Autorzy

Przedmowa

Możemy przyjąć, że zasiadając do stołu, zapraszamy do niego nasze mikroorganizmy jelitowe. Z tego powodu podejmowane wybory żywieniowe determinują nie tylko ludzkie zdrowie. Wpływają także na dobrostan superorganizmu, jakim są drobnoustroje tworzące mikrobiotę przewodu pokarmowego.

Coraz mocniej jesteśmy przekonani o tym, że na każdym etapie życia człowieka te dwa światy - świat naszych, ludzkich komórek oraz świat mikroorganizmów jelitowych - przenikają się wzajemnie i są zasilane przez składniki odżywcze. Dieta ma zatem znaczenie dla zmian struktury ekosystemu jelitowego. Wpływa na utrzymanie dużej różnorodności gatunkowej (homeostazę, tzw. eubiozę) lub na nasilenie zmian patologicznych (tzw. dysbiozę). Wiemy, że duża różnorodność gatunkowa mikrobioty jelitowej jest fundamentem zdrowia, jednak dotychczasowe próby opisania "zdrowej" czy "prawidłowej" mikrobioty jelitowej nie przyniosły oczekiwanych rezultatów. Przyczyną jest znaczne zróżnicowanie gatunkowe naszych mikrobiomów jelitowych, uwarunkowane zarówno przebytymi chorobami, żywieniem, farmakoterapią, aktywnością fizyczną, jak i - choć w mniejszym stopniu - czynnikami genetycznymi. Na uwagę zasługuje także zmienność mikrobiomu postępująca wraz ze starzeniem się organizmu. Wydaje się, że skład mikrobioty jelitowej może różnicować ponad 120 czynników egzogennych (tłumaczących istnienie około 18% zmienności w składzie mikroorganizmów jelitowych), spośród których aż 60 jest powiązanych z dietą!

Dlatego z taką radością oddajemy do Państwa rąk tę książkę. Chcieliśmy w rzetelny, a zarazem przystępny sposób przedstawić stan wiedzy na temat mikrobioty jelitowej, aby ułatwić zrozumienie działania tego superekosystemu, a także pomóc w podejmowaniu właściwych wyborów terapeutycznych.

Układ rozdziałów książki nie jest przypadkowy - kolejność przedstawianych treści ma pomóc w poznaniu organizacji i działania ekosystemu mikroorganizmów jelitowych. Każdy kolejny rozdział uzupełnia zasób wiedzy niezbędny do zrozumienia całości. Czytamy o tym, czym są mikrobiom i bariera jelitowa, jak funkcjonuje układ immunologiczny związany z błonami śluzowymi jelita i jak można go modyfikować, czym jest oś jelitowo-mózgowa, a czym - oś jelitowo-wątrobowa. Odrębny rozdział poświęcono metodom bioinformatycznym wykorzystywanym do opisu złożoności i działania ekosystemu mikroorganizmów jelitowych. Niektóre tematy zostały opisane przez specjalistów praktyków: lekarzy, dietetyków, technologów i biotechnologów, jak również farmaceutów, zajmujących się diagnostyką mikrobioty jelitowej oraz terapią żywieniową pacjenta. Pochylono się nad problemami pacjentów z chorobami zapalnymi przewodu pokarmowego, z zespołem jelita drażliwego, osób z dysbiozą przygotowywanych do operacji i operowanych, pacjentów onkologicznych z zaburzeniami mikrobioty jelitowej; wreszcie - pacjentów z zaburzeniami psychicznymi (wynikającymi z nieprawidłowości osi jelito-mózg). Zgłębiono także zagadnienie wpływu składników odżywczych na korzystne modyfikacje mikrobiomu jelitowego, opisano szerzej ideę pro- i prebiotykoterapii, poświęcono uwagę idei wykorzystania preparatów na bazie grzybów w terapii zaburzeń osi jelito-mózg, zwrócono uwagę na potencjalną moc związków polifenolowych w przebudowie mikrobioty jelitowej. Odrębny rozdział poświęcono tym składnikom pożywienia i technikom produkcji żywności, które negatywnie oddziałują na mikroorganizmy jelitowe. A jak na wyczerpujący temat mikrobioty podręcznik przystało - zawiera on rozdział dotyczący przeszczepów mikrobioty jelitowej.

Dla mnie, redaktora naukowego, powodem do ogromnej radości jest lista autorów, którzy zgodzili się podzielić z Państwem swoją wiedzą. Wszyscy są uznanymi autorytetami w swoich dziedzinach, a wielu z nich stosuje tę wiedzę w codziennej pracy z pacjentami. Na liście nie brakuje też młodych, zdolnych naukowców - to napawa optymizmem i daje nadzieję na popularyzację tej fascynującej gałęzi wiedzy przez kolejne lata.

prof. dr hab. n. med. Ewa Stachowska

Słowo wstępne Profesor Lucyny Ostrowskiej

Przedstawiony mi do recenzji podręcznik Żywienie w zaburzeniach mikrobioty jelitowej to pierwsza tego typu pozycja literaturowa dotycząca jakże aktualnego tematu - ludzkiego mikrobiomu. Chociaż temat mikrobioty jelitowej jest w ostatnich latach intensywnie badany, to jednak do tej pory nie było takiej polskojęzycznej pozycji na rynku. Człowiek nosi w swoich jelitach aż 1,5-2,0 kg bakterii, które mają swój własny genom, dlatego warto wiedzieć, jak one funkcjonują w ludzkim organizmie i co trzeba zrobić, aby nie zaburzyć tego porządku, lub jak - w przypadku dysbiozy jelitowej (przewaga bakterii patogennych nad probiotycznymi) - przywrócić tę korzystną dla wszystkich równowagę. Warto się również dowiedzieć, co już na ten temat sprawdzono i potwierdzono naukowo, a czego jeszcze należałoby dociekać w badaniach. Stąd książka, w której autorzy kompleksowo opisują zagadnienia związane z mikrobiotą jelitową w powiązaniu z wieloma aspektami jej funkcjonowania w stanie zdrowia i w trakcie choroby gospodarza, jest ciekawą pozycją dla osób zainteresowanych taką tematyką. Z kolei dla osób pracujących naukowo nad możliwościami modulacji mikrobioty jelitowej - podręcznik ten będzie inspiracją i przeglądem dobrze zebranej literatury naukowej.

Książka ma przejrzysty układ - podzielono ją na trzy części: "Oś jelito-wątroba", "Oś jelito-mózg" oraz "Stymulacja osi jelito-wątroba-mózg".

Część pierwsza rozpoczyna się od bardzo dokładnego opisu, czym są mikrobiota jelitowa i bariera jelitowa oraz czym się charakteryzuje mikrobiota zdrowego człowieka. W następnym rozdziale zostały bardzo przejrzyście i w prosty sposób przedstawione metody bioinformatyczne wykorzystywane w analizie mikrobiomu jelitowego. Bardzo mało jest tego typu pozycji na polskim rynku i dlatego wydaje mi się, że tę część należałoby uznać wręcz za unikatową. Kolejni autorzy książki piszą o funkcjach układu immunologicznego związanego z błonami śluzowymi jelit, o biomarkerach dysfunkcji jelitowej, cechach zaburzonej mikrobioty w przebiegu chorób zapalnych jelita oraz o wykorzystaniu żywności specjalnego przeznaczenia. W tej części podręcznika znajdziemy także rozdział dotyczący budowy i funkcji osi jelitowo-wątrobowej oraz oczywiście rozdział o roli żywienia w aspekcie utrzymania prawidłowej funkcji jelita. Nie zabrakło również wyjaśnienia, w jaki sposób poszczególne składniki pożywienia modulują funkcję mikrobioty jelitowej, co pozwala zrozumieć fragmenty książki poświęcone żywieniu osób z zaburzonymi funkcjami mikrobioty jelitowej. Ponadto godny uwagi jest opis przygotowania pacjenta (z chorobami zapalnymi jelit) do zabiegu operacyjnego - to zagadnienie, określane mianem prerehabilitacji, jest bardzo silnym oraz uznanym trendem we współczesnej opiece żywieniowej. Jako lekarza i dietetyka klinicznego ogromnie zaciekawił mnie rozdział dotyczący modyfikacji mikrobiomu w onkologii, w którym autorzy przedstawiają niezmiernie trudne tematy - rolę mikrobiomu w onkogenezie oraz charakterystykę zmian mikrobiomu w konkretnych nowotworach, jak również zachowanie się mikrobiomu przy zastosowaniu konkretnego leczenia przeciwnowotworowego.

Kolejna część książki traktuje o osi jelito-mózg. To jeden z najbardziej obecnie eksplorowanych obszarów wiedzy o mikroorganizmach jelitowych. Autorzy w sposób bardzo merytoryczny i uporządkowany przedstawiają kolejne aspekty funkcjonowania tego niezwykle złożonego układu powiązań między mikroorganizmami jelitowymi a układem nerwowym. Mamy tu rozdziały napisane przez naukowców zajmujących się badaniami mikrobioty jelitowej, ale także przez lekarzy psychiatrów i dietetyka klinicznego, co pozwala na bardzo wyczerpujące przedstawienie zarówno mikrobiologicznego tła chorób psychicznych, jak i praktycznego działania na rzecz poprawy funkcji mikrobioty jelitowej u chorych psychicznie (z lękiem, stresem, depresją, chorobą afektywną dwubiegunową, schizofrenią, a także z zaburzeniami związanymi z używaniem substancji psychoaktywnych, zaburzeniami ze spektrum autyzmu, z jadłowstrętem psychicznym). Ponadto znajdujemy tu przegląd badań mikrobiomu w psychiatrii i potencjalne kierunki leczenia zaburzeń psychicznych ukierunkowane na modulację mikrobioty jelitowej oraz opis zależności między leczeniem przeciwpsychotycznym a zmianami mikrobioty.

Ostatnia część książki to prawdziwa kopalnia wiedzy o substancjach stymulujących mikrobiotę jelitową. Mamy tu informacje o występujących w naturze węglowodanach (zawartych np. w grzybach, błonniku roślinnym oraz roślinach prozapalnych), naturalnych produktach roślinnych mających modulujący wpływ na mikrobiotę jelitową - czyli o działaniu prebiotycznym. Bardzo rozbudowany rozdział opisujący psychobiotyki wprowadza czytelnika w opis działania konkretnych szczepów bakteryjnych, mających potencjalne zastosowanie w terapii żywieniowej pacjentów z zaburzeniami osi jelito-wątroba-mózg. Niejako uzupełnieniem tego rozdziału jest kolejny - poświęcony zagadnieniu transferu mikrobioty jelitowej (wybór dawcy, drogi podania, wskazania i przeciwwskazania, bezpieczeństwo terapii). Na koniec możemy przeczytać o wpływie dodatków wykorzystywanych w produkcji żywności na skład i funkcję mikrobiomu jelitowego.

Jeśli ktoś z nas myślał, że może bez problemu zaplanować terapię żywieniową pacjenta z dysbiozą jelitową, to dopiero po lekturze tego podręcznika nabierze należytej pokory. Zachęcam jednakże do przeczytania tej książki nie tylko tych, którzy starają się jak najlepiej pomóc swoim pacjentom, lecz także wszystkich chcących żyć w zgodzie ze swoimi bakteriami jelitowymi.

prof. dr hab. n. med. Lucyna Ostrowska

1Mikrobiota jelitowa układu pokarmowego w stanie eubiozy i dysbiozy. Bariera jelitowaWojciech Marlicz, Anna Gudan

MIKROBIOTA JELITOWA I JEJ FUNKCJE

Przewód pokarmowy człowieka zamieszkują miliony mikroorganizmów, w tym bakterie, archeony, wirusy i eukariota. Nazywamy je mikrobiotą jelitową. Terminy "mikrobiota" i "mikrobiom" często stosuje się zamiennie, jednak ten pierwszy powinien mieć odniesienie do zespołu organizmów, a drugi - do zespołu ich genomów. Poza przewodem pokarmowym mikrobiotę i mikrobiomy można również odnaleźć w drogach oddechowych, rodnych, moczowych oraz na skórze i włosach człowieka. Pojawiają się także prace, które nawiązują do mikrobiomu krwi, w których autorzy poszukują bakterii czy produktów przemiany ich materii w układzie krwiotwórczym i szpiku kostnym.

Główne typy bakterii mikrobioty przewodu pokarmowego to Firmicutes oraz Bacteroidetes i mniej liczne Proteobacteria, Actinobacteria i Fusobacteria. Bakterie tlenowe (głównie Enterococcus i Enterobacteriaceae) stanowią mniejszość. Mikrobiota jelitowa ulega nieustannym przemianom w trakcie życia człowieka. Jej skład zaczyna się kształtować w czasie życia płodowego i porodu, a następnie zmienia się w zależności od sposobu karmienia dziecka i jego diety w kolejnych latach. Te nieustanne zmiany, czasem bardzo dynamiczne, służą szybkiej adaptacji do zmiennych warunków środowiskowych oraz zachowaniu homeostazy (ilościowej i jakościowej), tak aby zapewnić gospodarzowi optymalne zdrowie. Skład mikrobioty jelitowej u każdego człowieka jest inny (podobnie jak linie papilarne), a można go ustalić, wykonując badania molekularne (np. sekwencjonowanie nowej generacji; next generation sequencing - NGS). Inne metody pomocne w ocenie składu i funkcji metabolicznej mikrobioty to m.in. cytometria przepływowa, chromatografia gazowa, spektrometria mas czy mikroskopia konfokalna.

Mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w procesie trawienia i pozyskiwania energii z pożywienia. Odpowiada za fermentację niestrawionych składników pokarmowych oraz produkcję ochronnego śluzu w nabłonku jelitowym. Jest źródłem licznych enzymów, niezbędnych w ogólnoustrojowych procesach metabolicznych, a także dojrzewaniu i funkcjonowaniu układów immunologicznego i nerwowego. W kontekście zaburzeń metabolicznych mikrobiota bierze udział w trawieniu pokarmów i przyswajaniu energii oraz w pracy bariery jelitowej. Pełni również dwie inne funkcje, które wzajemnie się uzupełniają - troficzną oraz immunologiczną.

Bakterie jelitowe wykazują metaboliczną aktywność, rozkładając niestrawione resztki pokarmowe w procesie fermentacji. Produktami tych przemian są m.in. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Metabolity te utrzymują strukturę i funkcję troficzną nabłonka jelitowego (epithelium). Faecalibacterium prausnitzii i bakterie z rodzaju Clostridium oraz Butyrivibrio i Eubacterium produkują m.in. maślany. Mikrobiota jelita cienkiego bierze udział w syntezie i metabolizmie witamin, głównie K oraz z grupy B. Ponadto mikrobiota jelitowa zwiększa przyswajalność składników mineralnych, wytwarzając hydrolazy, które odgrywają rolę w procesie trawienia lipidów.

Mucyny wydzielane przez niektóre bakterie probiotyczne chronią barierę jelitową przed patogenami i toksynami, zapobiegając ich przenikaniu do wątroby i układu krążenia. W ten sposób bakterie komensalne zapobiegają kolonizacji narządów i tkanek przez bakterie chorobotwórcze. W procesie tym odgrywają ważną rolę białka przeciwdrobnoustrojowe produkowane przez mikroorganizmy jelitowe, tzw. bakteriocyny. Inne produkty fermentacji bakteryjnej (np. jony wodorowe) stanowią element wrodzonego układu odpornościowego (innate immunity). Receptory TLR (toll-like receptors) oraz domeny NOD (nucleotide oligomerisation domain) stanowią część tkanki limfatycznej przewodu pokarmowego GALT (gut associated lymphoid tissue) i uczestniczą w eliminacji szkodliwych antygenów z przewodu pokarmowego oraz wytwarzaniu tolerancji wobec bakterii komensalnych i antygenów żywności.

ROLA KRÓTKOŁAŃCUCHOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (short-chain fatty acids - SCFA) to produkty przemiany metabolizmu mikroorganizmów bytujących w jelicie. Do głównych SCFA zalicza się trzy kwasy: octowy, propionowy i masłowy. Są one wytwarzane w przewodzie pokarmowym w największej ilości - w stosunku 60 : 25 : 15. Zawartość SCFA w świetle jelita może się zmieniać, w zależności od aktualnie stosowanej diety, stanu zdrowia, aktywności fizycznej i czynników związanych ze stylem życia. Skład i ilość wytwarzanych kwasów najbardziej zależą jednak od dostarczania włókna pokarmowego wraz ze zwyczajową dietą.

Ze względu na największe zgromadzenie mikroorganizmów w obrębie dystalnej części jelita grubego można tam obserwować największą ilość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Funkcje SCFA są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania bariery jelitowej, szczególnie dla utrzymania jej integralnej struktury. Kwas masłowy wydaje się mieć tutaj największe znaczenie - stanowi skuteczne źródło energii dla szybko dzielących się komórek nabłonka jelit, dzięki czemu zapewnia prawidłowe funkcjonowanie mikroskopijnej bariery jelitowej. Ponadto wykazuje działanie hamujące względem deacetylazy histonów, co przekłada się na epigenetyczne działanie tego związku, a także możliwe działanie przeciwnowotworowe. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe mają również zdolność do przekraczania bariery krew-mózg (blood brain barrier) i wykazują działanie modulujące oś jelitowo-mózgową. Ten aspekt stanowi istotny element w podejściu do chorób neurologicznych oraz zaburzeń neuropsychiatrycznych. Inną rolą SCFA jest udział w dojrzewaniu komórek układu odpornościowego w szpiku kostnym i regulacja transportu tych komórek do odległych narządów i tkanek.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe mogą wykazywać swoje funkcje lokalnie w jelicie oraz globalnie - po wchłonięciu do krwiobiegu. Wchłanianie to odbywa się przez monokarboksylowe transportery umieszczone w nabłonku jelitowym. Po wniknięciu do komórki SCFA włączają się w energetyczne szlaki metaboliczne, co skutkuje pokryciem nawet w 60% całkowitego zapotrzebowania na energię dla komórek jelit. Niewielka ilość SCFA, która nie uległa przemianom wewnątrzkomórkowym, dostaje się do krwiobiegu oraz do bardziej odległych tkanek, w których może pełnić funkcje metaboliczne. Są to m.in.: niwelowanie stanu zapalnego indukowanego bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS), bezpośrednia modulacja odporności systemowej, poprawa insulinowrażliwości, regulacja łaknienia, indukcja dyferencjacji tkanki tłuszczowej (beżowienie), zwiększenie wydatków energetycznych (termogeneza) czy również zwiększenie lipolizy. Tak szeroki i plejotropowy wpływ SCFA na organizm gospodarza powoduje, że wydają się one istotnym czynnikiem regulującym metabolizm gospodarza zarówno lokalnie, jak i globalnie.

Ciekawym przykładem zmiany metabolizmu w przypadku choroby jest tzw. paradoks maślanu. Kwas masłowy używany jest preferencyjnie przez zdrowe komórki jelit i powoduje ich optymalny wzrost, jednak u osoby z nowotworem komórki jelitowe wykorzystują jako główne źródło energii glukozę i trzykrotnie bardziej akumulują kwas masłowy, aniżeli go utylizują, co najpewniej związane jest z preferowaną funkcją kwasu masłowego jako inhibitora deacetylazy histonowej (hictone deacetylase - HDAC) w komórkach chorych.

Funkcje SCFA są również ściśle związane z ich oddziaływaniem na receptory GPR różnych komórek. Końcowy efekt zależy zarówno od rodzaju receptora GPR, jak i od rodzaju samej komórki. Kwas masłowy ma potencjał modulowania aktywności jelitowego układu nerwowego (enteric nervous system - ENS). Receptor GPR41, którego maślan jest ligandem, wykazuje ekspresję w ENS. Dostarczenie błonnika pokarmowego w postaci skrobi opornej lub doodbytniczy wlew kwasu masłowego powoduje aktywację neuronów cholinergicznych, a także zwiększa aktywność motoryczną jelit. W przeciwieństwie do kwasu masłowego propionian może działać odwrotnie - redukując motorykę przewodu pokarmowego, jednak wciąż propionian zwiększa ilość wazoaktywnego peptydu jelitowego. Oprócz oddziaływania na trzewny system nerwowy SCFA mają zdolność stymulacji neuronów obwodowych, a nawet mózgu. Przykładowo stymulacja obwodowych neuronów współczulnych może skutkować zwiększeniem ilości noradrenaliny i aktywności fizycznej oraz przyspieszeniem bicia serca, co jednocześnie zwiększa wydatek energetyczny. Wykazano też, że maślan utylizowany przez komórki tłuszczowe powoduje wzrost adiponektyny, zwiększenie wychwytu glukozy i poprawę wrażliwości insulinowej. Ponadto powoduje inhibicję lipolizy i indukuje tworzenie triglicerydów, dzięki czemu może mieć potencjał prewencyjny w kontekście hiperlipidemii i hiperglikemii.

Kwas octowy zaaplikowany dożylnie ma zdolność przekraczania bariery krew-mózg i wykazuje wtedy działanie hamujące łaknienie. Kwas octowy po wchłonięciu może również wykazywać istotny wpływ na metabolizm cholesterolu, ponieważ jest pierwszorzędowym substratem w jego biogenezie. Istnieje również powiązanie pomiędzy kwasami tłuszczowymi a dojrzewaniem komórek mikrogleju w mózgu. Wydaje się, że proces ten zależy od receptorów GPR43. SCFA mają potencjał do regulowania przepuszczalności nie tylko bariery jelitowej, lecz także bariery krew-mózg, co powiązane jest ze zwiększoną ekspresją okludyny w korze czołowej i podwzgórzu. Dożylne dostarczanie kwasu masłowego chroni ciągłość bariery krew-mózg oraz stymuluje angio- i neurogenezę.

ROZGAŁĘZIONE KRÓTKOŁAŃCUCHOWE KWASY TŁUSZCZOWE - METABOLITY GNILNE

Niskie spożycie błonnika pokarmowego może doprowadzić do większego rozkładu białka pokarmowego przez bakterie, co skutkuje powstaniem rozgałęzionych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (branched chain fatty acids - BCFA) oraz toksyn gnilnych. Niestrawione białko, które dociera do dystalnych części jelita, rozkładane jest przez enzymy bakteryjne do peptydów i aminokwasów. Badania wykazują, że bakterie wykorzystują raczej peptydy niż wolne aminokwasy, ze względu na większą wydajność energetyczną tego procesu.

Aminokwasy, które przedostaną się do cytozolu bakteryjnego, mogą tam zostać wbudowane w proteiny lub zmetabolizowane z wytworzeniem bioaktywnych produktów końcowych w ściśle specyficznych reakcjach biochemicznych, m.in. deaminacji i dekarboksylacji. Podczas deaminacji powstają amoniak i ketokwasy. Wyprodukowany amoniak może służyć jako donor azotu dla bakteryjnego metabolizmu lub jest wydalany do światła jelita. Ketokwasy zaś mogą zostać wykorzystane do syntezy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, w tym maślanu, octanu, propionianu, mleczanu, bursztynianiu i kwasu mrówkowego. Aminokwasy siarkowe podczas rozkładu uwalniają siarkę. Nie wszystkie aminokwasy mogą podlegać procesowi fermentacji gnilnej, a najchętniej utylizowane w tym procesie są: glutaminian, arginina, glicyna, seryna, fenyloalanina i tyrozyna, w nieco mniejszej ilości: tryptofan, asparaginian i alanina.

Główne BCFA to kwas izowalerianowy i izomasłowy. Ich obecność w świetle jelita jest możliwa wyłącznie na drodze bakteryjnej fermentacji gnilnej, dlatego może w przyszłości stanowić istotny czynnik mówiący o stopniu nasilenia bakteryjnej proteolizy. BCFA zostały powiązane z występowaniem insulinooporności.

Bakteryjna fermentacja węglowodanowych substratów u człowieka zachodzi głównie w proksymalnej części jelita grubego, z mniejszym nasileniem w części dystalnej. W związku z tym do dystalnej części jelita grubego dociera znacznie mniej biofermentowalnych substratów, co też powoduje pewne zmiany biomów pomiędzy tymi odcinkami przewodu pokarmowego. Substraty białkowe, które docierają do jelita grubego, stanowią zbiór protein pochodzących od samego gospodarza, będących obumarłym nabłonkiem, komórkami mikroorganizmów, a także - przede wszystkim - z samego nie w pełni strawionego pokarmu.

Bakteryjna fermentacja proteolityczna prawdopodobnie może się zaczynać już w świetle jelita cienkiego. Wydaje się, że aminy biogenne i poliaminy produkowane przez mikrobiotę jelitową mają dwojakie działanie. Z jednej strony wpływają pozytywnie na wzrost komórek, proliferację i metabolizm komórkowy, z drugiej zaś strony zostało udowodnione, że zwiększają zapalenie lokalnie, a także powodują uszczuplenie warstwy śluzowej i negatywnie wpływają na komórki trzustki. Wydaje się, że działanie poliamin będzie ściśle zależne od ich stężenia.

Fermentacja proteolityczna, która ma miejsce w jelicie cienkim, może wpływać na ogólną pulę aminokwasów, które są wchłaniane do krwiobiegu gospodarza. Podczas patologicznych warunków i złej kondycji zdrowotnej gospodarza obserwuje się wzrost bakterii proteolitycznych, a w szczególności Klebsiella i Escherichia coli. Bakterie te mają silne zdolności proteolityczne, a ich zwiększona aktywność może doprowadzić do uszczuplenia puli aminokwasów dostępnych dla gospodarza. Same zaś produkty metabolizmu wyżej wymienionych bakterii mogą jeszcze bardziej nasilać lokalne zapalenie. Z kolei przerosty bakterii gnilnych w jelicie cienkim mogą być powiązane z uszczupleniem puli białka biodostępnego dla organizmu gospodarza.

