Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Zdjęcie na okładce Christoph Burgstedt/iStock

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redakcja Mieczysława Kompanowska

Korekta Urszula Pawłowska

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.: Michał Latusek

Recenzent Danuta Żuchowska

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl.

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2023r. (Wydanie I)

Warszawa 2023

ISBN 978-83-01-22782-1

DOI: https://doi.org/10.53271/2022.116

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Fragment

1. Różne zagadnienia związane z badaniami polimerów

1.1. Biopolimery a polimery syntetyczne

1.1.1. Czym są biopolimery

1.1.2. Podstawowe różnice między polimerami a biopolimerami

1.1.3. Metodyka badań biopolimerów

1.2. Wiązania chemiczne w biopolimerach

1.2.1. Siły van der Waalsa

1.2.2. Wiązania wodorowe

1.2.3. Rola wiązania wodorowego w biopolimerach

1.2.4. Oddziaływania donorowo-akceptorowe (koordynacyjne)

1.2.5. Oddziaływania stackingowe

1.2.6. Oddziaływania jonowe

1.2.7. Oddziaływania jon–dipol

1.2.8. Transport elektronów w układach biologicznych

1.3. Konformacje strukturalne

1.3.1. Konformacja chiralna

1.3.2. Konformacja helikalna (spiralna)

1.4. Woda w strukturach biopolimerów

1.4.1. Struktura fizyczna wody

1.4.2. Oddziaływanie wody z biopolimerami

1.4.3. Otoczka hydratacyjna

1.4.4. Wiązanie wody przez peptydy

1.4.5. Oddziaływania hydrofilowe

1.4.6. Oddziaływania hydrofobowe

1.5. Oddziaływanie międzycząsteczkowe w roztworach

1.5.1. Rozpuszczanie biopolimerów

1.5.2. Roztwory i jednostki stężeń

1.5.3. Termodynamiczne podstawy przebiegu reakcji biochemicznych

1.5.4. Makrocząsteczka w roztworze

1.5.5. Proces pęcznienia

1.5.6. Kompleksy międzycząsteczkowe

1.5.7. Asocjacja, aglomeracja i agregacja białek

1.5.8. Agregacje makrocząsteczek

1.5.9. Surfaktanty (detergenty) – środki pomocnicze

1.5.10. Błony komórkowe

1.5.11. Biokoloidy

1.5.12. Micele

1.5.13. Pęcherzyki – micele wielowarstwowe

1.6. Wilgoć

1.6.1. Wilgotność względna i bezwzględna

1.6.2. Właściwości higroskopijne biopolimerów

1.7. Ekstrakcja

1.8. Suszenie biopolimerów

1.8.1. Metody suszenia

1.8.2. Sita molekularne

1.9. Przygotowywanie próbek do badań

1.9.1. Oczyszczanie białek

1.9.2. Wysalanie białek

1.9.3. Denaturacja białek

1.10. Procesy oksydacyjne biopolimerów

1.10.1. Reakcje wolnych rodników z biopolimerami

1.10.2. Nadtlenek wodoru

1.10.3. Wychwyt rodnika tlenku azotu (⋅NO)

1.10.4. Stres oksydacyjny

1.10.5. Degradacja oksydacyjna biopolimerów tlenem molekularnym

1.10.6. Mechanizmy działania antyutleniaczy

1.10.7. Degradacja oksydacyjna biopolimerów tlenem singletowym

1.10.8. Degradacja oksydacyjna biopolimerów tlenem atomowym

1.10.9. Degradacja oksydacyjna biopolimerów ozonem

1.11. Homeostaza

1.12. Modyfikacja fizyczna i chemiczna biopolimerów – zagadnienia ogólne

1.13. Niebezpieczne preparaty w badaniach z biopolimerami

LITERATURA

2. Chromatograficzne metody separacji i wydzielania biopolimerów

2.1. Techniki separacyjne – chromatografia

2.2. Podstawy chromatografii

2.3. Chromatografia cienkowarstwowa

2.4. Chromatografia powinowactwa

2.5. Kolumnowa chromatografia cieczowa

2.6. Klasyczna chromatografia HPLC

2.7. Polimerowe adsorbenty porowate

2.8. Metody rozwijania chromatogramu

2.9. Chromatografia jonowymienna

2.9.1. Jonity organiczne

2.9.2. Wymiana jonowa na kolumnie

2.9.3. Oznaczanie pojemności wymiennej

2.9.4. Oznaczanie pęcznienia jonitów

2.10. Chromatografia sitowa (wykluczenia)

2.11. Chromatografia gazowa

2.12. Wybór techniki chromatograficznej

LITERATURA

3. Elektroforetyczne metody separacji i wydzielania biopolimerów

3.1. Podstawy praktyczne elektroforezy

3.2. Elektroforeza bibułowa

3.3. Elektroforeza żelowa

3.3.1. Nośniki żelowe

3.4. Rozdział elektroforetyczny białek

3.5. Oznaczanie elektroforetyczne rodzaju białek w materiale biologicznym metodą Western blot

3.6. Pozostałe metody elektroforetyczne

3.7. Elektroforeza kapilarna

3.8. Elektroforeza swobodna z przepływem elektrodynamicznym

3.9. Przygotowywanie próbek do elektroforezy

3.10. Wyznaczanie względnej masy cząsteczkowej białka za pomocą elektroferezy

3.11. Elektroforetyczny rozdział białek i kwasów nukleinowych

3.12. Test immunoenzymatyczny ELISA

3.13. Znakowanie immunologiczne rozdzielonych białek

LITERATURA

4. Fizykochemiczne metody identyfikacji struktury biopolimerów

4.1. Wyznaczanie mas molowych metodami sedymentacyjnymi

4.1.1. Wyznaczanie mas molowych za pomocą pomiarów sedymentacyjnych

4.1.2. Wyznaczanie mas molowych metodą pomiaru szybkości sedymentacji

4.1.3. Aparatura do ultrawirowania

4.1.4. Współczynnik sedymentacji

4.1.5. Współczynnik dyfuzji

4.1.6. Pomiar współczynnika dyfuzji

4.1.7. Wyznaczanie mas cząsteczkowych metodą pomiaru równowagi sedymentacyjnej

4.1.8. Wyznaczanie mas cząsteczkowych metodą pomiaru sedymentacji w gradiencie gęstości

4.2. Wyznaczanie mas molowych metodą spektrometrii mas

4.2.1. Mechanizm jonizacji

4.2.2. Pomiar widm masowych

4.3. Metody spektroskopowe badania biopolimerów

4.3.1. Spektrometria absorpcyjna w zakresie widzialnym

4.3.2. Widma elektronowe

4.3.3. Podstawowe prawa spektroskopii UV/VIS

4.3.4. Aparatura do pomiarów widm absorpcyjnych

4.3.5. Spektroskopia absorpcyjna aminokwasów i białek

4.3.6. Spektroskopia absorpcyjna kwasów nukleinowych

4.4. Spektrofotometria emisyjna fluorescencji

4.4.1. Podstawy spektroskopii emisyjnej

4.4.2. Wygaszanie fluorescencji

4.4.3. Bezpromieniste przeniesienie energii wzbudzenia

4.4.4. Aparatura do pomiarów widm fluorescencji

4.4.5. Spektroskopia emisyjna aminokwasów, białek i kwasów nukleinowych

4.4.6. Znakowanie biopolimerów do badań spektroskopowych

4.4.7. Zielona fluorescencja

4.4.8. Widma emisyjne fluorescencji chlorofilu

4.4.9. Efekt Kautsky’ego

4.4.10. Fluorescencyjne badanie rozwijania i zwijania białek

4.4.11. Metody badania szybkich reakcji w analizie przepływowej

4.5. Zastosowanie dichroizmu w badaniach biopolimerów

4.5.1. Dichroizm kołowy w badaniu struktury konformacyjnej białek

4.6. Metody optyczne badania biopolimerów

4.6.1. Dwójłomność

4.6.2. Skręcalność optyczna

4.6.2.1. Dyspersja skręcalności optycznej

4.6.3. Metoda dynamicznego rozpraszania światła

4.6.4. Małokątowe rozpraszanie światła (SALS)

4.7. Spektrometria w podczerwieni (IR)

4.7.1. Widma oscylacyjno-rotacyjne biopolimerów

4.7.2. Pomiar widm absorpcyjnych w podczerwieni (IR)

4.7.3. Przygotowywanie próbek biopolimerów do badań widm IR

4.7.4. Widma spektrofotometrii wewnętrznego odbicia promieniowania IR

4.7.5. Widma spektrofotometrii odbicia dyfuzyjnego

4.7.6. Spektroskopia IR wiązania wodorowego

4.7.7. Zastosowanie spektroskopii IR do badania deuterowanych biopolimerów

4.7.8. Spektrofotometria absorpcyjna IR w świetle spolaryzowanym

4.7.9. Spektroskopia IR w bliskiej podczerwieni

4.7.10. Analiza i zastosowania widm IR w badaniach biopolimerów

4.8. Badanie struktur polimerowych metodami spektroskopii Ramana

4.8.1. Podstawy spektroskopii Ramana

4.8.2. Pomiar widm Ramana

4.8.3. Badanie biopolimerów za pomocą spektroskopii Ramana

