235Rodzaje badań i typy analiz toksykologicznychGrzegorz Buszewicz

W przypadkach zgonów nagłych rodzaj badania toksykologicznego użytego do celów dowodowych wynika z roli jaką ma ono spełnić w całym procesie wyjaśnienia przyczyny śmierci. Jeżeli wynik ekspertyzy ma za zadanie tylko zweryfikować wstępne ustalenia organów ścigania lub medyków sądowych (patrz 234), mogą być stosowane jedynie badania ukierunkowane, tzw. celowane, które można zrealizować przy użyciu tylko jednej analizy - o ile jest dostatecznie selektywna (tab. 235-1).

Wykonanie jedynie badania ukierunkowanego może być wystarczające do wyjaśnienia przyczyny zgonu wówczas, gdy stężenie wykrytego ksenobiotyku jest bardzo wysokie, znacznie przekraczające minimalne stężenie śmiertelne. Pojedyncze badanie nie jest jednak wystarczające do pełnego wyjaśnienia okoliczności zatrucia np. w sytuacjach, gdy doszło do zatrucia wieloma substancjami lub zatruta osoba dodatkowo była pod wpływem substancji psychoaktywnej (alkoholu, środków odurzających, NSP).

Badania wielocelowane, ukierunkowane na oznaczenie co najmniej kilku związków chemicznych, mają zastosowanie podobne do ukierunkowanych, czyli weryfikację wstępnych ustaleń organów ścigania lub medyków sądowych, rozszerzoną na kilka-kilkanaście wybranych związków chemicznych lub całą ich grupę. Przykładowo, w przypadkach podejrzenia zatrucia alkoholem niekonsumpcyjnym metodą GC-headspace można równocześnie oznaczyć we krwi kilka lotnych alkoholi i ich pochodnych (np. metanol, etanol, 2-propanol, aceton).

Najbardziej pracochłonne są badania nieukierunkowane, w piśmiennictwie anglojęzycznym zwane "general unknown screening" (GUS). Mają zastosowanie wówczas, gdy wyniki sekcji nie pozwoliły na ustalenie przyczyny zgonu, a istnieją przesłanki, że śmierć nastąpiła z powodu zadziałania czynnika zewnętrznego. Lista poszukiwanych trucizn jest otwarta (teoretycznie nieograniczona) - zastosowane metody laboratoryjne powinny więc obejmować możliwie największy zakres oznaczanych związków chemicznych oraz pośmiertnych markerów zatruć, a badania są prowadzone aż do wyczerpania wszystkich możliwości analitycznych, nawet w przypadku uzyskania dodatnich wyników cząstkowych analiz. Nieukierunkowana ekspertyza toksykologiczna jest długotrwała, wymaga zaangażowania dużych nakładów materiałowych i pracy. Realizuje się ją przez zastosowanie wielu metod. Rodzaj i kolejność zastosowanych metod analitycznych nie są przypadkowe (patrz 236).

Tabela 235-1. Metody i materiały badawcze w ukierunkowanych badaniach toksykologicznych.

Ksenobiotyk (ukierunkowanie)

Materiał biologiczny

Metoda

Etanol

Krew, ciało szkliste, mocz

GC-headspace

ADH

Metanol

Krew, mocz

GC-headspace

Tlenek węgla

HbCO

Krew

Spektrofotometria UV-Vis; GC-headspace

MbCO

Mięśnie szkieletowe

GC-headspace

Jony azotanu(III) i azotanu(V)

Krew

Spektrofotometria UV-Vis

Cyjanowodór

Krew

Spektrofotometria UV-Vis; GC-headspace

Wybrany lek, narkotyk lub NSP

Krew, mocz

HPLC/MS/MS triple quad

Nawet przy znacznym zaangażowaniu środków nie jest jednak możliwe wykluczenie lub oznaczenie wszystkich znanych trucizn, dlatego zwykle rutynowo wykonywane są badania wielokierunkowe, zoptymalizowane pod kątem efektywności, czyli najlepszej proporcji między efektem (pewnym i dokładnym wynikiem) a czasem i kosztem jego uzyskania. Zoptymalizowany tok postępowania analitycznego w piśmiennictwie toksykologicznym określany jest mianem "systematic toxicological analysis" (STA). Badania STA obejmują jak największą liczbę ksenobiotyków z szeroko zdefiniowanych grup związków, będących najczęstszą przyczyną zatruć, np.: gazów toksycznych, trucizn lotnych, leków, środków psychoaktywnych, związków biobójczych, toksycznych anionów i metali. Lista poszukiwanych trucizn w badaniach STA jest więc zamknięta, ograniczona zakresem wykrywalności użytych metod. Granica między badaniami nieukierunkowanymi (GUS) a wielokierunkowymi (STA) nie jest ostra, często pojęć tych używa się zamiennie.

W zależności od tego, jaki rodzaj informacji jest preferowany (lub wymagany np. przez medyka sądowego lub prokuratora) w ramach badań toksykologicznych wykonywane są wymienione poniżej analizy:

- Jakościowe - dostarczają informacji, czy w badanym materiale znajdują się poszukiwane ksenobiotyki, bez określenia ich stężeń. Identyfikacji dokonuje się na podstawie charakterystycznych reakcji chemicznych (np. barwnych w TLC), immunochemicznych (RIA, EIA/ELISA/EMIT, FPIA) lub za pomocą metod instrumentalnych na podstawie charakterystycznych sygnałów analitycznych, emitowanych lub pochłanianych (np. widm masowych, widm absorpcyjnych lub emisyjnych promieniowania elektromagnetycznego).

- Jakościowo-półilościowe - są rozszerzoną formą analiz jakościowych. Mają zastosowanie głównie w toksykologii klinicznej, gdyż obejmują dodatkowo informacje o przybliżonym stężeniu ksenobiotyku (patrz 237).

- Ilościowe - informują o ilościach (stężeniach) poszukiwanych trucizn (oznaczeniu związku chemicznego) w badanym materiale. Oznaczenia jednego lub kilku ksenobiotyków wykonywane są metodami instrumentalnymi na podstawie pomiaru wielkości określonych sygnałów analitycznych (np. prądu elektrycznego, promieniowania UV, IR) lub zmian wielkości sygnału pod wpływem zewnętrznego bodźca fizycznego (np. reakcji MRM w spektroskopii mas). Metody ilościowe dowodowe (np. służące ocenie stanu "pod wpływem") powinny być specyficzne (gdy mierzony parametr, np. prąd jonowy pochodzący z wybranej masy pseudo-molekularnej m/z dotyczy wyłącznie jednej substancji) lub co najmniej wysoko selektywne (mierzony parametr jest zawężony do bardzo nielicznej grupy związków, które można zróżnicować za pomocą oceny innego parametru, np. czasu retencji związku o określonym parametrze m/z).

- Strukturalne - określają strukturę (liczbę, rodzaj i układ wiązań chemicznych w cząsteczce) dotąd nieznanego związku chemicznego wykrytego w materiale pośmiertnym (np. nowej substancji psychoaktywnej). Analizy strukturalne wykonywane są z wykorzystaniem technik, które umożliwiają rejestrację sygnałów analitycznych pochodzących ze ściśle określonych ugrupowań chemicznych oraz ich wiązań (np. NMR, FTIR, wysokorozdzielcza spektroskopia mas).

Oznaczanie substancji to ilościowy proces analityczny, którego wyniki informują również o stężeniu oznaczanego związku chemicznego w badanym materiale. Powszechnym błędem jest używanie pojęcia "oznaczanie stężenia", które stanowi przykład tautologicznego pleonazmu, czyli redundantnego połączenia wyrazów, w którym pierwszy człon zawiera treść występującą także w drugiej części wyrażenia.

Bibliografia

1. Moffatt A.C., Osselton M.D., Widdop B., Watts J.: Clarke's analysis of drugs and poisons. Pharmaceutical Press, London 2011.

2. Peters F.T., Wissenbach D.K., Busardo F.P. i wsp.: Method development in forensic toxicology. Curr. Pharm. Des., 2017, 23: 5455-5467.

3. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2019.

236Strategia badań nieukierunkowanych i wielokierunkowych oraz etapy badań toksykologicznychGrzegorz Buszewicz

Wykrycie lub wykluczenie śmiertelnego zatrucia w sytuacji gdy wyniki sekcji nie pozwoliły na ustalenie przyczyny zgonu, a istnieją przesłanki, że śmierć nastąpiła z powodu zadziałania czynnika zewnętrznego, wymaga użycia adekwatnych środków, czyli sprawdzonych pod względem dowodowym (zwalidowanych) metod instrumentalnych zastosowanych zgodnie z odpowiednim dla danej sprawy (danego przypadku) schematem postępowania diagnostycznego.

W toksykologii sądowo-lekarskiej strategia badań to procedura (sposób postępowania) uwzględniająca cały proces od pobrania próbki do wydania kompleksowego raportu na podstawie uzyskanych informacji analitycznych. Opis procedury jest obligatoryjną częścią raportu.

Procedury badań nieukierunkowanych (general unknown screening, GUS) oraz wielokierunkowe systematyczne analizy toksykologiczne (systematic toxicological analysis, STA) powinny być dostosowane do technik dostępnych w danym laboratorium i obejmować metody z wyboru (zalecane jako najpewniejsze i najbardziej wiarygodne dla danego celu). Poszczególne rodzaje analiz materiału biologicznego powinny być włączane do badań w określonej kolejności. Dobrze zaplanowana strategia badań wydatnie zmniejsza czas i koszt wydania ekspertyzy przy zachowaniu odpowiedniej wiarygodności. W toksykologii sądowej strategia analityczna ma na celu identyfikację związków chemicznych i ich metabolitów, które mają znaczenie procesowe (sądowe).

Kompletna procedura GUS lub STA (ryc. 236-1) składa się z następujących etapów:

1. pobranie próbki - wybór i pobranie materiału biologicznego, odpowiednie zabezpieczenie, transport;

2. przygotowanie próbki - ekstrakcja analitów, mineralizacja, odpowiednie rozcieńczenie do analiz headspace);

3. analiza instrumentalna:

a) różnicowanie analitów - rozdział chromatograficzny, elektroforetyczny;

b) wykrywanie - detekcja sygnałów pochodzących z analitów, w tym sygnały pochodzące z reakcji barwnych;

c) identyfikacja - przyporządkowanie sygnału analitu do konkretnego związku chemicznego;

d) potwierdzenie - potwierdzenie obecności zidentyfikowanego związku drugą metodą opartą na innej zasadzie fizykochemicznej;

e) określenie stężenia - pomiar wielkości specyficznego sygnału analitycznego, która to wielkość jest przyporządkowana do ilości toksycznego związku chemicznego;

4. sporządzenie raportu wraz z interpretacją wyniku - wydanie opinii toksykologicznej.

Ze względu na skutki prawne szczególny nacisk kładziony jest na jakość i wiarygodność wyników analitycznych. W tym kontekście opracowania procedur STA lub GUS nie należy utożsamiać z procesem akredytacji metod. Akredytacja ma odrębny charakter i inne zastosowanie (patrz 242).

Jak dotąd nie istnieje jedna, uniwersalna procedura analityczna umożliwiająca wykrycie chociażby tylko tych trucizn, które są najczęściej spotykane w praktyce medyczno-sądowej. Różnorodność potencjalnych związków chemicznych wymaga użycia wielu technik ekstrakcji, rozdziału oraz detekcji, identyfikacji i kwantyfikacji.

Próbki pośmiertnego materiału biologicznego przeznaczonego do nieukierunkowanych badań toksykologicznych należy zabezpieczać zgodnie z zasadami opisanymi w rozdziałach 053-055

oraz 057

. Nie w każdym przypadku możliwe jest zabezpieczenie wszystkich rodzajów materiału w odpowiedniej dla STA (a tym bardziej GUS) ilości, np. z powodu znacznego rozkładu gnilnego (ekshumacje, utonięcia) lub częściowego zwęglenia (zwłoki wyjęte z pożaru). Dlatego o wyborze i kolejności użycia konkretnych metod najczęściej decydują dostępność (rodzaj i ilość) materiału, ograniczenia techniczne (aparaturowe i odczynnikowe) oraz wymagania co do rodzaju informacji niezbędnej do wydania ekspertyzy (np. konieczność określenia struktury NSP).

Krytycznym etapem procedury STA jest izolacja ksenobiotyków z materiału biologicznego, popularnie zwana ekstrakcją.

Celem izolacji jest oddzielenie potencjalnych trucizn od matrycy biologicznej, głównie białek, tłuszczów i węglowodanów oraz zanieczyszczeń (np. produktów rozkładu gnilnego), które mogą zakłócić detekcję. Oprócz oczyszczenia analitów, korzystnym skutkiem ekstrakcji jest ich zagęszczenie, ważne w przypadku analiz śladowych obecności trucizn. Już ten etap jest decydujący czy dany związek chemiczny zostanie wykryty. Różnorodność strukturalna trucizn, determinująca różnorodność właściwości fizykochemicznych, powoduje, że nie ma jednej, uniwersalnej metody izolacji, która zapewniałaby odpowiedni poziom wykrywalności (odzysku analitu z materiału biologicznego) znanych substancji toksycznych. Z kolei zastosowanie zbyt wielu procedur ekstrakcyjnych o bardzo dobrych współczynnikach odzysku, lecz o wąskich zakresach wykrywania różnych związków chemicznych, wymaga dostępu do dużych ilości materiału badawczego, komplikuje procedurę, wydłuża czas i znacznie ją podraża. Przy doborze procedur izolacji zawsze należy brać pod uwagę to, czy ilość, często unikatowego, materiału dowodowego jest wystarczająca do przeprowadzenia pełnej analizy GUS, a następnie wykonania oznaczeń zidentyfikowanych ksenobiotyków. Ponadto należy upewnić się, czy ilość materiału wystarczy do powtórzenia badań w przypadku pojawienia się wątpliwości odnośnie do uzyskanych wyników.

Zanim przystąpi się do wykonywania procedury, należy dokonać pełnej oceny realnej możliwości przeprowadzenia kompleksowych badań GUS.

W przypadku ograniczonej dostępności materiału w pierwszej kolejności należy skoncentrować się na truciznach, które w danych okolicznościach sprawy stanowią najbardziej prawdopodobną przyczynę zatrucia. Niekiedy wymaga to konsultacji z organem zlecającym (prokuraturą, policją).

Rekomendowaną przez Międzynarodowe Stowarzyszenie Toksykologów Sądowych (The International Association of Forensic Toxicologists, TIAFT) procedurą ekstrakcyjną STA jest wielostopniowa, zróżnicowana w zakresie odczynu pH ekstrakcja typu ciecz-ciecz, w skrócie LLE (liquid-liquid extraction). Rozdzielenie składników zachodzi poprzez ich podział między dwie niemieszające się ze sobą fazy: fazę wodną, którą jest materiał biologiczny po wytrąceniu białek (tzw. odbiałczeniu) i doprowadzeniu do pożądanego odczynu pH (za pomocą buforów, np. węglanowego, fosforanowego) oraz fazę organiczną niemieszającą się z wodą, czyli rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników (np. dichlorometan, izopropanol, octan etylu). Procedura ekstrakcji polega na kilkukrotnym wytrząsaniu fazy wodnej z organiczną, a następnie ich rozdzielaniu przez odwirowanie (ryc. 236-2).

Zalety LLE to:

- krótki czas wykonania;

- prostota;

- wysoka wydajność;

- niski koszt.

LLE może być stosowana dla każdego rodzaju materiału biologicznego, z użyciem rozpuszczalników o zróżnicowanej polarności, z dodatkami soli i przy różnych odczynach pH (od 2-3 aż do 8-9), dzięki czemu uzyskiwanych jest kilka ekstraktów, które zawierają ksenobiotyki o charakterze kwaśnym, obojętnym i zasadowym, hydrofilowe i niepolarne. W przypadkach znacznych zanieczyszczeń pochodzenia gnilnego ekstrakty można ponownie rozpuścić, np. w buforze, i poddać reekstrakcji.

Jak każda metoda ekstrakcji, LLE nie jest pozbawiona wad:

- ekstrakcja jest mało selektywna - wraz z poszukiwanymi ksenobiotykami ulegają koekstrakcji liczne zanieczyszczenia;

- używane rozpuszczalniki są szkodliwe (problem utylizacji, praca pod dygestorium);

- odparowywanie rozpuszczalników należy wykonywać w kontrolowanych warunkach w strumieniu azotu (związki półlotne, np. amfetamina, mogą wysublimować);

- w czasie wytrząsania zwykle powstaje emulsja obniżająca wydajność ekstrakcji.

Oprócz LLE w powszechnym użyciu jest ekstrakcja do fazy stałej (solid phase extraction, SPE), która polega na selektywnym zatrzymywaniu ksenobiotyków przez powierzchnię zmodyfikowanego ciała stałego, tzw. złoża SPE (np. zmodyfikowanego chemicznie polimeru lub żelu krzemionkowego), a następnie wypłukaniu ich (oddzieleniu od złoża) za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika. W tym celu używane są kolumienki ekstrakcyjne (ryc. 236-3 i 236-4) o różnej pojemności, przez które przepuszczane są odbiałczone i zbuforowane wodne roztwory badanego materiału biologicznego, niekiedy dodatkowo rozcieńczone, aby zapewnić swobodny przepływ przez złoże. W badaniach typu GUS ekstrakcja typu SPE nie zapewnia "pokrycia" całego zakresu najczęściej spotykanych trucizn, dlatego jest stosowana przede wszystkim w badaniach ukierunkowanych lub wielocelowanych (patrz 235). W badaniach nieukierunkowanych SPE wykorzystywana jest jako uzupełnienie podstawowej procedury ukierunkowane na związki chemiczne słabo wykrywalne z użyciem LLE. Często jest stosowana na drugim etapie procedury, czyli do analiz ilościowych - potwierdzających.

Zalety SPE:

- "czyste" ekstrakty (zanieczyszczenia mniejsze w porównaniu do LLE);

- możliwość zautomatyzowania prac (sterowane cyfrowo automatyczne ekstraktory);

- łatwość zatężania analitów (ekstrakcja z dużej objętości materiału biologicznego).

Wady SPE:

- zbyt mała (jak na potrzeby analiz GUS) rozpiętość ekstrahowanych ksenobiotyków;

- w pojedynczej ekstrakcji wielu związków z jednej próbki występuje duży rozrzut w procentowym odzysku różnych ksenobiotyków, nawet gdy należą do jednej grupy związków.

W pierwszej kolejności wykonywane są analizy jakościowe lub jakościowo-ilościowe obejmujące w jednym procesie analitycznym całe grupy związków chemicznych, które mają podstawowe znaczenia dla celów medyczno-sądowych, np.: lotne pochodne węglowodorów, organiczne wysokowrzące (leki, narkotyki), jony metali ciężkich. Analizy jakościowe mogą być prowadzone równocześnie, jeśli pozwala na to ilość materiału badawczego oraz potencjał laboratorium. Natomiast analizy potwierdzające, ilościowe i strukturalne wykonywane są dopiero w drugiej kolejności. Rolę analizy potwierdzającej może pełnić analiza ilościowa, o ile jest specyficzna lub wystarczająco selektywna (np. analiza MS/MS - MRM).

