1Wspólnoty bakterii w środowisku
1.1. Wprowadzenie
1.2. Organizacja przestrzenna wspólnoty bakterii
1.3. Wpływ czynników fizykochemicznych na wspólnotę bakterii
1.4. Struktura i bioróżnorodność populacji tworzących wspólnoty bakterii
1.5. Funkcje populacji we wspólnocie bakterii (nisze ekologiczne)
1.6. Klasyfikacja bakterii środowiskowych na podstawie szybkości wzrostu
1.7. Klasyfikacja i identyfikacja bakterii
1.8. Aktualne spojrzenie na klasyfikację bakterii
1.9. Strategie przeżycia bakterii w środowisku
1.10. Rola wspólnoty bakterii w środowisku
1.11. Metagenomy wspólnoty bakterii
Literatura
1.1. Wprowadzenie
Z punktu widzenia ekologii jedną z cech bakterii jest ich powszechność. Bakterie zasiedliły te środowiska, w których zaistniała szansa na ich przetrwanie, co nie jest tożsame ze stwierdzeniem, że bakterie występują wszędzie. Bakterie zasiedliły niezwykle szeroki wachlarz środowisk, począwszy od tych, w których istnieją optymalne warunki do rozwoju dla większości bakterii, do ekstremalnych, w których żyją bakterie fizjologicznie i genetycznie silnie wyspecjalizowane. Zasiedliły one środowiska bogate w związki organiczne, tego typu jak gleby, rzeki, jeziora, oceany i organizmy eukariotyczne, oraz środowiska ubogie w związki organiczne, w których panują warunki ekstremalne - gorące źródła, solanki, kwaśne wody kopalniane o pH bliskim zera, grube warstwy lodów arktycznych, miejsca w skorupie ziemskiej kilka kilometrów poniżej powierzchni naszego globu. Bakterie określają granice życia w danym środowisku. Na przykład komórki Aeropyrum pernix rosną w temperaturze między 70°C a 100°C (optimum, 90°C do 95°C), przy pH 5 do 9 (optimum, pH 7) i zasoleniu od 1,8 do 7% (optimum, 3,5% zasolenia). Wzrost komórek Aeropyrum pernix nie obserwuje się w temperaturze 68°C lub w 102°C. W warunkach zasolenia poniżej 1,5% komórki ulegają lizie z powodu szoku osmotycznego.
Bakterie są wszędobylskie i ich liczba jest ogromna - od 4 do 6 × 1030 komórek, przy czym znaczna ich ilość rezyduje w oceanach i podglebiu (3,5 × 1030 oraz 0,25-2,5 × 1030 komórek) (tab. 1.1). Bakterie zawierają 350-550 Pg węgla org. (Pg = 1015 g), co stanowi od 60 do 100% węgla występującego w biomasie roślin, oraz dziesięciokrotnie więcej fosforu i azotu niż wszystkie rośliny. Oczywiście podane wyżej ilości węgla nie uwzględniają mikroorganizmów występujących w filosferze (1026 komórek), układzie pokarmowym człowieka (1023 komórek), oraz nanobakterii, które w dużej ilości występują w pewnych obszarach Oceanu Atlantyckiego i na Alasce (1030 komórek Sphingopyxis alaskensis, stanowiące nieoszacowaną "czarną biomasę" organiczną). Bakterie są odpowiedzialne nie tylko za obieg pierwiastków biogennych w biosferze, lecz także za rozmieszczenie dużej porcji pierwiastków biogennych w żywych organizmach.
Bioróżnorodność bakterii nie jest paralelna do świata organizmów eukariotycznych. Do końca lat 80. XX wieku nie wiedziano, ile jest bakterii w konkretnym środowisku, ponieważ w zależności od środowiska na podłożach wyrasta od 0,001 do 15% bakterii, z prób pobranych, odpowiednio, z głębin oceanów i osadu czynnego (tab. 1.2). Obecnie, po przeprowadzeniu analiz ilościowych i jakościowych składu wspólnoty bakterii z zastosowaniem technik molekularnych, znana jest liczba bakterii oraz gatunki i taksony dominujące w danym typie środowiska, a także które z nich są specyficzne. Liczba gatunków bakterii w gramie gleby waha się od kilkuset do ponad 11 tys. (tab. 1.3). Szacuje się, że na Ziemi występuje 10 mld gatunków bakterii reprezentujących znaczną część ogólnej bioróżnorodności organizmów. Jednakże pewna grupa mikrobiologów jest skłonna przyjąć, że szacunkowa liczebność gatunków bakterii jest nie większa niż 106-109, czyli około 1 mld. Wydaje się, że optymalne do zdobywania informacji o liczebności gatunków jest stosowanie technik tego rodzaju jak "zagnieżdżona PCR" (ang. nested PCR) oraz klonowanie całego izolowanego DNA (ang. shotgun cloning), w których PCR nie jest stosowana. Techniką PCR można wykrywać takie gatunki, których liczebność komórek w środowisku wynosi ? 1% całej liczby komórek.
Tabela 1.1 Liczebność i biomasa prokariotów w biosferze. (Z: Whitman W.B., Coleman D.C., Wiebe W.J. 1998. Prokaryotes: the unseen majority. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 6578-6583; dzięki uprzejmości i za zgodą autorów oraz PNAS)
Środowisko
Liczba komórek prokariotów 1028
Ilość węgla w komórkach prokariotów (Pg)*
Środowiska wodne
12
2,2
Podglebie oceanów
355
303
Gleby
26
26
Podglebie lądów
25-250
22-215
Ogólnie
415-640
353-546
* Szacunki w tekście.
Tabela 1.2 Procent bakterii hodowalnych w warunkach laboratoryjnych. (Z: Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. 1995. Phylogenic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59: 143-169; za zgodą American Society for Microbiology)
Środowisko życia bakterii
Procent bakterii hodowalnych
Morza i oceany
0,001-0,01
Zbiorniki słodkowodne
0,25
Jeziora
0,1
Osad czynny
1-15
Osad denny
0,25
Gleba
0,3
Tabela 1.3 Bioróżnorodność bakterii w różnych środowiskach oznaczana metodami molekularnymi. (Z: Torsvik V., ?vre?s L., Thingstad T.F. 2002. Prokaryotic diversity-magnitude, dynamics, and controlling factors. Science 296: 1064-1066; dzięki uprzejmości i za zgodą AAAS; dodane z Curtis i wsp. (2002)
Środowisko
Liczebność komórek/cm3
Bakteryjna różnorodność (ekwiwalenty liczby genomów)
Gleba leśna
4,8 × 109
6 000
Gleba leśna (lasy hodowlane)
1,4 × 107
35
Pastwiska
1,8 × 1010
3 500-8 800
Grunty orne
2,1 × 1010
140-350
Gleba 1 g
6 300-38 000
Gleba 100 g
100 000-1 000 000
Gleba 1000 kg
4 000 000
Strefa pelagiczna oceanu (1000 l)
2 000 000
Woda oceaniczna (1 ml)
163
Dziewicze osady morskie
11 400
Osady morskie (hodowla ryb)
3,1 × 109
50
Żupy solne (22% zasolenia)
7,7 × 109
7
Osad czynny
6,0 × 107
70
Jeziora
108-109
8 000
Wśród bakterii, oprócz bioróżnorodności taksonomicznej i ewolucyjnej, istnieje największa różnorodność - metaboliczna. Tylko bakterie są w stanie wykorzystywać każdą energię zgromadzoną w związkach organicznych i nieorganicznych lub bezpośrednio obecną w pierwiastkach, w tym w wodorze, wykorzystując do jej pozyskiwania unikatowe boczne szlaki metaboliczne. Bakterie rozkładają na przykład cząsteczki kerogenu niedostępne dla grup organizmów z innych taksonów (kerogen - rozpuszczona w skałach osadowych materia organiczna w postaci drobnych, wyodrębniających się czarnych skupień, powstałych ze szczątków organicznych, nagromadzonych w osadach, który powstał pod wpływem ciśnienia i wysokiej temperatury). Zdolne są także do degradacji całej gamy ksenobiotyków, toksycznych dla wielu innych organizmów. Cechami tymi są obdarzone bakterie należące do rodzaju Sphingomonas (?-Proteobacteria). Techniki molekularne umożliwiły znaczne rozszerzenie naszej wiedzy o bakteryjnej liczebności i bioróżnorodności środowiska (tab. 1.4).
Tabela 1.4 Liczebność bakterii w środowiskach naturalnych
Środowisko
Liczebność bakterii
Literatura
Gleba leśna
4,8 × 109
Torsvik i wsp. (2002)
Pastwiska
1,8 × 107
Torsvik i wsp. (2002)
Grunty orne
2,1 × 1010
Torsvik i wsp. (2002)
Gleby wetlandów
109-1010
Ipsilantis i wsp. (2007)
Ścioła leśna
7,5-9,5 × 108
Krivtson i wsp. (2005)
Jeziora (strefa fotyczna)
105-106
Del Giorgio (1996)
Kanion w Hiszpanii
13,7-16,1 × 106
Simek i wsp. (2001)
Osady rzeczne
108-109
Vorobyova i wsp. (1997)
Wody gruntowe
103-106
Vorobyova i wsp. (1997)
Wody morskie
3,2-6,1 × 105
Maruyama i wsp. (2000)
Atlantyk (płd.-wsch.)
0,37-5,53 × 105
Andrade i wsp. (2007)
Osady morskie k. Antarktydy
<1 × 107
Thierstein i wsp. (1991)
Źródło gorące (55°) Kamczatka
9,4 × 103
Belkova i wsp. (2004)
Lody morskie
10-106
Connelly i wsp. (2006)
Skład ilościowy i jakościowy wspólnot bakterii zależy od wielu czynników fizykochemicznych oraz typu gleby i gatunków roślin zasiedlających daną glebę (efekt ryzosfery), praktyki rolniczej, strefy geograficznej, zawartości pierwiastków biogennych, zasolenia, skażeń środowiskowych, drapieżnictwa. Wciąż jednak nie wiadomo, dlaczego jedne taksony występują tylko w określonych glebach (Fibrobacter spp. i Syntrophomonas spp. - w glebach leśnych, natomiast Burkholderia spp., Rhizobium spp., Agrobacterium spp. - na pastwiskach), inne zaś tylko w wodach słodkich (Polynucleobacter), a jeszcze inne tylko w wodach morskich (Alteromonas, Pseudoalteromonas, Roseobacter). Nie wiadomo także, który z czynników jest bardziej istotny, heterogenność gleb czy homogenność wód. Heterogenność środowiska, uważana jako mozaikowość w czasie i przestrzeni, przez długi czas uznawano za jeden z czynników determinujących bioróżnorodności bakterii. Przyjmuje się, że różnorodność bakterii jest pozytywnie skorelowana ze wzrostem heterogenności. Zespół czynników w warunkach środowiska może zmieniać się w różnej skali i wpływać na różnorodność bakterii. W mikroskali (grudki gleby) bioróżnorodność bakterii może być wysoka i występować na bardzo małym obszarze.
Wpływ ekosystemów na bioróżnorodność bakterii. Kock i Schippers (2008) przeprowadzili badania nad składem ilościowym i jakościowym wspólnoty bakterii występujących w hałdach w trzech różnych miejscach na kuli ziemskiej (Botswana, Niemcy i Szwecja). Hałdy zawierają odpady pochodzące z kopalni różnych minerałów, w tym także pirytu (FeS2). Z hałd wyciekają kwaśne wody kopalniane, zawierające wyługowane jony różnych metali. Liczebność bakterii w hałdach dochodzi do 108 komórek/cm3 wody. We wspólnocie mikroorganizmów we wszystkich trzech hałdach dominują taksony należące do domeny Bacteria, Archaea i Eukarya zaś są w mniejszości. W hałdach występują bakterie chemolitotroficzne, należące do rodzajów: Acidithiobacillus, Leptospirillum i Sulfobacillus, utleniające zredukowane związki siarki i Fe(II) oraz ługujące także inne jony metali. We wszystkich trzech środowiskach występują gatunki z rodzajów: Acidithiobacillus, Leptospirillum i Sulfobacillus. Gatunki Leptospirillum współdominują z gatunkami Acidithiobacillus w hałdzie szwedzkiej, w mniejszych ilościach występują w hałdzie niemieckiej, w hałdzie botswańskiej zaś występują tylko w niektórych miejscach poboru próbek. Gatunki należące do rodzaju Sulfobacillus występują w małej ilości w hałdzie szwedzkiej, w kilku próbach w Botswanie i okazjonalnie w niemieckiej. Wyniki te wyraźnie wskazują, że skład wspólnoty bakterii utleniających siarczki i Fe(II) różni się w opisanych miejscach, mimo podobieństwa składu minerałów kopalń, z których je wydobywano. I nie wiadomo, który z czynników istotnie wpływa na skład wspólnot bakterii zasiedlających hałdy kopalń minerałów.
Wzrost produktywności w ekosystemie działa różnie na skład i różnorodność wspólnot bakterii zasiedlających. Z badań Benlloch i wsp. (1995) prowadzonych nad bioróżnorodnością na dwóch lagunach o różnej produktywności wynika na przykład, że więcej różnych rybozomowych sekwencji bakterii pozyskano z laguny o większej produktywności niż o produktywności niższej, co sugeruje, że bogactwo taksonomiczne bakterii rośnie wraz ze wzrostem produkcji pierwotnej. Obserwacje poczynione przez Torsvik i wsp. (1998) w próbach osadu pobranych z nieskazitelnie czystych ekosystemów wodnych wskazują na występowanie w nich większej bioróżnorodności bakterii w porównaniu ze składem osadów stawów rybnych. Ta obserwacja wskazuje, że dodatek związków organicznych jest przyczyną spadku bioróżnorodności bakterii we wspólnotach. Wreszcie z badań Horner-Devine i wsp. (2003) wynika, że wzrost produktywności wpływa zarówno pozytywnie, jak i negatywnie na bioróżnorodność bakterii, a kształt tych zależności między produktywnością i bioróżnorodnością jest różny w różnych grupach taksonomicznych; szczególnie obserwacje te dotyczą bakterii z typu Bacteroidetes. Inne zależności występują w innej licznej grupie bakterii, np. w klasach ?-Proteobacteria i ?-Proteobacteria. Te trzy kolejne wykluczające się spostrzeżenia wskazują, że bioróżnorodność bakterii zmienia się różnie w zależności od produkcji pierwotnej (ryc. 1.1).