4.9. Badanie struktur polimerowych metodami magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

4.9.1. Podstawy spektroskopii NMR

4.9.2. Pomiar widm NMR biopolimerów

4.9.3. Przesunięcie chemiczne

4.9.4. Interpretacja widm NMR białek

4.9.5. Spektroskopia 13C NMR białek

4.9.6. Spektroskopia NMR w fazie stałej

4.9.7. Dwuwymiarowa spektroskopia 2D-NMR

4.9.8. Metoda chemicznie indukowanej dynamicznej polaryzacji jąder

4.10. Spektroskopia elektronowego rezonansu jądrowego (EPR) w badaniach rodników

4.10.1. Podstawy rezonansu jądrowego

4.10.2. Pomiar rezonansu jądrowego

4.10.3. Znakowanie spinowe

4.10.4. Badanie rozwijania i zwijania białek za pomocą znaczników spinowych

4.11. Krystalizacja peptydów i białek

4.11.1. Podstawy krystalizacji

4.11.2. Krystalizacja polipeptydów i białek

4.11.3. Zagadnienia analizy krystalograficznej

4.12. Metody rentgenograficzne badania morfologii biopolimerów

4.12.1. Podstawy spektrometrii rentgenowskiej

4.12.2. Analiza rentgenograficzna metodami WAXS i SAXS

4.12.3. Bazy danych krystalograficznych

4.13. Metody mikroskopowe

4.13.1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

4.13.2. Skaningowa mikroskopia elektronowa

4.13.3. Skaningowa mikroskopia sił atomowych

4.13.4. Badanie mechanicznego rozwijania białka metodą AFM

LITERATURA

Dorobek naukowy prof. Jana F. Rabka

Pozostałe rozdziały dostępne w pełnej wersji e-booka.

1

Różne zagadnienia związane z badaniami polimerów

1.1. Biopolimery a polimery syntetyczne

1.1.1. Czym są biopolimery

W współczesnym świecie pojęcia plastik (tworzywo sztuczne) i polimer (tworzywo wielkocząsteczkowe) stały się powszechne, chociaż niewiele osób ma szerszą wiedzę o budowie, właściwościach i zastosowaniach tych materiałów. Natomiast pojęcie biopolimery to nadal ziemia nieznana (terra incognita).

Biopolimery to naturalne polimery produkowane przez określone komórki organizmów. Stanowią makrocząsteczki różnych związków chemicznych, jak:

– polinukleotydów (kwasów nukleinowych DNA, RNA),

– polipeptydów i białek, enzymów (polimerów aminokwasów),

– polisacharydów (liniowych lub rozgałęzionych polimerycznych węglowodanów).

Biopolimery wchodzą w skład wyspecjalizowanych organów i podsystemów organizmów roślinnych, zwierzęcych i człowieka, zapewniając ich funkcjonowanie życiowe od urodzenia aż do śmierci. Stąd można implikować, że człowiek i cały otaczający na świat roślinny i zwierzęcy są biopolimerami, które są wytwarzane w naturze bez jego woli od nano-, mikrogramów do niewyobrażalnych milionów ton w skali rocznej.

Ponadto żywimy się biopolimerami, jedząc białka (roślinne i zwierzęce) oraz polisacharydy (skrobia w postaci chleba, makaronów, kartofli).

Badaniem budowy, biosyntezy i funkcjonowania biopolimerów zajmują się:

– biochemia,

– biologia molekularna (lignina, grewno, kauczuk, węgiel kamienny),

– biofizyka,

– fizjologia roślin i zwierząt.

Badanie te obejmują:

– przestrzenną strukturę białek na podstawie sekwencji występujących w nich aminokwasów,

– zrozumienie funkcji białek w organizmach na poziome molekularnym,

– podstawowe właściwości życia, czyli dynamiczny stan równowagi materii żywej,

– opracowanie metod projektowania ab initio białek o zadanej funkcji biologicznej,

– rolę białek w metabolizmie wielu chorób (między innymi Alzheimera, Parkinsona czy nowotworów),

– opracowywaniu nowych technologii procesów biochemicznych wytwarzania żywności i leków.

Na tematy związane z biochemią napisano wiele podręczników i monografii, wydanych w Polsce [1.1–1.23] i zagranicą [1.24–1.28].

Biopolimery specjalne (białka, enzymy) są produkowane w ilościach od nano-, mikrograma do setek ton rocznie. Biopolimery przemysłowe, takie jak celuloza, skrobia, kauczuk czy węgiel kamienny (skamieniały biopolimer), są wytwarzane w milionach ton rocznie.

Biopolimery mogą wywoływać choroby lub być stosowane w ich leczeniu.

Za chorobę uważa się stan dynamiczny organizmu, w którym dochodzi do:

– nieprawidłowości reakcji układów lub narządów,

– zaburzenia czynności życiowych,

– uszkodzenia morfologicznych struktur tkanek i narządów wywołanego:

• zmianami w biosyntezie białka i mechanizmów jego regulacji,

• zakłóceniu reperacji kodu genetycznego

na poziomie kwasów nukleinowych dezoksy- i rybonukleinowych (patologia molekularna).

Śmierć jest zaprogramowana jako integralna część życia człowieka, wśród trzech miliardów zasad DNA genomu. W chwili narodzin zaczynamy jednocześnie umierać w sposób biologicznie kontrolowany z powodu postępującego uszkadzania się naszych biopolimerów i wyłączania ich z procesów życiowych.

1.1.2. Podstawowe różnice między polimerami a biopolimerami

Polimery syntetyczne (synthetic polymers) są związkami makrocząsteczkowymi, zbudowanymi z [1.29, 1.30]:

– jednakowych cząsteczek merów A (gr. mer – część):

-A-A-A-A-A-A-, np. polietylen: –[CH_2–CH_2–]n–

gdzie n jest liczbą merów;

– co najmniej dwóch lub więcej różnorodnych merów A i B, stanowiących tzw. kopolimery:

-A-B-A-B-A-B-, np. kopolimer etylenu (A) z propylenem (B):

–[CH_2–CH_2–co–CH_2–CH(CH_3)–]n.

Odpowiednikiem meru w biopolimerach są reszty 20 różnych α-aminokwasów (patrz rozdz.2, tabela 2.1), produkowane w żywych komórkach (in vivo).

Biopolimery (biopolymers) są związkami makrocząsteczkowymi, zbudowanymi z 20 różnych merów (reszt) α-aminokwasów (patrz rozdz. 2, tabela 2.1), produkowanymi w żywych komórkach.

Polimery syntetyczne są syntezowane głównie na drodze:

– polimeryzacji rodnikowej,

– polikondensacji,

podczas gdy biopolimery naturalne wyłącznie na drodze polikondensacji (aminokwasów).

Ze względu na statystyczny przebieg większości polireakcji syntetycznych monomerów, otrzymuje się makrocząsteczki polimerów o różnej długości łańcucha, tj. zbiór makrocząsteczek niejednorodnych pod względem masy molowej (polidyspersję). Na skutek tego konieczne jest stosowanie średnich mas molowych [1.31–1.38]:

– średniego udziału liczbowego makrocząsteczek (Number Average Molecular Weight Mn (kg ⋅ mol–1)

– średniego udziału masowego makrocząsteczek (Weight Average Molecular Weight Mw) (kg ⋅ mol–1)

Stopień polidyspersyjności (Mw/Mn) określa niejednorodność masy molowej polimeru. Dla polimerów o jednakowej masie molowej:

czyli: Mw = Mn

W przypadku syntetycznych polimerów polidyspersyjnych

Mw > Mn

W większości przypadków każda makrocząsteczka biopolimeru białka czy enzymu ma tylko jedną masę molową, w związku z czym nie występuje tu polidyspersyjność. Każde białko, czy enzym mają tylko jedna masę molową (cząsteczkową).

Aby lepiej zrozumieć zawiłość związaną z polidyspersją występującą w polimerach syntetycznych, należy rozważyć podane są tu trzy przykłady:

– przykład A: dla próbki polimeru, w której 50% makrocząsteczek ma masę molową 10 000 a 50% masę molową 100 000:

– przykład B: dla próbki polimeru, w której 40% makrocząsteczek ma masę molową 10 000, 50% masę molową 100 000 i 10% masę molową 1 000 000:

– przykład C: dla próbki polimeru, gdzie 56,7% ma masę molową 20 000, 11,9% masę molową 50 000 i 32,4% masę molową 120 000:

Polimery syntetyczne mogą mieć postaci:

– liniowe,

– rozgałęzione,

– usieciowane

o strukturze:

– amorficznej,

– semikrystalicznej,

– krystalicznej.

