloroplastowy, cpDNA). Mitochondria i chloroplasty zlokalizowane są poza jądrem komórkowym (ryc. 1.9). Mitochondria występują zarówno u roślin, jak i u zwierząt, podczas gdy chloroplasty, rodzaj plastydów, wyłącznie u tych pierwszych. DNA organellowy występuje zwykle w postaci superskręconego dwuniciowego koła DNA, a genom ten jest o wiele mniejszy niż genom jądrowy. Na przykład genom mitochondrialny ssaków, którego rozmiary wynoszą między 15 a 17 tysięcy par zasad, jest 10 tysięcy razy mniejszy niż najmniejszy zwierzęcy genom jądrowy. Niedostateczny rozmiar kompensowany jest jednak przez liczebność: jedna komórka człowieka zawiera zazwyczaj od tysiąca do 10 tysięcy mitochondriów. Markery molekularne pochodzące z genomów organellowych, w szczególności zaś ze zwierzęcego mtDNA, stają się coraz popularniejsze w badaniach ekologicznych, a to dlatego, że – jak zobaczymy – cechują się właściwościami niespotykanymi w genomach jądrowych.

Ryc. 1.9. Mitochondria to organelle będące miejscami produkcji energii w komórce. We wnętrzu mitochondrium znajduje się niewielki kolisty chromosom zwany DNA mitochondrialnym (mtDNA), dziedziczony przez potomstwo (osobniki płci męskiej i żeńskiej) zazwyczaj od matki. Rycina pochodzi z National Institutes of Health

DNA mitochondrialny (mtDNA)

DNA mitochondrialny produkuje RNA oraz białka niezbędne do oddychania komórkowego, procesu, w wyniku którego z pożywienia powstaje energia. Zwierzęcy mtDNA zazwyczaj ma rozmiar od 16 kpz do 18 kpz (kpz = 1 tysiąc par zasad) i zawiera 13 genów kodujących białka, 22 geny RNA przekaźnikowego oraz dwa geny RNA rybosomowego. Występuje tam także region kontrolny, z miejscami inicjującymi procesy replikacji i transkrypcji. Większość sekwencji jest unikatowa, innymi słowy – są to sekwencje niepowtórzone, nie ma też wielu dowodów sugerujących obecność sekwencji rozdzielających w obrębie genów. Choć zauważa się pewne przeorganizowania w genach mitochondrialnych u różnych gatunków zwierząt, ich ogólna struktura, rozmiar i układ pozostają stosunkowo trwałe (ryc. 1.10). W przypadku większości zwierząt DNA mitochondrialny jest dziedziczony przez potomstwo (osobniki płci żeńskiej i męskiej) nie od ojca, lecz od matki.

Ryc. 1.10. Mapa genów i układ pełnego genomu mitochondrialnego australijskiej ryby Cetonurus globiceps. Wysoka liczba genów RNA przekaźnikowego (tRNA) jest charakterystyczna dla mtDNA kręgowców. Inne powszechne geny to podjednostki dehydrogenazy NADH (ND) i oksydazy cytochromowej (CO). Rycina przedrukowana z pracy Shi i in.(2016)

Zasadnicza rola mitochondriów zwierzęcych i roślinnych jest podobna, ale różnią się one znacząco pod względem struktury. Najoczywistszą różnicą jest rozmiar: w przeciwieństwie do średniego rozmiaru u zwierząt, wynoszącego 16,5 kpz, roślinne genomy mtDNA mają od 200 do 2500 kpz. Większy rozmiar i jego duża rozpiętość wynikają głównie z występowania sekwencji powtórzonych, dużych intronów oraz sekwencji niekodujących, a ponadto zintegrowanych sekwencji z genomów jądrowego i chloroplastowego. Stosunek zawartości genów i intronów w mtDNA roślinnym również znacząco waha się w zależności od gatunku – sekwencjonowanie pełnogenomowe mtDNA dowiodło różnic sięgających 32–67 genów i 18–25 intronów.

DNA chloroplastowy (cpDNA)

Roślinny mtDNA jest zazwyczaj trwały niezależnie od gatunku, co wraz z jego złożoną i zmienną strukturą przyczynia się do tego, że kiedy w badaniach potrzebne są markery haploidalne, naukowcy o wiele częściej sięgają po genomy cpDNA. Plastydy, do których zaliczają się chloroplasty, to występujące u roślin i glonów organelle, które wytwarzają i magazynują wiele składników chemicznych wykorzystywanych w komórce. Te, które zawierają chlorofil (plastydy zielone), mogą przeprowadzać fotosyntezę. W ekologii molekularnej DNA plastydowy nazywamy zazwyczaj DNA chloroplastowym (cpDNA). U większości okrytonasiennych cpDNA jest – podobnie jak mtDNA – dziedziczony od matki, podczas gdy u większości nagonasiennych (iglastych i sagowców) zazwyczaj od ojca. Genom DNA chloroplastowego, w przypadku większości roślin kluczowy do przeprowadzania procesu fotosyntezy, przyjmuje zazwyczaj rozmiar od 120 tysięcy do 220 tysięcy par zasad (przy średniej wynoszącej około 150 tysięcy par zasad; ryc. 1.11). Genom większości roślin fotosyntetyzujących zawiera od 70 (nagonasienne) do 88 (wątrobowce) genów kodujących białka oraz od 33 (większość dwuliściennych właściwych) do 35 (wątrobowce) genów strukturalnych RNA, w sumie od 100 do 120 różnych genów (Wicke i in. 2011). Choć czasami mamy do czynienia z rekombinacją, chloroplasty wykazują zasadniczą stabilność pod względem strukturalnym, zmienność w rozmiarze można zaś przypisać przede wszystkim długościom powtórzeń sekwencji – inaczej niż było to w przypadku przeorganizowania genów i duplikacji w roślinnym mtDNA.

