Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Vodickap/Dreamstime

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta Ewa Charitonow

Koordynator produkcji Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN

Woblink/Aneta Pudzisz

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

ISBN 978-83-01-20876-9

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2019 r., (Wydanie I)

Warszawa 2019

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Spis treści

Przedmowa

1. Wprowadzenie

1.1. Historia chromatografii cieczowej

1.2. Znaczenie chromatografii cieczowej

1.3. Istota rozdzielania chromatograficznego

1.4. Klasyfikacja układów chromatografii cieczowej

1.5. Podstawowe wielkości retencyjne i termodynamiczne

2. Chromatografia cieczowa kolumnowa

2.1. Aparatura do chromatografii cieczowej kolumnowej

2.2. Pompy chromatograficzne

2.2.1. Rodzaje i charakterystyka pomp chromatograficznych

2.2.2. Problemy związane z pracą pomp

2.3. Dozowniki próbek

2.3.1. Dozowanie ręczne

2.3.2. Dozowanie automatyczne

2.4. Fazy ruchome

2.4.1. Właściwości faz ruchomych

2.4.2. Faza ruchoma a matryca próbki

2.4.3. Eluenty izoeluotropowe

2.4.4. Dobór składu fazy ruchomej

2.4.5. Problemy związane z fazą ruchomą

2.4.6. Oszczędzanie faz ruchomych

2.5. Kolumny i fazy stacjonarne

2.5.1. Kolumny tradycyjne

2.5.2. Kolumny monolityczne

2.5.3. Kolumny matrycowe

2.5.4. Fazy stacjonarne

2.5.5. Wskazówki dotyczące eksploatacji kolumn

2.6. Sposoby prowadzenia procesu chromatograficznego w kolumnowej chromatografii cieczowej

2.6.1. Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz

2.6.2. Mechanizm retencji w normalnym układzie faz

2.6.3. Mechanizm retencji w odwróconym układzie faz

2.6.4. Elucja izokratyczna i elucja gradientowa

2.7. Rozdzielczość kolumn chromatograficznych

2.7.1. Parametry wpływające na proces rozdzielania

2.7.2. Pojęcie półki teoretycznej

2.7.3. Rozdzielczość kolumny w funkcji parametrów charakteryzujących selektywność i sprawność rozdzielania

2.7.4. Wpływ temperatury na rozdzielanie chromatografowanych substancji

2.8. Techniki kolumnowej chromatografii cieczowej

2.8.1. Chromatografia jonowa

2.8.2. Chromatografia wykluczania

2.8.3. Chromatografia powinowactwa

2.8.4. Chromatografia micelarna i mikroemulsyjna

2.8.5. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych

2.8.6. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych

2.8.7. Chromatografia par jonowych

2.8.8. Chromatografia przeciwprądowa

2.9. Detektory

2.9.1. Klasyfikacja detektorów

2.9.2. Ogólna charakterystyka detektorów

2.9.3. Charakterystyka detektorów używanych w kolumnowej chromatografii cieczowej

2.9.4. Detektor fotometryczny absorpcji w świetle widzialnym i nadfiolecie (UV-VIS)

2.9.5. Detektor fluorescencyjny

2.9.6. Detektor refraktometryczny

2.9.7. Detektory elektrochemiczne

2.9.8. Detektor konduktometryczny

2.9.9. Detektor aerozolowy promieniowania rozproszonego

2.9.10. Spektrometr mas

2.9.11. Spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowego

2.9.12. Inne detektory

2.9.13. Problemy związane z detektorami

2.10. Analiza jakościowa

2.11. Analiza ilościowa

2.11.1. Metoda kalibracji bezwzględnej (wzorca zewnętrznego)

2.11.2. Metoda normalizacji wewnętrznej

2.11.3. Metoda wzorca wewnętrznego

2.11.4. Metoda dodatku substancji oznaczanej

2.11.5. Problemy w analizie ilościowej

2.11.6. Proteomika ilościowa

2.12. Szybka chromatografia cieczowa kolumnowa

2.13. Techniki wielowymiarowe w chromatografii cieczowej kolumnowej

2.13.1. Chromatografia dwuwymiarowa

2.13.2. Tandemowa chromatografia cieczowa kolumnowa

2.14. Chromatografia cieczowa kolumnowa łączona z innymi technikami analitycznymi

2.14.1. Połączenie chromatografu cieczowego ze spektrometrią mas wysokiej rozdzielczości

2.14.2. Chromatografia cieczowa łączona z magnetycznym rezonansem jądrowym

2.15. Szczególne zastosowania kolumnowej chromatografii cieczowej

2.15.1. Biochromatografia

2.15.2. Chromatografia związków chiralnych

2.15.3. Szybka chromatografia preparatywna

3. Chromatografia cienkowarstwowa

3.1. Wprowadzenie

3.1.1. Historia TLC – ważniejsze etapy rozwoju

3.2. Analiza za pomocą chromatografii planarnej

3.3. Płytki do chromatografii cienkowarstwowej

3.3.1. Samodzielna preparatyka płytek chromatograficznych

3.4. Fazy stacjonarne do chromatografii cienkowarstwowej

3.5. Eluenty (fazy ruchome)

3.6. Nanoszenie próbek na płytki chromatograficzne

3.7. Sposoby rozwijania chromatogramów

3.7.1. Rozwijanie liniowe

3.7.2. Rozwijanie odśrodkowe (cyrkularne)

3.7.3. Rozwijanie dośrodkowe (antycyrkulacyjne)

3.7.4. Mechanizm rozwijania chromatogramów

3.7.5. Rozwijanie jednokrotne i wielokrotne

3.8. Komory do chromatografii cienkowarstwowej

3.9. Chromatografia cienkowarstwowa z wymuszonym przepływem fazy ruchomej

3.9.1. Rotacyjna chromatografia planarna

3.9.2. Ciśnieniowa chromatografia cienkowarstwowa

3.9.3. Elektrochromatografia planarna

3.10. Detekcja i dokumentacja chromatogramów

3.10.1. Fizyczne metody detekcji

3.10.2. Chemiczne metody detekcji

3.10.3. Biologiczne metody detekcji

3.11. Sprzężenie TLC ze spektralnymi metodami detekcji

3.11.1. Sprzężenie TLC z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym i/lub detektorem płomieniowo-fotometrycznym (TLC-FID/TLC-(FID-FPD))