Biopolimery jak białka czy enzymy tworzą liniowe makrocząsteczki zbudowane z połączonych ze sobą kowalentnie reszt aminokwasowych. Nie tworzą typowych kopolimerów. Jednak polisacharydy należące do biopolimerów mogą tworzyć kopolimery, np. arabinoza (Ara) z ksylozą (Xyl) [1.39] (rys.1.1), oraz struktury:

– rozgałęzione (rys.1.2a)

– blokowe (rys.1.2b);

– usieciowane (rys.1.2c).

Polimery syntetyczne mają zazwyczaj strukturę amorficzną, semikrystaliczną lub krystaliczną.

Biopolimery jak białka i enzymy mają strukturę krystaliczną i stany uporządkowania molekularnego (I–IV rzędowe) (patrz tom I, rozdz. 2.3):

– α-helisę,

– β-harmonijkę,

– β-splot.

Takiej morfologii strukturalnej nie wykazują polimery syntetyczne.

Rys. 1.1. Kopolimery polisacharydów: a) kopolimer nieregularny (random copolymer), b) kopolimer naprzemienny (alternating), c) kopolimer blokowy

Rys. 1.2. Schematyczne formy nieliniowych polisacharydów: a) rozgałęziony, b) kopolimer blokowy, c) usieciowany, d) kopolimer usieciowany

Polimery syntetyczne wykazują przejścia fazowe (rys. 1.3), zachodzące w określonych temperaturach, których wartości są charakterystyczne dla danego rodzaju polimeru (rys. 1.4) [1.40–1.43]:

– temperatura kruchości Tk (brittleness temperature) – temperatura przejścia ze stanu kruchego w stan szklisty z wymuszoną elastycznością;

– temperatura zeszklenia Tg (glass transition temperature) – temperatura przejścia ze stanu szklistego w elastyczny (i odwrotnie);

– temperatura płynięcia Tf (flow temperature) – temperatura przejścia ze stanu elastycznego w plastyczny (i odwrotnie); dla polimerów krystalicznych jest to temperatura topnienia Tm (melting point).

Rys. 1.3. Zmiany stanów fizycznych polimerów podczas ogrzewania

Rys. 1.4. Zmiany objętości właściwej dla różnych stanów fizycznych podczas ogrzewania

Biopolimery naturalne w większości przypadków nie wykazują przejść fazowych (Tk, Tg, Tf, i Tm). Nie mają temperatury topnienia (Tm), bowiem wcześniej ulegają termicznemu rozpadowi.

Polimery syntetyczne bez dodatków i środków pomocniczych są na ogół nietoksyczne i rzadko wywołują alergie.

Biopolimery są biosyntezowane w biosferze (in vivo) i mogą być bardzo toksyczne lub wywoływać choroby i alergie. Białka niektórych grzybów i jadu węży (patrz tom I. podrozdz. 2.10) wywołują nagłą śmierć.

Polimery syntetyczne różnych rodzajów ok. 200 gatunków są produkowane w ilościach 380–400 mln ton rocznie z woli człowieka i na jego potrzeby.

Stanowią podstawę do nowoczesnego rozwoju takich dziedzin codziennego życia, jak:

– budownictwa i infrastruktury społecznej,

– transportu lądowego, wodnego, lotniczego i kosmicznego,

– telekomunikacji i przekazywania informacji cyfrowej,

– opakowań żywności i innych materiałów,

– farmacja i medycyna.

Zielone biopolimery roślinne są produkowane na drodze fotosyntezy w przyrodzie w miliardach ton w sposób niekontrolowany przez człowieka. Jedynie część z nich jest wykorzystywana przy produkcji żywności w celu zaspokojenia głodu, a także codziennych produktów użytkowych.

Biopolimery mają bardzo szeroki zakres zastosowań:

– jako lekarstwa (specyficzne białka i enzymy),

– środki żywności (biopolimery roślinne i zwierzęce),

– materiały włókiennicze (celuloza, jedwab),

– materiały budowlane (drewno),

– materiały opałowe (drewno, lignina, węgiel kamienny – skamieniały biopolimer),

– opony samochodowe (poliizopren).

Różnic pomiędzy polimerami i biopolimerami można wymienić znacznie więcej.

Zastosowanie biopolimerów stwarza różne problemy, gdyż:

– mogą być trudne do utylizacji (patrz tom I, podrozdz. 7.6),

– wykazują toksyczność i cytotoksyczność (patrz tom I. podrozdz. 8.9),

– niektóre wywołują choroby (patrz tom I, podrozdz. 8.4.3.3 i 8.4.8).

Biosyntezie biopolimerów towarzyszą uboczne reakcje metaboliczne, w których powstają różnego rodzaju związki nieorganiczne i organiczne, mające właściwości:

– alergizujące (patrz tom I, podrozdz. 8.4.8),

– trujące (patrz tom I, rozdz. 8.9),

– fotodynamiczne (patrz tom I, podrozdz. 9.1.10).

Polimery syntetyczne same z siebie nie wykazują powyższych właściwości i są obojętne dla przebiegu ważnych procesów życiowych, podczas gdy biopolimery, takie jak kwasy nukleinowe, białka czy enzymy, biorą czynny udział w procesach metabolicznych, decydujących o życiu organizmów.

Biopolimery stały się przedmiotem nowych kierunków badań naukowych:

– biochemii molekularnej,

– biofizyki molekularnej,

– medycyny strukturalnej,

– proteomiki (patrz tom I, podrozdz. 2.9.1) i metabolomiki (patrz tom I, podrozdz. 2.18.8) [1.19],

– bioinformatyki,

– biomechaniki,

– biotechnologii molekularnej,

– kosmetyki i farmakologii molekularnej (patrz tom I, rozdz. 9),

– biomedycyny (patrz tom I, rozdz.8).

Dzięki porównaniu zmian strukturalnych i stężeń białek pod wpływem czynników zewnętrznych w procesach fizjologicznych i patogennych można wykryć chorobę i opracować nowe leki i terapie [1.20],

1.1.3. Metodyka badań biopolimerów

Metodyka badań biopolimerów nie różni się w sposób zasadniczy od podobnych badań prowadzonych z polimerami syntetycznymi. Niektóre biopolimery można otrzymać w ilościach miligramowych, podczas gdy polimery syntetyczne mogą być dostępne w ilościach nieograniczonych.

Do rozpoczęcia badań z biopolimerami potrzebny jest wybór właściwego tematu i możliwie jak najdokładniejsze jego opisanie i sprecyzowanie zadania. Wówczas wskazane jest postępowanie w celu osiągnięcia rezultatu według poniższych wskazówek:

– zapoznanie się z tematyką podstaw danego zagadnienia,

– zebranie literatury na temat zagadnienia z czasopism, książek czy z Internetu,

– opracowanie przeglądowe literatury na temat,

– ocena możliwości dostępu do aparatury badawczej (tabela 1.1),

– przygotowanie próbki do badań:

• izolacja z dostępnego materiału,

• oczyszczenie z zanieczyszczeń,

– sekwencjonowanie łańcuchów peptydowych i oznaczenie budowy strukturalnej produktów sekwencjonowania,

– wyznaczenie właściwości fizykochemicznych, jak:

• rozpuszczalności,

• temperatury topnienia (rozkładu termicznego),

• masy cząsteczkowej,

• widm absorpcyjnych i widm emisyjnych (fluorescencyjnych),

• widm IR i NMR,

• badań rentgenowskich,

• sekwencjonowanie łańcuchów peptydowych i oznaczenie budowy strukturalnej produktów sekwencjonowania.

Tabela 1.1. Najważniejsze metody doświadczalne stosowane w badaniach biopolimerów

Grupa metod

Nazwa/specyfika metody

Skala czasu

Badane parametry

Optyczne

Wygaszanie fluorescencji samoistnej oraz znaczników. Pomiaru czasów żucia oraz rezonansowy transfer energii.

ns–s

Sąsiedztwo Trp lub Tyr ekspozycja powierzchni hydrofobowej, miejsca aktywne enzymów, wiązanie białek z substratami, wyznaczanie odległości pomiędzy elementami struktury białka.

Dichroizm kołowy w dalekim i bliskim nadfiolecie.

ns–s

Formowanie się struktur drugorzędowych oraz trzeciorzędowych.

Absorbcja (bliski nadfiolet) praz spektroskopii FT IR.

ns–s

Sąsiedztwo łańcuchów aromatycznych oraz formowanie się struktur drugorzędowych.

NMR

Jądrowy rezonans magnetyczny.

s

Dynamika zwijania i rozwijania białka oraz wiązanie białka z substratem.

EPR

Elektronowy rezonans paramagnetyczny.

>0,5 ms

Dynamika zwijania i rozwijania białka oraz wiązanie białka z substratem; w szczególności: informacja „lokalna” i „globalna” o stadiach zwinięcia białka.

Promieniowanie rentgenowskie

Dyfrakcja promieni rentgenowskich.