BARIERA JELITOWA

Budowa i funkcje

Bariera jelitowa jest mikroskopijną strukturą zlokalizowaną w układzie pokarmowym człowieka. Jej główną funkcję stanowi kontrola interakcji między organizmem gospodarza a czynnikami zewnętrznymi. Funkcje bariery jelitowej są ściśle powiązane ze składem jakościowo-ilościowym mikrobiomu jelitowego, a także z jego funkcją. Bariera jelitowa umożliwia kontakt gospodarza z antygenami znajdującymi się w świetle jelita. W komórkach nabłonka jelit intensywnie zachodzą procesy wchłaniania składników odżywczych, a także procesy odpornościowe. Możemy zatem przyjąć, że bariera jelitowa w przewodzie pokarmowym człowieka reguluje jego podstawowe procesy fizjologiczne:

- zapewnia transport niezbędnych dla życia płynów, elektrolitów i substancji odżywczych;

- zapobiega wchłanianiu substancji toksycznych, patogenów oraz cząstek potencjalnie immunogennych;

- koordynuje pracę układów:

- immunologicznego,

- hormonalnego,

- układu nerwowego.

Bariera jelitowa umożliwia selektywność wchłaniania w warunkach fizjologicznych. Badania naukowe wskazują, że zaburzenia funkcji bariery jelitowej oraz zmiany w jej przepuszczalności mogą się istotnie przyczyniać do wielu różnych jednostek chorobowych o podłożu zapalnym.

W skład bariery jelitowej wchodzą takie elementy, jak:

- mikrobiota;

- ochronna warstwa śluzu;

- komórki nabłonka jelitowego (gut epithelial barrier);

- komórki nabłonka naczyniowego (gut vascular barrier);

- komórki układu limfatycznego (gut lymphatic vessels).

Bariera jelitowa to struktura fizjologiczna umożliwiająca przede wszystkim prawidłowe wchłanianie substancji pokarmowych, ale stanowi ona również ochronę przed wniknięciem do krwiobiegu substancji toksycznych, patogennych oraz potencjalnie chorobotwórczych. Zapobiega to nadmiernej aktywacji układu immunologicznego, a co za tym idzie, chroni m.in. przed rozwojem stanów zapalnych w przewodzie pokarmowym oraz innych narządach i tkankach. Jej prawidłowe funkcjonowanie opiera się na ścisłym przyleganiu do siebie komórek jelita - enterocytów, tak aby transport substancji odbywał się tylko drogą przezkomórkową, co umożliwia selektywność wchłaniania. Jest to możliwe dzięki połączeniom ścisłym, tzw. tight junctions.

Od strony światła jelita bariera jelitowa styka się z jednym z najbardziej zróżnicowanych ekosystemów - z mikrobiotą jelitową. Jest to zespół mikroorganizmów zawierający ponad 1200 różnych gatunków, z czego przeważającą większość stanowią gatunki zmienne. Skład i funkcja mikrobioty jelitowej zależy od wielu czynników wewnętrznych, takich jak:

- odczyn pH kwasu żołądkowego;

- wydzielanie żółci;

- ilość i jakość enzymów trawiennych.

Do czynników zewnętrznych niekorzystnie wpływających na skład mikroorganizmów jelitowych, a przez to na stan i pracę bariery jelitowej można zaliczyć m.in.:

- dietę;

- stres;

- zakażenia;

- leki;

- alkohol.

Zaburzenia w działaniu

Sprawność działania bariery jelitowej zmniejsza się wraz z wiekiem i u osób starszych często obserwujemy zaburzenia jej funkcji. W wielu chorobach przewlekłych, w których znaczenie mają czynniki środowiskowe, występują zaburzenia mikrobioty oraz struktury i funkcji bariery jelitowej.

W wyniku ekspozycji enterocytów na działanie czynników wyzwalających wytwarzanie zonuliny - m.in. glutenu czy lipopolisacharydów - połączenia ścisłe między tymi komórkami słabną, a enterocyty mniej ściśle do siebie przylegają, co powoduje transport substancji drogą międzykomórkową i wywołuje niepożądane reakcje układu immunologicznego. Inny mechanizm powodujący wzrost przepuszczalności bariery jelitowej to aktywacja układu beta-katenina/Wnt przez bakterie patogenne, np. Salmonella typhimirum w jelicie cienkim.

Wpływ glutenu

Gluten u osób wrażliwych z predyspozycją genetyczną (osoby będące nosicielami genu HLA DQ2/DQ8) może być przyczyną rozwoju choroby trzewnej (celiakii), w wyniku przewlekłej reakcji autoimmunologicznej prowadzącej do niszczenia kosmków jelitowych w jelicie cienkim. Celiakia przyczynia się do powstania zespołu złego wchłaniania. Osoby z tym objawem mogą zgłaszać problemy ze skórą oraz zaburzeniem szkliwienia zębów i mineralizacji kości, dochodzi też do rozwoju osteopenii i osteoporozy. Poza tym u osób z celiakią, które nie stosują diety bezglutenowej, możemy obserwować niedokrwistość z niedoboru żelaza i niedobór witamin z grupy A, D, E, K i B. Również osoby z nadwrażliwością na gluten, niekoniecznie chorujące na celiakię, zgłaszają niekiedy różne zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego, takie jak wzdęcia, problemy z wypróżnianiem czy ból brzucha. Nierzadko objawom tym towarzyszą zmęczenie, bóle mięśni i stawów.

U młodych kobiet mogą wystąpić problemy z płodnością. Problemy z zajściem czy donoszeniem ciąży u kobiet stanowią czasem jedyne objawy choroby trzewnej. Z chorobą trzewną, a także zaburzeniami mikrobioty jelitowej współwystępują niekiedy inne choroby autoimmunologiczne, np. choroba Hashimoto (przewlekłe zapalenie tarczycy) czy cukrzyca. Szacuje się, że w naszej populacji w przybliżeniu 1% osób może mieć celiakię, a około 10% - rozwijać nadwrażliwość na gluten (tzw. nietolerancję glutenu).

W leczeniu stosuje się dietę bezglutenową. Nie zaleca się spożywać alkoholu, który ma właściwości uszkadzające barierę jelitową. Korzystne działanie u pacjentów z celiakią mogą mieć pre- i probiotyki o działaniu wzmacniającym barierę jelitową. W badaniach wykazano, że niektóre bakterie Gram-ujemne uwalniają enzymy, które tak degradują peptydy gliadyny, że produkty ich przemiany są wysoce immunogenne. U osób z celiakią stwierdzono m.in. niedobór pałeczek kwasu mlekowego na powierzchni błon śluzowych dwunastnicy i jelita cienkiego.

Wpływ lipopolisacharydów

Lipopolisacharydy (LPS), nazywane też endotoksynami, wywołują wiele innych niż gluten niekorzystnych zmian w organizmie. Do najważniejszych można zaliczyć:

- zaburzenia pasażu jelitowego;

- większe, bardziej efektywne pozyskiwanie energii z pożywienia;

- spowolnienie procesów spalania tkanki tłuszczowej;

- spowolnienie utylizacji kwasów tłuszczowych w wątrobie i mięśniach.

Procesy wymienione powyżej ułatwiają z kolei magazynowanie energii z pożywienia w tkance tłuszczowej.

Wywołując odpowiedź zapalną w organizmie, LPS oddziałują niekorzystnie na układ immunologiczny. Procesom tym mogą towarzyszyć zaburzenia w metabolizmie glukozy w tkankach obwodowych (wątroba, mięśnie szkieletowe i tkanka tłuszczowa) i rozwój insulinooporności.

Innym niekorzystnym działaniem LPS może być bezpośrednie uszkodzenie śródbłonka naczyń krwionośnych w przewodzie pokarmowym i w naczyniach krążenia obwodowego. Śródbłonek naczyniowy w przewodzie pokarmowym pod wpływem stymulacji LPS zwiększa swoją przepuszczalność. W wyniku tego nawet duże cząsteczki, np. bakterie, przenikają ze światła jelita do krążenia wrotnego, wątroby, a następnie do krążenia ogólnoustrojowego. Prowadzi to do nasilenia zmian zapalnych w wątrobie (stłuszczeniowe lub metaboliczne zapalenie wątroby - non-alcoholic steatohepatitis lub metabolic steatohepatitis) i miażdżycy w dużych naczyniach obwodowych. Konsekwencją miażdżycy są groźne dla życia i zdrowia powikłania: choroba niedokrwienna serca, zawał mięśnia sercowego, nadciśnienie tętnicze - choroby będące główną przyczyną zgonów w Polsce i całej Europie. Według danych GUS (Główny Urząd Statystyczny) choroby układu krążenia są najczęstszą przyczyną zgonów osób powyżej 60. roku życia. Jelitowa bariera naczyniowa w przewodzie pokarmowym jest podobna do bariery krew-mózg. Zaburzenia bariery jelitowej mogą więc mieć związek z chorobami ośrodkowego układu nerwowego, takimi jak autyzm, demencja, choroba Parkinsona czy innymi groźnymi powikłaniami naczyniowymi prowadzącymi do udaru mózgu.

Wpływ trimetyloamin

Lipopolisacharydy to nie jedyne szkodliwe substancje pochodzenia bakteryjnego o działaniu toksycznym w ludzkim organizmie. Pod wpływem fermentacji bakteryjnej w jelitach powstają produkty przemiany materii, które mogą poprzez krążenie wrotne być uwalniane do krążenia ogólnoustrojowego. Do takich metabolitów należą tzw. trimetyloaminy (tzw. TMA). TMA powstają w jelitach w wyniku fermentacji bakteryjnej niektórych produktów spożywczych. Źródłem TMA w pożywieniu są pokarmy zawierające cholinę, fosfatydylocholinę, lecytynę, karnitynę i betainę. Pokarmy bogate w te substancje to m.in. czerwone mięso, ryby, jajka, czekolada, a także soczewica, czerwone buraki, szpinak czy popularne produkty zbożowe. TMA pod wpływem enzymów wątrobowych ulegają utlenieniu w wątrobie do tzw. trimetyloamin N-oxide (TMAO). TMAO są uwalniane do krążenia, uszkadzają naczynia krwionośne i biorą udział w procesie tworzenia blaszek miażdżycowych.

Zaburzenia mikrobioty jelitowej u pacjentów z zespołem jelita nadwrażliwego i innymi chorobami

Niekorzystne zmiany w mikrobiocie jelitowej, a zatem jej destabilizacja, znacząco pogarsza funkcjonowanie bariery jelitowej oraz powoduje stan zapalny in situ, co zdecydowanie zwiększa również ryzyko wystąpienia zespołu jelita nadwrażliwego, zespołu jelita przesiąkliwego (leaky gut syndrome - LGS). Obecnie badania naukowe wskazują na coraz większą rolę LGS zarówno w patogenezie, jak i przebiegu innych chorób o podłożu zapalnym i metabolicznym. Przykładowe prace, w których opisano zaburzenia mikrobioty jelitowej u pacjentów z zespołem jelita nadwrażliwego, zestawiono w tabeli 1.1, natomiast związek zaburzeń mikrobioty i bariery jelitowej z chorobami przewodu pokarmowego, metabolicznymi i psychicznymi przedstawiono na rycinie 1.1.

Tabela 1.1. Przykładowe badania, w których opisano zaburzenia mikrobioty jelitowej u pacjentów z zespołem jelita nadwrażliwego

Kraj badania

Kryteria rozpoznania IBS*

Liczba badanych

Kobiety

Wiek

Badana próbka

Metoda analizy mikrobioty

Wynik końcowy

Dane źródłowe

Zespół jelita nadwrażliwego (irritable bowel syndrome - IBS)

Finlandia

Kryteria rzymskie II

24

19 (79,2%)

47,3

stolec

sekwencjonowanie 16S rRNA

spadek liczby Collinsella aerofaciens, Clostridium cocleatum i Coprococcus eutactus

Gastroenterology 2007; 133(1): 24-33

Szwecja

Kryteria rzymskie II

37

26 (70,3%)

37

stolec

sekwencjonowanie 16S rRNA

wzrost liczby Firmicutes i spadek liczby Bacteroidetes

Gut 2012; 61(7): 997-1006

Finlandia

Kryteria rzymskie II

27

20 (74,1%)

46,5

stolec

sekwencjonowanie 16S rRNA

IBS-D: spadek liczby Lactobacillus spp.; IBS-C: wzrost liczby Veillonella spp. IBS: spadek liczby Clostridium coccoides oraz Bifidobacterium catenulatum

Am. J. Gastroenterol. 2005; 100(2): 373-382

Finlandia

Kryteria rzymskie II

26

19 (73,1%)

46

stolec

hodowle, PCR-DGGE

zwiększona obfitość form kulistych bakterii (coliforms), wzrost stosunku bakterii tlenowych do beztlenowych

FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 43: 213-222

Finlandia

Kryteria rzymskie II

20

16 (80%)

47,7

stolec

hodowle, sekwencjonowanie 16S rRNA

spadek liczby Lactobacillus spp. i Bifidobacterium spp. oraz wzrost liczby bakterii tlenowych w stosunku do beztlenowychIBS-D: spadek liczby Clostridium thermosuccinogenes, wzrost Ruminococcus torques IBS-C: wzrost liczby Ruminococcus bromii-like

World J. Gastroenterol. 2009; 15(47): 5936-5945

Wielka Brytania

Kryteria rzymskie II

47

28 (59,6%)