3.11.2. Sprzężenie TLC z MS

3.12. Chromatogramy planarne

3.12.1. Analiza jakościowa

3.12.2. Analiza ilościowa

3.13. Normalizacja w TLC

4. Przygotowanie próbek do analizy

4.1. Znaczenie i zasady przygotowania próbek do analizy

4.2. Przygotowanie próbek ciekłych

4.2.1. Ekstrakcja ciecz–ciecz

4.2.2. Ekstrakcja do ciała stałego

4.2.3. Mikroekstrakcja do fazy upakowanej

4.2.4. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej

4.2.5. Mikroekstracja do kropli rozpuszczalnika

4.2.6. Ekstrakcja ruchomym elementem sorpcyjnym

4.2.7. Destylacja

4.3. Przygotowanie próbek stałych

4.3.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikami

4.3.2. Ekstrakcja rozpuszczalnikami pod zwiększonym ciśnieniem

4.3.3. Ekstrakcja nadkrytyczna

4.3.4. QuEChERS

4.4. Derywatyzacja

4.5. Przygotowanie próbek biologicznych do analizy

4.5.1. Przygotowanie próbek do analizy kwasów nukleinowych w genomice

4.5.2. Przygotowanie próbek do analizy białek w proteomice

4.5.3. Przygotowanie próbek do analizy leków i ich metabolitów oraz biomarkerów w organizmach żywych

Przypisy

Nauka wciąż się rozwija i wiemy coraz więcej. Rozwija się także chromatografia – jako ważna metoda chemii analitycznej – odkryta w 1903 roku w Warszawie przez botanika Michaiła Cwieta. Powszechne stosowanie technik chromatograficznych w analizie chemicznej wynika z tego, że rozdzielanie za ich pomocą umożliwia jednoczesną identyfikację składników wielu złożonych mieszanin i określenie ich zawartości na bardzo niskich poziomach stężeń. Właściwe wykorzystanie poszczególnych rodzajów chromatografii, a zwłaszcza chromatografii cieczowej i gazowej, zależy od zrozumienia teorii rozdzielania i praktycznego zastosowania coraz bardziej nowoczesnej aparatury.

To, co wymyślą i poznają naukowcy, i to, co skonstruują i wprowadzą do laboratoriów praktycy, powinni znać wszyscy zainteresowani tematem – zarówno uczący się chromatografii, uczący jej innych, jak i pracujący w laboratoriach analitycznych. Niestety, coraz mniej jest wśród nich korzystających z publikacji w tradycyjnej postaci. Zaczynają dominować źródła elektroniczne, nierzadko pobierane z sieci nielegalnie.

Wciąż jednak istnieje grupa, która z papierowych książek korzysta, i to dla niej Wydawnictwu opłaca się publikować. Zapewne dlatego zwróciło się ono do nas z propozycją napisania pozycji o chromatografii cieczowej. Może wpłynęła na to dobra opinia o naszych wcześniejszych książkach poświęconych chromatografii?

Po namyśle podjęliśmy wyzwanie. Decyzja nie przyszła nam łatwo, bo dziś pisanie książek nie daje autorom ż a d n y c h korzyści – ani finansowych, ani naukowych. Książki nie zapewniają punktów MNiSW, nie mają współczynnika oddziaływania. Dlaczego zatem podręczniki powstają? W naszym przypadku dlatego, że pragniemy podzielić się wiedzą z tymi, którzy powinni ją mieć i chcą z niej korzystać. I dlatego, że miło jest słyszeć od młodych ludzi, że sięgają po nasze książki, że dobrze im się je – ze zrozumieniem – czyta i że sporo się z nich uczą.

Chromatografia cieczowa – z różnorodnością jej odmian – jest ważna i nieodzowna w każdym laboratorium analitycznym. Dzięki niej można wykonywać jakościowe i ilościowe oznaczanie około 80% istniejących związków chemicznych – z dużą wiarygodnością i w krótkim czasie. Możliwości są coraz większe, bo sprzyja temu wprowadzanie, między innymi, coraz to lepszych kolumn chromatograficznych oraz łączenie chromatografii cieczowej z innymi metodami analitycznymi. Potencjał takich układów zwiększa obszar ich zastosowań. Dobrym przykładem jest połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas, do zastosowań w badaniach bioanalitycznych, określanych jako „omiczne”.

Celem naszym było napisanie podręcznika przedstawiającego w możliwie przystępnej postaci podstawy teoretyczne procesów zachodzących w chromatografii cieczowej kolumnowej i cienkowarstwowej, różnorodne techniki i sposoby wykorzystania obu metod, oraz jakościową i ilościową interpretację uzyskanych chromatogramów. Jeden z rozdziałów został poświęcony przygotowaniu próbek do analizy, co ma decydujący wpływ na jakość uzyskiwanych wyników.

Dołożyliśmy starań, aby ta książka była zrozumiała. Zamieściliśmy w niej, oprócz klasycznej wiedzy chromatograficznej, wiedzę najnowszą, aktualną. Ufamy, że będzie to z pożytkiem zarówno dla tych, którzy znają już temat, jak i dla całkiem nowych czytelników, a podręcznik zasłuży na dobrą ocenę.

1.1.
Historia chromatografii cieczowej

Odkrywcą chromatografii jest Michaił Semenowicz Cwiet, który dokonał swojego odkrycia na Uniwersytecie Warszawskim, na początku XX wieku. Cwiet był botanikiem zajmującym się badaniem składników roślin. 21 marca 1903 roku, prawdopodobnie o godzinie 12 w południe, podczas zebrania Warszawskiego Towarzystwa Biologicznego, przedstawił referat zatytułowany O nowej kategorii zjawisk adsorpcji i ich zastosowaniu w analizie biochemicznej. W istocie referat ów dotyczył rozdzielania składników chlorofilu za pomocą chromatografii cieczowej.

Słowo „chromatografia” powstało ze złożenia dwóch słów greckich: grafein – pisanie i chroma – kolor. Nomen omen, gdyż słowo cwiet to w języku rosyjskim także kolor. Współczesna chromatografia ma jednak mało wspólnego z zapisywaniem kolorów, występującym niemal wyłącznie w chromatografii planarnej.

