1.2. MAZIAJE W RÓŻU I FIOLECIE, CZYLI DRZEWO POZNANIA
Drzewa w ludzkich wierzeniach i tradycjach są niejednokrotnie elementem nader istotnym. Bywa drzewo osią wszechświata, arbor et axis mundi, bywa podporą niebios i łączem pomiędzy światem ludzi i światem bóstw, bywa źródłem życia czy nieśmiertelności, bywa wreszcie wiązane z wiedzą, poznaniem, mądrością. Na drzewie zawisł Odyn, by poznać runy, pod drzewem Bodhi Budda osiągnął oświecenie, wieszcza belka na Jazonowym statku "Argo" pochodziła z poświęconego Zeusowi dębu wyrocznego z Dodony. W opowieściach irlandzkich orzechy leszczyny, drzewa mądrości, połknięte przez pewnego łososia, dały mu całą wiedzę świata, którą to nieszczęsny "Łosoś Wiedzy" przekazał dalej, gdy nieopatrznie skosztował go Fionn mac Cumhaill, późniejszy legendarny wojownik z cyklu feniańskiego. Nie sposób zresztą nie wymienić w tym szeregu biblijnego drzewa wiedzy, drzewa poznania dobra i zła.
Przełyk Barretta - specjalne barwienie podmalowuje na niebiesko typowe dla przemiany jelitowej wypełnione śluzem komórki kubkowe
Drzewem, któremu histologia i histopatologia, sztuki wyczytywania zdrowia i choroby z obrazów mikroskopowych, zawdzięczają współczesny swój obraz, jest niewątpliwie modrzejec kampechiański, zwany drzewem kampeszowym, Haematoxylum campechianum.
Europa odkryła drewno modrzejca i jego niezwykłe właściwości na początku szesnastego wieku. Hiszpanie, zaintrygowani żywymi barwami strojów zamieszkujących obszary dzisiejszego meksykańskiego stanu Campeche Majów, prędko dotarli do źródła barwnika pozyskiwanego, jak się okazało, z porośniętych cuchnącymi żółtymi kwiatami ciernistych drzew. Wytwarzany z przywiezionego do Hiszpanii drewna pigment szybko został zaadaptowany przez nie tylko lokalny przemysł barwiarski jako konkurencja dla indygo. Zainteresowanie nowym cennym zasobem - mimo hiszpańskich starań o utrzymanie monopolu - przyczyniło się do zapoczątkowania ożywionej działalności pirackiej na drewno modrzejca właśnie nakierowanej, do powstawania rabunkowych bazujących na wyrębie kolonii w Ameryce, a z czasem do przejęcia przez Anglię plantacji i przetwórni drzewa kampeszowego na Jamajce w wieku siedemnastym.
Nadające intensywną różowość zawartemu w preparatach śluzowi barwienie mucykarminem zawdzięczamy pewnym żerującym na kaktusach pluskwiakom (tu akurat wysepki komórek raka śluzowego piersi pływające pośród śluzowych jeziorek)
Lata doświadczeń i udoskonalania znacząco poprawiły jakość barwienia hematoksyliną, pigmentem, który sam w sobie tak naprawdę barwnikiem nie jest - jest bezbarwny i dopiero po utlenieniu do hemateiny zyskuje niezbędne właściwości, a po "zaprawieniu" odpowiednimi solami metali - akceptowalną trwałość. Ostateczny produkt zyskał tak wielką popularność, że to on właśnie posłużył do farbowania mundurów podczas wojny secesyjnej, a później I i II wojny światowej (co istotne zwłaszcza w obliczu konieczności uniezależnienia się od niemieckich syntetycznych barwników anilinowych). Przysposobienie