34,3

biopsja błony śluzowej odbytnicy

FISH

wzrost całkowitej liczby bakterii, podwyższone liczby Bacteroides i Eubacterium rectale - Clostridium coccoides; IBS-D: spadek liczby Bifidobacteria

Neurogastroenterol. Motil. 2012; 24(1): 31-39

Holandia

Kryteria rzymskie II

41

nd

42

stolec, wymaz z dwunastnicy

FISH, real time PCR

mała liczba Lactobacillus spp., spadek liczby Bifidobacterium catenulatum

World J. Gastroenterol. 2009; 15(23): 28-87

USA

Kryteria rzymskie III pediatryczne

22

8 (36,4%)

9,4

stolec

sekwencjonowanie 16S rRNA; PhyloChip analiza

wzrost obfitości Gammaproteobacteria i Veillonella, spadek liczby Eubacterium i Anaerovorax

Gastroenterology 2011; 141(5): 1782-1791

Finlandia

Kryteria rzymskie II

62

57 (91,2%)

49

stolec

qPCR, phylogenetic microarray analysis

wzrost stosunku Firmicutes do Bacteroidetes, większa obfitość Dorea, Ruminococcus i Clostridium spp., spadek liczby Bacteroidetes, Bifidobacterium, Faecalibacterium spp., metanogenowych bakterii

Gastroenterology 2011; 141(5): 1792-1801

USA

Kryteria rzymskie III

10

8 (80%)

31,9

stolec i wycinki błony śluzowej esicy

qPCR

spadek liczby bakterii tlenowych i wzrost Lactobacillus spp. w próbkach stolca

Gut Pathog. 2010; 2(1): 19

Szwecja

Kryteria rzymskie III

32

19 (59,4%)

41

stolec i wycinki błony śluzowej okrężnicy w trakcie kolonoskopii

sekwencjonowanie 16S rRNA

zmniejszona różnorodność mikrobioty

Aliment. Pharmacol. Ther. 2015; 41(4): 342-351

Finlandia

Kryteria rzymskie II

46

29 (63%)

42,2

stolec

qPCR, phylogenetic microarray analysis

wzrost liczby Bacteroidetes phylum, a spadek liczby bakterii Clostridia

Gut 2014; 63(11):

1737-1745

Japonia

Kryteria rzymskie II

26

13 (50%)

21,7

stolec

qRT-PCR

wzrost obfitości Veilonella spp. i Lactobacillus spp.

Neurogastroenterol. Motil. 2010; 22(5): 512-519, e114-515

Francja

Kryteria rzymskie II

14

14 (100%)

28

stolec

hodowle, FISH

niskie liczby Bifidobacterium spp. i Lactobacillus spp., wzrost liczby Enterobacteriaceae

Aliment. Pharmacol. Ther. 2012; 35(7): 828-838

Francja

Kryteria rzymskie III

14

3 (21,4%)

39,7

stolec

qPCR

zmniejszona liczba Bifidobacterium spp., leptum, wzrost E. coli

Neurogastroenterol. Motil. 2012; 24(6): 513-520, e246-517

Finlandia

Kryteria rzymskie I lub II

96

69 (71,9%)

48

stolec

qPCR

wzrost liczby S. aureus

Gut Pathog. 2011; 3(1): 6

Indie

Kryteria rzymskie III

47

8 (17%)

34

stolec

qPCR

niskie liczby Bifidobacterium spp. i Lactobacillus spp., duża obfitość Ruminococcus productus-Clostridium coccoides, Veilonella, Bacteroides thetaiotamicron, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides thetaiotamicron

Dig. Dis. Sci. 2015; 60: 2953-2962

Chiny

Kryteria rzymskie III

33

22 (66,6%)

35

wycinki błony śluzowej z dwunastnicy i odbytnicy

sekwencjonowanie 16S rRNA

obecność Faecalibacterium i Hyphomicrobium ma związek z objawami lub brakiem objawów klinicznych

J. Gastroenterol. Hepatol. 2017 Nov 30

Dyspepsja czynnościowa (functional dyspepsia)

Japonia

Kryteria rzymskie III

44

22 (50%)

42,5

sok żołądkowy

T-RFLP

niskie liczby Prevotella

BMJ Open Gastroenterol. 2016; 3(1): e000109

Japonia

Kryteria rzymskie III

24

12 (50%)

44

sok żołądkowy

sekwencjonowanie 16S rRNA

mała liczba Proteobacteria, wysokie liczby Bacteroidetes

BMJ Open Gastroenterol. 2017; 4(1): e000144

Australia

Kryteria rzymskie III

9

nd

nd

bioptaty z dwunastnicy

sekwencjonowanie 16S rRNA

mała liczba Actinomyces, Atopobium, Leptotrichia, Prevotella, Veilonella

Gut 2016; pii: gutjnl-2016-312574

IBS - irritable bowel syndrome; IBS-C - postać zaparciowa zespołu jelita nadwrażliwego (IBS-constipation); IBS-D - postać biegunkowa zespołu jelita nadwrażliwego (IBS-diarrhoea).

Rycina 1.1. Mikrobiota i bariera jelitowa w chorobach przewodu pokarmowego.

LEKI JAKO PRZYCZYNA ZABURZEŃ MIKROBIOTY I BARIERY JELITOWEJ

Współczesny styl życia i czynniki środowiskowe negatywnie wpływają na stan mikrobioty przewodu pokarmowego i mogą wywoływać jej zmiany. Niektóre powszechnie stosowane leki metabolizowane są w przewodzie pokarmowym przez mikrobiotę jelitową i jej metabolity. I tak np. obecność Helicobacter pylori w żołądku może warunkować biodostępność lewodopy, stosowanej w leczeniu choroby Parkinsona. Wiele leków zmienia skład mikroorganizmów jelitowych, wpływając na skład i funkcję metaboliczną drobnoustrojów. Zjawiska te mogą warunkować skuteczność leków, ich właściwości farmakodynamiczne i farmakokinetyczne, a także dostępność biologiczną leków. Skuteczność niektórych antymetabolitów (np. metotreksatu) może zależeć od ilości bakterii Gram-ujemnych z rodzaju Bacteroides w przewodzie pokarmowym. Bakterie te syntetyzują reduktazę dihydrofolianową, której zablokowanie może konkurować z wpływem antymetabolitów na ich endogenne enzymy w komórkach eukariotycznych. Poza tym stosowanie antymetabolitów w mechanizmie tzw. dysbiozy może wpływać negatywnie na błony śluzowe jelit i wywoływać działania niepożądane ze strony przewodu pokarmowego, co ma miejsce również w przypadku stosowania leków z grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ).

Leki antysekrecyjne stosowane często jako tzw. leki osłonowe w terapiach lekami uszkadzającymi śluzówkę żołądka także mogą zmieniać skład i funkcję mikrobioty jelitowej. Podobnie stosowanie przeciwciał blokujących białko CTLA-4, wykorzystywanych w leczeniu niektórych nowotworów (np. czerniaka złośliwego), może zależeć od obecności bakterii z rodzaju Bacteroides. Bakterie jelitowe (m.in. bakterie Gram-dodatnie z rodzaju Bifidobacterium) warunkują cytotoksyczne działanie i skuteczność biologiczną także innych leków, takich jak cyklofosfamid, oksaliplatyna czy przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko białkom PD-1/PD-L1 stosowanych w leczeniu chorób autoimmunologicznych i nowotworowych. Podobnie skuteczność przeciwciał monoklonalnych p/c Il-10 i syntetycznych oligonukleotydów CpG w terapiach eksperymentalnych jest największa u zwierząt i osób z prawidłową mikrobiotą jelitową.

W aspekcie nowych badań oceniających skuteczność leków immunomodulujących istotne znaczenie może mieć skojarzone z immunoterapią stosowanie antybiotyków. Według Europejskiego Nadzoru nad Konsumpcją Antybiotyków (European Surveillance of Antibiotic Consumption - ESAC) Polska przed pandemią SARS-CoV-2/COVID-19 znajdowała się w czołówce krajów europejskich pod względem spożycia antybiotyków. Antybiotykoterapia związana jest nie tylko z ryzykiem wystąpienia działań niepożądanych, najczęściej ze strony przewodu pokarmowego (np. rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego), lecz także może znosić skuteczność leków stosowanych w terapii nowotworów. Stosowanie antybiotyków prowadzi do zaburzeń mikrobioty jelitowej.

W stanie dysbiozy u niektórych osób wiele składników pokarmowych (np. gluten) czy leków (np. NLPZ) może wykazywać większą "toksyczność" w kierunku GALT. Leki z grupy NLPZ należą do najczęściej przepisywanych w Polsce leków, są dostępne bez recepty, często w sprzedaży poza aptekami. Zalicza się je do leków najczęściej wywołujących działania niepożądane ze strony przewodu pokarmowego, które stwierdza się nawet u co drugiego pacjenta stosującego te preparaty przewlekle. Do działań niepożądanych należą zapalenie błony śluzowej żołądka, jelita cienkiego i grubego. Leki te zmieniają skład mikrobioty jelitowej, zwiększają liczebność bakterii Gram-ujemnych, produkujących m.in. LPS, mogą wywoływać stany zapalne, zaburzać strukturę i funkcję bariery jelitowej oraz zmieniać transport substancji pokarmowych przez nabłonek i śródbłonek jelitowy.

Na podstawie badań z użyciem kapsułki endoskopowej stwierdzono, że u co trzeciej osoby przyjmującej małe dawki NLPZ występują nadżerki i owrzodzenia w jelicie cienkim. Za pomocą kapsułki endoskopowej wykazano także, że przez dodanie do kuracji NLPZ inhibitora pompy protonowej (NLPZ + PPI) ryzyko wystąpienia owrzodzeń w jelicie cienkim wzrasta. Jednym ze skutecznych sposobów zapobiegania tym uszkodzeniom jest dołączenie do kuracji lekowej probiotyku.

Działania niepożądane ze strony przewodu pokarmowego mogą także wywoływać inne leki, stosowane często dodatkowo u pacjentów onkologicznych, zwłaszcza z towarzyszącą cukrzycą, nadwagą i otyłością. Do takich leków należy m.in. metformina. Pojawienie się dolegliwości takich jak ból brzucha, wzdęcie czy biegunka świadczy o nietolerancji leku i może być powodem jego odstawienia u 30% pacjentów. Stosowanie metforminy może prowadzić do zmiany całkowitej liczebności i różnorodności bakterii w przewodzie pokarmowym, w tym bakterii z gatunku Akkermansia muciniphila, odpowiedzialnej za degradację mucyny w błonie śluzowej jelit. Działanie metforminy na mikrobiotę jelitową bywa dwukierunkowe, np. lek z jednej strony może aktywować układ endokanabinoidalny i korzystnie modulować procesy zapalne, a z drugiej - faworyzować szczepy bakteryjne odpowiedzialne za wystąpienie działań niepożądanych (np. zwiększać ilość bakterii Escherichia coli w przewodzie pokarmowym).

Bakterie probiotyczne mogą zapobiegać działaniom niepożądanym ze strony przewodu pokarmowego w trakcie kuracji antybiotykowych, a także innymi lekami, np. z grupy NLPZ czy PPI, podczas suplementacji żelaza czy radio- i chemioterapii. W badaniach wykazano, że stosowanie Lactobacillus plantarum 299v łącznie z metotreksatem może zmniejszać uszkodzenie nabłonka jelitowego i ograniczać przenikanie toksyn inicjujących stłuszczenie wątroby w trakcie przewlekłej farmakoterapii. Podobne obserwacje dotyczą stosowania 5-fluorouracylu czy osób poddawanych radioterapii. U dzieci przyjmujących bakterie probiotyczne obserwuje się spadek enteropatogenów kałowych, takich jak Campylobacter, Escherichia coli, Salmonella czy Shigella.

Pacjenci onkologiczni poddawani operacjom chirurgicznym, którzy przyjmowali probiotyki przed zabiegiem, rzadziej rozwijają zakażenia i groźne powikłania septyczne i rzadziej występują u nich inne działania niepożądane (np. wzdęcia, bóle brzucha). Okazuje się, że mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w patogenezie powikłań septycznych, a także może odpowiadać za "czystość onkologiczną" zabiegu operacyjnego. Co ciekawe, podawanie określonych szczepów bakterii probiotycznych prowadzi również do zmniejszenia natężenia dolegliwości bólowych głowy w przebiegu migreny oraz poprawia nastrój u osób z depresją. Należy pamiętać, że wiele leków antypsychotycznych i przeciwdepresyjnych może zmieniać skład i funkcję mikrobioty jelitowej i w tym mechanizmie wpływać na rozwój działań niepożądanych (jak np. wzrost masy ciała czy rozwój zespołu metabolicznego). Optymalizacja farmakoterapii w terapii onkologicznej (z uwzględnieniem wpływu innych leków na mikrobiotę przewodu pokarmowego) pozwoli na opracowanie nowoczesnych schematów terapeutycznych, co nie tylko zmniejszy lub nawet wyeliminuje wiele częstych działań niepożądanych, lecz także zwiększy skuteczność takiego leczenia. Na rycinie 1.2 przedstawiono przykłady interakcji niektórych leków z mikrobiotą jelitową.

Rycina 1.2. Przykłady interakcji leków z mikrobiotą jelitową.

