Pułapki diagnostyczne oznaczania hormonów, białek i przeciwciał - Krystyna Sztefko

? Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., Warszawa 2025

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorka i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Recenzent: Prof. dr hab. n. med. Bogdan Solnica

Prof. dr hab. n. med. Marek Ruchała

Wydawca: Anna Plewa

Redaktor prowadzący: Barbara Nowak-Pacholczak

Redaktor merytoryczny: Agnieszka Gruszka

Producent: Marta Kubica

Projekt okładki i stron tytułowych: Kamil Cybulski - cybul.art

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2025 r. (Wydanie I)

Warszawa 2025

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

ISBN: 978-83-01-24610-5

DOI: https://doi.org/10.53271/2025.155

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2

02-460 Warszawa

pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.: Michał Latusek

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: BR.PZWL@pwn.pl

DLACZEGO TA KSIĄŻKA POWSTAŁA?

Trudno sobie dzisiaj wyobrazić podejmowanie medycznych decyzji diagnostycznych czy terapeutycznych bez badań laboratoryjnych. Coraz nowsze technologicznie automaty biochemiczne, immunochemiczne, hematologiczne czy mikrobiologiczne i coraz lepsze systemy informatyczne z wykorzystaniem uczenia maszynowego i sztucznej inteligencji widoczne są w każdym laboratorium, niezależnie od jego wielkości. Narastająca w tempie geometrycznym liczba nowych biomarkerów i niewyobrażalna liczba wykonywanych we wszystkich laboratoriach badań, niezależnie od ich rodzaju, ciągła presja na wykonywanie oznaczeń "tu i teraz", "natychmiast" są widoczne na całym świecie.

Zmiany, które zaszły w laboratoriach medycznych w ostatnich dwóch-trzech dekadach, to nie tylko zmiany technologiczne i informatyczne. Laboratoria są od dawna postrzegane jako "fabryka wyników", a wykorzystywanie wyników laboratoryjnych staje się coraz bardziej automatyczne. Dzięki automatyzacji widoczny jest ogromny postęp w metodach analitycznych wykorzystywanych w medycznych laboratoriach, znacznie skrócony jest czas wykonywania oznaczeń i przekaz wyników dla odbiorcy (lekarza, pacjenta). To niestety często powoduje nieprawidłowe korzystanie z badań laboratoryjnych: zlecana jest nadmierna liczba badań lub zlecane są badania laboratoryjne niewłaściwe w danej sytuacji klinicznej pacjenta. Powszechna dostępność i szybkość wykonywania analiz spowodowały pewien niekorzystny trend - zaciemnia się cel medyczny wykonywania badań, cel ten nie jest już najważniejszy - ważniejsze stają się korzyści ekonomiczne z wykonywania coraz większej liczby badań. Chociaż wyniki badań laboratoryjnych nie stanowią wyłącznej podstawy podejmowania decyzji klinicznych, to w wielu sytuacjach nieprawidłowe wykorzystanie informacji z laboratorium i/lub nieprawidłowa interpretacja wyników może narazić bezpieczeństwo pacjenta. Ogromnym minusem "szybkości wykonywania i szerokiej dostępności" badań laboratoryjnych jest coraz częściej nieprawidłowa interpretacja wyników mogąca mieć istotny wpływ na decyzje kliniczne.

Wyniki uzyskiwane dzisiaj w laboratoriach medycznych to ogrom informacji, które przytłaczają, generując niepotrzebny szum informacyjny. W tym szumie informacyjnym zagubieni są nie tylko lekarze i pacjenci, lecz także diagności laboratoryjni. Przyczynia się to często do niezrozumienia informacji zawartej w wynikach i błędnego ich wykorzystywania. Powszechny brak wiedzy w społeczeństwie na temat metod laboratoryjnych, ich zalet, a przede wszystkim ich ograniczeń, powoduje, że oznaczenia tego samego parametru są powtarzane w różnych laboratoriach, w różnych okresach czasowych, często niepotrzebnie. Brak porównywalności wyników uzyskiwanych różnymi metodami nie przyczynia się do rozwiązania problemu diagnostycznego i często powoduje nieporozumienia. Koszty ekonomiczne i czasowe takiego postępowania ponosi nierzadko pacjent, ponoszą podatnicy, a także lekarze.

Panuje powszechne przekonanie, że "robimy za mało badań", jakby liczba wykonanych badań laboratoryjnych miała determinować zdrowie pacjenta. Nikt nie kwestionuje konieczności wykonywania okresowych laboratoryjnych badań kontrolnych, które są niezbędne w prewencji chorób czy monitorowaniu procesu leczenia. Nie powinno się nigdy ograniczać badań laboratoryjnych w sytuacjach krytycznych i ratujących życie. Jednak jako osoba przez dekady związana z laboratorium jestem przeciwna wykonywaniu nadmiernej liczby badań, podejścia "ilościowego" do zlecania badań laboratoryjnych na zasadzie - im więcej, tym lepiej. Byłam, jestem i będę za "jakością" wyników badań laboratoryjnych wykonywanych walidowanymi metodami, za wykonywaniem celowanych badań mających uzasadnienie kliniczne, które muszą być interpretowane z uwzględnieniem zmienności analitycznej, zmienności biologicznej, chorób współtowarzyszących i potencjalnych czynników interferujących. Bez uwzględnienia wszystkich tych aspektów nadmierne wykonywanie badań przynosi znacznie więcej nieporozumień, frustracji, błędnych decyzji klinicznych i niejednokrotnie zbędnych kosztów dla pacjenta.

Bez wątpienia, automatyzacja laboratoriów istotnie polepszyła precyzję analityczną i szybkość uzyskiwania wyników. Ale w automatach nie ma cudownych rozwiązań metodycznych, nadal wykorzystuje się fizykochemiczne podstawy reakcji chemicznych znane od lat. W przypadku oznaczania stężenia prostych cząsteczek biochemicznych metodologia nie sprawia obecnie większych problemów. Wykonywane kiedyś manualnie oznaczanie stężenia glukozy metodą z oksydazą glukozy czy heksokinazą jest obecnie zautomatyzowane. Chociaż każda metoda analityczna ma swoje ograniczenia, najbardziej podatne na różnego rodzaju pułapki metodyczne są metody immunochemiczne, którymi oznacza się tysiące substancji. Ale bez tych metod nie byłoby możliwości oznaczania stężenia wielu analitów, niezbędnych w praktycznie każdej dziedzinie medycyny. Dlatego zarówno diagności laboratoryjni, jak i lekarze powinni znać ograniczenia tych metod i uważniej interpretować wyniki.

Problem błędów, których nie da się wychwycić żadnym systemem zapewniania jakości stosowanego przez laboratorium, jest często marginalizowany. Uświadomienie sobie liczby oznaczeń wykonywanych metodami immunochemicznymi codziennie, w każdym laboratorium w Polsce i na świecie, zmienia perspektywę oceny błędów w immunochemii. Niewielki odsetek błędów nieregularnych czy też interferencji mających wpływ na wiarygodność oznaczenia, czyli powszechnie uzyskiwane "niezgodności" w wynikach, "dziwne wyniki" czy wyniki "niepasujące" do obrazu klinicznego przekłada się na ogromną liczbę wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Jest oczywiste, że nie każdy błędny wynik skutkuje podejmowaniem błędnych decyzji klinicznych, ale również jest oczywiste, że nikt nie chciałby być leczony na podstawie błędnych wyników laboratoryjnych.