hematoksyliny do mikroskopii było jedynie odpryskiem jej rozpowszechnienia się na rynku tkanin. Ponoć jako pierwszy wspominał o niej w tym kontekście jeszcze sam Robert Hooke, wielki siedemnastowieczny przyrodnik, jednak pierwsze zastosowanie hematoksyliny w histologii (choć roślinnej) przypisuje się Georgowi Christianowi Reichelowi w wieku osiemnastym, a na ostateczny sukces "owoc drzewa poznania" musiał odczekać kolejnych sto lat, kiedy to opisany oficjalnie w traktacie o mikroskopii Johna Thomasa Queketta w 1848 roku skupił na sobie powszechną uwagę i stał się obiektem dalszych prac ówczesnych uczonych. Przełomem okazał się rok 1865, w którym to zainspirowany przemysłem barwiarskim Boehmer zaproponował zaprawienie pigmentu i w tym zastosowaniu solami metali, tym razem w celu ułatwienia wniknięcia substancji w tkankę i utrwalenia efektu. Jeszcze przed końcem wieku dziewiętnastego jego pomysł stał się standardem podręcznikowym - także w literaturze polskojęzycznej. Już wydany w 1889 roku w Warszawie Zarys mikrochemii mineralnej i organicznej M. Heilperna tłumaczył:
"Rospatrując dane ciało, którego z cech zewnętrznych pod drobnowidzem poznać nie umiemy, możemy naturę jego wykryć, działając nań odczynnikiem, wywołującym w tem badanem ciele charakterystyczne zmiany [...]. W mikrochemii biologicznej stały się barwniki środkiem niezbędnym, tak do wykrycia niedostrzegalnych bez ich pomocy organizmów lub szczegółów ich budowy, jak również w celach lepszego zbadania, uwydatnienia i wyróżnienia oddzielnych składników organicznych i przebiegu zjawisk życiowych. Najczęściej używamy barwników karminowych, anilinowych i hematoksylinowych"[1].
Po czym następuje cała litania rzeczonych barwników hematoksylinowych, rozmaicie wzbogaconych postaci hematoksyliny (dokładniej: hemateiny) o różnych właściwościach i efektach kolorystycznych. Zaprawienie hematoksyliny ałunem, zasugerowane przez Boehmera, okazało się przepisem najnośniejszym, po dalszych modyfikacjach (hematoksyliny Ehrlicha, Harrisa czy Mayera) zyskując niemalże niekwestionowane po dziś dzień miejsce w histopatologii.
A to, czego nie udało się dokonać Hiszpanom, czyli monopol hematoksylinowy, ostatecznie dokonało się samo dzięki przemianom rynkowym, między innymi zastąpieniu plantacji drzew kampeszowych Jamajki uprawą trzciny cukrowej. Obecnie hematoksylina pozostaje jednym z ostatnich barwników histologicznych pozyskiwanym ze źródeł naturalnych, a jedynym dostawcą surowca jest firma Mexicana De Extractos w Campeche w Meksyku. Fakt ten co jakiś czas roznieca dyskusje o tym, czy nie warto by zastąpić hematoksyliny czymś mniej podatnym na ewentualne rynkowe czy polityczne wahania. Na razie bez efektów - hematoksylina króluje we współczesnej histopatologii, dzieląc się tronem jedynie z uzupełniającą ją na szkiełkach eozyną. Hematoksyliny nadają preparatom odcienie niebieskości i fioletu kontrowane różowością eozyny (nie bez powodu nazwanej przecież imieniem Eos, bogini jutrzenki).