WPŁYW ALKOHOLU NA STAN MIKROBIOTY I BARIERY JELITOWEJ

W Polsce ponad 80% osób dorosłych spożywa alkohol. Wbrew opiniom najczęściej są to mieszkańcy dużych miast i osoby lepiej wykształcone. Według raportu OECD (Organization for Economic Co-operation and Development), jeszcze sprzed pandemii COVID-19, spożywanie alkoholu odpowiada za wyższą liczbę zgonów w skali całego świata niż HIV, AIDS i przemoc łącznie. Ma on niekorzystne działanie na funkcję bariery jelitowej. Alkohol powoduje:

- rozszczelnienie połączeń przezbłonowych;

- rozluźnienie połączeń komórkowych bariery jelitowej;

- przewlekłą reakcję zapalną na powierzchni błony śluzowej jelita cienkiego;

- zaburzenia mikrobioty jelitowej skutkujące zmniejszeniem jej zróżnicowania.

W konsekwencji wzrasta przepuszczalność bariery jelitowej i rozwija się alkoholowe zapalenie wątroby (alcoholic liver disease). Mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w powstawaniu alkoholowego i niealkoholowego zapalenia wątroby. Transplantacja mikrobioty jelitowej od alkoholików z alkoholową chorobą wątroby u myszy pozbawionych bakterii (germ-free mice) wywołuje u nich zapalenie wątroby.

Główną rolę w rozwoju alkoholowego zapalenia wątroby pełnią endotoksyny. Stan bariery jelitowej koreluje ze stopniem uzależnienia od alkoholu. Im bardziej rozszczelniona bariera jelitowa, tym większe uzależnienie. Im większe uszkodzenie bariery jelitowej, tym większy lęk, chęć napicia się alkoholu i krótszy okres abstynencji.

Dysbioza towarzyszy marskości wątroby. Wraz z progresją choroby wątroby wzrastają zaburzenia mikrobioty jelitowej oraz ryzyko powikłań, takich jak krwawienie z przewodu pokarmowego, niewydolność nerek czy zaburzenia koncentracji i świadomości w tzw. encefalopatii wątrobowej.

PODSUMOWANIE

Mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w patogenezie chorób przewlekłych, a istotną także w przypadku wielu chorób zakaźnych, w tym infekcji wirusem SARS-CoV-2. Czynniki środowiskowe, w tym nieodpowiednia dieta, stres, brak aktywności fizycznej i leki niekorzystnie modulują ekosystem mikrobioty jelitowej. Dysbioza i endotoksemia są przyczyną nadmiernej aktywacji układu immunologicznego, wywołując upośledzenie funkcji bariery jelitowej, przewlekły stan zapalny organizmu i insulinooporność. W następstwie tych zaburzeń dochodzi do rozwoju schorzeń o podłożu metabolicznym (cukrzyca typu 2, niealkoholowe lub metaboliczne stłuszczenie wątroby, otyłość). Niezbędne są działania profilaktyczne i lecznicze polegające na ochronie i modulacji mikrobioty jelitowej (ryc. 1.3), zwłaszcza u osób z nieprawidłowym wskaźnikiem masy ciała i ryzykiem zaburzeń metabolicznych. Wszelkie interwencje sprzyjające jej odbudowie z pewnością przyniosą wymierne korzyści zdrowotne, a także ekonomiczne.

Rycina 1.3. Mikrobiom jelitowy i potencjalne miejsca modyfikacji bariery jelitowej.

Piśmiennictwo

1. Al-Lahham S.H., Peppelenbosch M.P., Roelofsen H. i wsp. Biological effects of propionic acid in humans; metabolism, potential applications and underlying mechanisms. Biochim. Biophys. Acta 2010; 1801(11): 1175-1183. doi: 10.1016/j.bbalip.2010.07.007.

2. Cabreiro F. Metformin Joins Forces with Microbes. Cell Host Microbe 2016; 19(1): 1-3.

3. Czajkowska A., Szponar B. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) jako produkty metabolizmu bakterii jelitowych oraz ich znaczenie dla organizmu gospodarza. Postepy Hig. Med. Dosw. (online) 2018; 72: 131-142.

4. Devkota S. Microbiome. Prescription drugs obscure microbiome analyses. Science 2016; 351(6272): 452-453.

5. Diether N., Willing B. Microbial Fermentation of Dietary Protein: An Important Factor in Diet-Microbe-Host Interaction. Microorganisms 2019; 7(1): 19. doi: 10.3390/microorganisms7010019.

6. Jaeggi T., Kortman G.A.M., Moretti D. i wsp. Iron fortification adversely affects the gut microbiome, increases pathogen abundance and induces intestinal inflammation in Kenyan infants. Gut 2015; 64(5): 731-742.

7. Łoniewski I., Misera A., Skonieczna-Żydecka K. i wsp. Major Depressive Disorder and gut microbiota - association not causation. A scoping review. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 2021; 106: 110111. doi: 10.1016/j.pnpbp.2020.110111.

8. Marlicz W., Łoniewski I., Grimes D.S., Quigley E.M. Nonosteroidal anti-inflammatory drugs, proton pump inhibitors, and gastrointestinal injury: contrasting interactions in the stomach and small intestine. Mayo Clin. Proc. 2014; 89(12): 1699-1709.

9. Pieper R., Boudry C., Bindelle J. i wsp. Interaction between dietary protein content and the source of carbohydrates along the gastrointestinal tract of weaned piglets. Arch. Anim. Nutr. 2014; 68(4): 263-280. doi: 10.1080/1745039X.2014.932962.

10. Raport OECD: http://www.oecd.org.

11. Rial S., Karelis A., Bergeron K.F., Mounier C. Gut Microbiota and Metabolic Health: The Potential Beneficial Effects of a Medium Chain Triglyceride Diet in Obese Individuals. Nutrients 2016; 8(5): 281. doi:10.3390/nu8050281.

12. Sayers E., MacGregor A., Carding S.R. Drug-microbiota interactions and treatment response: relevance to rheumatoid arthritis. AIMS Microbiology 2018; 4(4): 642-654.

13. Skonieczna-Żydecka K. i wsp. The emerging role of microbiome-gut-brain axis in functional gastrointestinal disorders [w:] Faintuch J., Faintuch S. Microbiome and Metabolome in Diagnosis, Therapy, and Other Strategic Applications. Elsevier: Academic Press, London; San Diego; Cambridge, MA; Kidlington, Oxford 2019.

14. Skonieczna-Żydecka K., Jakubczyk K., Maciejewska-Markiewicz D. i wsp. Gut Biofactory-Neurocompetent Metabolites within the Gastrointestinal Tract. A Scoping Review. Nutrients 2020; 12(11): 3369. doi: 10.3390/nu12113369.

15. Skonieczna-Żydecka K., Kaczmarczyk M., Łoniewski I. i wsp. A Systematic Review, Meta-Analysis, and Meta-Regression Evaluating the Efficacy and Mechanisms of Action of Probiotics and Synbiotics in the Prevention of Surgical Site Infections and Surgery-Related Complications. J. Clin. Med. 2018; 7(12): 556.

16. Skonieczna-Żydecka K., Łoniewski I., Misera A. i wsp. Second-generation antipsychotics and metabolism alterations: a systematic review of the role of the gut microbiome. Psychopharmacology (Berl). 2019; 236(5): 1491-1512.

17. Skonieczna-Żydecka K., Marlicz W., Misera A. i wsp. Microbiome - The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. J. Clin. Med. 2018; 7(12): 521.

18. Smith E.A., Macfarlane G. Enumeration of amino acid fermenting bacteria in the human large intestine: effects of pH and starch on peptide metabolism and dissimilation of amino acids. FEMS Microbiology Ecology 1998; 25(4): 355-368. doi: 10.1111/j.1574-6941.1998.tb00487.x.

19. Spanogiannopoulos P., Bess E.N., Carmody R.N., Turnbaugh P.J. The microbial pharmacists within us: a metagenomic view of xenobiotic metabolism. Nat. Rev. Microbiol. 2016; 14(5): 273-287. doi: 10.1038/nrmicro.2016.17.

20. Syer S.D., Wallace J.L. Environmental and NSAID-enteropathy: dysbiosis as a common factor. Curr. Gastroenterol. Rep. 2014; 16(3): 377.

21. Viaud S., Daill?re R., Boneca I.G. i wsp. Gut microbiome and anticancer immune response: really hot Sh*t! Cell Death Differ. 2015; 22(2): 199-214.

22. Viaud S., Daill?re R., Boneca I.G. i wsp. Harnessing the intestinal microbiome for optimal therapeutic immunomodulation. Cancer Res. 2014; 74(16): 4217-4221.

23. Weir T.L., Manter D.K., Sheflin A.M. i wsp. Stool microbiome and metabolome differences between colorectal cancer patients and healthy adults. PLoS One 2013; 8(8): e70803. doi: 10.1371/journal.pone.0070803.

24. Zitvogel L., Galluzzi L., Viaud S. i wsp. Cancer and the gut microbiota: an unexpected link. Sci. Transl. Med. 2015; 7(271): 27.

2Zarys metod bioinformatycznych w analizie mikrobiomu jelitowegoZuzanna Karwowska, Paweł P. Łabaj, Tomasz Kościółek

MIKROBIOM CZŁOWIEKA A EKSPOZOM

Człowiek to jeden z elementów swoistej niszy ekologicznej, a miarą wszystkich ekspozycji jego ciała na czynniki zewnętrzne w ciągu całego życia (od poczęcia do śmierci) oraz sposobu, w jaki te ekspozycje powiązane są ze zdrowiem, jest ekspozom. Ekspozycja danej osoby rozpoczyna się przed jej urodzeniem i obejmuje wszystkie czynniki środowiskowe i związane z nimi reakcje biologiczne, w tym narażenie na działanie środowiska zewnętrznego, żywności, zachowań i procesów endogenicznych. Koncepcja ekspozomu została po raz pierwszy zaproponowana w celu zwrócenia uwagi na potrzebę posiadania lepszych i pełniejszych danych o wpływie środowiska naturalnego na badania przyczynowo-skutkowe, aby dopełnić wiedzę uzyskiwaną z badań genetycznych.

W ekspozomie można wyróżnić trzy nakładające się domeny:

- ogólne środowisko zewnętrzne - w tym środowisko miejskie, edukacja, czynniki klimatyczne, kapitał społeczny, stres;

- specyficzne środowisko zewnętrzne - ze specyficznymi substancjami zanieczyszczającymi, promieniowaniem, infekcjami, czynnikami stylu życia (np. tytoń, alkohol), dietą, aktywnością fizyczną itp.;

- środowisko wewnętrzne - obejmuje wewnętrzne czynniki biologiczne, takie jak czynniki metaboliczne, hormony, mikrobiom jelitowy, stan zapalny, stres oksydacyjny.

W kontekście mikrobiomu należy się skupić na ożywionej części ekspozomu, do której zalicza się trzy obszary oddziaływania biomów na zdrowie człowieka:

- mikrobiom środowiskowy (np. przestrzeni miejskiej, miejsca pracy);

- zewnętrzny mikrobiom człowieka (np. mikrobiom skóry);

- wewnętrzny mikrobiom człowieka (np. jamy ustnej, układu pokarmowego).

Należy zauważyć, że biomy z wyżej wspomnianych obszarów nie są niezależne/izolowane, lecz występuje interakcja między nimi, a także z nieożywionymi czynnikami ekspozycyjnymi, które wspólnie wpływają na dobrostan i zdrowie człowieka. Dlatego i ekspozom postrzegany całościowo, i sam tylko mikrobiom człowieka należy traktować jako duży i dynamiczny układ o znacznym skomplikowaniu z wieloma zależnościami, zarówno wewnętrznymi, jak i zewnętrznymi. Zależności te, wynikające np. z wieku, masy ciała, pochodzenia etnicznego, miejsca zamieszkania, mają wpływ na skład mikrobiomu człowieka, a zwłaszcza mikrobiomu jelitowego. To powoduje, że do pełnego poznania konieczne jest wykorzystanie różnych dostępnych metod omicznych, a także zaawansowanych metod biostatystycznych i bioinformatycznych do analizy, integracji i interpretacji wygenerowanych danych.

Obecnie obserwuje się zwiększone zainteresowanie mikrobiomem jelit człowieka, o czym świadczy liczba prowadzonych na ten temat badań. Mikrobiom jelit wiązany jest m.in. z otyłością, cukrzycą typu 2, zespołem jelita drażliwego, nowotworami układu pokarmowego, a nawet z zaburzeniami psychicznymi. Bezpośrednio do wzrostu zainteresowania mikrobiomem przyczynia się rozwój technik analitycznych oraz bioinformatycznych umożliwiających jego analizę, tj. sekwencjonowanie nowej generacji oraz dostępność oprogramowania umożliwiającego odczyt oraz ewaluację wyników sekwenatora.