≥ms

Rozmiary i kształt łańcucha polipeptydowego.

AFM sprzężony ze szczypczykami optycznymi

Spektroskopia sił atomowych wspomagana techniką laserową szczypczyków optycznych.

s

Siły związane ze zwijaniem i rozciąganiem białka oraz stałe czasowe tych procesów mierzone dla pojedynczych molekuł.

1.2. Wiązania chemiczne w biopolimerach

W tabeli 1.2 przedstawiono typowe wartości energii wiązań międzyatomowych występujących w białkach, począwszy od najsilniejszych, jakimi są wiązania kowalencyjne, przez jonowe i wodorowe, po najsłabsze – wiązania van der Waalsa. Energię wiązań podano w najczęściej stosowanych w chemii i biochemii jednostkach kcal ⋅ mol–1 oraz kJ ⋅ mol–1. W ostatniej kolumnie podano wartości energii wiązań w jednostkach fizycznych (eV).

Tabela 1.2. Typowe energie wiązań międzyatomowych w białkach

Rodzaj wiązania

Energia

[kcal/mol]

[kJ/mol]

[eV]

Kowalencyjne

70–100

290–420

1,7–4,4

Jonowe

10

42

0,45

Wodorowe

4–5

17–21

0,18–0,22

Van der Waalsa

1–2

4,2–8,4

0,044–0,088

Za dynamikę układów biologicznych odpowiedzialne są dużo słabsze wiązania niekowalencyjne. Słabe wiązania wewnątrz- i międzycząsteczkowe, inne niż wiązania kowalencyjne obejmują [1.44–1.47] (rys. 1.5, tabela 1.3):

– siły van der Waalsa,

– wiązania wodorowe,

– oddziaływania donorowo-akceptorowe (koordynacyjne),

– oddziaływania efektu hydrofobowego,

– oddziaływania stackingowe π–π,

– oddziaływania kationu z π-elektronami,

– oddziaływania jonowe (jon–jon),

– wiązania disiarczkowe,

– sploty mechaniczne.

Rys. 1.5. Różne rodzaje wiązań niekowalencyjnych

Tabela 1.3. Rodzaje oddziaływań niekowalencyjnych

Rodzaj oddziaływania

Energia wiązania (kJ ∙ mol–1)

Wiązanie

Dyspersyjne (siły Londona) (oddziaływania indukowane diopol-dipol)

> 4,1

Elektronów π-π (stacking)

12,5–20,9

Hydrofobowe (asocjacji niepolarnych składników w polarnych środowiskach)

4,1–40,1

Wodorowe

4,1 (słabe)
4,1–16,7 (silne)
20,9–41,1 (bardzo silne)

Elektrostatyczne (oddziaływania kulombowskie)

4,1–40,1 (dipol-dipol)
40,1–125,5 (jon-dipol)
>188,3 (jon-jon)

Koordynacyjne tworzące trwałe supramolekularne (konglomeraty)

20,9–37,6

Słabe wiązania występują w:

– strukturach helikalnych białek,

– białkach strukturalnych,

– białkach motorycznych,

– kompleksach enzymów z koenzymami,

– kwasach nukleinowych (DNA, RNA).

Stabilność biopolimerów jest zależna od występowania dużej liczby słabych oddziaływań niekowalencyjnych [1.44–1.46]:

– intramolekularnych, zachodzących w jednym łańcuchu polipeptydu,

– intermolekularnych, zachodzących pomiędzy kilkoma łańcuchami, utrzymujących daną konformację układu.

Pomimo że takie oddziaływania mają niewielką energię, struktury konformacyjne są stabilne w normalnych warunkach. Podwyższenie temperatury powoduje zwykle zmniejszenie słabych oddziaływań stabilizujących układy makromolekularne. Zbyt niskie temperatury utrudniają tworzenie się wiązań niekowalencyjnych.

Środowisko odgrywa dużą rolę w utrzymaniu stabilności wiązań niekowalentnych przez:

– tworzenie dużej liczby wiązań wodorowych,

– elektrostatyczne oddziaływania na makrocząsteczki biopolimeru,

– tworzenie kompleksów z przeniesieniem ładunku,

– kompleksowanie przez cząsteczki substancji rozpuszczającej.

1.2.1. Siły van der Waalsa

Siły van der Walsa obejmują [1.47, 1.48] oddziaływania dipol–dipol, siły indukcyjne, siły dyspersyjne.

Oddziaływania dipol–dipol (siły Keesoma):

– dipol elektryczny (rys. 1.6) tworzą dwa równe co do wielkości ładunki elektryczne (q) o przeciwnym znaku, rozdzielone odległością (r);

Rys. 1.6. Schemat dipolu elektrycznego

– elektryczny dipol molekularny jest układem charakteryzującym się trwałym rozmieszczeniem w obrębie cząsteczki wypadkowych ładunków: dodatniego i ujemnego, równych sobie co do wartości bezwzględnej. Wynika on z nierównomiernego rozkładu ładunku elektrycznego w cząsteczce;

– moment dipolowy (m) układu dwóch równych ładunków o przeciwnym znaku jest równy iloczynowi ładunku jednego z biegunów dipola (q) przez odległość między ładunkami +q i –q (długość dipola) (r):

m = q ∙ r

Moment dipolowy (μ) jest wielkością wektorową. Kierunek momentu dipolowego jest od ładunku ujemnego do dodatniego. Moment dipolowy jest miarą stopnia polarności.

Jednostką momentu dipolowego dipola elektrycznego jest kulombometr (C ⋅ m) – moment dipolowy dipola elektrycznego utworzonego przez dwa ładunki różnoimienne +e i –e o wartościach 1 C (kulomb = amperosekunda; 1 C = 1 A ⋅ s), znajdujące się w odległości metra od siebie.

W układzie SI moment dipolowy wyraża się w debajach (D):

1 D = 0,33 ⋅ 10–29 A ⋅ s ⋅ m.

Momenty dipolowe μ mają wartości rzędu od zera do kilku debajów. Moment dipolowy wody μ = 1,84 D. Momenty dipolowe określają polarność wiązań chemicznych (tabela 1.4). W symetrycznie zbudowanych cząsteczkach moment dipolowy jest równy zeru.

Tabela 1.4. Momenty dipolowe i polarność wiązań chemicznych

Wiązanie chemiczne

Moment dipolowy (D)

Polarność wiązania

C–H

C–N

C–O

C=O

C–Cl

C–F

0,2

0,4

0,9

2,5

2,03

1,83

0,04

0,06

0,03

0,42

0,25

–

– siła oddziaływania (efekt dipolowy) (Edip) maleje proporcjonalnie do trzeciej potęgi odległości zgodnie z równaniem

gdzie: μ – moment dipolowy, ε – stała dielektryczna, r – odległość ładunkami.

Moment dipolowy cząsteczek związany jest z obecnością grup polarnych.

Całkowity moment dipolowy cząsteczki jest równy wektorowej sumie wszystkich składowych momentów pochodzących od grup polarnych.

Siły indukcyjne (Debye’a) dzieli się na:

– wewnętrzne, powstające wskutek oddziaływania dipola na cząsteczkę; ich zasięg wynosi 35–50 nm;

– zewnętrzne, powstające przez wprowadzenie cząsteczki zawierającej trwałe momenty dipolowe do pola elektrycznego, co powoduje przesunięcie ładunku (orientację dipoli) w cząsteczce i indukowanie momentu dipolowego w wyniku czego następuje polaryzacja dipolowa (orientacyjna), która zależy od:

• konfiguracji najbliższego sąsiedztwa takich samych dipoli molekularnych,

• energii aktywacji dipoli.

Moment dipolowy indukowany (μind) jest wyrażony wzorem

μind = α E

gdzie: α – polaryzowalność, będąca miarą zdolności do przesuwania ładunków w makrocząsteczce pod wpływem pola elektrycznego o natężeniu E.

Siły indukcyjne są zawsze siłami przyciągania, nie zależą od temperatury.

Siły dyspersyjne (Londona) są wynikiem zaburzenia (fluktuacji) gęstości ładunku w rozkładzie elektronów w jednej makrocząsteczce, powodującego powstanie chwilowego dipolu (zmiennego w czasie), który indukuje następny dipol w innej cząsteczce. W dwóch sąsiednich atomach lub cząsteczkach powstaje wskutek wzajemnego oddziaływania zmiennych dipoli przesunięcie fazowe (wynoszące przy małych odległościach 180°), warunkujące wzajemne przyciąganie.

Siła oddziaływania (efekt dyspersyjny) (Edys) jest proporcjonalna do liczby atomowej i liczby grup funkcyjnych, maleje odwrotnie proporcjonalnie do szóstej potęgi odległości między atomami

gdzie: h – stała Plancka, νo – częstotliwość drgań atomów, α – polaryzowalność, r – odległość między sąsiadującymi atomami.