Ryc. 1.11. Mapa genomu chloroplastowego palmy kokosowej (Cocos nucifera), o całkowitym rozmiarze wynoszącym 154 731 par zasad. Pogrubione linie naniesione na wewnętrznym okręgu wskazują odwrócone powtórzenia (IR). Geny zawierające introny oznaczone są „*”. Pseudogeny oznaczone są „Ψ”. Rycina przedrukowana z pracy Huang i in. (2013)

Podobnie jak miało to miejsce z mtDNA, genom cpDNA wielu gatunków został w całości zsekwencjonowany, co poszerzyło naszą wiedzę na temat jego rozmiaru i struktury. Podajmy kilka przykładów: genom cpDNA glonu Chlorella sorokiniana zawiera 109 811 par zasad kodujących w sumie 109 genów, w tym 74 geny kodujące białka, 3 geny rRNA i 31 genów tRNA (Orsini i in. 2016). Genom chloroplastowy manneczki indyjskiej (Eleusine indica) jest nieco większy i przyjmuje rozmiar 135 151 par zasad, mając 108 unikalnych genów, z których 76 to geny kodujące białka, 28 stanowią geny tRNA, a 4 to geny rRNA (Zhang i in. 2017). Praca Jiang i in. (2016) ukazuje korzyści płynące z pozyskiwania sekwencji z całego genomu cpDNA przy ustalaniu zależności ewolucyjnych między roślinami: pochodzące z całego genomu cpDNA sekwencje sagowców, do których należą najbardziej zagrożone gatunki roślin na Ziemi, zostały porównane przez badaczy na poziomie wewnątrzgatunkowym, międzygatunkowym i międzyrodzajowym. Długość genomu chloroplastowego wynosiła 162 094 par zasad: zawierał on 87 genów kodujących białka, 37 genów tRNA i 8 genów rRNA. Porównanie całego genomu pozwoliło naukowcom zidentyfikować istotne poznawczo zmienne regiony nawet u gatunków, których zasięg występowania jest bardzo ograniczony.

Chromosomy haploidalne

Jak wspomniano podczas omawiania dziedziczności markerów jądrowych i organellowych, geny jądrowe są dziedziczone dwurodzicielsko. Pozostaje to prawdą dla większości z nich, z wyjątkiem chromosomów płciowych (chromosomów determinujących płeć). Nie wszystkie gatunki mają chromosomy płciowe, na przykład płeć krokodyli, a także wielu żółwi i jaszczurek, jest determinowana środowiskowo – zależy od temperatury, w jakiej przebywają w początkowym okresie rozwoju. Jednak w przypadku wielu innych gatunków płeć jest determinowana genetycznie, to znaczy zależy od chromosomów płciowych. Genetyczna determinacja płci przebiega według różnych wzorców. U większości ssaków, a także niektórych roślin dwupiennych osobniki płci żeńskiej są homogametyczne (mają dwie kopie tego samego chromosomu płciowego: XX; ryc. 1.8), podczas gdy osobniki płci męskiej są heterogametyczne (mają jedną kopię każdego z chromosomów płciowych: XY). Odwrotnie jest w przypadku ptaków i motyli, gdzie osobniki płci żeńskiej są heterogametyczne (ZW), a osobniki płci męskiej – homogametyczne (ZZ). U niektórych gatunków, na przykład nicienia Caenorhabditis elegans, płeć heterogametyczna (męska) oznaczana jest jako XO, co oznacza, że osobnik ma wyłącznie jeden chromosom X. Gatunki roślin jednopiennych zazwyczaj nie mają wyodrębnionych chromosomów płciowych.

U ssaków samica przekazuje jeden ze swoich chromosomów X całemu potomstwu, zarówno samcom, jak i samicom. To udział samca decyduje o płci potomstwa: jeśli obdarzy je chromosomem X, potomstwo będzie płci żeńskiej, jeśli zaś chromosomem Y – będzie płci męskiej. Chromosom Y jest zatem dziedziczony przez syna po ojcu, więc przekazuje się go jedynie w linii męskiej. Ponieważ w żadnym zestawie chromosomów nie występuje więcej niż jedna kopia chromosomu Y (pomijamy defekty genetyczne), chromosom Y to jedyny chromosom ssaków wykazujący w istocie charakter haploidalny. Co więcej, podobnie jak w przypadku mtDNA, chromosomy Y w większości nie przechodzą rekombinacji. Istnieją dwa niewielkie regiony pseudoautosomalne na końcówkach chromosomu, które przechodzą rekombinację z chromosomem X, ale regiony te są oddzielone od sekwencji niepodlegającej rekombinacji odcinkiem o długości 60 Mpz (ryc. 1.12).

Tabela 1.2. Standardowy model dziedziczenia różnych regionów genomu w taksonach rozmnażających się płciowo

Region genomu

Standardowy model dziedziczenia

Zwierzęta

Chromosomy autosomalne

Dwurodzicielsko

DNA mitochondrialny

W linii matczynej u większości zwierząt

Dwurodzicielsko u niektórych małży

Chromosom Y

W linii ojcowskiej

Rośliny naczyniowe

Chromosomy autosomalne

Dwurodzicielsko

DNA mitochondrialny

Zazwyczaj w linii matczynej

DNA plastydowy (w tym DNA chloroplastowy)

W linii matczynej u większości okrytonasiennych

W linii ojcowskiej u większości nagonasiennych

Dwurodzicielsko u niektórych roślin

Chromosom Y

W linii ojcowskiej u niektórych dwupiennych

Ryc. 1.12. Chromosom Y u ssaków. Gen SRY (determinujący płeć region chromosomu Y) decyduje o tym, że zarodek przyjmuje płeć męską. Regiony pseudoautosomalne jako jedyne podlegają rekombinacji z chromosomami X podczas replikacji DNA

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Bogactwo informacji zawartych w genomie pozostaje bezużyteczne dla ekologów molekularnych, jeśli nie ma się do nich dostępu i jeśli nie da się ich oszacować; stało się to możliwe po roku 1985, w dużej mierze dzięki dr. Kary’emu Mullisowi, który opracował metodę pod nazwą „reakcja łańcuchowa polimerazy”, PCR (Mullis i Faloona 1987). Jej wynalezienie okazało się wielkim przełomem, który pozwolił badaczom wyizolować i powielić określony regiony DNA z dużych i złożonych genomów. Trudno przecenić znaczenie PCR dla wielu dziedzin biologii, co zresztą doceniono w 1993 roku, kiedy Mullis otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Piękno metody PCR wynika z faktu, że dzięki niej można z łatwością powielić jeden lub więcej regionów genomu. Najczęściej przebiega to tak, że najpierw izoluje się cały DNA z próbki, a następnie używa się sparowanych primerów oligonukleotydowych w celu wielokrotnego powielenia jednego lub więcej docelowych regionów DNA, dopóki nie osiągnie się odpowiedniej liczby kopii. Primery, których długość wynosi zazwyczaj od 15 do 35 par zasad, stanowią niezbędny punkt początkowy syntezy DNA, a każdy z nich musi być komplementarny z nicią DNA flankującą docelową sekwencję, dzięki czemu przyłączą się do żądanego miejsca i ustanowią odpowiedni punkt początkowy replikacji.