Rycina 1.1 Zależność między produkcją pierwotną (wyrażoną ilością chlorofilu a) i taksonomiczną bioróżnorodnością bakterii (obliczona wg Hughes i wsp. 2001) w pięciu zbiornikach wodnych. Oznaczenia: puste romby - bioróżnorodność ?-Proteobacteria, ciemne trójkąty - bioróżnorodność Bacteroidetes oraz szare kwadraty - bioróżnorodność ?-Proteobacteria. (Z: Horner-Devine M.C., Leibold M.A., Smith V.H. Bohannan B.J.M. 2003. Bacterial diversity patterns along a gradient of primary productivity. Ecol. Lett. 6: 613-622; dzięki uprzejmości i za zgodą wydawnictwa Wiley-Blackwell)
1.2. Organizacja przestrzenna wspólnoty bakterii
Mikroflora autochtoniczna wielu środowisk rozwija się przestrzennie zgodnie z gradientem czynników fizykochemicznych. Występowanie gradientu fizykochemicznego pozwala na rozwój i współegzystencję heterogennych populacji mikroorganizmów. Populacje mikroorganizmów, zależnie od kierunku gradientu czynników środowiskowych, organizują się albo horyzontalnie, albo wertykalnie. Przykładem gradientowego rozmieszczenia są bakterie magnetotaktyczne. Bakterie te są organizmami wodnymi, występującymi w bezpośrednim działaniu pola magnetycznego. Zdolność do magnetotaksji jest oparta na magnetosomach, które są wewnątrzkomórkowymi kryształami magnetytu (Fe3O4) lub greigitu (Fe3S4), otoczone membranami. Funkcją magnetotaksji, jak się przypuszcza, jest na ogół ułatwienie znalezienia przez bakterie strefy beztlenowej i utrzymanie dogodnej pozycji w pionowym gradiencie chemicznym w stratyfikowanym środowisku wodnym. Magnetotaktyczne ziarniaki występują w tlenowej i mikrotlenowej strefie osadów dennych morskich i słodkowodnych, w postaci różnych morfotypów, w ilości do 2 × 105 komórek/cm3, oraz w strefie beztlenowej w obecności siarczków o stężeniu 2 mM. Jak się przypuszcza, rozmieszczenie różnych bakterii magnetotaktycznych opiera się na gradientowym stężeniu siarczków oraz tlenu w środowisku. Również zauważa się, że bakterie wytwarzające magnetosomy z greigitu częściej występują w strefie beztlenowej tam, gdzie są siarczki, tworzące zaś je z magnetytu - w strefie tlenowej.
Liczne i różne typy zarówno fizjologiczne, jak i troficzne mikroorganizmów występują w wielu środowiskach i mimo współzawodnictwa mogą rosnąć w bezpośredniej bliskości. Jest to możliwe dzięki na przykład gradientowi tlenu w małych cząstkach gleby, który pozwala na wzrost mikroorganizmów tlenowych, mikroaerofili i beztlenowców w bezpośrednim sąsiedztwie. Bioróżnorodne wspólnoty są najbardziej istotne w świecie mikroorganizmów, np. w biofilmach. Biofilmy mają grubość kilkudziesięciu mikrometrów w środowiskach oligotroficznych, podczas gdy grudki gleby, maty mikrobiologiczne, kłaczki osadu czynnego i biofilmy powstałe w środowiskach bogatych w związki pokarmowe są strukturami widocznymi gołym okiem. Organizacja przestrzenna w biofilmie umożliwia mikroorganizmom uzyskiwanie licznych korzyści metabolicznych, jak: kometabolizm, odżywianie krzyżowe, bardziej zróżnicowane populacje są mniej modyfikowane przez zmiany czynników środowiskowych. Ta sytuacja prowadzi do długoterminowej stabilizacji, mimo pewnych zmian czynników środowiskowych i dynamiki populacji wspólnot mikroorganizmów. Biofilm jest wspólnotą mikroorganizmów zanurzonym w polimerycznej organicznej matriks (macierzy), przytwierdzonym do powierzchni fazy stałej. Polimeryczna matriks składa się z różnych pozakomórkowych związków, tego typu jak glikoproteiny i polisacharydy, których skład chemiczny nie jest dostatecznie poznany. Polimeryczna matriks nazywana jako EPS (ang. extracellular polymeric substances) stanowi 50-95% suchej masy całego biofilmu i jest poprzecinana gęstą siecią kanałów, którymi dostają się substancje odżywcze i woda, oraz są odprowadzane produkty przemiany materii wspólnoty mikroorganizmów. Biofilmy są stosunkowo stabilnym siedliskiem dla licznych heterogennych wspólnot mikroorganizmów. Zabezpieczają jako bariera przed czynnikami fizycznymi takiego typu, jak: promieniowanie UV, ciepło, minimalizują jednocześnie wpływ czynników środowiskowych, jak: pH, substancje toksyczne, metale ciężkie, wszelkie bezpośrednio działające zanieczyszczenia. Nadto biofilmy chronią mikroorganizmy przed wysychaniem, szczególnie istotnym w środowiskach wodnych i glebach narażonych na okresowe wysuszenie. Chronią również przed bakteriami litycznymi, pasożytami i fagami oraz drapieżnikami. Mikroorganizmy biofilmów efektywnie wyłapują wszelkie organiczne i mineralne cząsteczki pokarmu.
Tworzenie biofilmów w środowisku odbywa się w pewnej sekwencji i przebiega nieco odmiennie od powstających na żywych tkankach, w których biorą udział dwa typy białek: lektyny i adhezyny. W biofilmach środowiskowych zachodzi niespecyficzna adhezja, związana z odmienną powierzchnią od powierzchni tkanek. Tworzenie biofilmu przebiega w czterech etapach: 1) transport, 2) adsorpcja cząsteczek, 3) adhezja mikroorganizmów i 4) kolonizacja powierzchni fazy stałej. Transport powoduje przesunięcia cząsteczek oraz mikroorganizmów na powierzchni, na której powstaje biofilm. Adsorpcja cząsteczek i ich akumulacja na powierzchni stałej są nazywane kondycjonowaniem biofilmu. Tempo wzrostu mikroorganizmów jest podtrzymywane przez substancję organiczną gromadzącą się w większej ilości na powierzchni fazy stałej. Adhezja komórek zachodzi znacznie wolniej niż pierwsze dwa procesy. Trzeba pamiętać, że bakterie ulegają dodatkowo ruchom Browna, co wymaga więcej czasu do połączenia się z powierzchnią tworzonego biofilmu, zależnego od właściwości powierzchni oraz fazy wzrostu bakterii. Wydzielanie EPS rozpoczyna się w końcowej fazie wzrostu logarytmicznego oraz w fazie stacjonarnej, która faworyzuje adhezję do powierzchni hydrofobowej. Wreszcie kolonizacja EPS jest ostatnim etapem powstawania biofilmu. Bakterie tworzące EPS dzielą się w rozwijającej się matriks, tworząc mikrokolonie. Szybkość kolonizacji zmienia się w czasie, dochodząc do równowagi układu w biofilmie w ciągu od kilku godzin do kilku miesięcy. Wyróżnia się dwa rodzaje biofilmów: 1) o składzie typowo heterotroficznym, co powoduje, że są aktywne różne szlaki metaboliczne, w których praktycznie każdy związek energetyczny jest metabolizowany, umożliwiając odzyskiwanie energii koniecznej do życia, oraz 2) biofilmy zawierające wszystkie grupy troficzne, w tym istotne dla jego funkcjonowania mikroorganizmy fototroficzne tlenowe i/lub beztlenowe, w zależności od ilości światła, zawartości tlenu w środowisku, temperatury oraz zasolenia. Maty mikrobiologiczne są powszechne w środowiskach zasolonych, alkalicznych na całej kuli ziemskiej, w tym na Antarktydzie. Maty mikrobiologiczne różnogatunkowe to takie, w których mikroorganizmy są ułożone warstwowo zgodnie z gradientem zawartości tlenu, promieniowania słonecznego oraz zawartości związków chemicznych odpowiednich dla poszczególnych grup mikroorganizmów.
Bakterie charakteryzują się ogromnymi możliwościami adaptacyjnymi (fizjologicznymi i genetycznymi), pozwalającymi im na 1) sprawne przystosowanie się do zmiennych warunków środowiska oraz 2) globalną i skoordynowaną regulację ważnych funkcji życiowych. Mechanizmem regulacji ekspresji genów z wykorzystaniem związków chemicznych w populacji bakterii, w odpowiedzi na zmiany liczby komórek (gęstości populacji) żyjących w określonej niszy ekologicznej, jest quorum sensing (dosłownie: "poczucie obecności"). Obok definicji quorum sensing można znaleźć pojęcie "bakteryjnego quorum", definiowane jako "dostateczna liczba drobnoustrojów do przeprowadzenia efektywniej określonych procesów". Mechanizm molekularny systemu quorum sensing obejmuje: 1) wytwarzanie przez komórki bakterii cząsteczek sygnałowych (autoinduktory), 2) akumulację tychże cząsteczek sygnałowych w środowisku wzrostu, 3) rozpoznawanie i łączenie się cząsteczek ze swoistymi receptorami białkowymi, będącymi sensorami bakteryjnymi, 4) globalną i skoordynowaną ekspresję genów docelowych kontrolujących ważne szlaki metaboliczne i procesy życiowe. Zdolność syntezy cząsteczek sygnałowych ma wiele gatunków zarówno z grupy bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich. System ten odgrywa istotną rolę w takich procesach życiowych, jak: bioluminescencja, biosynteza antybiotyków, wytwarzanie czynników wirulencji, przenoszenie plazmidów koniugacyjnych, różnicowanie biofilmów itd. Istnieją dwa główne systemy komunikacji międzybakteryjnej: 1) specyficzny dla bakterii Gram-ujemnych, w którym rolę cząsteczek sygnałowych odgrywają laktony acylohomoseryny (acyl-HSL), i 2) charakterystyczny dla bakterii Gram-dodatnich, w którym rolę autoinduktorów odgrywają oligopeptydy. Oprócz odmienności chemicznej cząsteczek sygnałowych quorum sensing, te dwa systemy odróżnia także mechanizm regulacji ekspresji genów w odpowiedzi na autoinduktory. Zarówno laktony acylohomoseryny, jak i oligopeptydy umożliwiają komunikację między komórkami bakterii tego samego gatunku czy szczepu. W ostatnich latach odkryto trzeci system komunikacji między komórkami Vibrio harveyi, który łączy cechy charakterystyczne zarówno dla bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Gatunek ten syntetyzuje i wykorzystuje do tego celu odmienną cząsteczkę sygnałową nazwaną AI-2, którą odkryto także u innych gatunków bakterii. Cząsteczka AI-2 powstaje w szlaku biosyntezy identycznym, niezależnie od szczepu, gatunku czy rodzaju bakterii, i ma taką samą budowę chemiczną. Substratem do syntezy AI-2 jest, podobnie jak dla acyl-HSL, S-adenozylometionina (SAM), która ulega licznym przemianom, począwszy od przeniesienia grupy metylowej przez metylotransferazę, co wiąże się z wytworzeniem S-adenozylohomocysteiny (SAH). Kolejnym krokiem tworzenia AI-2 jest odłączenie od SAH adeniny, w wyniku czego powstaje S-rybozylohomocysteina (SHR). SHR jest substratem dla białka LuxS, hydrolizującego SHR do homocysteiny (HC) i 4,5-dihydroksy-2,3-pentadionu (DPD), który ulega spontanicznej cyklizacji i po włączeniu atomu boru przyjmuje postać AI-2. Rola AI-2 w indukcji ekspresji genów jest oczywista - a już na pewno u kilku gatunków bakterii, jednak wiedza o komunikacji za jej pośrednictwem jest niepełna.
System quorum sensing został odkryty i opisany przez Nelson i Hastings z Uniwersytetu Harvarda w 1977 roku, na podstawie wyników badań zdolności do bioluminescencji morskiej bakterii Vibrio fischeri, które emitują światło tylko wtedy, gdy jako symbionty kolonizują wyspecjalizowane narządy Euprymna scopoles (gatunek kałamarnicy) oraz Monocentris japonicus (gatunek ryby głębinowej). Nelson i Hastings zauważyli, że w narządach tych organizmów bakterie szybko rosną i osiągają gęstość 1011 komórek/cm3, a wtedy cząsteczka sygnałowa występuje w dużej ilości. Zdolność do bioluminescencji jest związana z kompleksem enzymatycznym lucyferazy, który jest syntetyzowany w komórkach Vibrio fischeri pod kontrolą operonu lux-CDABE. Emisja światła zachodzi wówczas, gdy populacja bakterii w skolonizowanym narządzie osiąga odpowiednio dużą liczbę komórek, duże stężenie akumulowanych cząsteczek sygnałowych (wartość progowa), które umożliwi indukcję kompleksu lucyferazy. Pojęcie quorum sensing upowszechniło się w literaturze naukowej, kiedy zostało użyte przez Fuqua i wsp. (1994) do opisania sposobu komunikowania się komórek bakterii. Okazuje się, że większość gatunków bakterii, jeśli nie wszystkie, syntetyzuje specyficzne cząsteczki sygnałowe. Do najlepiej poznanych sposobów komunikowania się bakterii należą: z Gram-ujemnych - Vibrio fischeri, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium tumefaciens i Erwinia carotovora oraz z Gram-dodatnich - Staphylococcus aureus i Bacillus subtilis, a także hybrydowy system Vibrio harveyi i innych. Quorum sensing pozwala na skoordynowaną kontrolę wielu aktywności biologicznych bakterii. Umożliwia ustalenie właściwych stosunków zarówno wewnątrz populacji jednego gatunku, jak i wzajemne oddziaływania międzygatunkowe. Klasycznym przykładem tego systemu są biofilmy. Jednym z lepiej poznanych pod względem działania jest biofilm tworzony przez komórki Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia czy Staphylococcus aureus. Cząsteczki sygnałowe syntetyzowane i wydzielane do środowiska przez Staphylococcus aureus uległy tutaj większej specjalizacji do konkretnego szczepu S. aureus. Oznacza to, że cząsteczki sygnałowe wydzielane do środowiska przez jeden szczep nie tylko nie powodują indukcji ekspresji docelowych genów u innych szczepów S. aureus, lecz także skutecznie ją hamują. Tworzenie biofilmów przez szczepy S. aureus odbywa się na zasadzie "kto pierwszy ten lepszy", skolonizowanie gospodarza przez jeden szczep i wydzielenie szczepowo specyficznej cząsteczki sygnałowej uniemożliwia inwazję innego szczepu na tym samym gospodarzu.