Siły dyspersyjne są:

– bardzo słabe i nie zależą od temperatury,

– wyraźnie występują w cząsteczkach polarnych,

– zwiększają się ze wzrostem cząsteczki,

– odpowiedzialne za adhezję i kohezję związków niezawierających grup polarnych,

– odpowiedzialne za trwałość układów dyspersyjnych, aglomeracje i podobne procesy.

Wielkość tych sił jest rzędu 1–20 nN. Wykazują one oddziaływania na odległość 0,25–0,5 nm.

Energia wiązań van der Waalsa 4,18–8,37 kJ ⋅ mol–1.

Oddziaływania elektrostatyczne dipol–dipol (kulombowskie) występują między (makro)cząsteczkami polarnymi o asymetrycznym rozkładzie elektronów.

Powstają one w wyniku orientowania się ładunku w cząsteczce lub w segmencie łańcucha polimeru.

Oddziaływania dipol–dipol w biopolimerach są bardzo małe (rzędu 4 kJ ⋅ mol–1) w porównaniu z oddziaływaniem substancji małocząsteczkowych (5–50 kJ ⋅ mol–1).

1.2.2. Wiązania wodorowe

Wiązania wodorowe występują w biopolimerach zawierających:

– grupę protonodonorową, w której silnie elektrododatni atom wodoru H jest połączony z silnie elektroujemnym atomem X, np. atomem tlenu lub azotu;

– grupę akceptorową protonu, w której atom A ma wolną parę elektronową, np. tlenem [1.49–1.73]:

X–Hδ+ ...δ–A

–O–Hδ+ ...δ–O=C<

>N–Hδ+…δ–O=C<

gdzie: X – atom elektroujemny (w porównaniu z H), który ma większą elektroujemność niż atom wodoru, powodując przesunięcie gęstości elektronowej w obrębie wiązania X–H, wynikiem czego jest zwiększony cząstkowy ładunek na atomie wodoru.

Do grup protonodonorowych należą grupy:

– karboksylowa –COOH,

– hydroksylowa –OH,

– tiolowa –SH,

– aminowa –NH_2,

– amidowa –CONH_2,

a w szczególnych przypadkach ≡C–H.

Do protonoakceptorów należą:

F > C=O > C–OH > –C–O–C– > RNH_2 > R_2NH > R_3N

i wszystkie związki zawierające atomy z wolnymi parami elektronowymi.

Mechanizm tworzenia się wiązania wodorowego między atomem wodoru (w grupach protonodonorowych) a atomem tlenu (azotu, fluoru) (w grupach protonoakceptorowych) polega na tym, że wiązanie kowalencyjne między atomem wodoru i tlenu jest bardzo silnie spolaryzowane, w wyniku czego gęstość ładunku elektronowego wokół atomu wodoru jest mała i proton doznaje silnego przyciągania przez wolną parę elektronową tlenu sąsiedniej cząsteczki. Oddziałujące na siebie grupy mają określoną wzajemną orientację.

Wiązanie wodorowe jest tym silniejsze:

– im jest ono bardziej liniowe,

– gdy jednocześnie występuje kilka wiązań wodorowych.

Jest ono wiązaniem kierunkowym, dlatego cząsteczki oddziałujące przez wiązanie wodorowe mogą tworzyć struktury trójwymiarowe.

Wiązania wodorowe wpływają na właściwości wody w różnych stanach skupienia. Opisują je następujące wielkości: d, D, θ, ϕ i r (rys. 1.7 i tabela 1.5).

Rys. 1.7. Definicja geometrycznych parametrów wiązania wodorowego

Wiązania wodorowe dzieli się na kilka kategorii:

– słaby donor–silny akceptor:

>C–H⋅⋅⋅O=C<

>P–H⋅⋅⋅O=C<

– silny donor–silny akceptor:

>NH⋅⋅⋅Ph (grupa fenylowa)

–O–H⋅⋅⋅F–C<

– słaby donor–słaby akceptor:

>C=C–H⋅⋅⋅C≡C–

Wiązanie wodorowe występuje również w układach C–H⋅⋅⋅π, gdzie wiązanie π oznacza donor elektronów.

Siła wiązania wodorowego osiąga maksimum wtedy, gdy grupa protonodonorowa i oś orbitalu wolnej pary elektronowej leżą na jednej prostej i jest odwrotnie proporcjonalna do odległości między X–H i A.

Tabela 1.5. Wielkości opisujące wiązanie wodorowe

Wiązanie wodorowe

Bardzo silne

Silne

Słabe

Energia wiązania

kJ ∙ mol–1

63–167

17–68

4–13<17

kcal ∙ mol–1

1–3

Przykłady

[F⋅⋅⋅H⋅⋅⋅F]¯

[N⋅⋅⋅H⋅⋅⋅N]+ P–OH⋅⋅⋅H=P

O–H⋅⋅⋅O=C< N–H⋅⋅⋅O=C<

O–H⋅⋅⋅O–H

C–H⋅⋅⋅O

O–H⋅⋅⋅π

Długość wiązania

H⋅⋅⋅A–X–H

H⋅⋅⋅A>X–H

H⋅⋅⋅A>>X–H

D(A⋅⋅⋅X) zakres Å

2,2–2,5

2,5–3,2

3,0–4,0

d(H⋅⋅⋅A) zakres Å

1,2–1,5

1,5–2,2

2,0–3,0

θ(X–H⋅⋅⋅A) zakres (°)

175–180

130–180

90–180

Wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe powstaje wówczas, gdy w jednej makrocząsteczce znajdują się grupy protonodonorowa i protonoakceptorowa tak usytuowane przestrzennie, że jest możliwe utworzenie pierścienia 5- lub 6-członowego. Siła wiązania wodorowego zależy od:

– naprężenia w pierścieniu,

– przestrzennej budowy makrocząsteczki,

– względnej kwasowości i zasadowości grup.

Wiązanie wewnątrzcząsteczkowe z udziałem tych samych grup protonodonorowej i protonoakceptorowej jest silniejsze wtedy, gdy w wyniku wiązania wodorowego powstaje pierścień 6-członowy, niż wtedy, gdy tworzą się mniejsze pierścienie. Wiązanie wodorowe jest najsilniejsze wtedy, gdy powstała struktura jest stabilizowana rezonansem.

Siła wiązania zarówno wewnątrz-, jak i międzycząsteczkowego zależy od:

– budowy makrocząsteczki,

– temperatury,

– oddziaływania między grupami funkcyjnymi rozpuszczalnika i polimeru w roztworze,

– stopnia mieszalności ze sobą dwóch różnych polimerów w fazie stałej.

Wiązanie wodorowe, o ile jest obecne, dominuje nad wszystkimi innymi oddziaływaniami wtórnych sił wiążących. Jeżeli wolna para elektronowa akceptora A przebywa w pobliżu protonu, to wiązanie wodorowe nabiera w pewnym stopniu cech wiązania kowalencyjnego, podobnie jak wiązania między ligandami i jonem centralnym w związkach kompleksowych. Odgrywa ono ważną rolę w wiązaniu długich łańcuchów supramolekularnych makrocząsteczek [1.46].

Międzycząsteczkowe wiązania wodorowe powodują asocjację (łączenie się) wielu makrocząsteczek tego samego polimeru ze sobą. Są one jednym z najważniejszych oddziaływań, które determinują tworzenie silnych kompleksów:

– kompleks molekularny pomiędzy donorem i akceptorem (kompleks CT),

– wiązanie wodorowe wewnątrz kompleksu,

– wiązanie wodorowe wewnątrz pary jonowej,

– wiązanie wodorowe wewnątrz pary jonowej z udziałem rozpuszczalnika.

Wiązanie wodorowe łatwo ulega zniszczeniu w środowisku kwasowym i zasadowym.

Właściwości termodynamiczne wiązań wodorowych można wyznaczać metodami:

– spektrofotometrii w podczerwieni,

– widm ramanowskich,

– magnetycznego rezonansu jądrowego,

– pomiarów dielektrycznych,

– mikrokalorymetrii.

1.2.3. Rola wiązania wodorowego w biopolimerach

Najczęściej występującymi oddziaływaniami między makrocząsteczkami biopolimerów są:

– wiązania wodorowe w białkach wykazują wyraźne właściwości kierunkowe. Wiązania wodorowe występują między:

• grupami peptydowymi (a)

• dwiema grupami hydroksylowymi (b),

• naładowaną grupą karboksylową a hydroksylową tyrozyny (c),

• naładowaną grupą aminową z naładowaną grupą karboksylową (d),

• hydroksylową grupą seryny a grupą peptydową (e):

– efekt hydrofobowy (tworzenie jądra hydrofobowego białek globularnych),

– oddziaływania elektrostatyczne (np. tworzenie mostków jonowych pomiędzy różnie naładowywanymi grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych aminokwasów NH_3+⋅⋅⋅COO–,

– tworzenie dupleksów (kopii) DNA.

Wiązania wodorowe wpływają bardzo istotnie na strukturę i właściwości molekuł biologicznych i biopolimerów [1.69–1.73].

