Przedmowa

W ostatnich kilkudziesięciu latach coraz częściej zamiast określenia położnictwo - z całą pewnością najstarszej specjalności medycznej - używa się pojęcia medycyna perinatalna. Ma to na celu podkreślenie spójności między życiem wewnątrzmacicznym a pierwszymi miesiącami życia noworodka. Druga połowa XX wieku to okres niezwykłego rozwoju tej specjalności, wynikiem czego jest poprawa stanu nowo narodzonych dzieci, ich mniejsza umieralność i zachorowalność.

Na jednej z pierwszych konferencji medycyny perinatalnej w Polsce (Poznań, 1971 rok) we wstępie do przygotowanych pamiętników napisano: "Moment porodu ma w sobie wiele cech dramatycznych, które powodują, że stał się on centralnym punktem procesu rozrodu. W oczach fachowców nie przesłoniło to jednak zasadniczej prawdy, a mianowicie tego, że zdrowe dziecko jest logicznym wynikiem prawidłowej ciąży oraz tego, że łatwy i fizjologiczny poród chorego płodu nie jest w stanie naprawić szkodliwości zaistniałych w ciąży. Na tych szkodliwościach i sposobach zmierzających do ich usunięcia jest skupiona cała uwaga i cały wysiłek dzisiejszej nauki położniczej". Pomimo upływu czasu charakterystyka ta bardzo dobrze oddaje cele współczesnej medycyny perinatalnej.

Nauczanie położnictwa w naszym kraju ma długą tradycję. Za najstarszą polską książkę o treści położniczej uznaje się dzieło nieznanego autora, które zostało wydane w 1423 roku w Krakowie. Książka ta, której dwunasta księga pt.: "Nauka o rodzeniu człowieka, gdzie jest opisane, jakim sposobem płód z żywota matki na świat przychodzi", dotyczy położnictwa, a w 1588 roku została przetłumaczona na język rosyjski. Do końca XVIII wieku książki o treści położniczej miały charakter podręczników dla położnych lub poradników dla kobiet rodzących. Dopiero na przełomie XIX i XX wieku zostały opublikowane w języku polskim pierwsze klasyczne podręczniki położnictwa i ginekologii przeznaczone dla lekarzy zajmujących lub przygotowujących się do wykonywania tej specjalności. Spośród autorów tych podręczników należy wspomnieć o H. Jordanie, S. Dobrowolskim, S. Gaszyńskim, S. Rosnerze, A. Czyżewiczu i B. Kowalskim. W drugiej połowie XX wieku ukazało się kilka monografii oraz podręczników przygotowanych przez różne ośrodki akademickie w naszym kraju (Poznań, Warszawa, Kraków). W tym okresie znaczne zasługi w nauczaniu położnictwa położył Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, który w ostatnich kilkudziesięciu latach wielokrotnie wydawał monografie oraz podręczniki położnictwa i ginekologii dla studentów studiów medycznych.

Celem, który przyświecał powstaniu tej książki, było stworzenie monografii dla wszystkich zajmujących się położnictwem. Publikacja obejmuje podstawową wiedzę z zakresu medycyny perinatalnej, ale również ukazuje potencjalne kierunki jej dalszego rozwoju, zgodnego z zasadami medycyny opartej na dowodach - evidence based medicine.

Pragnę wyrazić serdeczne podziękowanie Autorom, reprezentującym wszystkie ośrodki akademickie w Polsce, za przyjęcie zaproszenia do współpracy i za trud włożony w przygotowanie monografii.

Szczególne podziękowania za pomoc w redagowaniu poszczególnych tomów kieruję do profesorów: Wiesława Markwitza, Tomasza Paszkowskiego, Ryszarda Poręby i Mirosława Wielgosia. Za szczególnie wartościowe uważam zaproszenie przez doświadczonych położników swoich uczniów do przygotowania poszczególnych rozdziałów monografii, gdyż w przyszłości, w znacznej mierze, to od nich będzie zależał poziom nauczania położnictwa w naszym kraju.

Współpraca z Wydawnictwem Lekarskim PZWL, a szczególnie inspiracja i otwartość na nowe pomysły jego pracowników, stanowiła podłoże powstania tej monografii. Wyrazem takiej współpracy jest między innymi umieszczenie na okładce zdjęcia jednej z rzeźb Xawerego Dunikowskiego z cyklu "Kobiety brzemienne". Ma to dla mnie znaczenie symboliczne, została ona bowiem wykorzystana przed ponad 50 laty w pamiętnikach pierwszej konferencji Sekcji Medycyny Perinatalnej Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego zorganizowanej w Poznaniu.

Grzegorz H. Bręborowicz

Rozdział 1 Wybrane zagadnienia genetyki w położnictwie i ginekologii Anna Latos-Bieleńska

1.1 Wprowadzenie

Zsekwencjonowanie genomu człowieka w 2003 roku umożliwiło niezwykły postęp w badaniach nad molekularnym podłożem patologii człowieka. Genetyka przenika do wszystkich dziedzin medycyny, zmieniając myślenie o organizmie człowieka w warunkach fizjologii i patologii. Współczesnego lekarza obowiązuje odtąd myślenie genetyczne, tj. uświadomienie sobie, że wszystkie procesy życiowe zachodzące w pojedynczej komórce i w całym organizmie człowieka są zaprogramowane genetycznie. Nie podważa tego odkrycie zjawiska epigenetycznych modyfikacji genomu człowieka. Ginekologia i położnictwo są tymi dziedzinami, w których styk z genetyką jest szczególnie silny, a współpraca z genetykiem klinicznym nieodzowna. Genetyka wnosi do ginekologii i położnictwa wiedzę o podłożu molekularnym wielu często występujących patologii, pozwala na poprawę poziomu diagnostyki, zmianę w klasyfikacji wielu chorób oraz uzyskanie całkowicie nowych perspektyw terapeutycznych (wykorzystanie komórek macierzystych, zwierząt transgenicznych, terapia genowa). Ginekolodzy położnicy używają także warsztatu molekularnego w badaniach naukowych i coraz częściej uczestniczą w realizacji projektów badawczych z pogranicza ginekologii i położnictwa oraz genetyki.

2-3% dzieci rodzi się z jakąś poważną chorobą uwarunkowaną genetycznie lub wadą rozwojową, prowadzącą do kalectwa fizycznego, wczesnego zgonu lub związaną z niepełnosprawnością intelektualną. Choroby genetyczne to nie tylko choroby wieku dziecięcego - także w etiologii wielu częstych chorób wieku dorosłego czynniki genetyczne odgrywają ważną, a nawet decydującą rolę. Nawet 65% ludzi zachoruje w czasie całego swojego życia na jakąś chorobę o genetycznej lub częściowo genetycznej etiologii, a różnorodność kliniczna powoduje, że z pacjentem z chorobą genetyczną spotyka się lekarz każdej specjalności [55, 84, 117]. W ginekologii i położnictwie jest wiele sytuacji klinicznych, w których konieczne jest wykonanie badań genetycznych i wskazana jest współpraca z genetykiem klinicznym i biologiem molekularnym; do tych sytuacji należą: niepłodność, metody rozrodu wspomaganego (ART - assisted reproductive technics), poronienia samoistne, porody martwe, wady wrodzone u płodu i noworodka, choroby genetyczne kobiety mogące wpływać na przebieg ciąży, nowotwory oraz diagnostyka prenatalna chorób genetycznych i wad wrodzonych.

Rozdział ten ma za zadanie przedstawić podstawowe informacje dotyczące genetyki klinicznej oraz wybrane sytuacje kliniczne, z którymi ma do czynienia ginekolog położnik i w których badania genetyczne są niezbędną częścią postępowania diagnostycznego.

1.2 Genom człowieka [13, 84, 106, 117, 118, 125, 127]

Przyczyną choroby genetycznej jest zawsze patologiczna zmiana materiału genetycznego. Żeby zrozumieć podłoże molekularne chorób genetycznych, ich wielką różnorodność, korelacje genotypowo-fenotypowe i strategię diagnostyki genetycznej, należy znać budowę genomu ludzkiego.

Genom jest to kompletna sekwencja DNA danego organizmu zawierająca kompletną informację genetyczną. U eukariotów prawie cała informacja genetyczna znajduje się w jądrze komórkowym, a nić DNA nie jest ciągła, ale jest podzielona na odcinki o różnej długości - wraz z histonami i białkami niehistonowymi tworzą one chromosomy. Człowiek ma w każdej komórce somatycznej 46 chromosomów - 23 pary, z których 22 pary stanowią chromosomy autosomalne (autosomy), a para 23. to chromosomy płci: XX u kobiety i XY u mężczyzny (ryc. 1.1). Jest to diploidalny zestaw chromosomów. W gametach występuje haploidalny zestaw chromosomów, tj. 23 chromosomy - po jednym chromosomie z każdej pary. Po zapłodnieniu zostaje odtworzony zestaw diploidalny, a w każdej parze chromosomów jeden pochodzi od ojca, drugi - od matki. W każdej komórce jest aktywny tylko jeden chromosom X, zatem u kobiet jeden z chromosomów X ulega inaktywacji, tworząc ciałko Barra. Inaktywacja ta nie jest kompletna, w szczególności pozostają aktywne geny zlokalizowane w tzw. regionach pseudoautosomalnych PAR1 i PAR2, wykazujących homologię między X i Y [53, 78, 84, 95, 100, 117].

W jądrze interfazowym struktura chromatyny jest rozluźniona, ale podczas podziału komórkowego błona jądrowa zanika, a chromosomy ulegają maksymalnej kondensacji (10 tys. razy) i są wówczas widoczne w mikroskopie świetlnym jako charakterystyczne struktury. Chromosomy metafazowe są już po zreplikowaniu DNA, składają się z dwóch chromatyd połączonych w miejscu centromeru. Centromer dzieli chromosom na ramiona krótkie (oznaczane "p") i długie (oznaczane "q"). W zależności od położenia centromeru, chromosomy człowieka dzielimy na metacentryczne, submetacentryczne i akrocentryczne. Końce ramion chromosomów zakończone są telomerami, chromosomy akrocentryczne mają dodatkowo na końcach ramion krótkich satelity [78, 100, 101, 117].

W 1953 roku D.J. Watson i F. Crick przedstawili model struktury DNA, który wyjaśniał, w jaki sposób DNA może być nośnikiem informacji genetycznej [123]. Cząsteczka DNA składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych owiniętych wokół siebie i biegnących przeciwrównolegle, tworząc w ten sposób podwójną spiralę. Jednostką budulcową każdego łańcucha jest deoksyrybonukleotyd, w skład którego wchodzi jedna z czterech zasad azotowych (adenina, tymina, guanina lub cytozyna), połączona z cukrem deoksyrybozą i resztą fosforanową. Struktura podwójnej spirali jest utrzymywana przez wiązania wodorowe między adeniną (A) i tyminą (T) oraz guaniną (G) i cytozyną (C). Na jeden obrót podwójnej spirali przypada 10 par zasad. Fakt, że A tworzy wiązania tylko z T, a G tylko z C (tworzenie komplementarnych par zasad), oznacza, że sekwencje zasad obu nici są wzajemnie zależne i - tym samym - kolejność zasad jednej nici wyznacza sekwencję zasad drugiej nici DNA. Ta komplementarność ma podstawowe znaczenie dla struktury i funkcji DNA - stanowi mechanizm zachowania informacji genetycznej i jej przekazywania komórkom potomnym i z pokolenia na pokolenie. RNA zamiast tyminy zawiera uracyl, a zamiast deoksyrybozy - rybozę i występuje w postaci jednoniciowych cząsteczek, chociaż fragmenty RNA mogą tworzyć także strukturę dwuniciową. Genom jądrowy człowieka zawiera nieco ponad 3 mld par zasad (ok. 3280 mln par zasad). Ponad 70% to DNA niezawierający genów. Geny i sekwencje pokrewne zajmują mniej niż 30% DNA, ale sekwencje kodujące białko to jedynie 1,5% genomowego DNA (ryc. 1.2).

Człowiek posiada ok. 21 600 genów kodujących białka i ponad 8000 genów kodujących różne RNA (w większości biorące udział w procesie regulacji ekspresji genów) [117]. Do tej pory ok. 4000 genów powiązano z określonymi chorobami genetycznymi i liczba ta rośnie lawinowo w związku z wprowadzeniem na dużą skalę sekwencjonowania eksomu [83]. Liczba możliwych chorób genetycznych przekracza znacznie liczbę genów, ponieważ różne mutacje tego samego genu mogą prowadzić do różnych chorób genetycznych. Pełna informacja jest zawarta w katalogu chorób jednogenowych i genów dostępnym w internecie (OMIM) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/].

Istnieją znaczne różnice w wielkości poszczególnych genów, np. największy gen człowieka - kodujący dystrofinę - ma ok. 2500 kpz. Geny są zbudowane w taki sposób, że sekwencje kodujące kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym - ulegające translacji (eksony) - są poprzedzielane sekwencjami wtrąconymi, które są integralną częścią genu i ulegają przepisaniu na RNA (hnRNA) w procesie transkrypcji, ale nie kodują białka (introny). Liczba eksonów w poszczególnych genach człowieka jest różna - są geny składające się z jednego eksonu i takie, które mają ponad 100 eksonów. Również wielkość poszczególnych eksonów i intronów w różnych genach jest zróżnicowana. W procesie składania hnRNA sekwencje zsyntetyzowane na matrycy intronów ulegają usunięciu, a powstały w ten sposób mRNA przechodzi do cytoplazmy, gdzie bierze udział w biosyntezie białka. Dzięki takiej budowie jeden gen może kodować różne białka, gdyż hnRNA może ulec alternatywnemu składaniu, dlatego liczba białek znacznie przewyższa liczbę genów [84, 106, 117, 125, 127].

Około 20% genów jest czynnych (ulega transkrypcji) w każdej komórce. Są to geny metabolizmu podstawowego (housekeeping genes), kodujące białka niezbędne do funkcjonowania każdej komórki, np. enzymy cyklu Krebsa i białka rybosomalne. Jednak większość genów ulega wybiórczo aktywacji w taki sposób, że w komórkach określonego typu jest aktywna tylko pewna, ściśle określona grupa genów. W ten sposób komórki poszczególnych typów, mając taki sam materiał genetyczny, różnią się morfologią i funkcją. W poszczególnej komórce 90% aktywnych genów to geny metabolizmu podstawowego, a tylko 10% jest związanych ze specyficzną funkcją danej komórki. Obecnie wiele badań dotyczy mechanizmów regulacji czynności genów człowieka - mówi się o regulomie, tj. tej części genomu, która zawiera sekwencje regulujące geny kodujące białka.

Niektóre geny ulegają piętnowaniu genomowemu (ok. 100 loci), tj. allel pochodzący od matki i allel pochodzący od ojca różnią się ekspresją, co oznacza, że może być aktywny tylko matczyny lub tylko ojcowski allel. W przypadku większość genów są aktywne lub nieaktywne obydwa allele [117].

Sekwencjonowanie i badania z zastosowaniem techniki mikromacierzy wykazały, że genomy poszczególnych osób znacznie różnią się między sobą. Zmienność typu SNP (single nucleotide polymorphisms - zmiany pojedynczonukleotydowe) występuje co 100-300 nukleotydów. SNP mogą występować zarówno w genach (eksonach i intronach), jak i w pozagenowym DNA. W zależności od lokalizacji, SNP mogą nie mieć żadnych skutków fenotypowych, ale mogą też wpływać np. na genetyczną predyspozycję do zachorowania na choroby uwarunkowane wieloczynnikowo [25, 26]. Inny rodzaj zmienności to CNV (copy number variation - zmienność liczby kopii fragmentów DNA). Kopia CNV to fragment genomu o wielkości powyżej tysiąca par zasad (kb). Średnia wielkość kopii CNV mieści się w przedziale 81-341 kb, ale może to być fragment DNA o wielkości nawet do 2 mln par zasad (Mb). Kopie CNV zidentyfikowano aż w 1,5 mln regionach genomu o łącznej długości 360 Mb, co stanowi 12% genomu. W 58% zidentyfikowanych kopii CNV stwierdzono obecność genów, w 99% zakonserwowane niekodujące sekwencje DNA. Większość kopii CNV to warianty polimorficzne bez skutków fenotypowych, ale niektóre są przyczyną chorób genetycznych [21, 57, 119].