Wiedza o przyczynach uzyskiwania błędnych wyników laboratoryjnych dla różnych markerów biochemicznych oznaczanych metodami immunochemicznymi to przede wszystkim domena diagnostów laboratoryjnych. Ale sygnał o niezgodności wyniku laboratoryjnego z obrazem klinicznym wskazujący na występowanie nieznanej interferencji diagności laboratoryjni uzyskują najczęściej od lekarza. Dlatego lekarze muszą wiedzieć, jakie są ograniczenia metodyczne, muszą mieć świadomość występowania interferencji czy też pułapek metodycznych i wspólnie z diagnostą rozwiązywać często bardzo trudne problemy diagnostyczne i radzić sobie z interpretacją "wątpliwych" wyników. Nie wolno w przypadku problemów metodycznych prezentować biernej postawy typu "to błąd", "wynik się jeszcze raz powtórzy" czy "sprawdzimy w innym laboratorium". Podejście do wyników obarczonych błędem i laboratorium, które je wykonywało, jest często lekceważące. Niewiele osób tak naprawdę zdaje sobie sprawę, co i kto jest prawdziwym "winowajcą". Dlatego książka ta ma w zamiarze obudzić czujność nie tylko diagnostów laboratoryjnych, lecz także lekarzy w zakresie błędów nieregularnych wynikających ze swoistej natury metod immunochemicznych i wskazać narzędzia rozwiązywania problemów i lepiej interpretować "dziwne" wyniki, co zdecydowanie zmniejszy potencjalne narażenie pacjenta na nieprawidłowe postępowanie kliniczne i pomoże obniżyć koszty badań laboratoryjnych.

Rozdział 1IMMUNOCHEMIA ZNANA I NIEZNANA

Zastosowanie immunochemii w analityce to bez wątpienia jedno z najbardziej innowacyjnych osiągnięć z zakresu metod laboratoryjnych XX w. Metody immunochemiczne są podstawą oznaczania stężenia ogromnej liczby cząsteczek we krwi, surowicy/osoczu i innych płynach biologicznych, których wyniki są wykorzystywane do celów klinicznych. Ich systematyczne wprowadzanie do codziennej praktyki medycznych laboratoriów diagnostycznych, coraz lepsza wiarygodność uzyskiwanych wyników i powszechna dostępność miały i nadal będą miały wpływ na rozwój wielu dziedzin medycyny, takich jak endokrynologia, onkologia, hematologia, immunologia, alergologia czy wirusologia. Metody te cechują się wysoką swoistością i coraz lepszą czułością analityczną, a także są efektywne ekonomicznie. Metodami immunochemicznymi można nie tylko identyfikować różne białka, steroidy, pochodne amin, lecz także mierzyć ilościowo ich stężenie w płynach biologicznych. Zatem metody te mogą być jakościowe, półilościowe i ilościowe. Ogromny potencjał tych metod to nie tylko ich swoistość analityczna, lecz także możliwość ich wykorzystania do pomiaru biomarkerów w próbkach biologicznych, głównie we krwi/surowicy/osoczu, występujących w stężeniach w zakresie od 10-3 do aż 10-15 mol/l. Charakterystyka i własności metod immunochemicznych są odmienne od metod stosowanych w chemii klinicznej, co przedstawiono w tabeli 1.1, a w tabeli 1.2 podano anality, które są powszechnie oznaczane metodami immunochemicznymi w medycynie laboratoryjnej.

Tabela 1.1.

Porównanie podstawowych metod chemii klinicznej i metod immunochemicznych

Mierzone anality

Metody chemii klinicznej

Metody immunochemiczne

Podstawowe markery biochemiczne (np. glukoza, mocznik)

Białka, peptydy (hormony, receptory, białka swoiste, autoprzeciwciała)

Steroidy, witaminy, pochodne amin

Przeciwciała, antygeny (serologia chorób infekcyjnych)

Cechy chemiczne

Struktura cząsteczki

Znana

Dla wielu białek nieznana

Znana

Zmienna, nieznana

Masa cząsteczkowa

Znana

Dla glikoprotein i niektórych heterogennych białek nieznana

Znana

Różne klasy i podklasy

Niezmienność składu

TAK

Tylko dla bardzo stabilnych cząsteczek

TAK

Odpowiedź organizmu zmienna w czasie

Zmiany struktury w czasie

NIE

Fragmenty degradacji Modyfikacje potranslacyjne Makroformy

NIE

Fragmenty cząsteczki, przeciwciała mono- i poliklonalne, wolne lub skompleksowane

Różna awidność, różne powinowactwo

Heterogenność

Brak lub minimalne zmiany struktury cząsteczki

TAK/NIE w zależności od rodzaju białka lub peptydu

NIE

Różne genotypy/serotypy

Mutacje antygenowe

Formy analitu we krwi

Monomery

Formy wolne i/lub związane z białkami

Formy wolne i związane z białkami

Wolne białka lub ich fragmenty

Występowanie makroform

Na przykład enzymy

TAK

TAK

TAK

Formy glikozylowane

NIE

TAK

NIE

TAK

Ryzyko podwyższonego stężenia w surowicy dla populacji

Niskie

Niskie

Niskie

Wysokie ryzyko dla indywidualnej osoby i populacji

Cechy metod do oznaczania analitów

Metody ilościowe

Pomiar stężenia lub aktywności

Pomiar stężenia całkowitego i/lub wolnego hormonu

Pomiar stężenia całkowitego lub wolnego steroidu

Identyfikacja przeciwciał

Metody półilościowe

TAK

TAK

NIE

Pomiar awidności i/lub stężenia dla niektórych przeciwciał

Metody jakościowe

TAK

NIE/TAK

NIE

TAK

Standaryzacja metod

TAK

Zgodność pomiarowa do układu SI dla większości analitów

Brak standaryzacji dla wielu białek

TAK (LC-MS/MS)

Brak standaryzacji

Harmonizacja metod

TAK

TAK dla niektórych analitów

NIE

NIE

Zależność stężenia analitu od sygnału reakcji

Liniowa zależność w zakresie dynamicznym metody

Możliwość ponownej kalibracji po zmianie serii odczynników

Liniowa (po transformacji matematycznej)

Wprost proporcjonalna dla metod niekompetycyjnych, odwrotnie proporcjonalna dla metod kompetycyjnych

Liniowa (po transformacji matematycznej)

Wprost proporcjonalna dla metod niekompetycyjnych, odwrotnie proporcjonalna dla metod kompetycyjnych

Nieliniowa odpowiedź - brak odpowiedzi, gdy sygnał jest niski

Brak wzrostu odpowiedzi, gdy system jest wysycony

Moc sygnału zależy od powinowactwa do antygenu wiązania przeciwciał

Wartości referencyjne

TAK

TAK

TAK

TAK/NIE

Indeks osobniczy

Wysoki/średni

Niski

Niski

Średni/niski

LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) - chromatografia cieczowa połączona z tandemową spektrometrią mas

Tabela 1.2.