W modelach konformacji łańcuchów polipeptydowych i polinukleidowych wiązaniom wodorowym przypisuje się rolę oddziaływań służących wzajemnemu rozpoznawaniu się i przestrzennej orientacji segmentów makrocząsteczki sąsiadujących ze sobą w:

– tym samym łańcuchu (np. α-helisa polipeptydów),

– przeciwległym łańcuchu (np. podwójna helisa DNA)

lub oddalonych od siebie (np. formy globularne).

Wiązania wodorowe są podstawowym czynnikiem utrwalającym informacje genetyczne, gdyż w czasie „powielania” makrocząsteczek kwasu rybonukleinowego (RNA) powstają ściśle dopasowane łańcuchy (w sensie wysycenia wiązań wodorowych), o tym samym uszeregowaniu zasad.

W biopolimerach powstają silne oddziaływania dalekiego zasięgu w wyniku tworzenia się: podwójnych lub potrójnych wiązań wodorowych, które mają zdecydowany charakter kierunkowy (rys. 1.8):

– rozgałęzionych (podwójnych) wiązań wodorowych w dwóch kierunkach

X–H⋅⋅⋅A_1A_2 lub Y–A⋅⋅⋅HX_1 HX_2

– rozgałęzionych (potrójnych) wiązań wodorowych w trzech kierunkach

X–H⋅⋅⋅A_1A_2A_3 lub Y–A⋅⋅⋅HX_1 HX_2HX_3

Rys. 1.8. Rozgałęzione wiązania wodorowe

Podwójne wiązania wodorowe powstają np. między adeniną i tyminą (patrz tom I, rozdz. 1.2. Zasady te wchodzą w skład łańcuchów polinukleotydowych, z których zbudowana jest makrocząsteczka kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA).

Wiązanie wodorowe jest głównym czynnikiem wzajemnego powiązania makrocząsteczek oraz decyduje w znacznym stopniu o budowie (strukturze) ważnych biologicznie biopolimerów, jakimi są:

– białka (zapewniają elastyczność w fibroinie jedwabiu);

– celuloza – włókna celulozowe zawdzięczają swoją wytrzymałość mechaniczną i nierozpuszczalność w wodzie tworzeniu się międzycząsteczkowych wiązań wodorowych między makrocząsteczkami celulozy;

– kwasy nukleinowe DNA i RNA – tworzenie α-helisy, skręcenie łańcuchów i trwałość α-helisy zabezpieczają wiązania wodorowe, tworzące się między imidowymi atomami wodoru N–H (grupa protonodonorowa) i atomami tlenu z grup karbonylowych (C=O) (grupa protonoakceptorowa) (patrz tom I, podrozdz. 1.2);

– biopolimery o strukturach supramolekularnych.

1.2.4. Oddziaływania donorowo-akceptorowe (koordynacyjne)

Oddziaływania donorowo-akceptorowe (koordynacyjne) powstają wówczas, gdy jeden atom (donor) ma swobodną parę elektronową, a drugi (akceptor) ma niezapełnione orbitale elektronowe i dodatnie powinowactwo.

Pojawiają się między dwiema cząsteczkami, z których:

– jedna ma mały potencjał jonizacji i jest dobrym donorem elektronów,

– druga ma duży potencjał jonizacji i jest dobrym akceptorem elektronów.

Między takimi makrocząsteczkami może następować przeniesienie ładunku (Charge Transfer, CT), co oznacza przeniesienie gęstości elektronowej (Electron Density Transfer, EDT) z cząsteczki akceptora na donora.

Na energię oddziaływania donorowo-akceptorowego mają wpływ oddziaływania:

– elektrostatyczne,

– dyspersyjne,

– indukcyjne,

obniżające energię wiązania kompleksu CT. Oddziaływanie to zależy od odległości r–3 (odległość między cząsteczkami). Geometria kompleksu wyznaczana jest poprzez najkorzystniejszy efekt elektrostatyczny.

1.2.5. Oddziaływania stackingowe

Oddziaływania stackingowe π–π (stack) występują w cząsteczkach zawierających wzajemnie płasko ułożone pierścienie aromatyczne, zawierające zdelokalizowane orbitale. Pierścienie aromatyczne ustawiają się równolegle w odległości ok. 3,4 Å, a rozpuszczalnik jest wyparty spomiędzy nich [1.74].

Występują głównie w związkach biologicznych, stabilizując struktury białkowe i kompleksowanie białek, zawierających pierścienie aromatyczne, jak fenyloalanina (Phe), tryptofan (Trp) czy tyrozyna (Tyr).

1.2.6. Oddziaływania jonowe

Oddziaływania jonowe (jon–jon) wynikają z wzajemnego oddziaływania elektrostatycznego jonów przeciwnego znaku: kationu i anionu, które opisuje prawo Coulomba [1.75]

gdzie: U(r) – energia oddziaływania między parą jonów, zi – wartościowość jonu j, e – ładunek elementarny, εo – przenikalność elektryczna próżni εo = 8,85416 ⋅ 10–12 V–1 ⋅ C ⋅ m–1, ε – względna przenikalność elektryczna ośrodka, r – odległość między ładunkami. Współczynnik 4 π εo jest związany z układem SI.

Oddziaływania jon–jon są tym silniejsze, im mniejsze jony je tworzą oraz im większy ładunek elektryczny mają te jony.

Występują głównie w stanie stałym, ponieważ w roztworach następuje ich zaburzenie wywołane obecnością cząsteczek polarnych, które:

– tworzą oddziaływania jon–dipol,

– solwatują jony,

– rozdzielają jony od siebie.

1.2.7. Oddziaływania jon–dipol

Oddziaływania jon–dipol występują wówczas, gdy pole elektrostatyczne wytworzone przez jon wpływa na dipol.

Natężenie pola elektrycznego (I) wytworzonego przez ładunek (q) określa wzór

Energia dipola znajdującego się w polu wytworzonym przez jon o ładunku U(r,Θ), (q) zależy także od orientacji wektora dipola w polu jonu, określonej kątem (Θ) (kątem między kierunkiem dipola a kierunkiem pola jonu). Energię tą określa zależność:

gdzie: μ – moment dipolowy (C ⋅ m).

Oddziaływania jon–dipol odgrywają podstawową rolę w procesie solwatacji (hydratacji) jonów. Występują głównie podczas kompleksowania jonów.

Kation może oddziaływać z π-elektronami w π-kompleksach poprzez wiązania podwójne, potrójne i z pierścieniami aromatycznymi. Zostaje umieszczony ponad środkiem wiązania π lub ponad centrum pierścienia benzenu. W oddziaływaniu tym biorą również udział siły van der Waalsa.

1.2.8. Transport elektronów w układach biologicznych

Transport elektronów w układach biologicznych oraz jego kontrola są bardzo ważne dla:

– procesów metabolicznych (patrz tom I, podrozdz. 2.12.8),

– fotosyntezy (patrz tom I, rozdz.4.6),

– katalizy enzymatycznej (patrz tom I, podrozdz. 2.12.3),

– oddychania,

– działania biochipów i biosensorów.

Transport elektronów odbywa się według dwóch mechanizmów:

– bezpośredni transport elektronów (direct elektron transfer)

– z udziałem mediatora (mediated elektron transfer). Najczęściej stosowanymi mediatorami są:

• metaloenzymy (patrz tom I, podrozdz. 2.12.6),

• związki redoks,

• barwniki cyjankowe,

• błękit metylenowy,

• wiologen metylu,

• kwas wiolurowy,

• metosiarczan fenazyny,

• hydroksybenzotriazol.

Mediator powinien:

– być stabilny w polu elektrycznym,

– szybko i odwracalnie ulegać procesom elektroutleniania i elektroredukcji,

– szybko i odwracalnie reagować z białkiem,

– być odpornym na zmiany pH roztworu,

– nie powodować denaturacji białka,

– nie powodować zmian konformacyjnych białka i jego orientacji,

– nie wpływać na aktywność białka i czas życia białka

– szybko dyfundować przez kanały znajdujące się w białku,

– zwiększać maksymalną szybkość transportu elektronów.

Transport elektronów z udziałem mediatora może być:

– homogeniczny, gdy zarówno mediator jak i białko znajdują się w jednej fazie i mogą swobodnie dyfundować w roztworze,

– heterogeniczny, kiedy mediator (lub białko) jest uruchomiony na elektrodzie wykonanej z:

• samoorganizującej się monowarstwy tiolowej zawierającej odpowiednie grupy funkcyjne (-COOH, -NH2),

• nanowarstw ze srebra, złota czy platyny,

• nanocząstek magnetycznych, które charakteryzują się wysoką zdolnością wiązania białek, a szczególności paramagnetycznych metaloprotein. Łatwo je można wyodrębnić z mieszaniny reakcyjnej za pomocą magnesu;

• nanorurek węglowych, nanowłókien oraz różnego typu nadstruktur węglowych, natomiast druga jest w roztworze.