Chociaż prawie cały DNA znajduje się w jądrze komórkowym, to niewielka ilość DNA znajduje się w mitochondriach. Pojedyncza komórka zawiera w cytoplazmie setki mitochondriów. DNA mitochondrialny różni się od DNA jądrowego i inaczej się dziedziczy (dziedziczenie matczyne). Mitochondrialny DNA jest zbudowany z dwuniciowej kolistej cząsteczki DNA oraz składa się z 16 569 par zasad i zawiera 37 genów (2 geny rRNA, 22 geny tRNA i 13 genów białek łańcucha oddechowego). Mitochondrialny DNA cechuje się wysoką częstością mutacji (5-10 razy większą niż jądrowy DNA) [117, 128].

1.3 Choroby genetycznie uwarunkowane na tle budowy genomu człowieka

U podłoża każdej choroby genetycznie uwarunkowanej leży patologiczna zmiana materiału genetycznego (mutacja). Mutacja ta może powstać de novo, może też być odziedziczona od rodzica lub od obojga rodziców. Różnorodność kliniczna i molekularna chorób genetycznych jest ogromna i można je klasyfikować na wiele sposobów. Podział według rodzaju uszkodzenia materiału genetycznego wyróżnia choroby:

spowodowane klasycznymi aberracjami chromosomowymi;

spowodowane submikroskopowymi mikrorearanżacjami genomowymi;

spowodowane mutacją pojedynczego genu;

uwarunkowane wieloczynnikowo.

Jest to podział uproszczony. W rzeczywistości zmiany materiału genetycznego nie są skokowe, ale mają charakter ciągły, a ponadto ta sama choroba może być spowodowana np. submikroskopową rearanżacją genomową i mutacją pojedynczego genu, niektóre choroby są uwarunkowane dwugenowo itp.

1.3.1 Aberracje chromosomowe

Aberracje chromosomowe są często występującą zmianą materiału genetycznego u człowieka. Większość z nich powoduje bardzo wcześnie skutki letalne i najczęściej dochodzi do obumarcia zarodka/płodu w I trymestrze ciąży. Aberracje chromosomowe stwierdza się, w zależności od metody badań genetycznych, u 50-60% (w metodzie mikromacierzy do 70%) poronionych samoistnie zarodków i płodów. Aberracje chromosomowe o znaczeniu klinicznym stwierdza się u 0,6% dzieci żywo urodzonych [100, 117].

1.3.1.1 Zmiany materiału genetycznego w aberracjach chromosomowych

W przypadku klasycznych aberracji chromosomowych zmiany materiału genetycznego są duże i możliwe do oceny w mikroskopie świetlnym. Wyróżnia się aberracje liczby chromosomów i aberracje struktury chromosomów. Aberracje liczby chromosomów obejmują trisomię (dodatkowy chromosom w danej parze chromosomów), monosomię (tylko jeden zamiast dwóch chromosomów w danej parze), triploidię (potrójny garnitur haploidalny, tj. 69 chromosomów) i tetraploidię (92 chromosomy). Do niedoboru lub nadmiaru materiału genetycznego prowadzą także aberracje struktury chromosomów: delecje i duplikacje fragmentów chromosomów, izochromosomy i chromosomy pierścieniowe (ryc. 1.3). W przypadku zrównoważonych translokacji robertsonowskich i translokacji wzajemnych oraz inwersji materiał genetyczny ulega rearanżacji, ale ilościowo nie ulega zmianie. Efektem aberracji zarazem liczby i struktury są chromosomy markerowe, tj. małe dodatkowe chromosomy o trudnym do identyfikacji materiale genetycznym [48, 100, 117].

Niekiedy może się zdarzyć, że w danej parze chromosomów obydwa chromosomy pochodzą od jednego z rodziców i, tym samym, brakuje chromosomu od drugiego rodzica - jest to jednorodzicielska disomia. Ze względu na zjawisko rodzicielskiego piętnowania genomowego materiał genetyczny jednego z rodziców nie może zostać zastąpiony materiałem drugiego z rodziców, dlatego jednorodzicielska disomia może prowadzić do poważnej patologii [94, 117]. Jednorodzicielska disomia jest nieuchwytna w badaniu cytogenetycznym i można ją wykazać jedynie metodami biologii molekularnej.

1.3.1.2 Obraz kliniczny aberracji chromosomowych

Najmniejsze klasyczne aberracje chromosomowe widoczne w mikroskopie świetlnym obejmują co najmniej 4 Mb. Nawet małe cytogenetycznie zmiany ilości materiału genetycznego są ogromne molekularnie, w przypadku kariotypu niezrównoważonego dochodzi bowiem do niedoboru lub nadmiaru wielu (dziesiątek, setek) genów, z których każdy jest prawidłowy. Przy tak dużych zmianach ilościowych materiału genetycznego skutki fenotypowe zawsze muszą być poważne, zwłaszcza jeśli niezrównoważenie materiału genetycznego dotyczy autosomów. W przypadku niezrównoważonych aberracji chromosomowych skutki kliniczne wynikają nie tylko z dawki genów (nadmiaru lub niedoboru), ale także z zaburzeń w aktywności wielu innych genów zlokalizowanych w chromosomach innych niż objętych aberracją. Aberracje chromosomowe u zarodka i płodu prowadzą w ogromnej większości przypadków do obumarcia ciąży. U dzieci żywo urodzonych z niezrównoważoną aberracją chromosomową występuje dysmorfia, wady rozwojowe i opóźnienie rozwoju lub niepełnosprawność intelektualna. Aberracje struktury chromosomów bez zmian ilościowych materiału genetycznego (translokacje zrównoważone, inwersje) nie wpływają na stan zdrowia ani długość życia ich nosiciela, ale mogą prowadzić do niepowodzeń rozrodu [36, 53, 59, 75, 78, 100, 117, 118].

1.3.1.3 Diagnostyka genetyczna aberracji chromosomowych

Aberracje chromosomowe diagnozuje się za pomocą badania kariotypu [28, 64, 78, 95, 100, 117, 118]. Metod badania kariotypu jest wiele, niektóre pozwalają ocenić cały kariotyp, inne pozwalają na wykrycie tylko określonych zmian (np. aberracji liczby, rearanżacji subtelomerowych). Najczęściej jest to badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej, ale niekiedy stosuje się też metody FISH (fluorescence in situ hybridizatiom), CGH (comparative genomic hybridization), arrayCGH (aCGH) (array-comparative genomic hybridization), MLPA (multiplex ligation-dependend probe amplification) i QF-PCR (quantitative fluorescent polymerase chain reaction). Metodą, która szybko zastępuje klasyczne techniki cytogenetyczne w diagnostyce niezrównoważonych aberracji chromosomowych, jest technika mikromacierzy [30, 31].

1.3.1.4 Poradnictwo genetyczne w przypadku aberracji chromosomowych

W przypadku aberracji chromosomowych ryzyko genetyczne oblicza się empirycznie, tj. na podstawie obserwacji dużych grup rodzin z podobną patologią. W przypadku stwierdzenia u dziecka (płodu) regularnej trisomii (np. trisomii 21) nie ma wskazań do określenia kariotypu u rodziców dziecka, ponieważ mechanizm powstawania trisomii to głównie brak rozdziału chromatyd podczas mejozy, zatem nie należy spodziewać się zmian w kariotypie rodziców określanym na podstawie hodowli limfocytów.

Po urodzeniu dziecka z regularną trisomią ryzyko genetyczne ponownego wystąpienia trisomii u dzieci zależy od wieku matki: jeśli matka ma mniej niż 35 lat, ryzyko urodzenia dziecka z trisomią wynosi 1%, jeśli ma ponad 35 lat, do wymienionego ryzyka genetycznego należy dodać ryzyko wynikające z jej wieku. Niekiedy obserwuje się podwyższoną, niezależną od wieku skłonność do braku rozdziału chromatyd u któregoś z partnerów - takim parom częściej rodzi się dziecko z trisomią. U takich par mogą występować poronienia samoistne, a badania genetyczne materiału z poronienia wykazują trisomię u płodu. Inne aberracje liczby chromosomów (triploidia, tetraploidia, monosomia X) stwierdzone u dziecka nie są związane z podwyższonym ryzykiem ich powtórzenia się w następnych ciążach, chociaż w badaniach własnych obserwowano przypadki występowania tych aberracji także w kolejnej ciąży [117].

O ile w przypadku aberracji liczby chromosomów u dziecka nie wykonuje się badania kariotypu rodziców, o tyle po stwierdzeniu u dziecka w diagnostyce prenatalnej lub postnatalnej aberracji struktury chromosomów (np. delecji lub duplikacji) zawsze konieczne jest określenie kariotypu rodziców. Jeśli u któregoś z rodziców stwierdzi się nosicielstwo translokacji zrównoważonej (lub innej zrównoważonej aberracji chromosomów), ryzyko genetyczne wystąpienia niezrównoważonej aberracji w następnych ciążach i wynikające z tego ryzyko poronień samoistnych, porodów martwych lub urodzenia dziecka z zespołem wad i niepełnosprawnością intelektualną jest podwyższone. Zależy ono od rodzaju aberracji, od tego, które z chromosomów objęte są aberracją, od punktów pęknięć chromosomów oraz od tego, które z rodziców jest nosicielem aberracji [75, 100].

1.3.2 Submikroskopowe rearanżacje genomowe

1.3.2.1 Zmiany materiału genetycznego w submikroskopowych rearanżacjach genomowych

Tego typu zmiany materiału genetycznego mogą być różnej wielkości: od 1 kb do > 1 Mb. Zmiany mogą obejmować od jednego do stu i więcej genów [109, 112, 117]. Mogą to być rearanżacje zrównoważone bez ubytku czy naddatku materiału genetycznego (np. submikroskopowe translokacje) lub rearanżacje niezrównoważone (mikrodelecje, mikroduplikacje genomowe).

1.3.2.2 Obraz kliniczny submikroskopowych rearanżacji genomowych

Zrównoważone rearanżacje genomowe, jeśli nie dojdzie do uszkodzenia genu strukturalnego, a także nie wystąpi tzw. efekt pozycji, nie powodują zmian w fenotypie, są zatem szczególnie trudne do wykrycia, ale ich nosicielstwo może być przyczyną niepowodzeń rozrodu. Na przykład rearanżacje subtelomerowe występują u ok. 2% par doświadczających poronień nawracających; opisywano także submikroskopowe rearanżacje okołocentromerowe [22, 79].

Rearanżacje niezrównoważone mogą mieć różnorodne skutki kliniczne. Opisano małe duplikacje i delecje bez zmian w fenotypie oraz takie rearanżacje, które występowały rodzinnie i powodowały skutki kliniczne tylko u niektórych ich nosicieli. U dzieci żywo urodzonych manifestacja kliniczna niezrównoważonych rearanżacji genomowych to zazwyczaj wady wrodzone, dysmorfia lub niepełnosprawność intelektualna, ale może dojść również do poronienia samoistnego zarodka i płodu [91, 109].

1.3.2.3 Diagnostyka genetyczna submikroskopowych rearanżacji genomowych

Submikroskopowe rearanżacje genomowe odkryto po wprowadzeniu do diagnostyki genetycznej metod cytogenetyki molekularnej, w szczególności metody FISH, a także metody MLPA. Metody te pozwalają jednak na wykrycie tylko wybranych, ściśle określonych mikrorearanżacji genomowych. Metodą z wyboru jest technika mikromacierzy, która pozwala na wykrycie zmian nawet bardzo małych, ale niezrównoważonych [70, 102, 109, 117]. Rearanżacje zrównoważone mogą być diagnozowane metodą FISH, ale wówczas musi to być badanie celowane, np. z sondami specyficznymi dla sekwencji subtelomerowych wszystkich chromosomów [22, 79]. W przypadku diagnostyki prenatalnej i diagnostyki u dzieci z wadami rozwojowymi badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej zostaje częściowo lub całkowicie zastąpione badaniem z zastosowaniem technologii mikromacierzy [70, 102, 112].

1.3.2.4 Poradnictwo genetyczne w submikroskopowych rearanżacjach genomowych

W przypadku wykrycia rearanżacji submikroskopowej ważną sprawą jest ocena, czy jest to zmiana patogenna, czy może wariant euchromatyczny bez żadnych skutków klinicznych. Submikroskopowe rearanżacje genomowe mogą powstawać de novo, mogą również wynikać z ich nosicielstwa u jednego z partnerów/rodziców. Ustalenie tego jest niezbędne dla poradnictwa genetycznego. W przypadku nosicielstwa zmiany genomowej jednoznacznie patogennej ryzyko urodzenia dziecka z poważną patologią (wadami wrodzonymi, niepełnosprawnością intelektualną) jest wysokie.

1.3.3 Choroby uwarunkowane jednogenowo

Jest to najbardziej różnorodna klinicznie grupa chorób genetycznych. Znanych jest blisko 10 tys. różnych chorób uwarunkowanych jednogenowo, niektóre z nich są częste (rodzinna hipercholesterolemia 1: 500 urodzeń), inne występują skrajnie rzadko, np. < 1/mln urodzeń (np. zespół Sensenbrenner - dotychczas opisano na świecie ok. 30 przypadków) [39, 83, 117]. Choroby uwarunkowane jednogenowo dotyczą łącznie ok. 2,4% populacji ogólnej. Wszystkie cechy i choroby uwarunkowane jednogenowo są skatalogowane w ogólnodostępnej internetowej bazie danych OMIM [83].

1.3.3.1 Zmiany materiału genetycznego w chorobach jednogenowych [92, 111, 117]

W chorobach jednogenowych zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, wykrywalne jedynie metodami biologii molekularnej. Mutacje punktowe dotyczą zmiany jednej pary zasad. Mutacje zmiany sensu (70% mutacji punktowych) prowadzą do zamiany pojedynczego aminokwasu na inny. Z kolei mutacje nonsensowne (5%) powodują powstanie kodonu "stop", co prowadzi do przedwczesnej terminacji tworzącego się łańcucha polipeptydowego. Są też mutacje ciche - niepowodujące zaburzeń (25% mutacji punktowych), które gromadząc się w genomie, są źródłem polimorfizmu. Delecje i insercje polegają odpowiednio na ubytku lub naddatku od jednej do bardzo wielu par zasad. Jeśli prowadzą do przesunięcia ramki odczytu, całkowicie zmieniają kod genetyczny za miejscem mutacji. Szczególną formą mutacji są ekspansje powtórzeń trójek nukleotydów (np. CTG w dystrofii miotonicznej, typ 1). Taka mutacja jest niestabilna i może zwiększać się z pokolenia na pokolenie (mutacja dynamiczna), prowadząc do tzw. zjawiska antycypacji, czyli nasilania się i coraz wcześniejszego występowania objawów w kolejnych pokoleniach. Jest znanych ponad 20 chorób spowodowanych zwiększeniem się liczby powtórzeń trójek nukleotydów.

W zależności od rodzaju mutacji jej skutkiem jest zupełny brak danego białka, zmniejszona ilość białka, zmniejszona lub zwiększona aktywność białka, prawidłowa ilość białka, ale o zmienionej strukturze lub funkcji [83, 117].

1.3.3.2 Obraz kliniczny chorób uwarunkowanych jednogenowo

Choroby uwarunkowane jednogenowo to najbardziej różnorodna klinicznie grupa chorób genetycznych. Mają różny początek i przebieg - mogą to być choroby letalne już w okresie prenatalnym i takie, których pierwsze objawy występują nawet po dziesiątkach lat życia w pełnym zdrowiu. Wśród chorób uwarunkowanych jednogenowo są: wady wrodzone, choroby metaboliczne i neurologiczne, choroby układu krążenia, moczowego, oddechowego, pokarmowego, narządu wzroku i skóry, nowotwory złośliwe oraz wiele innych - z pacjentem z chorobą uwarunkowaną jednogenowo spotka się lekarz każdej specjalności. W obrębie zainteresowań ginekologa położnika będą zwłaszcza wady rozwojowe uwarunkowane jednogenowo, nowotwory dziedziczne (m.in. dziedziczny rak piersi i jajnika), choroby jednogenowe związane z niepłodnością oraz takie choroby, które mogą prowadzić do powikłań w czasie ciąży.