Metody laboratoryjne muszą spełniać kryteria co najmniej zadowalającego poziomu wykrywalności i identyfikacji, a następnie kwantyfikacji poszczególnych związków chemicznych.

Obecnie akceptowalne metody jakościowe lub jakościowo-ilościowe wykrywania trucizn organicznych to głównie metody instrumentalne oparte na rozdziale poszukiwanych związków chemicznych:

- chromatografia gazowa (GC) w sprzężeniu z różnymi detektorami (FID, NPD, MS);

- wysokosprawna oraz ultrawysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC/UHPLC) w sprzężeniu z różnymi detektorami (DAD, MS).

Stosowane w toksykologii sądowej ilościowe chromatograficzne metody analiz materiału biologicznego wymagają zastosowania kalibracji z dodatkiem wzorca wewnętrznego (internal standard, IS; ryc. 236-5). Jest to substancja dodawana do próbki w stałej ilości, której sygnał analityczny powstaje w zbliżonych warunkach i ma podobny charakter do sygnału analitycznego oznaczanego ksenobiotyku. W porównaniu z pozostałymi sposobami kalibracji wielopunktowej (ze standardem zewnętrznym lub metodą dodatku analitu) metoda wzorca wewnętrznego jest najbardziej odporna na zakłócającą obecność trudnych do usunięcia składników matrycy biologicznej. Jako IS stosowane są związki, które w jak największym stopniu przypominają badane anality. Przykładowo w detekcji ksenobiotyku techniką spektrometrii mas jako IS używane są jego pochodne zawierające izotopy wodoru (deuterowane pochodne), a ten rodzaj kalibracji z użyciem IS to tzw. technika rozcieńczenia izotopowego (isotope dilution, ID). IS dodawane są do próbek przed ekstrakcją i podlegają wszystkim etapom obróbki materiału badawczego. Kalibracja zewnętrzna lub metodą dodatku analitu w toksykologii sądowej stosowana jest bardzo rzadko, np. z powodu ograniczenia technicznego, jak w analizie HbCO metodą GC-headspace (patrz 282) lub uzupełniająco w razie wyjątkowych trudności analitycznych, np. przy analizie materiału pochodzącego z ekshumacji.

IS powinien charakteryzować się właściwościami chemicznymi, chromatograficznymi i widmami zbliżonymi do oznaczanego analitu, nie może powstawać endogennie, reagować z matrycą i analitem oraz powinien być dostępny w najwyższej klasie czystości.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i jej odmiana wysokosprawna (HPTLC) obecnie mają już marginalne znaczenie w toksykologii sądowej i razem z metodami bezpośrednimi (RIA, EIA/ELISA/EMIT, FPIA) są traktowane jako wstępne przed właściwymi badaniami jakościowymi - dowodowymi (badań jakościowych nie należy utożsamiać z badaniami przesiewowymi - patrz 237).

Problemem badań GUS są procedury analityczne obejmujące trucizny nieorganiczne, gdyż dla tego rodzaju trucizn nie istnieją szerokozakresowe i względnie tanie metody wykrywania równocześnie wielu związków. Praktycznie jedyną techniką instrumentalną częściowo spełniającą kryteria analizy szerokozakresowej jest spektrometria mas sprzężona z plazmą wzbudzaną indukcyjnie (inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS), która w teorii pozwala na wykrywanie kilkudziesięciu jonów metali i kilku niemetali.

Jeśli laboratorium dysponuje szerokim zapleczem aparaturowym, na danym etapie badań GUS wybierana jest jedna konkretna technika, która pozwala na uzyskanie poprawnego wyniku analizy. Wybór zależy od:

- rodzaju analizowanego materiału (matrycy biologicznej);

- dostępności materiału biologicznego (materiałochłonności metody);

- wymagań co do granic wykrywalności, oznaczalności, dokładności i precyzji;

- wymagań co do czasu trwania analizy;

- doświadczenia analityków;

- kosztów materiałowych (w tym kosztów utrzymania aparatury w pełnej sprawności).

Wąskie zaplecze techniczne nie umniejsza wiarygodności uzyskanych wyników, natomiast zawęża zakres badań i obniża pewność (kategoryczność) wnioskowania. W raporcie z badań powinno to być określone w sposób ścisły i zrozumiały dla prawników.

Bibliografia

1. Marquet P.: LC-MS vs. GC-MS, online extraction systems, advantages of technology for drug screening assays. W: LC-MS in drug analysis: methods and protocols (red. L.J. Langman, Ch. Snozek). Springer Science+Business Media, Berlin 2012.

2. Peters F.T., Wissenbach D.K., Busard? F.P. i wsp.: Method development in forensic toxicology. Curr. Pharm. Design, 2017, 23: 1-13.

3. Poklis A.: Analytic and forensic toxicology. W: Casarett & Doull's essentials of toxicology, 3rd edition (red. C.D. Klaassen, J.B. Watkins III). McGraw-Hill, New York 2015.

4. Soriano T., Jurado C., Menendez M., Repetto M.: Improved solid-phase extraction method for systematic toxicological analysis in biological fluids. J. Anal. Toxicol., 2001, 25: 137-143.

5. Stimpfl T., Mueller K., Gergov M. i wsp.: Recommendations on sample collection for systematic toxicological analysis. Bulletin of the International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT), 2009. http://www.tiaft.org/data/uploads/documents/tiaft-sta-recommendations-on-sample-collection.pdf [dostęp 03.09.2020].

6. Stimpfl, T., Mueller, K., Gergov, M. i wsp.: Recommendations on sample preparation of biological specimens for systematic toxicological analysis. Bulletin of the International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT), 2011. http://www.tiaft.org/data/uploads/documents/tiaft-sta-recommendations-on-sample-preparation.pdf [dostęp 03.09.2020].

7. Yinon J. (red.): Advances in forensic applications of mass spectrometry. CRC Press, Boca Raton 2004.

237Badania przesiewowe i dowodoweGrzegorz Buszewicz

Toksykologiczne badania przesiewowe wykonywane są w celu uzyskania informacji o obecności jednego ksenobiotyku lub większej liczby ksenobiotyków w wielu próbkach materiału biologicznego w krótkim czasie oraz przy niskim jednostkowym koszcie analizy.

W medycynie sądowej badania przesiewowe mają zastosowanie przede wszystkim przy ocenie:

- zachowania abstynencji od alkoholu (patrz 306) lub środków odurzających - np. w terapii uzależnień, w kontroli więźniów będących na zwolnieniu warunkowym, wśród kierowców, maszynistów, operatorów skomplikowanych urządzeń oraz osób decydujących o bezpieczeństwie (dróżników, kontrolerów ruchu lotniczego itp.);

- narażenia wielu ludzi i zwierząt na różne związki toksyczne.

Celem toksykologicznych badań przesiewowych jest zawężenie liczebności prób badanych (np. grupy badanych osób) jedynie do przypadków występowania intoksykacji. Do badań przesiewowych szczególnie nadają się różnego rodzaju techniki immunochemiczne, które opierają się na reakcji przeciwciała z antygenem (haptenem):

- radioimmunologiczne, RIA (radioimmunoassay) - wykorzystujące przeciwciała znakowane promieniotwórczymi izotopami oznaczanego związku; poszukiwana substancja kompetycyjnie wypiera (uwalnia) z kompleksu antygen-przeciwciało substancję znakowaną izotopem, która następnie przechodzi do frakcji wolnej, zwiększając jej aktywność promieniotwórczą, co można zmierzyć za pomocą odpowiedniego detektora;

- immunoenzymatyczne, EIA (enzyme immunoassay), immunoenzymosorpcyjna, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oraz EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - w których przeciwciało jest połączone w jeden kompleks z poszukiwaną substancją sprzężoną z enzymem; oznaczana wolna substancja uwalnia z kompleksu do frakcji wolnej antygen znakowany enzymem, a jego aktywność, proporcjonalną do ilości ksenobiotyku, można zmierzyć używając odpowiedniego substratu;

- immunofluorescencyjne w świetle spolaryzowanym, FPIA (fluorescence polarization immunoassay) - w której przeciwciało jest w kompleksie z antygenem (poszukiwanym związkiem), sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym, np. fluoresceiną; poszukiwana wolna substancja kompetycyjnie uwalnia z kompleksu znakowany fluoresceiną antygen, a jego ilość we frakcji wolnej jest proporcjonalna do stężenia ksenobiotyku, co można zmierzyć pośrednio poprzez pomiar energii światła wzbudzonego.

Komercyjnie dostępne są liczne gotowe tego rodzaju testy do badania moczu oraz śliny (ryc. 237-1), niektóre nie wymagają użycia specjalistycznej aparatury (czytników, spektrofotometrów lub czytników wielodetektorowych). Pozwala to na przeprowadzenie licznych badań skriningowych w krótkim czasie, rzędu kilkunastu minut, nawet w bardzo skromnie wyposażonych laboratoriach. Dlatego znajdują zastosowanie tam, gdzie liczy się przede wszystkim dostateczna czułość detekcji, mobilność (możliwość wykonania badań poza laboratorium), szybkość wykonania i niski koszt (a nie wysoka, "dowodowa" pewność uzyskanego wyniku), np. w policyjnych przesiewowych kontrolach drogowych (ryc. 237-2) lub laboratoriach klinicznych.

Oceniając przydatność toksykologicznych testów przesiewowych do celów medyczno-sądowych, należy kierować się własnym doświadczeniem oraz dostępnymi publikacjami naukowymi, gdyż informacje podawane przez producentów mogą zawierać istotne pominięcia, np. odnośnie do ryzyka reakcji krzyżowych zastosowanego antygenu z substancjami innymi niż oznaczany ksenobiotyk, co skutkuje wynikiem fałszywie pozytywnym. Przykładami takich interakcji, istotnych w toksykologii sądowej, niektórych testów typu EMIT są:

- amfetamina i metamfetamina ? dimetylamylamina (DMAA, spotykany w handlu suplement energetyzujący);

- LSD ? fentanyl (anestetyk stosowany w szpitalach);

- ?9-THC ? kwas niflumowy (Nifluril - niesteroidowy lek przeciwzapalny);

- opiaty ? ofloksacyna (Ofloxacin, Floxal - antybiotyk zatrzymujący replikację bakteryjnego DNA).

Ponadto w przypadku użycia testów przesiewowych do badań materiału pośmiertnego lub próbek nieodpowiednio przechowywanych, ze względu na zdegradowaną gnilnie matrycę biologiczną zawierającą liczne związki, należy liczyć się z możliwością wystąpienia inhibicji reakcji immunologicznych będących podstawą oznaczenia, co może skutkować wynikiem fałszywie negatywnym.

W toksykologii sądowej wyniki badań przesiewowych wykonanych z wykorzystaniem testów immunochemicznych przedstawiają należytą wartość jedynie dla przeprowadzających badania toksykologów - diagnostów, gdyż tylko oni mogą ocenić ich rzeczywistą wartość informacyjną.

Pozytywne wyniki tych badań nie powinny być końcowym "produktem" (podstawą raportu), gdyż nie spełniają wymogów sądowych w zakresie wagi dowodowej. Bezkrytyczne traktowanie tych wyników jako dowodowe może prowadzić do przyjęcia błędnych wniosków przez medyka sądowego co do przyczyny śmierci lub skutkować skierowaniem uwagi prokuratorów (śledczych) na fałszywy trop, co w przypadku utylizacji dowodów toksykologicznych po upływie okresu przechowywania wiąże się z bezpowrotną utratą unikatowego materiału dowodowego.

Badania przesiewowe, które zapewniają znacznie większą wartość informacyjną zarówno pod względem zakresu liczby poszukiwanych związków, jak i pewności ich wykrycia, wykonywane są z użyciem technik GC/MS lub LC/MS. Dostępne komercyjne biblioteki widm masowych (np. systematycznie aktualizowana baza NIST), a także dostępne bezpłatnie bazy on-line (np. mzCloud, MassBank, SWGDrug), znacznie ułatwiają ten etap badań nieukierunkowanych (patrz 239).

Dodatnie wyniki badań spektralno-masowych, które uzyskano wyłącznie opierając się na dostępnych zewnętrznych bazach danych widm masowych, nie mają charakteru w pełni dowodowego (potwierdzającego).

Badania dowodowe, określane niekiedy badaniami potwierdzającymi (lub konfirmacyjnymi), służą celom procesowym - sądowym, co stawia bardzo wysokie wymagania odnośnie do pewności analiz w zakresie specyficzności (selektywności), czułości (wykrywalności) oraz dokładności i precyzji wyniku ilościowego. Wykonywane są z użyciem zwalidowanych metod instrumentalnych (patrz 242), w których detekcja, identyfikacja oraz kwantyfikacja odbywa się za pomocą odpowiednio selektywnego detektora. W zakresie związków o budowie organicznej preferowane są detektory oparte na spektrometrii mas (mass spectrometry, MS), zaś przy związkach o budowie nieorganicznej detektory wykorzystujące absorpcyjną spektrometrię atomową (atomic absorption spectrometry, AAS) lub spektrometrię mas sprzężoną z plazmą wzbudzaną indukcyjnie (inductively coupled plasma - mass spectrometry, ICP-MS).

Identyfikacja i kwantyfikacja wykrytych ksenobiotyków w badaniach dowodowych realizowana jest na podstawie porównania sygnału analitu badanego materiału z sygnałem pochodzącym od wzorca analitycznego.

Przy użyciu certyfikowanych wzorców ilościowych (ryc. 237-3) oraz ich izotopów dla każdego ksenobiotyku sporządzane są własne, indywidualne dla danego spektrometru sprzężonego z chromatografem widma masowe i odpowiadające im chromatogramy:

- dla spektrometrów wyposażonych w pojedynczy analizator:

- widmo masowe wybranego jonu macierzystego (selected ion monitoring, SIM);

- dla spektrometrów wyposażonych w więcej niż jeden analizator, tzw. spektrometrów tandemowych:

- widma fragmentacyjne jonu macierzystego:

- jednokrotne (MS/MS, MS2);

- wielokrotne (MSn);

- widma uzyskiwane w trybach zwanych monitorowaniem reakcji fragmentacji:

- następczych (multiple reaction monitoring, MRM);

- pojedynczych (selected reaction monitoring, SRM).

Do analiz ilościowych sporządzane są indywidualne dla danego związku krzywe kalibracyjne z użyciem standardu wewnętrznego, którym jest izotopowa, najczęściej deuterowana, pochodna analizowanego związku (patrz 236), a cała procedura ilościowa zostaje zwalidowana. Parametry, które należy poddać walidacji to: czułość (określenie granicy detekcji, LOD), dokładność, precyzja, procent odzysku (przy różnych stężeniach), zakres kalibracji, selektywność, określenie granicy oznaczalności (LOQ), wpływ matrycy biologicznej (inhibicja lub wzmocnienie sygnału analitu), powtarzalność, odtwarzalność, ewentualnie także czas i koszt analizy. Odczynniki muszą być sprawdzane za pomocą procedur kontroli jakości. Zakres stężeń, dla których metoda jest prawidłowa powinien być wystarczająco duży, aby objąć wszystkie stężenia, które mogą wystąpić (np. terapeutyczne, toksyczne i śmiertelne).

Zgodnie z ustawą o przeciwdziałaniu narkomanii zakup i stosowanie do badań wzorców substancji kontrolowanych (środków odurzających i substancji psychotropowych) wymagają posiadania odpowiednich zezwoleń Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego (GIF) oraz właściwego Wojewódzkiego Inspektoratu Farmaceutycznego (WIF).

Bibliografia

1. Apollonio L.G., Whittall I.R., Pianca D.J. i wsp.: Matrix effect and cross-reactivity of select amphetamine-type substances, designer analogues, and putrefactive amines using the Bio-Quant direct ELISA presumptive assays for amphetamine and methamphetamine. J. Anal. Toxicol., 2007, 31: 208-214.

2. Bidny S., Gago K., Chung P. i wsp.: Simultaneous screening and quantification of basic, neutral and acidic drugs in blood using UPLC-QTOF-MS. J. Anal. Toxicol., 2017, 41: 181-195.

3. EMIT drugs of abuse urine assays cross-reactivity list. Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Muenchen 2011. https://www.wakemed.org/documents/pathology/EMIT_Drugs_of_Abuse_Cross_Reactivity_List.pdf [dostęp 03.09.2020].

4. Gomółka E., Morawska A.: Zalety i wady szybkich testów, czyli jak oznaczać narkotyki w laboratorium medycznym? Diagnostyka Laboratoryjna, 2011, 47: 197-203.

5. Lequin R.M.: Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin. Chem., 2005, 51: 2415-2418.

6. Maurer H.H.: Current role of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical and forensic toxicology. Anal. Bioanal. Chem., 2007, 388: 1315-1325.

7. Stolarczyk E., Kutner A.: Zastosowanie spektrometrii mas w analizie farmaceutycznej zanieczyszczeń organicznych. fARM. Pol., 2009, 65: 586-593.

238Toksydromy oraz pośrednie biomarkery toksykologiczneGrzegorz Buszewicz, Grzegorz Teresiński

W sytuacji gdy do śmierci doszło mimo udzielenia pomocy medycznej, we wstępnej ocenie śmiertelnego zatrucia, jeszcze przed rozpoczęciem badań toksykologicznych, bardzo pomocne mogą być informacje zawarte w historii choroby. W niektórych przypadkach są to zespoły cech klinicznych, które można przypisać określonym klasom trucizn - tzw. toksydromy (tab. 238-1).

Toksydromy to toksyczne zespoły (konstelacje) objawów związanych z klasą trucizn. W toksykologii klinicznej wyróżnia się kilkanaście toksydromów.

Tabela 238-1. Niektóre (najważniejsze) toksydromy.