1.3. Wpływ czynników fizykochemicznych na wspólnotę bakterii
Zrozumienie czynników, które mają istotny wpływ na stabilność funkcjonalną i strukturalną zasiedlających je bakterii w ekosystemach, jest od lat jednym z ważnych wyzwań mikrobiologów i ekologów środowiskowych. Wiedza o wpływie warunków na tę stabilizację jest niezbędna do określenia wpływu czynników zewnętrznych na mikroorganizmy i na środowisko. Definicja stabilności wspólnoty nie jest precyzyjna i jest najczęściej określana jako stabilność funkcji w ekosystemie i/lub składu wspólnoty mikroorganizmów. Wiele badań dotyczących wspólnoty bakterii jest skierowanych na zmiany ich populacji, kiedy cały ekosystem jest narażony na zakłócenia naturalne, tego typu jak zmiany sezonowe, lub zakłócenia sztuczne. Jednakże jednym z pytań, na które nie uzyskano odpowiedzi, jest - czy w niezakłóconym ekosystemie funkcjonalna stabilność pociąga za sobą stałość wspólnoty bakterii. Jak wynika z badań modelowych, funkcjonalna stabilność nie implikuje stabilności wspólnoty, a największe zmiany we wspólnocie mikroorganizmów są możliwe tylko w prostych ekosystemach. Obecność poszczególnych taksonów bakteryjnych we wspólnocie jest zależna zarówno od warunków środowiskowych, jak i od interakcji troficznych i pozatroficznych pomiędzy taksonami. Wspólnoty mikroorganizmów we wszystkich środowiskach naturalnych i sztucznych są narażone na działanie różnych czynników środowiskowych, prowadzących do zmiany warunków środowiska, odbiegających od stanu przed ich zadziałaniem. Przy każdej zmianie czynnika mikroorganizmy przeżywają stres, objawiający się ograniczeniem lub zaprzestaniem wzrostu i produkcji biomasy. Jedne z czynników działają destrukcyjnie, powodując śmierć mikroorganizmów lub części wspólnoty. Te dramatyczne zmiany to np. skutek wpływu czynnika chemicznego będącego skażeniem środowiska, ksenobiotyku stosowanego w ochronie roślin, pożarów powodujących sterylizację ekosystemu czy wreszcie samej sterylizacji. Stres jest definiowany jako czynnik abiotyczny lub zespół czynników, które ograniczają wzrost i produkcję biomasy.
Bakterie są poddawane różnorodnym warunkom stresowym. Są to: nagłe podwyższenie temperatury (stres cieplny), pojawienie się reaktywnych form tlenu (stres tlenowy), zmiany osmolarności (stres osmotyczny) czy nagłe zakwaszenie ich środowiska (stres kwasowy). Stres prowadzi do odpowiedzi adaptacyjnej komórki, eliminując go lub naprawiając uszkodzenia. Odpowiedź stresowa jest kontrolowana przez czynniki transkrypcyjne sigma - ?. Jednym z nich, biorącym udział w ekspresji genów, jest ?38, syntetyzowany w fazie wzrostu zarówno stacjonarnego, jak i wykładniczego, zwany też rpoS lub ?s, czy szoku cieplnego - związany z czynnikiem ?32 (rpoH), który pozwala na wydajną transkrypcję genów białek szoku cieplnego (HSP, ang. heat shock proteins). Jest ono głównym regulatorem odpowiedzi na różne warunki stresowe. Białka szoku termicznego tworzą filogenetycznie starą rodzinę białek o masach od 15 do 110 kDa. Należą do nich głównie białka opiekuńcze oraz proteazy. Białka opiekuńcze zapewniają uzyskanie prawidłowej konformacji tworzących się łańcuchów polipeptydowych, chronią inne białka przed denaturacją oraz umożliwiają renaturację białek, które uległy częściowej denaturacji. Rolą proteaz, jako białek stresowych, jest degradacja zdenaturowanych białek, których renaturacja nie jest możliwa, nawet w wyniku działania białek opiekuńczych. Tak więc przy przejściu komórek w fazę stacjonarną E. coli syntetyzuje 30 białek, które są regulowane przez czynnik sigma ?s (rpoS). W fazie stacjonarnej oraz w stadium głodu u E. coli lub Salmonella enterica var. Typhimurium są indukowane białka opiekuńcze (DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES), które wywołują oporność w komórkach bakterii na niekorzystne czynniki chemiczne i fizyczne oraz na proteazy (Lon). Bakteria morska Vibrio harveyi jest mezofilem i rośnie w temperaturze < 39°C. Przeniesienie hodowli tej bakterii z temperatury 30°C do temperatury 39°C powoduje syntezę dodatkowo co najmniej 10 białek, w tym białek szoku termicznego.
Stresem pokarmowym jest dla bakterii niedostateczna ilości składników odżywczych lub ich brak w środowisku. O większości wolno żyjących heterotrofach myśli się, że ich egzystencją jest "uczta" (ang. nutrient-excess conditions) lub "głód" (ang. starvation). Bakterie są czasami ani nie przekarmione, ani głodne. Ten trzeci stan jest opisywany jako permanentne niedożywienie (ang. hungry). Występuje ono w wielu środowiskach, w których stężenie substancji pokarmowych jest na poziomie stężenia mikromolarnego, i zabiega o nie wiele konkurujących ze sobą bakterii. W środowisku morskim, glebie czy w przewodzie pokarmowym stężenie substancji pokarmowych jak glukoza nie spada do absolutnego zera. W płytkim eutroficznym jeziorze stężenie cukru jest stabilne na poziomie około 1-48 nanomoli. Bakterie wolno rosnące, ze zdolnością do wyszukiwania substancji pokarmowych w małych stężeniach, w takim środowisku występują powszechnie. Jak pokazano na rycinie 1.2, przejście między "ucztą" i "głodem" w środowisku - stan niedożywienia bakterii jest powodowany przez jedną lub kilka grup istotnych substancji pokarmowych. W stanie niedożywienia bakterie muszą poszukiwać w środowisku substratów pokarmowych, a także indukują reakcje stymulujące ich przyjęcie. Ferenci (2001) proponuje zamiast terminów "limitacja pokarmowa" czy "czynniki ograniczające wzrost" używanie terminu "niedożywienie" do opisania stanu fizjologicznego bakterii, z kilku powodów: 1) "limitacja substratowa" jest myląco używana w kilku kontekstach, łącznie z przyrostem biomasy, w warunkach innych niż głód, 2) "limitacja substratowa" czy "wzrost limitowany substratowo" zawiera elementy zarówno niedożywienia, jak i głodu. "Limitacja substratowa" utrudnia zrozumienie procesu niedożywienia, gdyż bakterie mogą wykorzystywać tylko niektóre substraty, które niekoniecznie podtrzymują je przy życiu. Stężenia substancji odżywczych, które aktywują reakcje niedożywienia i głodu, są różne dla różnych organizmów.
Rycina 1.2 Niedożywienie jako powszechne zjawisko pomiędzy nadmiarem substancji odżywczych (uczta) a głodem. (Z: Ferenci T. 2001. Hungry bacteria - definition and properties of a nutritional state. Environ. Microbiol. 3: 605-611; dzięki uprzejmości i za zgodą wydawnictwa Wiley-Blackwell)
Dla każdej klasy substancji odżywczych istnieje odmienny stan głodowania (ryc. 1.2). Brak azotu wymaga całkowicie odmiennych odpowiedzi fizjologicznych i regulacyjnych niż w stosunku do limitacji fosforanów, glukozy czy innego źródła węgla. Nie ma uniwersalnego regulatora kontroli wszystkich odpowiedzi bakterii na niedożywienie. Limitacja azotem jest zupełnie czymś innym niż limitacja glukozą. Niedożywienie jest przedstawiane jako sytuacja, w której specyficzna szybkość wzrostu głodnego organizmu (?) nie osiąga wartości zerowej (głód), ani nie osiąga wartości szybkości maksymalnej, uzyskiwanej przy stężeniach substancji pokarmowych na poziomie wysycenia (?max), wyrażając się następującym równaniem ?max > ? ? 0. Klasyczne badania Monoda dotyczące wzrostu bakteryjnego dowodzą, że istnieje ścisła zależność między szybkością wzrostu a stężeniem substancji pokarmowych. Maksymalna szybkość wzrostu E. coli (?max) zostaje osiągnięta dopiero przy stężeniu glukozy < 0,3 mM, na co wskazuje spadek cAMP w hodowli. Przy stężeniu glukozy poniżej 0,3 mM bakterie są w stanie permanentnego niedożywienia (ryc. 1.3).
Rycina 1.3 Specyficzna szybkość wzrostu E. coli w podłożu z różnymi stężeniami glukozy oraz jednoczesne zmiany stężenia cAMP w komórkach i synteza RpoS. (Z: Ferenci T. 2001. Hungry bacteria - definition and properties of a nutritional state. Environ. Microbiol. 3: 605-611, zmien.; dzięki uprzejmości i za zgodą wydawnictwa Wiley-Blackwell)
Ogólnie mikroorganizmy są bardziej oporne na działanie czynników środowiskowych niż wyższe organizmy eukariotyczne. Wpływ danego czynnika zależy od jego składu chemicznego, zakresu i szybkości, z jaką następuje zmiana. Kiedy zmiana jest niewielka, wspólnota populacji mikroorganizmów może się przystosować do nowych czynników środowiskowych, zmiany przewlekłe mogą mieć wpływ względnie ograniczony. Mimo licznych adaptacji stres bakterii jest często wyrażony spadkiem bioróżnorodności, który zwykle bardziej dotyczy organizmów eukariotycznych niż prokariotycznych. W sytuacjach ekstremalnych wspólnota bakterii może być zredukowana do kilkudziesięciu, kilku lub do pojedynczego gatunku.
Z analizy wspólnoty bakterii występujących w próbach gleb wykorzystywanych rolniczo (Smit i wsp. 2001) wynika, że wśród 128 izolatów hodowalnych, należących do 38 gatunków, dominują bakterie Gram-dodatnie, jedynie nieliczne należą do Proteobacteria i Chlorobi. Wśród Gram-dodatnich dominują izolaty Micrococcus, Arthrobacter i Corynebacterium i sporadycznie gatunki Bacillus. W zależności od pory roku Actinobacteria stanowiły od 55 do 86% wszystkich bakterii hodowalnych. Dominantem we wszystkich próbach tych gleb był Arthrobacter oxydans. Analiza sekwencji 16S rRNA pozwoliła na wykrycie klonów z pięciu głównych typów: Acidobacteria, Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria i Chlorobi. Żaden z klonów nie należał do bakterii Gram-dodatnich. Skład wspólnoty bakterii gleb wykorzystywanych rolniczo jest znacznie mniej różnorodny niż w glebach nierolniczych. Można stwierdzić, że gleby rolnicze są mikrobiologicznie silnie zdegradowane i istnieją przesłanki, że wydajność biomasy z hektara gleb rolniczych będzie stale spadała. Takie zjawisko w skrajnej postaci obserwuje się np. w utrwalaniu żywności, gdy wszystkie zabiegi zmierzają do redukcji liczby mikroorganizmów potencjalnie powodujących jej psucie się. Jednakże czynnik silnie działający może spowodować selekcję mikroorganizmów wyspecjalizowanych, które zwykle minimalizują współzawodnictwo. W takich sytuacjach obserwuje się ogromną produktywność mikroorganizmów oraz następczą redukcję szybkości ich wzrostu. Wzrost dostępności pierwiastków biogennych powodujących wzbudzenie wzrostu populacji może spowodować redukcję bioróżnorodności, jak np. w czasie zakwitów glonów. Zjawisko to jest wynikiem działania konkurencji między populacjami o pierwiastki biogenne. W środowiskach naturalnych powrót do stanu poprzedniego po np. katastrofie ekologicznej jest związany z wtórną kolonizacją na danym obszarze. Mikroorganizmy przeżywające bezpośrednio po katastrofie, często sporulujące, są mikroflorą dominującą. Mikroflora ta zwykle pozostaje w stanie równowagi w czasie kolonizacji tego środowiska. Często pionierskimi kolonizatorami zdegradowanych środowisk są sinice. Proces powracania i zasiedlania, stabilizacji wspólnoty mikroorganizmów w tego typu środowiskach jest dość długi i nie zawsze do końca możliwy.
1.4. Struktura i bioróżnorodność populacji tworzących wspólnoty bakterii
Jednym z celów mikrobiologii środowiskowej jest zdefiniowanie struktury i różnorodności naturalnej wspólnoty mikroorganizmów (microbial community). Definiowanie to prowadzi się m.in., określając skład ilościowy i jakościowy populacji wchodzących w skład wspólnoty mikroorganizmów badanego ekosystemu, w szczególności oznaczając: 1) liczbę gatunków, 2) populacji dominujących, 3) gatunków pojawiających się i znikających, 4) sukcesję gatunków, 5) biomasę gatunku i na tle wszystkich gatunków, 6) typy troficzne oraz 7) skład pętli mikrobiologicznej, 8) wartość współczynnika grzyby saprofityczne/bakterie, w zależności od zawartości organicznego węgla glebowego (SOC). Stosując konwencjonalne techniki badawcze, prowadzi się identyfikację izolatów, tj. określa się ich morfologię oraz cechy fizjologiczno-biochemiczne. Zastosowanie technik konwencjonalnych jest jednak możliwe dla nie więcej niż 1-10% mikroorganizmów (tzw. hodowalne), a nawet znacznie mniej niż się wydaje. W tabeli 1.5 pokazano procentowy udział
Tabela 1.5 Taksony występujące w różnych ekosystemach lądowych i wodnych (w %) (tabela opracowana przez autora na podstawie literatury cytowanej niżej). Liczby przy ekosystemach oznaczają numery prac, z których wykorzystano wyniki badań
Takson
zbiornik wody pitnej (1)
Gleby
Wetlandy
Słodkowodne
Morskie
gleby orne (2)
trawy (3)
ryzosfera (4)
gleby nadrzeczne (5)
zielone tereny (6)
bagna (7)
jeziora (8)
osady (9)
ryzosfera (10)
wody (11)
osady (12)
przybrzeżne (13)
Acidobacteria
13,1
19
19,7
19
18
27,1
28,5
0-5
3-8
20,8
2
23
11,0
Actinobacteria
12,7
3
7,2
9,5
0-37
0-8
1,0
7,8
5
30,5
Cyanobacteria
2,6
2
0,7
3,6
0-35
2-6
1,0
36,2
36
4,5
Chloroflexi
3
3,2
1
10,0
3,6
0-7
0-3
14,6
12,5
5
Chlorobi
23,8
2-18
2-8
60,4
Bacteroidetes
18,4
15
5
3
8
4,8
0-2
4-10
2,1
Firmicutes
15
1,8
15,5
0-12
1-2
Flexibacteres
1-21
4-15
Gemmatimonadetes
3
2
1
0,7
0-23
4-8
Nitrospira
6,6
2,6
0-8
4-10
Planctomycetes
5,3
2
3
1,0
0-5
51-2
?-Proteobacteria
5,3
14
18,8
24
18
15,7
0-18
~2
?-Proteobacteria
28,9
8
10
19
16
7,2
0-5
3-4
?-Proteobacteria
3,9
3
8,1
9
1
5,5
0-3
?-Proteobacteria
5
2,3
3
2
6,8
Spirochaetes
1
1,3
Verrucomicrobia
2,6
9
7
3
OP10
1
TM6
1
Inne
15
3
6,8
Liczba klonów
76
400
2920
703
101
764
130
400
210
108
84
Bakterie należące do trzech typów są bardzo istotne w różnych środowiskach, są to: OP10, Acidobacteria oraz ?-Proteobacteria. Jak do tej pory typ OP10 zawiera 134 gatunki bakterii, Actinobacteria od 100 do 114 gatunków oraz klasa ?-Proteobacteria od 143 do 162 gatunków. W klasie ?-Proteobacteria jest 112-135 gatunków, a w Planctomycetes 125-144 gatunków bakterii. OP10 jest jednym z trzech szeroko rozprzestrzenionych filogenetycznie kandydatów w randze typu w środowisku. Po raz pierwszy został znaleziony w źródle gorącym Obsydian Pool w Yellowstone National Park. Sekwencje OP10 zostały znalezione w osadach morskich i jeziornych, na terenach geotermalnych, pod powierzchnią skał, w glebach, jamie ustnej człowieka, akwenach zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi. Na podstawie analizy sekwencji 16S rRNA ekosystemy lądowe i morskie różnią: Acidobacteria oraz SAR11, ten ostatni należący do ?-Proteobacteria, reprezentuje ponad 25% sekwencji 16S rRNA gatunków bakterii morskich. O ile klasa ?-Proteobacteria zawiera najwięcej sekwencji, o tyle duże ilości gatunków zawierają Firmicutes, Verrucomicrobia i Bacteroidetes. Trzy typy bakterii zawierają mniej niż 10% gatunków hodowalnych, sześć typów bakterii zawiera ponad 90% hodowalnych gatunków bakterii. W zależności od rodzaju analizy można pozyskać od 4 tys. do 10 mln genów w próbce gleby o masie od 10 do 30 g. Zdaniem Schloss i Hendelsman (2006) z badań molekularnych wynika, że w glebach stanów Alaska i Minnesota znajduje się odpowiednio 5 tys. i 2 tys. gatunków, a około 20% gatunków bakterii jest endemitami tych gleb.