Każdy cykl reakcji PCR składa się z trzech faz: denaturacji DNA, przyłączania primerów i wydłużania zsyntetyzowanych sekwencji (ryc. 1.13). Faza pierwsza, denaturacja DNA, polega na podniesieniu temperatury do około 94°C, dzięki czemu wiązania wodorowe rozpadną się, a dwuniciowy DNA stanie się jednoniciowym DNA matrycowym. Następnie temperatura obniżana jest do 40–65°C, co pozwala primerom przyłączyć się do sekwencji komplementarnych flankujących sekwencję docelową. Faza końcowa, przebiegająca zazwyczaj w temperaturze 72°C, sprowadza się do wykorzystania polimerazy DNA oraz wolnych nukleotydów użytych w reakcji do wydłużenia sekwencji primerów. Nukleotydy są dodawane w uporządkowany sposób, poczynając od końca primeru 3ʹ, czyli tak, jak przebiega replikacja DNA in vivo (ryc. 1.6). W cyklu PCR z każdej macierzystej nici DNA powstają dwie nowe nici, co sprawia, że w przebiegu PCR liczba sekwencji rośnie wykładniczo. Na procedurę PCR składa się zazwyczaj 35 cykli, co wystarcza, by jedną sekwencję macierzystą powielić do 68 miliardów kopii!

Ryc. 1.13. Dwa pierwsze cykle reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Pogrubione czarne linie symbolizują oryginalną matrycę DNA, krótkie szare kreski to primery, a linie zakreskowane to nowo zsyntetyzowane fragmenty DNA

W PCR wykorzystuje się polimerazę termostabilną, najczęściej polimerazę Taq, nazwaną w ten sposób, ponieważ została wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus bytującej w źródłach termalnych. Wysokie temperatury nie dezaktywują polimerazy Taq, dzięki czemu wystarczy dodać ją tylko raz, na początku reakcji, która przebiega w skomputeryzowanych termocyklerach (urządzeniach do PCR) przeprowadzających cykle w różnych temperaturach. W przypadku wykorzystywania nowych primerów lub analizy DNA różnych gatunków potrzebna jest czasem pewna optymalizacja, polegająca na przykład na modyfikacji temperatury przyłączania albo stężenia soli w celu podtrzymania aktywności polimerazy. Niemniej kiedy już się tego dokona, badacz musi jedynie dostarczyć składników reakcji, zaprogramować urządzenie i wrócić po jednej, dwóch lub trzech godzinach, kiedy praca zostanie ukończona. Po tym czasie liczba kopii regionu docelowego znacząco przekroczy ilość wyjściowego, niepowielonego DNA, a produkt końcowy procedury będzie można opisać za pomocą kilku metod, które przybliżymy w dalszej części tego rozdziału i w rozdziale 2.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy

Jak zaznaczono, PCR wykorzystuje się najczęściej do generowania dużych ilości jednego lub więcej docelowych regionów DNA, które następnie są używane do tworzenia profili genetycznych osobników, populacji i gatunków. Tyle że jedną z rzeczy, których nie można dokonać za pomocą tradycyjnego PCR, jest oszacowanie ilości DNA zawartego w danej próbce. Wynika to z braku zależności między rozmiarem matrycy na początku reakcji a ilością DNA powielonego po jej zakończeniu. W latach 90. XX wieku stworzono jednak technikę pod nazwą „ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy” (qPCR lub też ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, RTPCR), która pozwala badaczom określić ilość DNA zawartego w danej próbce.

qPCR pozwala jej użytkownikom monitorować reakcję PCR „w czasie rzeczywistym”, to jest podczas jej trwania, a nie czekać, aż wszystkie cykle reakcji PCR dobiegną końca. Reakcje qPCR wykorzystują te same elementy co standardowa PCR, z jednym wyjątkiem: fragmenty wytworzone w ramach qPCR są oznaczane barwnikami fluorescencyjnymi lub barwnikami wiążącymi DNA i mogą być obliczane po każdym cyklu. Do reakcji qPCR dodaje się więcej primerów i polimerazy, niż potrzeba, wobec czego jedynym czynnikiem wpływającym na liczbę kopii DNA tworzonych w początkowych cyklach PCR jest ilość DNA matrycowego; wynika stąd, że ilość barwnika dodanego do amplikonów jest wprost proporcjonalna do początkowej ilości DNA. Istnieje zależność między pierwszym znaczącym wzrostem ilości produktu PCR a całkowitą ilością DNA początkowego. Metodą qPCR można dokonywać zarówno względnej, jak i bezwzględnej oceny ilości DNA lub RNA. Ocena bezwzględna dotyczy liczby kopii uzyskanych z określonej matrycy; dokonuje się jej zazwyczaj, porównując ilość DNA wygenerowaną w każdym cyklu z krzywą wzorcową opartą na próbach o znanej jego zawartości (ryc. 1.14). Z kolei ocena względna polega na określeniu, która z prób zawiera więcej, a która mniej danego produktu.

Ryc. 1.14. Generowanie krzywej wzorcowej, z którą zestawia się produkty qPCR w celu ustalenia, jaka ilość DNA została dodana do mieszanki qPCR. W tym przypadku krzywa wzorcowa bazuje na serii wzorcowych stężeń, z których każde jest 10-krotnie wyższe od drugiego; innymi słowy – na serii próbek, w których wiemy, ile DNA do nich dodano. (A) Wykres przedstawiający uzyskaną ilość produktu fluorescencyjnego (ΔRN) w każdej reakcji qPCR. Każda para krzywych (w sumie jest ich 7) oznacza inne stężenie DNA, począwszy od 10^6 kopii na reakcję (po lewej), a skończywszy na 10^0 kopiach na reakcję (po prawej); krzywe te sporządzono dwukrotnie. Na ilustracji ukazano też próg kwantyfikacji (ΔRN = 0,02141), poniżej którego powielony DNA uważa się za „szum”, a także typową flourescencję tła (skręcone linie poniżej progu). (B) Krzywa wzorcowa qPCR wygenerowana w tej samej reakcji co (A). Każdy prostokąt odpowiada jednej krzywej; CT to cykl kwantyfikacji, a „liczba” to liczba kopii DNA dla reakcji (dodawanych ręcznie do reakcji). Porównując produkty reakcji qPCR o nieznanych ilościach DNA z krzywymi wzorcowymi, jesteśmy w stanie oszacować liczbę kopii DNA obecnych w danej próbce. Rycina autorstwa Charise Currier