Ilość unieruchomionego białka, szybkość przebiegu tego procesu oraz stabilność formowanej warstwy zależą od:

– fizycznej charakterystyki białek jak:

• rozmiaru,

• elastyczności,

• ładunku,

– morfologii matrycy na której osadzane jest białko. W przypadku hydrofobowych matryc występuje silniejsze związanie cząsteczek białka niż dla matryc o właściwościach hydrofilowych;

– środowiska w którym zachodzi proces transportu elektronów.

Aby uzyskać trwałe połączenie mediatora (lub białka) z powierzchnią materiału przewodzącego stosuje się:

– pastę węglową,

– związki koloidalne,

– hydrożele,

– polimery półprzewodzące.

W zależności od:

– charakteru matrycy,

– stabilności biocząsteczki,

– właściwości biocząsteczki,

stosuje się różne metody unieruchamiania białek jak:

– adsorpcję fizyczną,

– wiązanie kowalencyjne z matrycą polimeru jak np. poliglikolu etylenowego, celulozy, chityny poprzez grupę karboksylową (-COOH) matrycy oraz grupę aminowa (-NH2) białka, z użyciem karbodiimidu. W wyniku reakcji karbodiimidu z grupami karboksylowymi wytwarza się reaktywny produkt pośredni, którym jest acyloamionoester, który następnie reaguje z grupą aminową białka tworząc wiązanie amidowe

– pułapkowanie, na bazie zol-żel, który jest porowatą matrycą polimerową o zwiększonej powierzchni. Efektywną adsorpcja białek osiąga się gdy wielkość porów jest podobna lub większa od średnicy białek. Duży rozmiar porów prowadzi do małej stabilności białek. Na stabilność układu ma ładunek wewnątrz porów. Kontrola ładunku możliwa jest przez:

– monitorowanie PH środowiska,

– modyfikowanie powierzchni porów różnymi grupami funkcyjnymi, np. aminowymi (-NH2) lub karboksylowym (-COOH),

– pułapkowanie w sieci polimerowej poprzez sieciowanie. Technika ta polega na zmieszaniu monomeru lub polimeru z roztworem białka w obecności czynnika sieciującego. Wadą tej metody jest prowadzenie do denaturacji białka;

– pułapkowanie w żelatynie,

– oddziaływanie na zasadzie powinowactwa. Proces ten może w określonych warunkach być odwracalny.

Kinetyka przeniesienia elektronu pomiędzy dwoma układami redoks określona jest za pomocą siły napędowej to jest różnicy potencjałów.

Występowanie otoczki białkowej uniemożliwia bezpośredni transport na drodze tunelowania.

Cząsteczki muszą posiadać odpowiednią orientację gwarantującą najmniejszą odległość pomiędzy grupami prostetycznymi łańcuchów polipeptydowych. Niewłaściwa orientacja białka oraz możliwy proces jego denaturacji blokuje wymianę elektronów.

1.3. Konformacje strukturalne

1.3.1. Konformacja chiralna

Konformacja chiralna w cząsteczkach aminokwasów czy białek (lub w fragmencie łańcucha peptydowego) wynika z ułożenia atomów w przestrzeni. Nie są one na tyle symetryczne, aby można było je nałożyć na ich odbicia lustrzane (lewej i prawej ręki) (gr. cheir – ręka) [1.76–1.80]. Jeżeli cząsteczka nakłada swoje lustrzane odbicie, to jest ona achiralna.

Gdy w cząsteczce lub w łańcuchu peptydowym występuje asymetrycznie podstawiony atom węgla, tzw. chiralny (stanowiący centrum stereogeniczne lub centrum chiralności), znajdujący się w otoczeniu chiralnym, wówczas związek ten staje się optycznie czynny [1.81–1.83].

Jeżeli w cząsteczce lub w łańcuchu peptydowym występuje więcej niż jedno centrum asymetrii, to liczba izomerów optycznych osiąga wartość 2n, gdzie n jest liczbą centrów asymetrii.

Dwie cząsteczki chiralne, będące względem siebie odbiciami lustrzanymi (ale nie nakładające się na siebie), nazywa się enancjomerami (gr. enantios – przeciwny). Enancjomery wykazują skręcanie, odpowiednio w lewo (–), S (łac. sinister – lewy) i w prawo (+), D (łac. dexter – prawy) przechodzącego przezeń światła spolaryzowanego. Skręcają one płaszczyznę polaryzacji światła zawsze dokładnie o taki sam kąt, ale w przeciwną stronę (rys. 1.9).

Rys. 1.9. Enancjomery skręcające płaszczyznę polaryzacji w: a) prawo (+) i b) lewo (–).

Mieszaninę równomolową dwóch enencjomerów lewo- i prawoskrętnych nazywa się mieszaniną racemiczną. Mieszanina racemiczna nie wykazuje czynności optycznej.

Kierunek skręcania płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego w lewo (–) lub prawo (+), zależy od:

– stereobudowy enancjomeru,

– długości fali światła spolaryzowanego,

– temperatury pomiaru,

– rodzaju użytego rozpuszczalnika,

– stężenia enancjomeru w rozpuszczalniku.

W zależności od sposobu rozmieszczenia podstawników w przestrzeni w odniesieniu do punktu, osi, płaszczyzny lub helisy uzyskuje się chiralność typu:

– centrycznego, w cząsteczkach mających asymetryczne atomy węgla podstawione czterema różnymi atomami lub grupami,

– osiowego, spotykaną w niektórych monomerach nienasyconych, allenach, i cyklicznych,

– planarnego, gdzie płaszczyznę molekularną stanowi wiązanie podwójne,

– helisowego, występującą w biopolimerach (białkach i kwasach nukleinowych):

Prochiralność to właściwość geometryczna achiralnego związku, który może stać się chiralny w następstwie procesów desymetryzacji.

Achiralny związek lub jego część jest nazywany prochiralnym, jeżeli może stać się chiralny w wyniku zastąpienia atomu lub achiralnej grupy innym atomem lub grupą.

Biopolimery optycznie, polimery enancjomeryczne to makrocząsteczki [1.81–1.83]:

– zawierające w łańcuchu powtarzalne centra chiralności,

– przyjmujące asymetryczną konformację helikalną.

Biopolimery enancjomeryczne izotaktyczne mogą tworzyć II- i III-rzędowe struktury chiralne (rys. 1.10). Charakteryzują się one wysokim stopniem uporządkowania morfologicznego i fazowego, pozwalającego na pełnienie ściśle określonych funkcji, np. w przyrodzie – białka.

Rys. 1.10. Powstawanie chiralnych struktur uporządkowanych II- i III-rzędowych (gwiazdka oznacza centrum chiralności)

Biopolimery enancjomeryczne optycznie czynne można otrzymać za pomocą:

– racemicznego rozdziału makrocząsteczek (–) od (+),

– chiralnych katalizatorów – biopolimer chiralny z achiralnego.

Zjawisko chiralności odgrywa bardzo ważną rolę w procesach biochemicznych, takich jak molekularne oddziaływania i mechanizmy procesów komórkowych (metabolicznych). Wiele związków organicznych i biopolimerów jest aktywnych tylko w jednej odmianie konfiguracyjnej, najczęściej lewoskrętnej, podczas gdy odmiana prawoskrętna lub racemiczna jest słabo aktywna lub całkiem nieaktywna. Najlepsze działanie terapeutyczne wykazują aktywne enenancjomery.

Enancjomery rozdziela się metodami:

– ekstrakcji ciecz–ciecz,

– selektywnej krystalizacji frakcyjnej lub krystalizacji w optycznie czynnym rozpuszczalniku,

– chromatograficznymi, stosując chiralne selektory w fazie ruchomej lub chiralne fazy stacjonarne (chemicznie związane na nośniku lub na nim zaadsorbowane cyklodekstryny lub etery koronowe),

– ultrafiltracji przez chiralne membrany,

– elektroforezy kapilarnej.

Do badania związków chiralnych stosuje się pomiary (patrz podrozdz. 4.6):

– skręcalności optycznej przy stałej długości fali,

– dyspersji skręcalności optycznej (Optical Rotatory Dispersion – ORD),

– dichroizmu kołowego (Circular Dichroism – CD),

– polaryzacji kołowej luminescencji (Circular Polarization of Lumiscence – CPL),

– magnetycznej dyspersji skręcalności optycznej (Magnetic Optical Rotatory Dispersion – MORD),

– magnetycznego dichroizmu kołowego (Magnetic Circular Dichroism – MCD).

1.3.2. Konformacja helikalna (spiralna)

Helisa jest konformacją typu spiralnego utworzoną w wyniku oddziaływań składających się na efekt steryczny [1.76, 1.77]. Helisa powstaje w biopolimerach, w których atomy wodoru w łańcuchu polipeptydowym są zastąpione innymi podstawnikami. Obecność tych podstawników powoduje występowanie przeszkód sterycznych, powodujących odchylenie kątowe w uporządkowaniu struktury makrocząsteczki, w wyniku czego tworzy się struktura helikalna. Kolejne skręcenie łańcucha powtarza się co każde trzy mery i jest regularnie powtarzane dookoła wiązań szkieletowych w makrocząsteczce biopolimeru. Konformacja heliakalna umożliwia grupowanie się makrocząsteczek w mikrokryształy w stanie krystalicznym.