1.3.3.3 Diagnostyka genetyczna chorób uwarunkowanych jednogenowo [13, 106, 111, 114, 117]

Diagnostyka chorób uwarunkowanych jednogenowo jest oparta w dużym stopniu na ocenie fenotypu (ocena kliniczna, indywidualnie dobrane badania laboratoryjne, badania obrazowe i in.) z uwzględnieniem analizy rodowodu. Dopiero po ustaleniu rozpoznania (lub podejrzeniu) określonej choroby uwarunkowanej jednogenowo wykonuje się adekwatnie dobrane badania molekularne. W chorobach uwarunkowanych jednogenowo kariotyp jest prawidłowy, jednak np. w przypadku zespołów wad rozwojowych uwarunkowanych jednogenowo badanie kariotypu jest wykonywane, ponieważ fenotyp może przypominać zespół wad spowodowany aberracją chromosomową. Jeszcze lepiej jest wykonać w takim przypadku badania metodą mikromacierzy. Opisano wiele przypadków, w których u pacjentów z wadą wrodzoną o znanej jednogenowej etiologii wykrywano mikrorearanżacje genomowe. Podłoże molekularne znacznej grupy chorób uwarunkowanych jednogenowo zostało już poznane, a tym samym coraz więcej chorób jednogenowych jest możliwych do diagnozowania na poziomie DNA (lub RNA). Jeśli są trudności w rozpoznaniu danej choroby uwarunkowanej jednogenowo na poziomie fenotypu, diagnostyka na poziomie DNA umożliwia jej rozpoznanie w sposób pewny. Diagnostyka ta jest szczególnie wartościowa w przypadkach chorób heterogennych genetycznie, tj. wówczas gdy taki sam fenotyp może być skutkiem mutacji różnych genów. W takich sytuacjach pomocne będzie sekwencjonowanie eksomu (lub całego genomu).

1.3.3.4 Poradnictwo genetyczne w chorobach uwarunkowanych jednogenowo [84, 117]

W przypadku chorób dziedziczonych według praw Mendla ryzyko genetyczne jest stałe i nie zależy od liczby chorych członków rodziny. Wprawdzie rozpoznanie kliniczne i wnioski wynikające z analizy rodowodu są bardzo ważne, ale - jeśli jest to możliwe - należy zawsze potwierdzić rozpoznanie kliniczne badaniami molekularnymi. Jest to tym ważniejsze, że choroby uwarunkowane jednogenowo są heterogenne genetycznie i wiele z nich może dziedziczyć się w różny sposób, np. może być forma autosomalna dominująca i autosomalna recesywna choroby, a w każdej z nich jest zupełnie inne poradnictwo genetyczne. W dziedziczeniu jednogenowym obserwuje się niekiedy odstępstwa od dziedziczenia według praw Mendla. Na przykład w przypadku mutacji dynamicznych występuje zjawisko antycypacji w miarę zwiększania się liczby powtórzeń specyficznej trójki nukleotydów (objawy choroby występują wcześniej i są bardziej nasilone w kolejnych pokoleniach), odstępstwem od praw Mendla charakteryzuje się również dziedziczenie mitochondrialne.

Choroba autosomalna dominująca. Objawy choroby występują już u heterozygoty pod względem patologicznego genu, tj. wówczas gdy w parze alleli jeden jest zmutowany, a drugi prawidłowy. Jeśli rodzice są zdrowi, a patologiczny gen wykazuje pełną penetrację, należy przyjąć, że choroba dziecka wystąpiła w wyniku nowej mutacji. Ryzyko genetyczne wystąpienia tej choroby u rodzeństwa dziecka chorego nie jest wówczas podwyższone, poza rzadko spotykaną sytuacją, kiedy stwierdza się mozaikowość gonadalną (mutacja występuje w części komórek gonad któregoś ze zdrowych rodziców, dlatego choroba może się powtórzyć u kolejnych dzieci). Osoba chora na chorobę autosomalną dominującą jest obarczona 50% ryzykiem wystąpienia tej choroby u potomstwa (przy pełnej penetracji patologicznego genu), niezależnie od płci, natomiast ryzyko może być odpowiednio niższe przy ewentualnej niepełnej penetracji (choroba nie ujawnia się mimo obecności patologicznego genu). Dla wielu chorób genetycznie uwarunkowanych penetracja patologicznego genu została określona. W dziedziczeniu autosomalnym dominującym znane jest też zjawisko zmiennej ekspresji - u członków rodziny posiadających ten sam patologiczny gen objawy choroby mogą ujawniać się w różnym stopniu, dlatego zawsze należy dokładnie zbadać krewnych osoby chorej, szukając minimalnych objawów.

Choroba autosomalna recesywna. Objawy choroby występują u homozygot pod względem patologicznego genu (obydwa allele w parze genów są zmutowane), natomiast osoby będące heterozygotami to zdrowi nosiciele. W chorobach autosomalnych recesywnych prawie nie zdarzają się przypadki niepełnej penetracji i zmiennej ekspresji. Urodzenie dziecka z chorobą autosomalną recesywną najczęściej oznacza, że oboje rodzice są nosicielami patologicznego genu. Znacznie rzadziej obserwuje się sytuację, że dziecko otrzymało zmutowany allel od rodzica - nosiciela mutacji, a w drugim allelu nastąpiła mutacja de novo. Para, w której oboje partnerzy są nosicielami zmutowanego genu, jest obarczona 25% ryzykiem wystąpienia u dziecka danej choroby autosomalnej recesywnej (niezależnie od płci). Ryzyko to dotyczy każdej ciąży, niezależnie od liczby już chorych czy zdrowych dzieci. Zdrowe rodzeństwo osoby chorej na chorobę autosomalną recesywną jest obarczone 66% ryzykiem nosicielstwa patologicznego genu. Choroby autosomalne recesywne występują częściej u dzieci ze związków, w których partnerzy są ze sobą spokrewnieni.

Choroba dominująca sprzężona z chromosomem X. Chorują zarówno kobiety, jak i mężczyźni, ale objawy choroby u mężczyzn są bardziej nasilone. Niektóre choroby dominujące sprzężone z chromosomem X są letalne dla płci męskiej - choroba występuje tylko u kobiet, gdyż zarodki męskie z patologicznym genem ulegają obumarciu. Kobieta z chorobą dziedziczoną jako cecha dominująca sprzężona z chromosomem X jest obarczona 50% ryzykiem wystąpienia danej choroby u potomstwa niezależnie od płci, ale jeśli patologiczny gen prowadzi do obumarcia zarodka męskiego, ryzyko wystąpienia danej choroby dotyczy tylko córek. Mężczyzna z chorobą dziedziczoną jako cecha dominująca sprzężona z chromosomem X ma wszystkie córki chore, natomiast żaden z synów nie otrzyma od niego patologicznego genu. Występują znaczne różnice w nasileniu objawów choroby u kobiet zależne od tego, czy losowej inaktywacji uległ w większości komórek chromosom X zawierający gen prawidłowy, czy chromosom X zawierający gen patologiczny. Może się zdarzyć, że mimo posiadania patologicznego genu kobieta wykazuje zaledwie minimalne objawy choroby, dlatego po rozpoznaniu u dziecka choroby dominującej sprzężonej z chromosomem X obowiązuje drobiazgowe badanie matki pod kątem ewentualnych śladowych objawów świadczących o obecności mutacji.

Choroba recesywna sprzężona z chromosomem X. Na chorobę recesywną sprzężoną z chromosomem X chorują tylko mężczyźni, natomiast kobiety mające patologiczny gen są zdrowymi nosicielkami. Nosicielka patologicznego genu jest obarczona 50% ryzykiem wystąpienia choroby u synów i 50% ryzykiem, że jej córki będą nosicielkami mutacji. Chory mężczyzna nie przekazuje patologicznego genu żadnemu z synów (nie ma dziedziczenia choroby z ojca na syna), ale przekaże go każdej z córek (wszystkie są zdrowymi nosicielkami). Jeśli jest to pierwszy przypadek choroby recesywnej sprzężonej z X w rodzinie, choroba mogła być wynikiem nowej mutacji (rzadziej) lub otrzymania patologicznego genu od zdrowej matki-nosicielki (częściej).

Dziedziczenie holandryczne. Dziedziczenie holandryczne, czyli sprzężone z chromosomem Y, dotyczy genów zlokalizowanych w chromosomie Y. Przykładem takiego dziedziczenia jest dziedziczenie genu SRY. Choroby spowodowane mutacjami mitochondrialnego DNA. Choroby te są dziedziczone tylko po matce. Jest to związane z tym, że komórka jajowa jest bogata w mitochondria, podczas gdy plemnik prawie ich nie posiada. Chora matka ma zatem wszystkie dzieci chore, natomiast chory ojciec nie przekaże choroby żadnemu ze swoich dzieci. Skutki fenotypowe chorób spowodowane mutacjami mitochondrialnego DNA są bardzo różnorodne, co jest związane ze zjawiskiem heteroplazmii (w danej komórce część mitochondriów jest prawidłowa, w części występuje mutacja; w różnych tkankach odsetek mitochondriów z mutacją w DNA może być różny) [117].

1.3.4 Choroby uwarunkowane wieloczynnikowo

Około 5% populacji do 25. roku życia choruje już na jakąś chorobę uwarunkowaną wieloczynnikowo i z wiekiem odsetek osób z tymi chorobami zwiększa się w populacji, ponieważ do tej grupy należy wiele częstych chorób wieku dorosłego. Ostatecznie nawet do 60% populacji ogólnej choruje w trakcie swojego życia na chorobę uwarunkowaną wieloczynnikowo.

1.3.4.1 Zmiany materiału genetycznego w chorobach uwarunkowanych wieloczynnikowo

W dziedziczeniu wieloczynnikowym występuje interakcja wielu par genów zlokalizowanych w różnych miejscach (loci) i powodujących predyspozycję do wystąpienia choroby. W miarę poznawania podłoża molekularnego chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo identyfikuje się liczne polimorfizmy wpływające na produkt białkowy genu (np. w przypadku białek enzymatycznych obniżające ich aktywność) stanowiące o genetycznej predyspozycji do wystąpienia określonej choroby uwarunkowanej wieloczynnikowo. W różnych populacjach etnicznych mogą występować częściowo te same, częściowo inne mutacje i polimorfizmy. Dla ostatecznego wystąpienia choroby jest jednak niezbędny wpływ czynników środowiskowych i dopiero współdziałanie czynników genetycznych i środowiskowych powoduje wystąpienie choroby [84, 117].

1.3.4.2 Obraz kliniczny chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo

Około połowa wad rozwojowych o ustalonej etiologii to wady uwarunkowane wieloczynnikowo. Do nich należy większość wad izolowanych, tj. dotyczących jednego narządu, chociaż w części przypadków wad izolowanych występują mikrodelecje lub mikroduplikacje wykrywalne metodą mikromacierzy. Choroby atopowe, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca typu 2, łuszczyca, schizofrenia, większość nowotworów złośliwych - to również przykłady chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo [39, 84, 117].

1.3.4.3 Diagnostyka genetyczna chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo

Rozpoznanie danej choroby uwarunkowanej wieloczynnikowo oznacza identyfikację rodziny ryzyka genetycznego. W chorobach uwarunkowanych wieloczynnikowo nie ma wskazań do określenia kariotypu. Polimorfizmy genetyczne bada się tymi samymi metodami biologii molekularnej, jakie są stosowane przy diagnostyce chorób uwarunkowanych jednogenowo. Należy jednak uwzględniać mutacje i polimorfizmy występujące w danej populacji, gdyż w różnych populacjach etnicznych podłoże molekularne predyspozycji do danej choroby uwarunkowanej wieloczynnikowo może być odmienne. W badaniu molekularnego podłoża genetycznej predyspozycji do chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo szczególnego znaczenia nabiera metoda mikromacierzy, pozwalająca na analizę nawet tysięcy mutacji i polimorfizmów jednocześnie.

1.3.4.4 Poradnictwo genetyczne w chorobach uwarunkowanych wieloczynnikowo [39, 84, 117]

Wielkość ryzyka wystąpienia choroby uwarunkowanej wieloczynnikowo ustala się na podstawie badań empirycznych, opartych na obserwacji dużych grup rodzin, w których dana choroba występuje. W odniesieniu do indywidualnej rodziny ryzyko to może być jednak znacząco odmienne (większe lub mniejsze). W dziedziczeniu wieloczynnikowym ryzyko genetyczne zależy od tego, ilu członków rodziny jest dotkniętych daną chorobą. Ważny jest też stopień pokrewieństwa z osobą chorą - ryzyko genetyczne gwałtownie spada wraz ze zmniejszaniem się stopnia pokrewieństwa (największe ryzyko wystąpienia choroby dotyczy krewnych pierwszego stopnia, tj. rodzeństwa i potomstwa). W przypadku wielu chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo stopniowo poznawane są geny i ich polimorfizmy stanowiące o genetycznej predyspozycji do zachorowania na określoną chorobę. Badania molekularne mogą zidentyfikować osoby podatne na zachorowanie, co nie tylko ułatwia poradnictwo genetyczne, ale przede wszystkim umożliwia wdrożenie adekwatnych działań profilaktycznych (np. badania profilaktyczne w przypadku predyspozycji do określonych nowotworów). Zarówno w poradnictwie genetycznym, jak i diagnostyce genetycznej należy uwzględniać pochodzenie etniczne pacjenta, ponieważ zarówno ryzyko genetyczne, jak również mutacje i polimorfizmy mogą się różnie przedstawiać w różnych populacjach.

1.4 Metody diagnostyki genetycznej w położnictwie i ginekologii

1.4.1 Badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej

Badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej można przeprowadzić na komórkach dzielących się, ponieważ ocenia się chromosomy będące w metafazie podziału komórkowego. Standardowo badanie kariotypu wykonuje się na limfocytach krwi obwodowej. Do określenia kariotypu potrzeba 2-3 ml krwi obwodowej pobranej jałowo na heparynę. Probówkę z krwią można przesyłać pocztą w temperaturze otoczenia. Hodowla limfocytów trwa zwykle 72 godziny (niekiedy 48 godzin), następnie hodowla jest kończona i są wykonywane preparaty cytogenetyczne. W przypadku podejrzenia lub stwierdzenia mozaikowości chromosomowej badanie kariotypu przeprowadza się dodatkowo na innych komórkach, najczęściej fibroblastach skóry. W przypadku diagnostyki prenatalnej aberracji chromosomowych materiałem biologicznym do badań są komórki płynu owodniowego lub krew pępowinowa [7, 64, 84].

Na chromosomach uzyskuje się wzór prążkowy (zwykle GTG, tj. wzór uzyskany przez trawienie trypsyną i barwienie barwnikiem Giemsy). Ocena kariotypu obejmuje określenie liczby chromosomów w wybranych płytkach metafazowych oraz analizę wzoru prążkowego chromosomów. Badanie kariotypu jest zatem wieloetapowe, przeprowadzane przez odpowiednio przygotowany personel (cytogenetyków) [28].

Wskazania do określenia kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej [39, 117]:

fenotyp wskazujący na określoną aberrację chromosomów (np. zespół Downa, zespół Turnera) - badanie kariotypu ma potwierdzić rozpoznanie kliniczne;

fenotyp wskazujący na bliżej nieokreśloną aberrację chromosomową (dysmorfia, wady wrodzone, opóźnienie rozwoju);

niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia samoistne, porody martwe, zgony dzieci z wadami);

zaburzenia różnicowania płci, hipogonadyzm;

opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niepełnosprawność intelektualna;

zespoły genetyczne z łamliwością chromosomów.

Są to klasyczne wskazania do badania kariotypu, które stale obowiązują, chociaż niektóre z nich są wycofywane. Według najnowszych międzynarodowych standardów badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej jest konieczne w razie podejrzenia zrównoważonych aberracji chromosomowych, tj. u par z niepowodzeniami rozrodu, ewentualnie również w celu potwierdzenia podejrzenia klasycznych zespołów liczby chromosomów. Natomiast w przypadku osób z wadami rozwojowymi i osób z opóźnieniem rozwoju lub niepełnosprawnością intelektualną metody cytogenetyki klasycznej są zastępowane badaniem opartym na technice mikromacierzy [70, 77, 117]. Nie ma wskazań do badania kariotypu w chorobach uwarunkowanych jednogenowo. W praktyce wskazania do badania kariotypu są nieco rozszerzone i w przypadkach podejrzenia zespołu dysmorficznego uwarunkowanego jednogenowo przeprowadza się jednak badanie kariotypu (najlepiej metodą mikromacierzy), które - wykluczając aberrację chromosomową - jest pomocne w potwierdzeniu rozpoznania.

W zapisie wyniku badania kariotypu obowiązują określone zasady i odpowiednia nomenklatura [101]. Jest to zapis międzynarodowy. Zasady zapisywania wyniku badania kariotypu z zastosowaniem metod cytogenetyki klasycznej przestawiono w tabeli 1.1.

Badanie kariotypu metodą cytogenetyki klasycznej wymaga niekiedy uzupełnienia o inne metody badania kariotypu (np. FISH, patrz niżej). Konwencjonalne badanie cytogenetyczne, przy liczbie prążków 400-500 na garnitur haploidalny, pozwala na uwidocznienie zmian materiału genetycznego wielkości ok. 10 mln par zasad (10 Mb = 10 000 kb) i większych. Przy zastosowaniu analizy chromosomów prometafazowych rozdzielczość wzrasta do 5, a nawet 2-3 Mb (2000-3000 kb), ale badanie staje się trudne, wymagające najwyższych umiejętności cytogenetycznych i czasochłonne, dlatego w praktyce zostało zastąpione przez FISH i technologię mikromacierzy [1, 24, 64].