Metoda qPCR może przynieść korzyść badaniom ekologicznym z wielu powodów. Jedną z jej zalet jest to, że pozwala badaczom na określenie wymaganej czułości testów, to jest na sprawdzenie, ile materiału DNA powinna zawierać próbka, zanim podda się ją PCR. Brandl i in. (2015) wykorzystali qPCR do określenia czułości testów z układu pokarmowego wybranych gatunków ryb; chcieli ustalić, w jakim stopniu te introdukowane gatunki ryb żywią się rybami rodzimymi w Zatoce San Francisco. Poza tym metodę qPCR można wykorzystać także do określenia ekspresji genu: ponieważ transkrypcja RNA zachodzi tylko w ramach ekspresji genu, ilość RNA w próbce wskazuje na intensywność zachodzącej ekspresji genu. Naukowcy mogą wyizolować RNA z organizmów i poddać odwrotnej transkrypcji (tj. przekształcić RNA w DNA, co jest odwrotnością procesu transkrypcji), aby powstał w ten sposób DNA komplementarny (cDNA). Dzięki oszacowaniu cDNA metodą qPCR możliwe jest określenie stopnia, w jakim badany gen podlegał ekspresji w organizmie w momencie pobierania próbki. Może to pomóc naukowcom poznać warunki sprzyjające bądź to regulacji dodatniej (podwyższonej ekspresji genu), bądź to regulacji ujemnej (obniżonej ekspresji genu). Metoda qPCR, w której wykorzystano cDNA, posłużyła naukowcom do oszacowania RNA w badaniach nad koralowcami ośmiopromiennymi. Negatywny wpływ na rafy koralowe wywiera działalność człowieka prowadząca do podniesienia pH i temperatury oceanów; Shimpi i in. (21016) wykorzystali qPCR do porównania poziomów transkrypcji zestawu genów referencyjnych; chcieli sprawdzić, czy ekspresja genu zależy od środowiskowych czynników stresowych. Jednym z badanych genów było białko szoku cieplnego 70 (hsp70). Białka szoku cieplnego, zwane również białkami stresu, są wszechobecne i odgrywają wiele istotnych ról, między innymi chronią komórki przed stresem; w przypadku rodzaju Sinularia w wyniku wysokiego stresu termicznego ich ekspresja się zwiększała, a gdy poziom stresu związany z odczynem pH był niski – malała. Badanie to pomogło lepiej zrozumieć, jak koralowce odpowiadają na stres, a także jak w przyszłości będą reagować na zmiany czynników abiotycznych.

Źródła DNA

Zarówno PCR, jak i qPCR wymagają bardzo niewielkiej ilości DNA matrycowego; oznacza to, że jesteśmy w stanie dokonać charakterystyki genetycznej osobników na podstawie bardzo wielu rodzajów próbek, których większość można pobrać bez powodowania trwałego uszczerbku na zdrowiu organizmów, z których próbki te pochodzą. Mówiąc ogólnie, istnieją trzy różne kategorie DNA wykorzystywanego w ekologii molekularnej. Pierwszy rodzaj to DNA genomowy, izolowany albo z całych organizmów (na przykład mikrobów czy małych bezkręgowców), albo z materiału takiego jak krew, włosy, sierść, liście, korzenie itp. Drugi typ to DNA zbiorczy, odnoszący się do puli fragmentów genomu pobranych w tym samym czasie z wielu gatunków i osobników usuniętych z ich siedlisk, na przykład z grupy mikroorganizmów w próbce gleby (Creer i in. 2016). Trzecia kategoria to eDNA, czyli materiał wyizolowany z pozostałości DNA pochodzących z próbki środowiskowej, takiej jak gleba lub woda, bez konieczności uprzedniego wyizolowania organizmów (Taberlet i in. 2012).

Jako że do przeprowadzenia PCR potrzeba naprawdę niewielkich ilości DNA, nie musimy zabijać zwierząt, by dokonać charakterystyki genetycznej osobników. Oto przykłady próbek wykorzystanych w analizie DNA i pobranych bez zabijania zwierząt, a czasem też próbek o charakterze zupełnie nieinwazyjnym: DNA z kału wykorzystany do opisania gatunków trudnych do schwytania, takich jak duże kotowate (Mesa-Cruz i in. 2016); DNA z kału lub pajęczej nici wykorzystany do opisania małych gatunków, takich jak pająki, które w przeciwnym razie na potrzeby pobrania próbki trzeba by zabić (Blake i in. 2016, Sint i in. 2015); DNA z wymiocin, odchodów lub całej zawartości żołądka do opisania ofiar drapieżników (Kamenova i in. 2018); pióra ptaków (Kleven i in. 2016); fragmenty czułków pszczół (Oi i in. 2013); wymazy ze śluzu ryb i słodkowodnych małży (Cho i in. 2016, Le Vin i in. 2011); próbki włosów pobrane za pomocą metod nieinwazyjnych (Kendall i in. 2009). Na temat pobierania próbek genetycznych metodami nieinwazyjnymi zob. Beja-Pereira i in. (2009). Pracując z niewielkimi próbkami, należy jednak postępować szczególnie ostrożnie, by uniknąć ich zanieczyszczenia, ponieważ obcy DNA łatwo może przykryć DNA, który nas interesuje. Co więcej, mogą się także pojawić problemy związane z amplifikacją DNA z próbek zdegradowanych, takich jak włosy czy odchody, ponieważ potrzebne są wówczas albo dogłębne potwierdzenie (na przykład przez wielokrotnie genotypowanie pojedynczej próbki), albo modyfikacje statystyczne uwzględniające możliwość wystąpienia błędów w genotypowaniu (Knapp i in. 2009).

Jeśli chodzi o sprawy praktyczne, przechowywanie próbek pobranych w celu PCR podczas prac w terenie nie jest zbyt trudne, ponieważ próbki te mogą występować w postaci ususzonych okazów (na przykład próbki liści w kopertach zawierających środki do pochłaniania wilgoci) albo być przetrzymywane w temperaturze pokojowej w niewielkich fiolkach z 70–95-procentowym roztworem etanolu lub roztworem buforowym. DNA w świeżo pobranej krwi czy tkance przetrwa w dobrym stanie, jeśli tylko materiał umieści się w odpowiednim roztworze buforowym lub etanolu – DNA przechowywany nieprawidłowo ulegnie degradacji i zamieni się w pofragmentowane cząsteczki. DNA z próbki nieżywej, takiej jak kał lub okaz muzealny, sam w sobie będzie już zdegradowany. Jeśli fragmenty DNA ze zdegradowanej próbki będą mniejsze niż badany region DNA, amplifikacja PCR się nie powiedzie; stąd też gdy pracuje się z próbkami zdegradowanymi, przedmiotem analizy powinny być stosunkowo krótkie odcinki DNA (ramka 1.2).