Literatura dotycząca wspólnoty bakterii w ekosystemach: (1) Schmeisser C., Stockigt C., Raasch C. i wsp. 2003. Metagenome survey of biofilms in drinking-water networks. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7298-7309. (2) Liles M.R., Manske B.F., Bintrin S.B. i wsp. 2003. A census of rRNA genes and linked genomic sequences within a soil metagenomic library. Appl. Envinon. Microbiol. 69: 2684-2691. (3) Zhou J., Xi B., Huang H. i wsp. 2003. Bacterial phylogenetic diversity and a novel candidate division of two humid region sandy surface soils. Soil Biol. Biochem. 35: 915-924. (4) Chow M.L., Radomski C.C., McDermott J.M. i wsp. 2002. Molecular characterization of bacterial diversity in Lodgepole pine (Pinus contorta) rhizosphere soils from British Columbia forest soils differing in disturbance and geographic source. FEMS Microbiol. Ecol. 42: 347-357. (5) i (6) Hartman W.H., Richardson C.J., Vilgalysb R., Bruland G.L. 2008. Environmental and anthropogenic controls over bacterial communities in wetland soils. PNAS 105: 17 842-17 847. (7) Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E. i wsp. 2006. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog. Appl. Environ. Microbiol. 72: 2110-2117. (8) Eiler A., Bertilsson S. 2004. Composition of freshwater bacterial communities associated with cyanobacterial blooms in four Swedish lakes. Environ. Microbiol. 6: 1228-1243. (8) Horner-Devine M.C., Liebold M.A., Smith V.H., Bohannan J.M. 2003. Bacterial diversity patterns along a gradient of primary productivity. Ecol. Letters 6: 613-622. (9) Wobus A., Bleul C., Maassen S. i wsp. 2003. Microbial diversity and functional characterization of sediments from reservoirs of different trophic states. FEMS Microbiol. Ecol. 46: 331-347. (9) Spring S., Schulze R., Overman J., Schleifer K.H. 2000. Identification and characterization of ecologically significant prokaryotes in the sediment of freshwater lakes: molecular and cultivation studies. FEMS Microbiol. Rev. 24: 573-590. (10) Stout L.M., Nusslein K. 2005. Shifts in rhizoplane communities of aquatic plants after cadmium exposure. Appl. Environ. Microbiol. 71: 2484-2492. (11) i (12) Methe B.A., Hiorns W.D., Zehr J.P. 1998. Contrasts between marine and freshwater bacterial community composition: analyses of communities in Lake George and six other Adirondack lakes. Limnol. Oceanogr. 43: 368-374. (13) Crump B.C., Armbrust E.V., Baross J.A. 1999. Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia River, its estuary, and the adjacent coastal ocean. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3192-3204.
różnych taksonów w ekosystemach lądowych i wodnych. Zdaniem wielu badaczy taki stan jest wynikiem stosowania nieadekwatnych metod. W hodowlach wzbogaconych namnażają się głównie bakterie należące do kopiotrofów, a nie do oligotrofów. Jednak do pewnych celów wciąż stosuje się dawne metody badawcze, włącznie z posiewem na podłoże zestalone agarem. Techniki bezpośrednie analizy mikroorganizmów, bez ich hodowli, umożliwiają głębsze spojrzenie na strukturę wspólnoty bakterii w środowisku, włącznie z ilościowym i jakościowym określeniem ich składu oraz powinowactwa filogenetycznego. Techniki molekularne określające procentowy udział par G+C w DNA miały na celu określenie fenotypów bakterii (taksonomia fenotypowa). Wreszcie, wykorzystanie analizy sekwencji rybosomów (23S rRNA zawierającego około 2900 nukleotydów, 5S rRNA - około 120 nukleotydów i 16S rRNA - ponad 1500 nukleotydów) zmierzają do określenia składu populacji bakterii w dowolnym ekosystemie. Analizy składu frakcji kwasów tłuszczowych pozwalają na oszacowanie biomasy oraz identyfikację specyficznych grup mikroorganizmów. Techniki te wykazują jednak ograniczenia, gdyż z ich pomocą nie wykrywa się w środowisku taksonów poniżej pewnej ich liczebności, np. bakterii nitryfikacyjnych w ilości mniejszej niż 102 komórek w gramie próby.
Rycina 1.4 Zmiany współczynnika grzyby saprofityczne/bakterie, powodowane zmianą stężenia węgla organicznego (SOC) w dwóch typach gleb: (a) na plantacjach zbóż oraz (b) preriach. (Z: Allison V.J., Miller R.M., Jastrow J.D., Matamala R., Zak D.R. 2005. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci. Soc. Amer. J. 69: 1412-1421; dzięki uprzejmości i za zgodą Soil Science Society of America)
Wartości współczynnika grzyby saprofityczne/bakterie w zależności od ilości węgla organicznego glebowego są różne dla gleb wykorzystywanych rolniczo oraz gleb prerii (ryc. 1.4).
1.5. Funkcje populacji we wspólnocie bakterii (nisze ekologiczne)
Zdaniem pewnej grupy ekologów mikroorganizmów, a nie mikrobiologów, najważniejsze są badania związane z funkcjonowaniem wspólnoty bakterii (ang. bacterial community) w ekosystemach, nie zaś opisywanie dokładnej struktury mikroorganizmów. W zakres tych badań wchodzą takie zagadnienia, jak: udział grup troficznych mikroorganizmów w krążeniu pierwiastków w przyrodzie, szybkość przepływu pierwiastków biogennych i energii przez ekosystem, z uwzględnieniem takich parametrów, jak: produkcja pierwotna i wtórna, w tym produkcja pierwotna i wtórna różnych typów troficznych bakterii, tempo dekompozycji materii organicznej, dominacja szlaków metabolicznych w ekosystemie, wykorzystanie potencjalnych źródeł energii zarówno słonecznej, jak i zmagazynowanej w postaci organicznej lub nieorganicznej, wykorzystanie donorów oraz akceptorów elektronów, czy tworzenie produktów metabolicznych. Prowadzone badania z tzw. sztucznymi substratami w żadnym stopniu nie odzwierciedlają procesów zachodzących w warunkach rzeczywistych. Nie wiadomo, czy uzyskane wyniki przybliżają do rzeczywistości panującej w ekosystemie, czy wręcz oddalają. Zdaniem większości badaczy rekomendowane do badań są substraty naturalne znakowane pierwiastkami promieniotwórczymi, chociaż ich użycie jest ograniczone do inkubacji próbek izolowanych ze środowiska naturalnego.
1.6. Klasyfikacja bakterii środowiskowych na podstawie szybkości wzrostu
Na podstawie preferencji pokarmowych bakterii glebowych w 1924 roku S. Winogradsky dokonał ich podziału na autochtony i zymogeny. Autochtony (bakterie tubylcze) występują w glebie zawsze i powszechnie, charakteryzują się powolnym wzrostem i są zdolne do rozkładu trudno rozkładalnej polimerycznej materii organicznej (substancje humusowe). Autochtony są wyposażone w różne mechanizmy adaptacyjne, umożliwiające im przeżycie w warunkach skrajnie niskiego poziomu substancji pokarmowych. Przeciwnie, zymogeny charakteryzują się szybkim wzrostem w obecności dużej ilości substancji pokarmowych łatwo degradowalnych, zwykle wprowadzanych uprzednio do środowiska ich życia. Po ich wyczerpaniu zymogeny przechodzą w fazę nieaktywną, przy czym większość z nich w fazie tej ginie. Podział Winogradskiego nie uwzględnia jednak bakterii, które nie są obligatoryjnymi autochtonami i w środowisku bogatym w związki organiczne zachowują się jak zymogeny. Oprócz wspomnianych wyżej dwóch terminów, pojawiło się pojęcie allochtonów jako antonim autochtonów. Dotyczy ono takiej grupy bakterii, które nie zajmują w środowisku glebowym odpowiednich nisz i są z niego szybko eliminowane.
Wprowadzone w 1983 roku do mikrobiologii wody określenia: oligotrofy i kopiotrofy są terminami stosowanymi do charakterystyki hodowli jednogatunkowych prowadzonych w warunkach laboratoryjnych. Oligotrofy to mikroorganizmy zdolne do życia w środowisku ekstremalnie ubogim w związki organiczne (od 1 do 15 mg rozpuszczalnego węgla/l). Kopiotrofy zaś rosną i namnażają się obficie w środowiskach bogatych w związki organiczne (ok. 1000 mg rozpuszczalnego C-org./litr). Kopiotrofy są bakteriami szybko rosnącymi i w przeciwieństwie do oligotrofów rosną także na podłożach ubogich w związki organiczne. Oligotrofy rosną tylko na podłożach ubogich, zawierających niewielkie ilości związków organicznych. Liczne gatunki kopiotrofów rosną w środowiskach oligotroficznych i są tak silnie do nich przystosowane, że wymagają następczej stopniowej adaptacji do wzrostu na podłożach bogatych. W tabeli 1.6 przedstawiono charakterystykę oligotrofów i kopiotrofów.
Tabela 1.6 Ekologiczne atrybuty korespondujące z grupami bakterii należącymi do kopiotrofów i oligotrofów. (Z: Fierer N., Bradford M.A., Jackson R.B. 2007. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology 88: 1354-1364; dzięki uprzejmości i za zgodą Ecological Society of America)
Cecha
Kopiotrofy
Oligotrofy
Specyficzna maksymalna szybkość wzrostu (?max)
wysoka maksymalna szybkość wzrostu przy braku limitacji substratowej, wysoka wartość Ks
niska specyficzna szybkość wzrostu, niskie wartości Ks
Plon komórkowy(Yx/s)
niskie Yx/s; niskowydajna konwersja substratu do biomasy bakterii
wysokie Yx/s; wysoka biomasa na jednostkę substratu, efektywne wykorzystanie substratu
Zapotrzebowanie na substrat (Smin)
wysokie wartości Smin, tempo dostarczania substratu musi być dostatecznie wysokie do utrzymania zdolności do życia
niskie wartości Smin, komórki pozostają żywe mimo limitacji substratowej
System pobierający substrat
niskie specyficzne powinowactwo komórek do substratu (aA lub stosunek ?max : Ks)
wysokie specyficzne powinowactwo (aA), wysoka zdolność do jednoczesnego wykorzystywania substratów mieszanych
Wrażliwość na dodatkowy substrat
krótka faza lag po dodaniu świeżego substratu, wiele enzymów jest produkowanych konstytutywnie
stosunkowo długa faza lag, zanim tempo wzrostu na świeżym substracie jest wysokie, wiele enzymów jest indukowanych substratem
Czasowe zmienności w wielkości populacji
wysoka, szybkie tempo fluktuacji populacji, krótki średni czas generacji
niska, tempo fluktuacji jest niskie, długi czas generacji
Łatwość hodowli
wysoka, rosną dobrze na podłożach bogatych, kolonie rosną szybko mimo krótkiej inkubacji
niska, widoczne kolonie pojawiają się powoli, dobrze je izolować na podłożu ubogim
Chemia i morfologia komórek
niski stosunek C : N i C : P związany z dużą zawartością białek i kwasów nukleinowych, komórki sferyczne z niskim stosunkiem powierzchni do objętości
komórki wydłużone lub nitkowate, z wysokim stosunkiem powierzchni do objętości, wysoka zdolność gromadzenia substancji zapasowych w komórkach
Ks - stała nasycenia substratem; Yx/s - wydajność wzrostu; aA - specyficzne powinowactwo do substratu, ?max - maksymalna specyficzna szybkość wzrostu.
Terminy: "strategia-r" i "strategia-K" przyjęte z makroekologii, stosowane w ekologii teoretycznej przez Oduma (1969), również wyróżniają dwie grupy bakterii. Pojedyncze organizmy w środowisku mogą wykazywać zarówno strategie-r, jak i strategie-K. Na przykład populacja mikroorganizmów może wykazywać wzrost dwufazowy, w odpowiedzi na zakłócenia środowiskowe, wykazując charakterystykę gatunku o strategii-r w pierwszym etapie, a strategię-K w następnym. Tej samej populacji bakterii mogą dotyczyć również sezonowe zmiany strategii-r i -K. Mikroorganizmy o strategii-K mogą zawierać się w definicji autochtony, a w strategii-r - zymogeny. Termin "strategia-K" jest synonimem pojęć autochtona i oligotrofa, podczas gdy termin "strategia-r" jest synonimem pojęć kopiotrofy i zymogeny. Użycie odpowiednich określeń jest zależne od obszaru badań aktywności mikroorganizmów. Sugeruje się, że jeśli badania prowadzi się in situ, w naturalnych glebach i na naturalnych substratach pokarmowych (humus, obornik, zielony nawóz, stałe pozostałości), powinna być stosowana para nazw autochtony i zymogeny. Do opisu eksperymentów laboratoryjnych na podłożach z określonymi substratami, dodawanymi w odpowiednich stężeniach lub ich kombinacjach, jest rekomendowana para terminów "oligotrof" i "kopiotrof". Jeśli w środowisku znajdują się czynniki powodujące stresy (nieoptymalne warunki, redukcja aktywności metabolicznej lub sukcesja), do opisu powinno się stosować terminy: "strategia-r" i "strategia-K".