Tabela 1.1

Zasady zapisywania wyniku badania kariotypu. Najczęstsze oznaczenia stosowane w zapisie wyniku badania kariotypu i przykłady interpretacji [101]

Symbol/zapis wyniku

Objaśnienie/interpretacja

p

Ramię krótkie chromosomu

q

Ramię długie chromosomu

t

Translokacja

del

Delecja

dup

Duplikacja

inv

Inwersja

ins

Insercja

r

Chromosom pierścieniowy

i

Izochromosom

mar

Chromosom markerowy

h

Heterochromatyna konstytutywna

pat

Pochodzenie ojcowskie

mat

Pochodzenie matczyne

46,XX

Prawidłowy kariotyp żeński

46,XY

Prawidłowy kariotyp męski

47,XY,+21

Trisomia 21 (zespół Downa) u chłopca (47 - całkowita liczba chromosomów; XY - chromosomy płci; +21 - dodatkowy chromosom 21)

46,XY,9qh+

Prawidłowy kariotyp męski; w jednym z chromosomów 9 występuje duży blok heterochromatyny konstytutywnej; jest to polimorfizm zazwyczaj bez znaczenia klinicznego

45,XY,der(13;14) (q10;q10)

Nieprawidłowy kariotyp męski; translokacja robertsonowska między chromosomem pary 13 i chromosomem pary 14

46,XX,t(13;18) (q31;q22)

Nieprawidłowy kariotyp żeński; translokacja wzajemna materiału genetycznego między chromosomem pary 13 a chromosomem pary 18; miejsca złamań to prążek 31 w ramieniu długim chromosomu 13 i prążek 22 w ramieniu długim chromosomu 18; wymianie uległy części ramion długich obu chromosomów, leżące dystalnie w stosunku do miejsc złamań

1.4.2 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FiSH) [24, 79]

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), jedna z metod tzw. cytogenetyki molekularnej, z powodzeniem łączy metody klasycznej cytogenetyki z technikami biologii molekularnej. Na preparat cytogenetyczny (chromosomy lub jądra interfazowe leżące na szkiełku podstawowym) zostaje nałożona sonda molekularna (ewentualnie wiele sond jednocześnie), dobrana ściśle pod kątem przypadku klinicznego. Sonda jest znakowana fluorochromem i po jej specyficznej hybrydyzacji do chromosomowego DNA miejsce hybrydyzacji sondy jest obserwowane w mikroskopie fluorescencyjnym. FISH jest znacznie czulsza niż klasyczne techniki cytogenetyczne (można wykryć zmiany materiału genetycznego wielkości 0,5 kb) i uzupełnia metody cytogenetyki klasycznej. Obecnie FISH jest zastępowana przez metodę mikromacierzy, zwłaszcza przy podejrzeniu niezrównoważonych submikroskopowych rearanżacji genomowych, ale w niektórych przypadkach jest metodą z wyboru.

FISH umożliwia [22, 23, 76, 79, 104]:

dokładniejsze określenie aberracji wykrytej w standardowym badaniu kariotypu, ale trudnej do interpretacji, jakimi są głównie zmiany w strukturze chromosomów, translokacje obejmujące więcej niż 2 chromosomy, zwłaszcza zrównoważone;

wykrywanie zrównoważonych mikrorearanżacji chromosomowych (np. w regionach subtelomerowych występujących rzadko u osób z niepowodzeniami rozrodu);

stosunkowo łatwą i szybką ocenę dużej liczby komórek w przypadkach mozaikowości chromosomowej;

wykrywanie aberracji chromosomowych w komórkach niedzielących się, co znajduje zastosowanie m.in. w tzw. szybkim teście diagnostyki prenatalnej najczęstszych aberracji liczby chromosomów (wielokolorowa FISH do niehodowanych amniocytów), w diagnostyce preimplantacyjnej i w badaniu aberracji chromosomowych w plemnikach (ryc. 1.4).

1.4.3 Badania molekularne

Diagnostykę genetyczną metodami biologii molekularnej wykonuje się na DNA (niekiedy RNA). Materiałem biologicznym najczęściej wykorzystywanym do badań molekularnych jest krew obwodowa. Do badań pobiera się zazwyczaj od 1 ml (małe dziecko) do 5-10 ml (osoba dorosła) krwi obwodowej na EDTA. Zwykle używa się do tego celu firmowych probówek. Nie należy zastępować EDTA heparyną, ponieważ hamuje ona działanie niektórych enzymów restrykcyjnych. Niekiedy badania molekularne wykonuje się na DNA uzyskanym z fragmentów kosmówki, z cebulek włosowych, z wymazów z jamy ustnej, plam krwi, bioptatów tkankowych, hodowli amniocytów i fibroblastów, a także z fragmentów narządów pobranych w trakcie badania anatomopatologicznego oraz tkanek utrwalonych przechowywanych w postaci bloczków parafinowych. Wszystkie próbki materiału biologicznego i wyizolowany DNA muszą być dokładnie opisane. Należy pamiętać, że osoba, u której będą wykonywane badania molekularne, musi wyrazić na nie pisemną zgodę (w przypadku dzieci zgodę wyrażają rodzice lub prawni opiekunowie). Probówki z krwią mogą być przesyłane pocztą w temperaturze otoczenia. Pobrany materiał biologiczny można też zamrozić w temperaturze -20oC. Bibułę z plamami krwi należy zabezpieczyć przed zanieczyszczeniem i można ją przechowywać w temperaturze pokojowej.

Metody biologii molekularnej są najczęściej stosowane w diagnostyce genetycznej chorób uwarunkowanych jednogenowo. Coraz częściej uzupełniają one, a niekiedy zastępują, analizę kariotypu. Innowacyjną technikę mikromacierzy przedstawiono poniżej. W diagnostyce aberracji liczby chromosomów oraz identyfikacji wybranych delecji i duplikacji stosowane są także metody QF-PCR i MLPA (ryc. 1.5) [105, 131].

W diagnostyce genetycznej chorób jednogenowych metoda badań molekularnych musi zostać starannie dobrana, a zależy ona m.in. od rodzaju mutacji (np. delecja części genu czy mutacja punktowa) i od tego, czy mutacja/mutacje prowadzące do danej choroby są znane, czy też nieznane i mogą występować w całym danym genie [13, 39, 106, 125]. Do niedawna nie można było prowadzić diagnostyki molekularnej w przypadku chorób genetycznych, jeśli nie został zidentyfikowany gen, którego mutacje prowadzą do danej choroby. Jeśli są jednak spełnione określone warunki (przede wszystkim duże rodziny, w których występuje wiele osób chorych na tę samą chorobę genetyczną - monogenową lub wieloczynnikową - i wiele osób zdrowych oraz jest możliwość uzyskania od tych osób materiału biologicznego), podejmuje się starania, aby zidentyfikować gen, którego mutacje są przyczyną choroby i - powiększając wiedzę na temat podłoża molekularnego chorób jednogenowych - stworzyć zarazem możliwość diagnostyki molekularnej tej choroby. Ostatnio w identyfikacji patologicznego genu w chorobach jednogenowych o nieustalonym dotąd podłożu molekularnym jest stosowane sekwencjonowanie całego eksomu (kompletnej sekwencji kodującej genomu) lub całego genomu.

Wiele metod diagnostyki molekularnej jest opartych na hybrydyzacji z sondą molekularną. Są to: hybrydyzacja w roztworze; hybrydyzacja na stałym nośniku - hybrydyzacja punktowa (dot blot), hybrydyzacja Southerna, hybrydyzacja northern i hybrydyzacja in situ. Hybrydyzacja, polegająca na tworzeniu hybrydu (dupleksu) między sondą molekularną a badanym DNA, jest wysoce specyficzna. Sonda molekularna jest znakowana, aby mogła być uwidoczniona w miejscu hybrydyzacji [13, 39, 84, 106, 114].

W diagnostyce molekularnej dąży się do wykrycia mutacji prowadzącej do danej choroby uwarunkowanej jednogenowo, ale w wielu przypadkach bada się także polimorfizmy (istotne w przypadku badania chorób uwarunkowanych wieloczynnikowo). Polimorfizmy RFLP są wariantami sekwencji DNA, w których dochodzi do utworzenia lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne, lub różniącymi się liczbą nukleotydów między miejscami cięcia przez dany enzym restrykcyjny. Polimorfizmy DNA są przekazywane z pokolenia na pokolenie jako cechy kodominujące. RFLP (restriction fragment length polymorphism, polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) jest metodą szeroko wykorzystywaną w diagnostyce molekularnej. Metoda ta może służyć do wykrywania zarówno mutacji, jak i polimorfizmów. W przypadku mutacji metoda ta może być zastosowana wówczas, gdy mutacja usuwa dotychczasowe lub wprowadza nowe miejsce cięcia enzymem restrykcyjnym [106, 117].

Metodą, która jest szczególnie szeroko stosowana w diagnostyce molekularnej, jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR - polymerase chain reaction), która umożliwia specyficzną amplifikację in vitro wybranego fragmentu DNA spośród całkowitego genomowego DNA. Amplifikacja metodą PCR polega na powtarzaniu cykli: denaturacji matrycowego DNA, podczas której DNA ulega rozdzieleniu, umożliwiając dostęp starterom, specyficznego wiązania starterów oraz syntezy komplementarnej nici DNA przeprowadzanej przez termostabilną polimerazę. W każdym cyklu dochodzi zatem do podwojenia wyjściowej liczby matryc. W trakcie 30 cykli wybrana sekwencja DNA ulega amplifikacji ponad milion razy. Ważną zaletą PCR jest to, że do badań wystarcza bardzo mała ilość materiału biologicznego (nawet pojedyncza komórka). Ograniczeniem PCR jest natomiast to, że musi być znana sekwencja fragmentu DNA mającego ulec amplifikacji, chociaż niedogodność tę można częściowo obejść. W niektórych przypadkach stosuje się metodę PCR multipleks, w której jest amplifikowanych jednocześnie kilka fragmentów DNA. Produkty PCR można od razu poddawać elektroforezie w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych i uwidocznić za pomocą bromku etydyny, srebrzenia azotanem srebra, lub - w przypadku sond znakowanych fluorochromami - zastosowania fluorografii [13, 106, 114].

Często PCR jest dopiero wstępem do dalszych badań - wówczas służy do amplifikacji fragmentu DNA, w którym może występować mutacja lub polimorfizm. Następnie produkt PCR jest sekwencjonowany (najczęściej) lub może np. być trawiony odpowiednio dobranym enzymem restrykcyjnym, a następnie dokonuje się analizy długości fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP) (ryc. 1.6) [106, 114].

Bezpośrednie rozróżnienie allelu prawidłowego (dzikiego) od allelu zmutowanego umożliwia metoda ASAPCR (dzięki odpowiednio dobranym starterom) i PCR-ASO (dzięki odpowiednio dobranym sondom oligonukleotydowym).

Konwencjonalna PCR jest metodą jakościową - ilość zamplifikowanego DNA zależy od liczby cykli, ale nie od liczby kopii badanego fragmentu DNA. W celu ilościowego pomiaru liczby kopii genu w genomowym DNA opracowano PCR w czasie rzeczywistym (realtime PCR) [106, 117].

Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera zamplifikowanych fragmentów DNA jest najczęściej stosowaną metodą bezpośredniej identyfikacji mutacji i polimorfizmów. Zsekwencjonować można wybrany fragment DNA zamplifikowany metodą PCR (np. ekson, w którym występują najczęściej mutacje), analizować można także cały gen - wówczas sekwencjonuje się produkty PCR wszystkich eksonów [106].

1.4.4 Technika mikromacierzy i sekwencjonowanie nowej generacji

Mikromacierze to innowacyjna metoda badania materiału genetycznego oparta na najnowszych osiągnięciach technologicznych. W porównaniu z dotychczas stosowanymi metodami, takimi jak klasyczne badanie kariotypu czy FISH, hybrydyzacje na mikromacierzach umożliwiają analizę w jednym badaniu całego materiału genetycznego, przy rozdzielczości nieosiągalnej we wspomnianych metodach. Można oczekiwać, że będzie to wkrótce jedna z podstawowych metod diagnostyki genetycznej, która zastąpi w znacznej mierze m.in. dzisiejsze techniki analizy mikroskopowej chromosomów. W zależności od typu mikromacierzy można badać duże i bardzo małe duplikacje i delecje materiału genetycznego, mutacje i polimorfizmy, a także ekspresję genów [70, 77, 93].

Mikromacierz DNA (DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka wielkości szkiełka mikroskopowego z naniesionymi w regularnych pozycjach polami (spots) mikroskopijnej wielkości. Pola te zawierają różniące się od siebie sekwencją jednoniciowe cząsteczki DNA, które są sondami molekularnymi mającymi zdolność specyficznego wiązania komplementarnych sekwencji badanego DNA. Zastosowania mikromacierzy to: diagnostyka aberracji chromosomowych i niezrównoważonych mikrorearanżacji genomowych, diagnostyka mutacji genowych i polimorfizmów (mikromacierze SNP), badanie ekspresji genów kodujących białka, badanie genomów nowotworów (precyzyjne prognozowanie i personalizacja terapii), identyfikacja i genotypowanie patogenów, badanie antybiotykooporności i farmakogenomika.

W arrayCGH na płytce mikromacierzowej osadza się bardzo małe fragmenty chromosomowego DNA; rozdzielczość metody jest zależna od liczby umieszczonych fragmentów i może wynosić od 1 Mb do 1 kb. Na płytkę mikromacierzową nakłada się DNA pacjenta wyznakowany fluorochromem, dającym zieloną fluorescencję, wraz z DNA kontrolnym wyznakowanym fluorochromem, dającym fluorescencję czerwoną. Przewaga zielonej fluorescencji na danym polu wskazuje na duplikację, przewaga czerwonej - na delecję określonego materiału genetycznego u pacjenta. Całość obrazu - fluorescencja z każdego pola - jest analizowana przy użyciu programu komputerowego, a wynik jest przedstawiony za pomocą raportu zawierającego listę genów, które u pacjenta uległy np. duplikacji czy delecji (ryc. 1.7).

Badania z zastosowaniem mikromacierzy wykazały, że mikrorearanżacje materiału genetycznego są przyczyną wielu przypadków niepowodzeń rozrodu, dystrofii wewnątrzmacicznej płodu, wad wrodzonych, opóźnienia rozwoju, niepełnosprawności intelektualnej, autyzmu i innych patologii. Stwierdzono, że w tych grupach pacjentów, w których klasyczne badanie chromosomów ujawnia aberrację chromosomową u 4%, arrayCGH wykazuje zmiany materiału genetycznego u 20% badanych, zatem 5 razy częściej. Z tych właśnie względów mikromacierze są obecnie uważane za metodę z wyboru w diagnostyce genetycznej w wyżej wymienionych sytuacjach klinicznych [70].

Oprócz wielkiej rozdzielczości badanie metodą mikromacierzy ma jeszcze jedną zaletę, ważną zwłaszcza dla diagnostyki prenatalnej - wynik badania można uzyskać w ciągu 3 dni. Ponadto, podobnie jak w przypadku innych metod molekularnych, badanie metodą mikromacierzy można przeprowadzić również na materiale archiwalnym [3].

W ginekologii i położnictwie badanie z zastosowaniem mikromacierzy jest zalecane w wielu często występujących sytuacjach klinicznych, takich jak: poronienia samoistne - badanie genetyczne materiału z poronienia (kosmówka), obumarcie płodu po I trymestrze - badanie kosmówki lub łożyska, diagnostyka prenatalna, np. w przypadkach wad wrodzonych u płodu [41, 91, 93, 112, 122]. Mikromacierze są niezwykle skuteczną metodą diagnostyki genetycznej u noworodków z wadami rozwojowymi. Mikromacierze klinicznie mogą być skuteczne także w wykrywaniu submikroskopowych zmian materiału genetycznego u noworodków z dysmorfią lub ciężką dystrofią wewnątrzmaciczną. W pediatrii badania z zastosowaniem mikromacierzy są rekomendowane w diagnostyce genetycznej u dzieci z opóźnieniem rozwoju, autyzmem i/lub wrodzonymi wadami rozwojowymi i są uznawane za metodę z wyboru, która zastąpi badanie kariotypu metodami cytogenetyki klasycznej [70, 77].