Standardowe techniki mikrobiologiczne mają ograniczenia, które uniemożliwiają analizę ogromnej ilości bakterii występujących w mikrobiomie jelit. Pierwszym z nich jest the great plate count anomaly, tj. dysonans między ilością komórek obserwowaną w formie kolonii na agarze a ilością komórek obserwowanych pod mikroskopem. Zjawisko to wynika m.in. z faktu, że większość gatunków występujących w jelitach człowieka nie poddaje się hodowli bakteryjnej. Innym ograniczeniem jest jakościowy charakter analiz posiewowych. Hodowle bakteryjne dostarczają informacji wyłącznie jakościowych, podczas gdy sekwencjonowanie umożliwia również analizę ilościową próbki. Kolejnym ograniczeniem jest różnorodność gatunków zamieszkujących ludzkie jelita przewyższająca możliwości metod biochemicznych standardowo używanych w celu identyfikacji poszczególnych. Sekwencjonowanie materiału genetycznego oraz techniki bioinformatyczne ominęły ograniczenia metod laboratoryjnych, co umożliwiło ekstensywny rozwój badań nad mikrobiomem jelit (ryc. 2.1).

Rycina 2.1. Od próbki do wyniku. Schemat przedstawiający uniwersalne etapy analizy próbki mikrobiomowej. Niezależnie od metody w pierwszej kolejności należy wyizolować materiał genetyczny z próbki. Następnie poddaje się go sekwencjonowaniu (metodą 16S lub shotgun). Wyniki sekwencjonowania analizowane są za pomocą programów bioinformatycznych. Etapy analizy obejmują demultipleksowanie, kontrolę jakości sekwencjonowania oraz wybór reprezentatywnych cech (jednostek taksonomicznych). Ostatecznie uzyskane wyniki mogą posłużyć jako dane wyjściowe do obliczeń statystycznych, które odpowiedzą na zadane na początku eksperymentu pytanie badawcze.

TECHNOLOGIE BADANIA MIKROBIOMU JELITOWEGO

Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie genomu organizmu można rozumieć jako ustalenie kolejności nukleotydów jego materiału genetycznego. Sekwencjonowanie DNA zostało opracowane w 1977 roku przez Fredericka Sangera i od tego czasu dynamicznie się rozwija.

Technologia sekwencjonowania Sangera, zaliczana do sekwencjonowania pierwszej generacji, oparta jest na syntezie DNA przez polimerazę. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które wbudowywane są w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się poprzez elektroforezę kapilarną, co powoduje ich segregację pod względem długości. Standardowo używa się układu z 96 kapilarami, a generowane odczyty sekwencji mają długość 600-1000 zasad, co skutkuje głębokością sekwencjonowania do 100 tys. baz na jedno "uruchomienie".

Sekwencjonowanie drugiej generacji odnosi się do metod wykorzystujących również sekwencjonowanie przez syntezę (ew. ligację) pojedynczych nukleotydów, ale wykonywane w masowo równoległym formacie. Dzięki temu liczba równoczesnych reakcji sekwencjonowania może być liczona w miliardach, a głębokość sekwencjonowania - dochodzić do kilku bilionów baz na jedno "uruchomienie". Zwykle w obecnie stosowanych rozwiązaniach długość sekwencjonowanych fragmentów nie przekracza kilkuset par zasad (przeważnie 100-200). Najpopularniejszą technologią w tej kategorii jest Illumina.

Sekwencjonowanie trzeciej generacji również odnosi się do metod, które opierają się na masowo równoległym sekwencjonowaniu przez syntezę. Różnica polega na tym, że jako szablon może być wykorzystywana cała molekuła DNA lub RNA, a nie jedynie jej fragment o ograniczonej długości. Technologie te umożliwiają także sekwencjonowanie bez amplifikacji metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase chain reaction - PCR), a wyniki dostępne są w czasie rzeczywistym. Platformy sekwencjonowania trzeciej generacji mają mniej równoległych reakcji sekwencjonowania, ale długość otrzymywanych odczytów jest znacznie większa. W związku z tym głębokość sekwencjonowania na jedno "uruchomienie" może być porównywalna z urządzeniami drugiej generacji. W tej kategorii popularne są technologie opracowane przez Oxford Nanopore Technologies oraz PacBio.

Idealna technologia zapewniałaby długie odczyty (sekwencjonowana cała molekuła DNA lub RNA), dużą precyzję oraz wysoką przepustowość. Niestety obecnie dostępne rozwiązania umożliwiają osiągnięcie co najwyżej dwóch z tych trzech celów. Technologie sekwencjonowania drugiej generacji mają wysoką precyzję i bardzo wysoką przepustowość, ale są to technologie produkujące krótkie odczyty. Natomiast technologie sekwencjonowania trzeciej generacji wprawdzie produkują bardzo długie odczyty, ale albo są nisko przepustowe, albo ich precyzja jest relatywnie niska.

Należy zauważyć, że w wielu przypadkach nie rozróżnia się sekwencjonowania drugiej i trzeciej generacji, a wszystkie metody wykorzystujące masowo równoległe podejście określa się mianem sekwencjonowania następnej generacji (next generation sequencing - NGS). Wprowadzenie pierwszych technologii NGS było kluczowym technologicznym przełomem, który spowodował lawinowy wzrost badań opartych o sekwencjonowanie, a zarazem dramatyczny spadek kosztów takich eksperymentów. Warto również podkreślić, że rozwój technologii jest bardzo dynamiczny i w niedalekiej przyszłości może pojawić się technologia zbliżona, łącząca zalety podejść drugiej i trzeciej generacji.

Inne aplikacje sekwencjonowania nowej generacji

Szybki rozwój technologii sekwencjonowania nie tylko spowodował obniżenie kosztów sekwencjonowania genomów, lecz także doprowadził do znacznego rozwoju innych pokrewnych dziedzin nauki, zgodnie ze słowami laureata Nagrody Nobla Sydneya Brennera: Postęp w nauce zależy od nowych technologii, nowych odkryć i nowych idei,najprawdopodobniej w tej kolejności.

W przypadku masowo równoległego sekwencjonowania szybko okazało się, że technologia ta może być zastosowana nie tylko do poznania genomu i występujących w nim zmian osobniczych czy chorobowych (whole genome sequencing - WGS). Jest również przydatna do analizy zmian w egzomie, czyli w sekwencjach eksonów tworzących geny (whole exome sequencing - WES) i ekspresji alternatywnych transkryptów genów (whole transcriptome sequencing - WTS). W ostatnim czasie popularne stają się też celowane podejścia, kiedy jedynie obszar interesujący ze względu na daną chorobę jest zsekwencjonowany (targeted DNA-seq i targeted RNA-seq). Ponadto masowo równoległe sekwencjonowanie umożliwia poznanie i analizę epigenomu: metylacji (np. whole genome bisulfite sequencing - WGBS; oxidative bisulfite sequencing - oxBS; enzymatic methyl-seq - EM-seq), stanu dostępności chromatyn (assay for transposase-accessible chromatin using sequencing - ATAC-seq), a także badanie interakcji między kompleksami białkowymi i DNA (ChIP-seq). Ta lista nie wyczerpuje wszystkich obecnie stosowanych aplikacji sekwencjonowania, a kolejne lata przynoszą nowe, ciekawe możliwości.

Sekwencjonowanie mikrobiomu jelitowego

Przykładem praktycznego zastosowania sekwencjonowania NGS wychodzącego poza sekwencjonowanie pojedynczego genomu jest Human Microbiome Project (HMP), rozpoczęty w 2007 roku. Pierwsza faza projektu, zakończona w 2014 roku, pozwoliła za pomocą sekwencjonowania scharakteryzować ludzki mikrobiom oraz ustalić podstawowe zależności między zmianami w mikroflorze jelit a rozwojem chorób.

Obecnie jednymi z najczęściej wykorzystywanych w analizie mikrobiomu metodami sekwencjonowania są sekwencjonowanie genu markerowego 16S rRNA (tzw. sekwencjonowanie 16S) oraz sekwencjonowanie metagenomowe metodą shotgun.

Sekwencjonowanie metodą 16S

Technika sekwencjonowania metodą 16S rRNA wykorzystuje charakterystykę genu 16S rRNA - małej podjednostki rybosomu prokariotycznego. Gen ten występuje u wszystkich bakterii i archeonów, a składa się z regionów DNA silnie konserwatywnych i dziewięciu regionów zmiennych. Jego uniwersalność, dobrze poznana struktura regionów zmiennych (charakterystycznych dla organizmów) oraz konserwatywnych (używanych do projektowania sekwencji primerów) oraz relatywnie niski koszt takich eksperymentów wpływają na popularność tej techniki. Najczęściej używanymi hiperzmiennymi regionami genu 16S rRNA są V1-V3, V4 oraz V4-V5.

W celu zsekwencjonowania próbki mikrobiomu należy wyizolować materiał genetyczny z materiału biologicznego. Po izolacji DNA następuje przyłączenie specyficznych dla metody sekwencjonowania adapterów, tj. primerów komplementarnych, do matrycy sekwenatora oraz amplifikacja sekwencji metodą PCR. Obecność fragmentów konserwatywnych genu 16S umożliwia przyłączenie się starterów i przeprowadzenie amplifikacji. Powstałe kopie materiału genetycznego z przyłączonymi adapterami nazywa się biblioteką genową (genomic library). Jeśli analizujemy jednocześnie próbki od wielu pacjentów, do sekwencji przyłączane są specyficzne sekwencje barkodowe (multiplexing), które na dalszych etapach analizy umożliwią przypisanie sekwencji do próbki. Wreszcie następuje samo sekwencjonowanie. Jego wyniki analizowane są przez odpowiednie oprogramowanie: przeprowadzane jest demultipleksowanie (demultiplexing) - przypisanie sekwencji do próbki, weryfikacja jakości sekwencjonowania oraz wybór reprezentatywnych sekwencji nukleotydowych. Reprezentatywne sekwencje mogą być następnie analizowane niezależnie lub możemy im przypisać taksonomię, korzystając z algorytmów opartych na uczeniu maszynowym lub bazach danych, takich jak SILVA lub GreenGenes. Proces ten podsumowano na ryc. 2.1.

Analiza jakości sekwencjonowania jest ważnym etapem samej procedury, ponieważ pozwala zminimalizować wyniki fałszywie dodatnie. Podczas analizy jakości wyników sekwencjonowania należy zwrócić uwagę m.in. na obecność sekwencji chimerycznych, tj. odcinków powstałych z kilku osobnych sekwencji podczas reakcji PCR, jakość sekwencjonowania (quality score - przewidywanie prawdopodobieństwa błędu w base callingu, tj. procesie przypisywania nukleozydów do sygnału) oraz długość odczytów.

Sekwencjonowanie metodą shotgun

Założeniem metody sekwencjonowania techniką shotgun jest poznanie genomu przez jego fragmentację, sekwencjonowanie, a następnie złożenie ze zbioru częściowo zachodzących na siebie fragmentów. Pozwala to ominąć ograniczenia techniczne sekwenatorów, które nie są w stanie sekwencjonować całych genomów w trakcie pojedynczej reakcji.

Etapy sekwencjonowania metodą shotgun obejmują fragmentację wyizolowanego materiału genetycznego, przygotowanie biblioteki oraz sekwencjonowanie fragmentów DNA. Następnie wyniki sekwenatora poddawane są kontroli jakości odczytów oraz przeprowadzane jest składanie pofragmentowanych sekwencji (assembly). Składanie sekwencji polega na połączeniu wcześniej pofragmentowanych odcinków w celu odzyskania sekwencji pierwotnej długości. Wyróżnia się składanie sekwencji zależne od wzorca, np. genomu referencyjnego, oraz składanie sekwencji de novo, tj. niezależne od wzorca. Składanie sekwencji zależne od wzorca przeprowadzić można za pomocą narzędzi bioinformatycznych, takich jak Bowtie2 czy Kraken.

Omówione metody sekwencjonowania posiadają swoiste ograniczenia i różnią się m.in. ceną, wymogami obliczeniowymi oraz sposobem przypisania taksonomii (tab. 2.1). Przygotowanie materiału do sekwencjonowania metodą 16S jest tańsze niż w przypadku metody shotgun. Analiza wyników sekwencjonowania metodą 16S jest dobrze ustandaryzowana; dostępne są łatwe w użyciu narzędzia bioinformatyczne, takie jak QIIME 2 czy Qiita, które znacząco ułatwiają procesowanie próbek w stosunkowo krótkim czasie. Mimo wyższych kosztów przygotowania próbki i samego sekwencjonowania oraz większym wymogom obliczeniowym metoda shotgun jest coraz częściej wybierana w analizach mikrobiomu. Wynika to z dużo większej czułości metody w porównaniu do 16S. Sekwencjonowanie metodą shotgun pozwala na identyfikację nie tylko bakterii i archeonów, lecz także wirusów oraz grzybów (należy jednak zwrócić uwagę na kontaminację ludzkim DNA, która często występuje w tej metodzie sekwencjonowania). Metoda shotgun pozwala na analizę taksonomiczną próbki do poziomu szczepu oraz umożliwia stosunkowo szczegółową analizę funkcjonalną, podczas gdy sekwencjonowanie metodą 16S pozwala na przypisanie taksonomii wyłącznie do poziomu gatunku, a wnioskowanie funkcjonalne, mimo że jest możliwe, mocno bazuje na probabilistyce.

Wybór metody sekwencjonowania zależy w znacznej mierze od pytania badawczego, które należy zadać przed planowaniem eksperymentu, oraz budżetu przeznaczonego na badania.