Najważniejsze substancje oznaczane metodami immunochemicznymi

- Hormony białkowe i peptydowe (np. TSH, insulina, PTH, gastryna)

- Hormony steroidowe (np. kortyzol, aldosteron)

- Pochodne amin biogennych (np. tyroksyna, adrenalina)

- Białka swoiste (np. ferrytyna, SHBG, TBG)

- Markery nowotworowe (np. CEA, PSA, HCG)

- Markery kardiologiczne (np. troponina, NT-proBNP)

- Białka alergenowe (IgE swoiste)

- Autoprzeciwciała (np. anty-TPO, TRAB, anty-Tg)

- Przeciwciała powstające w wyniku infekcji (np. immunoglobuliny klasy IgG, IgM)

- Antygeny wirusów (np. HBs)

- Witaminy (B12, witamina D)

- Leki (np. karbamazepina, digoksyna)

- Markery stanu zapalnego (np. CRP)

- Narkotyki i inne związki chemiczne

anty-Tg - przeciwciała przeciwko tyreoglobulinie; anty-TPO - przeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej; CEA (carcinoembrionic antigen) - antygen karcynoembrionalny; CRP (C-reactive protein) - białko C-reaktywne; HBs - marker diagnostyczny w zakażeniu wirusem zapalenia wątroby typu B; HCG (human chorionic gonadotropin) - ludzka gonadotropina kosmówkowa; NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) - N-końcowy fragment peptydu natriuretycznego typu B; PSA (prostate-specific antigen) - swoisty antygen sterczowy; PTH (parathyroid hormone) - parathormon; SHBG (sex hormone binding globulin) - globulina wiążąca hormony płciowe; TBG (thyroxine-binding globulin) - globulina wiążąca tyroksynę; TRAB (thyroid receptor antibodies) - przeciwciała przeciwko receptorowi tyreotropiny; TSH (thyroid stimulating hormone) - hormon tyreotropowy

Przez dziesięciolecia zmieniały się formuły/formaty metod immunochemicznych, wykorzystywane do śledzenia reakcji znaczniki (izotopowe, enzymatyczne, chemiluminescencyjne) i szybkość wykonywania oznaczeń. Krokiem milowym było wykorzystanie w metodach immunochemicznych przeciwciał monoklonalnych, a rozwój metod biotechnologicznych pozwolił na wytwarzanie coraz lepszych, bardziej swoistych przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych. Na polepszenie jakości metod immunochemicznych miały także wpływ lepsze sposoby sprzęgania antygenów i przeciwciał z fazą stałą, a także ze znacznikami metody. Istotną zmianą stało się również znaczne skrócenie czasu oznaczania analitów i zmniejszenie objętość materiału biologicznego potrzebnego do pojedynczego oznaczenia analitu. Ogromny postęp w metodach immunochemicznych, jaki się dokonał dzięki wykorzystaniu nanotechnologii, stwarza coraz większe możliwości wykorzystania tych metod do oznaczania antygenów i przeciwciał również w systemie testów wykonywanych w miejscu opieki nad pacjentem (point of care testing, POCT).

Niezależnie od tego, jak ogromny będzie postęp w identyfikowaniu i ilościowym oznaczaniu różnych analitów białkowych i niebiałkowych, jedno pozostaje niezmienne - w typowych metodach immunochemicznych wykorzystywanych w laboratoriach medycznych można wyróżnić trzy składowe:

1. Rozpoznawanie oznaczanej substancji (endogennej lub egzogennej) przez swoistą substancję rozpoznającą. Najczęściej jest to przeciwciało wychwytujące metody (zwierzęce), ale też stosowane są inne cząsteczki zdolne do rozpoznania analitu [nanociała, aptamery, cząsteczki odwzorowane na polimerach (molecular imprinting polimer, MIP)]. Jest to część "rozpoznająca" metody.

2. Przetransformowanie efektu wiązania antygenu z przeciwciałem (lub z inną cząsteczką wychwytującą antygen) w mierzalny sygnał reakcji.

3. Ilościowy pomiar sygnału reakcji w wykorzystaniem metod fizykochemicznych (pomiar absorbancji, fluorescencji, chemiluminescencji, elektrochemiczny i inne). Jest to część "pomiarowa" metody.

Postęp w jakości metod immunochemicznych i możliwościach ich wykorzystywania jest niewiarygodny, ale trudno przewidzieć, kiedy ten postęp będzie w pełni widoczny w zminiaturyzowanych automatach immunochemicznych. Oczekuje się, że w rutynowych laboratoriach medycznych wszelkie ograniczenia tych metod zostaną wyeliminowane, a przynajmniej w znacznym stopniu zminimalizowane. Zanim to jednak nastąpi, diagności laboratoryjni będą nadal korzystać z co prawda coraz lepszych metod immunochemicznych, ale nadal niepozbawionych pułapek metodycznych, a tym samym będą uzyskiwać wyniki oznaczeń mogące mieć wpływ na bezpieczeństwo pacjenta. Dlatego wiedza na temat tych metod i ich ograniczeń musi być stale aktualizowana.

1.1.Metody immunochemiczne

Do pomiaru stężenia różnych substancji w próbkach biologicznych wykorzystywane są ich własności fizyko-chemiczne. Na przykład do oznaczania stężenia mocznika, glukozy czy elektrolitów wykorzystuje się proste, klasyczne, metody analityczne, takie jak metody spektrofotometryczne, enzymatyczne czy potencjometrycze. Metody immunochemiczne to całkowicie odmienna technika analityczna, w której wykorzystuje się wysoce swoistą reakcję pomiędzy antygenem obecnym w próbce pacjenta a przeciwciałem wychwytującym metody. Ściślej rzecz ujmując: reakcja polega na wiązaniu jednej lub więcej unikalnych konformacji na cząsteczce antygenu (epitop) przez korespondujące miejsce wiązania na cząsteczce przeciwciała (paratop). Zarówno epitop, jak i paratop mogą być definiowane tylko poprzez ich wzajemną komplementarność, a nie poprzez ich wewnętrzne własności chemiczne. Ta komplementarność jest charakteryzowana przez swoistość oddziaływania, co jest podstawą metod immunochemicznych. Ogromny potencjał tych metod tkwi w unikalnych własnościach przeciwciał, które rozpoznają określoną strukturę (epitop) na cząsteczce analitu w bardzo złożonej mieszanie różnych substancji chemicznych, często spośród analitów o bardzo zbliżonej budowie.

Wiele metod immunochemicznych to metody jakościowe niewymagające znacznika - te metody nie będą w tej książce szczegółowo omawiane. Ilościowe oznaczenie stężenia analitu, poza połączeniem antygenu z przeciwciałem, wymaga dodatkowo znakowanego antygenu (lub znakowanego przeciwciała), aby możliwe było prześledzenie reakcji. Granica oznaczalności współczesnych metod immunochemicznych zależy od: 1) złożonej kombinacji fizykochemicznych właściwości mierzonych antygenów, powinowactwa stosowanych przeciwciał i powierzchni reakcyjnej - jest tzw. część rozpoznająca metody; 2) rodzaju i własności stosowanych znaczników - jest to tzw. część detekcyjna metody.