Toksydrom

Objawy

Substancja lub "klasa" substancji toksycznych

Sympatykomimetyczny

- Pobudzenie psychoruchowe

- Hipertermia

- Tachykardia

- Nadciśnienie tętnicze

- Szerokie źrenice

- Skóra ciepła, wilgotna

- Zaburzenia świadomości

- Drgawki

- Kokaina

- Amfetamina i jej pochodne

- Katynony

- Efedryna

- Fencyklidyna

- Kofeina

- LSD

- Metylofenidat

Cholinergiczny

(muskarynowy)

- Ślinotok

- Bradykardia lub tachykardia

- Wąskie (szpilkowate) źrenice

- Nadmierne pocenie się

- Nasilone wydzielanie oskrzelowe

- Wzmożona perystaltyka jelit

- Wymioty

- Nietrzymanie moczu/stolca

- Osłabienie mięśniowe

- Drżenie mięśni

- Zaburzenia świadomości

- Drgawki

- Pestycydy fosforoorganiczne

- Pestycydy karbaminianowe

- Nikotyna

- Muskaryna (muchomor czerwony - Amanita muscaria)

Cholinolityczny

(atropinowy)

- Zmniejszone wydzielanie śliny

- Tachykardia

- Nadmiernie rozszerzone źrenice

- Skóra sucha, zaczerwieniona

- Hipertermia

- Suchość śluzówek

- Nadciśnienie tętnicze

- Zatrzymanie moczu

- Zahamowanie perystaltyki jelit

- Zaburzenia świadomości

- Drgawki

- Atropina, skopolamina (alkaloidy tropanowe: pokrzyk wilcza jagoda - Atropa belladonna; bieluń dziędzierzawa - Datura stramonium)

- Alkaloidy taksynowe (cis pospolity - Taxus baccata)

- Cykliczne antydepresanty

- Cyklobenzapryna

Serotoninowy

- Pobudzenie, niepokój, stany lękowe

- Dysforia - euforia

- Zlewne poty

- Hipertermia

- Nudności i wymioty

- Biegunka

- Wahania ciśnienia krwi

- Tachykardia

- Ślinotok

- Rozszerzenie źrenic

- Drżenia

- Przyspieszony oddech

- Sztywność mięśni

- Zaburzenia świadomości

- Majaczenie

- Inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SRI)

- Selektywne inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI)

- Niektóre opioidy

- Pochodne ergotaminy

- Dekstrometorfan

- Metoklopramid

- Prometazyna

Opioidowy

- Sedacja

- Analgezja

- Zawroty głowy

- Zwężenie źrenic

- Bradykardia

- Zmniejszona perystaltyka jelit

- Spowolnione oddychanie

- Hipotensja

- Zaburzenia rytmu serca

- Śpiączka

- Opioidy (heroina, morfina, fentanyl, metadon, oksykodon, tramadol)

- Klonidyna

Taka klasyfikacja objawów ma praktyczne zastosowanie głównie w toksykologii klinicznej, we wstępnej ocenie ciężkości zatrucia i prawdopodobnej klasy substancji toksycznej oraz przy określaniu rokowania. W praktyce toksykologii sądowej ułatwia natomiast zaplanowanie przebiegu badań STA (patrz 236) oraz jest pomocna w medyczno-sądowym rozpoznaniu przyczyny śmierci.

W przypadkach zgonów nagłych oraz zdiagnozowanej intoksykacji różnymi substancjami toksycznymi i ich metabolitami medyczno-sądowa ocena przyczyny śmierci nie powinna ograniczać się jedynie do popierania tezy o śmiertelnym zatruciu, nawet gdy stwierdzone stężenie ksenobiotyku przekracza granicę zakresu toksycznego.

W sytuacji gdy śmierć mogła być spowodowana przez inny niż zatrucie czynnik, np. uraz mechaniczny, termiczny czy utonięcie, należy poszukiwać biomarkerów pośrednich, uzasadniających przyjęcie ostatecznej diagnozy.

Pośrednie biomarkery toksykologiczne (PBT) powstają w następstwie toksycznego uszkodzenia i dysfunkcji tkanek lub narządów. Są one niespecyficzne, dlatego w odniesieniu do mechanizmu działania toksycznego poszczególnych substancji chemicznych należy oceniać nie pojedyncze biomarkery, a cały zestaw PBT (tab. 238-2). Wyniki takich badań z zakresu biochemii sądowej niosą informację pomocną w interpretacji wyników badań toksykologicznych.

W diagnostyce pośmiertnej odpowiednikiem klinicznych toksydromów są niespecyficzne objawy sekcyjne, które ukierunkowują na zatrucie określoną grupą substancji toksycznych lub na określony sposób intoksykacji, na przykład:

- obecność patologicznej treści w obrębie twarzy lub jamy ustnej (ryc. 238-1);

- niefizjologiczne zabarwienie organów wewnętrznych w wyniku zatrucia preparatami chemicznymi barwionymi w celach ostrzegawczych (ryc. 238-2);

- zmiana zabarwienia śluzówki przewodu pokarmowego w wyniku kontaktu z substancją toksyczną (patrz 285), np. tzw. reakcja ksantoproteinowa (ryc. 238-3);

- nietypowa konsystencja tkanek ścian przewodu pokarmowego - oparzenia chemiczne (patrz 196):

- martwica skrzepowa (koagulacja tkanek) w przypadku zatruć np. kwasami nieorganicznymi (ryc. 238-3);

- martwica rozpływna w przypadku zatruć ługami (ryc. 238-4);

- nietypowe zabarwienie plam opadowych (patrz 283) lub krwi sekcyjnej w przypadkach zatruć tzw. truciznami krwi, które zmieniają kolor hemoglobiny (ryc. 238-5);

- obecność kapsułek lub rozpuszczonej masy tabletkowej w świetle żołądka lub początkowych odcinkach jelit (ryc. 238-6);

- obecność w świetle przewodu pokarmowego pozostałości innych wtrętów pochodzenia syntetycznego lub naturalnego (ryc. 238-7).

Tabela 238-2. Pośrednie biomarkery toksykologiczne.

Pośredni (biochemiczny) biomarker toksykologiczny

Skutek toksycznego uszkodzenia

Substancje toksyczne

Mioglobina we krwi

Rabdomioliza, hipertermia

Etanol, amfetamina i jej pochodne, rozpuszczalniki organiczne, tlenek węgla, leki przeciwgorączkowe, leki przeciwbólowe

Zwiększone stężenia katecholamin i serotoniny we krwi oraz płynach osierdziowym i mózgowo-rdzeniowym

Neurotoksyczność ogólnoustrojowa

Leki uspokajające i nasenne oraz stymulatory OUN

Podwyższona aktywność tryptazy komórek tucznych, podwyższone stężenie histaminy i immunoglobulin oraz zwiększona aktywność markerów czynności wątroby

Anafilaksja

Penicylina, cefalosporyny, lidokaina, kontrasty dożylne

Obniżona aktywność esterazy cholinowej:

- osoczowej (biomarker ekspozycji)

- krwinkowej (biomarker ekspozycji oraz skutku)

Neurotoksyczność

Inhibitory esterazy cholinowej: pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe oraz niektóre bojowe środki trujące (np. tzw. nowiczoki)

Obniżona aktywność płytkowej monoaminooksydazy B

Neurotoksyczność

Niektóre rozpuszczalniki organiczne, styren

Obecność kwasu mrówkowego w moczu oraz podwyższone:

- aktywność markerów czynności wątroby

- stężenie kreatyniny

- stężenie mocznika

Neurotoksyczność, hepatotoksyczność

Chlorometan (chlorek metylu)

W niektórych przypadkach tego rodzaju nietypowe znaleziska sekcyjne stanowią jedynie pozorne objawy zatrucia, zwłaszcza w sytuacji izolowanych przebarwień pętli jelitowych, które bywają następstwem:

- lokalnie nasilonych procesów gnilnych - z uwagi na obecność saprofitycznej flory bakteryjnej w świetle jelit ściany przewodu pokarmowego mogą wykazywać cechy nasilonych zmian gnilnych nawet przy braku uchwytnych objawów późnych zmian pośmiertnych w obrębie powłok zewnętrznych (ryc. 238-8);

- prześwitywania zalegających mas krwotocznych w wyniku krwawienia do światła przewodu pokarmowego - np. krwotoczny nieżyt błony śluzowej, ostre lub przewlekłe wrzody trawienne (ryc. 238-9);

- spożycia dużej ilości niektórych intensywnie zabarwionych produktów spożywczych pochodzenia naturalnego - np. buraków ćwikłowych (ryc. 238-10).

Bibliografia

1. Boyer E.W., Shannon M.: The serotonin syndrome. NEJM, 2005, 352: 1112-1120.

2. Burda P.: Wstępna diagnostyka w ostrych zatruciach i podejrzeniach zatruć ksenobiotykami. Medycyna po Dyplomie, 2013, 07-08. https://podyplomie.pl/medycyna/15168,wstepna-diagnostyka-w-ostrych-zatruciach-i-podejrzeniach-zatruc-ksenobiotykami [dostęp 03.09.2020].

3. Central East Prehospital Care Program (CEPCP): Toxidromes; what's your poison? Lakeridge Health. Self Study Package Summer 2008. Continuing Medical Education. https://www.lakeridgehealth.on.ca/en/ourservices/resources/Toxidromes%20Self%20Study%20Package.pdf [dostęp 03.09.2020].

4. Cserni G., Kocsis L.: The case of the purple colon. Virchows Arch., 2008, 452: 703.

5. lndulski J., Lutz W., Lutz P.: Biochemiczne markery neurotoksyczności. Wyd. Instytutu Medycyny Pracy im. prof. dra med. Jerzego Nofera, Łódź 1999.

6. Lawrence D., McLinskey N., Huff J.S., Holstege C.P.: Toxin-induced neurologic emergencies. W: Clinical neurotoxicology. Syndromes, substances environments (red. M.R. Dobbs). Saunders, Philadelphia 2009.

7. Roemmelt A.T., Franckenberg S., Steuer A.E., Kraemer T.: Purple discoloration of the colon found during autopsy: Identification of betanin, its aglycone and metabolites by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry. Forensic Sci Int., 2014, 240: e1-e6.

8. Woroń J., Filipczak-Bryniarska I., Krzanowska K., Strzępek K.: Zespół serotoninowy jako powikłanie polifarmakoterapii u pacjenta z zaawansowaną chorobą nowotworową - opis przypadku. Anestezjologia i Ratownictwo, 2012, 6: 176-178.

239Interpretacja wyników badań oraz informacja toksykologicznaGrzegorz Buszewicz

Właściwa interpretacja wyników badań toksykologicznych w medyczno-sądowej ocenie przyczyny śmierci nagłej opiera się na szerokiej informacji pochodzącej z kilku źródeł:

- przedlaboratoryjnych - informacje dotyczące okoliczności śmierci: policja, prokuratura, informacje z przebiegu leczenia, objawy - toksydromy (patrz 238);

- laboratoryjnych - wyniki oględzin i sekcji zwłok, badań toksykologicznych, histopatologicznych, biochemicznych;

- postlaboratoryjnych - informacja naukowa, toksykologiczna i medyczno-sądowa zebrana i analizowana w kontekście uzyskanych wyników badań.

W raporcie końcowym zawsze należy uwzględniać całość dostępnej informacji, a kluczowe dane, takie jak okoliczności zatrucia, objawy, wyniki badań klinicznych, wyniki badań pośmiertnych toksykologicznych i biochemicznych oraz prawdopodobna pośmiertna redystrybucja powinny się wzajemnie zazębiać. Ewentualne niezgodności między poszczególnymi informacjami należy rozstrzygać zgodnie z ich wagą dowodową (ryc. 239-1).

Interpretacja wyników analiz toksykologicznych to końcowy etap badań, produkt finalny, który w przypadkach badań pośmiertnych stanowi podstawę opinii medyczno-sądowej, dlatego istotne jest systematyczne aktualizowanie wiedzy oraz unikanie długotrwałego powielania utartych schematów interpretacyjnych.

Nieprzerwany dostęp do aktualnej informacji toksykologicznej jest ważny dla zapewnienia adekwatnego poziomu badań ze względu na:

- pojawiające się nowe zagrożenia (np. NSP);

- aktualizację metodyk;

- stale poszerzający się zasób wiedzy na temat toksyczności różnych związków chemicznych (nie tylko nowo pojawiających się, ale także znanych od dawna, lecz dotąd nieprzebadanych);

- systematyczną nowelizację przepisów prawa dotyczących różnych zagrożeń toksykologicznych.

Informacje te są istotne zarówno dla analityków wykonujących badania, jak i ekspertów (toksykologów i lekarzy medycyny sądowej), których zadaniem jest odpowiednia dla celów sądowych interpretacja wyników badań. Najbogatszym źródłem wiedzy są oczywiście uniwersyteckie zasoby biblioteczne zapewniające dostęp on-line do międzynarodowych baz publikacji naukowych (tab. 239-1).

Tabela 239-1. Największe instytucje oraz podmioty gospodarcze zajmujące się m.in. gromadzeniem i udostępnieniem naukowej informacji medycznej.

NCBI - National Center for Biotechnology Information z bazami podrzędnymi: PubMed oraz PUBChem Substance

National Library of Medicine - największa na świecie biblioteka medyczna prowadzona przez rząd federalny Stanów Zjednoczonych

Elsevier, Wiley oraz Springer - wielkie, ogólnoświatowe wydawnictwa naukowe, ale zarazem firmy zajmujące się analizą i udostępnianiem danych oraz informacji naukowych

Popularne wyszukiwarki internetowe, wśród których dominuje Google (ok. 90% udziałów w światowym rynku wyszukiwarek), ale także inne, np. Bing i Yahoo!, są dużym ułatwieniem w wyszukiwaniu publikacji o tematyce toksykologicznej, ale jednocześnie zasypują zbędnymi linkami, często na pierwszy plan wybijają się strony z popularyzatorskimi artykułami o niskiej (lub wręcz fałszywej) wartości merytorycznej. Wyszukiwarki mogą pomijać znaczny zasób danych z uwagi na ustawicznie prowadzoną personalizację preferencji osób korzystających z Internetu.

Przy opracowywaniu chromatogramów GC/MS i LC/MS bardzo pomocne są dostępne nieodpłatnie internetowe bazy widm masowych z możliwością porównywania on-line własnych widm (tab. 239-2).

Tabela 239-2. Dostępne nieodpłatnie on-line internetowe bazy widm masowych oraz programy obsługi widm.

mzCloud (www.mzcloud.org), ok. 3,5 tys. związków w ok. 700 tys. widm ESI (+/-) od MS1 do MS8. Zawiera widma konkretnej fragmentacji MSn, drzewa fragmentacji, struktury związków, dane m/z i nazwy związków. Dużym ułatwieniem są dostępne aplikacje bazy na systemy smartfonów (Android oraz iOS)

MassBank (massbank.eu/MassBank/), najstarsze publiczne repozytorium ponad 50 tys. widm masowych małych związków chemicznych (< 3000 Da) istotnych dla nauk przyrodniczych od MS1 do MS8, przy różnych rodzajach analizatorów oraz typów jonizacji

SWGDrug (www.swgdrug.org), strona internetowa naukowej grupy roboczej zajmującej się nielegalnymi narkotykami, SWGDRUG (Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs)

CFM-ID (cfmid.wishartlab.com), serwer sieciowy dokonujący automatycznej identyfikacji metabolitów w tandemowych widmach masowych (MS/MS) poprzez wskazywanie pików znanych struktur chemicznych, prognozowanie widm dla danej (znanej) struktury chemicznej oraz modelowanie możliwych struktur chemicznych dla danego widma (ryc. 239-2). Narzędzie przydatne szczególnie w badaniach metabolomicznych

METLIN (metlin.scripps.edu), ogólnodostępna baza danych ułatwiająca identyfikację metabolitów. Zawiera dane ponad pół miliona znanych struktur chemicznych skorelowanych z katalogiem widm (z jonizacją dodatnią i ujemną, przy różnych energiach kolizji) w wysokiej rozdzielczości z transformatą Fouriera (FTMS), tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) oraz danymi LC/MS. Dostępna także w wersji mobilnej (METLIN Mobile)

Na stronie SWGDrug dostępna jest bezpłatnie biblioteka SWGDRUG obsługiwana przez program NIST MSSEARCH, który także jest dostępny bezpłatnie on-line. Ponadto biblioteka została przekonwertowana na różne formaty sprzętowe. Na stronie www dostępne też są liczne monografie substancji psychoaktywnych opracowane z wykorzystaniem strukturalnie potwierdzonych materiałów referencyjnych oraz linki do monografii autoryzowanych przez CFSRE (Forensic Drug Review and the Center for Forensic Science Research and Education).

Wśród popularnych i wysoko ocenianych przez toksykologów sądowych pozycji książkowych są: systematycznie aktualizowany podręcznik "Clarke's isolation and identification of drugs" (Pharmaceutical Press) oraz "Clarke's isolation and identification of drugs: in pharmaceuticals, body fluids and post mortem material". Szczególnie istotne są zawarte tam informacje o stężeniach terapeutycznych, toksycznych i śmiertelnych, a także okresy biologicznego półtrwania związków toksycznych, często notowanych w praktyce medyczno-sądowej. Informacji o stężeniach terapeutycznych/toksycznych/śmiertelnych we krwi lub surowicy krwi dostarczają różne zestawienia opublikowane w piśmiennictwie toksykologicznym, niektóre są dostępne on-line jako pliki typu pdf. Interpretacji stężeń we krwi nowych substancji psychoaktywnych (NSP) można natomiast dokonać na podstawie publikowanych danych kazuistycznych, które są dostępne w bazach publikacji naukowych (tab. 239-1).

Interpretacja wyników badań toksykologicznych powinna być dokonywana na podstawie aktualnej wiedzy o mechanizmie działania toksycznego, toksodynamice, metabolizmie i toksokinetyce wykrytego związku chemicznego.

Przy ocenie działania NSP na organizm człowieka źródłem informacji mogą też być różne nieoficjalne fora internetowe (http://wolnamolekula.info/pl/przeglad-polskich-serwisow-o-narkotykach/), zwłaszcza że zawarte tam samoobserwacje są niekiedy wykorzystywane w publikacjach naukowych. Mimo potocznego języka wagę tych informacji można ocenić jako istotną dla medyków sądowych, bowiem pochodzą zwykle od co najmniej kilku-kilkunastu różnych osób, a podawane przez nie oceny skutków działania na OUN nawiązują do wcześniejszych eksperymentów z innymi NSP.

W niektórych przypadkach należy ocenić prawdopodobieństwo wystąpienia interakcji między lekami lub innymi związkami toksycznymi lub aktywnymi biologicznie. Oprócz publikacji naukowych dobrym źródłem tych informacji są karty charakterystyki produktu leczniczego dostępne na stronie internetowej Urzędu Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych (http://pub.rejestrymedyczne.csioz.gov.pl/).

Bardzo wygodnymi narzędziami sprawdzającymi możliwość wytępienia interakcji są internetowe bazy danych (tab. 239-3).

Tabela 239-3. Dostępne nieodpłatnie on-line internetowe bazy danych interakcji między lekami i różnymi związkami toksycznymi.

Drug Interactions Checker (www.drugs.com/drug_interactions.html), bardzo wygodne narzędzie sprawdzające możliwość wystąpienia interakcji

MedScape Drug Interactions Checker

(reference.medscape.com/drug-interactionchecker). Strona główna MedScape (medscape.com/) zawiera wiele innych przydatnych informacji oraz narzędzi ułatwiających pracę toksykologa, m.in. identyfikator tabletek (reference.medscape.com/pill-identifier).

Bibliografia

1. Allen F., Pon A., Wilson M. i wsp.: CFM-ID: a web server for annotation, spectrum prediction and metabolite identification from tandem mass spectra. Nucleic Acids Res., 2014,42 (Web Server Issue): W94-W99. https://academic.oup.com/nar/article/42/W1/W94/2437594 [dostęp 03.09.2020].

2. Moffatt A.C., Osselton M.D., Widdop B., Watts J.: Clarke's analysis of drugs and poisons. Pharmaceutical Press, London 2011.

3. Clarke E.G.C., Moffat A.C.: Clarke's isolation and identification of drugs in pharmaceuticals, body fluids and post mortem material. Pharmaceutical Press, London 1986.

4. Grifell M., Ventura M., Carbón X. i wsp.: Patterns of use and toxicity of new para-halogenated substituted cathinones: 4-CMC (clephedrone), 4-CEC (4-chloroethcatinone) and 4-BMC (brephedrone). Hum. Psychopharmacol., 2017, 32: 2621.

5. Horai H., Arita M., Kanaya S. i wsp.: MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J. Mass. Spectrom., 2010, 45: 703-714.