Michaił Cwiet urodził się w 1872 roku, w Asti we Włoszech. Jego matka była Włoszką, ojciec Ukraińcem z Czernihowa, stolicy jednej z rosyjskich guberni. Cwiet uczył się w Szwajcarii. W 1896 roku otrzymał na Uniwersytecie Genewskim stopień doktora botaniki. Jednak po przyjeździe do Rosji, najpierw na Krym, a potem do Petersburga, wskutek problemów z uznaniem zagranicznych dyplomów, pomimo trudności w posługiwaniu się językiem rosyjskim, w 1901 roku obronił pracę dyplomową na uniwersytecie w Kazaniu. W tym samym roku rozpoczął pracę w Zakładzie Anatomii i Fizjologii Roślin na Uniwersytecie Warszawskim, a od 1908 roku pracował na Politechnice Warszawskiej.

RYC. 1.1. Michaił Semenowicz Cwiet (1872–1919)

W 1907 roku ożenił się z dawną nauczycielką siedleckiego liceum, pracownicą biblioteki UW. Opuścił Warszawę w 1915 roku, po ewakuacji Politechniki Warszawskiej do Estonii. Otrzymał tam nominację na stanowisko profesora, a następnie wyjechał do Niżnego Nowogrodu i Woroneża, gdzie zmarł 26 czerwca 1919 roku. Miejsce jego spoczynku nie jest znane.

W 1910 roku, w Warszawie, Cwiet uzyskał ponownie stopień doktora na podstawie rozprawy Chlorofile w świecie roślinnym i zwierzęcym, wyróżnionej nagrodą im. Achmatowa w wysokości 1000 rubli. W trakcie kariery naukowej opublikował 13 prac w języku francuskim, 15 w rosyjskim i 28 w niemieckim. Te najważniejsze dotyczyły rozdzielania odmian chlorofilu. Spotkały się z niedowierzaniem i twierdzeniem, że chlorofil nie istnieje w dwóch odmianach, ale rozkłada się w kolumnie chromatograficznej. Pogląd taki głosił Willstäter. Oczywiście nie miał racji, ale jego krytyka była jedną z przyczyn tego, że po śmierci Cwieta jego prace nie zostały docenione i pozostawały zapomniane przez około 25 lat.

Cwiet wynalazł chromatografię, badając ekstrakty roślin w eterze naftowym. Ekstrakty te wprowadzał do szklanej rurki (kolumny) wypełnionej węglanem wapnia. Po zaadsorbowaniu składników ekstraktu wymywał je benzenem. W trakcie wymywania pojawiały się barwne krążki odpowiadające składnikom ekstraktu.

RYC. 1.2. Schematy urządzeń stosowanych przez Cwieta i widok rozdzielonych składników ekstraktu roślinnego: a) zestaw do chromatografii Cwieta – do małych próbek; b) zestaw do chromatografii – do większych próbek; c) uzyskane rozdzielenie barwników z roślin, eluent – rozpuszczalnik, faza stacjonarna – węglan wapnia

Według profesora Sakodynskiego do odkrycia chromatografii przyczynił się przypadek – Cwietowi do ekstraktu roślinnego wpadł kawałek kredy szkolnej, na której pojawiło się zabarwienie inne, niż miał ekstrakt. W wyniku tego spostrzeżenia do dalszych badań uczony zastosował rurkę (kolumnę) napełnioną sproszkowaną kredą. Na rycinie 1.2 przedstawiono pojedynczą kolumnę stosowaną przez Cwieta i zbudowany przez niego wielokolumnowy zestaw chromatograficzny.

21 marca 2003 roku przedstawiciele Komisji Analizy Chromatograficznej Komitetu Chemii Analitycznej PAN odsłonili na ścianie budynku, w którym pracował Cwiet, tablicę przedstawioną na rycinie 1.3. Budynek ten znajduje się na terenie UW na Krakowskim Przedmieściu.

RYC. 1.3. Tablica na gmachu UW upamiętniająca miejsce odkrycia chromatografii

Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne, uznając doniosłość odkrycia, podarowało uniwersytetowi tablicę przedstawiającą pierwszą stronę publikacji Cwieta dotyczącą chromatografii. Znajduje się ona na Wydziale Chemicznym UW (ryc. 1.4).

Prace Cwieta dotyczyły chromatografii, którą obecnie nazywa się chromatografią cieczową, izokratyczną, w normalnym układzie faz. Powrócono do nich w latach 30. XX wieku, wprowadzając rozdzielanie techniką, która już wtedy miała pewne cechy chromatografii gradientowej w odwróconym układzie faz. Coraz lepsze rozumienie zjawisk powodujących rozdzielenie chromatograficzne doprowadziło w latach 40. XX wieku do teorii, a w latach 50. do praktyki chromatografii gazowej.

W latach 30. XX wieku w Rosji powstała technika chromatografii cieczowej, w której składniki mieszaniny rozdzielano nie w kolumnie chromatograficznej, ale na cienkiej warstwie fazy stacjonarnej. Dokonały tego Izmaiłowa i Schreiber. Duże zasługi w rozwoju tej techniki miał Stahl, który opracował dobre sorbenty do chromatografii cienkowarstwowej na bazie żelu krzemionkowego.

Pierwsze przyrządy do chromatografii cieczowej kolumnowej pojawiły się w latach 60. XX wieku, a realizowana w nich chromatografia przy użyciu długich kolumn z dużymi cząstkami fazy stacjonarnej była określana jako High Pressure Liquid Chromatography (wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa). Wprowadzenie kolumn z wypełnieniami o małych cząstkach, które umożliwiały dobre rozdzielenie składników mieszanin na krótkich dystansach, zaowocowało techniką High Performance Liquid Chromatography (wysokosprawna chromatografia cieczowa) Obie nazwy zostały opisane akronimem HPLC. Ten sam akronim współcześnie można rozwinąć żartobliwie jako High Price Liquid Chromatography.

RYC. 1.4. Tablica upamiętniająca odkrycie chromatografii na Uniwersytecie Warszawskim

Doskonalenie HPLC w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat jest związane głównie z doskonaleniem wypełnień kolumn chromatograficznych. Dużymi krokami na drodze rozwoju metody było wprowadzenie faz związanych z żelem krzemionkowym, systematyczne zmniejszanie rozmiarów cząstek wypełnienia (od 10 do ok. 1,5 µm), związane z tym skracanie długości kolumn do kilkudziesięciu milimetrów i wreszcie wprowadzenie kolumn matrycowych (ang. Micro Pillar Array Columns, µPAC). Nie uwzględniając wag analitycznych i pehametrów, chromatografy są obecnie najczęściej występującymi przyrządami w laboratoriach na świecie. Zakres zastosowań HPLC jest bardzo szeroki. Trudno sobie wyobrazić dziedzinę badań związaną z analizą chemiczną, w której chromatografia cieczowa nie miałaby zastosowania. Szacuje się, że za jej pomocą można analizować około 80% związków chemicznych spośród znanych ponad 150 milionów.