Chcąc zrozumieć immunochemię i jej ograniczenia, nie wystarczy pamiętać tylko o podstawowej reakcji antygen-przeciwciało. Ograniczenia metod immunochemicznych mogą być spowodowane nie zawsze właściwą immobilizacją przeciwciał lub antygenów na fazie stałej, nieswoistym rozpoznawaniem analitu przez przeciwciało (lub inne czynniki rozpoznające), czy też mogą dotyczyć substancji znacznikowych wykorzystywanych do znakowania antygenów/przeciwciał, a także samego układu pomiarowego. Oznaczenie analitu metodą immunochemiczną to nie tylko proste dodanie analitu do "probówki", "dołka na mikropłytce" czy na pasek nitrocelulozy. To złożony proces, często całkowicie niewidoczny dla diagnosty laboratoryjnego czy osób wykonujących oznaczenia testem kasetkowym. Pełne zrozumienie tego procesu jest podstawowym kluczem do prawidłowej interpretacji wyniku uzyskanego metodą immunochemiczną.

1.2.Immobilizacja przeciwciał na fazie stałej

Pierwsze metody immunochemiczne były wykonywane w fazie ciekłej (powszechnie znana metoda radioimmunologiczna; radioimmunoassay, RIA). Metody RIA, chociaż nadal stosowane, wymagają rozdziału frakcji związanej (kompleks antygen-przeciwciało) od frakcji wolnej, co sprawia, że konieczny staje się dodatkowy etap metody, którego nie zawsze da się zautomatyzować. Pod koniec lat 60. ubiegłego stulecia zaobserwowano, że białka spontanicznie adsorbują się na plastikowych powierzchniach i to dało impuls do zastosowania różnych materiałów organicznych w metodach immunochemicznych, dzięki czemu uproszczono etap rozdziału kompleksu antygen-przeciwciało od frakcji wolnej (niezwiązanej) i pozwoliło początkowo na szybszy rozwój metod oznaczania hormonów, a następnie metod oznaczania przeciwciał. Od tego czasu powierzchnia fazy stałej jest integralną składową większości metod immunochemicznych.

Określenie "adsorpcja białek na fazie stałej" rodzi kilka pytań: jak białka się adsorbują na fazie stałej?, jak zaadsorbowane białko zachowuje się jako indywidualna cząsteczka, a jak w grupie białek?, jaki mechanizm rządzi procesem adsorpcji i czy adsorpcja wpływa na biologiczną funkcję białka? Adsorpcja cząsteczek na fazie stałej w praktyce to bardzo trudny proces i nadal daleki od pełnego zrozumienia. Proces ten jest złożony i zależy od wielu czynników, takich jak pH, temperatura, powierzchnia fazy stałej, rodzaj białka oraz technika oceny jakości. Dodatkową komplikacją jest także cel, do jakiego ma być wykorzystana powierzchnia z zaadsorbowanym białkiem. W celu zwiększenia czułości metod immunochemicznych niektóre powierzchnie są modyfikowane przez ich funkcjonalizowanie odpowiednimi grupami chemicznymi. W ten sposób otrzymuje się powierzchnie bardziej homogenne, mające mniejszy wpływ na zmianę pofałdowania białek. Niewielu diagnostów laboratoryjnych i lekarzy się zastanawia, co znajduje się na fazie stałej - na ściankach probówki, dołkach czy "kulkach", a instrukcje do metod są w tym zakresie coraz bardziej lakoniczne.

W metodach immunochemicznych białko (antygen lub przeciwciało) jest adsorbowane na różnych materiałach [probówki plastikowe, dołki (mikropłytki), nitroceluloza, membrany nylonowe, kulki polistyrenowe i mikrocząstki]. Kulki polistyrenowe funkcjonują podobnie jak płytka (ścianka probówki), ale mają większą powierzchnię. Z kolei kulki paramagnetyczne, często wykorzystywane, dają możliwość przeprowadzenia rozdziału frakcji związanej z kulkami i pozostałymi składnikami mieszaniny reakcyjnej.

Immobilizacja białka na fazie stałej zależy od rodzaju powierzchni. Mechanizm adsorpcji przeciwciał czy antygenów na powierzchni fazy stałej jest różny. Wszystkie te materiały "fazy stałej" są przygotowywane w taki sposób, aby zwiększyć ich zdolność do adsorpcji białek. Proces immobilizacji jest konsekwencją wiązania białko-plastik, a przygotowanie funkcjonalizowanej powierzchni sprzyja porównywalności między powierzchniami stosowanymi do tego samego celu. Bezpośrednia immobilizacja przeciwciała (lub antygenu) na fazie stałej może być niekonwalencyjna. Adsorpcja na powierzchni stałej jest mediowana przez oddziaływanie międzycząsteczkowe (np. siły van der Walsaa, wiązania hydrofilowe i oddziaływania hydrofobowe). Rodzaj wiązań zależy od liczby hydrofobowych lub hydrofilowych reszt aminokwasowych w adsorbowanej cząsteczce. To również determinuje wybór rodzaju powierzchni polistyrenowej lub jej modyfikację poprzez dodanie grup hydrofobowych. Białka mogą być immobilizowane na powierzchni poprzez bezpośrednią adsorpcję, kowalencyjneprzyłączenie do funkcjonalizowanej powierzchni, immunochemicznie lub niekonwalencyjnymi metodami adsorpcji. Przedstawienie zagadnień związanychz adsorpcją białek na różnych materiałach, nawet skrótowe, wykracza poza ramy tego opracowania.

Immobilizacja przeciwciał na fazie stałej jest kluczowa do otrzymywania powtarzalnych wyników pomiaru stężenia białek. Chociaż spontaniczna adsorpcja białek na polistyrenie jest techniką powszechnie stosowaną w metodach immunochemicznych, to jednak w trakcie adsorpcji może dojść do obniżenia całkowitej zdolności wiązania antygenu (przeciwciała) przez zaadsorbowane na powierzchni przeciwciało(antygen), co sprzyja obniżeniu stosunku sygnału reakcji do tła (signal-to-noise). Po każdym procesie pasywnej adsorpcji niezbędne jest zablokowanie niezajętych miejsc na fazie stałej poprzez dodanie białka, np. albuminy wołowej (bovine serum albumin, BSA).