Powstaje pytanie: dlaczego pewne grupy bakterii występują w glebach w dużych ilościach? Odpowiedź jest możliwa po analizie ilościowego występowania głównych typów bakterii, z jednoczesną charakterystyką czynników abiotycznych i biotycznych. Ogólnie mikroorganizmy o strategii-r charakteryzują się maksymalną szybkością wzrostu, kiedy pokarm występuje obficie, podczas gdy mikroorganizmy o strategii-K przeżywają w środowiskach o niewystarczającej ilości substratu. Mikrobiolodzy do charakterystyki bakterii częściej używają pojęć "kopiotrof" i "oligotrof", odpowiednio do tych cech typowych dla strategii-r i -K (Fierer i wsp. 2007). Kopiotrofy preferują wykorzystanie substancji łatwo strawialnych i wykazują znacznie wyższą szybkość wzrostu, kiedy ilość substancji organicznych jest wystarczająca. Przeciwnie, oligotrofy wykazują znacznie wolniejszy wzrost oraz charakteryzują się znacznie wyższym powinowactwem produkowanych przez nie enzymów do substratów. Tak więc w zależności od ilości materii organicznej, w tym łatwo dostępnej, w glebach obserwuje się odmienny udział populacji należących do kopiotrofów i oligotrofów. W glebach bogatych w substancje organiczne będą dominowały populacje kopiotrofów, w ubogich zaś - oligotrofy.
Fierer i wsp. (2007) dokonali analizy ilościowego występowania populacji należących do dominujących typów bakterii w 71 niepowtarzalnych próbach pobranych z różnych gleb i ekosystemów Ameryki Północnej. Autorzy określali ilościowo bakterie należące do pięciu typów bakterii dominujących w glebach, tj.: Acidobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria (?-Proteobacteria i ?-Proteobacteria), oraz oznaczali tempo mineralizacji węgla organicznego w tych próbach. Uzyskane wyniki sugerują, że dominujące typy bakterii można podzielić na dwie kategorie ekologiczne, korespondujące z populacjami kopiotrofów i oligotrofów. Bakterie należące do typu Acidobacteria występują w dużej liczbie w glebach ubogich w łatwo dostępne związki organiczne oraz we względnej liczbie w glebach o dużej zawartości materii organicznej (ryc. 1.5).
W przeciwieństwie do oligotroficznych Acidobacteria, cechy kopiotrofów wykazują ?-Proteobacteria i Bacteroidetes. Potwierdzeniem tego są obserwacje świadczące, że gatunki Proteobacteria są w największej liczbie klonów w ryzosferze, w porównaniu z liczbą klonów należących do Acidobacteria, tj. odwrotnie niż w glebach ubogich (tab. 1.7). Wyniki te nie sugerują jednak, że wszystkie klony należące do Acidobacteria, Proteobacteria i Bacteroidetes są dokładnie kopiotrofami lub oligotrofami. Przykładem mogą być dominanty utleniające jony amonowe, należące do ?-Proteobacteria. Z drugiej strony wiadomo, że ?-Proteobacteria i Bacteroidetes powszechnie wykazują dużą aktywność w środowiskach, do których dopływają związki organiczne. Wyniki tych badań sugerują, że pewnym typom bakterii mogą być przypisane kategorie troficzne: kopiotrofów i oligotrofów, korespondujących odpowiednio z bakteriami strategii-r i -K. Jednakże nie wszystkie typy bakterii dominujących w glebach są przyporządkowane kategorii kopiotrof-oligotrof w relacji z testem tempa zużycia materii organicznej. Są to jedna klasa i dwa typy bakterii: ?-Proteobacteria, Firmicutes i Actinobacteria, które współdominują w glebach. Zdaniem autorów istnieją prawdopodobnie inne lub dodatkowe czynniki, które sprawiają, że Actinobacteria, ?-Proteobacteria i Firmicutes występują obficie w glebach. Specyficzną szybkość wzrostu dominujących taksonów bakterii, w tym trzech klas należących do typu Proteobacteria oraz typu Bacteroidetes występujących w ekosystemach wodnych, przedstawiono w tabeli 1.8.
Rycina 1.5 Zależności między tempem mineralizacji węgla organicznego a typem bakterii. (Z: Fierer N., Bradford M.A., Jackson R.B. 2007. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology 88: 1354-1364; dzięki uprzejmości i za zgodą Ecological Society of America)
Tabela 1.7 Częstość (w %) występowania klonów wybranych typów bakterii w ryzosferze i glebie kontrolnej. (Z: Fierer N., Bradford M.A., Jackson R.B. 2007. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology 88: 1354-1364; dzięki uprzejmości i za zgodą Ecological Society of America)
Typ bakterii
Ryzosfera
Gleba kontrolna
Proteobacteria
?-Proteobacteria
27,5
19
?-Proteobacteria
15
9
?-Proteobacteria
15
6,5
?-Proteobacteria
2
2,5
Acidobacteria
12,5
17
Actinobacteria
4
8
Firmicutes
1
3,5
Bacteroidetes
5
5
Planctomycetes
1
2,5
Verrucomicrobia
2,5
6,5
Inne
3,5
7,5
Niesklasyfikowane
11,5
12,5
Tabela 1.8 Specyficzna szybkość wzrostu bakterii w ekosystemach wodnych należących do różnych taksonów
Ekosystem wodny
Specyficzna szybkość wzrostu głównych grup bakterii w ekosystemach wodnych (? doba-1)
ogólna (dla wspólnoty)
Eubacteria
Alfa-Proteobacteria
Beta-Proteobacteria
Gamma-Proteobacteria
Bacteroidetes
Literatura
Jeziora
1,1
0,9
1,4
1,7
1,3
2,7
Jürgens i wsp. (1990)
Estuaria
zasolenie 0,1%
1,7-3,0
1,7-3,2
3,2-6,1
2,9-3,8
0,0-3,8
1,0-5,1
Yokokawa i wsp. (2004)
zasolenie 26,5%
0,4-3,5
0,2-4,1
0,0-5,5
0,0-2,1
1,3-4,3
1,1-2,5
temp. 14°C
2,3
3,2
2,6
0,0
4,0
1,4
Fuchs i wsp. (2000)
temp. 24°C
2,3
2,8
3,9
0,0
4,6
2,3
Ocean
0,5
1,0
1,0
1,1
0,5
Eilers i wsp. (2000)
0,6
1,9
1,1
-
0,5
-
1,8 2,5-2,9
0,9
-
Beardaley i wsp. (2003)
Stwierdzono pewną ogólną ekologiczną zależność dla gleb wykorzystywanych rolniczo, tj. że stosunek liczebności Proteobacteria i Acidobacteria wyznacza status pokarmowy gleb jako ekosystemów ubogich lub bogatych w substancje pokarmowe. Tak więc, jeśli wyliczony stosunek wynosi 0,16, to gleby należą do oligotroficznych, 0,34 to gleby, do których dostarczana jest niewielka ilość materii organicznej, 0,46 również określa gleby, które zawierają niewielką ilość substancji pokarmowych, a 0,87 opisuje gleby rolnicze, do których dostarczane są duże ilości substancji pokarmowych.
1.7. Klasyfikacja i identyfikacja bakterii
Z zastosowaniem analizy sekwencji nukleotydów 16S rRNA wykazano, że świat organizmów dzieli się na trzy domeny: Bacteria, Archaea oraz Eukarya. W domenie Bacteria opisano do tej pory przedstawicieli trzydziestu typów bakterii hodowalnych i ponad dziewięćdziesiąt filotypów bakterii niehodowalnych (tab. 1.9). Klasa ?-Proteobacteria jest reprezentowana przez jeden gatunek Mariprofundus ferrooxydans (Siderooxidans marinum), chemolitotrof utleniający w warunkach tlenowych jony Fe(II) w oceanach na dużych głębokościach. Jest to gatunek bardzo charakterystyczny, ponieważ tworzy na zewnątrz komórki nóżkę z żelaza (ang. stalk). Po raz pierwszy izolowany z głębin oceanicznych w okolicach Hawajów.
Tabela 1.9 Typy bakterii oraz archeonów hodowalnych dotychczas opisanych. (Z: Bone D.R., Castenholz R.W., Garrity G.M. 2001. Bergey's manual of systematic bacteriology. The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria. Volume one, 2nd ed., Springer; dzięki uprzejmości i za zgodą J.W. Browna, Department of Microbiology, NC State University, Raleigh, NC 27695 USA)
Typ/klasa
liczba
taksony reprezentatywne (rodzaje)
gatunków (6 939)
klonów (137 352)
Domena Bacteria
Acidobacteria
7
2 566
Acidobacterium, Edaphobacter, Geothrix, Holophaga, Terriglobus
Actinobacteria
1 646
7 798
Acidimicrobium, Actinomyces, Agromyces, Arthrobacter, Bifidobacterium, Brevibacterium, Celulomonas, Frankia, Gordonia, Kineococcus, Micrococcus, Mycobacterium, Micromonospora, Nocardia, Polymonospora, Rhodococcus
Aquificae
29
668
Aquifex, Desulfurobacterium, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Thermovibrio
Bacteroidetes
355
22 959
Bacteroides, Cytophaga, Flavobacterium, Flexibacter, Polaribacter, Psychroflexus, Psychroserpens, Sporocytophaga, Sphingobacterium
Chlamydiae
16
228
Chlamydia, Chlamydiophila, Neochlamydia, Parachlamydia
Chlorobi
21
95
Ancalochloris, Chlorobium, Chlorobaculum, Pelodyction, Prosthecochloris
Chloroflexi
19
1 603
Chloroflexus, Chloronema, Heliothrix, Herpetosiphon, Roseiflexus
Chrysiogenetes
1
4
Chrysiogenes (C. arsenatis)
Cyanobacteria
82
2 130
Anabaena, Nostoc, Synechococcus, Trichodesmium
Dehalococcoides
1
57
D. ethenogenes
Deferribacteres
10
19
Caldithrix, Deferribacter, Flexistipes, Geovibrio
Deinococcus-Thermus
62
257
Deinobacter, Deinococcus, Marinithermus, Meiothermus, Oceanithermus, Thermus, Truepera, Vulcanithermus
Dictyoglomi
2
16
Dictyoglomus
Fibrobacteres
3
20
Fibrobacter
Firmicutes
2 151
54 075
Bacillus, Clostridium, Desufotomaculum, Enterococcus, Lactobacillus, Listeria, Leuconostoc, Peptostreptococcus, Sarcina, Sporomusa, Sporosarcina, Streptococcus, Staphylococcus, Syntrophomonas
Fusobacteria
36
513
Fusobacterium, Leptotrichia, Propionigenium
Gemmatimonadetes
1
323
Gemmatimonas (G. aurantiaca)
Lenthisphaere
2
66
Lenthisphaera (L. araneosa), Victivallis
Nitrospira
9
461
Leptospirillum, Nitrospira, Thermodesulfovibrio
Planctomycetes
14
1 674
Gemmata, Isosphaera, Pirelula, Planctomyces
Poribacteria
1
1
niehodowalny symbiont morskich gąbek Porifera
Proteobacteria
?-Proteobacteria
?-Proteobacteria
?-Proteobacteria
?-Proteobacteria
?-Proteobacteria
?-Proteobacteria
533
283
1 006
197
67
1
38 046
Acetobacter, Caulobacter, Erythrobacter, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Methylobacterium, Nitrobacter, Ochrobactrum, Polaromonas, Rhizobium, Rickettsia, Rhodobacter, Roseobacter, Sphingomonas, Sphyngopyxis
Azoarcus, Alcaligenes, Aquabacterium, Burkholderia, Commamonas, Galionella, Methylophilus, Nitrosomonas, Polaromonas, Polynucleobacter, Ralstonia, Rhodoferax, Sphaerotilus, Thauera, Thiobacillus, Variovorax
Aeromonas, Alteromonas, Beggiatoa, Chromatium, Citrobacter, Colwellia, Ectothiorhodospira, Escherichia, Halomonas, Moritella, Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Psychromonas, Shewanella, Thiomargarita, Thiocystis, Thiocapsa
Desulfobacterium, Desulfovibrio, Desulfuromonas, Geobacter, Myxococcus, Nitrospina, Syntrophus, Syntrophobacter, Syntrophorhabdus, Trichlorobacter
Campylobacter, Helicobacter, Hydrogenimonas, Nitrotiruptor, Thiovulum
Mariprofundus (M. ferrooxydans)
Spirichaetes
110
1 399
Borellia, Leptospira, Spirochaeta, Treponema
Synergistetes
Tenericutes
4
199
28
Cloacibacillus, Synergistes
Anaeroplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma
Thermodesulfobacteria
Thermomicrobia
6
2
67
Thermodesulfobacterium, Thermodesulfatator
Thermomicrobium (T. roseum, T. fosteri)
Thermotogae
31
76
Geotoga, Marinitoga, Petrotoga, Thermotoga
Verrucomicrobia
32
2 203
Chthonibacter, Prosthecobacter, Roseibacillus, Verrucomicrobium
Domena Archaea
Crenarchaeota
Euryarchaeota
Nanoarchaeota
Korarchaeota
Acidianus, Hyperthermus, Pyrodictium, Sulfolobus, Thermoproteus
Archeoglobus, Ferroglobus, Ferroplasma, Halobacterium
Nanoarchaeum equitans
Niehodowalne
Identyfikacja bakterii jest oparta na następujących badaniach i cechach: 1) obserwacje morfologiczne (kształt i wielkość komórki, ruchliwość, typ urzęsienia, materiały zapasowe, spory i ich ułożenie w komórce, barwienie Grama, kształt i kolor kolonii, tworzenie ciał owocowych lub grzybni powietrznej, jak w przypadku Actinobacteria; 2) cechy fizjologiczne (temperatura, pH oraz tolerancja na zasolenie), cechy biochemiczne (wykorzystywane źródła węgla i azotu, utlenienie węglowodanów, fermentacja węglowodanów, oporność lub wrażliwość na antybiotyki, barwniki, wzrost na podłożach selektywnych i różnicujących); 3) testy serologiczne (dla szczepów będących potencjalnymi patogenami), wśród których najczęściej stosuje się testy aglutynacji lateksowej, immunofluorescencji bezpośredniej lub testy immunoenzymatyczne, jak np. test ELISA; 4) skład chemiczny komórek (kwasy tłuszczowe, lipidy polarne, kwasy mikolowe, lipopolisacharydy, aminokwasy ściany komórkowej, cukry w ścianie komórkowej, pigmenty komórkowe, chinony wchodzące w skład łańcucha oddechowego oraz poliaminy i białka komórkowe) - metody biofizyczne obejmujące techniki elektroforetyczne oraz techniki oparte na chromatografii gazowej (zastosowanie systemu AMBIS, opracowanego przez amerykańską firmę Ambit Microbiology); 5) cechy genotypowe (procentowa zawartość molowa par zasad G+C w DNA chromosomów, polimorfizm DNA, elektroforetyczny rozkład fragmentów DNA po trawieniu enzymami restrykcyjnymi, próby DNA), cechy filogenetyczne (hybrydyzacja DNA:DNA, hybrydyzacja DNA:rRNA, sekwencje 5S rRNA, sekwencje 16S rRNA, sekwencje 23S rRNA, sekwencje podjednostki ? syntazy ATP, sekwencje białka chaperonowego GroEL). W celu przeprowadzenia charakterystyki biochemiczno-fizjologicznej wykonuje się następujące testy: produkcji indolu, utleniania i fermentacji glukozy, obecności oksydazy cytochromowej, katalazy, aminopeptydazy oraz wykorzystywania różnych substratów jako źródeł węgla i energii.