Metodą PCR można identyfikować jednocześnie wiele gatunków organizmów, posługując się w tym celu próbami zbiorczymi – technikę tę zastosowano na potrzeby badań nad wieloma grupami taksonomicznymi, w tym żyjącymi w glebie grzybami (Schmidt i in. 2013), schwytanymi w pułapki bezkręgowcami (Ji i in. 2013) czy planktonem w jeziorach (Poretsky i in. 2014). eDNA, trzecia kategoria, to DNA, który trafił do środowiska w postaci rozkładających się ciał, jako wydzieliny, krew, liście, pyłek, nasiona, mocz, kał, skóra lub inny materiał pochodzący od organizmu. Większość organizmów pozostawia w środowisku, w którym się pojawia, ślad DNA, dlatego ten materiał może być dowodem obecności konkretnego organizmu na danym terenie w przeszłości lub obecnie; nie trzeba wówczas zobaczyć go na własne oczy. Proszę, by czytelnik podczas lektury zakładał, że ilekroć mowa o DNA, mamy na myśli DNA genomowy pobrany z pojedynczych organizmów, chyba że zaznaczono inaczej. O DNA zbiorczym i eDNA będzie jeszcze mowa w rozdziale 3.

Pozyskiwanie danych metodą PCR

Rozmiar fragmentów

Określony region genu, gdy zostanie już powielony z odpowiedniej liczby próbek, musi być w pewien sposób opisany, tak by naukowiec był w stanie przypisać genotyp do każdego osobnika. Najprościej dokonać tego na podstawie rozmiaru powielonego produktu, który jesteśmy w stanie poznać, rozdzielając produkty PCR w żelu agarozowym. Roztwory żelu sporządza się, dodając do roztworu buforowego proszek agarozowy, a następnie podgrzewając roztwór do momentu, aż stanie się płynny. Wówczas roztwór przelewany jest na tackę otoczoną usuwalnymi ściankami, wyposażoną w grzebienie, które zostają na niej, dopóki roztwór nie schłodzi się i nie zastygnie. Wtedy grzebienie są usuwane, w wyniku czego po jednej stronie tworzą się kieszonki. Następnie usuwa się ścianki, próbki trafiają do kieszonek i zostaje włączone źródło prądu. Cząsteczki DNA mają ładunek ujemny, więc będą się przemieszczać w stronę elektrody dodatniej.

Ramka 1.2. Muzea i herbaria. Skarbce danych biologicznych

Muzea i herbaria na całym świecie razem wzięte mają około 3 miliardów okazów reprezentujących około 2 milionów gatunków z najróżniejszych miejsc na kuli ziemskiej (Wheeler i in. 2012). W wielu przypadkach zbiory dotyczące jednego tylko gatunku mieszczą okazy z wielu różnych dekad, dzięki czemu możliwe jest próbobranie temporalne bez konieczności cofania się w czasie. Dzięki temporalnym porównaniom okazów muzealnych udało się zyskać niesłychaną wiedzę na temat ewolucyjnych zmian w fenotypie różnych organizmów. Na przykładu ciernik (Gasterosteus aculeatus) z jeziora Washington na przestrzeni 5 dekad rozwinął większe ilości łusek ochronnych, prawdopodobnie z uwagi na wzrost presji drapieżników (Kitano i in. 2008). W ciągu ostatnich 100 lat niedźwiedziówka kaja (Arctia caja) rozwinęła dłuższe i węższe skrzydła tylne i węższe skrzydła przednie, prawdopodobnie z uwagi na potrzebę zwiększenia możliwości dyspersji (Anderson i in. 2008) (ryc. 1.15). Jeśli chodzi o zbiory muzealne, szerokiej wiedzy mogą dostarczać także dane genetyczne, na przykład naukowcy badający niedźwiedziówkę kaję wyizolowali DNA z odnóży tego owada, a następnie je zsekwencjonowali i stwierdzili, że spadkowi liczebności tego gatunku, odnotowywanemu przez ostatnie dekady, towarzyszyło również obniżenie różnorodności genetycznej.

Ryc. 1.15. Przednie i tylne skrzydła niedźwiedziówki kai (Arctia caja) (a), zebrane na przestrzeni dekad z różnych miejsc we Wielkiej Brytanii i przechowywane w wielu zbiorach muzealnych, dowodzą toczącego się w przeszłości procesu ich zwężania, a w przypadku skrzydeł tylnych – także wydłużania (b). Tendencja ta może być wynikiem rozciągniętego w czasie doboru faworyzującego osobniki będące w stanie przemieszczać się na stosunkowo duże odległości; mechanizm ten wynika z fragmentacji siedlisk i towarzyszyło mu obniżenie różnorodności genetycznej (Anderson i in. 2008)

W innym badaniu, w którym również wyizolowano i powielono DNA pochodzące ze zbiorów muzealnych, zmutowane allele odporności wykryto u owadów z czasów sprzed stosowania pestycydu o nazwie malation – allele te stanowiły dowód na preadaptację, która tłumaczy, dlaczego muchy plujki tak szybko rozwinęły odporność na insektycydy (Hartley i in. 2006). W obszarze genetyki konserwatorskiej u wielu gatunków zagrożonych, takich jak pardwa mszarna (Lagopus lagopus) (Freeland i in. 2007) czy sterniczka zwyczajna (Oxyura leucocephala) (Jacobs, Latimer 2012), odnotowano tymczasowe obniżenie różnorodności genetycznej. Badania tego rodzaju stały się możliwe dzięki pojawieniu się metody PCR, pozwalającej uzyskać wystarczające ilości DNA docelowego ze śladowych ilości materiału wyjściowego, takiego jak fragment skóry, element pióra, kawałek liścia czy rybie łuski.

DNA pochodzące ze zbiorów muzealnych i herbariów, choć może stanowić cenne źródło informacji, jest jednak zazwyczaj zdegradowane, czasem w stopniu znacznym (Burrell i in. 2015). W rezultacie amplifikacja i sekwencjonowanie DNA z próbek muzealnych mogą być trudne i jak dotąd procedury te stosuje się tylko do tych regionów genu, które występują w wielu kopiach, szczególnie do regionów mtDNA i cpDNA, jako że genomy są wielokrotnie kopiowane w każdej z komórek. Warto jednak dodać, że technologia HTS (patrz niżej) dostarcza większej ilości danych z okazów muzealnych w porównaniu z wcześniejszymi technologiami sekwencjonowania; wynika to stąd, że najnowsze metody są przystosowane do wykorzystywania w funkcji matryc krótkich, pofragmentowanych cząsteczek DNA. Naukowcy wykorzystujący HTS byli w stanie zsekwencjonować cały genom jądrowy z liczącego 43 lata okazu rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) (Brassicaceae) pochodzącego z herbarium, a także dużą część materiału z okazów grzybów liczących nawet 82 lata (Staats i in. 2013). W ramach innego badania naukowcom za pomocą HTS udało się wygenerować około 4 Mb danych sekwencyjnych z pochodzącej z muzeum, liczącej około 100 lat skóry pręgowca Tamias alpinus i stwierdzić na tej podstawie, że związane ze zmianami klimatycznymi zawężenie występowania tego gatunku w wysokich partiach gór Sierra Nevada w Kalifornii nie obniżyło różnorodności genetycznej.