Jak wiadomo, granica oznaczalności immunochemicznej zależy nie tylko od jakości przeciwciał (antygenów/analogów) wychwytujących analit, lecz także od jakości ich immobilizacji na fazie stałej z wystarczającą gęstością powierzchniową. Konformacja przeciwciał immobilizowanych na fazie stałej musi mieć taką postać jak przeciwciała w roztworze i mieć taką orientację, która pozwoli na maksymalizację zdolności wychwytujących przeciwciał. W idealnych warunkach po immobilizacji przeciwciało musi mieć nadal wysoką pojemność wiązania, pełną zdolność do utrzymania aktywności immunologicznej oraz zapewniać wysoki stosunek sygnału do tła. Pożądana jest również niska zmienność pomiędzy kolejnymi seriami produkcyjnymi powierzchni do immobilizacji przeciwciał. Cząsteczki przeciwciał mogą się adsorbować do polistyrenowych powierzchni w czterech różnych orientacjach, przy czym najbardziej pożądana i jedyna z punktu widzenia jakości metody immunochemicznej, jest orientacja end-on Fab-up (fragmentem Fab do góry) (ryc. 1.1A). Adsorpcja przeciwciał w każdej innej orientacji drastycznie zmniejsza zdolność przeciwciała do wiązania antygenu. Inna metoda immobilizacji przeciwciał wykorzystuje mostek disiarczkowy zlokalizowany w rejonie zawiasowym przeciwciał. Orientacja przeciwciał na powierzchni stałej ma istotny wpływ na dostęp antygenu do miejsc wiążących znajdujących się na domenach Fab.

Chociaż przeciwciała mają mniejszą podatność na denaturację w porównaniu z innymi białkami, to nawet minimalna denaturacja przeciwciał może wyeksponować regiony hydrofobowe przeciwciał, zwiększając tym samym nieswoiste wiązanie białek i potencjalnie zmieniając dolną granicę pomiaru (limit of detection, LoD) metody. Immobilizacja przeciwciał na fazie stałej jest istotnym krokiem w procedurze przygotowania metod do pomiaru różnych antygenów (białek, wirusów, bakterii, leków, toksyn). Orientacja przeciwciał na kulkach magnetycznych jest ważniejsza niż ich liczba. Wychwytujące przeciwciało immobilizowane na linii testowej w metodzie immunochromatograficznej (lateral flow immunoassay, LFIA) może być zorientowane przy wykorzystaniu białek fuzyjnych (fusion proteins), które są związane w dwojaki sposób: na celulozie i na fragmencie Fc przeciwciała. Zasadniczo orientacja przeciwciał na powierzchni fazy stałej podnosi zdolność wiązania antygenu w metodach ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i LFIA i przyczynia się do zwiększenia czułości tych metod. Jest to szczególnie prawdziwe dla małych antygenów, których promień Stokesa (miara absolutnej wielkości cząsteczki) jest mniejszy niż przeciwciał, ponieważ możliwe jest równoczesne wiązanie. W metodach ELISA i ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay) przeciwciała adsorbują się na powierzchniach hydrofobowych.

W wielu metodach oznaczania białek (hormonów, białek swoistych, peptydów, przeciwciał) immobilizacja cząsteczek (antygenu lub przeciwciała) na powierzchni fazy może być uzyskana bezpośrednio lub za pomocą cząsteczki "łącznikowej" (ryc. 1.1B). Do takiej immobilizacji wykorzystuje się białko A/G, streptawidynę wiążącą biotylylowane białka, immunoglobuliny lub kwas boronowy.

1.2.1.Streptawidyna-biotyna

Wysokie powinowactwo awidyny i streptawidyny do biotyny dostarcza alternatywnej metody adsorpcji (nieadsorpcyjna, niekowalencyjna immobilizacja antygenu lub przeciwciała). Streptawidyna ma niskie powinowactwo do polistyrenu, dlatego musi być kowalencyjnie związana do powierzchni, immobilizowana przez nieistotny dla metody nośnik (substancję "łącznikową") lub immobilizowaną biotynę, która jest kowalencyjnie przyłączona do funkcjonalizowanego polistyrenu. Ta metoda pozwala na immobilizację antygenów lub przeciwciał, które słabo adsorbują się na plastiku lub nitrocelulozie i/lub łatwo ulegają denaturacji w procesie adsorpcji. Immobilizacja biotynylowanego przeciwciała do streptawidyny opłaszczonej na fazie stałej nie powoduje utraty miejsc wiązania antygenu.

Streptawidyna to tetrameryczna glikoproteina, która wiąże z wysokim powinowactwem niekowalencyjnie cztery cząsteczki biotyny z wysokim powinowactwem. Biotyna (witamina H, witamina B7 lub koenzym R) to mała cząsteczka, która może być sprzężona z przeciwciałami, enzymami i innymi cząsteczkami bez wpływu na ich aktywność biologiczną. Sprzęganie biotyny z makromolekułami (biotynylacja) nie ma wpływu na konformację białka, jego wielkość czy funkcjonalność. To wiązanie jest szybkie, niezależne od pH, temperatury, rozpuszczalników organicznych, proteolizy i innych czynników. Biotynylacja białek, a przez to łatwość przyłączenia ich do streptawidyny, jest dobrze znaną techniką stosowaną w różnych metodach analitycznych i biochemicznych, która znalazła zastosowanie również w metodach immunochemicznych. Na przykład kulki magnetyczne opłaszczone streptawidyną uniwersalnie wiążą każdy rodzaj biotynylowanych cząsteczek, takich jak przeciwciała, białka, peptydy, DNA czy aptamery, dzięki wysokiemu powinowactwu biotyny do streptawidyny. Za pomocą magnesu kulki magnetyczne wraz np. z kompleksem antygen-przeciwciało czy też inną cząsteczką wychwytującą antygen mogą być łatwo oddzielone od reszty mieszaniny reakcyjnej. Z punktu widzenia analityki taka procedura może być wykorzystywana do oczyszczania białek, izolowania komórek, immunoprecypitacji i detekcji różnych cząsteczek.

W automatach immunochemicznych sposób immobilizacji przeciwciał wychwytujących na fazie stałej (np. kulki magnetyczne) nie zawsze jest identyczny w każdej metodzie oznaczania analitów. Na przykład układ streptawidyna-biotyna-przeciwciało wychwytujące w jednym automacie może być wykorzystywany tylko w kilku metodach, a na automacie innej firmy w dwudziestu metodach. Również w metodach do oznaczania tego samego analitu na różnych automatach mogą być wykorzystywane różne sposoby immobilizacji przeciwciał na fazie stałej. Połączenie faza stała-"łącznik"-streptawidyna-biotynylowane przeciwciało wychwytujące są częste i najbardziej znane diagnostom laboratoryjnym. Ale układ streptawidyna-biotyna wykorzystywany jest też do przyłączenia biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego (znakowanego) poprzez streptawidynę do znacznika enzymatycznego. Należy też wyraźnie podkreślić, że na automatach immunochemicznych w wielu metodach może być stosowany układ streptawidyna-biotyna, ale oznaczenia mogą być wykonywane zarówno metodami kompetycyjnymi, jak i niekompetycyjnymi, co różnicuje te metody z punktu widzenia podatności na interferencje. Zatem jakość metody to nie tylko właściwe oddziaływanie antygenu z elementami rozpoznającymi, lecz także jakość i sposób połączenia przeciwciała z fazą stałą.

1.2.2.Lektyny

Lektyny i inne białka wiążące immunoglobuliny bakterii, które są łatwo adsorbowane na plastiku lub innych hydrofobowych powierzchniach, mogą być także używane jako mostek między fazą stałą a substancją, która ma być immobilizowna. Ten proces nie może zmienić lub spowodować obniżena swoistości oznaczenia. Z kolei konkanawalina A adsorbuje się na dołkach mikropłytek i jest w stanie immobilizować niektóre białka wirusów.