6. Molina D.K. Handbook of forensic toxicology for medical examiners. CRC Press, Boca Raton 2010.

7. Schulz M., Schmoldt A.: Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. Pharmazie, 2003, 58: 447-474.

8. Smith C., O'Maille G., Want E.J. i wsp.: METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit., 2005, 27: 747-751.

9. Tautenhahn R., Cho K., Uritboonthai W. i wsp.: An accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database. Nat. Biotechnol., 2012, 30: 826-828.

10. The International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT): Reference blood level list of therapeutic and toxic substances. 2004 (dokument usunięty ze strony www TIAFT, dostęp 03.09.2020 przez https://iweb3.fnusa.cz/wp-content/uploads/therap_tox_levels.pdf).

11. Winek C.L., Wahba W.W., Winek C.L. Jr., Balzer T.W.: Drug & chemical blood-level data 2001. Forensic Sci. Int., 2001, 122: 107-123.

240Skutki niewłaściwego zabezpieczenia materiału do badań toksykologicznychGrzegorz Buszewicz

Zabezpieczenie materiału biologicznego niezgodne z zasadami obowiązującymi w diagnostyce toksykologicznej (patrz 057) może doprowadzić do endogennego formowania niektórych związków mających znaczenie toksykologiczne oraz powstawania niektórych markerów zaburzeń metabolicznych, np. etanolu, acetonu, cyjanowodoru czy siarkowodoru (patrz 244). Należy wówczas liczyć się z wynikami fałszywie pozytywnymi. Istnieje także ryzyko uzyskania wyniku fałszywie ujemnego. Może bowiem dojść do zaniku lotnego ksenobiotyku (alkohole, cyjanowodór) wskutek parowania i dyfuzji lub do eliminacji, ewentualnie rozkładu przy udziale drobnoustrojów oraz enzymów autolitycznych. Konsekwencją niewłaściwego zabezpieczenia materiału może być próba podważenia wiarygodności uzyskanych wyników badań, zarówno tych dodatnich, jak i ujemnych, lub (co może być groźniejsze w skutkach) wprowadzenie w błąd organów stosowania prawa: policji, prokuratur, sądów (ryc. 240-1).

Biorąc pod uwagę możliwe konsekwencje prawne niewłaściwe zabezpieczenie materiału do badań toksykologicznych należy traktować jako błąd w sztuce diagnostycznej.

Najczęściej spotykane błędy w zabezpieczeniu to:

- w przypadku analiz w kierunku lotnych związków toksycznych (także w kierunku etanolu) umieszczanie próbek w:

- nieszczelnych fiolkach;

- fiolkach lub pojemnikach o zbyt dużej objętości w porównaniu z objętością próbki;

- przechowywanie w temperaturze pokojowej;

- umieszczanie próbek w fiolkach lub pojemnikach, które nie były fabrycznie nowe (używanych);

- umieszczanie w jednym pojemniku wycinków z różnych narządów (np. żołądka, wątroby, mózgu i nerki);

- utrwalanie wycinków narządów wewnętrznych w roztworze formaliny;

- niezamrożenie w co najmniej -20°C próbki krwi w przypadku podejrzenia intoksykacji kokainą.

Istotnym problemem jest sposób zabezpieczania i przekazywania do badań materiału biologicznego pobranego podczas sądowo-lekarskich sekcji zwłok wówczas, gdy laboratorium toksykologiczne znajduje się poza zakładem, w którym wykonano sekcję zwłok (w odległym miejscu). Nieprzestrzeganie odpowiednich zasad (tab. 240-1) obowiązujących w tej kwestii także może doprowadzić do podważenia wiarygodności uzyskanych wyników badań.

Tabela 240-1. Zasady zabezpieczania materiału biologicznego przeznaczonego do transportu.

1

Próbki krwi, które będą badane w kierunku substancji lotnych, w tym etanolu, należy pobrać metodą próżniową wprost z żyły za pomocą tzw. zestawu kryminalistycznego zawierającego konserwant - przeciwutleniacz. Niedopuszczalne jest pobieranie krwi do zwykłej fiolki polipropylenowej z tzw. wciskanym korkiem - tak można postępować wyłącznie wówczas, gdy badania toksykologiczne wykonywane są niezwłocznie w tej samej jednostce - zakładzie, w którym wykonano sekcję zwłok

2

W trakcie sekcji zwłok należy zabezpieczyć tzw. rezerwę analityczną, np. zgodnie z opublikowanymi wytycznymi PTMSiK (patrz 054), i przechowywać ją w stanie zamrożonym do czasu podjęcia stosownej decyzji przez prokuraturę co do zlecenia badań toksykologicznych lub odstąpienia od nich. Krew przeznaczoną do badań w kierunku alkoholu oraz środków działających podobnie do alkoholu należy przechowywać w kontrolowanej lodówce zamykanej na klucz

3

Materiał dowodowy biologiczny przed wysyłką do oddalonego laboratorium toksykologicznego należy zamrozić, a następnie umieścić w styropianowym opakowaniu z wkładami chłodzącymi lub suchym lodem (zestalony dwutlenek węgla o temperaturze sublimacji -78,5°C)

4

Materiały dowodowe należy przesyłać tzw. pocztą specjalną policji. Wysyłanie próbek zwykłą pocztą (tzw. poleconą) lub zwykłym kurierem jest równoznaczne z powierzeniem materiału dowodowego nieupoważnionym osobom "drugim"

Bibliografia

1. Stimpfl T., Mueller K., Gergov M. i wsp.: Recommendations on sample collection for systematic toxicological analysis. Bulletin of the International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT), 2009. http://www.tiaft.org/data/uploads/documents/tiaft-sta-recommendations-on-sample-collection.pdf [dostęp 06.02.2020].

2. Berent J.: Zalecenia Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii w sprawie pobierania materiału sekcyjnego do badań toksykologicznych. Prokuratura i Prawo, 2012, 11: 155-161.

3. Anderson S.G., Allender W., Moynham A.F. i wsp.: The effects of storage on the accuracy of blood alcohol readings. International Conference on Alcohol, Drugs and Traffic Safety (ICADTS), Glasgow 2004.

4. Mandić-Radić S., Džingalašević G., Luković N.: Stability of ethanol in blood and urine samples. JMB, 2007, 26: 241-244.

241Techniki instrumentalne i metody analityczne w toksykologii sądowejGrzegorz Buszewicz

Toksykologia sądowa, jako dziedzina interdyscyplinarna i jednocześnie nauka stosowana, korzysta z zasobów chemii analitycznej, przede wszystkim w zakresie analityki stosowanej - medyczno-biologicznej (ryc. 241-1), będącej źródłem podstaw technicznych (zastosowań aparaturowych), oraz z zasobów dziedziny diagnostyki laboratoryjnej - laboratoryjnej toksykologii sądowej, która wskazuje jak wykorzystać techniki instrumentalne i metody analityczne w praktyce, dla potrzeb organów stosowania prawa.

Jeszcze pod koniec ubiegłego wieku w laboratoriach toksykologicznych szeroko stosowano tzw. klasyczne techniki: spektrofotometryczne, chromatografię cienkowarstwową, a nawet miareczkowanie. Za wyjątkiem spektrofotometrii są to techniki manualne, wykorzystujące proste narzędzia laboratoryjne, a rolę detektora spełnia narząd wzroku analityka. Ich zaletami są prostota wykonania, dostępność i niskie koszty, dlatego dotąd w niektórych laboratoriach znajdują zastosowania do oznaczeń makroskładników (np. w badaniach dowodów rzeczowych). W użyciu są też nowoczesne techniki manualne - immunochemiczne testy "paskowe" (patrz 237), lecz ich celem jest jedynie ukierunkowanie właściwych badań dowodowych, instrumentalnych. Taki sam ograniczony cel mają analizy instrumentalne - immunochemiczne, które wymagają wsparcia specjalistycznej aparatury: spektrofotometrów, dedykowanych czytników lub czytników wielodetektorowych (ryc. 241-2). Zaletą technik immunochemicznych jest możliwość wykonania wstępnych oznaczeń w nieobrobionym materiale biologicznym. Ich przydatność do celów dowodowych (sądowych) jest jednak ograniczona, dlatego interpretacji wyników uzyskanych tymi technikami zawsze powinien dokonać specjalista w zakresie laboratoryjnej toksykologii sądowej (patrz 237).

Analit - składnik próbki podlegający oznaczaniu (izolacji z matrycy biologicznej, rozdziałowi chromatograficznemu, wykryciu, identyfikacji oraz określeniu stężenia w próbce).Technika analityczna (analytical technique) - zespół metod analitycznych wykorzystujących to samo zjawisko fizyczne (np. atomowa spektrometria absorpcyjna).Metoda analityczna (analytical method) - konkretny sposób oznaczania określonego analitu w określonej matrycy za pomocą danej techniki z wykorzystaniem określonego postępowania (np. metoda potencjometryczna, metoda spektrofotometryczna).Procedura (metodyka) analityczna (analytical procedure) - szczegółowy sposób postępowania, uwzględniający m.in. używane stężenia i objętości odczynników, szczegółowe warunki pobierania próbek, sporządzanie wykresu analitycznego itp. Analiza i oznaczanie to nie synonimy - oznaczanie to zazwyczaj ostatni etap analizy.

Techniki instrumentalne - dowodowe oznaczania trucizn o budowie organicznej bazują na chromatografii: gazowej (gas chromatography, GC) oraz cieczowej (liquid chromatography, LC) wysokosprawnej (lub wysokociśnieniowej - high pressure/high performance liquid chromatography, HPLC) ewentualnie ultra-wysokosprawnej (lub ultra-wysokociśnieniowej - ultra high pressure/ultra high performance liquid chromatography, UHPLC). Rozdział chromatograficzny ekstraktu uzyskanego w efekcie etapu izolacji ksenobiotyków z materiału biologicznego, LLE lub SPE (patrz 236), przed etapem detekcji jest konieczny, gdyż ekstrakty zawierają wiele substancji, które zakłócają etap detekcji, zwłaszcza wówczas, gdy rodzaj detektora nie pozwala na selektywny wybór sygnału detekcji, ukierunkowanego na jeden związek chemiczny.

Chromatografia to technika rozdziału mieszaniny związków chemicznych (eluatów) zachodząca w trakcie ich migracji wraz z fazą ruchomą (eluentem: gazem, cieczą) przez fazę stacjonarną (fazę rozdzielczą, którą najczęściej jest powierzchniowo zmodyfikowane ciało stałe). W chromatografii kolumnowej (GC lub LC) faza stacjonarna mająca zdolność do adsorbowania lub innego nietrwałego wiązania związków chemicznych jest umieszczona w kolumnie, która ma postać rury lub kapilary. W LC próbka (ekstrakt) jest dozowana w postaci roztworu za pomocą zaworu przełączającego z pętlą dozującą. Podczas przepływu eluentu przez fazę rozdzielczą następuje proces selektywnego uwalniania (wypłukiwania) zatrzymywanych z różną siłą substancji, dzięki czemu dochodzi do ich separacji (ryc. 241-3). Czas migracji danego składnika przez kolumnę określany jest mianem czas retencji (retention time, RT). W GC fazą ruchomą jest gaz obojętny (hel, wodór, argon, azot). Próbka ciekła lub w postaci roztworu ciała stałego zostaje wstrzyknięta do dozownika chromatografu, gdzie jest podgrzewana powyżej temperatury wrzenia i dalej już w postaci gazowej dostaje się do strumienia fazy ruchomej. W metodzie headspace jeszcze przed nastrzykiem próbka jest podgrzewana w termostacie podajnika próbek (autosamplera headspace) do osiągnięcia równowagi ciśnienia parcjalnego par w fazie nadpowierzchniowej, a do dozownika wstrzykiwana jest od razu w postaci pary.

Współczesne chromatografy GC, HPLC/UHPLC to aparatura analityczna zintegrowana z różnymi detektorami, automatycznymi podajnikami do nastrzyku próbek (autosamplerami) i sterownikami komputerowymi z oprogramowaniem do przetwarzania danych (chromatogramów). To uniwersalne urządzenia analityczne, które można skonfigurować w zależności od potrzeb przez dobór autosamplera i detektora.

Chromatografy gazowe dla potrzeb toksykologii sądowej najczęściej konfigurowane są w dwa typowe zestawy: 1 - z przystawką do analizy fazy nadpowierzchniowej (headspace, HS) z różnymi typami detektorów.; 2 - do próbek ciekłych. GC można też skonfigurować w postaci uniwersalnej (ryc. 241-4).

Konfiguracja 1: GC z autosamplerem do analizy fazy nadpowierzchniowej i detektorem:

- płomieniowo-jonizacyjnym - FID (flame ionization detector) z przeznaczeniem do analiz w kierunku alkoholu etylowego i lotnych związków chemicznych, pochodnych węglowodorów (ryc. 241-5);

- tlenowym płomieniowo-jonizacyjnym - O-FID (oxygenate flame ionization detector) do analiz w kierunku tlenku węgla (patrz 282 - ryc. 282-3);

- azotowo-fosforowym NPD (nitrogen-phosphorus detector) z przeznaczeniem do analiz w kierunku cyjanowodoru.

Konfiguracja 2: GC z autosamplerem do próbek ciekłych i detektorem:

- FID - do analiz w kierunku glikoli (głównie glikolu etylenowego);

- spektralno-masowym MS - z analizatorem mas typu pojedynczy kwadrupol, potrójny liniowy kwadrupol lub analizatorem mas pułapkowym (patrz ryc. 241-9) z jonizacją elektronową, EI lub chemiczną, CI - do analiz obejmujących związki organiczne, wysokowrzące (leki, narkotyki, pestycydy itp.), zarówno wielokierunkowych, jak i ukierunkowanych, ilościowych i jakościowych.

Automatyczne zmieniacze próbek do analiz fazy nadpowierzchniowej - autosamplery headspace, są szczególnie przydatne do oznaczeń w materiale biologicznym alkoholu etylowego (patrz 252) oraz innych lotnych związków chemicznych. Próbka materiału jest dozowana do szczelnej fiolki i podgrzewana do osiągnięcia stanu stacjonarnego prężności par analizowanego związku w fazie nadpowierzchniowej, a następnie ściśle określona porcja par jest wprowadzana do kolumny przez dozownik chromatografu (ryc. 241-6).

W detektorze FID (patrz ryc. 241-5) znajduje się palnik wodorowo-powietrzny, do którego wpływa faza ruchoma z kolumny chromatograficznej. Analizowane związki ulegają spaleniu w płomieniu wodorowym, który jest otoczony biegunem elektrody zbiorczej z przyłączonym potencjałem elektrycznym. Drugim biegunem - elektrodą polaryzującą, może być dysza palnika lub osobna elektroda. Jony powstające podczas spalania próbki zwiększają natężenie prądu płynącego przez płomień, a wielkość prądu jest proporcjonalna do stężenia substancji w analizowanej próbce. W detektorze O-FID przed dyszą palnika znajduje się rurka katalityczna pokryta tlenkiem niklu, która w temperaturze 330-350°C w obecności wodoru katalizuje przemianę tlenku węgla w metan, znacznie zwiększając wykrywalność CO (patrz 282 - ryc. 282-3). W bezpłomieniowych detektorach NPD nad dyszą znajduje się katalizator w postaci ogrzewanego ceramicznego źródła jonów metali alkalicznych (np. chlorek rubidu lub cezu). W temperaturze 600-800°C na powierzchni katalizatora formuje się warstwa plazmy z ujemnymi jonami (np. CN-, PO-, PO2-, PO3-), zwiększając czułość detekcji związków azotu i fosforu.

Chromatografy cieczowe HPLC/UHPLC dla potrzeb toksykologii sądowej najczęściej konfigurowane są w dwa rodzaje w zależności od rodzaju detektora:

- z detektorami z matrycą diodową (ryc. 241-7), DAD/PDA (diode array detector/photodiode array detector), które umożliwiają równoczesną rejestrację całego widma UV-Vis eluatu; tego typu detektory mają znacznie mniejszą selektywność i czułość w porównaniu z detektorami opartymi na spektroskopii mas, dlatego znajduje zastosowanie głównie w diagnostyce zatruć śmiertelnych lekami;

- z detektorami spektralno-masowymi MS (pojedynczy kwadrupol, potrójny liniowy kwadrupol, pułapkowy, wysokorozdzielczy) z jonizacją przez elektrorozpylanie, ESI lub chemiczną w ciśnieniu atmosferycznym, APCI - do analiz obejmujących związki organiczne, wysokowrzące (leki, narkotyki, pestycydy itp.), zarówno wielokierunkowych, jak i ukierunkowanych, ilościowych i jakościowych.

HPLC/UHPLC zawsze wyposażone są w układ odgazowywania fazy ruchomej (tzw. degazer), gdyż powietrze rozpuszczone w składnikach fazy zakłóca rozdział, może niekorzystnie wpływać na złoże kolumny, a rozprężając się powoduje powstawanie bąbelków, które zakłócają detekcję. Istotnym elementem jest układ kontrolujący mieszanie składników fazy (tzw. gradient-mikser). Odpowiednio dobierając bufor i rozpuszczalnik oraz zmianę proporcji tych składników w przebiegu rozdziału (gradient rozpuszczalnika w buforze) uzyskuje się optymalne warunki rozdziału, czyli krótki czas elucji oraz odpowiednią separację analitów. Najczęściej stosowanymi rozpuszczalnikami są acetonitryl, metanol oraz izopropanol.

Detektory DAD/PDA (ryc. 241-8) oparte są na analizie widma światła UV/Vis - bliskie IR (zakres długości fal ok. 190-800 nm) przechodzącego przez strumień fazy ruchomej w celi pomiarowej. Wykrywane są maksima absorpcji światła w analizowanym zakresie długości fal. Widma UV-Vis są mało charakterystyczne, dlatego bardzo ważny jest odpowiedni dobór kolumny i fazy ruchomej zapewniający efektywny rozdział chromatograficzny poszczególnych ksenobiotyków. W chromatografii HPLC/UHPLC z detekcją DAD/PDA najczęściej stosowana jest faza ruchoma składająca się z buforu fosforanowego i acetonitrylu.

Detektory masowe (MS) zarówno sprzężone z chromatografami gazowymi (GC/MS), jak i z cieczowymi (LC/MS) rejestrują zależność prądu jonowego od masy jonów pochodzących z analizowanych substancji. Cząsteczki analitów na wstępie poddawane są jonizacji w komorze jonizacyjnej, tzw. źródle jonów, gdyż tylko w formie zjonizowanej można je utrzymać w polu elektromagnetycznym. Następnie w analizatorze mas określana jest wielkość ich mas molekularnych w stosunku do ładunku elektrycznego, czyli ustalana jest wielkość parametru m/z. Na trzecim etapie, detekcji w fotopowielaczu, zliczana jest liczba tych jonów w postaci generowanego prądu jonowego (ryc. 241-9). Prąd generowany przez wszystkie jony wpadające do fotopowielacza to całkowity prąd jonowy (total ion current, TIC), zaś widmo wszystkich mas w szerokim zakresie m/z (od wybranego minimum do maksimum) określane jest mianem full-scan. Sygnał (prąd) generowany przez jeden wybrany jon określany jest skrótem SIS (selected ion signal) lub SIM (selected ion monitoring).