W przypadku gatunków wymarłych zbiory muzealne są jedynym źródłem informacji. Anmarkrud i Lifjeld (2017) zdołali zsekwencjonować cały genom mitochondrialny każdego z 11 wymarłych gatunków ptaków. Prace genetyczne na istniejących zbiorach nigdy więc nie miały takiego potencjału jak dziś. Zbiory muzealne pomagają też w stawianiu czoła wyzwaniom logistycznym związanym z pracami terenowymi, na przykład Muzeum Historii Naturalnej w Londynie, Amerykańskie Muzeum Historii Naturalnej i Muzeum Historii Naturalnej Instytutu Smithsońskiego łącznie mają ponad 30 tysięcy próbek naczelnych (Burrell i in. 2015). Muzealny materiał biologiczny prezentuje więc ogromny potencjał dla badań genetycznych w obszarze taksonomii (w tym badań nad gatunkami wymarłymi) oraz biologii konserwatorskiej; stanowi również alternatywę dla długoterminowych eksperymentów poświęconych historycznym skutkom takich procesów jak wahania wielkości populacji czy przystosowanie do zmieniających się warunków środowiskowych.

Prędkość przemieszczenia się fragmentów DNA w żelu podczas elektroforezy zależy przede wszystkich od ich rozmiarów – im większy fragment, tym wolniej się porusza. Gdy dojdzie już do uporządkowania fragmentów w żelu, można je wybarwić na przykład bromkiem etydyny, który wiąże się z cząsteczkami DNA; po naświetleniu ultrafioletem cząsteczki te się uwidaczniają. Wielkości prążków DNA można następnie oszacować na podstawie drabinki zawierającej fragmenty DNA o znanym rozmiarze (ryc. 1.16). Żel agarozowy umożliwia sprawdzenie, czy w reakcji PCR udało się dokonać amplifikacji fragmentu DNA oczekiwanej długości, jednak do precyzyjnego określenia rozmiaru prążków trzeba wykorzystać bardziej wyrafinowane urządzenia, na przykład takie, których używa się do poznawania wielkości alleli mikrosatelitowych (rozdział 2). Jeśli powielone produkty będą różnej długości, będziemy w stanie nadać im konkretną tożsamość genetyczną (zob. mikrosatelity, rozdział 2). Jeżeli jednak – a zdarza się tak często – sekwencje o różnym składzie będą tej samej wielkości, do ustalenia genotypów trzeba będzie zastosować sekwencjonowanie produktów uzyskanych w ramach PCR.

Ryc. 1.16. Rozdzielanie fragmentów DNA w żelu agarozowym. Ścieżki 1–6 to drabinki wielkości – zauważmy, że mniejsze fragmenty przemieszczają się w żelu z większą prędkością niż fragmenty większych rozmiarów. W ścieżkach 2 i 5 uzyskano po jednym prążku o długości nieco ponad 400 pz. W próbce ze ścieżki 3 znalazły się dwa prążki o podobnej długości około 200 pz, z kolei w ścieżce czwartej wykryto dwa prążki o długościach około 100 i około 300 pz

Sekwencjonowanie DNA

Pierwszą powszechnie wykorzystywaną metodą sekwencjonowania DNA było tzw. sekwencjonowanie dideoksy czy też sekwencjonowanie Sangera – technika opracowana w połowie lat 70. XX wieku przez Fredericka Sangera (to między innymi dzięki temu dokonaniu naukowiec otrzymał w roku 1980 Nagrodę Nobla). Polega ona na syntezie nici DNA z użyciem polimerazy DNA i pojedynczych nukleotydów, w czym przypomina PCR – między tymi metodami istnieją jednak dwie znaczące różnice. Po pierwsze, syntezę zapoczątkowuje tylko jeden primer, w związku z czym sekwencje są dobudowywane wzdłuż matrycy tylko w jednym kierunku. Po drugie, niektóre nukleotydy zawierają dideoksyrybozę, a nie deoksyrybozę, czyli cukier występujący normalnie w DNA. Cukier ten nie ma grupy 3ʹ-hydroksylowej obecnej w deoksyrybozie, w związku z czym niemożliwe staje się dodanie do tworzonej sekwencji DNA kolejnego nukleotydu; ilekroć zatem w reakcji udział weźmie nukleotyd zawierający dideoksyrybozę, synteza dobiega końca.

Sekwencjonowanie dideoksy przebiega w czterech seriach reakcji; w każdej z nich udział biorą wszystkie cztery nukleotydy w postaci trifosforanu deoksy (dNTP) i niewielka ilość jednego z nukleotydów (G, A, T lub C) w postaci trifosforanu dideoksy (ddNTP). Ostatecznie któryś z ddNTP dołączy się do sekwencji w każdym możliwym miejscu, dzięki czemu powstaną fragmenty o rozmiarach w pełnym zakresie – od 1 pz do maksymalnej długości badanej sekwencji. W każdej z serii reakcji będą powstawać inne rozmiary fragmentów; w sekwencjonowaniu manualnym produkty każdej z tych reakcji ulegną rozmieszczeniu na osobnych, ale sąsiadujących ze sobą pasmach żelu. Fragmenty te można wizualizować na wiele sposobów, w tym za pomocą wybarwiania srebrem czy znaczników radioaktywnych (izotopu siarki lub fosforu), które wykrywa się w procesie autoradiografii na kliszach rentgenowskich. Rozmiary fragmentów w danym paśmie odzwierciedlają miejsca, w których podczas danej reakcji dołączył się ddNTP. Na przykład jeśli w reakcji, w której udział brał dATP w postaci dideoksy, powstaną fragmenty o długości 1 pz, 5 pz i 10 pz, znaczy to, że pierwszą, piątą i dziesiątą zasadą w sekwencji musiała być adenina (A). Fragmenty pochodzące ze wszystkich czterech reakcji można połączyć i odtworzyć sekwencję w całości.