Tabela 2.1. Porównanie metod sekwencjonowania 16S oraz shotgun

Metody sekwencjonowania

16S

shotgun

Koszt eksperymentu

Stosunkowo niski

Wyższy niż w przypadku 16S

Analizowane królestwo organizmów

Bakterie, archeony, zależne od primerów

Bakterie, wirusy oraz archeony, grzyby, ludzkie dna (uwaga na kontaminację ludzkim DNA)

Poziom taksonomiczny analizy

Rodzaj/gatunek

Szczep

Jakość przypisania taksonomii

Szybsze obliczeniowo, zależne od baz danych

Wymagające obliczeniowo, szczególnie przy składaniu sekwencji de novo

Profilowanie funkcjonalne

Nie

Tak

Inne metody omiczne w badaniu mikrobiomu jelitowego

Badanie mikrobiomu jelitowego przez sekwencjonowanie 16S lub metagenomowe jest obecnie głównym narzędziem, jednak aby w pełni scharakteryzować i zrozumieć funkcję mikrobiomu jelit oraz jego interakcję z ciałem człowieka, należy spojrzeć na ten problem z różnych stron (ryc. 2.2). Metagenomika zapewnia statyczne informacje na temat składu mikrobiomu w danym momencie oraz jego potencjału funkcjonalnego, natomiast nie daje wglądu w obecny stan aktywności transkryptów, białek czy szlaków metabolicznych. Metatranskryptomika przekazuje informacje na temat tego, które geny są ekspresjonowane w danym momencie. Metaproteomika pokazuje poziom ekspresji białek w badanym środowisku, a metabolomika - małych cząsteczek chemicznych, np. lipidów, kwasów tłuszczowych. Należy przy tym pamiętać, że wszystkie metody pomiarowe mają własne wady i zalety.

Rycina 2.2. Technologie omiczne. Porównanie informacji pochodzących z różnych technologii omicznych: sekwencjonowanie genu 16S rRNA, metagenomika shotgun, metatranskryptomika, metaproteomika i metabolomika (na podstawie Zhang, Li, Butcher i wsp. 2019; link do ryciny oryginalnej: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-019-0767-6#additional-information).

Eksperymenty metatranskryptomiczne wymagają uzyskania znacznej ilości wysokiej jakości RNA z próbki, co może być dość trudne ze względu na wszechobecność RNaz w próbkach pochodzących od gospodarza. Ponadto przy sekwencjonowaniu metatranskryptomu problemem są wysoko ekspresjonowane transkrypty z najliczniejszych mikrobów, które niekoniecznie muszą być dla nas informatywne, ale "zużywają" dominującą część głębokości sekwencjonowania (tj. rybosomalnych białek, czynników translacyjnych, głównych białek błony zewnętrznej). Może to prowadzić do niewykrycia ważnych funkcjonalnie, ale mniej częstych transkryptów. Dlatego zarówno jakość RNA, jak i głębokość sekwencjonowania jest ważnym aspektem, który należy ocenić lub rozważyć w metatranskryptomice. Wymagana głębokość sekwencjonowania powinna być o 3-4 rzędy wielkości większa niż przy shallow shotgun.

W porównaniu z metagenomiką i metatranskryptomiką metaproteomika ma mniejszą czułość i może wychwycić tylko 10-20% białek wytworzonych przez mikrobiom jelitowy człowieka. Wyniki mogą być również nasycone bardzo licznymi białkami pochodzącymi od dominujących gatunków - odpowiednie etapy dodatkowe, jak separacja białek/peptydów czy ukierunkowane wzbogacanie, mogą w pewnym stopniu rozwiązać ten problem. Należy zwrócić uwagę, że metaproteomika nie jest jeszcze standardową procedurą w badaniach mikrobiomu, nadal brakuje wytycznych i protokołów do prawidłowego przeprowadzania doświadczeń metaproteomicznych i interpretacji wyników. W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę na przygotowanie próbek, pomiary spektrometrią mas, raportowanie danych i analizę bioinformatyczną.

Głównym wyzwaniem dla metabolomiki w badaniach nad mikrobiomem jest trudność w rozróżnianiu metabolitów pochodzących od gospodarza i mikrobiomu oraz bezpośrednim powiązaniu metabolitów z określonymi taksonami. Znaczącym problemem jest też identyfikacja metabolitów, gdyż przestrzeń chemiczna metabolomu jelitowego jest olbrzymia i relatywnie słabo opisana. Jeden z możliwych sposobów rozwiązania tego problemu to określenie współwystępowania metabolitów i gatunków drobnoustrojów, co wskazuje na wytwarzanie metabolitów specyficznych dla danego gatunku, przez integratywną analizę składu mikrobioty z profilami metabolitów. Inne podejścia, takie jak sondowanie stabilnych izotopów białka (protein-SIP), mogą również łączyć metabolizm konkretnego substratu z informacją filogenetyczną przez monitorowanie izotopów w sekwencjach białek drobnoustrojów za pomocą spektrometrów masowych i mogą ostatecznie pomóc w rekonstrukcji metabolizmu mikrobiomu. Podobnie jak w wypadku metaproteomiki technika ta nie jest jeszcze standardową procedurą w badaniach nad mikrobiomem, nadal brakuje wytycznych i protokołów do prawidłowego przeprowadzania doświadczeń metabolomicznych i interpretacji wyników.

Należy też zwrócić uwagę, że integracja wyników uzyskanych z badań metagenomicznych, metatranskryptomicznych, metaproteomicznych i metabolomicznych nie jest zadaniem trywialnym. Integracja danych multi-omicznych to jedno z większych wyzwań obecnej bioinformatyki, a dostępne rozwiązania nie przynoszą jeszcze w pełni zadowalających rezultatów.

STANDARYZACJA PROTOKOŁÓW

Wobec dużego wyboru rozwiązań technologicznych do badania mikrobiomu (sekwencjonowanie 16S, metagenomika shotgun, metatranskryptomika, metabolomika itd.) oraz jego olbrzymiego rozmiaru i zmienności - konieczna jest standaryzacja wszystkich metod, począwszy od zbierania i przetwarzania materiału biologicznego, przez analizę danych, po przechowywanie i dzielenie przetworzonych informacji.

W tej sekcji omówimy dobre praktyki dla - w kolejności - protokołów laboratoryjnych, bioinformatycznych oraz dzielenia i przechowywania danych. Najnowsze protokoły stosowane w Projekcie Mikrobiom Polaków dostępne są na stronie: mikrobiom.mcb.uj.edu.pl.

Standaryzacja protokołów laboratoryjnych

W zależności od wybranego eksperymentu (np. metagenomika lub metatranskryptomika) należy przestrzegać innego zestawu wymagań dotyczących pobierania i przechowywania próbek. DNA ogólnie jest stabilne, natomiast żywe i aktywne bakterie mogą się nadal namnażać w próbce, dlatego będziemy chcieli to zminimalizować. Dla porównania RNA jest o wiele mniej stabilne i w badaniach metatranskryptomicznych będziemy chcieli jak najwierniej odzwierciedlić stan transkryptomiczny próbek, dlatego znacznie bardziej istotne stanie się szybkie unieczynnienie materiału biologicznego.

Warto zwrócić uwagę na fakt, że niezależnie od sposobu, w jaki zbieramy i przechowujemy próbki, zawsze wprowadzamy do badanego systemu pewne zmiany. Dlatego najistotniejsze ze względu na wyniki analiz jest stosowanie tych samych protokołów podczas całego badania.

W obecnym standardzie badań metagenomicznych (zarówno 16S, jak i shotgun) próbki kału najczęściej pobierane są na sterylne podwójne drewniane wymazówki zakończone wacikami. Taka wymazówka umieszczana jest w 95% EtOH dla utrwalenia materiału biologicznego. Następnie próbki trzyma się w lodówce w temperaturze -20°C do czasu przekazania materiału do laboratorium. W laboratorium, w zależności od potrzeb, próbki mogą zostać zamrożone i przechowywane nawet przez wiele miesięcy. Istotne jest, żeby materiał nie przechodził przez wiele cykli zamrażania-rozmrażania.

Standardowo w przypadku eksperymentów metagenomicznych zebrany materiał przechodzi ekstrakcję DNA, amplifikację oraz przygotowanie bibliotek zależnych od przeprowadzanego eksperymentu, tj. inną dla sekwencjonowania genu 16S rRNA i dla płytkiej/głębokiej metagenomiki. Sekwencjonowanie natomiast odbywa się w technologii krótkich odczytów na platformie Illumina. Wszystkie protokoły są zgodne z Earth Microbiome Project i dostępne na stronach Projektu Mikrobiom Polaków.

Eksperymenty metatranskryptomiczne, metaproteomiczne lub metabolomiczne obecnie ustandaryzowane są w o wiele mniejszym zakresie i zarówno ze względu na złożoność eksperymentalną, jak i koszty nie skalują się wydajnie do badań wymagających zebrania setek do tysięcy próbek. Nie będą więc omawiane tutaj szerzej. W pierwszej kolejności zalecamy rozważenie eksperymentów metagenomicznych.

Standaryzacja protokołów bioinformatycznych

Surowe dane pochodzące z sekwencjonowania w formacie FASTQ, czyli sekwencje wraz z jakością przypisania danego odczytu, przenoszone są na serwery, gdzie mogą zostać poddane obróbce i analizom.

W przypadku analiz 16S dobre praktyki i optymalizacja metod były prowadzone już od wielu lat, dlatego obecnie istnieje zestaw praktyk bioinformatycznych, które zapewniają powtarzalne i reprodukowalne wyniki kompatybilne z danymi generowanymi przez inne grupy badawcze. Początków takich starań można szukać w latach 2007-2010 wraz z ustanowieniem takich projektów, jak Human Microbiome Project (HMP) czy Earth Microbiome Project (EMP), a także jednego z najważniejszych narzędzi powszechnie używanych w analizach mikrobiomu - Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME).

Obecnie QIIME 2 (https://qiime2.org) jest główną platformą służącą do analiz danych mikrobiomowych. Zaletą platform takich jak QIIME 2 jest standaryzacja i kompatybilność produkowanych formatów danych - wynik z jednej analizy będzie kompatybilny z wymaganiami kolejnej analizy zależnej od pierwszego wyniku. Jednocześnie QIIME 2 umożliwia łatwą wymianę danych dzięki uniwersalnemu formatowi archiwów (formaty QZA oraz QZV), a wizualizacje wyników i automatyczny zapis parametrów używanych do otrzymania wyników dzięki mechanizmowi śledzenia pochodzenia (provenance tracking). W połączeniu z popularnymi narzędziami do przechowywania kodu, takimi jak Jupyter, można w łatwy sposób tworzyć powtarzalne analizy próbek mikrobiomowych, które z jednej strony oszczędzają czas (schemat analizy wystarczy opracować jednokrotnie i można go powtarzać na nowych danych), a z drugiej strony minimalizują prawdopodobieństwo błędów.

Większość narzędzi bioinformatycznych działa z poziomu terminala w komputerze lub z poziomu interpretera języka Python, np. w środowisku Jupyter. Wymagają więc znajomości przynajmniej podstaw programowania. Wygodną i równie wydajną alternatywą może być Qiita (qiita.ucsd.edu). Jest to baza danych do przechowywania danych multi-omicznych, która zawiera również moduł do analiz oparty na QIIME 2. Dzięki Qiita w łatwy, graficzny sposób, wybierając z kontekstowych menu odpowiednie analizy i parametry, można przechowywać, analizować i udostępniać analizy mikrobiomowe.

W przypadku analiz metagenomicznych, zarówno płytkich (shallow shotgun), jak i głębokich (deep shotgun), metodyka obróbki danych jest obecnie mniej ustandaryzowana niż w przypadku analiz 16S. Pojawia się coraz więcej prób optymalizacji takich analiz, jak np. SHOGUN w przypadku shallow shotgun, jednak ze względu na o wiele większą złożoność danych oraz koszt komputerowy takich obliczeń i możliwych sposobów analizy w porównaniu do 16S, najbardziej popularnym obecnie rozwiązaniem jest konstruowanie własnych schematów przetwarzania i analizy danych.

Standaryzacja dzielenia i przechowywania danych

Dzielenie i udostępnianie nieprzetworzonych danych oraz wyników analiz stało się w dziedzinie mikrobiomu standardem. W wielu przypadkach, ze względu na regulacje prawne, jest też koniecznością. Duże organizacje, takie jak European Bioinformatics Institute (EBI) czy amerykańskie National Center for Biotechnology Information (NCBI) dysponują swoimi długoterminowymi repozytoriami, w których należy umieszczać dane z sekwencjonowania przed publikacją wyników. Są to: dla EBI - European Nucleotide Archive (EBI ENA), a dla NCBI - Sequence Read Archive (NCBI SRA).

Wygodną metodą przechowywania danych - zarówno surowych, jak i przetworzonych - jest wspomniana wcześniej Qiita. Ta platforma umożliwia również zautomatyzowane deponowanie danych w EBI ENA i kontrolę poziomu dostępności naszych danych - od prywatnych, przez udostępnianie ich wybranym użytkownikom, po publiczny dostęp dla wszystkich.