Ale w sumie po co to wszystko? Czy sam plasterek tkanki wsunięty pod mikroskop nie wystarczy? Tkanki ludzkie (nieludzkie zresztą przecież także) same w sobie wszak prezentują cały wachlarz kolorów - od żółtej dzięki zapasom karotenoidów tkanki tłuszczowej przez brudną czerwień mięśni po brunatność wątroby czy zielonkawość podbarwionego żółcią pęcherzyka. I jasne, tak rzeczywiście jest. Człowiek pełen jest kolorów. Niestety, cała nieomalże ta paleta barwna umyka naszemu wzrokowi, gdy tkanka zostaje pokrojona tak cienko, jak czyni się to podczas obróbki laboratoryjnej naszych preparatów. Pamiętajcie, mikroskopia świetlna wymaga, by preparat był dla światła przezierny, a jednocześnie by dało się w miarę precyzyjnie ocenić jego zawartość. Wiele nakładających się na siebie warstw komórek uczyniłoby obraz nieczytelnym, stąd trafiające na szkiełka preparaty krojone są na plasterki grubości kilku mikrometrów (będące wdzięcznym odnośnikiem ludzkie czerwone krwinki, erytrocyty, mają średnicę mniej więcej 7 ?m), kolor tymczasem w znakomitej większości tkwi w masie. Taki cieniutki zatem plasterek skóry, mięśnia czy wątroby, skrojony z pobranego do badania fragmentu zatopionego dla większej trwałości i sztywności w parafinowej kosteczce zwanej bloczkiem, trzeba nieco podbarwić. I tak się złożyło, że najlepszym wyborem okazały się róże i fiolety hematoksyliny oraz eozyny. Bo wcześniej bywało z barwieniem preparatów różnie.
Już Antoni van Leeuwenhoek uznawany za ojca mikroskopii świetlnej w swych listach do Towarzystwa Królewskiego w Londynie (Royal Society of London) opisywał w roku 1714 użycie zmieszanego z brandy sproszkowanego szafranu dla lepszego uwidocznienia preparatów włókien mięśniowych, ale też w jego czasach mikroskop uchodził wciąż w dużej mierze za zabawkę. Dopiero dziewiętnasty wiek przyniósł poważniejsze badania - także mikroskopowe - nad tkankami zwierzęcymi. Pojawił się Joseph von Gerlach, niemiecki profesor anatomii, badający zawzięcie tkankę nerwową, a do szerszego użytku wszedł promowany przez Gerlacha od lat pięćdziesiątych czerwony barwnik histologiczny, karmin. Oczywiście karmin - podobnie jak hematoksylina czy szafran Leeuwenhoeka - przyszedł do histologii z zewnątrz; jego podstawowa składowa, kwas karminowy, był substancją pozyskiwaną podówczas naturalnie, z wysuszonych, zmielonych czerwców kaktusowych (Dactylopius coccus), żyjących w Meksyku owadów żerujących na kaktusach, i stosowany jako barwnik w farbiarstwie, malarstwie, a z czasem także w kulinariach i kosmetyce. Jeśli kojarzy się to wam z koszenilą - to jest to słuszne skojarzenie, bo pod tą nazwą właśnie karminowy proszek funkcjonuje; jeśli przypomniały wam się nasze rodzime czerwce polskie (lub ich armeńscy kuzyni) również wykorzystywane do produkcji barwników, to też dobry trop. Nadal chodzi o tę samą substancję. Zresztą zaprawiona solami glinu już jako mucykarmin nadal bywa wykorzystywana w pewnych dodatkowych barwieniach histologicznych (powszechnie spotykane badanie pozwalające ocenić obecność śluzu w preparacie). Tyle że końcówka dziewiętnastego wieku, bo wtedy to Mayer karmin ulepszał, to już czas hematoksyliny i eozyny, więc choć karmin przez jakieś czas był popularny (używał go na przykład Rudolph Virchow, jeden z pierwszych prawdziwych patologów), jako główny barwnik histologiczny został niedługo później odesłany do lamusa, pozostając właśnie tylko w badaniach dodatkowych. Dlaczego wygrały drzewo kampeszowe i syntetyczny barwnik anilinowy nazwany imieniem greckiej bogini? W przeciwieństwie do karminu i hematoksyliny eozyna była produktem syntetycznym. Opracowana w 1874 roku przez Heinricha Caro, dyrektora niemieckiej Badische Anilin und Soda Fabrik, spopularyzowana została zaledwie kilka lat później przez Paula Ehrlicha, późniejszego noblistę, choć wtedy właściwie jeszcze anonimowego studenta medycyny i już za chwilę młodego lekarza. Jego wczesne prace nad komórkami krwi nie tylko utorowały mu ścieżkę do głównych sukcesów na polu immunologii, ale także właśnie przy okazji opisania jednej z frakcji białych krwinek, granulocytów kwasochłonnych nazwanych od naszej anilinowej bogini jutrzenki eozynofilami, zwróciły uwagę na eozynę. No ale to nie jest odpowiedź na pytanie o przyczyny sukcesu.