Stosowane są różne sposoby jonizacji, poprzez zderzanie lub oddziaływanie:

- z elektronami:

- w detektorach sprzężonych z chromatografami gazowymi GC/MS - jonizacja elektronowa (electron ionization, EI);

- w detektorach sprzężonych z chromatografami cieczowymi LC/MS - jonizacja przez elektrorozpylanie (electrospray ionization, ESI spray);

- z cząsteczkami gazu, tzw. jonizacja chemiczna:

- w GC/MS - CI (chemical ionization);

- w LC/MS - APCI (atmospheric pressure chemical ionization).

Jony analizowanych substancji płynąc za polem elektromagnetycznym poprzez tzw. optykę jonową dostają się do analizatora mas pracującego w wysokiej próżni. Utrzymanie wysokiej próżni jest konieczne, gdyż jony zderzając się z cząsteczkami powietrza natychmiast uległyby rozładowaniu. Stosowane są analizatory o różnej budowie. W toksykologii wykorzystuje się przede wszystkim spektrometry tandemowe z analizatorami:

- pułapkowymi - starszej generacji trójwymiarowe (3D ion trap, 3D IT) oraz nowszej generacji liniowe (2D line ion trap, 2D LIT, ryc. 241-10);

- typu potrójny liniowy kwadrupol (triple-quad, tQ, ryc. 241-11);

- czasu przelotu z kwadrupolem (quadrupole time of flight, Q-TOF, ryc. 241-12);

- typu potrójny liniowy kwadrupol z pułapką liniową (Q-trap);

- czasu przelotu z kwadrupolową pułapką liniową (Q-trap-TOF).

Po przejściu przez analizator mas wyselekcjonowane jony lub ich fragmenty uderzają w wewnętrzną powierzchnię powielacza elektronów (fotopowielacza), gdzie każdy pojedynczy jon wybija ściśle określoną liczbę elektronów. Wiązka wyemitowanych elektronów uderza w następną część (kaskadę) powielacza, a energia kinetyczna każdego z elektronów powoduje wybicie kilkunastu elektronów z następnej płytki powielacza. W efekcie powstaje prąd elektryczny, proporcjonalny do energii danego jonu (m/z), który jest rejestrowany w funkcji czasu. Fragmentacja cząsteczki danego związku organicznego tworzy charakterystyczne dla niej widmo fragmentacyjne.

Spektrometry wyposażone w analizatory z pułapką jonową (LIT, Q-trap) dzięki dużej szybkości skanowania i wysokiej czułości trybu full-scan w jednej analizie mogą wykryć teoretycznie nawet kilka tysięcy różnych związków. Mają więc zastosowanie przede wszystkim do analizy szerokozakresowej. Istnieje jednak możliwość nakładania się na jony poszukiwanych związków jonów pochodzących z fragmentacji substancji tła, zwłaszcza gdy badany materiał biologiczny uległ silnemu rozkładowi gnilnemu, dlatego obecność ksenobiotyku należy potwierdzić za pomocą analizy fragmentów potomnych MS/MS. Z wykorzystaniem spektrometrów pułapkowych można wykonać wielokrotną fragmentację wybranych jonów potomnych, co zwiększa pewność identyfikacji wykrytego związku. Nowsze wersje spektrometrów LIT mają dobrą czułość oraz liniowość oznaczeń w trybie XIC (eXtacted Ion Chromatogram, czyli ekstrakcja post hoc sygnału wybranego jonu z chromatogramu full-scan), lecz w ukierunkowanej analizie ilościowej nie dorównują spektrometrom triple-quad.

Spektrometrami typu triple-quad wykonywane są analizy wybranych reakcji fragmentacji jonów prekursorowych do jonów potomnych, tzw. przejść jonowych poprzez monitorowanie fragmentacji wybranych jonów: fragmentacji pojedynczych (selected reaction monitoring, SRM) lub następczych - wielokrotnych (multiple reaction monitoring, MRM), co w teorii eliminuje zakłócający wpływ tła na wyniki oznaczeń. Spektrometry typu triple-quad charakteryzują się najwyższą czułością oznaczeń wybranych związków oraz bardzo dobrą liniowością sygnału detekcji, lecz musi być znane widmo fragmentacyjne, co w praktyce wiąże się z koniecznością przeprowadzenia optymalizacji pracy spektrometru z użyciem wzorca analitycznego. W porównaniu ze spektrometrami pułapkowymi LIT wykonanie badań nieukierunkowanych tego typu aparaturą jest utrudnione z powodu mniejszej czułości pracy w trybie full-scan. Jest jednak możliwe przeprowadzenie badań wielocelowanych, lecz należy znać dokładne parametry rozdziału chromatograficznego (tzw. okna detekcji), a dla większości urządzeń tego typu należy wykonać co najmniej kilka analiz badanego materiału.

Spektrometry typu Q-TOF, Orbitrap, Q-trap-TOF o dużej dokładności pomiaru mas, znacznie dokładniejszej od LIT i triple-quad, szczególnie dobrze nadają się do analiz, w których należy zidentyfikować strukturę chemiczną ksenobiotyku dotąd nieznanego w praktyce toksykologicznej, np. nowej substancji psychoaktywnej - NSP (ryc. 241-13).

Rosnące wymagania stawiane toksykologii sądowej, np. przez pojawiające się nowe substancje psychoaktywne (NSP), postęp wiedzy w dziedzinie diagnostyki opartej na analizie śladowych stężeń, np. dotyczący markerów przebytej intoksykacji czy adduktów DNA, oraz dowodowy charakter badań toksykologiczno-sądowych powiązany z regulacjami prawnymi (patrz 275), np. w zakresie odróżniania "stanu po użyciu" i "stanu pod wpływem" środka psychoaktywnego (także w chwili śmierci), wymusza stosowanie instrumentalnych technik analitycznych, które powinny spełniać następujące kryteria:

- wysoka selektywność - specyficzność względem jednego lub grupy związków chemicznych, np. w spektrometrii mas spektrometry wysokiej rozdzielczości typu HR (high resolution; TOF, ICR, FT-ICR i Orbitrap);

- szeroki zakres detekcji - zdolność do wykrywania różnych ksenobiotyków, np. w spektrometrii mas spektrometry tandemowe, pułapkowe o dużej czułości i szybkości skanowania w szerokim zakresie mas;

- wysoka czułość - zapewniająca odpowiednią wykrywalność, np. spektrometry tandemowe typu potrójny liniowy kwadrupol;

- powtarzalność i liniowość - zapewniające dokładność i odpowiednią precyzję oznaczeń, np. potrójny liniowy kwadrupol.

Z powodów technicznych wymogi te najczęściej są przeciwstawne. Jak dotąd nie istnieją w pełni uniwersalne spektrometry mas spełniające w zadowalający sposób wszystkie powyższe wymagania (ryc. 241-14). Nowszej generacji tandemowe spektrometry mas łączą co najwyżej 2 zalety, dlatego w praktyce stosuje się kilka metod instrumentalnych (minimum 2), które pokrywają kryteria specyficzności, szerokiego zakresu detekcji oraz czułości.

Instrumentalne badania dowodowe materiału biologicznego w kierunku toksycznych związków metali oraz metaloidów wymagają zastosowania analizy elementarnej. Wykonywane są z użyciem technik spektrometrii atomowej: absorpcyjnej oraz emisyjnej.

Atomowa spektrometria absorpcyjna, AAS (atomic absorption spectrometry), opiera się na zjawisku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez swobodne atomy, która jest wynikiem przejść elektronów walencyjnych między określonymi poziomami energetycznymi. Do oznaczeń metali i metaloidów wykorzystuje się ilościową zależność między tymi przejściami elektronowymi, a ich zbiór stanowi charakterystyczne dla danego pierwiastka widmo atomowe (widmo liniowe). Długość absorbowanej fali jest charakterystyczna dla danego pierwiastka. Dzięki temu istnieje możliwość selektywnego oznaczania wielu pierwiastków zawartych w próbce w sposób niezależny od siebie.

Spektrometry AAS składają się z następujących elementów (ryc. 241-15):

- źródło promieniowania - lampa emitująca promieniowanie o częstotliwości zgodnej z częstotliwością rezonansową oznaczanego pierwiastka:

- lampy z katodą wnękową jedno- i wielopierwiastkowe (hollow cathode lamp, HCL);

- bezelektrodowa lampa wyładowcza z generatorem częstości radiowej (electrodeless discharge lamp, EDL);

- modulator - urządzenie przypominające wiatraczek, które w krótkich interwałach (ułamkach sekundy) przesłania promieniowanie z lampy, co umożliwia pomiar emisji własnej atomizera i eliminację jej z sygnału detekcji;

- atomizer - w nim poprzez dostarczenie energii termicznej uzyskiwane są wolne atomy pochodzące z próbek analitycznych, o jak najmniejszym stopniu wzbudzenia i jonizacji (w stanie podstawowym);

- monochromator - eliminuje wpływ promieniowania własnego oraz usuwa linie rezonansowe z promieniowania emitowanego przez lampy z katodą wnękową;

- detektor (fotopowielacz);

- system sterowania pracą urządzenia oraz akwizycji i przetwarzania danych - komputer z oprogramowaniem.

W zależności od rodzaju atomizera dostępne są poniższe spektrometry AAS:

- Płomieniowe, F-AAS (flame atomic absorption spectrometry) - próbka w postaci roztworu jest zamieniana w nebulizatorze w aerozol i mieszana z gazem palnym (acetylen, acetylen/tlenek azotu, wodór, metan, propan-butan), a następnie spalana w palniku szczelinowym, gdzie w wysokiej temperaturze płomienia jest przeprowadzana w wolne atomy. Najczęściej używanym gazem jest acetylen zalecany do oznaczania: Mg, Ca, Sr, Cr, Mb, Mn, Tc, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Hg, Ga, In, Tl, Pb, Sb, Bi, a po dodaniu gazu utleniającego (tlenku azotu) także tych, które tworzą trwałe tlenki, np.: Ba, Al, B, Be, Si. W tej technice atomizacji wymagana próbka jest dość duża (ok. 500 ?l), płomień absorbuje część promieniowania emitowanego przez źródło, wydajność atomizacji wynosi ? 10%, podczas nebulizacji próbka ulega dużemu rozcieńczeniu (ok. 104), a atomy przebywają na drodze wiązki światła przez krótki czas (10-4 s), co ogranicza wykrywalność do wartości od 1 do kilku ppm.

- Bezpłomieniowe, elektrotermiczne, ET-AAS (electrothermal atomic absorption spectrometry) lub GF-AAS (graphite furnace atomic absorption spectrometry) - próbka stała lub ciekła jest przeprowadzana w wolne atomy w grafitowej kuwecie w kształcie rurki pokrytej grafitem pirolitycznym (piecu Massmanna), który zapobiega dyfuzji atomów do ścianek. Próbkę wprowadza się bezpośrednio do kuwety lub na płytce grafitowej (platformie Lwowa) w otoczce gazu obojętnego (najczęściej argonu). Źródło ciepła jest elektryczne (oporowe lub indukcyjne) i programowane. Pomiar odbywa się sekwencyjnie na etapach: odparowanie rozpuszczalnika - ok. 1 min, mineralizacja próbki (piroliza) - 10-50 s, atomizacja - kilka sekund, oraz wygrzewanie (czyszczenie kuwety) - kilka sekund w maksymalnej temperaturze. Atomizacji ulega jednocześnie cała próbka (wydajność 100%), swobodne atomy pozostają dłużej (w porównaniu z F-AAS) w obszarze wiązki światła, atomizacji ulegają trwałe termicznie tlenki, a objętość próbek ciekłych to 5-50 ?l.

- Wodorkowe, HG-AAS (hydride generation atomic absorption spectrometry) - wykorzystują zdolność tworzenia lotnych wodorków przez niektóre pierwiastki (As, Bi, Ge, Pb, Sb, Se, Sn, Te) w reakcji z silnymi substancjami redukującymi (np. z borowodorkiem sodu w środowisku kwaśnym), co prowadzi do uwolnienia ich z matrycy. Wodorki wypłukiwane są z mieszaniny reakcyjnej wodorem, wprowadzane do kwarcowej kuwety pomiarowej ogrzewanej (płomieniowo lub elektrycznie) do temperatury ok. 1000°C, gdzie ulegają atomizacji (rozpadowi na wolne atomy i gazowy wodór). HG-AAS zapewnia bardzo dobrą wykrywalność i jest szybka, a dzięki temu, że analizowana substancja jest wyodrębniana z matrycy, poziom szumów z tła jest bardzo niski.

- Z generowaniem zimnych par, CV-AAS (cold vapor atomic absorption spectrometry) - technika dedykowana do ilościowego oznaczania rtęci oraz kadmu, podobna do HG-AAS. Wykorzystywana jest zdolność tych metali do przechodzenia w postać gazową (par) w temperaturze 300 K. Tą techniką można wykryć Hg nawet w stężeniach rzędu ppt.

Spektrometrami absorpcji atomowej F-AAS oraz ET-AAS można oznaczać 68 pierwiastków, lecz w jednej analizie można oznaczyć tylko jeden. Tego ograniczenia jak dotąd nie udało się pokonać.

Techniki spektrometrii oparte na emisji atomowej (ICP) wykorzystają pomiar emitowanego promieniowania elektromagnetycznego (OES) lub zjonizowanych cząstek (MS):

- Spektrometria emisji optycznej ze wzbudzeniem w indukowanej plazmie, ICP-OES (inductively coupled plasma optical emission spectrometry) lub ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectrometry) - analizowana próbka jest wprowadzana do wysokotemperaturowej plazmy generowanej polem elektromagnetycznym o wysokiej częstotliwości, w której związki chemiczne rozpadają się do atomów, a następnie ulegają wzbudzeniu i emitują pochłoniętą energię w postaci promieniowania elektromagnetycznego charakterystycznego dla danego pierwiastka (ryc. 241-16).

- Spektrometria mas z plazmą wzbudzoną indukcyjnie, ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry) - analizowana próbka, jak w ICP-OES, przechodzi przez plazmę wzbudzoną indukcyjnie, a powstałe zjonizowane cząstki są rozdzielane w analizatorze mas (o różnej budowie), który przepuszcza do detektora (fotopowielacza) tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku elektrycznego (m/z).

Techniki ICP-OES/MS umożliwiają analizę wielopierwiastkową, ICP-OES wyposażone w polichromator pozwalają na jednoczesną detekcję wielu linii widmowych, teoretycznie do 70 pierwiastków.

Techniki AAS oraz ICP-ES/MS wymagają wyodrębniania trucizn nieorganicznych z materiału biologicznego. Wykonywane jest to poprzez mineralizację, która polega na eliminacji (zniszczeniu) substancji organicznych w wyniku utleniania przy jednoczesnym przeprowadzeniu trucizn metalicznych w postać jonową.

Typowy przebieg badania materiału biologicznego za pomocą metod AAS oraz ICP obejmuje:

- mineralizację i przeprowadzenie próbki w formę ciekłą (roztwór);

- przygotowanie roztworu niezawierającego mierzonego elementu (próbka tła);

- przygotowanie serii roztworów o znanych zawartościach analizowanego elementu (wzorców) do wyznaczenia krzywej kalibracji;

- pomiary prób tła i wzorców;

- wyznaczenie krzywych kalibracji;

- pomiary próbek badanych;

- odczyt z krzywych kalibracyjnych stężeń analizowanych elementów w badanych próbach.

Bibliografia

1. Agilent 6540 UHD Quadrupole Time-of-Flight Accurate-Mass Mass Spectrometer. Creative Proteomics. https://www.creative-proteomics.com/support/agilent-6540-uhd-quadrupole-time-of-flight-accurate-mass-mass-spectrometer.htm [dostęp 03.09.2020].

2. Ardrey R.E.: Liquid chromatography - mass spectrometry: an introduction. John Wiley & Sons, Chichester 2003.

3. Beaty R.D.: Podstawy, aparatura i metodyka atomowej spektrometrii absorpcyjnej. Perkin Elmer, Warszawa 1988.

4. Bidny S., Gago K., Chung P. i wsp.: Simultaneous screening and quantification of basic, neutral and acidic drugs in blood using UPLC-QTOF-MS. J. Anal. Toxicol., 2017, 41: 181-195.

5. Bogusz M.: Liquid chromatography/mass spectrometry in forensic toxicology. W: Advances in forensic applications of mass spectrometry (red. J. Yinon). CRC Press, Boca Raton 2004.

6. Bulska E., Krata A.: Instrumentalne metody spektralne stosowane w analizie próbek środowiskowych. Inżynieria Ekologiczna, 2014, 40: 228-238.

7. Bulska E., Pyrzyńska K. (red.): Spektrometria atomowa. Możliwości analityczne. Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2007.

8. Fu K., Bao Q., Zhou W., Yuanb S.: Simultaneous determination of N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide and N-methyl-2-pyrrolidone in textiles by RP-HPLC. Anal. Methods, 2016, 8: 2941-2946.

9. Groves C.M., Deanan J.R.: Forensic applications of gas chromatography. CRC Press, Boca Raton 2013.

10. Hou X., Jones B.T.: Inductively coupled plasma/optical emission spectrometry. W: Encyclopedia of analytical chemistry (red. R.A. Meyers). John Wiley & Sons, Chichester 2000; s. 9468-9485.

11. Jennings W., Mittlefeheldt E., Stremple P.: Analytical gas chromatography. Academic Press, Cambridge 1987.

12. Kałużna-Czaplińska J., Witkiewicz Z.: Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2019.

13. Kolb B., Ettre L.S.: Static headspace-gas chromatography theory and practice. Wiley VCH, New York-Toronto 1997.

14. McMaster M.: HPLC a practical user's guide. John Wiley & Sons, Chichester 2007.

15. Matusiewicz H.: Metoda generowania wodorków z zawiesin: zastosowanie w absorpcyjnej spektrometrii atomowej. http://www.pg.gda.pl/chem/CEEAM/Dokumenty/CEEAM_ksiazka_polska/Rozdzialy/rozdzial_015.pdf [dostęp 03.09.2020].

16. Matusiewicz H., Sturgeon R.E.: Chemical vapor generation with slurry sampling: a review of applications to atomic and mass spectrometry. Appl. Spectros. Rev., 2012, 47: 41-82.

17. NIH/NIGMS biomedical mass spectrometry resource. Mass Analyzers. https://msr.dom.wustl.edu/mass-analyzers/ [dostęp 03.09.2020].

18. Vatansever B., Lahrichi S.L., Thiocone A. i wsp.: Comparison between a linear ion trap and a triple quadruple MS in the sensitive detection of large peptides at femtomole amounts on column. J. Sep. Sci., 2010, 33: 2478-2488.

19. WASSON - ECE Instrumentation. Oxygenated Components in Gasoline by O-FID. Approved for determining oxygenates in gasoline and other motor fuels by ASTM D5599 and EN 1601. https://applications.wasson-ece.com/files/OFID.pdf [dostęp 03.09.2020].