Kamienie milowe w rozwoju HPLC

1903 odkrycie chromatografii (cieczowej) przez M.S. Cwieta

1938 odkrycie chromatografii na płaszczyźnie przez Izmaiłową i Schreiber

1940 opracowanie teorii chromatografii podziałowej przez Martina i Synge’a

1958 otrzymanie żelu krzemionkowego do chromatografii cienkowarstwowej

1969 wprowadzenie komercyjnego chromatografu cieczowego firmy Waters

lata 70. XX w. wprowadzenie chromatografii w odwróconym układzie faz

1971 wprowadzenie komercyjnego chromatografu jonowymiennego firmy Dionex,

wprowadzenie komercyjnego detektora ze zmienną długością fali

1972 wprowadzenie kolumn z fazami związanymi

1973 wprowadzenie kolumn do chromatografii wykluczania firmy Tosoh Corporation

1978 wprowadzenie szybkiej chromatografii preparatywnej

1979 wprowadzenie detektora z matrycą diodową firmy Agilent Technologies

1982 wprowadzenie detektora elektrochemicznego firmy ESA Biosciences

lata 90. XX w. wprowadzenie komputera jako integralnej części chromatografu,

wprowadzenie kolumn monolitycznych,

połączenie chromatografu ze spektrometrem mas

2002 wprowadzenie ultrawysokociśnieniowego chromatografu cieczowego (ang. Ultra-High Pressure Liquid Chromatography, UHPLC) firmy Jasco

2004 wprowadzenie ultrawysokosprawnego chromatografu cieczowego (ang. Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) firmy Waters,

zastosowanie kulistych cząstek wypełnienia kolumn o średnicy 1,7 µm

2005 wprowadzenie aerozolowego detektora cząstek naładowanych (Corona Charged Aerosol Detector, CAD) firmy ESA Biosciencies

2009 zastosowanie do wypełnienia kolumn cząstek powierzchniowo-porowatych firmy Kinetex

2018 wprowadzenie kolumn matrycowych firmy PharmaFluidics

Udział w rozwoju chromatografii miało wielu uczonych. Za prace dotyczące badania chromatografii jako metody analitycznej i za badania, w których ją stosowano, przyznawane były Nagrody Nobla. W 1937 roku nagrodę otrzymał P. Karrer – za badania karotenoidów, w 1938 roku R. Kuhn – za badania karotenoidów i witamin, w 1939 roku L. Ružička – za badanie polietylenu i terpenów, i A.F.J. Butenandt – za badanie hormonów płciowych. W 1948 roku, za prace dotyczące elektroforezy i chromatografii adsorpcyjnej, nagrodzono nią A. Tiseliusa, zaś w 1952 roku A.J.P. Martina i R.L.M. Synge’a – za prace dotyczące chromatografii podziałowej. W kolejnych latach nagroda trafiała wielokrotnie do uczonych wykorzystujących chromatografię jako metodę analityczną, co świadczy o jej wysokiej randze.

Podczas II wojny światowej, w ramach prac związanych z konstrukcją bomby atomowej, rozważano możliwość zastosowania chromatografii do rozdzielania izotopów uranu. Po wojnie natomiast nastąpił burzliwy rozwój chromatografii, także w Polsce. Duży udział mieli w tym profesorowie Andrzej Waksmundzki i Jan Głogoczowski. Zorganizowany przez profesora Waksmundzkiego w Lublinie silny ośrodek badawczy chromatografii został nazwany Lubelską Szkołą Chromatografii.

RYC. 1.5. Profesor Andrzej Waksmundzki

RYC. 1.6. Profesor Edward Soczewiński

RYC. 1.7. Profesor Jerzy Kowalczyk

Szczególne zasługi w rozwoju chromatografii cieczowej, kolumnowej i cienkowarstwowej ma – w skali światowej – profesor Edward Soczewiński. Duże znaczenie teoretyczne i praktyczne mają jego prace dotyczące zależności między składem mieszanej ciekłej fazy ruchomej a retencją chromatografowanych substancji. Zależności te w literaturze światowej są znane jako równania Soczewińskiego-Wachtmeistera i Snydera-Soczewińskiego. Opisują podstawowe zależności mechanizmu rozdzielania chromatograficznego. Służą do optymalizacji warunków rozdzielania składników mieszanin przy użyciu różnych technik chromatograficznych, adsorpcyjnych i podziałowych.

W 2007 roku została wydana książka A. Wróbla i J. Chomickiej Mały, wielki człowiek, czyli życie i pasje profesora Edwarda Soczewińskiego.

Istotny wkład w konstrukcję chromatografów cieczowych wniósł profesor Jerzy Kowalczyk, pracujący na Politechnice Gdańskiej. Skonstruował w latach 70. XX wieku pierwszy w Polsce – i jeden z pierwszych na świecie – wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy.

1.2.
Znaczenie chromatografii cieczowej

Chromatografia jako metoda analityczna ma największe znaczenie w analizie substancji organicznych, ale odgrywa też pewną rolę w analizie związków nieorganicznych. Dominujący udział ma chromatografia cieczowa. Za jej pomocą można zanalizować około 4/5 związków chemicznych zarejestrowanych w bazie Chemical Abstracts Service.

Związki chemiczne występują w mieszaninach z innymi substancjami w wielu materiałach. Materiały te muszą być analizowane w różnych gałęziach przemysłu, w żywności i w różnych elementach środowiska. W ostatnich latach chromatografia jest coraz częściej stosowana w naukach bezpośrednio związanych z życiem człowieka, na świecie znanych jako Life Sciences. W czasopismach analitycznych (nie tylko chromatograficznych) większość publikacji dotyczy analizy substancji biologicznie aktywnych, badanych w ramach biotechnologii, biochemii, farmacji i medycyny. Istnieje nawet pojęcie biochromatografii, które obejmuje kilka technik chromatograficznych o szczególnych możliwościach w zakresie analizy substancji biologicznie aktywnych. Są to: chromatografia powinowactwa, chromatografia wykluczania i chromatografia jonowa, chromatografia oddziaływań hydrofobowych i chromatografia oddziaływań hydrofilowych.