Przez wiele lat manualne sekwencjonowanie dideoksy było standardem, obecnie jednak jest ono w dużej mierze zastępowane sekwencjonowaniem automatycznym. Na rynku dostępnych jest wiele modeli sekwenatorów różnych producentów, ale zasady wciąż są takie same. Różne fragmenty składające się na sekwencje nadal są generowane tak samo, jak opisano powyżej, tyle że obecnie nukleotydy zawierające dideoksyrybozę są znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Ulepszenie to sprawia, że reakcji nie trzeba przeprowadzać już oddzielnie, jak miało to miejsce w przypadku sekwencjonowania manualnego, gdyż różne kolory barwnika odpowiadają odmiennym rodzajom ddNTP, za sprawą których powstały fragmenty różnej długości. Gdy reakcje przeprowadza się w automatycznych sekwenatorach, laser wzbudza barwnik fluorescencyjny każdego prążka (zazwyczaj jest to kolor czarny dla G, zielony dla A, czerwony dla T i niebieski dla C). Kolor jest następnie rozpoznawany przez fotokomórkę, a w pliku komputerowym zostaną zapisane dane dotyczące fragmentów w postaci serii różnokolorowych szczytów. Ponieważ szczytowi danego koloru odpowiada jedna z zasad, całą sekwencję można odczytać z pojedynczego obrazu (ryc. 1.17).

Ryc. 1.17. (a) Obraz żelu uzyskany w procesie sekwencjonowania dideoksy: produkty reakcji umieszczono w ścieżkach oznaczonych „G”, „A”, „T” i „C”, w zależności od tego, który z nukleotydów przyjął formę dideoksy; ponieważ fragmenty najmniejsze migrują najszybciej, podążając z dołu w górę, jesteśmy w stanie odtworzyć przyrastanie sekwencji, tak jak to pokazano po prawej stronie ilustracji; (b) przykładowy elektroferogram sekwencji stanowiący efekt końcowy sekwencjonowania automatycznego: szczyty reprezentujące „T” są czerwone, „C” – niebieskie, „G” – czarne, „A” – zielone; w przykładzie wykorzystano region rps16-trnQ genomu cpDNA osoki aloesowatej (Stratiotes aloides); sekwencję odczytuje się w porządku jej generowania, w tym przypadku odczytalibyśmy ją więc następująco: TTTCGTTCTGAA itd. (linijka tekstu w górnej części ilustracji odpowiada kolorowym szczytom poniżej)

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe

Jak wspominaliśmy, jednym z głównych motorów rozwoju ekologii molekularnej jest obecnie coraz większa dostępność sekwencjonowania wysokoprzepustowego (HTS), nazywanego alternatywnie sekwencjonowaniem nowej generacji lub masowym sekwencjonowaniem równoległym. Technologia ta ujrzała światło dzienne mniej więcej w roku 2005, ale do niedawna dysponowały nią wyłącznie wyspecjalizowane laboratoria z pokaźnymi budżetami; w ciągu kilku ostatnich lat, z uwagi na jej szybki rozwój i opłacalność, stała się jednak dostępna szerokiej społeczności badaczy. Mówiąc najogólniej, metoda HTS polega na jednoczesnym sekwencjonowaniu milionów cząsteczek DNA, dzięki czemu możliwe jest generowanie większej ilości danych sekwencyjnych, niż było to możliwe wcześniej, a nawet niż można to sobie było wyobrazić. HTS to w rzeczywistości termin parasolowy, obejmujący wiele technologii, które jednak łączą dwa główne etapy: po fragmentacji biblioteki/przygotowaniu biblioteki amplikonów następuje wykrycie włączonych nukleotydów (Glenn 2011). Technologie NGS może podzielić na dwie główne kategorie:

– technologie oparte na PCR (czasami nazywane technologiami drugiej generacji) oraz

– technologie sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki, w ramach którego przed sekwencjonowaniem nie dochodzi do amplifikacji PCR (czasem nazywane technologiami trzeciej generacji).

Szczegółowe objaśnienie tych technologii wykracza poza ramy objętościowe niniejszego podręcznika, aczkolwiek można się z nimi zapoznać dzięki wielu artykułom przeglądowym (na przykład Bleidorn 2016; Glenn 2011; Heather, Chain 2016; Pareek i in. 2011; Reuter i in. 2015).

Między omawianymi technologiami utworzyła się pewna równowaga pod kątem odchylenia (pojawiającego się podczas amplifikacji fragmentów w sekwencjonowaniu drugiej generacji), kosztochłonności i pokrycia (na przykład długością generowanych sekwencji, nazywanych odczytami). Ogólnie rzecz biorąc, sekwenatory drugiej generacji generują bardzo dużo krótkich odczytów, podczas gdy technologia sekwencjonowania trzeciej generacji jest szybsza i generuje dłuższe odczyty, w związku z czym łatwiej je zebrać w całość (Bleidorn 2016; Miyamoto i in. 2014). Trzeba jednak zauważyć, że w porównaniu z sekwencjonowaniem drugiej generacji wyższy jest odsetek błędów, a liczba wyników (rozumiana jako liczba odczytów) niższa; stąd to technologie drugiej generacji, szczególnie zaś platformy produkowane przez firmę Illumina, jeszcze przez wiele lat będą używane przez największe grono badaczy (Bleidorn 2016). Bądź co bądź warto zauważyć, że technologie będące awangardą sekwencjonowania drugiej generacji odchodzą już do lamusa, na przykład niezwykle popularna technologia pirosekwencjonowania 454 nie jest już wspierana przez Roche, firmę zajmującą się jej dystrybucją. Najczęstszym zastosowaniem HTS w badaniach ekologicznych są metody, za sprawą których można wygenerować duże ilości danych sekwencyjnych z pewnej części genomu. Metody te to tak zwane genotypowanie przez sekwencjonowanie (GBS) i sekwencjonowanie RAD – omówimy je w rozdziale 2. Na kartach podręcznika czytelnik znajdzie kolejne przykłady badań, w których wykorzystano HTS.