Na koniec warto wspomnieć, że popularne staje się udostępnianie nie tylko samych danych, lecz także analiz i kodu źródłowego, który posłużył do uzyskania wyników, czy rycin prezentowanych w publikacjach. Najbardziej popularną platformą w tym obszarze jest GitHub.

WYZWANIA BIOINFORMATYCZNEJ ANALIZY MIKROBIOMU JELITOWEGO

Ograniczenia danych mikrobiomowych

Analizując dane mikrobiomowe, najczęściej poszukuje się odpowiedzi na pytania, czy zmiany w środowisku zewnętrznym lub w ludzkim organizmie wpływają na zmiany w mikrobiomie jelitowym oraz czy zmiany zachodzące w mikrobiomie wpływają na zmiany w organizmie człowieka. Specyfika danych mikrobiomowych uniemożliwia spełnienie założeń znacznej części testów statystycznych, które wymagają m.in. niezależności zmiennych, rozkładu normalnego czy jednorodności wariancji. Standardowe testy statystyczne, jak np. korelacje (Pearsona lub Spearmana) czy test t-Studenta, nie będą odpowiednie w analizach surowych danych mikrobiomu jelitowego. Dane mikrobiomowe charakteryzują się wielowymiarowością, silnym rozrzutem oraz rozkładem rzadkim, posiadającym znaczną ilość zer. Dodatkowo w przypadku mikrobiomu jelit nie możemy wnioskować o absolutnych wartościach, ponieważ na różnych etapach analizy tracimy część informacji. Za materiał służy nam próbka kału pacjenta. Z frakcji próbki izolowany jest materiał genetyczny. W zależności od wybranego zestawu do izolacji DNA zostanie wyizolowana frakcja materiału genetycznego obecna w próbce. Następnie frakcja wyizolowanego DNA zostanie użyta do amplifikacji, frakcja amplikonów do stworzenia biblioteki, a tylko część biblioteki zostanie zsekwencjonowana. Dlatego wyniki sekwencjonowania nie pokazują wartości absolutnych, ale relatywne dla wszystkich zliczeń dla próbki. Wymaga to wybrania odpowiedniego podejścia uwzględniającego specyfikę tych danych (metody takie jak ANCOM czy Songbird, opisane w dalszej części rozdziału).

Wielowymiarowość danych może prowadzić do sytuacji, w której liczba zmiennych przewyższa liczbę przypadków. Zjawisko to jest niewygodne podczas analizy statystycznej, ponieważ w przypadku wielu zmiennych prawdopodobieństwo ich korelacji znacząco rośnie, co utrudnia poprawną interpretację modelu. Wyobraźmy sobie, że porównujemy mikrobiom osób chorych i zdrowych za pomocą testów statystycznych lub modeli uczenia maszynowego. Uzyskujemy wynik - cecha 1 (np. gatunek bakterii lub operacyjna jednostka taksonomiczna) jest istotnie różna między pacjentami a osobami zdrowymi. Zauważyliśmy natomiast, że cecha 1 jest silnie skorelowana z cechą 8. Nie możemy więc jednoznacznie stwierdzić, czy to cecha 1 czy cecha 8 jest istotna.

Problemy związane z tzw. klątwą wielowymiarowości pokonywane są za pomocą technik redukcji wymiarowości, regularyzacji oraz wyboru istotnych cech przy użyciu algorytmu lub bazując na wiedzy domenowej. Redukcja wymiarowości pozwala odzwierciedlić zależności obecne w danych. Aby nie wprowadzać zbyt dużo nieistotnych informacji do modelu statystycznego, które będą zaburzać jego wydajność, stosowana jest regularyzacja. Zmniejsza ona wagę nieistotnych cech lub zupełnie je usuwa. Nie będą już zmiennymi modelu, co powinno zwiększyć jego dokładność. Jest to metoda wymagająca obliczeniowo ze względu na iteracyjny charakter (model musi weryfikować różne kombinacje zmiennych, aby wybrać tę optymalną). Dodatkowo, pracując na danych mikrobiomowych, jesteśmy w stanie manualnie zmniejszyć ich wymiarowość, np. przez przejście na wyższy poziom taksonomii lub wybranie istotnych dla nas cech na podstawie naszej wiedzy i literatury.

Obecność zer w danych jest rezultatem różnorodności mikrobiomu wśród ludzi związanej m.in. ze stosowaną dietą czy antybiotykoterapią. Wiele mikrobów, szczególnie na niższych poziomach taksonomicznych, występuje wyłącznie u niewielkiej liczby osób. Rozkład z nadwyżką zer powoduje, że dane nie spełniają założeń testów parametrycznych. Ponadto zazwyczaj oporne na wartości odstające testy nieparametryczne również nie będą miały wystarczającej mocy, aby odpowiednio analizować dane. Zera obecne w danych mogą być także generowane na etapie sekwencjonowania, co może wynikać z niedoskonałości użytej technologii bądź niewystarczającego rozmiaru próbki. Oznacza to, że widząc zero w danych, nie jesteśmy w stanie jednoznacznie stwierdzić, czy dana bakteria nie występuje u pacjenta, czy po prostu nie została u niego wykryta.

Modele statystyczne wykorzystywane w analizie mikrobiomu

Obecnie stosuje się testy zaprojektowane specjalnie pod wymogi danych mikrobiomowych. Co więcej, w związku z prężnie rozwijającą się dziedziną badań, jaką jest analityka danych (data science), oraz coraz szybszą mocą obliczeniową komputerów algorytmy uczenia maszynowego znajdują szerokie zastosowanie w analizach mikrobiomu.

Testy stosowane w analizie mikrobiomu rozwiązują problem wielu zer obecnych w danych. Korzysta się z dwuczęściowych modeli, takich jak model z rozkładem Poissona (zero-inflated Poisson, ZIP) oraz model rozkładu ujemnego dwumianowego, bardziej odporny na duże rozproszenie danych (zero-inflated negative binomial - ZINB). W pierwszej kolejności decydują, czy dane zero jest "prawdziwe" (np. bakterie, które nie występują w jelicie grubym człowieka i ich ilość będzie zawsze wynosić 0 w próbce pobranej od człowieka) czy przypadkowe (tzw. sampling zeros, które wynikają z nieodpowiedniego próbkowania), a następnie dopasowują model do danych. Ponadto stosowane są modele zwane płotkowymi (hurdle models), które działają na podobnej zasadzie co modele zero-inflated.

Ponadto do porównania mikrobiomu między osobami zdrowymi i chorymi wykorzystywane są algorytmy ALDEx/ALDEx2 (ANOVA-like differential expression), ANCOM (analysis of composition of microbiomes) oraz Songbird. Metoda ALDEx za pomocą transformacji logarytmicznych zmienia rozkład danych mikrobiomowych, aby można było zastosować na nich odpowiednie testy. ANCOM został tak zaprojektowany, aby wskazywać na specyfikę danych mikrobiomowych. Charakteryzuje go brak założeń dotyczących dystrybucji, jest odpowiedni do dużych zbiorów danych oraz kontroluje obecność wyników fałszywie dodatnich. Songbird bazuje na rangach oraz stosunkach zlogarytmizowanych, co pozwala obejść ograniczenia wynikające z kompozycyjności danych mikrobiomowych.

INTERPRETACJA WYNIKÓW BADAŃ

Analiza taksonomiczna

Etap przypisywania taksonomii zależy od wyboru metody sekwencjonowania. W sekwencjonowaniu metodą 16S początkowo sekwencje mogą zostać zgrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU), które następnie można wyszukać w taksonomicznych bazach danych, takich jak GreenGenes lub SILVA. Obecnie jednak częściej wykorzystuje się indywidualne sekwencje poddane odszumianiu (usunięciu potencjalnych błędów wprowadzonych podczas przygotowania próbek oraz sekwencjonowania), którym w następnej kolejności przypisuje się taksonomie, stosując techniki uczenia maszynowego lub metody oparte na statystyce Bayesowskiej. Należy zaznaczyć, że 16S jako technologia ma pewne ograniczenia: dokładność przypisania taksonomii zależy od sekwencji dostępnych w bazach danych oraz od wyboru algorytmu przypisującego taksonomię; przez to, że sekwencjonujemy tylko fragment jednego genu (markerowego 16S rRNA), rozdzielczość jest typowo ograniczona do rodzaju (zamiast gatunku czy szczepu).

W przypadku sekwencjonowania metodą shotgun przypisanie taksonomii jest dokładniejsze. Techniki przypisujące taksonomię oparte są m.in. na poszukiwaniu k-merów sekwencji (krótkich podsekwencji o wybranej długości) wśród genomów obecnych w bazie danych. Należy jednak zwrócić uwagę na głębokość sekwencjonowania (ilości wygenerowanych odczytów na próbkę), gdyż przy zbyt płytkim sekwencjonowaniu rzadsze bakterie mogą zostać niedostrzeżone.

Bioróżnorodność mikrobiomu - metryki różnorodności alfa i beta

Bioróżnorodność mikrobiomu jelitowego określa jego zróżnicowanie. Ze względu na mnogość funkcji pełnionych przez bakterie jelitowe różnorodność mikrobiomu jest niezwykle ważna. W kontekście danych mikrobiomowych wyróżnia się dwa typy bioróżnorodności: alfa oraz beta. Różnorodność alfa odnosi się do zróżnicowania mikrobiomu w danej próbce, natomiast różnorodność beta wskazuje na różnice między dwiema próbkami. Każda z różnorodności może być mierzona na wiele sposobów.

Wśród metryk alfa-różnorodności najczęściej stosowane są: indeks Shannona, indeks Simpsona oraz filogenetyczny indeks różnorodności Faitha. Indeks Shannona informuje o prawdopodobieństwie, że dwa wylosowane z próbki osobniki będą należały do różnych gatunków. Im wyższy wskaźnik Shannona, tym większa różnorodność próbki. Indeks Simpsona określa, jakie jest prawdopodobieństwo, że dwa osobniki wybrane losowo z próby będą należeć do tego samego gatunku. Im większa wartość indeksu, tym mniejsze zróżnicowanie. Filogenetyczny indeks różnorodności Faitha bazuje na drzewie filogenetycznym, a różnorodność filogenetyczna próbki określana jest jako suma długości wszystkich gałęzi drzewa filogenetycznego obejmujących członków zbioru.

Wśród metryk beta-różnorodności wyróżnia się m.in. wskaźnik odmienności Braya-Curtisa, dystans Jaccarda czy dystans UniFrac. Wskaźnik odmienności Braya-Curtisa wskazuje na różnice w liczebności drobnoustrojów między dwiema próbkami (np. na poziomie gatunku). Wskaźnik równy 0 oznacza, że obie próbki zawierają dokładnie te same gatunki w tych samych ilościach. Współczynnik Jaccarda porównuje dwie próbki pod względem cech (jednostek taksonomicznych), tych, które występują w obu próbkach, i tych, które są unikatowe dla jednej z próbek. Im wyższa wartość indeksu, tym wyższe podobieństwo między próbkami. Indeks ten jest wrażliwy na małe wartości. Dystans Jaccarda obliczany jest poprzez odjęcie współczynnika podobieństwa Jaccarda od 100%. Dystans UniFrac różni się od poprzednich dwóch wskaźników różnorodności beta, ponieważ w obliczaniu różnicy między dwiema próbkami bierze pod uwagę filogenetyczne zależności między obecnymi w niej mikrobami. Wyróżniamy ważony (weighted) i nieważony (unweighted) dystans UniFrac. Ważony dystans UniFrac podczas analizy filogenetycznej bierze pod uwagę liczebność drobnoustrojów, podczas gdy nieważony UniFrac bazuje wyłącznie na obecności lub nieobecności danej cechy/gatunku.

Analiza ścieżek metabolicznych

Sekwencjonowanie metodą shotgun umożliwia nie tylko poznanie środowiska bakterii na poziomie taksonomicznym, lecz także analizę funkcji potencjalnych produktów genów mikrobiomu. Najczęściej stosowanymi bazami funkcjonalnymi są KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) oraz GO (Gene Ontology).

Baza danych KEGG umożliwia przypisanie interesującego nas białka do szlaku metabolicznego, w którym on występuje. Baza zawiera ręcznie opisane szlaki metaboliczne oraz operuje na jednostkach zwanych KO (KEGG Orthologs). KO określa grupę genów/białek mających podobną funkcję molekularną.

Celem Ontologii Genów (GO) jest zunifikowanie nazewnictwa oraz wzajemnych zależności funkcji genów, a zwłaszcza ich produktów - białek. Każde białko opisują trzy kategorie, tj. funkcja molekularna (molecular function), lokalizacja białka (cellular component) oraz proces biologiczny, w który białko jest zaangażowane (biological process). Funkcja molekularna informuje o ogólnej funkcji, jaką pełni białko, takiej jak np. transport czy kataliza. Lokalizacja białka mówi o strukturze komórkowej, w której dane białko wykonuje swoją funkcję. Proces biologiczny określa szerzej pojęty proces, w którym aktywność białka jest niezbędna (np. naprawa DNA). GO jest bazą hierarchiczną, a jedno białko może mieć wiele identyfikatorów GO.