Czemuż zatem róże i fiolety, a nie szafran, karmin i reszta chemicznego towarzystwa? Cóż, literatura podkreśla relatywną (mimo hematoksylinowego monopolu) taniość metody i stosunkową łatwość wykonania. Nie mnie, co prawda, wymądrzać się w tej ostatniej kwestii - to nie czasy Ehrlicha, Virchowa i innych - dzisiaj lekarze, o ile nie zajmują się tematem naukowo, nie barwią już sami swoich preparatów (stąd ukłony dla ekip laboratoryjnych odpowiedzialnych za tę część pracy zakładów patologii, która oddziela pobranie wycinków z nadesłanego do zdiagnozowania materiału, i umieszczenie ich w zwanych kasetkami pudełeczkach z tworzywa sztucznego od momentu, gdy w postaci eleganckich szkiełek niegdysiejsze kawały "mięcha" wędrują pod mikroskop). Jednak nie tylko finanse i prostota procedur są tu istotne. Ten właśnie zestaw barwników, zwany skrótowo HE, pozwala ocenić wyjątkowo wiele w oglądanych tkankach. Nie wszystko, owszem, stąd nadal niezbędne są barwienia pomocnicze, takie jak wspomniany mucykarmin chociażby, ale w większości przypadków w codziennej pracy diagnostycznej w zupełności wystarczy. Nasza para barwników pozostawia nas wbrew pozorom wcale nie z masą barwnych plam, jak mogłoby się wydawać na pierwszy rzut oka niewyszkolonego odpowiednio.
"Duże fioletowe zdjęcie, mnóstwo fioletowych plamek, a wy wiecie, że jedna z tych fioletowych jest złą fioletową... No magia..." - napisała kiedyś jedna z czytelniczek bloga. I jest to po części przynajmniej magia hematoksyliny i eozyny właśnie. No i naszego szkolenia specjalizacyjnego. HE wybarwia znakomitą część potrzebnych do uwidocznienia struktur prawidłowych (histologia) i zaburzonych (histopatologia) tkanek i komórek, bazując w znacznej mierze na odczynie chemicznym, czyli pH, tego, co barwi. Niebieska hematoksylina (a właściwie, jak pamiętacie, hemateina de facto) jest związkiem zasadowym, naładowanym dodatnio, przez co barwi struktury takie jak kwasy nukleinowe ciemnoniebiesko, stąd jądra komórkowe zwykle są w obrazach mikroskopowych niebieskimi bądź fioletowymi plamami. Eozyna, barwnik kwasowy, na czerwono (czy różowo) maluje, na przykład, cytoplazmę obfitującą w białka bogate w dodatnio naładowane łańcuchy aminokwasowe zawierające zasadowe lizynę i argininę - dlatego też większość objętości komórek pod mikroskopem to jeziorka różowości, pośród których wokół jagodowych jąder komórkowych dryfują pozostałe organella, czyli takie wewnątrzkomórkowe niby-narządy. Wypłukane ze swej zawartości podczas obróbki laboratoryjnej niegdysiejsze kropelki tłuszczowe z kolei pozostaną bezbarwne, stąd adipocyty, komórki tkanki tłuszczowej, przypominają puste w środku cienkościenne baloniki.
Różnice w rozmieszczeniu i zagęszczeniu niebieskości i fioletów jądrowych powiedzą nam niemało o szczegółach budowy jądra komórkowego i jego aktywności. HE pokaże nam pofałdowania otaczającej jądro błony jądrowej wpuklające się i falujące, tworząc na przekrojach wżery i bruzdy albo wręcz wyraźnie wydzielające się pseudoinkluzje, takie łże-pęcherzyki, jaśniejsze bąbelki charakterystyczne dla, na przykład, jąder komórek raka brodawkowatego tarczycy. Pokaże inaczej podbarwione i o odmiennej teksturze prawdziwe inkluzje powstałe wskutek infekcji wirusowych, kiedy to niepożądani goście tłoczą się w jądrach komórkowych gospodarzy, wykorzystując je do swych niecnych celów. Pokaże jasne, puste jądra hepatocytów, komórek wątroby, wypełnione drobnoziarnistymi złogami glikogenu, tak zwane glikogenowe zwyrodnienie jąder typowe dla niektórych schorzeń wątroby, ale też często spotykane po prostu w cukrzycy.