20. Witkiewicz Z.: Podstawy chromatografii. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2005.

242Walidacja metod analitycznych w toksykologii sądowejSebastian Rojek

Metody analityczne stosowane w toksykologii sądowej muszą charakteryzować się najwyższą jakością, aby zapewnić wiarygodne (miarodajne) wyniki analiz. W celu zapewnienia prawidłowych wyników analitycznych wszystkie metody stosowane w dziedzinie toksykologii sądowej muszą być stale monitorowane poprzez ich walidację, a także wewnętrzną i zewnętrzną kontrolę jakości podczas rutynowych zastosowań. Na rycinie 242-1 przedstawiono środki zabezpieczenia wiarygodności wyników analitycznych, które powinny funkcjonować w każdym laboratorium toksykologii sądowej.

Walidacja metody - proces oceny metody (lub procedury) analitycznej w celu zapewnienia zgodności ze stawianymi tej metodzie wymogami, definiujący tę metodę oraz pozwalający określić jej przydatność.

Przed przystąpieniem do procesu walidacji analityk powinien określić podstawowe cechy metody analitycznej, takie jak:

- rodzaj oznaczanego analitu;

- stężenia w materiale biologicznym;

- możliwy zakres stężeń analitu;

- rodzaj matrycy biologicznej, w której oznaczany jest analit;

- obecność substancji przeszkadzających (interferentów);

- istnienie odgórnych regulacji i wymogów, którym powinna sprostać metoda analityczna;

- rodzaj oczekiwanej informacji - wynik analizy ilościowej czy jakościowej;

- wymagana wartość granicy wykrywalności i oznaczalności;

- oczekiwana i wymagana dokładność i precyzja;

- możliwość oznaczenia danego analitu z wykorzystaniem określonej lub dowolnej aparatury.

Matryca biologiczna - materiał pochodzenia ludzkiego, zwierzęcego (np. próbki krwi, moczu, wycinków narządów wewnętrznych, kości, włosów, paznokci) lub roślinnego (susz konopi, makowiny), w których dokonuje się oznaczenia określonej substancji w procesie analitycznym.

Standardy dotyczące walidacji metod analitycznych w odniesieniu do toksykologii sądowej odnaleźć można w wytycznych pochodzących z Amerykańskiej Agencji Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA), Europejskiej Agencji Leków (European Medicines Agency, EMA), Niemieckiego Towarzystwa Toksykologii i Chemii Sądowej (Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie, GTFCH) oraz Naukowej Grupy Roboczej ds. Toksykologii Sądowej (Scientific Working Group for Forensic Toxicology, SWGTOX). Wśród najważniejszych parametrów walidacyjnych wymienia się specyficzność i selektywność metody analitycznej, granice wykrywalności (limit of detection, LOD), granice oznaczalności (limit of quantitation, LOQ), zakresy liniowości (limit of linearity, LOL), precyzję, dokładność, a także ocenę stabilności oznaczanych analitów (tab. 242-1).

Tabela 242-1. Parametry walidacyjne metody bioanalitycznej i ich krótka charakterystyka.

Parametr walidacyjny

Charakterystyka

Specyficzność

Zdolność metody do jednoznacznego określenia analitu w obecności endogennych interferentów matrycy biologicznej (np. metoda analityczna pozwala na oznaczenie morfiny w próbce krwi w obecności białek, fosfolipidów czy soli)

Selektywność

Zdolność metody do rozróżnienia analitów o podobnej strukturze (np. metoda analityczna umożliwia oznaczenie morfiny w próbce krwi przy obecności w niej innych opioidów)

Granica wykrywalności (LOD)

Najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, która może być wykryta, za pomocą danej metody analitycznej z określonym prawdopodobieństwem

LOD = 3,3 × S/b

S - odchylenie standardowe s?lepej pro?bki

b - nachylenie prostej kalibracji

Granica oznaczalności (LOQ)

Najmniejsza ilos?c? (ste?z?enie) badanej substancji w pro?bce, jaka moz?e byc? oznaczona z odpowiednia? precyzja? (? 15-25% RSD) i dokładnos?cia? (80-120% rzeczywistego stężenia)

LOQ = 10 × S/b

S - odchylenie standardowe s?lepej pro?bki

b - nachylenie prostej kalibracji

Zakres liniowości (LOL)

Zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stężenia (zawartos?ci) substancji oznaczanej w pro?bce, w okres?lonym zakresie, zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax + b. Zalez?nos?c? mie?dzy zmiennymi charakteryzuje wspo?łczynnik korelacji r.

r > 0,98 (wartość akceptowalna w przypadku oznaczania s?lado?w)

Precyzja

Stopien? zgodnos?ci mie?dzy pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyniko?w), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezalez?nych oznaczen? jednorodnej pro?bki (ryc. 242-2). Najcze?s?ciej miara? precyzji jest odchylenie standardowe (S), wzgle?dne odchylenie standardowe (RSD) lub wspo?łczynnik zmiennos?ci (CV)

Dokładność (bias)

Zgodnos?c? mie?dzy wartos?cia? rzeczywista? (zawartos?cia?, ste?z?eniem) a wartos?cia? be?da?ca? wynikiem analizy. Miara? dokładnos?ci metody analitycznej jest wielkos?c? jej błe?du systematycznego. Metoda niedokładna moz?e byc? obarczona błe?dem systematycznym stałym (niezalez?nym od stężenia oznaczanego składnika) i zmiennym (zalez?nym od ste?z?enia oznaczanego składnika). Dokładnos?c? moz?e byc? przedstawiona jako procent odzysku:

(Xi - ? ) × 100%/?

Xi - wyznaczona ilość analitu w badanej pro?bce

? - znana ilos?c? analitu w badanej pro?bce

Szacowana jest przez analize? pro?bki o znanym ste?z?eniu (np. poprzez analizę CRM) i poro?wnanie wyniko?w uzyskanych walidowana? metoda? z wartos?cia? prawdziwa?

Stabilność

Ocena zachodzących zmian ilości analitu w trakcie przechowywania materiału biologicznego do badań toksykologicznych, a także w trakcie stosowanej do jego oznaczenia procedury analitycznej

Tabela 242-2. Wskazówki dotyczące przeprowadzania i oceny badań efektów matrycy w analizach LC-MS(-MS) (wg Matuszewskiego i wsp.).

Seria

Sposób przygotowania

1

Analiza próbki składającej się z czystego wzorca

2

Analiza próbek tej samej matrycy biologicznej pochodzącej z co najmniej 6 różnych źródeł, wolnych od analitu, które po ekstrakcji wzbogaca się dodatkiem określonej ilości wzorca

3

Analiza próbek tej samej matrycy biologicznej pochodzącej z co najmniej 6 różnych źródeł, wolnych od analitu, które przed ekstrakcją wzbogaca się dodatkiem określonej ilości wzorca

Im większa jest liczba parametrów walidacyjnych, tym więcej czasu potrzeba na przeprowadzenie procesu walidacji. Im bardziej restrykcyjny charakter mają przyjęte wartości graniczne (oczekiwane), tym częściej należy sprawdzać, kalibrować, czy wręcz rewalidować daną metodę analityczną. Nie zawsze istnieje konieczność przeprowadzania całego procesu walidacji metody analitycznej. Należy wtedy określić, który z parametrów powinien być włączony do procesu walidacji. Wszystkie działania związane z procesem walidacji trzeba zakończyć raportem walidacyjnym.

Proces opracowania i walidacji metod analitycznych wymaga stosowania komercyjnie dostępnych, bezmatrycowych lub matrycowych, certyfikowanych materiałów odniesienia (certified reference material, CRM). Z punktu widzenia toksykologii sądowej powszechnie stosowane są bezmatrycowe CRM, które stanowią czyste wzorce substancji lub ich roztwory (m.in. środków odurzających, substancji psychotropowych, środków farmakologicznych, nowych substancji psychoaktywnych, środków ochrony roślin, związków metali lub niemetali). Wśród bezmatrycowych CRM znajdują również zastosowanie czyste wzorce wewnętrze (internal standards, IS) substancji, w cząsteczkach których od kilku do kilkunastu atomów znakowane jest stabilnymi izotopami D, 13C, 15N lub 18O. Tego typu wzorce wewnętrzne są szczególnie przydatne dla poprawy dokładności oznaczeń analitów w złożonych matrycach biologicznych z zastosowaniem technik chromatograficznych sprzężonych ze spektrometrią mas. Ze względu na szybką dynamikę zmian na rynku narkotyków (np. nowych substancji psychoaktywnych) firmy w swojej ofercie nie mają bezmatrycowych CRM tych substancji. Etap ich dostępności poprzedza wprowadzenie do oferty materiałów odniesienia (reference material, RM), które przeznaczone są do wykorzystania na potrzeby analiz identyfikacyjnych.

Dobra praktyka laboratoryjna wymaga wprowadzenia materiałów do kontroli jakos?ci (quality control material, QCM), dostępnych komercyjnie lub przygotowanych wewnętrznie w laboratorium. Celem tego działania jest zapewnienie obiektywnych sposobów oceny wyników w toksykologii sądowej, w szczególności dokładności oznaczenia analitu. W toksykologii sądowej QCM stanowią m.in. próbki krwi, surowicy, moczu, włosów, które zawierają poszukiwany analit w określonym stężeniu. Dostępne są także liofilizowane matryce biologiczne, które przed analizą należy rozpuścić w określonej objętości rozpuszczalnika, zgodnie z dołączoną procedurą.

Przy ocenie zewnętrznej laboratorium wymagane jest uczestnictwo w badaniu biegłości (proficiency testing, PT), niezależnie od laboratorium oceniającym jego kompetencje w różnych aspektach toksykologii sądowej (zdolność do wykrywania i identyfikacji szerokiego spektrum substancji oraz zapewnienie wyniku ilościowego i interpretacji uzyskanych wyników).

Powyższe działania powinny być zintegrowane z ogólnym systemem zarządzania jakością, dotyczącym kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących wg normy PN-EN ISO/IEC 17025:2018-2, a ich uwieńczeniem może być akredytacja metody analitycznej (patrz 012).

Certyfikowany materiał odniesienia (CRM) - matrycowy lub bezmatrycowy materiał opatrzony certyfikatem, dla kto?rego kaz?dej wartos?ci (np. zawartość substancji, stężeniu substancji) przypisana jest niepewnos?c? (U) na okres?lonym poziomie ufnos?ci (ryc. 242-3).Materiał odniesienia (RM) - matrycowy lub bezmatrycowy materiał opatrzony certyfikatem, dla kto?rego wskazano zawartość substancji lub jej stężenie (np. RM mefedronu o zawartości ? 98%).Materiał odniesienia do kontroli jakości (QCM) - matrycowy lub bezmatrycowy materiał opatrzony certyfikatem, zawierający analit o określonym stężeniu.Badanie biegłości (PT) - ocena rezultatów działania uczestnika względem wcześniej ustalonego kryterium za pomocą porównań międzylaboratoryjnych.

W procesie walidacji metody analitycznej ocenie należy poddać efekt matrycy, szczególnie kiedy stosowana jest technika chromatografii cieczowej sprzężona z tandemową spektrometrią mas z jonizacją poprzez rozpylanie w polu elektrycznym (LC-ESI-(MS)-MS). Za efekt matrycy odpowiedzialne są składniki matrycy biologicznej nieusunięte z próbki w trakcie prowadzonych procedur izolacji analitu. Składniki takie jak białka, fosfolipidy czy sole trafiając wspólnie z analitem do komory jonizacyjnej ESI spektrometru mas mogą wywołać zjawisko tłumienia lub wzmocnienia jonizacji analitu. Efektem tego jest spadek lub wzrost sygnału analitycznego dla oznaczanej substancji, generowany przez detektor (ryc. 242-4).

Chociaż doniesiono, że elektrorozpylanie (electrospray, ESI) jest znacznie bardziej podatne na takie zakłócenia, mogą one również wystąpić przy jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI). Tłumienie i wzmocnienie jonizacji analitu może negatywnie wpływać na parametry walidacji, takie jak LOD, LOQ, liniowość, precyzję i dokładność (ostatnie trzy zwłaszcza w przypadku braku wzorca wewnętrznego znakowanego izotopowo). Dlatego badania efektów matrycy powinny stanowić integralną część walidacji dowolnej metody LC-MS(-MS).

Kompleksowa strategia oceny efektu matrycy, a także parametrów odzysku i wydajności procesu, w analizach LC-MS(-MS) może zostać przeprowadzona na podstawie uzyskanych odpowiedzi analitycznych dla oznaczanej substancji w trzech różnych seriach (tab. 242-2), a następnie wyznaczenia ich odpowiednich stosunków:

Efekt matrycy (tłumienie/wzmocnienie jonizacji analitu) = seria 2/seria 1 × 100%

Odzysk = seria 3/seria 2 × 100%

Wydajność procesu = seria 3/seria 1 × 100%

Bibliografia

1. Jakubowska M.: Walidacja metod analitycznych. Raport z walidacji. http://home.agh.edu.pl/~kca/Walidacja%20-%20raport%20z%20walidacji.pdf [dostęp 03.09.2020].

2. Matuszewski B.K., Constanzer M.L., Chavez-Eng C.M.: Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal. Chem., 2003, 75: 3019-3030.

3. Namieślnik J., Konieczka P.: Materiały odniesienia - rola w laboratorium analitycznym (problemy i wyzwania). https://chem.pg.edu.pl/documents/175289/4241474/Slesin2013.pdf [dostęp 03.09.2020].

4. Pasławski P.: Wymagania techniczne normy PN-EN ISO/IEC 17025 w praktyce laboratoryjnej - 4. Miarodajnos?c? wyniko?w badan?. Walidacja a miarodajność. http://pollab.pl/files/dokumenty/prezentacje_z_sympozjum/2012/1_Walidacja_a_miarodajnosc.pdf [dostęp 03.09.2020].

5. Penders J., Verstraete A.: Laboratory guidelines and standards in clinical and forensic toxicology. Accred. Qual. Assur., 2006, 11: 284-290.

6. Peters F.T., Drummer O.H., Musshoff F.: Validation of new methods. Forensic Sci. Int., 2007, 165: 216-224.

7. Peters F.T., Wissenbach D.K., Busardo F.P. i wsp.: Method development in forensic toxicology. Curr. Pharm. Des., 2017, 23: 5455-5467.

243Pośmiertna redystrybucja ksenobiotyków i biomarkerówGrzegorz Buszewicz

Wraz ze śmiercią ustają procesy toksokinetyczne ADME: absorpcja, dystrybucja, metabolizm i eliminacja. Jednak nie zawsze wyniki toksykologicznych badań pośmiertnych w pełni odzwierciedlają rozłożenie ksenobiotyku w organizmie w chwili śmierci. Pośmiertna redystrybucja, PMR (post-mortem redistribution), ksenobiotyków oraz ich metabolitów jest zjawiskiem dobrze znanym medykom i toksykologom sądowym, np. przy ocenie stanu trzeźwości w chwili śmierci na podstawie wyników badań próbek krwi. Opisano zjawisko przenikania niezresorbowanego etanolu z przewodu pokarmowego do krwi jam serca, dlatego do bezspornej oceny stanu trzeźwości w chwili śmierci konieczne jest równoczesne zabezpieczenie krwi obwodowej oraz ciała szklistego oka (patrz 244 i 261-264). W tym samym mechanizmie może dojść do dyfuzji ze światła przewodu pokarmowego do najbliższych tkanek i narządów każdej drobnocząsteczkowej, dobrze rozpuszczalnej w wodzie trucizny o względnie niskim powinowactwie do białek (np. barbiturany, trójcykliczne leki przeciwdepresyjne).

Redystrybucji z naczyń krwionośnych podlega wiele ksenobiotyków, nie tylko etanol, który jest hydrofilowy i łatwo przenika przez błony biologiczne. Uwzględnienie lub pominięcie tego zjawiska może istotnie wpłynąć na prawidłową interpretację stężenia leku lub związku toksycznego we krwi pobranej ze zwłok. Jednak w przypadku wielu substancji (leków, narkotyków) zjawisko PMR nie jest do końca rozpoznane pod względem dynamiki zmian w poszczególnych kompartmentach (narządach, tkankach czy częściach ciała).

Dyfuzja w obrębie tej samej tkanki lub z jednej tkanki do drugiej ksenobiotyków dobrze rozpuszczalnych w lipidach lub znajdujących się w wysokich stężeniach w tkankach w stosunku do krwi zachodzi pośmiertnie w wyniku ustania wewnątrzkomórkowych fizjologicznych procesów przeciwstawiających się dyfuzji oraz wskutek pękania błon komórkowych.

Mechanizmy powodujące PMR są złożone. Po śmierci ustają procesy zależne od dostarczanej energii, które przeciwdziałają dyfuzji wielu związków chemicznych. W zależności od rodzaju ksenobiotyku może wystąpić wzrost lub obniżenie jego stężenia we krwi. Wzrost stężenia obserwowany jest dla leków, które zażyciowo łatwo wiążą się z tkankami otaczającymi naczynia krwionośne, a po śmierci szybko się z nich uwalniają do krwi (trójcykliczne antydepresanty, leki przeciwmalaryczne, digoksyna - we krwi z jam serca). Przyjmuje się, że leki o dużej objętości dystrybucji - Vd (np. fenotiazyny), ulegają redystrybucji do krwi z powodu ich rozmieszczenia głównie w tkankach, przy czym za wartość progową dla występowania PMR przyjmuje się Vd ok. 3-4 l/kg. Przeciwstawną przyczyną występowania PMR może być wysokie stężenie leku w kompartmencie centralnym (osoczu oraz tkankach i narządach dobrze ukrwionych: wątrobie, płucach, nerce, mózgu, sercu, gruczołach wydzielania wewnętrznego) w stosunku do kompartmentu obwodowego (tkankowego).

Leki podlegające zażyciowemu gromadzeniu w różnych kompartmentach wykazują potencjał do redystrybucji po śmierci w kierunku zgodnym z malejącym gradientem stężenia (ryc. 243-1). Substancje hydrofilowe łatwo penetrujące błony biologiczne mogą przemieszczać się wraz z wodą, np. z naczyń do otaczających tkanek, natomiast lotne mogą ulec dyfuzji przez skórę. Wzrost stężenia we krwi leków mających powinowactwo do białek krwi może być spowodowany przemieszczeniem wody z naczyń krwionośnych i zagęszczeniem w nich białek. W podobny sposób może dojść do zagęszczenia substancji lipofilnych w tkankach bogatych w tłuszcze. Przemieszczeniu sprzyjają wysoka temperatura, zwiększone uwodnienie, np. w zwłokach przebywających w wodzie, a także przeciwstawna przemiana pośmiertna - wysychanie zwłok.

Stopień redystrybucji zależy od:

- właściwości fizykochemicznych ksenobiotyku, które mają wpływ na objętość dystrybucji;

- czasu od chwili śmierci do momentu pobrania próbek;

- warunków, w jakich przebywało ciało zmarłego (temperatura otoczenia, wilgotność powietrza, środowisko wodne itp.).

Typowymi rezerwuarami, w których zażyciowo mogą gromadzić się leki podlegające PMR są wątroba, płuca i serce. Natomiast żołądek to miejsce, do którego dostają się leki przyjęte doustnie - może być rezerwuarem, gdy do śmierci dochodzi krótko po połknięciu.

Pośmiertna redystrybucja związków toksycznych zachodzi także z krwi znajdującej się w żyłach udowych (tab. 243-1), stanowiącej materiał badawczy do celów toksykologicznych powszechnie uznawany za najbardziej odporny na wszelkie przemiany pośmiertne.