Bardziej skomplikowane helisy tworzą niektóre łańcuchy polipeptydowe w elastynie i kolagenie.

Helisy opisuje się za pomocą symboli:

– c – okres powtarzalności w kierunku równoległym do osi łańcucha,

– n – liczba powtarzalnych jednostek konformacyjnych na jeden zwój,

– h – jednostkowa wysokość, tj. translacja wzdłuż osi α-helisy przypadająca na powtarzalną jednostkę konformacyjną,

– t – jednostkowy obrót, tj. kąt rotacji wokół osi helisy przypadający na powtarzalną jednostkę konformacyjną.

Struktura helikoidalna łańcucha polipeptydu jest wystarczająca dla chiralności takiego łańcucha. Helisy makrocząsteczek o dwu przeciwnych skrętach, wynikające z obu przeciwnych konfiguracji pseudochiralnych atomów węgla (C*), są enancjomorficzne względem siebie. Każdy z obu rodzajów helis oddzielnie wykazuje czynność optyczną. Specyficzne właściwości konformacyjne ujawniają się wyłącznie w roztworach wodnych.

1.4. Woda w strukturach biopolimerów

1.4.1. Struktura fizyczna wody

Woda (water) – masa cząsteczkowa 18 Da, długość cząsteczki 0,2 nm. Cząsteczka wody jest spolaryzowana (izotropowa) na skutek dodatniego ładunku +e w pobliżu atomów wodoru (grupa protonodonorowa) i ładunku ujemnego –e w pobliżu atomu tlenu (grupa protonoakceptorowa) (rys. 1.11) [1.84–1.93]. Kształt wody nie jest liniowy lecz trójkątny, co powoduje, że rozkład ładunków jest w niej asymetryczny (rys. 11a). Cząsteczka wody ma dwie grupy protonodonorowe i dwie wolne pary elektronowe (grupy protonoakceptorowe), co prowadzi do powstawania sieci wiązań wodorowych. O występowaniu wiązań wodorowych świadczy wysoka temperatura topnienia wody 0°C i temperatura wrzenia 100°C oraz duże wartości ciepła topnienia 333 kJ ⋅ kg–1 i parowania 2269 kJ ⋅ kg–1 (potrzebne do rozerwania wiązań wodorowych w cząsteczce wody).

Cząsteczka wody jest dipolem elektrycznym, ponieważ zawiera wysoce polarne wiązania tlen–wodór, w których elektrony są silnie przesunięte w stronę atomu tlenu. Powoduje to powstawanie cząstkowych ładunków elektrycznych nad atomami, odpowiednio dodatnich nad atomami wodoru i ujemnych nad atomami tlenu (rys. 1.11a). Dzięki temu ciekłe związki polarne potrafią otaczać inne związki o budowie polarnej i rozpuszczać je na drodze oddziaływania między przeciwnymi cząstkowymi ładunkami elektrycznymi.

Pole elektryczne (rys. 1.11b) wymusza taką orientację cząsteczki wody na swobodnej powierzchni, aby ta swym najsilniejszym polem elektrycznym (fragmentem o największej gęstości linii sił pola elektrycznego) była przyciągana do powierzchni innej fazy, co prowadzi do pojawienia się powierzchniowego potencjału elektrycznego.

Rys. 1.11. Wzór chemiczny wody: a) rozkład atomów, b) dipol elektryczny wody (rozkład gęstości linii pola elektrycznego)

W fazie ciekłej woda ulega samoistnej jonizacji zwanej autodysocjacją zgodnie z reakcją

H_2O + H_2O ↔ H_3O+ + OH–

tworząc kation H_3O+ – jon hydroniowy i anion – jon wodorotlenkowy (OH–).

Równowagę autodysocjacji wody opisuje tzw. iloczyn jonowy wody, który w temp. 20°C ma wartość ok. 10^14 (wielkość bezwymiarowa, lub mol^2 ⋅ kg–2).

Woda nie jest zbiorem samych pojedynczych, poruszających się cząsteczek. Według teorii Némethy-Scheraga struktura wody ciekłej składa się z klastrów (clusters) – obszarów, w których cząsteczki wody są powiązane ze sobą licznymi przypadkowo powstającymi wiązaniami wodorowymi (E = 20 kJ ⋅ mol–1), rozdzielonych od siebie swobodnymi cząsteczkami wody [1.89–1.93]. Klastry (zależnie od temperatury) tworzą asocjacyjne zespoły (H_2O)n, gdzie n = 2, 3, 4, 6, zawierające do 100 cząsteczek wody. Stopniowy rozpad klastrów powoduje, że gęstość wody zwiększa się podczas ogrzewania od temperatury topnienia do 4,14°C.

Klastry odgrywają ważną rolę w:

– przenikaniu cząsteczek wody przez membrany polimerowe (osmoza, dyfuzja),

– adsorpcji na powierzchni biopolimerów,

– mechanizmie i kinetyce wymiany jonowej w roztworach wodnych,

– procesach biochemicznych i metabolicznych.

Cząsteczki wody, na skutek silnej polaryzacji wiązania, tworzą łatwo wiązania wodorowe z innymi cząsteczkami wody (rys. 1.12) i z makrocząsteczkami biopolimerów tworzącymi wiązania wodorowe. Proces ten zależy od temperatury.

Rys. 1.12. Łączenie się cząsteczek wody przy współudziale wiązań wodorowych

W temperaturze od 3,84°C do 4,14°C gęstość wody jest największa, gdyż zawiera ona najwięcej asocjatów dwucząsteczkowych (H_2O)2, które w niższej temperaturze łączą się w zespoły trójcząsteczkowe (H_2O)3, a w wyższej – rozpadają się na pojedyncze cząsteczki H_2O według równania

2 (H_2O)3 ↔ 3 (H_2O)2 ↔ 6 (H_2O)

W temperaturze poniżej i powyżej +4,14°C gęstość wody jest mniejsza od jedności.

Woda ulega łatwiej protonizacji i deprotonizacji niż kwasy, tworząc jon hydroniowy H_3O+. Jon ten również łączy się z wiązaniami wodorowymi, tworząc kation Zundela H_5O_2+, kation Eigena H_9O_4+ i większe aglomeraty.

Woda ma dużą wartość napięcia powierzchniowego 7,2 ⋅ 10–2 N⋅m–1. Wiązanie wodorowe warunkuje zdolność wody do silnego oddziaływania z grupami hydrofilowymi różnych materiałów i ich zwilżania. Zwilżanie szkła przez wodę polega na tworzeniu się wiązań wodorowych między protonami cząsteczki wody a atomami tlenu powierzchni szkła, zawierającego ditlenek krzemu (SiO_2). W podobny sposób woda zwilża biopolimery zawierające w makrocząsteczkach grupy tlenowe (np. celulozę czy skrobię).

Woda absolutnie czysta wykazuje bardzo duży opór właściwy. Słup chemicznie czystej wody o wysokości 1 cm i podstawie 1 cm^2 ma taki sam opór elektryczny jak przewód miedziany o identycznym przekroju, o długości wynoszącej 4 tys. obwodów kuli ziemskiej. Najmniejsze ilości rozpuszczonego CO_2 w wodzie opór ten znacznie zmniejszają. Opór właściwy najczystszej wody wynosi 0,22 ∙ 10^8 Ω ⋅ cm.

Duża wartość napięcia powierzchniowego wody (7,2⋅10–2 N⋅m–1) ma znaczenie przy zwilżaniu powierzchni.

Wodę oczyszczoną (Aqua purificata) otrzymuje się metodami:

– destylacji w aparaturze kwarcowej, platynowej lub srebrnej (stosuje się również podwójną destylację wody w atmosferze pozbawionej ditlenku węgla CO_2),

– wymiany jonowej,

– odwróconej osmozy,

Wodę wysokooczyszczoną (Aqua valde purificata) stosowaną do produktów leczniczych o wysokiej jakości biologicznej, otrzymuje się metodami:

– ultrafiltracji,

– dejonizacji,

– odwróconej osmozy,

– naświetlania UV przed wzrostem drobnoustrojów.

Woda do wstrzykiwań (Aqua ad inictabile) jest wyjałowiona, nie zawiera i drobnoustrojów.

Woda do receptury aptecznej (Aqua pro usu officinale) używana jako rozpuszczalnik w procesie przygotowywania leków recepturowych w aptece to woda wysokooczyszczona.

Woda do rozcieńczania koncentratów do hemodializy (Aqua ad dilutionem solutionum concentratarum ad haemodialysim) to woda wysokooczyszczona.