Technika mikromacierzy wchodzi szeroko do diagnostyki prenatalnej. Po wykazaniu niezwykłej skuteczności mikromacierzy w wykrywaniu zarówno klasycznych aberracji chromosomowych, jak i submikroskopowych rearanżacji genomowych u dzieci z wadami rozwojowymi wiele ośrodków zaczęło wprowadzać mikromacierz do diagnostyki prenatalnej. Wskazaniem do badań prenatalnych z zastosowaniem mikromacierzy jest zwłaszcza patologia płodu wykryta w USG. Materiałem biologicznym do badań jest trofoblast, płyn owodniowy i krew pępowinowa. Jeszcze w 2009 roku ACOG wyraził opinię, że w diagnostyce prenatalnej badania z zastosowaniem mikromacierzy nie mogą zastąpić klasycznych badań cytogenetycznych, jednak w latach 2010 i 2011 ukazało się kilka poważnych prac z dobrych ośrodków diagnostyki prenatalnej, z których wynika, że technika mikromacierzy ma tak znaczną przewagę nad dotychczasowymi metodami badań genetycznych, że powinna być stosowana w diagnostyce prenatalnej [41, 50, 132]. W jednym z badań metodą mikromacierzy wykryto dodatkowo u 3,6% płodów niezrównoważone rearanżacje genomowe niewykryte uprzednio w badaniu cytogenetycznym, a odsetek ten wzrastał do 5,2, jeśli w badaniu USG stwierdzono wady rozwojowe u płodu [50]. W 2012 roku wiele ośrodków wprowadziło arrayCGH jako podstawową metodę diagnostyki prenatalnej, ale doświadczenie uczy, że nie można całkowicie zrezygnować z badania metodami cytogenetyki klasycznej.

Sekwencjonowanie tzw. nowej generacji jest to sekwencjonowanie o olbrzymiej wydajności, co umożliwia badanie całego eksomu (wszystkich sekwencji kodujących), a nawet całego genomu. Istnieją różne podejścia metodyczne do sekwencjonowania, m.in. pirosekwencjonowanie i sekwencjonowanie przez ligację. Sekwencjonowanie nowej generacji jest podstawą opracowywania wielu testów genetycznych, w których analizuje się szybko bardzo duże geny i wielką liczbę genów jednocześnie.

Sekwencjonowanie całego eksomu jest z powodzeniem stosowane w celach naukowych i stopniowo wchodzi do diagnostyki genetycznej. Jego koszt systematycznie obniża się, ale nie wysoka cena badania jest zasadniczą barierą szerokiego zastosowania diagnostycznego. Podstawową trudnością jest interpretacja wyników sekwencjonowania, ponieważ aktualnie nie jest łatwe wyciąganie wniosków co do klinicznego znaczenia ogromu wykrytych zmian i przy analizie niezbędny jest udział bioinformatyków [26, 106]. Ponadto obserwuje się całkowicie nowe podejście badawcze i diagnostyczne: do tej pory w genetyce klinicznej obowiązywał kierunek analizy od fenotypu do genotypu. Lekarz genetyk ustalał rozpoznanie kliniczne i następnie szukał potwierdzenia badaniami molekularnymi. Obecnie możliwe jest odwrotne podejście metodyczne - od genotypu do fenotypu, kiedy zamiast żmudnego dopasowywania obserwowanych objawów do określonego znanego zespołu genetycznego (co nie zawsze jest uwieńczone ustaleniem rozpoznania) przeprowadza się sekwencjonowanie eksomu i wykryte zmiany, np. patogenna mutacja w określonym genie naprowadza na rozpoznanie kliniczne.

1.5 Wybrane zagadnienia kliniczne

1.5.1 Pary planujące ciążę

W przypadku pary planującej ciążę należy dołożyć staranności, aby ustalić, czy nie jest to rodzina podwyższonego ryzyka genetycznego. Rekomendacje I Europejskiego Kongresu Opieki Przedkoncepcyjnej i Zdrowia Przedkoncepcyjnego (1st European Congress Preconception Care and Preconception Health), który odbył się w Brukseli w dniach 6-9 października 2010 roku dotyczyły m.in. konieczności wczesnego wykrycia czynników ryzyka niepowodzeń rozrodu, a także czynników ryzyka urodzenia dziecka z wadami wrodzonymi lub chorobą genetyczną. W praktyce obowiązek ten spoczywa na ginekologu położniku, jako na tym lekarzu, który ma możliwość zwrócenia na to uwagi podczas wizyty pacjentki przed planowaną przez nią ciążą.

U każdej pary planującej ciążę konieczne jest zastosowanie określonego postępowania w celu ustalenia, czy nie występuje podwyższone ryzyko genetyczne urodzenia dziecka z wadami/chorobą genetyczną. Obejmuje ono:

Wywiad i ocenę stanu zdrowia partnerów, także z uwzględnieniem u nich wad wrodzonych, chorób genetycznych, przewlekłych chorób o nieznanej etiologii.

Wywiad rodzinny połączony z analizą rodowodu: występowanie określonej patologii (poronienia samoistne, porody martwe, brak ciąży, choroby genetyczne, choroby o nieustalonej etiologii, wady wrodzone, niepełnosprawność intelektualna), u kogo w rodzinie, ewentualnie sposób dziedziczenia.

Pytanie o ewentualne pokrewieństwo partnerów.

Zwrócenie uwagi na pochodzenie etniczne partnerów (np. Romowie, Żydzi aszkenazyjscy).

Skrining genetyczny, jeśli jest to rodzina lub populacja podwyższonego ryzyka genetycznego (np. rodzina, w której występują przypadki dystrofii mięśniowej Duchenne'a lub para należąca do populacji obciążonej wyższym ryzykiem wystąpienia określonych chorób genetycznych). Aktualnie nie ma zaleceń dotyczących wykonywania skriningu genetycznego w populacjach o niepodwyższonym ryzyku, jednak wiele firm komercyjnych oferuje testy wykrywające nosicielstwo najczęstszych mutacji.

To bardzo proste działanie jest niezwykle skuteczne w identyfikacji rodzin ryzyka genetycznego i - po przeprowadzeniu odpowiednio dobranych badań genetycznych - para może uzyskać poradę genetyczną, a ginekolog położnik zyskuje informacje co do ewentualnego stopnia zagrożenia wystąpieniem wad rozwojowych/choroby genetycznej u płodu, co pozwoli mu zaproponować pacjentce adekwatną diagnostykę prenatalną.

W badaniach oceniających znaczenie wywiadu rodzinnego w identyfikacji wskazań do diagnostyki genetycznej przed planowaną pierwszą ciążą wykazano, że spośród ogółem 481 analizowanych par u 58% (280 par) nie było wskazań do konsultacji genetycznej, gdyż wywiad rodzinny był nieobciążony, u 38% (181 par) wywiad rodzinny ujawnił choroby i niepowodzenia rozrodu wymagające zebrania dodatkowych informacji (uzupełnienie wywiadu rodzinnego, uzyskanie wglądu w dokumentację lekarską), a u 4% (20 par) stwierdzono wskazania do skierowania do poradni genetycznej jeszcze przed planowaną ciążą [120].

W przypadku par, w których partnerzy są spokrewnieni ze sobą, w wywiadzie rodzinnym należy zwrócić szczególną uwagę na występowanie w rodzinie chorób autosomalnych recesywnych i jeśli analiza rodowodu ujawni taki przypadek, przeprowadzić badania genetyczne u obojga partnerów w kierunku nosicielstwa patologicznego genu. Niezależnie od tego należy brać pod uwagę fakt, że spokrewnieni ze sobą partnerzy są obarczeni nieco większym ryzykiem urodzenia dziecka z chorobą genetyczną i wadą wrodzoną (wadami). U kuzynostwa I stopnia (krewni III stopnia) ryzyko to jest 2 razy większe od ryzyka populacyjnego i maleje w miarę oddalania się pokrewieństwa [39].

1.5.2 Zaawansowany wiek pacjentki planującej ciążę

W przypadku gdy kobieta planująca ciążę jest w wieku powyżej 37 lat lub oboje partnerzy są w zaawansowanym jak na rodzicielstwo wieku, lekarz ginekolog położnik może spotkać się z oczekiwaniami, że skieruje ich na badania genetyczne jeszcze przed planowaną ciążą. Oczekiwania te wynikają z powszechnej znajomości faktu, że zaawansowany wiek partnerów, zwłaszcza kobiety, zwiększa ryzyko urodzenia dziecka z chorobą genetyczną, przy czym zaawansowany wiek kobiety zwiększa ryzyko wystąpienia u dziecka trisomii, a zaawansowany wiek mężczyzny - chorób monogenowych spowodowanych nowymi mutacjami.

U takiej pary wskazane jest opisane uprzednio rutynowe postępowanie przedkoncepcyjne i jeśli nie stwierdzono innych niż wiek partnerów czynników ryzyka genetycznego, należy przedstawić wielkość ryzyka genetycznego, jednak przy nieobciążonym wywiadzie rodzinnym nie ma wskazań na tym etapie do badania kariotypu ani do innych badań genetycznych u kobiety lub jej partnera. Dopiero w czasie ciąży proponuje się adekwatną diagnostykę prenatalną, zgodnie z obowiązującymi standardami.

1.5.3 Brak ciąży. Badania genetyczne w przygotowaniu do iVF

W przypadku niepłodności badania genetyczne są istotną częścią postępowania diagnostycznego. Czynnik genetyczny można wykazać aktualnie u ok. 30% niepłodnych par, jednak w rzeczywistości przyczyny genetyczne mogą kryć się także za wieloma przypadkami niepłodności idiopatycznej [39, 87].

Celem badań genetycznych jest nie tylko ustalenie przyczyny niepłodności, ale także porada genetyczna, gdyż w przypadku stwierdzenia przyczyn genetycznych istnieje ryzyko przekazania nieprawidłowego materiału genetycznego potomstwu. Może to nierzadko oznaczać podwyższone ryzyko urodzenia dziecka z chorobą genetyczną, wadami wrodzonymi i/lub niepełnosprawnością intelektualną i taka para powinna być o tym poinformowana, aby świadomie kształtować swoje plany prokreacyjne. Szczególnie ważne jest przeprowadzenie badań genetycznych w przypadku par korzystających z procedury IVF.

Badania nad genetycznymi przyczynami niepłodności, zwłaszcza niepłodności męskiej, prowadzi wiele znanych ośrodków naukowych. Obejmują one konstruowanie modeli zwierzęcych i analizę genów kandydujących, co do których są przesłanki, że ich mutacje mogą prowadzić do niepłodności [59, 60, 61, 83]. Duże nadzieje wiąże się z sekwencjonowaniem całego eksomu (wszystkich sekwencji kodujących genomu człowieka) - metoda ta została już z powodzeniem zastosowana w badaniu genetycznego podłoża wielu zespołów genetycznych, przyczyniając się do poznania nowych genów, których mutacje są przyczyną wad wrodzonych i niepełnosprawności intelektualnej. Sekwencjonowanie wielu wybranych genów kandydujących w wielkich grupach mężczyzn z niepłodnością idiopatyczną wykazało u nich wiele polimorfizmów typu SNP (single nucleotide polymorphisms, tj. polimorfizmy pojedynczonukleotydowe). Wiele z nich najprawdopodobniej nie ma znaczenia klinicznego, jednak przynajmniej niektóre mogą być związane przyczynowo z niepłodnością [19]. Przyczyną niepłodności mogą być też zaburzenia w ekspresji genów podlegających rodzicielskiemu piętnowaniu genomowemu (imprintingowi). W plemnikach pochodzących od niektórych niepłodnych mężczyzn, szczególnie w przypadkach oligozoospermii oraz teratozoospermii lub asthenozoospermii, wykazano zmieniony wzór metylacji genów podlegających imprintingowi (m.in. MEST, IGF2/H19) [45, 88]. Może to mieć związek z podwyższonym ryzykiem wystąpienia u dziecka poczętego na drodze ICSI niektórych zespołów związanych z zaburzeniami rodzicielskiego piętnowania genomowego, takich jak zespół Beckwitha-Wiedemanna czy Silvera-Russella [71]. Zmienioną metylację obserwowano w jeszcze innych częściach genomu, m.in. w ALU i LINE1 [34]. Istnieją również znaczne różnice między transkryptami w nasieniu płodnych i niepłodnych mężczyzn, także w przypadkach normospermii [42]. Na płodność mogą też wpływać zmiany epigenetyczne w komórkach rozrodczych, tj. takie zmiany, które nie zmieniają kodu genetycznego, ale wpływają na ekspresję genów [8].

1.5.3.1 Diagnostyka genetyczna u niepłodnych par

Ze względu na znaczny udział czynników genetycznych w etiologii niepłodności badania genetyczne są niezbędną częścią postępowania diagnostycznego. Diagnostyka genetyczna u par z niepłodnością, w tym korzystających z IVF, obejmuje:

Wywiad rodzinny i analizę rodowodu obojga partnerów. Może przyczynić się do uzyskania informacji ułatwiających diagnostykę genetycznych przyczyn niepłodności, a także ujawnić rodzinę podwyższonego ryzyka genetycznego, zagrożoną urodzeniem dziecka z poważną chorobą uwarunkowaną genetycznie.

Badanie kariotypu. Badanie kariotypu jest podstawowym badaniem genetycznym u par, które nie mogą uzyskać ciąży [7, 39, 95]. U kobiet najczęstszą przyczyną niepłodności spowodowaną aberracją chromosomową jest zespół Turnera (1:2500 żywo urodzonych dziewczynek), przy czym tylko w niespełna 50% przypadków występuje kariotyp 45,X. Typowa jest duża różnorodność kariotypów - aberracje struktury chromosomu X (najczęściej izochromosom ramion długich) i/lub kariotypy mozaikowe z udziałem linii komórkowej 46,XX, co prowadzi do różnorodnych fenotypów, w tym z zachowaniem płodności, ale z przedwczesnym wygasaniem czynności jajników. Należy wykluczyć ewentualną obecność materiału genetycznego chromosomu Y ze względu na ryzyko rozwoju gonadoblastoma [39]. Kobiety z zespołem Turnera i zachowaną płodnością (nieliczne przypadki, najczęściej przy kariotypie mozaikowym) są obarczone podwyższonym ryzykiem wystąpienia zespołu Turnera u potomstwa (także duże ryzyko poronień, ponieważ 99% zarodków i płodów z kariotypem 45,X ulega poronieniu) [39]. Również u mężczyzn aberracje chromosomowe są najczęstszą genetyczną przyczyną niepłodności. Odsetek wykrywanych nieprawidłowych kariotypów zależy od wyników badania nasienia: aberracje chromosomowe stwierdzono u 13,2% mężczyzn z azoospermią, u 4,3% mężczyzn z oligozoospermią i u 3% niepłodnych mężczyzn z normozoospermią [126]. Najczęściej występują aberracje chromosomów płci (4% niepłodnych mężczyzn), zwłaszcza w azoospermii. Kariotyp 47,XXY (zespół Klinefeltera) występuje u 10% mężczyzn z azoospermią (i 0,5% mężczyzn z oligozoospermią), a u 0,9% mężczyzn z azoospermią stwierdza się kariotyp 46,XX z obecnością na jednym z chromosomów X fragmentu chromosomu Y zawierającego gen SRY. Rzadziej przyczyną niepłodności jest dodatkowy chromosom Y (47,XYY, ok. 0,3% przypadków oligozoospermii) lub kariotypy mozaikowe, kiedy oprócz linii komórkowej z kariotypem 46,XY występuje linia komórkowa z nieprawidłową liczbą lub strukturą chromosomów płci [39, 126]. U niepłodnych mężczyzn z oligozoospermią lub normozoospermią przeważają aberracje autosomów: 3% w przypadkach oligozoospermii i 1,6% w przypadkach normozoospermii. Aberracjami autosomów występującymi u niepłodnych mężczyzn są najczęściej translokacje robertsonowskie, zwłaszcza 13;14, rzadziej translokacje wzajemne, inwersje i chromosomy markerowe [35, za 126]. Badanie kariotypu należy zawsze przeprowadzić także u partnerki niepłodnego mężczyzny. Zarówno dane z piśmiennictwa, jak i wyniki badań własnych wskazują na to, że partnerki niepłodnych mężczyzn częściej niż kobiety z populacji ogólnej są nosicielkami aberracji chromosomowej.