Tabela 243-1. Pośmiertna redystrybucja leków lub metabolitów leków z krwi z żyły udowej w okresie 50-60 godzin od chwili ujawnienia zwłok do czasu wykonania sekcji zwłok (wg Gerostamoulosa i wsp.).

% zmiany stężenia

Lek

Spadek o > 20%

6-acetylomorfina, amfetamina, metamfetamina, 7-aminonitrazepam, rysperydon, tramadol

Wahania stężeń w zakresie ? 20%

Alprazolam, amitryptylina, kofeina, 7-aminoklonazepam, kodeina, diazepam, fluoksetyna, metadon, midazolam, morfina, nordiazepam, nortryptylina, oksazepam, kwetiapina, olanzapina, oksykodon

Wzrost o 20-50%

Citalopram, mirtazapina, sertralina, temazepam, EDDP (metabolit metadonu)

Wzrost > 50%

Doksylamina, wenlafaksyna

Stężenia wielu leków oznaczonych pośmiertnie we krwi z serca zwykle są większe od stężeń oznaczonych we krwi obwodowej (np. z żyły udowej), co może być następstwem PMR (tab. 243-2). Jednak oszacowanie, czy stwierdzone w badaniach pośmiertnych stężenie leku we krwi obwodowej było większe czy mniejsze od zażyciowego wyłącznie na podstawie opublikowanych danych na temat proporcji stężeń ksenobiotyku między krwią z jam serca a krwią obwodową (cardiac/peripheral lub central/peripheral blood, C/P) nie ma charakteru rozstrzygającego (dowodowego). Stwierdzono bowiem duże rozrzuty wartości C/P. Wielość ta abstrahuje od właściwości fizykochemicznych leków. Nie określono, jaka wielkość C/P oznacza znaczną PMR, a jaka minimalną i jak dotąd brak wyjaśnienia, dlaczego niektóre leki, o których wiadomo, że nie podlegają redystrybucji - salicylany, naproksen i tramadol, mają C/P > 1, zaś efedryna, hydrokodon, hydroksyzyna, metoprolol, procyklidyna i trifluoperazyna, które podlegają PMR, mają maksymalną wartość C/P ? 1.

Tabela 243-2. Wartości C/P wybranych substancji o znaczeniu toksykologicznym (wg Baselta) oraz THC (wg Hollanda i wsp.).

Lek

C/P

Zakres C/P

Amitryptylina

3,1

0,6-15

Chloropromazyna

4

1-8

Diazepam

1,6

0,2-12

Kokaina

2,3

1,5- 3,2

Metadon

1,8

0,4-7,3

Morfina

2,2

1-5,8

?9-THC

1,5

0,3-3,1

?9-THC-OH

1,7

0,3-2,7

?9-THC-COOH

1,8

0,5-3

Innym, potencjalnie bardziej miarodajnym od C/P sposobem oceny PMR jest proporcja między stężeniem ksenobiotyku w wątrobie a jego stężeniem we krwi obwodowej (liver/peripheral blood, L/P). Przyjęto, że proporcja L/P < 5 wskazuje na niewielką lub nieistotną PMR, a > 20-30 wskazuje na skłonność leku do znacznej PMR. Jak dotąd brak jednak dostatecznie szerokich opracowań na ten temat.

Rozwinięciem oceny PMR za pomocą parametru L/P jest koncepcja współczynnika redystrybucji pośmiertnej F i jego teoretycznego odpowiednika Ft:

gdzie: AM - stężenie we krwi (całkowitej) przed śmiercią

P - stężenie pośmiertne we krwi obwodowej

R - proporcja L/P

Na podstawie analizy ponad 860 przypadków opublikowano listę 44 substancji, dla których zostały obliczone wartości Ft (tab. 243-3). Do obliczonych na podstawie wartości Ft teoretycznych stężeń ksenobiotyków przed śmiercią (AM) należy jednak podchodzić z dużą ostrożnością w kontekście celów dowodowych w przypadkach ponad 48-godzinnego odstępu od chwili śmierci do zabezpieczenia (zamrożenia) próbki krwi, czyli praktycznie w większości badań pośmiertnych, szczególnie dla związków o dużej skłonności do PMR.

Tabela 243-3. Lista współczynników Ft w kolejności rosnącej (wierszami) dla 44 substancji (wg McIntyre).

Gabapentyna - 0,97

Etanol - 1

Naproksen - 1

Gwajafenazyna - 1

Acetaminofen - 1

Bupropion - 1

Meprobamat - 1

Karisoprodol - 1,1

Tramadol - 1,1

Hydrokodon - 1,2

Trazodon - 1,2

Doksylamina - 1,2

Zolpidem - 1,2

Metoprolol - 1,3

Wenlafaksyna - 1,3

Metadon - 1,4

Fentanyl - 1,5

Amfetamina - 1,6

Klozapina - 1,6

Difenhydramina - 1,6

Metamfetamina - 1,6

Citalopram - 1,7

Chlorfeniramina - 1,8

Dekstrometorfan - 1,8

Lamotrygina - 1,8

Prometazyna - 1,8

Propoksyfen - 1,8

Propranolol - 1,9

Hydroksyzyna - 2

Mirtazapina - 2

Olanzapina - 2

Kwetiapina - 2

Amitriptylina - 2,3

Diltiazem - 2,4

Cyklobenzapryna - 2,5

Doksepina - 2,5

Amlodypina - 2,9

Imipramina - 3

Paroksetyna - 3

Fluoksetyna - 3,1

Amiodaron - 3,6

Dezipramina - 3,7

Klomipramina - 4,3

Sertralina - 4,8

Oprócz podwyższenia stężenia substancji toksycznej we krwi wynikającego z pośmiertnej redystrybucji, należy brać pod uwagę rozkład ksenobiotyku po śmierci. Stężenie substancji (leku) w próbce pobranej podczas sekcji zwłok niekiedy może być znacznie niższe niż stężenie, które występowało w chwili śmierci. Jeszcze przez pewien czas po śmierci enzymy hydrolityczne zachowują swoją aktywność, dlatego niektóre związki mające powinowactwo do centrum aktywnego hydrolaz są podatne na ich aktywność. Nietrwałe są związki:

- zawierające grupę nitrową (np. klonazepam i flunitrazepam ulegają redukcji do pochodnych aminowych);

- N-tlenki (np. chlordiazepoksyd);

- związki zawierające siarkę;

- związki o budowie estrowej (np. kokaina).

Rozwijająca się po śmierci flora bakteryjna również może powodować rozkład i zmniejszenie stężenia ksenobiotyków oraz zmieniać proporcję między postacią sprzężoną a wolną wskutek hydrolizy ksenobiotyków związanych z kwasem glukuronowym (np. glukuronid morfiny).

Pośmiertnej redystrybucji w mechanizmach opisanych powyżej podlegają także pośrednie biomarkery toksykologiczne (patrz 238). Po ustaniu zażyciowych procesów fizjologicznych oraz destrukcji błon biologicznych biomarkery o mniejszej masie cząsteczkowej ulegają dyfuzji i rozprzestrzenieniu zgodnie z gradientem stężeń. Spada też aktywność enzymów mających znaczenie diagnostyczne.

Bibliografia

1. Baselt R. (red.): Disposition of toxic drugs and chemicals in man. 10th edition. Biomedical Publications, Seal Beach 2014.

2. Gerostamoulos D., Beyer J., Staikos V. i wsp.: The effect of the postmortem interval on the redistribution of drugs: a comparison of mortuary admission and autopsy blood specimens. Forensic Sci. Med. Pathol., 2012, 8: 373-379.

3. Holland M.G., Schwope D.M., Stoppacher R. i wsp.: Postmortem redistribution of ?9-tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-THC (11-OH-THC), and 11-nor-9-carboxy-THC (THCCOOH). Forensic Sci. Int., 2011, 212: 247-251.

4. Kennedy M.: Interpreting postmortem drug analysis and redistribution in determining cause of death: a review. Pathology and Laboratory Medicine International, 2015, 7: 55-62.

5. Lemaire E., Schmidt C., Denooz R. i wsp.: Postmortem concentration and redistribution of diazepam, methadone, and morphine with subclavian and femoral vein dissection/clamping. J. Forensic Sci., 2016, 61: 1596-1603.

6. McIntyre I.M.: Analytical data supporting the "theoretical" postmortem redistribution factor (Ft): a new model to evaluate postmortem redistribution. Forensic Sci. Res., 2016, 1: 33-37.

7. McIntyre I.M.: Identification of a postmortem redistribution factor (F) for forensic toxicology. Journal of Analytical Science and Technology, 2014, 5: 24.

8. McIntyre I.M., Escott M.: Postmortem drug redistribution. J. Forensic Res., 2012, 3: 6.

9. Rohrig T.: Postmortem redistribution. W: Postmortem toxicology: challenges and interpretive considerations (T. Rohrig). Academic Press, Cambridge 2019; s. 185-198.

10. Yarema M.C., Becker C.E.: Key concepts in postmortem drug redistribution. Clin. Toxicol. (Phila.), 2005, 43: 235-241.

Autorzy

dr hab. n. med. GRZEGORZ TERESIŃSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

dr hab. n. farm. PIOTR ADAMOWICZ, prof. IES

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

dr n. med. JACEK BAJ

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

prof. dr hab. n. med. KRZYSZTOF BOROWIAK

Katedra Medycyny Sądowej

Zakład Toksykologii Klinicznej

Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

dr n. med. ALEKSANDRA BOROWSKA-SOLONYNKO

Zakład Medycyny Sądowej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

prof. dr hab. n. med. WOJCIECH BRANICKI

Małopolskie Centrum Biotechnologii

Uniwersytet Jagielloński - Collegium Medicum

dr n. med. PIOTR BRZEZIŃSKI

Katedra Anatomii i Histologii

Zakład Histologii i Embriologii

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

PIOTR BRZUSZCZYŃSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr hab. n. med. GRZEGORZ BUSZEWICZ

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

mgr PAULINA CAŁKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

dr n. med. MARZANNA CIESIELKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

lek. MAGDALENA CZUBA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

lek. RADOSŁAW DROZD

Katedra Medycyny Sądowej

Zakład Prawa Medycznego

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr n. med. PIOTR ENGELGARDT

Katedra Medycyny Sądowej

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

dr n. med. MARTA GORZKIEWICZ

Katedra Medycyny Sądowej

Wydział Lekarski Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

prof. dr hab. n. med. TOMASZ GRZYBOWSKI

Katedra Medycyny Sądowej

Wydział Lekarski Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

dr hab. n. med. RENATA JACEWICZ, prof. UM

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

dr n. med. KATARZYNA JERMAKOW

Katedra i Zakład Mikrobiologii

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr hab. n. farm. MARIA KAŁA

Krakowska Wyższa Szkoła Promocji Zdrowia

dr hab. n. med. TOMASZ KONOPKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Jagielloński - Collegium Medicum

prof. dr hab. n. med MAŁGORZATA KŁYS

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Jagielloński - Collegium Medicum

dr n. med. WOJCIECH KOCIEMBA

Odział Neurochirurgii

Wielospecjalistyczny Szpital Miejski

im. J. Strusia w Poznaniu

prof. dr hab. n. med. MAREK KRZYSTANEK

Katedra i Klinika Psychiatrii i Psychoterapii

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

dr n. biol. TOMASZ KUPIEC

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

dr hab. n. farm. TERESA LECH, prof. IES

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

dr n. chem. WOJCIECH LECHOWICZ

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

dr n. wet. PIOTR LISTOS

Zakład Patomorfologii i Weterynarii Sądowej

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

dr n. biol. DOROTA LORKIEWICZ-MUSZYŃSKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu

mgr OLGA LOSKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr n. med. MARZENA ŁABĘCKA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

dr hab. n. med. KRZYSZTOF MAKSYMOWICZ

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr hab. SZYMON MATUSZEWSKI, prof. UAM

Laboratorium Kryminalistyki

Wydział Prawa i Administracji

Uniwersytet im. A. Mickiewicza w Poznaniu

mgr ANNA MĄDRA-BIELEWICZ

Laboratorium Kryminalistyki

Wydział Prawa i Administracji

Uniwersytet im. A. Mickiewicza w Poznaniu

prof. dr hab. n. med. WITOLD PEPIŃSKI

Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

dr hab. n. med. KRZYSZTOF RĘBAŁA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Gdański Uniwersytet Medyczny

dr n. med. SEBASTIAN ROJEK

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Jagielloński - Collegium Medicum

dr n. med. MARTA RORAT

Katedra Medycyny Sądowej

Zakład Prawa Medycznego

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr n. med. RAFAŁ SKOWRONEK

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej i Toksykologii Sądowo-Lekarskiej

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

dr n. med. JULIA SOBOL

Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Zielonogórski - Collegium Medicum

dr n. med. BOHDAN SOLONYNKO

Klinika Chirurgii Ogólnej, Naczyniowej i Transplantacyjnej Uniwersyteckie Centrum Kliniczne

Warszawski Uniwersytet Medyczny

dr n. med. ŁUKASZ SZLESZKOWSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

mgr MONIKA SZOPA

Sekcja Rozpoznania Biologicznego

Wojskowy Ośrodek Medycyny Prewencyjnej w Modlinie

dr n. med. PAWEŁ SZPOT

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

mgr AGATA THANNHÄUSER

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

dr n. med. MARCIN TOMSIA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej i Toksykologii Sądowo-Lekarskiej

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

mgr inż. arch. WOJCIECH TUNIKOWSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

mgr EWA WACH

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

prof. dr hab. n. med. ROMAN WACHOWIAK

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu

dr hab. n. farm. MAREK WIERGOWSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Gdański Uniwersytet Medyczny

mgr KINGA WIERZBA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Jagielloński - Collegium Medicum

dr DARIUSZ WILK

Katedra Kryminalistyki

Wydział Prawa i Administracji

Uniwersytet Jagielloński

dr n. med. KATARZYNA WOCHNA

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

dr hab. n. med. MARCIN WOŹNIAK

Katedra Medycyny Sądowej

Wydział Lekarski Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

mgr MONIKA WÓJCIK

Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

mgr MARIA WRÓBEL

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

lek. KRZYSZTOF WRÓBLEWSKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

dr hab. n. chem. DARIUSZ ZUBA, prof. IES

Instytut Ekspertyz Sądowych im. prof. dra J. Sehna

w Krakowie

dr n. med. mgr chemii MARCIN ZAWADZKI

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Od Redaktora Naukowego

Według najbardziej lapidarnej definicji, medycyna sądowa jest sztuką wykorzystania wiedzy i technologii medycznej dla zaspokajania potrzeb organów stosowania prawa. Dziedzina ta w unikalny sposób łączy podstawy naukowe szerokiej gamy dziedzin biologicznych i fizycznych oraz osiągnięcia własnej metodologii badawczej w celu dostarczenia profesjonalnych dowodów w postępowaniach weryfikujących przestrzeganie określonych norm prawnych.

Drugi tom podręcznika "Medycyna sądowa" obejmuje tematy szeroko rozumianej diagnostyki sądowej (toksykologicznej, genetycznej, obrazowej i in.), czyli wykorzystania różnych technik badawczych ukierunkowanych na dostarczanie umocowanych naukowo ekspertyz i opracowywania optymalnych metod wyjaśniania spornych kwestii w obszarze związanym z wszelkimi aspektami naruszenia lub zagrożenia ludzkiego życia i zdrowia. Książka definiuje aktualne standardy opiniowania dla praktykujących biegłych oraz przedstawia osiągnięcia i najnowsze sposoby wsparcia procesowego w aspekcie dochodzenia prawdy materialnej, m.in. w zakresie toksykologii i genetyki sądowej, obrazowania medycznego oraz wybranych obszarów kryminalistyki.

Krąg odbiorców książki nie ogranicza się jedynie do profesjonalistów z obszarów toksykologii, genetyki oraz lekarzy, którzy mogą znaleźć się w sytuacji wymagającej współpracy z organami i decydentami procesowymi w roli biegłych. Jest skierowana zarówno do studentów kierunków medycznych, prawnych, lekarzy w trakcie szkolenia podyplomowego (nie tylko z zakresu medycyny sądowej), jak i diagnostów laboratoryjnych. Naturalnym adresatem są również adepci różnych dziedzin kryminalistyki i szerokiego obszaru nauk sądowych, prawnicy stykający się z problemami oceny okoliczności przestępstw przeciwko życiu i zdrowiu oraz ich skutków - w roli prokuratora, sędziego, radcy prawnego czy adwokata. Rozdziały podręcznika mogą stanowić swego rodzaju przewodnik dla zleceniodawców poszukujących wykonawców określonych rodzajów ekspertyz.

Podstawowym założeniem książki jest wyeksponowanie praktycznego aspektu opiniowania, głęboko osadzonego w realiach aktualnych problemów z rodzimej praktyki opiniodawczej. Wybór zagadnień oraz układ podręcznika odnoszą się wprost do przekroju problemów spotykanych w rutynowej działalności eksperckiej. Książka została zaplanowana jako kompendium tematyczne i praktyczny przewodnik dostosowany do istniejących aktualnie możliwości diagnostycznych - tematyka poszczególnych rozdziałów obejmuje szerokie spektrum problemów spotykanych w codziennej praktyce eksperckiej oraz pytań kierowanych do biegłych przez organy procesowe.

- Toksykologia sądowa i tanatochemia:

- diagnostyka zatruć rozmyślnych i przypadkowych;

- środki wykorzystywane w działaniach przestępczych;

- leki i inne przyczyny zatruć nieprzypadkowych;

- trucizny syntetyczne i pochodzenia naturalnego;

- toksykologia substancji psychoaktywnych;

- alkohologia sądowa i obliczenia toksokinetyczne;

- markery diagnostyki nekrochemicznej;

- strategia badań laboratoryjnych.

- Genetyka sądowa:

- podstawy prawne i standardy badań genetycznych;

- współczesne techniki badań genetycznych;

- obliczenia biostatystyczne i badania predykcyjne;

- genetyczna identyfikacja ofiar katastrof;

- diagnostyka molekularna w tanatologii.

- Badania śladów biologicznych:

- identyfikacja i indywidualizacja śladów biologicznych;

- ocena mechanizmu powstania plam krwi;

- rekonstrukcja okoliczności zdarzenia na podstawie analizy śladów.

- Badania obrazowe:

- pośmiertna diagnostyka radiologiczna i tomografia komputerowa;

- nowoczesne sposoby dokumentowania miejsca zdarzenia;

- identyfikacja narzędzi i wirtualna diagnostyka porównawcza;

- wirtualna identyfikacja i rekonstrukcja wyglądu nieznanych osób;

- wizualizacja sądowa.