1.2.3.Białko A, białko G i białko A/G

Do immobilizacji cząsteczek na fazie stałej za pomocą łącznika wykorzystywane są niektóre białka wiążące fragment Fc immunoglobulin, takie jak białka A, białko G i białko A/G (białko rekombinowane). Wiązanie białka A (z bakterii Staphylococcus) lub białka G (z bakterii Streptococcus) do przeciwciał jest znane od dawna i często wykorzystywane w immunochemii. Białka te swoiście wiążą się do regionów Fc różnych typów przeciwciał klasy IgG z wysokim powinowactwem. To pozostawia wolne zmienne regiony przeciwciał na ekspozycję antygenu z próbki pacjenta, przez co zwiększa się zdolność wiązania antygenu, a zatem także czułość metody i stabilność sensora (np. w immunosensorach opartych na różnych formach transdukcji sygnału). Białka te wiążą reszty aminokwasowe na powierzchni pomiędzy stałymi domenami (constatnt heavy, CH) CH2 i CH3 immunoglobuliny G. Białko A wiąże wszystkie podklasy ludzkiej immunoglobuliny G z wyjątkiem IgG3. Wiąże także ludzkie IgA, IgM, IgE, a także mysie IgG2a, IgG2b i IgG3. Białko G rozpoznaje domeny Fc wszystkich podklas ludzkich IgG, a także IgG królika, myszy i kozy. Białko A/G przez wiele lat wykorzystywano w chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał, a obecnie jest powszechnie stosowane w immunochemii.

1.2.4.Inne sposoby immobilizacji cząsteczek na fazie stałej

Do immobilizacji przeciwciał na fazie stałej można wykorzystać kwas boronowy dzięki wykorzystaniu reakcji tego kwasu z diolami N-glikanu przeciwciał. Proces ten ma wiele etapów i wymaga odpowiedniej selekcji przeciwciał, które mogą być w ten sposób przyłączone do powierzchni fazy stałej. Możliwe jest też wytworzenie mostka pomiędzy immunoglobulinami zaadsorbowanymi na fazie stałej a przeciwciałami metody (ryc. 1.1B).

1.3.Cząsteczki rozpoznające analit w metodach immunochemicznych

Podstawowym reagentem w metodach immunochemicznych do pomiaru stężenia białek i niskocząsteczkowych molekuł jest substancja, która może rozpoznać analit spośród ogromnej liczby cząsteczek obecnych w próbce pacjenta. Do rozpoznawania antygenów wykorzystywane są najczęściej przeciwciała (monoklonalne i/lub poliklonalne) i nanociała rozpoznające odpowiednie epitopy na antygenie, a także aptamery i MIP, rozpoznające cząsteczkę docelową poprzez odpowiednie dopasowanie do analitu.

1.3.1.Przeciwciała

Przeciwciała stosowane w metodach immunochemicznych są pochodzenia zwierzęcego i są to najczęściej immunoglobuliny klasy IgG, mające cztery łańcuchy polipeptydowe (dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie). Każdy łańcuch ciężki składa się z trzech stałych domen (CH1, CH2 i CH3) i domeny zmiennej (variable heavy, VH), a każdy łańcuch lekki składa się ze stałej domeny (constant light, CL) i domeny zmiennej (variable light, VL). Przeciwciała są dużymi białkami (m.cz. ok. 150 kDa), a metody służące do ich produkcji są czasochłonne, kosztowne i nie zawsze spełniają wymagane kryteria jakościowe. Zmienne domeny łańcuchów lekkich i ciężkich asocjują, tworząc domenę wiążącą antygen, znaną jako Fab.

Przeciwciała wychwytujące powinny się charakteryzować wysokim powinowactwem (niską stałą dysocjacji), wysoką swoistością, czyli zdolnością do rozpoznawania substancji docelowej w próbce, a także powinny być stabilne. Stosowane w immunochemii przeciwciała monoklonalne mają niekwestionowane znaczenie dla oznaczania tysięcy biomarkerów, ale stosowane są też fragmenty przeciwciał, przeciwciała rekombinowane i przeciwciała chimeryczne. Przeciwciała są wrażliwe na temperaturę, ulegają nieodwracalnej denaturacji i mają ograniczony czas przechowywania. Istotnym ograniczeniem stosowania przeciwciał w metodach jest też to, że kinetyka interakcji pomiędzy antygenem (substancja oznaczana, docelowa) a przeciwciałem nie może być zmieniana na żądanie, np. przy zmianie własności analitycznych metody. Ponadto różne przeciwciała heterofilowe (ludzkie przeciwciała rozpoznające przeciwciała pochodzenia nieludzkiego) mogą interferować w oddziaływanie pomiędzy antygenem a przeciwciałem, sprawiając, że wyniki uzyskiwane w metodach immunochemicznych mogą być fałszywie zawyżone lub fałszywie zaniżone w zależności od formatu metody.

1.3.2.Nanociała

Nową ścieżkę w poszukiwaniu przeciwciał dla immunochemii otworzyło scharakteryzowanie przeciwciał występujących u zwierząt z rodziny wielbłądowatych. W przeciwieństwie do ludzkich przeciwciał u tych zwierząt stwierdzono obecność przeciwciał niezwierających łańcucha lekkiego, zatem niemających domen CH1. Nazwano je przeciwciałami ciężkołańcuchowymi (heavy chain antibodies, HCAb). Ich masa cząsteczkowa wynosi ok. 90 kDa, a więc są mniejsze niż ludzkie przeciwciała. Mają one tylko dwa łańcuchy ciężkie, a każdy z nich zawiera pojedynczą zmienną domenę wiążącą antygen (variable heavy chain domain, VHH). Domena VHH ma masę cząsteczkową 15 kDa, jej wielkość wynosi zaledwie 2,5 × 4,0 nm, a jej wykorzystywana samodzielna jednostka to nanociało.

Nanociała mogą wiązać antygeny z powinowactwem porównywalnym do powinowactwa monoklonalnych immunoglobulin IgG. Ponadto nanociała mają długi czas życia i są bardziej stabilne w porównaniu z klasycznymi przeciwciałami i fragmentem ScFv (single chain Fv fragment) przeciwciał. Ze względu na mniejsze rozmiary, zmniejszoną powierzchnię wiązania antygenu i wydłużony, giętki CDR3 nanociała mają dużą zdolność wiązania wklęsłych i ukrytych epitopów na antygenie. Niezależnie od zastosowań in vitro nanociała mają istotne zastosowanie w badaniach in vivo: obrazowaniu i działaniach terapeutycznych, ponieważ cechują się niską immunogennością i są szybko usuwane z krwi. Ich mała wielkość pozwala na penetrację do tkanek i przechodzenie przez barierę krew-mózg. Cechy, takie jak odporność na zmiany pH w szerokim zakresie, jak również odporność na działanie proteaz, niska immunogenność, łatwość multimeryzacji (wielowalentność/wieloparatopowość/wieloswoistość) i łatwość sprzęgania z różnymi cząsteczkami, znalazły szerokie zastosowanie in vivo i in vitro. Są wykorzystywane w testach kasetkowych do oznaczania analitów będących markerami chorób zakaźnych, do kontroli jakości farmaceutyków, do analizy jakości pożywienia i zanieczyszczeń środowiska, a także w metodach ELISA, zarówno kompetycyjnych, jak i niekompetycyjnych, oraz biosensorach. Na rycinie 1.2 pokazano porównanie budowy ludzkich przeciwciał i ich fragmentów oraz przeciwciał pochodzących od wielbłądowatych i nanociała.