Pewne testy są produkowane i dostępne w postaci systemów identyfikacyjnych: system API francuskiej firmy bioMeriéux SA, kity BBL Crystal RS/E i E/NF amerykańskiej firmy Becton Dickinson Microbiological Systems, Enterotube II oraz Oxi-Ferm Tube amerykańskiej firmy Becton Dickinson Microbiological Systems, Pasco MIC/ID system amerykańskiej firmy Difco Laboratories, system PhenePlate szwedzkiej firmy BioSys nova, system BBL Minitek amerykańskiej firmy Becton Dickinson Microbiological Systems, system Vitek amerykańskiej firmy bioMeriéux Vitek, system MicroID amerykańskiej firmy General Diagnostic, system Sensititre amerykańskiej firmy Radiometer America, system Biolog amerykańskiej firmy Biolog. Niektóre z nich są zautomatyzowane i skomputeryzowane, np. BIOLOG?, API, ATB. Zautomatyzowany system BIOLOG umożliwia identyfikację bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych z zastosowaniem dwóch różnych rodzajów płytek: GP-plates (dla bakterii Gram-dodatnich) i GN-plates (dla bakterii Gram-ujemnych). Systemy te są łatwe do stosowania i umożliwiają otrzymanie wyników w stosunkowo krótkim czasie, co ma duże znaczenie szczególnie w badaniach klinicznych. Do charakterystyki bakterii jest bardzo przydatna obecność wytwarzanych przez nie enzymów. Sugeruje się wykorzystywanie substratów fluorogenicznych, np. 4-MU (pochodne kumaryny 4-metylolumbeliferonu), 7-AMC (7-amino-4-metylokumaryna) oraz chromogeny, takie jak: p-nitroanilina, estry o- i p-nitrofenolu oraz estry 5-bromo-4-chloro-3-indolilu. Z zastosowaniem testów uzyskuje się charakterystykę fizjologiczno-biochemiczną badanych szczepów, które mogą posłużyć do wykorzystania taksonomii numerycznej zaproponowanej przez Sneath i Sokal w 1973 roku. W procedurze tej porównuje się dużą liczbę cech fenotypowych różnych szczepów bakterii, wyliczając współczynniki Ssm (ang. simple matching coefficient) oraz SJ (ang. Jaccard coefficient). Taksonomię numeryczną wykorzystuje się głównie w badaniach klinicznych oraz testach sanitarnych żywności.
Chemotaksonomia. Analiza chemiczna jest pomocna, ale nie może być stosowana jako jedyna metoda do identyfikacji i klasyfikacji bakterii. Analizie poddaje się kwasy tłuszczowe, poliaminy, aminokwasy zasadowe, chinony łańcucha oddechowego, cukry występujące w otoczkach komórkowych, materiały zapasowe gromadzone przez komórki itd.
Kwasy tłuszczowe. Do klasyfikacji i identyfikacji bakterii powszechnie stosuje się analizę ilościową i jakościową kwasów tłuszczowych obecnych w błonach cytoplazmatycznych jako składniki fosfolipidów i lipopolisacharydów błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych oraz kwasów lipotejchowych u bakterii Gram-dodatnich. Istotą tej metody jest badanie różnic strukturalnych, ilościowych i jakościowych, kwasów tłuszczowych, których skład, przy zachowaniu kontrolnych warunków hodowli, jest charakterystyczny dla danego gatunku mikroorganizmu. System oparty na tej metodzie to Microbial Identification System (MIS). Analizie poddaje się liczbę atomów węgla w kwasach tłuszczowych (od 8 do 20 atomów), obecność nasyconych (8:0-20:0) i nienasyconych kwasów tłuszczowych (15:1, 17:1), występowanie kwasów w formie izo- lub antyizo-rozgałęzionych (16:1 cis 9 lub 16:1 trans 9, np. kwas cis-9-heksadekanowy lub kwas trans-9-heksadekanowy) i kwasów tłuszczowych metylowanych wewnątrz cząsteczki (15:0 izo- i 15:0 antyizo-, np. 13-metylotetradekanowy i 12-metylotetradekanowy), obecność cyklopropanowych kwasów tłuszczowych (c17:0 cyklo 9-10, c19:0 cyklo 9-10, np. kwas cis-9,10-metylenoheksadekanowy) i hydroksykwasów zawierających grupę -OH (np. 16:0-2OH, 16:0-3OH kwas 2 i 3-hydroksypalmitynowy) (tab. 1.10).
Poliaminy bakteryjne. Poliaminy są składnikami komórek wielu gatunków bakterii, w niewielkich jednak ilościach występują w komórkach bakterii żyjących w skrajnie zasolonych środowiskach. Tabela 1.11 prezentuje naturalne poliaminy występujące w komórkach wielu gatunków bakterii i archeonów. Związki te są dobrymi markerami do identyfikacji gatunków należących do domeny Archaea. Pomocne są także w chemoklasyfikacji bakterii Gram-ujemnych należących do typu Proteobacteria. Ogólnie u gatunków należących do klasy ?-Proteobacteria dominują triaminy (spermidyna lub homospermidyna). W klasie ?-Proteobacteria występuje putrescyna i 2-hydroksyputrescyna. Te dwie poliaminy występują także u dwóch gatunków typu Bacteroidetes. W klasie ?-Proteobacteria
Tabela 1.10 Profile kwasów tłuszczowych (zawartość w procentach u gatunków z rodzaju Maribacter. (Z: Nedashkovskaya O.I., Kim S.B., Jan S.K. i wsp. 2004. Maribacter gen. nov., a new member of the family Flavobacteriaceae, isolated from marine habitats, containing the species Maribacter sedimenticola sp. nov., Maribacter aquivivus sp. nov., Maribacter orientalis sp. nov., and Maribacter ulvicola sp. nov. Intern. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1017-1023; dzięki uprzejmości i za zgodą Society for General Microbiology, UK)
Kwas tłuszczowy
Maribacter
M. sedimenticola
M. aquivivus
M. orientalis
M. ulvicola
C13:1
0,7
1,1
1,1
0,3
C14:0
0,5
1,0
0,9
0,5
C14:1?5
1,0
0,9
i-C15:0
20,5
12,3
13,6
10,6
a-C15:0
1,2
1,3
1,9
2,3
i-C15:1
16,9
13,6
18,9
10,1
C15:0
6,3
14,5
8,1
12,3
C15:1?6c
1,7
4,8
1,6
2,5
i-C16:0
1,1
0,7
0,3
0,3
C16:0
1,0
0,5
1,0
1,2
C16:1?7/i-C15:o2-OH
5,8
12,9
12,2
11,4
i-C17:1?5c
1,4
1,2
i-C17:1?9c
2,3
2,2
2,2
4,0
C17:1?6c
0,5
1,7
0,5
1,3
i-C15:03-OH
5,4
2,3
4,1
2,9
C15:03-OH
2,4
2,3
1,5
1,5
i-C16:03-OH
1,7
2,5
1,7
2,1
C16:03-OH
2,2
2,9
3,7
3,0
i-C17:03-OH
20,4
11,6
14,5
18,8
i-C15:1
2,4
Nieznane
7,9
10,2
10,3
5,9
u gatunków należących do Enterobacteriaceae występuje diaminopropan oraz putrescyna, w rodzaju zaś Vibrio triamina - norspermidyna. Spermidyna występuje w komórkach należących do rodzajów: Xanthomonas, Frateuria, Halomonas, Deleya i Oceanospirillum. Kadaweryna i spermidyna dominują w komórkach Stenotrophomonas. Gatunki Pseudomonas zawierają znaczne ilości putrescyny, spermidyny i w małych stężeniach kadawerynę. Należy raz jeszcze podkreślić, że analiza poliamin jest niewystarczająca do klasyfikacji bakterii.
Aminokwasy zasadowe. Aminokwasy zasadowe są istotnymi składnikami peptydoglikanu bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, występując zwykle na trzeciej pozycji łańcucha peptydowego. W skład peptydoglikanu Gram-ujemnych bakterii należących do Proteobacteria i Bacteroidetes wchodzi kwas m-diaminopimelinowy, u bakterii Gram-dodatnich występują różne aminokwasy: ornityna, walina, kwas aminopimelinowy oraz kwas diaminomasłowy lub kwas diaminopimelinowy. Przykładem takiej różnorodności aminokwasów mogą być bakterie należące do Actinobacteria. Tak więc u gatunków Arthrobacter i Microbacterium w ścianie komórkowej występuje l-lizyna, Aureobacterium i Curtobacterium d-ornityna, u Brevibacterium, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium, Nocardioides, Rhodococcus kwas m-diaminopimelinowy, u gatunków Clavibacter i Rathayibacter zaś - kwas l-diaminomasłowy.
Tabela 1.11 Naturalne poliaminy występujące w komórkach bakterii i archeonów. (Z: Busse H.J., Denner E.B.M., Lubitz W. 1996. Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics. J. Biotechnol. 47: 3-38; dzięki uprzejmości i za zgodą Elsevier)
Wzór chemiczny
Nazwa zwyczajowa
Skrót
H2N-(CH2)3-NH2
1,3-diaminopropan
DAP
H2N-(CH2)4-NH2H2
putrescyna
PUT
N-CH-CHOH-(CH2)2-NH2
2-hydroksyputrescyna
HPUT
H2N-(CH2)5-NH2
kadaweryna
CAD
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2
norspermidyna
NSPD
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2
spermidyna
SPD
H2N-(CH2)4-NH-(CH2)4-NH2
homospermidyna
HSPD
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2
norspermina
NSPM
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2
spermina
SPM
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2
termospermina
TSPM
H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2
kanawalmina
CANV
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2
kaldopentamina
CLPA
H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2
homokaldopentamina
HCPA
Chinony izoprenoidowe łańcucha oddechowego. Chinony izoprenoidowe, występujące w błonach cytoplazmatycznych bakterii, biorą udział w transporcie elektronów i wchodzą w skład łańcucha oddechowego. Są to: ubichinony, menachinony oraz pochodne chinonów: dihydromenachinony i dimetylomenachinony oraz rodochinony. Ubichinony są obecne jedynie w komórkach typu Proteobacteria (klasy ?-, ?- i ?-Proteobacteria) oraz w komórkach grzybów i drożdży. Obok ubichinonów, w komórkach wymienionych trzech klas oraz ?- i ?-Proteobacteria, u licznych gatunków bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz u archeonów występują menachinony i ich pochodne. W komórkach bakterii purpurowych oprócz ubichinonu i/lub menachinonu występuje rodochinon, u Cyanobacteria zaś - plastochinony i filochinony, typowe dla roślin. W tabeli 1.12 przedstawiono charakterystyczne cechy odróżniające gatunki bakterii z trzech klas Proteobacteria.
Tabela 1.12 Przykłady bakterii różnicowanych na podstawie składu chemicznego komórek. (Z: Busse H.J., Denner E.B.M., Lubitz W. 1996. Classification and idenitification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics. J. Biotechnol. 47: 3-38; dzięki uprzejmości i za zgodą Elsevier)
Klasa
Gatunek bakterii
System chinonów
Poliaminy
Kwasy tłuszczowe
?-Proteobacteria
Rhodospirillum rubrum
Paracoccus denitrificans
Thiobacillus novelus
Q-10
Q-10
Q-10
PUT, SPD
PUT, SPD
HSPD
18:1, 16:1, 16:0 (16:0-3OH, 14:0-3OH)
18:1, 16:0 (10:0-3OH, 14:0-3OH)
18:1, 19:0-cyklo, 16:0
?-Proteobacteria
Acidovorax delafieldi
Comamonas acidovorans
Q-8
Q-8
PUT, HPUT
PUT, HPUT
16:1, 16:0, 18:1 (10:0-3OH)
16:1, 16:0, 18:1, 17:0-cyklo (10:0-3OH)
?-Proteobacteria
Deleya aquamarina
Stenotrophomonas maltophilia
Q-9
Q-8
SPD
CAD, SPD
18:1, 16:0 (19:0-cyklo)15:0 izo, 15:0-antyizo, 16:1 (13:0 izo-3OH)
Identyfikacja gatunków wspólnoty bakterii. Od początku lat 90. ubiegłego wieku, od słynnych badań Giovanoniego i wsp. (1990) oraz Warda i wsp. (1990), do izolacji i identyfikacji bakterii wchodzących w skład wspólnoty mikroorganizmów szeroko stosuje się techniki molekularne. Pozwalają one na wykrycie specyficznych populacji bakterii, bez ich wcześniejszego namnażania i następczej izolacji. Procedury kolejnych technik molekularnych są opisane w licznych pracach szczegółowych dotyczących analizy jakościowego i ilościowego składu wspólnoty bakterii oraz w pracach przeglądowych (np. Amann i wsp. 1995).
Izolacja kwasów nukleinowych ze środowiska. Pierwszym etapem procedury analizy wspólnoty bakterii występujących w danym ekosystemie jest odzyskiwanie kwasów nukleinowych z pobranych próbek. Kwasy nukleinowe, po uwolnieniu z komórek bakterii poprzez bezpośrednią ekstrakcję, należy oczyścić z białek, kwasów humusowych oraz wszelkich związków interferujących z tymi kwasami. Można też izolować szczepy, wcześniej posiane na podłoża rekomendowane dla danego środowiska. Próby bakterii pobrane ze środowiska wodnego osadza się na filtrach membranowych i poddaje się lizie, a następnie izoluje kwasy nukleinowe. Istnieją także procedury izolacji DNA chromosomowego i plazmidowego oraz RNA. W większości protokołów stosuje się lizę komórek z zastosowaniem lizozymu, proteinazy K i SDS (laurylosiarczan sodu), oraz ekstrakcję kwasów nukleinowych roztworem fenolu i chloroformu. Dalsza filtracja na kolumnie z sefadeksem G-75 umożliwia eliminację substancji humusowych. Czystość preparatów kwasów nukleinowych ustala się spektrofotometrycznie oraz poprzez rozdział elektroforetyczny izolowanego DNA. Preparat jest czysty lub dostatecznie czysty wówczas, jeśli ustalony elektroforetycznie współczynnik OD260 do OD280 wynosi około 1,8. Współczynnik niższy od 1,8 świadczy, że preparat jest zanieczyszczony białkami, a wyższy, że zawiera RNA. Współczynnik OD należy obliczać również przy 260/230 nm, co dla DNA daje wartość od 1,8 do 2,2. Współczynniki te są orientacyjne. W celu upewnienia się co do czystości izolowanego DNA genomowego należy przeprowadzić jego rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym. Uzyskane w ten sposób wyniki umożliwiają oznaczenie dokładnej ilości DNA w jednostce objętości na podstawie świecenia w lampie UV zdjęcia komputerowego, z zastosowaniem programu (Quantity One) służącego do obróbki zdjęć żeli agarozowych. Do tzw. doczyszczenia stosuje się dostępne komercyjne kolumienki (np. CleanUp A&A Biotechnology).