Znaczenie chromatografii w życiu człowieka uwidacznia się, między innymi, w wykorzystywaniu jej w normach światowych, europejskich i polskich. Na przykład w zbiorze Polskich Norm znajduje się aktualnie około 430 związanych z analizą chromatograficzną, mających zastosowanie do analizy różnych materiałów.

Szczególnie dobre właściwości mają przyrządy hybrydowe, stanowiące połączenie chromatografów ze spektrometrami mas (LC-MS). Coraz częściej są to chromatografy, z którymi łączy się dwa spektrometry mas (LC-MS/MS). Urządzenia takie, stanowiące połączenie efektywnej techniki rozdzielania (HPLC) z czułą detekcją mas (MS), stają się najbardziej optymalnym narzędziem do kompleksowych badań proteomicznych, metabolomicznych i lipidomicznych (ogólnie: „omicznych”). Obecne w próbce składniki ulegają najpierw rozdzieleniu, co zmniejsza złożoność powstającego następnie widma masowego. W wyniku tego możliwa jest identyfikacja wielu składników próbki w trakcie pojedynczej analizy. W przypadku analizy substancji biologicznie aktywnych uzyskane informacje mogą być wykorzystane do diagnozowania i monitorowania wielu chorób. Istnieją także przyrządy stanowiące połączenie chromatografu ze spektrometrem ruchliwości jonów i spektrometrem mas – szczególnie przydatne do wykonywania bardzo skomplikowanych bioanaliz.

Pojawiają się prace dotyczące zastosowania chromatografii cieczowej do badań fizykochemicznych, do których ze znaczącymi sukcesami wykorzystywana jest od lat chromatografia gazowa. W chromatografii cieczowej duże sukcesy wciąż jeszcze nie zostały odnotowane, ponieważ układ w LC jest znacznie bardziej skomplikowany niż w chromatografii gazowej i interpretacja wykonanych z jego wykorzystaniem pomiarów fizykochemicznych nie jest łatwa.

Techniki chromatografii cieczowej odgrywają również dużą rolę w oczyszczaniu, rozdzielaniu i otrzymywaniu czystych substancji, zwłaszcza z surowców naturalnych, głównie do produkcji leków, w tym peptydów, białek i izomerów optycznych.

O dużym znaczeniu chromatografii dla ludzkości mówiono podczas obchodów sześćdziesięciolecia The Chromatographic Society 22 marca 2016 roku w Londynie. Wśród dziedzin życia i nauki, dla których chromatografia ma bardzo duże znaczenie, wymieniono między innymi badanie kosmosu, analizę żywności, badanie leków, diagnostykę medyczną, kryminalistykę i kontrolę antydopingową.

Mając na uwadze bardzo duże znaczenie chromatografii dla ludzkości, profesor Victoria Samanidou z uniwersytetu w Salonikach zaproponowała ustanowienie dnia, lub dni, chromatografii („The Analytical Scientist” 72 (2019) 18). Propozycję wsparły The Chromatograhic Society oraz Zespół Chromatografii i Technik Pokrewnych KChA PAN. Należy mieć nadzieję, że idea profesor Samanidou zostanie zrealizowana i chromatografia będzie mieć swoje święto.

1.3.
Istota rozdzielania chromatograficznego

Rozdzielanie chromatograficzne można zilustrować za pomocą historyjki przedstawionej na rycinie 1.8. Widać na niej królewnę, która obserwuje zawody mające na celu wyłonienie kandydata godnego jej ręki. Reguły rywalizacji ustalił król – potencjalni narzeczeni jego córki mają przepłynąć odcinek wartkiego strumienia, w którym powbijane są słupki. Zwycięzcą zostanie ten, który do mety dopłynie ostatni. Aby zatem przebywać w wodzie jak najdłużej, pływacy muszą dopływać do słupków i trzymać się ich tak długo, jak pozwalają im siły.

Ci słabsi, niedopływający do kolejnych słupków albo niepotrafiący się przy nich utrzymać, wychodzili z wody szybko. W wyniku tego grupa kandydatów do ręki królewny została rozdzielona, i dopiero ostatni z nich zasłużył na ślub.

RYC. 1.8. Ilustracja istoty rozdzielania chromatograficznego (Dünnschichtchromatographie, Merck, 1995)

Rozdzielenie nastąpiło w płynącej wodzie, w której znajdowały się stałe punkty w postaci słupków. Bardzo podobnie następuje chromatograficzne rozdzielenie związków chemicznych, których cząsteczki w różny sposób oddziałują z układem składającym się z dwóch faz – ruchomej i nieruchomej (nazywanej stacjonarną). Na podstawie tego mechanizmu chromatografię można zdefiniować jako fizykochemiczną metodę rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału pomiędzy fazę nieruchomą i ruchomą, poruszającą się wzdłuż fazy stacjonarnej. W procesie chromatografowania uczestniczą zatem trzy składniki – substancja chromatografowana, substancja będąca fazą stacjonarną i substancja będąca fazą ruchomą. W chromatografii gazowej oddziaływania międzycząsteczkowe zachodzą między składnikami próbki a fazą stacjonarną (oddziaływanie tych składników z gazem nośnym jest pomijalnie małe). W chromatografii cieczowej natomiast oddziaływania międzycząsteczkowe zachodzą pomiędzy wszystkimi składnikami układu: fazą stacjonarną, fazą ruchomą i substancjami chromatografowanymi. Tym samym na zatrzymywanie składników próbki (ich retencję) wpływa w chromatografii cieczowej zarówno faza stacjonarna, jak i faza ruchoma, podczas gdy w chromatografii gazowej wyłącznie faza stacjonarna. W wyniku różnego oddziaływania z cząsteczkami obu faz cząsteczek substancji chromatografowanych są one dłużej lub krócej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i w wyniku ulegają rozdzieleniu.

Oddziaływanie elementów układu chromatograficznego ilustruje rycina 1.9.