Wypełniająca komórkę cytoplazma zwykle jest różowa, ale subtelne niekiedy różnice w odcieniu różu również niosą ze sobą ważkie czasem wskazówki. Komórki intensywnie syntetyzujące białka będą miały cytoplazmę opchaną szorstką siateczką śródplazmatyczną (zwaną także szorstkim retikulum endoplazmatycznym). Ta odmiana siateczki, występująca w każdej poza plemnikami komórce zaopatrzonej w jądro, to system błon i kanałów z podczepionymi rybosomami dzielnie dziergającymi nici aminokwasowe docelowo tworzące białka. Rybosomy barwią się hematoksyliną na niebiesko, zatem takie intensywniej produkujące komóreczki będą miały cytoplazmę nieco niebieskawą (czy w praktyce - bardziej fioletową) w porównaniu z tymi mniej aktywnymi, stąd mniej różowości oczekujemy, przyglądając się komórkom wydzielniczym trzustki na przykład. Albo intensywnie wytwarzającym kolagen fibroblastom, komórkom tkanki łącznej o lekko niebieskawym odcieniu. Ale już podobne czasami bardzo do fibroblastów komórki mięśniówki gładkiej zajmują się kurczeniem raczej i rozkurczaniem, zatem nie rybosomy i kilometry upakowanej siateczki są im potrzebne, a włókienka białek kurczliwych - ich głęboki róż pomaga je odróżnić od poprzedników.
W cytoplazmie pływają najrozmaitsze rzeczy - to już wiecie. Te rzeczy również bywają nam pomocne. Mówiłam o bezbarwnych lipidach i balonikach komórek tkanki tłuszczowej, ale nie zawsze efekt będzie tak piorunujący, jak w adipocytach. Pozostałe po wypłukaniu tłuszczów "dziury" w cytoplazmie widoczne pod mikroskopem w stłuszczeniu wątroby, czy to drobno-, czy wielkokropelkowym, nie opróżnią komórek w aż takim stopniu, jednak trudno je będzie przeoczyć. Inne oblicze kropelki tłuszczu przyjmą w skórze w gruczołach łojowych. Każdy sebocyt (bo tak nazywają się tworzące gruczoł przekształcone komórki nabłonkowe) ma cytoplazmę wypełnioną pianką drobnych kropelek lipidowych. Z tym że kropelki te nie leżą (czy nie pływają może raczej) sobie w komórkach luzem, tylko są zamknięte w błoniastych pęcherzykach, wakuolkach, co daje efekt delikatnej różowej pianki utworzonej z otaczających wypłukaną pustkę maleńkich różowych bąbelków.