1.3.3.Aptamery ("syntetyczne przeciwciała")

Aptamery to sztucznie wytworzone "przeciwciała". Są to krótkie cząsteczki jednoniciowe DNA lub RNA (ssDNA lub ssRNA), które wiążą cząsteczki docelowe z wysoką swoistością i powinowactwem ze względu na swoją trójwymiarową strukturę. Nazwa "aptamer" pochodzi od łacińskiego słowa aptus/apto, co oznacza 'pasować' (fit) i greckiego słowa meros - 'część (najmniejsza jednostka powtarzanej struktury)'. Ich wielkość waha się w granicach od 20 do 100 zasad (6-26 kDa). Wiążące sekwencje mają wielkość rzędu 6-12 kDa, zatem - podobnie jak nanociała - mogą się wiązać z miejscami, które nie są rozpoznawane przez przeciwciała. Aptamery wiążą się do swoich molekuł docelowych w podobny sposób jak przeciwciała i nanociała - poprzez rozpoznanie kształtu cząsteczki w ich miejscu docelowym (rozpoznawanym) poprzez międzycząsteczkowe interakcje, takie jak łączenie pierścieni aromatycznych, oddziaływań elektrostatycznych lub wiązań wodorowych.

Aptamery wytwarzane są w systemie SELEX, cechują się wysoką stałą asocjacji, więc mogą się wiązać z wieloma docelowymi cząsteczkami, o masie cząsteczkowej optymalnie w granicach 100-10 000 Da. Procedura SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) to technika chemiczna zastosowana w biologii molekularnej do produkcji oligonukleotydów albo pojedynczej nici DNA lub RNA (aptamerów), które swoiście wiążą ligand docelowy. Zatem technika uzyskiwania aptamerów nie wymaga immunizacji zwierząt. Najbardziej niespodziewaną cechą aptamerów jest możliwość ich ponownego użycia. Proces regeneracji jest szybki i nie ma wpływu na zdolność wiązania aptameru do ligandu. Schematyczną budowę (kształt) aptameru przedstawiono na rycinie 1.3.

Aptamery są zdolne do identyfikowania wielu substancji, w tym antygenów o niskiej immunogenności. Aptamery mogą być sprzężone z różnymi znacznikami (enzymy, fluorofory, nanomateriały) i grupami chemicznymi (aminowe, tiolowe), zatem ich zastosowanie w analityce może być różnorodne. W metodach ELISA, w których przeciwciało zastąpione jest aptamerem, proponowana jest zmiana nazwy metody na "metoda ALISA". Podobnie jak w przypadku homogennych metod niekompetycyjnych w metodzie z aptamerem, po połączeniu się aptameru z cząsteczką docelową dochodzi do zmian konformacyjnych i strukturalnej rearanżacji, co powoduje zmianę sygnału reakcji. To z kolei umożliwia ilościowy pomiar substancji docelowej. Do aptamerów mogą być łatwo dołączone "łączniki" pozwalające na ich immobilizację na fazie stałej, co jest powszechnie stosowane w metodach z ich zastosowaniem. Na rycinie 1.4 przedstawiono schematyczne porównanie wielkości epitopu na analicie w stosunku do różnych elementów rozpoznających cząsteczkę docelową (analit).

W metodach immunochemicznych aptamery, jako cząsteczki rozpoznające anality, mają istotną przewagę nad przeciwciałami, ponieważ:

1. Mogą być łatwo produkowane przez syntezę chemiczną (SELEX), która eliminuje potencjalne różnice między seriami odczynników, co obniża koszty i czas potrzebny do ich produkcji.

2. W przeciwieństwie do przeciwciał, które ulegają nieodwracalnej denaturacji w temperaturze pokojowej lub wyższej, aptamery mogą się rearanżować do ich początkowej konformacji, gdy układ, w którym się znajdują, powraca do optymalnej temperatury.

3. Mają wysoką stałą asocjacji i mogą się wiązać z wieloma docelowymi cząsteczkami, najlepiej o masie cząsteczkowej od 100 Da do 10 000 Da.

4. Mogą rozpoznawać i odróżniać blisko spokrewnione anality.

5. Są małe (ok. 6 kDa) i mniej immunogenne niż przeciwciała.

6. Mogą być łatwo znakowane i modyfikowane różnymi cząsteczkami znacznikowymi, łącznikowymi i innymi grupami funkcyjnymi.

7. Nie ulegają degradacji enzymatycznej.

1.3.4.Cząsteczki odwzorowane na polimerach (molecular imprinted polymers, MIP)

Cząsteczka MIP nazywana jest czasami "plastikowym przeciwciałem". Jej forma jest zaplanowana na podstawie syntetycznego połączenia wzornika zawierającego potencjalny epitop z sieciami polimerowyni 3D. Po usunięciu wzornika w polimerze pozostają zagłębienia, które mają wzór i wielkość odpowiadające wielkości cząsteczki wzornika. Wiązania jonowe i wodorowe między analitem a formą cząsteczki w MIP tworzą kompleks, który działa jak miejsce rozpoznające analit z wysoką swoistością i selektywnością. Cząsteczki MIP mają coraz większe zastosowanie biosensorach. Chociaż wydaje się, że wytworzenie MIP dla wszystkich analitów jest proste, metody z ich wykorzystaniem nadal wymagają ulepszania.

Polimery dopasowane do cząsteczek, które mają być rozpoznane w materiale biologicznym, to materiały wytwarzane na zamówienie, zawierające specjalne miejsce rozpoznające cząsteczkę docelową. Inspiracją do wytworzenia MIP było zapotrzebowanie na syntetyczne materiały, które mogłyby imitować naturalną zdolność do selektywnego wychwytywania chemicznej cząsteczki ze złożonej mieszaniny. Aby wytworzyć takie polimery w pierwszym etapie, docelowy analit (szablon) musi być połączony z funkcjonalnym monomerem w celu utworzenia struktury prekursora, tworząc wiązania kowalencyjne, semikowalencyjne i niekowalencyjne. W drugim etapie dochodzi do polimeryzacji w obecności łącznika. Następnie wzornik jest usuwany z szablonu (ryc. 1.5). Szablonowa cząsteczka jest odwracalnie związana (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z funkcjonalnym monomerem odpowiednimi grupami chemicznymi, a następnie polimeryzowana z nadmiarem łącznika krzyżowego. Kolejne usunięcie szablonu sprawia, że pojawiają się mikroubytki, które są komplementarne w kształcie, wielkości i przestrzennie zorientowane dzięki grupom funkcyjnych cząsteczki szablonowej.