RYC. 1.9. Oddziaływanie składników układu chromatograficznego

Cząsteczki substancji chromatografowanej rywalizują z cząsteczkami fazy ruchomej o miejsce na fazie stacjonarnej, oddziałując z fazą stacjonarną siłami charakterystycznymi dla ich właściwości. Substancja chromatografowana o większej sile oddziaływania jest zatrzymywana na fazie stacjonarnej dłużej niż substancja chromatografowana oddziałująca z nią słabiej. Jednocześnie cząsteczki substancji chromatografowanej oddziałują z fazą ruchomą, ulegając podziałowi między fazę ruchomą a stacjonarną. Stosunek podziału substancji chromatografowanej między fazę stacjonarną s i ruchomą r można wyrazić stosunkiem stężeń c tej substancji w obu fazach:

. (1.1)

Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych obecnych w fazach nieruchomej i ruchomej ustala się równowaga dynamiczna z wielokrotnym przechodzeniem tych cząsteczek z jednej fazy do drugiej. Ich przenoszenie wzdłuż układu chromatograficznego jest możliwe tylko wtedy, gdy znajdują się w fazie ruchomej.

Na rycinie 1.10 przedstawiono ideę rozdzielania chromatograficznego na przykładzie mieszaniny dwóch składników A i B, wprowadzonej do układu w czasie t_0. W czasie t_1 widoczny jest różny podział składników między dwie fazy i odpowiadające temu podziałowi ich rozdzielenie. W czasie t_2 jeden ze składników, a w czasie t_3 już oba nie mają kontaktu z fazą stacjonarną i są wyniesione z układu w fazie ruchomej, tworząc z nią eluat.

RYC. 1.10. Schemat rozdzielania chromatograficznego mieszaniny składającej się z dwóch składników – A i B; t_0 – moment wprowadzenia mieszaniny do układu chromatograficznego, t_1, t_2 – wybrane czasy z ogólnego czasu przebiegu rozdzielania chromatograficznego, t_3 – czas zakończenia rozdzielania składników mieszaniny, C – stężenie składnika (A lub B) w fazie ruchomej (fr) lub w fazie nieruchomej – stacjonarnej (fs)

Pasma stężeniowe składników po przejściu przez układ chromatograficzny różnią się od pasma początkowego mieszaniny. Różnica polega na poszerzeniu się pasm składników i na przyjęciu przez te pasma, w optymalnych warunkach, kształtu krzywej Gaussa. Pasma te są rejestrowane w postaci pików chromatograficznych. Zbiór pików odpowiadających poszczególnym składnikom analizowanej mieszaniny nosi nazwę chromatogramu.

Na rycinie 1.10 pik składnika B jest wyraźnie szerszy niż pik składnika A. Jest to wynik pewnej prawidłowości – im dłużej substancja chromatografowana jest zatrzymywana w układzie (im większe jej rozmycie dyfuzyjne), tym szerszy jest pik, który tej substancji odpowiada.

W chromatografii cieczowej rozdzielanie składników mieszaniny przeprowadza się w kolumnie lub na płaszczyźnie. W pierwszym przypadku faza stacjonarna jest umieszczona w zamkniętym pojemniku, zwykle w rurce. W drugim – faza stacjonarna jest bibułą lub cienką warstwą sorbentu rozprowadzoną równomiernie na płaskim podłożu.

Rozdzielenie składników mieszaniny jest możliwe wtedy, gdy stosunki podziału K poszczególnych składników są różne. Rolą chromatografisty jest takie dobranie warunków chromatografowania, aby ta różnica zaistniała. Pod pojęciem warunków rozumie się rodzaj i właściwości fazy stacjonarnej i ruchomej, prędkość przepływu fazy ruchomej oraz temperaturę. W przypadku chromatografii kolumnowej należy uwzględnić rodzaj i wymiary kolumny, a w przypadku chromatografii cienkowarstwowej – rodzaj płytki i sposób rozwijania chromatogramów.

Najbardziej ogólny podział metod chromatograficznych określa stan skupienia fazy ruchomej, ponieważ w znaczący sposób wpływa on na mechanizm procesu, który jest realizowany przy zastosowaniu różnej aparatury. W chromatografii gazowej fazą ruchomą jest gaz, w cieczowej ciecz, a w chromatografii nadkrytycznej – substancja w stanie nadkrytycznym. W praktyce najczęściej stosowane są chromatografia gazowa i cieczowa. Pomimo że podstawy teoretyczne obu są wspólne, istnieją trzy zasadnicze różnice w mechanizmach rozdzielania. Po pierwsze współczynnik dyfuzji w cieczach jest co najmniej 10 000 razy mniejszy niż w gazach. Po drugie lepkość cieczy jako fazy ruchomej jest w przybliżeniu 100 razy większa niż w przypadku gazów. Trzecia różnica polega na mocy oddziaływań cząsteczek fazy stacjonarnej z cząsteczkami fazy ruchomej. O ile w przypadku chromatografii gazowej są one do zaniedbania, o tyle w chromatografii cieczowej mają istotny wpływ na efekt rozdzielania.

1.4.
Klasyfikacja układów chromatografii cieczowej

W chromatografii cieczowej fazą ruchomą jest ciecz, zaś fazą stacjonarną ciało stałe lub ciecz osadzona na nośniku. Fazą ruchomą, zwaną również w chromatografii cieczowej eluentem, może być pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, mieszanina wodno-organiczna albo roztwory buforowe. W przeciwieństwie do chromatografii gazowej, właściwości fazy ruchomej w chromatografii cieczowej mają istotny wpływ na końcowy efekt rozdzielania. Fazą stacjonarną jest rzeczywisty adsorbent, zwykle żel krzemionkowy albo związana z nim chemicznie substancja organiczna. W pierwszym przypadku mechanizm oddziaływania substancji chromatografowanej z fazą stacjonarną jest adsorpcyjny, a w drugim adsorpcyjno-podziałowy, pomimo że dominuje mechanizm podziałowy. Udział mechanizmu adsorpcyjnego wynika z faktu, że nie wszystkie grupy hydroksylowe na powierzchni żelu krzemionkowego zostają zastąpione innymi grupami funkcyjnymi. Warunkiem możliwości zastosowania chromatografii cieczowej do analizy jakiegoś materiału jest rozpuszczalność jego składników w fazie ruchomej.

Faza stacjonarna w chromatografii cieczowej może być umieszczona w kolumnie chromatograficznej lub stanowić płaszczyznę w postaci bibuły albo cienkiej warstwy adsorbentu na podłożu z płytki szklanej lub folii aluminiowej czy polimerowej. W pierwszym przypadku chromatografię cieczową określa się jako kolumnową, w drugim jako planarną. W chromatografii kolumnowej, w zależności od wartości ciśnienia fazy ruchomej, rozróżnia się chromatografię niskociśnieniową z grawitacyjnym przepływem cieczy, określaną również jako zwykła lub tradycyjna, i wysokociśnieniową lub wysokosprawną. W przypadku chromatografii planarnej współcześnie stosuje się głównie chromatografię cienkowarstwową, w której istnieją podobne mechanizmy rozdzielania jak w chromatografii kolumnowej.