Amplifikacja DNA - reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR, ang. polimerase chain reaction). Jest to replikacja DNA in vitro z użyciem polimerazy, w mieszaninie, w której występują wolne nukleotydy deoksyrybonukleinowe (dNTP), oligonukleotydy startowe - tzw. primery, które hybrydyzują z odpowiednimi regionami DNA (ang. template DNA), oflankowując obszar, który ma być wykorzystywany jako matryca do wydłużania startera, oraz jony magnezu. Do reakcji PCR stosuje się termostabilne polimerazy DNA, występujące u wielu termofilnych gatunków bakterii i archeonów. Polimerazy te mają aktywność zarówno 3? ? 5?, jak i 5? ? 3?. W dotychczasowej ofercie handlowej istnieje wiele rodzajów polimeraz, stosowanych w zależności od potrzeb badacza. Pierwszą opisaną i zastosowaną do PCR, a także najbardziej popularną jest polimeraza Taq z Thermus aquaticus. Stosuje się też Tfi z Thermus filiformis, Pfu z Pyrococcus furiosus, a także ostatnio rekomendowaną Pfx z Thermococcus zilligii. Polimerazę dobiera się do typu reakcji PCR (polimerazy single - jeśli stosuje się jedną parę starterów, lub multiplex - przy wielu parach starterów w mieszaninie reakcyjnej), do wielkości i rodzaju produktu, a także w zależności od potrzeb: polimerazy o wysokim stopniu specyficzności, polimerazy o wysokim stopniu wydajności (do długich fragmentów), polimerazy Hot Start (zwiększające specyficzność, zabezpieczające przed powstawaniem niespecyficznych produktów w temperaturze pokojowej). Dana polimeraza wymaga optymalnego stężenia jonów Mg2+ w mieszaninie reakcyjnej, przy którym wykazuje najwyższą aktywność enzymatyczną (należy ustalić doświadczalnie). Do przesyłki konkretnej polimerazy dołączone są bufory, których skład jest zastrzeżony przez producenta. Wydłużanie startera odbywa się w automatycznym termocyklerze, w tzw. cyklach według określonego protokołu. Na przykład dla pary starterów EUB 338 i NON 338 (dla domeny Bacteria), wprowadzonych do termocyklera, mieszaninę umieszczoną w automatycznym termocyklerze ogrzewa się do temperatury 94°C przez 2 minuty, w tym czasie zachodzi denaturacja wstępna DNA. Po tym czasie następuje np. 30 cykli. W ciągu jednego cyklu przez 15 sekund przebiega denaturacja właściwa w temperaturze 94°C, po następnym obniżeniu temperatury do 50°C na 30 sekund następuje przyłączenie startera (ang. annealing primers to the target DNA), a w kolejnym etapie, po podniesieniu temperatury do 72°C przez 60 sekund - wydłużanie startera (ang. extending the DNA) poprzez dodawanie nukleotydów. Po zakończeniu cykli odbywa się ostatni etap amplifikacji DNA - chłodzenie produktu w temperaturze 4°C.
PCR jest szeroko stosowana do analizy wspólnoty bakterii występujących w ekosystemie, do wykrywania pojedynczych gatunków w tej wspólnocie, np. bakterii wiążących azot cząsteczkowy czy bakterii denitryfikacyjnych, potencjalnych patogenów w próbach środowiskowych, np. E. coli, przy tak małym stężeniu jak 1-10 fg DNA genomowego, co może odpowiadać niewielkiej liczbie komórek w 100 ml wody pitnej. Można także śledzić obecność lub brak określonych patogenów po procesie sterylizacji lub utrwalenia żywności. Poza tym PCR można również wykorzystać do stwierdzenia obecności lub braku bakterii zdolnych do degradacji określonych związków, w tym skażeń środowiskowych.
Identyfikacja produktów PCR (ang. genetic fingerprint). Do wyodrębnienia odpowiednich odcinków DNA, które zostały zamplifikowane techniką PCR, służą dwie techniki: RFLP oraz D(T)GGE. RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) polega na porównaniu sekwencji odcinków DNA po ich trawieniu enzymami restrykcyjnymi różnych bakterii. Posługując się tą techniką, można wykryć różnice w wielkości fragmentów DNA pociętych enzymami restrykcyjnymi, powstające np. w wyniku mutacji. Metoda RFLP umożliwia wykazanie powiązań filogenetycznych pomiędzy gatunkami lub osobnikami, poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów polimorficznych, otrzymywanych z użyciem techniki PCR. Z zastosowaniem techniki D(T)GGE (ang. denaturing/thermal gradient gel electrophoresis), wykorzystując do analizy określoną grupę fizjologiczną bakterii, wspólnotę populacji, np. w biofilmie, można wydzielić amplifikowany fragment lub fragmenty genu 16S rRNA. Rozdział elektroforetyczny techniką D(T)GG wydziela fragmenty DNA tej samej długości, ale różniące się składem nukleotydowym lub mutacją punktową. Technika ta pozwala na wydzielenie fragmentu genu przynależnego określonemu gatunkowi bakterii, o wielkości od 100 do 500 nukleotydów. Po wyodrębnieniu odpowiedniego odcinka DNA poddaje się go klonowaniu do komórki Escherichia coli, w celu powielenia do ilości możliwej do sekwencjonowania. Uzyskane wzory porównuje się z sekwencjami zdeponowanymi w bankach genów. Analizy sekwencji rRNA pozwalają na ustalenie zależności filogenetycznych pomiędzy badanymi szczepami bakterii.
Geny reporterowe. Są to markery genetyczne służące do wykrywania specyficznych populacji w środowisku naturalnym. Komercyjnym przykładem genu reporterowego jest lacZ, kodujący ?-glukozydazę, enzym odpowiedzialny za hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy. Po podaniu do podłoża hodowlanego syntetycznego związku 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-?-d-galaktozy, ?-glukozydaza powoduje jego rozcięcie, tworząc nierozpuszczalny niebieski barwnik, widoczny w postaci niebieskich kolonii na podłożu agarowym. W literaturze opisano wiele genów reporterowych, zarówno w chromosomie bakteryjnym, jak i w plazmidach. Genem reporterowym służącym poszukiwaniu różnych bakterii, w tym patogennych, jest lux, powszechnie wykorzystywany do konstrukcji biosensorów stosowanych w ochronie środowiska lub śledzeniu migracji skażeń środowiskowych. Innym, także komercyjnym przykładem markera genetycznego jest białko zielono fluoryzujące. Może ono służyć do śledzenia przeżywalności genetycznie modyfikowanych bakterii w środowisku wodnym. Obserwacje tych bakterii można prowadzić bezpośrednio pod mikroskopem lub w postaci kolonii wyrosłych na szalkach Petriego.
Profil fizjologiczny wspólnoty mikroorganizmów. Określenie profilu fizjologicznego populacji mikroorganizmów w środowisku naturalnym (ang. community level physiological profile) umożliwia m.in. automatyczny system identyfikacyjny BIOLOG?. Ustalana jest w tym przypadku nie taksonomia, ale wykorzystanie różnych zródeł węgla wzorca, którym są płytki BIOLOG? (Ecoplates, GN plates i Fungal Biolog?). Różnorodność funkcjonalna mikroorganizmów w środowisku, szczególnie w stosunku do substratów wykorzystywanych w metabolizmie energetycznym, jest bardzo ważna dla zrozumienia zachodzących w nim zjawisk. Metoda ta jest oparta na inokulacji płytek BIOLOG? próbkami pobranymi bezpośrednio ze środowiska (po uzyskaniu populacji komórek przeprowadzeniu ich do roztworu), inkubacji i spektrometrycznym określeniu heterotroficznej aktywności mikrobiologicznej. Jest to czuła i szybka metoda pozwalająca na oszacowanie potencjalnej różnorodności metabolicznej tylko małej części mikroorganizmów występujących w danym środowisku, tj. kopiotrofów. Umożliwia ona również określenie wpływu oraz ryzyka ekologicznego zanieczyszczeń środowiska, np. pestycydami i metalami ciężkimi. W porównaniu z innymi metodami, np. z analizą fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA, ang. phospholipid fatty acid analysis), jest uznawana za metodę bardziej wrażliwą na zmiany zachodzące w środowisku, choć stwierdzenie to nie musi być do końca prawdziwe.
1.8. Aktualne spojrzenie na klasyfikację bakterii
Earth Microbiome Project (EMP) to inicjatywa założona przez Janet Jansson, Jacka Gilberta i Roba Knighta w 2010 roku w celu zbierania i analizowania wspólnoty mikroorganizmów w naturalnych próbkach na całym świecie. Drobnoustroje występują bardzo licznie, są różnorodne i odgrywają ważną rolę w systemach ekologicznych. Na przykład ocean zawiera około 1,3 × 1028 komórek archeonów, 3,1 × 1028 komórek bakteryjnych i 1 × 1030 cząstek wirusa. Różnorodność bakterii, która jest miarą liczby rodzajów bakterii we wspólnocie, szacuje się na około 160 w jednym mililitrze wody oceanicznej, 6400-38 000 na gram gleby i 70 komórek w jednym mililitrze ścieków. W 2010 roku oszacowano, że całkowity globalny wysiłek związany z sekwencjonowaniem środowiskowego DNA dał około 1% całkowitego DNA znalezionego w litrze wody morskiej lub gramie gleby, specyficzne interakcje zaś między mikroorganizmami są nieznane. EMP ma na celu przetestowanie aż 200 000 próbek w różnych biomach, generując kompletną bazę danych mikroorganizmów na ziemi, aby scharakteryzować środowiska i ekosystemy na podstawie składu mikrobiologicznego i ich interakcji. Oszacowano, że Ziemię zamieszkuje 1011-1012 gatunków bakterii. Dla kontrastu - jak do tej pory - wyhodowano około 104 gatunków, mniej niż 105 gatunków jest reprezentowanych przez sklasyfikowane sekwencje, a całość EMP skatalogowała mniej niż 107 gatunków, z czego 29% zostało wykryte tylko dwa razy.
Wysokowydajne sekwencjonowanie i bioinformatyka rozszerzyły katalog taksonów mikroorganizmów o rzędy wielkości, podczas gdy odkrywanie nowych typów zmienia kształt drzewa życia (ang. Tree Life). Jednocześnie odkrycie nowych form metabolizmu dostarczyły wglądu w to, jak mikroorganizmy żyją i rozmnażają się we wszystkich ekosystemach wodnych, lądowych, inżynieryjnych i związanych z żywicielem.
Techniki metagenomiczne zaowocowały też opracowaniem nowej wersji drzewa życia skonstruowanego na bazie połączenia zestawu 16 rybosomalnych sekwencji białek z każdego organizmu. Do składu drzewa życia bakterii wedle danych Hugenholtz i wsp. (2021) zostały zaklasyfikowane do 129 typów bakterii, 369 klas, 1020 rzędów, 2558 rodzin, 9428 rodzajów i 31 910 gatunków. Drzewo życia prawdopodobnie jest najważniejszym elementem porządkującym klasyfikację mikrobiologiczną organizmów żywych, a także ilustrującym proces ewolucji bakterii.
Pewne typy bakterii są wykrywane ze zmienną częstością w różnych środowiskach i są to: Acidobacteria (Acidobacteriota), Actinobacteria (Actinomycetota), Armatimonadetes (Armatimonadota), Aquificae (Aquificota), Bacteroidetes (Bacteroidota), Bdelovibrionota, Calditrichota, Campylobacterota, Chlamydiae (Chlamydiota), Chlorobi (Chlorobiota), Chloroflexi (Chloroflexota), Chrysiogenes (Chrysiogenota), Coprothermobacterota, Cyanobacteria, Delphibacteria, Deferribacteres (Deferribacterota), Deinococcus-Thermus (Deinococcota), Desulfobacterota, Dictyoglomi (Dictyoglomota), Elusimicrobia (Elusimicrobiota), Firmicutes (Bacillota), Fusobacteria (Fusobacteriota), Gemmatimonadetes (Gemmatimonadota), Ignavibacteria (Ignavibacteriota), Lentisphaerae (Lentisphaerota), Myxococcota, Nitrospinae (Nitrospinota), Nitrospira (Nitrospirota), Planctomycetes (Planctomycetota), Proteobacteria (Pseudomonadota), Spirochaetes (Spirochaetota), Synergistes (Synergistota), Tenericutes (Mycoplasmatota), Thermodesulfobacteria (Thermodesulfobacteriota), Thermotogae (Thermotogota), Verrucomicrobia (Verrucomicrobiota).
Dominującymi wśród całej wspólnoty bakterii w różnych ekosystemach zarówno lądowych, jak i wodnych są bakterie należące do następujących typów: Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria i Verrucomicrobia. Absolutnymi wśród bakterii dominantami w środowiskach lądowych i wodnych są bakterie należące do typu Proteobacteria, subdominantami są w zależności od środowiska albo Actinobacteria, albo Acidobacteria, albo Verrucomicrobia, albo Cyanobacteria.
Obecnie wszystkie gatunki Proteobacteria są zaklasyfikowane do czterech klas (Alpha, Beta-, Gamma- i Epsilonproteobacteria), 25 rzędów, 65 rodzin i 261 rodzajów (w tym 10 rodzajów, nieprzypisanych do rodzin). Tak oto 304 gatunki należą do klasy Alphaproteobacteria, 257 gatunków do klasy Gammaproteobacteria, 82 gatunki do klasy Betaproteobacteria i jeden gatunek do klasy Epsilonproteobacteria.
Gram-ujemne gatunki Proteobacteria posiadają zróżnicowane cechy morfologiczne, fizjologiczne, ekologiczne i patogeniczne. Proteobacteria zawierają komórki bakterii o różnych kształtach. Liczne gatunki są ruchliwe, poruszają się za pomocą wici, niektóre są nieruchome lub poruszają się ruchem ślizgowym. Wśród Proteobacteria wyróżnia się wszystkie możliwe rodzaje procesów metabolicznych. Większość gatunków to fakultatywne lub obligatoryjne beztlenowce, chemolitoautotroficzne i heterotroficzne, podczas gdy niektóre są autotroficzne i prowadzą proces fotosyntezy. Proteobacteria są rozprzestrzenione we wszystkich możliwych siedliska, w wodzie słodkiej, wodzie morskiej, glebie, na/w roślinach, zwierzętach oraz kopalniach wydobywających różne surowce oraz w powietrzu (które nie jest środowiskiem życia). Proteobacteria obejmuje także liczne bakterie patogeniczne.