Niezależnie od różnic strukturalnych przeciwciała i MIP mają podobne własności wiązania. W obu przypadkach możliwe jest ilościowe opisanie równowagi pomiędzy substancją wiążącą a docelowym analitem. Metody, w których wykorzystywane są MIP, są głównie kompetycyjne (i heterogenne), chociaż możliwe jest również zastosowanie MIP w metodzie niekompetycyjnej, w której MIP są związane z analitem, a kompleks jest rozpoznawany przez znacznik, który wiąże tylko kompleks, ale nie wiąże wolnego analitu. Z reguły metody z MIP mają czułość w zakresie 0,1-1 ?mol/l, chociaż opisywane są metody o wyższej czułości, ale nie dotyczą one (póki co) analitów, które mogłyby być wykorzystane w zastosowaniach klinicznych. O ile przygotowanie MIP w celu rozpoznawania prostych organicznych cząsteczek jest łatwe, o tyle dla peptydów i białek trudno jest uzyskać odpowiedni szablon, zwłaszcza gdy cała struktura cząsteczki nie jest znana. Istnieje jeszcze wiele problemów do rozwiązania, zanim metody oznaczania antygenów z wykorzystaniem MIP będą powszechnie wykorzystywane w laboratorium medycznym. W zależności od rozmiaru MIP mogą on być wykorzystywane do rozpoznawania komórek bakterii i wirusów (~20 nm do 10 ?m), DNA, RNA i białek (~1-10 nm), peptydów, aminokwasów, lipidów i glikanów (~0,1 nm). Zatem wielkość rozpoznawanej cząsteczki nie ma znaczenia - istotne jest dobre wydrukowanie szablonu, za pomocą którego cząsteczka docelowa będzie rozpoznawana.

1.4.Znaczniki w metodach immunochemicznych

Oddziaływanie substancji rozpoznającej (wychwytującej) analit spośród ogromnej liczby cząsteczek obecnych w próbce pacjenta i utworzenie połączenia antygen-przeciwciało (antygen-nanociało, antygen-aptamer lub antygen-MIP) to pierwszy etap reakcji immunochemicznej, "etap rozpoznający". Liczba wytworzonych połączeń (kompleksów) musi być zamieniona na mierzalny sygnał reakcji. Innymi słowy, wytworzone kompleksy muszą być zidentyfikowane poprzez przyłączenie kolejnej cząsteczki (antygenu lub przeciwciała), sprzężonej ze znacznikiem bezpośrednio lub pośrednio poprzez łącznik. Ilościowa ocena reakcji jest możliwa również poprzez konkurencję pomiędzy endogennym i znakowanym analitem (np. w metodzie RIA). Niezależnie od sposobu detekcji pojawia się możliwość wykrycia obecności i/lub skwantyfikowania ilości analitu (antygenu lub przeciwciała) w próbce biologicznej. W przypadku metod ilościowych stężenie docelowej substancji jest określane na podstawie zależności sygnału reakcji (niezależnie od sposobu jego detekcji) od stężenia analitu (substancji docelowej), czyli krzywej kalibracyjnej wyznaczonej dla kalibratorów metody zawierających określone stężenia analitu. Znaczniki izotopowe (jod-125) są obecnie rzadko stosowane [metoda RIA, metoda immunoradiometryczna (immunoradiometric assay, IRMA)], głównie z powodu konieczności posiadania przez laboratorium licznika scyntylacyjnego promieniowania gamma, narażenia na promieniowanie jonizujące (obecnie minimalne) i braku możliwości zautomatyzowania tych metod.

1.4.1.Znaczniki enzymatyczne

W większości metod immunochemicznych znacznikiem jest enzym katalizujący reakcję zamiany odpowiedniego substratu w produkt o różnych własnościach chemicznych i fizycznych. Zatem czułość analityczna metod immunochemicznych ze znacznikiem enzymatycznym jest zależna nie tylko od jakości przeciwciał, lecz także od wydajności katalitycznej i aktywności enzymu. Ale nie tylko. Granica detekcji (LoD) zależy w dużej mierze od sygnału próbki niezawierającej przeciwciał, co jest prostą konsekwencją wiązania nieswoistego (non-specific binding, NSB). Wielkość sygnału uzyskana w wyniku reakcji katalizowanej przez znacznik enzymatyczny nie polepsza LoD, ponieważ stosunek sygnału do tła pozostaje stały. Tak zwane metody wzmocnione wytwarzają większy sygnał, ale każda warstwa reagentów w fazie detekcji metody potencjalnie zwiększa NSB. Czy dana metoda jest bardziej czy mniej czuła, zależy od LoD i NSB, a nie od rodzaju znacznika w systemie pomiarowym.

Powszechnie stosowane enzymy jako znaczniki mają swoje ograniczenia: łatwo ulegają denaturacji, ich produkcja jest kosztowna i czasochłonna, mają niską stabilność i wymagają odpowiednich warunków przechowywania. Niezależnie od tego czynnikiem ograniczającym czułość metod ze znacznikiem enzymatycznym jest niski współczynnik ekstynkcji niskocząsteczkowych substancji stosowanych jako substraty. Biotechnologia i nanotechnologia przyniosły wiele nowych możliwości w zakresie tworzenia nanomateriałów, które mogą być alternatywą substratu, alternatywą enzymu lub same mogą powodować wzmocnienie sygnału. Obecnie wykorzystuje się już biosensory immunochemiczne oparte na fluorescencji, chemiluminescencji i sensorach elektrochemicznych.

Sygnał reakcji katalizowanej przez znacznik enzymatyczny jest emitowany w reakcji zamiany chromogennego, fluorogennego lub luminescencyjnego substratu do produktu, którego ilość może być mierzona kolorymetrycznie, fluorescencyjne i chemiluminescencyjnie. Znaczniki enzymatyczne wykorzystywane najczęściej w immunochemii to: peroksydaza chrzanowa (horseradish peroxidase, HRP) i fosfataza alkaliczna (alkaline phosphatase, ALP), a także oksydaza glukozy, galaktozydaza, dysmutaza ponadtlenkowa. Peroksydaza chrzanowa może katalizować utlenianie chromogennych substratów do barwnych produktów w obecności nadtlenku wodoru (istotna stabilność nadtlenku). Ograniczeniem dla HRP jest możliwość pojawiania się wiązania nieswoistego, aktywność enzymu może być zahamowana obecnością jonów Cu2+, różnymi mikroorganizmami i antybiotykami. Ograniczeniem jest też wykorzystywanie do reakcji enzymatycznej substancji rakotwórczych. W metodach immunochemicznych fluorescencyjnych z wykorzystaniem ALP korzysta się z różnych materiałów fluorescencyjnych, takich jak m.in. barwniki organiczne, kulki kwantowe, nanoklastry metali, co kategoryzuje metody z ALP zgodnie z generowanym sygnałem.

Na rycinie 1.6 pokazano schematycznie przykłady sygnałów reakcji uzyskiwanych w reakcjach katalizowanych przez znacznik enzymatyczny.