W chromatografii kolumnowej stosuje się układy o różnym stosunku polarności fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Jeżeli faza stacjonarna jest polarna, to faza ruchoma może być mniej polarna lub niepolarna. Taki rodzaj chromatografii cieczowej określa się jako chromatografię w normalnym układzie faz (ang. Normal Phase Chromatography, NPC). Związki polarne są w tym układzie dłużej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i wymywane z kolumny za związkami niepolarnymi. Jeżeli faza stacjonarna jest niepolarna, to faza ruchoma może być polarna. Jest to tak zwana chromatografia w odwróconym układzie faz (ang. Reversed Phase Chromatography, RPC). Retencja związków niepolarnych jest wtedy większa niż związków polarnych.

W trakcie prowadzenia procesu chromatograficznego wszystkie parametry przepływu fazy ruchomej mogą być stałe. Mówi się wtedy o chromatografii izokratycznej. Gdy w trakcie analizy zmieniany jest, w sposób ciągły lub stopniowo, skład fazy ruchomej, jej szybkość przepływu i temperatura, wówczas mówi się o elucji gradientowej (gradiencie elucji, przepływu lub temperatury).

Do rozwiązania danego problemu analitycznego dobiera się układ chromatograficzny, w którym wskutek specyficznych oddziaływań składników tego układu możliwe będzie rozdzielenie składników mieszaniny. W zależności od mechanizmu oddziaływania rozdzielanych składników rozróżnia się kilka technik chromatograficznych. Poszczególne mechanizmy oddziaływania substancji chromatografowanych z fazami stacjonarnymi zostaną scharakteryzowane przy opisie poszczególnych technik. Schematycznie przedstawiono je na rycinie 1.11.

RYC. 1.11. Klasyfikacja technik chromatografii cieczowej

Na schemacie poszczególne techniki chromatograficzne oznaczono akronimami ich pełnych nazw w języku angielskim. Akronimy te są stosowane w literaturze światowej i powszechnie używane w języku polskim: NPC (ang. Normal Phase Chromatography) – chromatografia w normalnym układzie faz, HILIC (ang. Hydrophilic Interaction Chromatography) – chromatografia oddziaływań hydrofobowych, RPC (ang. Reversed Phase Chromatography) – chromatografia w odwróconym układzie faz, HIC (ang. Hydrophobic Interaction Chromatography) – chromatografia oddziaływań hydrofilowych, AC (ang. Affinity Chromatography) – chromatografia powinowactwa, SEC (ang. Size Exclusion Chromatography) – chromatografia wykluczania/chromatografia żelowa, IEC (ang. Ion Exchange Chromatography) – chromatografia jonowa, CCC (ang. Counter Current Cromatography) – chromatografia przeciwprądowa, IPC (ang. Ion Pair Chromatography) – chromatografia par jonowych.

Jednym z rodzajów chromatografii jest chromatografia nadkrytyczna, w której fazą ruchomą jest substancja w stanie nadkrytycznym. Substancja w takim stanie ma fizykochemiczne właściwości pośrednie między gazem i cieczą. Dlatego chromatografia nadkrytyczna ma też właściwości i możliwości analityczne pośrednie między chromatografiami gazową i cieczową. Za jej pomocą można zatem analizować substancje podobne jak za pomocą chromatografii cieczowej. Można przy tym stosować takie kolumny i takie detektory, jakie stosuje się w chromatografiach gazowej i cieczowej. Wspólnota tych cech trzech rodzajów chromatografii jest podstawą koncepcji ich unifikacji i konstrukcji aparatów możliwych do wykorzystania w każdym z jej rodzajów.

Ponieważ ważnym aspektem chromatografii cieczowej staje się szybkość analizy, coraz bardziej rozpowszechnia się ultrasprawna chromatografia cieczowa – UHPLC (ang. Ultra-High Pressure/Performance Liquid Chromatography). Powstanie UHPLC stało się możliwe dzięki rozwojowi w ciągu ostatnich kilkunastu lat nowoczesnych kolumn.

1.5.
Podstawowe wielkości retencyjne i termodynamiczne

Składniki próbki wprowadzonej do kolumny chromatograficznej ulegają podziałowi pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną, ale są przenoszone wzdłuż kolumny tylko w fazie ruchomej. W konsekwencji składniki substancji mające większą tendencję do przebywania w fazie ruchomej poruszają się szybciej niż te z większą tendencją do przebywania w fazie stacjonarnej. Te drugie są silniej zatrzymywane przez fazę stacjonarną.

Zatrzymywanie na fazie stacjonarnej, nazywane retencją, w chromatografii gazowej spowodowane jest wyłącznie oddziaływaniem z nią składników próbki siłami międzycząsteczkowymi (dyspersyjnymi, polarnymi i jonowymi). Siły te są większe niż siły oddziaływania międzycząsteczkowego między składnikami próbki a fazą ruchomą (gaz nośny praktycznie nie oddziałuje ze składnikami próbki). Na retencję składników próbki wpływa w tym przypadku wyłącznie faza stacjonarna. Natomiast w chromatografii cieczowej oddziaływania zachodzą pomiędzy wszystkimi składnikami układu: fazą stacjonarną, fazą ruchomą (rozpuszczalnikiem) i składnikami próbki, a zatem na retencję wpływają obie fazy: zarówno stacjonarna, jak i ruchoma.

Retencja może być określana w różny sposób. Istnieją dwie podstawowe grupy parametrów retencyjnych. Pierwsza związana jest z czasem, który składniki spędzają w kolumnie chromatograficznej – tak zwanym czasem retencji. Druga grupa natomiast związana jest z objętością fazy ruchomej przepływającej przez kolumnę podczas przebywania w niej składników próbki – jest to objętość retencji. Retencję charakteryzuje również parametr wyrażający stosunek czasu, który składniki spędzają w fazie nieruchomej do czasu, który spędzają w fazie ruchomej, tak zwany współczynnik retencji.

Każdy proces chromatograficzny jest procesem termodynamicznym. Z jego istoty wynika, że w trakcie analizy chromatograficznej nie uzyskuje się wprawdzie pełnej równowagi podziału wszystkich substancji między fazę ruchomą i nieruchomą, ale w większości przypadków osiąga się duży stopień zbliżenia do tego stanu.