Badania molekularne dobrane indywidualnie. Poszerzenie diagnostyki genetycznej o badania molekularne jest najczęściej wskazane u mężczyzn z azoospermią i oligozoospermią, u których wynik badania kariotypu jest prawidłowy. W pierwszym rzędzie powinna to być analiza molekularna regionu AZF chromosomu Y oraz badanie genu CFTR. 5-15% mężczyzn z prawidłowym kariotypem i azoospermią lub ciężką oligozoospermią ma mikrodelecje w AZF (azoospermic factor) w Yq11.2. Mikrodelecji Yq nie należy się spodziewać w przypadkach oligozoospermii, w których liczba plemników w 1 ml przekracza 5 mln. Całkowita delecja AZFa lub AZFb prowadzi odpowiednio do zespołu samych komórek Sertoliego lub zaburzeń w dojrzewaniu spermatocytów, podczas gdy częściowe delecje są związane z łagodniejszymi skutkami i często z obecnością plemników. Najczęściej występuje mikrodelecja AZFc, w której występują zaburzenia spermatogenezy, ale w ponad 70% przypadków stwierdza się obecność plemników w nasieniu [38, 66, 81]. Mężczyźni z mikrodelecjami w locus AZF nie tylko przekazują tę mikrodelecję synom, ale są również doniesienia o podwyższonym ryzyku wystąpienia u córek zespołu Turnera (monosomii X) [39]. Innym badaniem molekularnym wskazanym u niepłodnych mężczyzn jest analiza genu CFTR. Mutacje w genie CFTR w układzie homozygotycznym prowadzą do mukowiscydozy, przy czym u prawie wszystkich mężczyzn z tą ciężką chorobą autosomalną recesywną stwierdza się wrodzony obustronny brak nasieniowodów (CBAVD), prowadzący do niepłodności. Niekiedy mutacje w genie CFTR manifestują się klinicznie jedynie jako CBAVD. Wśród mutacji stwierdza się nie tylko delF508, najczęstszą mutację występującą w klasycznej mukowiscydozie, ale także mutacje typowe dla CBAVD, zwłaszcza R117H [39, 49, 83, 107]. U 19-24% mężczyzn z CBAVD stwierdza się mutację w obu allelach genu CFTR, a następne 42-47% ma mutację w jednym allelu. Oznacza to, że 60-70% mężczyzn z CBAVD ma mutację w przynajmniej jednym allelu genu CFTR, co jest ponad 15-krotnie częściej niż w populacji ogólnej. W przypadku stwierdzenia u mężczyzny mutacji w genie CFTR konieczna jest analiza molekularna genu CFTR także u partnerki, a w przypadku stwierdzenia u niej takiej mutacji para taka jest obarczona wysokim (25%) ryzykiem wystąpienia mukowiscydozy u potomstwa. Podwyższoną częstość występowania mutacji w genie CFTR (14,4-17,5%) stwierdzono także u zdrowych niepłodnych mężczyzn z azoospermią niespowodowaną CBAVD. U mężczyzn z CBAVD należy wykluczyć wady rozwojowe nerek (jednostronna agenezja) ze względu na podwyższone ryzyko wystąpienia w takich przypadkach agenezji nerek także u potomstwa [39]. Istnieje wiele innych chorób jednogenowych, w których częścią fenotypu jest niepłodność. W tych przypadkach badania molekularne muszą być poprzedzone dokładnym rozpoznaniem klinicznym (np. dotyczy to zespołu Kallmanna) [83]. U kobiet z POF na uwagę zasługuje nosicielstwo premutacji w genie FMR1, które występuje w 2% przypadków sporadycznych i 15% przypadków rodzinnych POF [39]. Inne geny, których mutacje opisywano, kiedy POF był częścią zespołu genetycznego, to BMP15, FMR2, LHR, FSHR, INHA, FOXL2, FOXO3, ER-?, SF1, ER-? i CYP19A1 [27].

Technologia mikromacierzy w diagnostyce genetycznej niepłodności. Można przewidywać szerokie zastosowanie w genetycznej diagnostyce niepłodności technologii mikromacierzy opartej na SNP [41]. W jednym badaniu będzie możliwe szybkie i precyzyjne zbadanie tysięcy mutacji i polimorfizmów w wielkiej liczbie genów. Inną sprawą jest technologia mikromacierzy typu arrayCGH, która umożliwia wykrycie niezrównoważonych zmian genomowych. Znaną przyczyną niepowodzeń rozrodu są m.in. zmiany genomowe zrównoważone, a takich arrayCGH nie wykrywa. Z kolei już poznane mikrodelecje związane z niepłodnością mogą być diagnozowane innymi, prostymi metodami. Badania z zastosowaniem mikromacierzy wykrywają nosicielstwo niezrównoważonych mikrorearanżacji materiału genetycznego także u osób bez widocznych zmian w fenotypie i niektóre z tych zmian mogą mieć związek z niepłodnością, sprawa jest zatem otwarta.

W przypadku stwierdzenia u któregoś z partnerów nosicielstwa aberracji chromosomowej, rearanżacji genomowej lub mutacji genowej obowiązuje udzielenie porady genetycznej obejmującej informację o ryzyku dotyczącym poronień samoistnych lub ryzyku urodzenia chorego dziecka. W przypadku skorzystania z procedury ART należy przedstawić parze specyficzne ryzyko określonych skutków dla potomstwa. Ostateczna decyzja dotycząca prokreacji i ewentualnego skorzystania z diagnostyki prenatalnej należy do pacjentów.

1.5.4 Poronienia samoistne

Analizując genetyczne przyczyny poronień samoistnych, należy uwzględnić obydwa genomy - genom matki i genom zarodka/płodu. Znacznie częściej genetyczną przyczyną obumarcia ciąży/poronienia samoistnego są zmiany patologiczne w genomie zarodka/płodu prowadzące do zaburzeń rozwojowych, rzadziej - mutacje i polimorfizmy w genomie matki niekorzystnie wpływające na warunki życia wewnątrzmacicznego płodu, co powoduje, że dochodzi do obumarcia płodu, mimo że materiał genetyczny rozwijającego się dziecka był prawidłowy.

Letalne choroby zarodka i płodu można znaleźć wśród wszystkich typów chorób genetycznych. Mogą to być zatem choroby spowodowane aberracjami chromosomowymi, submikroskopowymi rearanżacjami genomowymi, mutacjami pojedynczych genów, choroby związane z zaburzeniami piętnowania genomowego i choroby uwarunkowane wieloczynnikowo [5, 80, 83, 97].

Większość genetycznych przyczyn poronień samoistnych można obecnie diagnozować, jednak należy pamiętać, że pełna diagnostyka genetycznych przyczyn poronień samoistnych to badanie zarówno obojga partnerów (rodziców), jak i zarodka/płodu. Dopiero wówczas można wyciągnąć wnioski co do rokowania i odpowiedzieć na pytanie, czy niepowodzenia rozrodu dotyczą pary obarczonej ryzykiem genetycznym i zagrożonej podwyższonym ryzykiem urodzenia dziecka z wadami i niepełnosprawnością intelektualną.

Po dwóch poronieniach samoistnych obowiązuje diagnostyka genetyczna, składająca się z części klinicznej (wywiad dotyczący stanu zdrowia obojga partnerów i ewentualnej ekspozycji na czynniki szkodliwe związane z wykonywaną pracą zawodową, używkami itp.; wywiad dotyczący dotychczasowych ciąż; ocena fenotypu obojga partnerów ze zwróceniem uwagi na ewentualne cechy dysmorfii i objawy chorób genetycznych; wywiad rodzinny w zakresie co najmniej trzech pokoleń - wykreślenie i analiza) i badań genetycznych. Interpretacja wyników jest zidywidualizowana, uwzględniająca dane z wywiadu i analizy rodowodu. W przypadku obciążonego wywiadu rodzinnego diagnostyka genetyczna powinna zostać przeprowadzona już po pierwszym poronieniu, a nawet u par dopiero planujących ciążę.

1.5.4.1 Badania genetyczne u obojga partnerów

Aktualnie podstawowym badaniem genetycznym u obojga partnerów jest badanie kariotypu na podstawie hodowli limfocytów krwi obwodowej (analiza chromosomów w stadium nie mniej niż 550 prążków na garnitur haploidalny), niekiedy z zastosowaniem dodatkowych metod badania materiału genetycznego. U 3-6% par doświadczających poronień samoistnych badanie kariotypu ujawnia nosicielstwo aberracji chromosomowej, zwykle translokacji lub inwersji, i jest to 10-30 razy częściej niż w populacji ogólnej. Prawdopodobieństwo występowania nosicielstwa aberracji chromosomowej rośnie, jeśli kobieta nie tylko roniła, ale również urodziła dziecko z wadami lub jeśli u bliskich krewnych występowały niepowodzenia rozrodu [20, 40, 52].

Dane z piśmiennictwa i wyniki badań własnych wskazują na to, że w przypadku par z poronieniami samoistnymi nosicielstwo aberracji występuje niemal 2-krotnie częściej u kobiet, a wykrywanymi aberracjami najczęściej są translokacje wzajemne, rzadziej translokacje robertsonowskie i inwersje. W badaniach własnych stwierdzono, że połowa nosicieli aberracji miała zupełnie nieobciążony wywiad rodzinny, u pozostałych nosicieli wystąpiły już wcześniej niepowodzenia rozrodu w rodzinie. Jedna piąta nosicieli aberracji miała już jedno zdrowe dziecko. Nosiciel lub nosicielka aberracji chromosomowej są zupełnie prawidłowi fenotypowo, ale w ich przypadku odsetek gamet z nieprawidłowym materiałem genetycznym jest większy niż w przypadku osoby z prawidłowym kariotypem [20, 37, 117]. Wykrycie nosicielstwa aberracji chromosomowej nie zwalnia od dalszej diagnostyki mającej na celu wykrycie także ewentualnych innych przyczyn poronień, ponieważ w indywidualnym przypadku przyczyna poronień może być złożona [104]. Para, w której jeden z partnerów jest nosicielem aberracji chromosomowej, jest obarczona podwyższonym ryzykiem niezrównoważonego kariotypu u płodu i, tym samym, następnych poronień, a często także podwyższonym ryzykiem urodzenia dziecka z zespołem wad i opóźnieniem rozwoju. Ryzyko poronień i/lub urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem jest określane indywidualnie i zależy od tego, które chromosomy są objęte aberracją, od rodzaju aberracji (translokacja czy inwersja) oraz wielkości fragmentów chromosomów zaangażowanych w aberrację. Poza wyjątkowo niekorzystną sytuacją, kiedy jest to np. translokacja robertsonowska obejmująca chromosomy tej samej pary, w pozostałych przypadkach nosiciel lub nosicielka aberracji może mieć także zdrowe potomstwo [18, 43, 76, 79, 110, 113, 117].

W przypadku wykrycia nosicielstwa aberracji chromosomowej u któregoś z partnerów badaniem powinni zostać objęci także najbliżsi krewni nosiciela aberracji, rozpoczynając od rodziców, a wszyscy nosiciele aberracji powinni zostać objęci poradnictwem genetycznym [51, 129].

Niekiedy przyczyną poronień jest też obecność u któregoś z partnerów linii komórkowej z nieprawidłowym kariotypem, zwykle w bardzo małym odsetku i trudnej do wykazania, np. podwyższonym ryzykiem poronień samoistnych są obarczone kobiety z kariotypem mozaikowym z linią 45,X [58].

Przyczyną poronień samoistnych mogą być submikroskopowe rearanżacje genomowe u zarodka/płodu - mikrodelecje i mikroduplikacje. Część z nich jest de novo, jednak w części przypadków zmiany te są odziedziczone od rodzica, który jest bezobjawowym nosicielem takiej rearanżacji, zrównoważonej lub niezrównoważonej. Nosicielstwo rearanżacji zrównoważonych jest bardzo trudno wykryć - przeszkodą jest możliwość badania tylko wybranych regionów genomu (metoda mikromacierzy nie wykrywa zmian zrównoważonych), a barierą bardzo duży koszt badania. U około 2% par doświadczających poronień nawracających występują rearanżacje subtelomerowe, opisywano także submikroskopowe rearanżacje okołocentromerowe i w wielu innych miejscach genomu [22, 39, 79]. Wskazówką, że któreś z partnerów jest nosicielem submikroskopowych rearanżacji genomowych, jest wykrycie takich zmian w materiale z poronienia (w badaniu metodą mikromacierzy) - w przypadku stwierdzenia mikrodelecji lub mikroduplikacji u poronionego samoistnie zarodka/płodu przeprowadza się badanie obojga partnerów pod kątem nosicielstwa określonej zmiany materiału genetycznego.

Poronienia samoistne mogą mieć też etiologię jednogenową, np. kiedy oboje partnerzy są zdrowymi nosicielami tego samego zmutowanego genu i są obarczeni 25% ryzykiem, że u płodu dojdzie do układu homozygotycznego ze skutkami letalnymi [39]. Czasem kobieta jest nosicielką mutacji dominującej letalnej dla męskich zarodków i płodów - w takich przypadkach kobieta może nie wykazywać żadnych lub tylko śladowe objawy choroby, ale wskazywać na nią może obserwowana u kobiety nielosowa inaktywacja chromosomu X [6, 80, 130]. Większe ryzyko poronień występuje u kobiet z wrodzoną trombofilią, a także u kobiet, które są nosicielkami heterozygotycznej mutacji w genie NLRP7 w 19q13.4 (w układzie homozygotycznym mutacja powoduje rodzinną nawracającą chorobę trofoblastyczną) [89]. Opisano także skrócenie sekwencji telomerowych u kobiet z poronieniami nawracającymi, co może wskazywać na przyspieszony proces starzenia się, chociaż zjawisko to nie było bardziej zaznaczone u tych kobiet, u których przyczyną poronień była powtarzająca się trisomia u płodu [46]. Badania prowadzone na modelu mysim, a także analiza rodowodów rodzin, w których obserwuje się występowanie niepowodzeń rozrodu u wielu osób, wskazują, że istnieje jeszcze wiele innych genów, których dziś nie wiążemy z niepowodzeniami rozrodu, a których mutacje mogą odpowiadać za poronienia samoistne [4, 11, 29, 68].

1.5.4.2 Badania genetyczne materiału z poronienia

W przeszłości, kiedy badanie kariotypu metodami klasycznej cytogenetyki było jedynym badaniem genetycznym, trudności w badaniach genetycznych poronionych samoistnie zarodków i płodów (duży odsetek nieudanych hodowli, kontaminacja materiałem biologicznym pochodzącym od matki) powodowały, że badania te były rzadko wykonywane. Wraz z rozwojem zupełnie nowych metod badania materiału genetycznego wgląd w materiał genetyczny poronionego zarodka i płodu jest możliwy, co całkowicie zmienia całość diagnostyki genetycznej poronień.

Tabela 1.2

Aberracje chromosomowe występujące u poronionych samoistnie zarodków i płodów [103]

Kariotyp zarodka/płodu poronionego samoistnie w I trymestrze ciąży

Częstość występowania u zarodków/

/płodów poronionych samoistnie w I trymestrze

Odsetek

Prawidłowy 46,XX lub 46,XY

54,1

Triploidia 69,XXX

69,XXY

2,7

4,2

7,7

Tetraploidia

2,6

Monosomia X

18,6

Aberracje struktury chromosomów

1,5

Polisomia chromosomów płci

0,2

Monosomia autosomów (grupa G)

0,1

Trisomia autosomów 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

0

1,11

0,25

0,64

0,04

0,14

0,89

0,79

0,72

0,36

0,04

0,18

1,07

0,82

1,68

7,27

0,18

1,15

0,01

0,61

2,11

2,26

22,3

Podwójna trisomia

0,7

Trisomia w układzie mozaikowym

1,3

Inne aberracje

0,9

RAZEM

100,0

W większości przypadków przyczyną poronienia samoistnego jest aberracja chromosomowa u zarodka/płodu. Jest to związane z tym, że 20-30% komórek jajowych i 6-8% plemników u młodych, zdrowych, płodnych osób ma aberrację chromosomową (zwykle liczbową), a odsetek ten znacząco rośnie wraz z zaawansowanym wiekiem kobiety i nieprawidłowymi wynikami badania nasienia u mężczyzny [2, 37, 39, 83, 117]. Badania genetyczne materiału z poronienia wykazują, że aż 60% zarodków poronionych samoistnie w I trymestrze ciąży ma aberrację chromosomową. Oprócz aberracji chromosomowych znaczenie ma także m.in. nieprawidłowa ekspresja w kosmówce genów związanych z immunosupresją, implantacją, angiogenezą i apoptozą [5].

W praktyce bada się kosmówkę z poronienia, która w ponad 99% jest taka sama genetycznie jak płód. Kosmówkę pobiera się w trakcie zabiegu ewakuacji obumarłej ciąży lub oczyszczenia jamy macicy z resztek po poronieniu. Materiał biologiczny należy umieścić w jałowym niewielkim naczyniu i zalać jałową solą fizjologiczną. Można również badać materiał archiwalny przechowywany po poronieniach w postaci kostek parafinowych nawet sprzed wielu lat.