Klasa Alphaproteobacteria to najbardziej zróżnicowana grupa bakterii, zawiera kilkanaście rzędów. Alphaproteobacteria są kosmopolityczne i kolonizują szeroką gamę siedlisk, w tym glebowe, pelagiczne i bentosowe regiony oceanów, wody słodkie i porosty. Powszechnie Alphaproteobacteria stanowią jeden z najbardziej aktywnych i liczebnie dominujących taksonów wspólnoty mikroorganizmów. Zdecydowana większość Alphaproteobacteria to bakterie wolno żyjące, ale ta klasa obejmuje przedstawicieli związanych asocjacyjnie z szeroką gamą gospodarzy. Wśród bakterii należących do Alphaproteobacteria we wszystkich analizach wspólnot bakterii w różnego typu glebach dominują gatunki należące do rodziny Rhizobiaceae. Na przykład Rhizobium, wiążące azot cząsteczkowy, wchodzi w asocjacje z roślinami motylkowatymi i tworzy brodawki korzeniowe. Rodzina Rhizobiaceae jest wysoce zróżnicowana, z 168 gatunkami sklasyfikowanymi w 17 rodzajach. Inne Alphaproteobacteria, takie jak Bartonella i Brucella, są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Rodzaj Rickettsia może wywołać poważne choroby u roślin, zwierząt i ludzi. Alphaproteobacteria są także oportunistycznymi patogenami człowieka, na przykład rodzaj Roseomonas.
Betaproteobacteria obejmują heterotrofy, autotrofy i metanotrofy. Najbardziej znane heterotrofy w glebie należą do rodzaju Burkholderia, Alcaligenes i Acidovorax. Gatunki Burkholderia są zróżnicowane metabolicznie, wykorzystują proste związki organiczne (kwasy organiczne, aminokwasy i cukry) oraz związki aromatyczne i fenolowe jako źródło węgla. Gatunki Burkholderia wiążą azot cząsteczkowy oraz w ryzosferze promują wzrost i rozwój roślin. Wśród autotrofów występują bakterie utleniające amoniak Nitrosomonas, Nitrosospira, bakterie z rodzaju Thiobacillus utleniające żelazo oraz fototrofy z rodzaju Rhodocyclus i metanotrofy z rodzaju Methylomonas.
Gammaproteobacteria w glebie obejmują heterotrofy, litotrofy i fototrofy. Wśród najbardziej znanych heterotrofów są Pseudomonadaceae i Xanthomonadaceae. Liczne gatunki należące do rodzaju Pseudomonas są o niezwykłej wszechstronności pokarmowej. Większość rośnie na ponad 50 do 100 związków organicznych. Metabolizują cukry, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, alkohole i węglowodory. Do Gammaproteobacteria należą również fotolitotrofy, takie jak Chromatiaceae (Thiocapsa i Chromatium), które w warunkach beztlenowych na świetle utleniają zredukowane związki siarki (siarczki) lub siarkę pierwiastkową, którą wykorzystują jako donor elektronów i asymilują dwutlenek węgla w procesie fotosyntezy.
Acidobacteria są wszechobecną i liczną grupą bakterii głównie w glebie. Analizy metagenomiczne genów 16S rRNA, ujawniły, że Acidobacteria są metabolicznie zróżnicowane i szeroko rozpowszechnione. Większość Acidobacteria to bakterie tlenowe, ale niektóre mogą rosnąć w warunkach obniżonej zawartości tlenu (1-2% tlenu). Różnorodność i liczebność Acidobacteria odnotowano w różnych miejscach, takich jak różnorodne gleby rolnicze i zanieczyszczone, osady, gleby leśne, torfowiska, różne systemy wodne, kwaśne drenaże kopalni oraz powierzchnie paleolitycznych jaskiń i katakumb. Kilka zsekwencjonowanych genomów Acidobacteria wskazuje na szeroki zakres transporterów ABC do pobierania składników pokarmowych, co sugeruje przewagę Acidobacteria w złożonych środowiskach i adaptację do warunków oligotroficznych, takich jak warunki glebowe o ograniczonej zawartości składników pokarmowych. Mimo ich dużej liczebności w środowiskach lądowych do tej pory opisano tylko 60 gatunków Acidobacteria. Pierwszym izolatem należącym do tej gromady był Acidobacterium capsulatum, od którego wzięła się nazwa typu. Rodzaj Acidobacterium został po raz pierwszy zaproponowany w 1991 roku dla bakterii kwasolubnych, chemoorganotroficznych wyizolowanych z kwaśnego środowiska mineralnego.
Bacteroidetes jest typem kosmopolitycznym, który zamieszkuje wiele siedlisk na Ziemi. Jest jednym z kluczowych składników mikrobioty zwierząt. Jako mikroorganizmy komensalne występują zwłaszcza w przewodzie pokarmowym i jamie ustnej. Bacteroidetes kolonizują wiele innych naturalnych siedlisk, takich jak gleby, osady, woda morska i słodka, a niektóre nawet tolerują ekstremalne warunki środowiskowe. Znajduje to odzwierciedlenie w dużej różnorodności metabolicznej Bacteroidetes, która obejmuje tlenowce oraz beztlenowce, mimo że wszystkie są chemoorganoheterotrofami. Niektóre szczepy są znane jako patogeny, zwłaszcza ryb. Uderzającymi cechami Bacteroidetes są ich wyspecjalizowane mechanizmy rozkładu węglowodanów, systemy pobierania oligosacharydów i funkcje przechowywania, które umożliwiają im odgrywanie kluczowej roli w rozkładzie materii organicznej partykularnej. W glebach najwyższa różnorodność występuje w ściółce i górnej warstwie gleby, gdzie składniki odżywcze najpierw dostają się do ekosystemu i zaczynają być metabolizowane.
Wiedza o typie Verrucomicrobia jest skończona, ponieważ niewiele gatunków można hodować i scharakteryzować jako czyste szczepy. Obecnie w sumie 65 potwierdzonych gatunków zaklasyfikowano jako 28 rodzajów, z których 18 uzyskano z gleb. W większości Verrucomicrobia są mezofilami, ścisłymi tlenowcami, fakultatywnymi lub obligatoryjnymi beztlenowcami. Beztlenowce prowadzą fermentacje węglowodanów z wydzieleniem głównie kwasu propionowego i octowego oraz niewielkich ilości kwasu bursztynowego, mlekowego, mrówkowego, etanolu i wodoru. Coraz częściej uważa się, że Verrucomicrobia są grupą bakterii o znaczeniu środowiskowym i rolniczym. Występują w różnych siedliskach glebowych, od beztlenowych gleb plantacji ryżu do gleb pustynnych, a także w ekstremalnych środowiskach, w tym w glebach Antarktydy, gorących źródłach (60°C) i w warunkach niskiego pH 2,0-2,5. Zmienność przestrzenną i liczebność Verrucomicrobia można przewidzieć na podstawie warunków klimatycznych/środowiskowych, a najliczniej występują w pośrednich temperaturach i glebach podmokłych. Wśród nich istnieje grupa metanogenów. Verrucomicrobia to w większości wolno żyjące bakterie, które można znaleźć w środowiskach słodkowodnych, morskich, glebowych i jelitach zwierząt. Powszechne występowanie Verrucomicrobia w glebach zostało obszernie udokumentowane - wydają się one dominujące w wielu wspólnotach bakterii glebowych na całym świecie, w tym na Antarktydzie, w Europie i w obu Amerykach, a także w glebach górskich lasów iglastych. Analizy metagenomiczne wspólnot bakterii wielu gleb wskazują, że Verrucomicrobia średnio stanowią nawet do 23% wszystkich sekwencji bakteryjnych obecnych w zbiorowiskach mikroorganizmów. Szczególnie istotne są Verrucomicrobia występujące w glebach trawiastych i preriowych, które być może są związane z nicieniami glebowymi, ponieważ "Xiphinematobacter" z klasy Terrimicrobia jest powiązany asocjacyjnie z nicieniami. Verrucomicrobia występują jako symbionty (?) zwierząt, takich jak nicienie, występują w jelitach termitów oraz u osłonic morskich. Verrucomicrobia nie wydają się patogenne. Analizy sekwencji 16S rRNA wskazują, że Verrucomicrobia może być istotnymi gatunkami wspólnoty mikroorganizmów związanych z korzeniami roślin ryzosferowych.
Typ Planctomycetes obejmuje bakterie o rzadkich cechach wśród prokariotów, takie jak podział komórki przez pączkowanie i złożone struktury komórkowe. Chociaż Planctomycetes są wszechobecne, liczba opisanych gatunków i izolowanych szczepów dostępnych jako szczepy akseniczne jest nadal niska w porównaniu z różnorodnością obserwowaną w metagenomach lub badaniach środowiskowych.
Planctomycetes są szeroko rozpowszechnioną i liczną grupą bakterii, która reprezentuje jedną z głównych linii w domenie Bacteria. Bakterie należące do typu Planctomycetes kolonizują szeroką gamę organizmów zasiedlających siedliska wodne i lądowe. Najwyższą liczebność Planctomycetes obserwuje się zwykle w środowiskach nasyconych wodą, które są bogate w materię organiczną pochodzenia roślinnego, taką jak powierzchnie morskich makroglonów, biofilmy rzeczne, liście makrofitów słodkowodnych, torfowiska oraz gleby bogate w substancje organiczne. Planctomycetes stanowią również 7 ? 5% całkowitego rRNA wyekstrahowanego z gleb rolniczych, a ich liczebność rRNA ustępowała tylko klasie Alphaproteobacteria w badaniu obejmującym osiem głównych linii bakterii. Mimo ich dużej liczebności w biosferze niewiele wiadomo na temat ekologicznego znaczenia tych organizmów oraz czynników środowiskowych wpływających na ich różnorodność i liczebność w glebie. Większość uzyskanych izolatów to wolno rosnące, tlenowe lub fakultatywne chemoorganotrofy, które specjalizują się w metabolizmie węglowodanów, ale istnieją dowody na to, że możliwości metaboliczne tej grupy są znacznie bardziej zróżnicowane. Na przykład wykazano, że głęboko rozbieżna linia w obrębie Planctomycetes jest zdolna do wzrostu chemolitoautotroficznego poprzez beztlenowe utlenianie amonu. Chemolitoautotroficzne Planctomycetes "anammox", które są zdolne do beztlenowego utleniania amonu, nie są jeszcze dostępne w postaci czystych szczepów. W ostatnich 3 latach uzyskano imponującą kolekcję Planctomycetes z różnych siedlisk wodnych, dziesiątki szczepów wyhodowano z prób pobranych z mokradeł słodkowodnych i beztlenowych osadów solnych. Obejmują one chemoorganotroficzne tlenowe i beztlenowe Planctomycetes, które wykorzystują szeroką gamę związków organicznych.
Jednym z takich mniej zbadanych typów bakterii są Gemmatimonadetes (Gemmatimonadota). Obecnie typ zawiera tylko sześć hodowalnych gatunków. Wszystkie hodowane w warunkach laboratoryjnych gatunki Gemmatimonadetes są chemoorganoheterotrofami, z wyjątkiem fakultatywnych fotoheterotroficznych Gemmatimonas phototrophica i Gemmatimonas groenlandica. Rosną w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych w środowiskach o niskim zasoleniu i środowiskach o neutralnym odczynie lub lekko zasadowym. Typową cechą wszystkich hodowanych Gemmatimonadetes jest intensywna pigmentacja hodowli od koloru pomarańczowego i różowego do czerwonego w fazie stacjonarnej. Gemmatimonadetes zawiera także gatunki bakterii zdolne do fototrofii beztlenowej. Fototrofy beztlenowe można rozróżnić na podstawie rodzaju posiadanego centrum reakcji - typu I lub typu II, które różnią się w odniesieniu do akceptorów elektronów. Zarówno Gemmatimonas phototrophica, jak i Gemmatimonas groenlandica zawierają centra reakcji fotosyntezy typu II. Są więc fakultatywnymi fotoheterotrofami, które nie asymilują węgla nieorganicznego i wymagają dostarczenia substratów organicznych do ich rozwoju. Zdolność ta pozwala do zbierania światła dostarczającego im dodatkowej energii, co poprawia efektywność wykorzystania węgla, a w konsekwencji zwiększa tempo ich wzrostu. Światło jest wykorzystywane do generowania ATP poprzez fotofosforylację, która umożliwia im zmniejszenie częstości oddychania, a jednocześnie zwiększenie tempa asymilacji związków organicznych oraz syntez komórkowych.
Sekwencjonowanie środowiskowych genów 16S rRNA wskazuje, że typ Gemmatimonadetes jest kosmopolityczny, a jego gatunki są rozsiane po całym świecie w różnych środowiskach naturalnych. Występują w glebach, wiecznej zmarzlinie, ryzosferach, jeziorach słodkowodnych i osadach, osadzie czynnym, osadach głębinowych, słonawych ujściach rzek i są symbiontami gąbek morskich. Z analizy sekwencji genu 16S rRNA dostępnych w publicznych bazach danych wynika, że maksymalna liczebność sekwencji jest notowana w różnych typach gleb, w tym użytków zielonych, rolniczych, leśnych lub glebach zanieczyszczonych. Kosmopolityczne rozmieszczenie Gemmatimonadetes w różnych glebach sugeruje, że są to gatunki ogólne o wszechstronnym metabolizmie, do którego można przystosować szeroką gamę składników pokarmowych. Gemmatimonadetes są przystosowane do środowisk suchych, ponieważ występuje w dużych względnych proporcjach w glebach półsuchych i suchych oraz pustyniach. W kilku publikacjach odnotowano obecność Gemmatimonadetes w jeziorach słodkowodnych i osadach lub ujściach rzek i ekosystemach morskich. Mimo tego faktu wciąż niewiele wiadomo na temat ich metabolizmu, a tym samym roli w środowisku. Zazwyczaj tworzą tylko niewielką część wspólnoty bakterii, ze względną liczebnością na poziomie około 1%. Te niskie liczebności w środowisku mogą wiązać się z ich wolniejszym wzrostem, który często wiąże się ze zdolnością do wytrzymania stresujących warunków życia. Gemmatimonadetes są w stanie przetrwać w środowiskach ekstremalnych, takich jak gleby zasolone, gleby na Antarktydzie, hiperzasolone jeziora sodowe czy osady głębinowe. To oznacza, że są oligotrofami (strategia typu K) z mniej aktywnym metabolizmem i podwyższoną opornością na stresy środowiskowe kosztem niższego tempa wzrostu.
Nową grupą na aktualnym drzewie życia są mikroorganizmy określane jako CPR (candidate phyla radiation), stanowiącą dość dużą grupę linii bakteryjnych, które nie rosną w standardowych warunkach laboratoryjnych (brak szczepów hodowalnych) i zostały zdefiniowane głównie poprzez techniki metagenomiczne oparte na sekwencjonowaniu ich genomów. Chociaż szacunki różnią się w zależności od zastosowanych metod, przewiduje się, że bakterie CPR stanowią znaczącą część różnorodności bakteryjnej, odrębnej i różnicującej się. Bakterie CPR mają na ogół stosunkowo małe rozmiary genomu i często brak im zdolności do syntezy istotnych składników komórkowych, jak lipidy, aminokwasy i nukleotydy. Istnieje prawdopodobieństwo, że CPR mogły wcześnie oddzielić się od innych bakterii lub mogły powstać na drodze szybkiej ewolucji obejmującej redukcję ich genomu. Poza tym niektóre grupy w obrębie CPR nie są wykrywane w badaniach genów rRNA z powodu niedopasowania primerów. Obecnie zostało zidentyfikowanych 71 przedstawicieli typów należących do CPR.