Stała podziału K, jako podstawowa wielkość termodynamiczna określająca stan równowagi procesu chromatograficznego, zależy od temperatury, w której prowadzi się proces chromatograficzny, polarności chromatografowanych substancji oraz charakteru ich oddziaływań z fazą stacjonarną i fazą ruchomą. Ponieważ wartość stałej podziału określa szybkość migracji pasma chromatograficznego przez złoże sorbentu, a zatem wpływa na czas jego przebywania w kolumnie, parametry retencyjne są z nią ściśle powiązane.

Można wyprowadzić bezpośrednią zależność między wielkością retencji a wartością stałej podziału K. Z definicji stałej podziału wynika, że:

, (1.2)

gdzie:

Ns – liczba moli substancji w fazie stacjonarnej,

Nr – liczba moli w fazie ruchomej,

Vs – objętość fazy stacjonarnej,

Nr – objętość fazy ruchomej.

Stosunek β = Vr/Vs nazywany jest stosunkiem faz.

Po uporządkowaniu wzoru (1.2):

. (1.3)

Wpływ poszczególnych elementów układu chromatograficznego na rozdzielanie składników mieszaniny zostanie przedstawiony przy charakterystyce rozpuszczalników zgrupowanych w tak zwane szeregi eluotropowe, związane z ich polarnością, oraz przy charakterystyce polarności faz stacjonarnych. Efektem wzajemnych oddziaływań trzech elementów układu chromatograficznego jest rozdzielenie lub brak rozdzielenia składników chromatografowanej mieszaniny.

Nie wchodząc w szczegóły, w chromatografii cieczowej na czas przebywania substancji chromatografowanych w kolumnie wpływają następujące czynniki:

– przepływ fazy ruchomej – retencja w warunkach izokratycznych jest odwrotnie proporcjonalna do szybkości przepływu fazy ruchomej, zatem zwiększenie szybkości jej przepływu powoduje skrócenie czasu retencji. Wartość szybkości przepływu fazy ruchomej wpływa istotnie na rozdzielanie składników mieszanin. Opisują to równanie i wykres van Deemtera (patrz rozdz. 2.7),

– temperatura kolumny – im wyższa, tym krócej zatrzymują się w niej substancje chromatografowane, a co za tym idzie – są gorzej rozdzielane niż przy niższej. Z zasady wynikającej z praktyki wiadomo, że retencja w warunkach izokratycznych, w odwróconym układzie faz, zmienia się w przybliżeniu o 2% przy zmianie temperatury kolumny o 1°C,

– skład fazy ruchomej – na retencję wpływają takie cechy fazy ruchomej, jak: polarność, skład mieszaniny i pH, związane z obecnością buforu, który jest składnikiem fazy ruchomej,

– polarność składników rozdzielanej mieszaniny – w normalnym układzie faz związki polarne są dłużej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i są z niej wymywane za związkami niepolarnymi. Natomiast w odwróconym układzie faz retencja składników niepolarnych jest większa niż polarnych,

– rodzaj oddziaływań z fazą stacjonarną – w chromatografii ciecz–ciecz retencja rozdzielanych składników zależy od rodzaju oddziaływań międzycząsteczkowych (np. hydrofobowych, dipolowych, π-elektronowych) fazy stacjonarnej ze związkami analizowanej mieszaniny. Oddziaływania te w przypadku faz związanych (w postaci adsorbentu modyfikowanego grupami organicznymi) zależą od rodzaju grupy organicznej modyfikującej adsorbent oraz od stopnia jego obsadzenia grupami funkcyjnymi. Ważną cechą fazy stacjonarnej, ze względu na obecność wody w składzie fazy ruchomej w odwróconym układzie faz, jest jej zdolność do oddziaływań hydrofobowych. Siła tych oddziaływań zwiększa się ze wzrostem, na przykład, długości łańcuchów alkilowych. W przypadku stosowania jako podłoża faz związanych żelu krzemionkowego ważna jest dostępność resztkowych (wolnych) grup silanolowych na jego powierzchni, zdolnych do tworzenia wiązań wodorowych z rozdzielanymi związkami,

– długość kolumny – substancje chromatografowane są, w takich samych warunkach, tym dłużej zatrzymywane w kolumnie, im jest ona dłuższa. Lepsze jest wówczas rozdzielenie składników mieszaniny, ale większe rozmycie ich pików, które może niwelować efekt dobrego rozdzielania.

Czas przebywania składników mieszaniny w kolumnie chromatograficznej, liczony od chwili wprowadzenia tej mieszaniny do dozownika do osiągnięcia maksimum stężenia poszczególnych składników w detektorze, któremu odpowiada wierzchołek piku chromatograficznego, to tak zwany całkowity czas retencji tR.

RYC. 1.12. Sposoby wyznaczania czasów retencji z chromatogramu

Całkowity czas retencji odczytuje się z chromatogramu (ryc. 1.12).

Na całkowity czas retencji składa się czas przebywania substancji chromatografowanych w obu fazach uczestniczących w procesie chromatograficznym. Bardziej interesujący jest czas ich przebywania w fazie nieruchomej . Czas ten to tak zwany zredukowany czas retencji. Można go wyznaczyć eksperymentalnie, odejmując od całkowitego czasu retencji tR czas retencji substancji niezatrzymywanej przez fazę stacjonarną tM:

. (1.4)

Do wyznaczania czasu retencji substancji niezatrzymywanej stosuje się na przykład uracyl

Zredukowany czas retencji jest proporcjonalny do wartości stałej podziału K. Jego wartość, podobnie jak całkowitego czasu retencji, zależy jednak nie tylko od rodzaju fazy, zarówno stacjonarnej, jak i ruchomej, lecz także od innych warunków chromatografowania, takich jak temperatura kolumny, objętościowa szybkość przepływu fazy ruchomej przez kolumnę, wymiary kolumny, masa fazy stacjonarnej w kolumnie. Aby choć częściowo uniezależnić się od wpływu tych parametrów, wprowadzono pojęcie retencyjne związane z objętością eluentu potrzebnego do wymycia danego składnika z kolumny, czyli objętość retencji VR. Jeżeli chromatografowanie prowadzi się przy stałej wartości objętościowego przepływu eluentu Fc [ml/min] na wylocie kolumny, to całkowitą objętość retencji można obliczyć ze wzoru:

, (1.5)

zaś zredukowaną objętość retencji ze wzoru:

. (1.6)