Badania genetyczne materiału z poronienia dostarczają informacji istotnych zarówno dla lekarza, jak i dla pary, która doświadczyła utraty ciąży [15, 74, 96].

Znaczenie badań genetycznych materiału z poronienia

Dostarczają informacji dotyczących przyczyny poronienia samoistnego/obumarcia ciąży. W zależności od zastosowanej metody badań genetycznych, w 40-70% przypadków stwierdza się w materiale z poronienia aberracje chromosomowe lub rearanżacje submikroskopowe. Nie oznacza to, że należy zaniechać rutynowej diagnostyki ginekologicznej, gdyż przyczyny poronień są zazwyczaj złożone i należy upewnić się, że wada genetyczna zarodka/płodu była jedyną przyczyną utraty ciąży [104]. Ponad połowa aberracji chromosomowych wykrywanych u poronionych samoistnie zarodków/płodów to trisomie (tab. 1.2), do których dochodzi najczęściej wskutek błędów podczas matczynej mejozy [48, 83, 103, 116]. Inne często występujące aberracje chromosomowe wykrywane u poronionych samoistnie zarodków i płodów to monosomia X (10-18% poronień) oraz triploidia i tetraploidia (łącznie ok. 10% poronień). Przyczyną poronienia są również aberracje struktury chromosomów u zarodka/płodu - delecje lub duplikacje, a także submikroskopowe rearanżacje genomowe.

Są podstawą właściwego poradnictwa genetycznego i ustalenia wskazań do diagnostyki prenatalnej w następnych ciążach. Uprzednie poronienia samoistne stanowią czynnik ryzyka urodzenia dziecka chorego (z wadami, chorobą genetyczną), ale trudno to ryzyko odnieść do indywidualnej pary bez znajomości genotypu poronionego zarodka/płodu. Znaczenie ma m.in. ustalenie, czy aberracja chromosomowa występująca u płodu jest liczbowa czy strukturalna. Także w przypadku zmian liczby chromosomów należy wziąć pod uwagę rodzaj aberracji: trisomie (z wyjątkiem większości przypadków trisomii 16) są prawie zawsze związane z podwyższonym (nieznacznie) ryzykiem powtórzenia się w następnych ciążach [15, 90, 121]. Według danych z piśmiennictwa triploidia (69 chromosomów) i monosomia X (kariotyp 45,X) nie podwyższają ryzyka powtórzenia się ich w kolejnej ciąży, jednak w badaniach własnych obserwowano powtarzanie się poronień z monosomią X lub triploidią u płodu. W przypadku wykrycia niezrównoważonej aberracji struktury chromosomów (duplikacji lub delecji) wskazana jest wnikliwa analiza kariotypu obojga partnerów (rodziców), nawet jeśli było to pierwsze poronienie samoistne. Badanie materiału z poronienia może również ujawnić sytuację, kiedy jedno z partnerów jest nosicielem submikroskopowej rearanżacji genomowej, niemożliwej do wykrycia przez wykonanie u nich klasycznego badania kariotypu. Para taka jest obarczona wysokim ryzykiem powtórzenia się tej patologii, a także urodzenia dziecka z wadami i niepełnosprawnością intelektualną. Na przykład u ok. 2% par z poronieniami nawracającymi jedno z partnerów jest nosicielem rearanżacji subtelomerowych [22, 39, 51, 79].

Umożliwiają określenie rokowania dotyczącego utrzymania się następnych ciąż. Chociaż niektóre aberracje chromosomowe wykryte w materiale z poronienia (większość trisomii, aberracje struktury odziedziczone po zdrowym rodzicu-nosicielu) oznaczają podwyższone - zwykle nieznacznie - ryzyko powtórzenia się aberracji chromosomowej u płodu, to jednak nieprawidłowy kariotyp będący wynikiem aberracji liczbowych de novo lepiej rokuje dla utrzymania następnej ciąży niż brak aberracji chromosomowych u poronionego/obumarłego samoistnie zarodka/płodu [15]. Zarówno w piśmiennictwie, jak i w badaniach własnych wykazano, że jeśli u danej pary występuje wiele poronień samoistnych, nie wykrywa się zwykle aberracji chromosomowej w materiale z poronienia [15, 17, 62].

Przynoszą rozstrzygnięcie, czy nosicielstwo aberracji chromosomowej u któregoś z partnerów jest wyłączną przyczyną poronień samoistnych. Wykrycie nosicielstwa zrównoważonej aberracji chromosomowej u któregoś z partnerów badaniem kariotypu na podstawie limfocytów krwi obwodowej bywa traktowane jako wyłączna przyczyna poronień u danej pary. Tymczasem przyczyny poronień samoistnych bywają złożone i prawidłowy kariotyp poronionego samoistnie płodu wskazuje na to, że w danym przypadku jest jeszcze inna przyczyna poronień niż nosicielstwo aberracji chromosomowej u rodzica [15, 16].

Łagodzą uraz psychiczny po utracie ciąży. Poznanie przyczyny utraty ciąży umożliwia łatwiejszą akceptację tego faktu przez parę. W przypadku stwierdzenia aberracji chromosomowej u poronionego samoistnie zarodka/płodu zostaje wyeliminowane poczucie winy u kobiety, że jakimiś działaniami w czasie ciąży (np. pracą zawodową, podróżą) mogła spowodować utratę dziecka. Istotne jest również to, że zaufanie pary do lekarza prowadzącego nie zostaje zachwiane ("nie można było nic zrobić"), co zwłaszcza w przypadku poronień nawracających ma bardzo duże znaczenie.

Najlepszą metodą badań genetycznych materiału z poronienia jest metoda mikromacierzy, ponieważ jako jedyna pozwala na wykrycie wszystkich aberracji liczby i struktury, a także submikroskopowych rearanżacji genomowych [9, 91, 99, 102]. W celu wykrycia aberracji liczby chromosomów płci oraz najczęstszych trisomii autosomów i triploidii oraz tetraploidii można również stosować metody FISH, QF-PCR i MLPA. Ta ostatnia pozwala także na identyfikację wybranych submikroskopowych zmian w okolicach telomerowych i centromerowych [31, 105].

Mało poznaną przyczyną obumarcia ciąży są ciężkie choroby jednogenowe zarodka i płodu. Niekiedy są przesłanki do ich stwierdzenia na podstawie rodzaju obserwowanych dużych wad, ale w przypadku wczesnych poronień samoistnych choroby jednogenowe są trudne do wykazania i w większości przypadków nie można zaproponować adekwatnych badań molekularnych, chociaż niektóre z genów, których mutacje prowadzą do obumarcia zarodka/płodu ludzkiego, już zidentyfikowano. Choroby jednogenowe letalne w okresie prenatalnym mogą być spowodowane nową mutacją, (np. letalne dysplazje kostne), mutacją odziedziczoną od łagodnie chorującej matki i mutacjami odziedziczonymi od obojga rodziców [39, 83, 85, 97]. W przypadku podejrzenia choroby jednogenowej o znanym podłożu molekularnym można przeprowadzić badanie materiału z poronienia metodami biologii molekularnej. Przy podejrzeniu choroby jednogenowej jako przyczyny poronień samoistnych należy zawsze zabezpieczyć do badań molekularnych zarówno materiał z poronienia, jak i krew obwodową obojga partnerów. Nawet jeśli diagnostyka molekularna określonej choroby nie jest na danym etapie dostępna, można oczekiwać, że przy obecnym szybkim rozwoju genetyki już w niedługim czasie pojawią się możliwości badań genetycznych w przypadku kolejnych chorób jednogenowych.

Przyczyną poronienia samoistnego mogą być również choroby zarodka i płodu uwarunkowane wieloczynnikowo. Wiele izolowanych wad rozwojowych, np. wady cewy nerwowej, ma etiologię wieloczynnikową. Badania genetyczne są w tej grupie trudne ze względu na złożone podłoże genetyczno-środowiskowe [39, 86].

Można przewidywać, że diagnostyka genetyczna w przypadku poronień samoistnych ulegnie z czasem zmianie - najpierw będzie to badanie materiału z poronienia, a dopiero później w zależności od wyniku, badania kariotypu partnerów. W miarę obniżania się kosztów badań genetycznych materiału z poronienia badania te będą stosowane w każdym przypadku poronienia samoistnego, i to już po pierwszym poronieniu. Jeśli kariotyp poronionego samoistnie zarodka/płodu za każdym razem będzie prawidłowy, badanie kariotypów partnerów/rodziców nie będzie wykonywane, a ginekolog położnik będzie poszukiwać innych przyczyn poronień niż aberracja chromosomowa u zarodka/płodu, i to począwszy od pierwszego poronienia.

Ocenę nie tylko kariotypu partnerów, ale także poronionego zarodka/płodu w przypadku niepowodzeń ciąży (szczególnie nawracających poronień samoistnych) zalecają towarzystwa naukowe: European Society for Human Reproduction and Embryology (Special Interest Group Early Pregnancy (SIGEP) of ESHRE), European Board and College of Obstetrics and Gynaecology, brytyjski Royal College of Obstetricians and Gynaecologists, amerykańskie National Society of Genetic Counselors oraz Polskie Towarzystwo Ginekologiczne, które zaleca ocenę kariotypu pary z niepowodzeniami ciąży i zwraca uwagę na znaczenie badań genetycznych u poronionego samoistnie zarodka/płodu [10, 15, 36, 96].

1.5.5 Wrodzone wady rozwojowe u płodu/noworodka

Poważne wady rozwojowe występują u 2-3% żywo urodzonych noworodków, a wśród płodów poronionych samoistnie lub martwo urodzonych częstość występowania wad rozwojowych jest znacznie większa [56, 63, 117]. Wady rozwojowe znajdują się na pierwszym lub drugim miejscu wśród przyczyn zgonów noworodków i niemowląt, są najczęstszą przyczyną niepełnosprawności fizycznej u dzieci i nierzadko współistnieją z niepełnosprawnością intelektualną. Urodzenie dziecka z poważną wadą rozwojową lub z zespołem wad jest przyczyną głębokiego urazu psychicznego u rodziców, często prowadząc do destrukcji rodziny. Osoby z poważnymi wadami rozwojowymi wymagają wieloletniej wielokierunkowej i kosztownej opieki medycznej, a wiele zespołów wad należy do tzw. rzadkich chorób, które stanowią szczególny problem dla systemu opieki zdrowotnej.

W chwili wprowadzenia Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWWR) w 1998 roku etiologia ponad 60% wad wrodzonych nie była znana. Od tego czasu nastąpiło w medycynie wiele zdarzeń zasługujących na miano przełomowych, związanych zwłaszcza z genetyką. Zsekwencjonowanie genomu człowieka, opracowanie całkowicie nowych technik badań genetycznych i badania na modelach zwierzęcych pozwoliły na znaczący postęp także w badaniach nad etiopatogenezą wad rozwojowych. Już obecnie wiadomo, że udział czynników genetycznych w etiologii wad wrodzonych jest decydujący. Dzięki badaniom z zastosowaniem mikromacierzy, sekwencjonowaniu nowej generacji i badaniom funkcjonalnym podłoże molekularne wad rozwojowych jest coraz pełniej poznawane, ale obraz, jaki się wyłania, jest niekiedy zaskakujący - odkrywa się także znaczenie mechanizmów epigenetycznych [54, 69, 108].

Znajomość etiologii wady/zespołu wad pozwala na podjęcie właściwych decyzji dotyczących postępowania terapeutycznego, a rodzicom dziecka pomaga zaakceptować fakt urodzenia dziecka z wadą/wadami i pozwala kształtować ich plany prokreacyjne. Jest ona również podstawą właściwej i skutecznej profilaktyki wad rozwojowych. Z tych względów u dziecka z wadą/wadami rozwojowymi należy zawsze dążyć do jak najwcześniejszego ustalenia ich etiologii. Z badań prowadzonych przez PRWWR we współpracy z ośrodkami genetyki medycznej w kraju wynika, że w Polsce stopień objęcia dzieci z wadami rozwojowymi diagnostyką genetyczną jest niewystarczający. O ile u 70-90% dzieci żywo urodzonych z zespołem Downa przeprowadza się badanie kariotypu, o tyle niespełna 15% wszystkich dzieci z wadami i 30% dzieci z wadami mnogimi w Polsce jest objętych diagnostyką genetyczną. Brak diagnostyki genetycznej i - tym samym - właściwej porady genetycznej ma niejednokrotnie dramatyczne skutki dla rodziny dziecka z wadami, a lekarz, nie kierując dziecka z wadami i rodziców do poradni genetycznej, naraża się na zarzut popełnienia błędu w sztuce lekarskiej. W związku z tym, że opisano już ponad 3000 zespołów wad wrodzonych, i z tym, jak rozbudowana jest obecnie diagnostyka genetyczna, współpraca z genetykiem klinicznym jest niezbędna.

Geny zaangażowane w proces organogenezy są u człowieka trudne do badania, wiele informacji pochodzi z badań na modelach zwierzęcych. Produkty tych genów to najczęściej białka sygnałowe, receptory, czynniki transkrypcyjne, białka strukturalne i enzymy (tab. 1.3) [111].

Etiologia wrodzonych wad rozwojowych jest różnorodna, ale tylko niewielki odsetek tych wad powstaje zupełnie bez udziału czynników genetycznych [56, 63, 83, 98, 117]. Trudno zresztą mówić o zupełnym braku czynników genetycznych nawet w przypadku wad rozwojowych u płodu powstających przy udziale czynników teratogennych (np. teratogeny chemiczne są w organizmie metabolizowane, a to także zależy od genów, dlatego ten sam teratogen działający na danym etapie organogenezy spowoduje powstanie wady u niektórych płodów, ale nie u wszystkich). Etiologię wrodzonych wad rozwojowych u dzieci żywo urodzonych przedstawiono w tabeli 1.4.

Około 6,5% wad rozwojowych jest spowodowanych przez aberracje chromosomowe [63, 117]. Osoby z kariotypem niezrównoważonym w zakresie autosomów mają nadmiar lub niedobór nawet setek genów, dlatego kliniczne skutki tak dużych ilościowo zmian materiału genetycznego są zawsze bardzo poważne. O poronieniach samoistnych wspomniano uprzednio. W przypadku utrzymania się ciąży występuje zespół wad rozwojowych i opóźnienie rozwoju/niepełnosprawność intelektualna u dziecka. Wspólne cechy fenotypowe w przypadku niezrównoważonego materiału genetycznego w zakresie autosomów to: dystrofia wewnątrzmaciczna, charakterystyczna dysmorfia twarzy, dysplastyczne małżowiny uszne i inne cechy dysmorfii, wady rozwojowe narządów wewnętrznych i niepełnosprawność intelektualna, ale przy małych aberracjach chromosomowych nie wszystkie te cechy są obecne [63, 100]. W przypadku aberracji chromosomów płci fenotyp pacjenta odpowiada określonemu zespołowi (np. zespołowi Turnera) lub występują zaburzenia różnicowania płci [100, 117].

Tabela 1.3

Geny zaangażowane w organogenezę [111]

Gen

Białko i jego funkcja

Przykład choroby

Białka sygnałowe

SHH

Sonic hedgehog Regulacja organogenezy

Holoprosencefalia typu 3

EDN3

Endotelina 3

Rola w rozwoju linii komórkowych wywodzących się z grzebieni nerwowych

Choroba Hirschsprunga Zespół Waardenburga typu 4b

LEFTY2

Lefty2

Rola w utrzymaniu symetrii "lewa-prawa strona"

Odwrócenie trzewi

Receptory

FGFR3

Receptor czynnika wzrostowego fibroblastów Ważna rola w rozwoju układu kostnego

Achondroplazja

Dysplazja tanatoforyczna typ I i II Hipochondroplazja

Zespół Cruzona, zespół Muenkego Kamptodaktylia

EDNRB

Receptor endoteliny B

Różnicowanie komórek grzebieni nerwowych w melanocyty i komórki zwojów jelitowych

Choroba Hirschsprunga Zespół Waardenburga typu 4A Zespół ABCD

GHR

Receptor hormonu wzrostu

Zespół Laron Niskorosłość idiopatyczna

Czynniki transkrypcyjne

HOXD13

Rozwój kończyn

Syndaktylia typ I, typ V Brachydaktylia typ E

Zespół brachydaktylia-syndaktylia Zespół VACTERL

PAX6

Rozwój gałek ocznych

Aniridia

TBX5

Rozwój kończyn

Zespół Holta-Orama

SRY

Determinacja płci męskiej

Zaburzenia determinacji płci

Białka strukturalne

ELN

Elastyna

Białko przestrzeni międzykomórkowej

Cutis laxa

Zwężenie zastawki aorty Zespół Williamsa-Beurena

LAMA3

Podjednostka ? 3 laminy 5

Ważna rola w różnicowaniu keratynocytów

Epidermolysis bullosa

Zespół krtaniowo-paznokciowo-skórny

Enzymy

CYP11B1

11-?-hydroksylaza steroidowa Udział w syntezie aldosteronu

Wrodzony przerost nadnerczy (CAH) Hiperaldosteronizm

HSD17B3

Dehydrogenaza 17-?-hydroksysteroidowa Udział w syntezie testosteronu

Niedobór dehydrogenazy 17-?-hydroksysteroidowej (zaburzenia determinacji płci)

EXT1

Glikozylotransferaza

Udział w polimeryzacji siarczanu heparyny

Mnogie dziedziczne wyrośla kostne Zespół Langera-Giediona

Tabela 1.4

Etiologia wrodzonych wad rozwojowych u dzieci żywo urodzonych [56, 70, 83, 98, 117]

Etiologia wrodzonych wad rozwojowych

Odsetek

Aberracje chromosomowe

6

Rearanżacje genomowe, mikrodelecje, mikroduplikacje

10-20-?