Bez względu na wybraną technologię HTS można wykorzystywać także do badania ekspresji genu, na przykład do rozstrzygania, które geny ulegają ekspresji w danych warunkach środowiskowych. Jak informowaliśmy w podrozdziale poświęconym qPCR, do określania ekspresji genu można używać cDNA powstającego z matrycy RNA. Cząsteczki mRNA wykryte u osobnika odzwierciedlają pełen zasób produktów ekspresji genu, znany także jako transkryptom, dzięki czemu staje się możliwe zrozumienie genów funkcjonalnych. Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe transkryptomu (transkryptomika to nauka zajmująca się transkryptomami i ich funkcjami) pozwala badaczom przeanalizować wiele genów lub wszystkie, które uległy ekspresji, a w konsekwencji sprawdzić, które z nich – a także które z wariantów danego genu – ulegają ekspresji w określonych tkankach, w różnych fazach rozwoju osobniczego, w odmiennych środowiskach itd. Transkryptom jest oczywiście o wiele mniejszy od całego genomu, ponieważ odzwierciedla jedynie geny, które uległy ekspresji, stąd o wiele łatwiej jest poddać HTS właśnie ten produkt, niż rekonstruować cały genom. Przed pojawieniem się transkryptomiki opartej na HTS naukowcy chcący wykryć geny potencjalnie znaczące musieli szukać igły w stogu siana, na przykład wtedy, gdy mieli zamiar określić genotyp warunkujący konkretny fenotyp; obecnie jednak można już porównywać dużą liczbę genów ulegających ekspresji u różnych osobników i w różnych fazach rozwoju. Jones i in. (2015) wykorzystali metodę HTS do porównania transkryptomów inwazyjnego szkodnika – słonecznicy orężówki (Helicoverpa armigera), przy różnej intensywności lotów tego owada. Udało im się zidentyfikować zestaw genów powiązanych z fizjologicznym przystosowaniem do lotów na dużych odległościach, w tym genów warunkujących wykorzystanie tłuszczów jako paliwa do lotu, genów odpowiadających za rozwinięcie się mięśni odpowiedzialnych za zdolność latania oraz genów regulujących hormony biorące udział w fizjologii przemieszczania się.

Eksperyment dotyczący słonecznicy orężówki polegał na porównaniu różnic ujawniających się w zależności od intensywności lotów. Inne podejście polega na pozyskiwaniu danych transkryptomowych z organizmów bytujących w naturalnych warunkach – jeśli uwzględnia się w jego ramach także dane ekologiczne i meteorologiczne, można by je nazwać podejściem ekologii transkryptomu (Richards i in. 2009). Kobayashi i in. (2013) zastosowali tę metodę do zbadania zjawiska „powszechnego kwitnienia”, kiedy wiele – czasem setki – gatunków roślin w Azji Południowo-Wschodniej kwitnie jednocześnie po bardzo różnych przerwach w kwitnieniu, od mniej niż roku do nawet kilku lat (Kobayashi i in. 2013, Sakai i in. 2006). Kobayashi i in. (2013), dokonując sekwencjonowania wysokoprzepustowego transkryptomów, sprawdzili hipotezę głoszącą, że za to niecodziennie zjawisko odpowiada susza. W tym celu zebrali pąki z pojedynczego okazu drzewa Shorea beccariana (Dipterocarpaceae) w różnych odstępach czasu, w tym w fazie przed kwitnieniem i w fazie kwitnienia, po czym porównali transkryptomy. Aby ocenić stopień suszy, który w przeszłości wywoływał zjawisko powszechnego kwitnienia, wykorzystali ponadto długoterminowe dane meteorologiczne. Wyniki ich badań wykazały wyraźne zmiany transkrypcyjne przed kwitnieniem w genie SbFT, a także w genie SbSVP. Co więcej, ujawniły się też zmiany w transkrypcji genów, które ulegają ekspresji w okresie suszy i w reakcji na sacharozę. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że czynnikiem wyzwalającym powszechnie kwitnienie jest właśnie susza, a ponadto dostarczają wskazówek, jak sztucznie można w szybkim tempie wywołać kwitnienie.

Podsumowanie

W niniejszym rozdziale ukazaliśmy znaczenie danych molekularnych w polu badań ekologicznych. Zapoznaliśmy się także z różnymi rodzajami genomów oraz przeanalizowaliśmy przyczyny zarówno wewnątrz-, jak i międzygatunkowej zmienności DNA. Znajomość technik, takich jak PCR, qPCR i sekwencjonowanie (w tym sekwencjonowanie wysokoprzepustowe genomów i transkryptomów), pozwala wykorzystać informacje zawarte w genomach; to na tej wiedzy będziemy się opierać w kolejnym rozdziale, poświęconym między innymi właściwościom poszczególnych genomów i markerom genetycznym wykorzystywanym w ekologii molekularnej.

Streszczenie rozdziału

• Przed wyłonieniem się ekologii molekularnej bardzo trudno było pozyskiwać dane genetyczne z populacji dzikich, a biolodzy zazwyczaj musieli się ograniczać do widocznych polimorfizmów. Choć dane fenotypowe są przydatne w wielu dziedzinach, zjawisko plastyczności fenotypowej sprawia, że relacje między fenotypami a genotypami pozostają niejasne.

• Pierwsze badania, w których doszło do spotkania genetyki molekularnej i ekologii, opierały się na danych allozymowych. Jako że białka kodowane są przez geny, do pewnego stopnia odzwierciedlają one zmienność występującą w sekwencjach DNA. Obecnie jednak, z uwagi na ich adekwatność do zaledwie ułamka genomu oraz trudności logistyczne, allozymy, będące swego czasu wielkim przełomem, zostały prawie w całości zastąpione markerami DNA.

• W genomie występuje wiele rodzajów regionów genu, zarówno regiony kodujące (powtórzone i jednokopiowe), jak i niekodujące (w tym introny i pseudogeny).

• Różnorodność genetyczna wytwarza się nieustannie w toku rekombinacji i mutacji, w tym błędnego parowania nici opóźnionej, insercji i delecji nukleotydów, a także ich substytucji.

• Obecnie laboratoria systematycznie wykorzystują metodę PCR do selektywnej amplifikacji wybranych regionów DNA; technika ta pozwala naukowcom na dokonanie genetycznego opisu osobników przez wygenerowanie wystarczającej liczby kopii danego odcinka DNA, by móc na nich pracować i je scharakteryzować.

• Ponieważ PCR wymaga bardzo niewielkich ilości materiału początkowego, izolowanie DNA może przebiegać nieinwazyjnie i nie prowadzi już do śmierci badanych organizmów. Na potrzeby amplifikacji PCR materiał DNA izoluje się z kału, sierści, owłosienia, liści, łusek ryb, śluzu, okazów muzealnych itp.; pozwala to na humanitarne pobieranie próbek z organizmów żyjących na wolności.

• Metoda qPCR – w przeciwieństwie do techniki PCR – pozwala naukowcom oszacować liczbę kopii DNA w każdej próbie.

• Elektroforeza żelowa umożliwia rozdzielenie i identyfikację fragmentów amplifikowanych metodą PCR na podstawie ich rozmiarów.

• W wyniku sekwencjonowania DNA powstają precyzyjne sekwencje powielonych produktów DNA. Nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie HTS, zwiększają dostępność danych sekwencyjnych i wywierają wielki wpływ na wszystkie aspekty genetyki; na przykład współcześnie często się zdarza, że w badaniach z zakresu ekologii molekularnej wykorzystuje się dane z tysięcy loci lub nawet całych genomów lub transkryptomów.