Albo takie mitochondria na przykład. Pełnią one w naszych komórkach funkcję swoistych mikroelektrowni. Wędrują po całej cytoplazmie, podlegając nieustającym cyklom fragmentacji oraz fuzji i tworząc coś w rodzaju komórkowej sieci energetycznej. Zmieniają kształty i rozmiary, przeważnie jednak przyjmując postać podłużnych pęcherzyków wysłanych od wewnątrz grzebieniasto pofałdowaną błoną (ten niewidoczny dla nas na oko grzebień błonowy to zresztą podstawa ich funkcji - tam właśnie rozmieszczone są kompleksy enzymatyczne, dzięki którym w procesach tak zwanego oddychania komórkowego, wskutek utleniania produktów rozkładu glukozy, "powstaje" energia upakowana w cegiełkach ATP, adenozynotrifosforanu). Zwykle nie przyjrzymy im się dokładnie, korzystając z mikroskopu świetlnego, są bowiem na to zbyt drobne, jednak pośrednio możemy je zaobserwować, nadają bowiem cytoplazmie szczególny różowy ziarnisty wygląd. Wyjątkowo licznych mitochondriów będziemy się spodziewać w komórkach wykonujących intensywną pracę - i tak komórki mięśni szkieletowych potrafią mieć ich setki tysięcy (no ale też trzeba pamiętać, że komórki mięśni szkieletowych bywają bardzo długie - sięgają nawet kilkudziesięciu centymetrów), a niezwykle aktywne metabolicznie komórki wątroby - dwa tysiące. Podobnie będzie z niektórymi komórkami nowotworowymi - w patologii zwykle takie intensywniej różowe, ziarniste komóreczki obładowane mitochondriami określa się mianem onkocytów. Sztandarowym przykładem będzie onkocytoma nerki, nowotwór łagodny, choć w niektórych przypadkach łatwy pod mikroskopem do pomylenia z jedną z odmian raka nerkowokomórkowego. Ale nie tylko w nerce takie "pracowite" guzy się zdarzają. Guzki onkocytarne notujemy też na przykład w tarczycy czy w śliniankach. Niektóre z nich będą łagodne, inne nie. Pojedyncze kryterium może pomagać w różnicowaniu, nie będzie jednak zazwyczaj decydować jednoznacznie o naturze zmiany.
Złocisty osad z resztek soli cholesterolu i barwników żółciowych, złuszczonych nabłonków oraz białych i czerwonych krwinek, ot, takie błotko żółciowe
W niektórych wreszcie komórkach również pod mikroskopem odezwą się pozostałości tych najbardziej naturalnych, pierwotnych barwników występujących w poszczególnych tkankach. Pamiętacie? Tych na przykład, które podbarwiają żółto i zielonkawo śluzówkę pęcherzyka żółciowego chociażby, pozostawiając delikatne złogi barwników żółciowych widoczne czasem także mikroskopowo. Albo drobnych ziarenek brunatnej melaniny produkowanej przez melanocyty, komórki barwnikotwórcze czy to zdrowej skóry (lub błon śluzowych), czy w znamionach i czerniakach. Czasami w wycinkach z jelita pomiędzy gruczołami jelitowymi pośród fioletów i różowości dostrzeżemy złocistobrązowe plamy obładowanych pigmentem makrofagów, czyli komórek żernych. Takie złociste lub brunatne ziarnistości tworzy mieszanina pigmentów zbiorczo nazywana lipofuscyną, określana też mianem "barwnika zużycia" mieszanka produktów metabolizmu kwasów tłuszczowych, efekt rozpadu błon komórkowych, wzbogacona o najrozmaitsze domieszki. W jelitach nazwiemy podobny stan melanozą i powiążemy zazwyczaj z nadużywaniem środków przeczyszczających, ale lipofuscynę napotkamy również w nerkach, sercu czy skórze. A i ona nie jest jedynym brązowawym barwnikiem mogącym się pojawiać w objedzonych komórkach żernych, bo kiedy makrofagi napotkają na swej drodze pozostałości mniejszych czy większych krwawień i obeżrą się resztkami czerwonych krwinek, to nazywane hemosyderofagami i pełne brunatnych ziarnistości również będą pośrednio mówić nam, co zaszło w okolicy.
I choć to dopiero początek, zorientowanie się w palecie barwnej preparatów to krok niezbędny, żeby ruszyć dalej w wędrówkę po labiryncie histopatologii. Taki podstawowy przewodnik, niezbędnik pozwalający w ogóle zacząć myśleć o braniu się za bary z oceną wyżej uorganizowanych struktur przez te wszystkie komórki tworzonych, by z kształtów podbarwionych różem i fioletem wyczytać, co chorym dolega i jak bardzo zdążyło się rozwinąć.
[1] M. Heilpern, Zarys mikrochemii mineralnej i organicznej, nakładem Administracyi "Wiadom. Farmaceutycznych", Warszawa 1889.