(w zależności od fenotypu)

Mutacje pojedynczych genów

7,5

Mieszane wpływy genetyczno-środowiskowe

20

Infekcja wewnątrzmaciczna

2

Choroby ciężarnej

3

Teratogeny chemiczne i fizyczne

1,5

Nieznana

?-40-50

Szczególną grupę wad rozwojowych stanowią wady spowodowane submikroskopowymi rearanżacjami genomowymi. Mogą to być wady jednego narządu lub zespoły wad z opóźnionym lub prawidłowym rozwojem intelektualnym. Niektóre z nich są dobrze poznane i wykrywalne za pomocą metod biologii molekularnej lub metody FISH (np. zespoły Pradera-Williego, Angelmana), ale metodą z wyboru w ich diagnostyce jest badanie z zastosowaniem mikromacierzy. Metoda mikromacierzy wykrywa zmiany materiału genetycznego (niezrównoważone aberracje chromosomowe lub mikrorearanżacje genomowe) u 67% pacjentów z fenotypem wskazującym na aberrację chromosomową, u 33% pacjentów z obojnaczymi narządami płciowymi, u 18% pacjentów z mnogimi wadami rozwojowymi i u 22% pacjentów z wrodzoną wadą serca [70, 91, 109].

Blisko 7,5% wszystkich wad rozwojowych o znanej etiologii jest uwarunkowanych jednogenowo [83, 117]. Uderzająca jest różnorodność fenotypowa chorób uwarunkowanych jednogenowo, w tym zespołów wad rozwojowych. Wśród zespołów wad są takie, którym towarzyszy niepełnosprawność intelektualna, oraz takie, w których rozwój umysłowy jest całkowicie prawidłowy. Niektóre zespoły wad rozwojowych są letalne w skutkach i prowadzą do poronień samoistnych, martwych porodów oraz zgonów dzieci wkrótce po urodzeniu.

Do wad rozwojowych powstających przy udziale czynników genetycznych należą także wady wrodzone uwarunkowane wieloczynnikowo - stanowią one ok. 20% wad wrodzonych. Do tej grupy należy wiele wad jednego narządu, np. większość przypadków wad cewy nerwowej, chociaż także wady jednego narządu mogą być spowodowane mikrorearanżacjami genomowymi [83].

Należy zwrócić uwagę na fakt, że konieczne jest monitorowanie wad wrodzonych u dzieci, które się urodziły po ART. Duża analiza wykazała, że ryzyko urodzenia dziecka z wadami jest podwyższone o ok. 25% w stosunku do ryzyka populacyjnego [47]. Z IVF związane jest podwyższone ryzyko wystąpienia niektórych zespołów genetycznych, w szczególności zespołu Beckwitha-Wiedemanna (BWS) [83, 124]. Co więcej, BWS u dzieci, które urodziły się dzięki ART, jest odmienny fenotypowo od BWS występującego u dzieci poczętych w sposób naturalny, m.in. jest związany z większym ryzykiem wystąpienia nowotworów [67]. Z kolei zespół Angelmana, także obserwowany częściej u dzieci z ART, jest kojarzony z hiperstymulacją jajników u kobiet z zaburzeniami owulacji [33]. W związku z rozwojem metod wspomaganego rozrodu i z tym, że w krajach rozwiniętych już 1-3% dzieci rodzi się dzięki ART, konieczne jest dalsze prowadzenie obserwacji. Konsekwencje kliniczne i społeczne urodzenia dziecka z wadami są tak poważne, a możliwości skutecznej terapii wielu wad znacznie ograniczone, że szczególnego znaczenia nabierają działania profilaktyczne. W przypadku wad uwarunkowanych genetycznie pierwotna profilaktyka polega na identyfikacji rodzin podwyższonego ryzyka genetycznego i objęciu ich poradnictwem genetycznym. Profilaktyka pierwotna wad wrodzonych to także przyjmowanie przez kobiety w wieku rozrodczym kwasu foliowego i suplementacja żywności kwasem foliowym. O ile dawka dzienna kwasu foliowego 0,4 mg jest w większości krajów uznana za dawkę profilaktyczną w populacji ogólnej, o tyle jest zgoda co do tego, że kobiety z padaczką, cukrzycą lub te kobiety, które urodziły już dziecko z wadą cewy nerwowej, powinny przyjmować dawkę 10-krotnie większą (4 mg na dobę). Ponadto wykazano, że przyjmowanie kwasu foliowego zmniejsza ryzyko także innych wad rozwojowych u płodu (m.in. wady serca, rozszczepu wargi i podniebienia) oraz że należy przedłużyć przyjmowanie kwasu foliowego na II i III trymestr ciąży, gdyż zmniejsza to ryzyko porodu przedwczesnego [32, 82, 115]. Pierwotna profilaktyka wad o etiologii niegenetycznej polega na eliminowaniu czynników teratogennych, w tym zwłaszcza unikaniu ekspozycji płodu na dym tytoniowy, alkohol, teratogeny chemiczne (w tym niektóre leki), szkodliwe czynniki fizyczne i teratogeny biologiczne. Profilaktyka II stopnia, jaką jest diagnostyka prenatalna, nie zmniejsza ryzyka poczęcia dziecka z wadami, ale rozpoznanie prenatalne wad rozwojowych jest ważne dla sposobu prowadzenia ciąży i porodu oraz leczenia chirurgicznego bezpośrednio po urodzeniu.

1.5.5.1 Noworodek z wadami letalnymi - postępowanie

W większości przypadków poważne wady rozwojowe u płodu są rozpoznane prenatalnie i ciężarna jest kierowana do ośrodka III stopnia referencyjności. Zwykle ośrodki te współpracują z genetykiem klinicznym i noworodek jest badany przez lekarza genetyka, który niekiedy już na podstawie badania przedmiotowego ustala w sposób niemal pewny rozpoznanie określonego zespołu, a zawsze zleca odpowiednio dobrane badania genetyczne. Problem stanowią te przypadki, kiedy konsultacja genetyczna nie jest możliwa, a rokowanie co do dłuższego przeżycia dziecka jest złe. W takiej sytuacji należy dołożyć starań, żeby rozpoznanie przyczynowe było możliwe nawet po śmierci noworodka z wadami. Poniżej przedstawiono postępowanie diagnostyczne w miejscu hospitalizacji dziecka, umożliwiające ustalenie etiologii wad nawet w przypadku zgonu dziecka. Postępowanie takie jest konieczne zawsze w przypadku wad mnogich, ale także wówczas gdy pojedynczej wadzie rozwojowej towarzyszą cechy dysmorfii. Należy pamiętać, że konieczna jest pisemna zgoda rodziców na przekazanie danych osobowych i materiału biologicznego oraz na zbankowanie DNA.

Postępowanie w przypadku letalnych wad rozwojowych u noworodka

Szczegółowy opis badania przedmiotowego. Należy szczegółowo opisać nie tylko duże wady, ale także wady drobne (np. niewielkie zmiany barwnikowe, zagłębienia skórne itp.), jeśli takie występują. Duże wady są zwykle mało charakterystyczne, natomiast wady drobne mają nierzadko ogromne znaczenie diagnostyczne.

Dokumentacja fotograficzna. Dokumentacja fotograficzna jest niezbędna, można ją wykonać także post mortem. Należy sfotografować całe dziecko, twarz, profil twarzy (z widoczną małżowiną uszną i potylicą), dłonie (powierzchnia dłoniowa i grzbietowa oraz dłoń w naturalnym położeniu), stopy (powierzchnia podeszwowa i grzbietowa) oraz ewentualnie inny region ciała, w którym występuje wada rozwojowa (np. zewnętrzne narządy płciowe).

Dokumentacja radiologiczna. Wskazane jest wykonanie zdjęcia radiologicznego całego ciała na jednej kliszy ("babygram"), a jeśli stwierdza się wady kostne, dodatkowo należy wykonać zdjęcie czaszki (boczne), kręgosłupa (boczne), dłoni i stóp. Dokumentacja radiologiczna jest niezbędna zwłaszcza w przypadku podejrzenia dysplazji kostnej u dziecka. Można ją wykonać post mortem.

Pobranie krwi na badanie kariotypu. Krew (0,5-1 ml) należy pobrać jałowo do strzykawki z heparyną i dostarczyć do laboratorium cytogenetycznego. Próbka krwi powinna być dostarczona najlepiej w ciągu 24 godzin, jeśli przekazanie krwi się przedłuża, do chwili transportu strzykawkę z krwią dobrze jest przechowywać w temperaturze +4°C (nie zamrażać!). Należy jednak podkreślić, że o ile dotąd badanie kariotypu było w przypadku wad mnogich "złotym standardem", o tyle obecnie jest nim badanie genetyczne z zastosowaniem mikromacierzy. Do badania metodą mikromacierzy zabezpiecza się materiał biologiczny tak samo jak dla badań molekularnych.

Pobranie materiału biologicznego na zbankowanie DNA i ewentualne badania molekularne. Zabezpieczenie materiału biologicznego na zbankowanie DNA jest konieczne w każdym przypadku porodu martwego lub zgonu noworodka z niewyjaśnionych przyczyn, zwłaszcza w przypadku wad rozwojowych lub z podejrzenia choroby genetycznej. W badaniu sekcyjnym należy pobrać do suchego naczynia (bez płynu) fragmenty wątroby i śledziony i natychmiast przekazać do pracowni genetyki molekularnej, a jeśli natychmiastowe przekazanie nie jest możliwe, materiał biologiczny należy zamrozić i w stanie zamrożonym przekazać do pracowni. Wyizolowany DNA zostanie zbankowany (konieczna zgoda na piśmie rodziców dziecka). Diagnostyka genetyczna obejmuje badanie metodą mikromacierzy i/lub inne badania molekularne w zależności od fenotypu, a w niedalekiej przyszłości sekwencjonowanie eksomu (sekwencji kodujących genomu).

1.5.6 Poród martwego płodu

Podobne postępowanie dotyczy także porodów martwych płodów, zwłaszcza jeśli prenatalnie lub po urodzeniu stwierdzono u płodu wady rozwojowe. Także i w tym przypadku ważny jest dokładny opis stwierdzonych u płodu nieprawidłowości. Ponadto należy pobrać fragment łożyska do naczynia z jałową solą fizjologiczną, a w badaniu sekcyjnym fragment wątroby i śledziony, tak jak opisano wyżej. Parę należy skierować do poradni genetycznej.

Jeśli został zabezpieczony materiał biologiczny martwo urodzonego dziecka, można przeprowadzić badanie genetyczne. W przypadku gdy fenotyp wskazuje na określoną trisomię, np. zespół Pataua, można wykonać badanie metodą QF-PCR, a jeśli fenotyp jest niecharakterystyczny, metodą z wyboru jest badanie z zastosowaniem mikromacierzy. Następnie - w zależności od wyników badania genetycznego u dziecka oraz zastosowanej metody diagnostyki genetycznej - można także wykonać badanie obojga rodziców dziecka.

Ponieważ aktualnie badania genetyczne płodu obumarłego/dziecka martwo urodzonego są rzadko wykonywane, zgodnie z obecnymi standardami jeden poród martwy, a nawet jedno obumarcie ciąży po I trymestrze jest wskazaniem do określenia kariotypu obojga rodziców dziecka. Wykrycie nosicielstwa klasycznej aberracji chromosomowej u któregoś z rodziców identyfikuje parę podwyższonego ryzyka genetycznego. W przypadku gdy kariotyp obojga partnerów jest prawidłowy, nie można wykluczyć możliwości, że któreś z partnerów jest nosicielem submikroskopowej rearanżacji chromosomowej, jednak są to sytuacje rzadkie.

1.6 Rejestry wrodzonych wad rozwojowych

Monitorowanie wrodzonych wad rozwojowych w populacji jest częścią systemów ochrony zdrowia w wielu krajach świata. Monitorowane są wady u dzieci żywo urodzonych, martwo urodzonych oraz przypadki, kiedy po rozpoznaniu wady ciąża została ukończona. Aktualnie (2011 rok) istnieją 123 rejestry wad zorganizowane w trzy sieci: EUROCAT (European Surveillance of Congenital Anomalies), ECLAMC (Latin-American Collaborative Study of Congenital Malformations) i ICBDSR (International Clearinghouse for Birth Defects Surveillance and Research). W Europie konsorcjum zrzeszającym rejestry wad rozwojowych, spełniające jednolite i bardzo ostre kryteria, jest EUROCAT (www.eurocat.ulster.ac.uk) utworzony w 1979 roku. EUROCAT zrzesza 43 rejestry wad (2011) monitorujące 31% urodzeń w Europie (ponad 1,7 mln urodzeń rocznie) [12, 44].

Cele EUROCAT:

dostarczanie informacji dotyczących epidemiologii wrodzonych wad rozwojowych w Europie;

koordynowanie działań i współpraca krajów europejskich w zakresie zbierania porównywalnych, kompletnych danych dotyczących wad rozwojowych; współpraca z rejestrami wad na świecie;

działania zmierzające do identyfikacji czynników teratogennych i źródeł ryzyka;

ocena efektywności działań podejmowanych w zakresie pierwotnej profilaktyki wad rozwojowych i przesiewowych badań prenatalnych;

współpraca i wymiana informacji mająca na celu poprawę poziomu opieki medycznej nad dziećmi z wrodzonymi wadami rozwojowymi i wypracowanie standardów postępowania profilaktycznego, diagnostycznego i terapeutycznego.

Polska uczestniczy aktywnie w tych działaniach poprzez Polski Rejestr Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWWR), który jest największym rejestrem EUROCAT [44, 64, 65, 73]. Polski Rejestr Wrodzonych Wad Rozwojowych, utworzony w 1997 roku, gromadzi informacje o wadach stwierdzonych prenatalnie oraz rozpoznanych do ukończenia przez dziecko 2. roku życia (www.rejestrwad.pl). Gromadzenie przez PRWWR wielu różnorodnych danych (m.in. dotyczących przebiegu ciąży, prenatalnej ekspozycji na czynniki mutagenne i teratogenne, wieku, wykształcenia, zawodu i stanu zdrowia rodziców, miejsca zamieszkania matki, poprzednich ciąż, wywiadu rodzinnego, prenatalnego rozpoznania wady, przyjmowania przez kobietę kwasu foliowego) umożliwia prowadzenie analiz epidemiologicznych i etiologicznych.

Cele PRWWR:

uzyskanie informacji o częstości występowania i rodzajach wrodzonych wad rozwojowych na terenie kraju;

analiza danych mogących przyczynić się do zidentyfikowania czynników ryzyka wystąpienia wad rozwojowych u płodu;

uzyskanie danych dotyczących zapotrzebowania na specjalistyczną opiekę medyczną i rehabilitację dla dzieci z wadami wrodzonymi i danych dla oceny jakości opieki medycznej;

poprawa poradnictwa genetycznego dla rodzin, w których urodziło się dziecko z wadami rozwojowymi;

uzyskanie wiarygodnych danych do badań etiologicznych i klinicznych;

utworzenie bazy danych szczegółowych analiz i zapytań.

Raporty z PRWWR są przekazywane do Ministerstwa Zdrowia, władz samorządowych i NFZ oraz są publikowane. Informacje o wadach wrodzonych w Polsce są także przekazywane do EUROCAT, gdzie są publikowane i umieszczane na stronie www.eurocat.ulster.ac.uk, a przez EUROCAT przekazywane dalej do urzędów Unii Europejskiej i WHO, stając się punktem wyjścia dla europejskich i światowych programów monitorujących i profilaktycznych.