- Inne obszary diagnostyki sądowej, technologii pośmiertnej oraz wybrane badania kryminalistyczne:

- badania mikrobiologiczne i histopatologiczne;

- techniki maceracji kości, zabiegi tanatopraksji i balsamacja zwłok;

- badania toksykologiczne, genetyczne i kryminalistyczne włosów;

- entomologia medyczno-sądowa;

- profilowanie kryminalistyczne i psychologia sądowa;

- ocena szczerości wypowiedzi (badania poligraficzne - wariograficzne).

dr hab. n. med. Grzegorz Teresiński

231Cele, zadania oraz obszar działania toksykologii sądowejGrzegorz Buszewicz

Toksykologia sądowa należy do umownego działu toksykologii stosowanej. To interdyscyplinarna dziedzina badań wyodrębniona m.in. z biologii, chemii, medycyny, medycyny weterynaryjnej i farmakologii, uwzględniająca podstawy metodyczne analiz chemicznych prowadzonych w celu wykluczenia lub potwierdzenia obecności ksenobiotyków w materiale biologicznym i niebiologicznym oraz interpretacji wyników analizy dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości.

Toksykologia sądowa ma zastosowanie w przypadkach, w których niekorzystne skutki działania substancji toksycznych lub psychoaktywnych mają konsekwencje administracyjne lub medyczno-prawne.

Typowymi obszarami zainteresowania toksykologii sądowej są:

- zatrucia śmiertelne - przypadkowe, samobójcze, zbrodnicze (patrz 277);

- toksykologia zaburzeń sprawności psychomotorycznej człowieka, np. w kontekście prowadzenia pojazdów pod wpływem alkoholu (patrz 273) lub środków działających podobnie do alkoholu - ŚDPA (patrz 274);

- przestępstwa związane z narkotykami i nowymi substancjami psychoaktywnymi - NSP; np. udzielanie dopalaczy nieletnim czy odurzanie w celach przestępczych, wykorzystania seksualnego itp. (patrz 265-272 i  276);

- użycie środków farmakologicznych w celu wywołania poronienia (patrz 294);

- używanie zabronionych środków dopingujących w sporcie wyczynowym (patrz 297).

Substancja chemiczna wg definicji REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals - rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady nr 1907/2006) to pierwiastek chemiczny lub jego związki w stanie, w jakim występują w przyrodzie lub zostają uzyskane za pomocą procesu produkcyjnego, z wszelkimi dodatkami wymaganymi do zachowania ich trwałości oraz wszelkimi zanieczyszczeniami powstałymi w wyniku zastosowanego procesu, wyłączając rozpuszczalniki, które można oddzielić bez wpływu na stabilność i skład substancji.

Obszar toksykologii sądowej ma specyficzne:

- cele - szeroko rozumiane toksykologiczne ekspertyzy sądowe;

- zadania - współpraca z medykami sądowymi, organami ścigania i wymiarem sprawiedliwości;

- środki - procedury postępowania z materiałem badawczym oraz odpowiednio zwalidowane metody.

Odrębności tej dziedziny powodują, że dwa podstawowe pojęcia w "ogólnej" toksykologii: trucizna i zatrucie, w toksykologii sądowej mają swój odrębny charakter, podobny do pojęć funkcjonujących w toksykologii klinicznej (ta dziedzina wiedzy medycznej ma jednak inne cele, zadania i środki):

- trucizna w ujęciu medyczno-sądowym to substancja chemiczna, która wprowadzona do ustroju w stosunkowo niewielkiej ilości prowadzi do rozstroju zdrowia (w rozumieniu przepisów kodeksu karnego) lub śmierci;

- zatrucie jest skutkiem działania trucizny na organizm - czyli jest to stan chorobowy z przedmiotowymi i podmiotowymi objawami, wywołany przez substancję chemiczną pochodzenia egzo- lub endogennego.

Trucizna może zostać wprowadzona także do żywności, paszy czy środowiska (patrz 245 i 291-293). Tego rodzaju intoksykacje w zależności od stopnia ryzyka dla ludzi lub zwierząt mogą być kwalifikowane jako przestępstwa i także leżą w kręgu zainteresowania toksykologii sądowej.

Bibliografia

1. Moffat A., Osselton M., Widdop B. i wsp.: Introduction to forensic toxicology. W: Clarke's analytical forensic toxicology. 1st edition. (red. S. Jickells, A. Negrusz). Pharmaceutical Press, London 2008.

2. Osselton M., Moffat A., Widdop B.: Forensic toxicology. W: Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 4th edition. (red. A. Moffat, M. Osselton, B. Widdop, J. Watts). Pharmaceutical Press, London 2011.

3. James R., Roberts S., Williams P.: General principles of toxicology. W: Principles of toxicology environmental and industrial applications. 2ed edition. (red. P. Williams, R. James, S. Roberts). Wiley-Interscience Publication, New York 2000.

232Podział trucizn i rodzaje zatruć w toksykologii sądowejGrzegorz Buszewicz

Celem klasyfikacji trucizn i zatruć jest ułatwienie:

- oceny potencjalnego zagrożenia, jakie stwarza dana trucizna;

- wstępnej diagnostyki i doboru metod analitycznych;

- opiniowania dla potrzeb sądowych.

Trucizny mogą być klasyfikowane na podstawie różnych kryteriów:

- pochodzenia - np. naturalne: bakteryjne, grzybicze, roślinne, zwierzęce, mineralne, antropogenne;

- budowy chemicznej - np. organiczne i nieorganiczne;

- miejsca działania - np. działające miejscowo i ogólnie (po wchłonięciu i dystrybucji);

- sposobu oddziaływania na organizm - np. żrące, powodujące anoksję, uszkadzające narządy miąższowe czy działające wybiórczo na ośrodkowy układ nerwowy;

- zachowania się w organizmie - np. kumulujące się, niekumulujące się, wykazujące kumulację działania (tzw. hit and run);

- według toksyczności (siły oddziaływania określonej za pomocą badań toksykometrycznych na zwierzętach):

- podział wg Hodge'a i Sternera (USA) na 6 stopni toksyczności (tab. 232-1);

- podział na IV klasy działania toksycznego substancji chemicznych po podaniu dożołądkowym stosowany w krajach UE - Dyrektywa RE 93/32/EWG (tab. 232-2; ryc. 232-1).

Pojęcie hit and run w toksykologii dotyczy trucizn o krótkim okresie biologicznego półtrwania (intoksykacje nimi są trudne do uchwycenia), które po pierwszej intoksykacji zostawiają względnie niewielkie skutki (często bezobjawowe), a po kolejnych dawkach uszkodzenia kumulują się, aż do wywołania objawów ostrego zatrucia. Określenie hit and run funkcjonuje także w medycynie wypadkowej, lecz dotyczy zachowania się sprawców wypadków (ucieczki z miejsca wypadku - patrz 159).

Ocena toksyczności ostrej badanej substancji metodą klas ostrej toksyczności polega na wyznaczeniu zakresu narażenia, w którym spodziewane są zejścia śmiertelne 50% zwierząt eksperymentalnych.Ocena metodą ustalonej dawki polega na wyznaczeniu dawki różnicującej substancji toksycznej, tj. najwyższej spośród wstępnie ustalonych, którą można podać bez wywołania śmierci zwierząt.

Tabela 232-1. Stopnie toksyczności wg Hodge'a i Sternera.

Stopień

Nazwa

LD50 (g/kg mc.)

droga doustna;

szczury

LD50 (g/kg mc.)

droga dermalna;

króliki

LD50 (ppm)

droga inhalacyjna;

szczury

Prawdopodobna dawka śmiertelna dla dorosłego człowieka w gramach

1

Ekstremalnie toksyczna

? 0,001

? 0,005

?10

? 0,065

2

Bardzo toksyczna

0,05

0,043

100

4

3

Średnio toksyczna

0,5

0,34

1000

30

4

Słabo toksyczna

5

2,81

10 000

250

5

Praktycznie nietoksyczna

15

22,6

100 000

1000

6

Stosunkowo nieszkodliwa

> 15

> 22,6

> 100 000

> 1000

Tabela 232-2. Klasy działania toksycznego substancji chemicznych po podaniu dożołądkowym według Dyrektywy RE 93/32/EWG z dnia 30.04.1992 r.

Klasa

Nazwa (symbol)

Dawka doustna dla szczura

(określona metodą klas toksyczności ostrej)

mg/kg mc.

Dawka różnicująca

(określona metodą ustalonej dawki)

mg/kg mc.

I

Bardzo toksyczna (T+)

LD50 < 25

< 5

II

Toksyczna (T)

25 < LD50 < 200

5

III

Szkodliwa (Xn)

200 < LD50 < 2000

50 lub 500

IV

Mało szkodliwa

LD50 > 2000

> 2000

W toksykologii sądowej ze względów praktycznych ważniejsza jest klasyfikacja na podstawie doboru metod analitycznych (podział nawiązujący do programu specjalizacji w zakresie laboratoryjnej toksykologii sądowej). Wyróżnia się:

1. trucizny lotne i gazy - wykrywane technikami chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (GC-FID i FID po metanizacji), w tym z zastosowaniem analizy fazy nadpowierzchniowej (technika headspace):

- lotne - np. alkohole niższe (metylowy, etylowy), alkohole wyższe, glikole, aceton, węglowodory aromatyczne i alifatyczne (benzen, toluen, ksylen, składniki benzyny, nafty) oraz halogenoalkany (chloroform, tetrachlorek węgla, trichloroetylen), anestetyki wziewne (patrz 278-281);

- gazy - np. CO, HCN, H2S, N2O (patrz 282).

2. rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych - ekstrahujące się ze środowiska kwaśnego lub obojętnego i zasadowego metodami ciecz-ciecz (LLE) lub do fazy stałej (SPE); wykrywane metodami chromatograficznymi: chromatografii cienkowarstwowej (TLC), gazowej (GC) z różnymi rodzajami detekcji (płomieniowo-jonizacyjny: FID; wychwytu elektronów: ECD; spektrometrii mas: MS), cieczowej (HPLC) z różnymi systemami detekcji (spektrofotometrycznym: UV-Vis; diodowym: DAD, MS) oraz metodami spektrofotometrycznymi; przede wszystkim są to:

- związki biobójcze - np. pestycydy polichlorowe, fosforoorganiczne, karbaminiany (patrz 291);

- leki pochodzenia naturalnego i syntetyczne (patrz 286-289);

- środki uzależniające - np. "klasyczne" środki odurzające i substancje psychotropowe oraz NSP (patrz 268 i 269).

3. rozpuszczalne w wodzie - izolowane przez wytrząsanie z wodą lub przez dializę, wykrywane metodami spektrofotometrycznymi, np. toksyczne aniony: fluorki, szczawiany, azotany(III), azotany(V) (patrz 285).

4. metale (patrz 295) - materiał biologiczny wymaga mineralizacji (na sucho, mokro, wspomaganej mikrofalami); wykrywane technikami spektrometrii absorpcyjnej płomieniowej (F-AAS) i bezpłomieniowej, w tym z generowaniem zimnych par rtęci (CV-AAS) i atomizacją elektrotermiczną (ET-AAS) oraz techniką optycznej spektrometrii emisyjnej, względnie spektrometrii mas z plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP-OES, ICP-MS).

W medycynie sądowej także funkcjonuje raczej mało konsekwentny podział trucizn nawiązujący do obrazu sekcyjnego (np. tzw. trucizny krwi powodują zmianę zabarwienia krwi, czyli możliwą do zaobserwowania podczas sekcji zwłok). W ujęciu medyczno-sądowym wyróżnia się trucizny:

- prowadzące do wytworzenia się wyraźnych, często charakterystycznych zmian "anatomicznych" (uszkodzenia strukturalnego tkanek):

- działające miejscowo (w miejscu kontaktu) - np. kwasy, ługi, brom, jod, formaldehyd (patrz 196);

- działające ogólnie (miąższowe) - np. sole rtęci (patrz 295), toksyny muchomora sromotnikowego (patrz 290);

- nieprowadzące do wytworzenia się wyraźnych zmian "anatomicznych" (organicznych):

- trucizny krwi (zmieniające właściwości krwi) - np. tlenek węgla (patrz 282), azotany(III) i azotany(V), anilina (patrz 285);

- trucizny działające na drodze czynnościowej przede wszystkim na ośrodkowy układ nerwowy (patrz 265):

- trucizny nielotne - np. leki (patrz 286-288), narkotyki (patrz 267), pestycydy (patrz 292), jady zwierzęce (patrz 289);

- trucizny lotne - np. rozpuszczalniki, alkohole (patrz 278-281).

W toksykologii sądowej znajduje również zastosowanie (np. podczas opiniowania dla sądów na podstawie akt sprawy) znana z toksykologii klinicznej klasyfikacja rodzajów zatruć w zależności od toksodynamiki objawów:

- zatrucia ostre - charakteryzują się wysoką dynamiką objawów klinicznych i rozwoju szkodliwych zmian biochemicznych w krótkim czasie po wprowadzeniu jednorazowej dawki trucizny doustnie, inhalacyjnie lub po naniesieniu na skórę; ciężkie objawy uszkodzenia narządów lub śmierć następują w czasie do ok. 24 godzin;

- zatrucia podostre - nie stanowią wyłącznej przyczyny śmierci; szkodliwe zmiany w organizmie występują mniej gwałtownie po podaniu jednorazowej lub kilkakrotnej dawki; wykrycie powstałych zmian patologicznych jest często możliwe dopiero po przeprowadzeniu badań czynności narządów;

- zatrucia przewlekłe - wywołują je małe dawki trucizny przyjmowane wielokrotnie przez dłuższy czas lub powstają wskutek narażenia na niskie stężenia trucizny w długim okresie (w toksykologii narażenie oznacza fizyczny kontakt z trucizną); najczęściej są to zatrucia przypadkowe.

Klasyfikacja rodzajów zatruć w ujęciu toksykologii sądowej odnosi się natomiast do kazuistyki. Jej podstawowym kryterium jest przyczyna powstania zatrucia w kontekście sprawczego udziału człowieka, czyli tzw. okoliczności. Wyróżnia się:

- zatrucia rozmyślne:

- samobójcze - najczęściej w tym celu były i są używane leki (np. przeciwpadaczkowe, nasenne, nasercowe i przeciwpsychotyczne) oraz pestycydy;

- przestępcze - w celu:

- dokonania zabójstwa;

- obezwładnia ofiary dla ułatwienia czynności przestępczych, np. gwałtu lub kradzieży (patrz 276);

- nielegalnego wywołania aborcji (patrz 294);

- nielegalnego uśmiercania zwierząt (patrz 374);

- zatrucia niezamierzone (przypadkowe):

- ostre - np. błędne podanie leków lub ich przedawkowanie, przedawkowanie narkotyków, zatrucia u dzieci chemikaliami używanymi w gospodarstwie domowym, zatrucia fałszowanymi alkoholami oraz chemicznie skażoną żywnością;

- przewlekłe - np. w miejscu pracy lub spożywanie wody i żywności skażonej środkami ochrony roślin.

Bibliografia

1. Jodynis-Liebert J.: Trucizny, zatrucia i ich przyczyny. W: Toksykologia współczesna (red. W.J. Seńczuk). Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2012; s. 28-36.

2. OECD Series on Testing and Assessment no. 24. 2001. Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. ENV/JM/MONO(2001)4, 23-Jul-2001, http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2001)4&doclanguage=en [dostęp 03.09.2020].

3. Program specjalizacji w dziedzinie Laboratoryjnej Toksykologii Sądowej. Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego. Warszawa 2018. https://www.cmkp.edu.pl/ksztalcenie/ksztalcenie-diagnostykow-laboratoryjnych/programy-specjalizacji/ [dostęp 03.09.2020].

4. Toksykologia sądowo-lekarska. W: Medycyna sądowa. Podręcznik dla studentów medycyny (red. A. Jakliński; J.S. Kobiela). Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1983; s. 262-304.

233Metabolizm ksenobiotyków i interakcje lekoweRafał Skowronek

Organizmy żywe są narażone na kumulujące się egzogenne związki lipofilne, dlatego w toku ewolucji wykształciły struktury komórkowe i szlaki biochemiczne zaangażowane w procesy usuwania obcych związków chemicznych z ustroju. Obecnie znanych jest ponad 200 000 ksenobiotyków (greckie: "xenos", znaczy "obcy"). Zanieczyszczenia środowiska, takie jak środki ochrony roślin, policykliczne węglowodory aromatyczne czy dioksyny, stosowanie konserwantów żywności oraz wzrastające wykorzystanie środków farmaceutycznych (leków, suplementów diety, "klasycznych" narkotyków i nowych związków psychoaktywnych) sprawiają, że wiedza na temat mechanizmów przemian tych substancji w organizmie i ich regulacji ma duże znaczenie praktyczne również w medycynie sądowej.

Opisując losy ksenobiotyków w ustroju, często używa się akronimu ADME: A - absorption (wchłanianie), D - distribution (rozmieszczenie), M - metabolism (metabolizm), E - excretion lub elimination (wydalanie/usuwanie).

Absorpcja to przenikanie ksenobiotyku do układu krążenia, m.in. przez płuca (droga wziewna), przewód pokarmowy (droga doustna), skórę i błony śluzowe jam ciała. Stopień wchłaniania ksenobiotyku zależy m.in. od: drogi podania, właściwości fizykochemicznych substancji, wielkości przyjętej dawki (zazwyczaj jest większa niż dawka efektywna), obecności pokarmu w przypadku przyjęcia per os oraz powierzchni kontaktu w przypadku intoksykacji przez skórę.

Dystrybucja to rozmieszczenie przyjętego ksenobiotyku w organizmie. Parametr charakteryzujący pozorną (hipotetyczną) objętość płynów organizmu, w których lek w stanie stacjonarnym miałby takie samo stężenie jak we krwi, nosi nazwę objętość dystrybucji - Vd (Vd bezwzględna jest wyrażana w litrach, Vd względna w litrach na kilogram). Z kolei parametr określający ułamek masy ciała, do której dociera ksenobiotyk to tzw. współczynnik dystrybucji (p = Vd/mc.). O procesie dystrybucji decydują m.in.: szybkość przepływu krwi przez poszczególne tkanki i narządy, szybkość transportu przez określone błony biologiczne, wiązanie z białkami krwi i tkanek oraz lipofilność ksenobiotyku. Interpretację wartości liczbowych tych parametrów przedstawiono w tabeli 233-1.

Tabela 233-1. Interpretacja wartości liczbowych parametrów objętości i współczynnika dystrybucji.

Objętość dystrybucji [l]

Współczynnik dystrybucji

Przykłady

5

Dystrybucja ograniczona jest do krwi

~ 0,05

Ksenobiotyk ulegający dystrybucji do osocza

Heparyna

10-20

Przenikanie do płynu pozakomórkowego

~ 0,2

Ksenobiotyk ulegający dystrybucji do płynów pozakomórkowych

Niektóre antybiotyki

40

Rozmieszczanie we wszystkich płynach organizmu

~ 0,55

Ksenobiotyk ulegający dystrybucji do wody organizmu

Etanol

> 100

Silna kumulacja w tkankach

> 1

Ksenobiotyk ulegający wiązaniu w tkankach (np. w tkance tłuszczowej)

THC

Przemiany metaboliczne ksenobiotyków (procesy biotransformacji), wśród których wyróżnia się m.in. mikrosomalne (przy udziale cytochromów P450) reakcje utleniania, mikrosomalne reakcje redukcji, pozamikrosomalne reakcje redoks i reakcje sprzęgania, z uwagi na ich znaczenie w praktyce klinicznej i medyczno-sądowej omówiono szerzej poniżej.

Eliminacja ksenobiotyków zachodzi z moczem (bierna filtracja kłębuszkowa, bierna dyfuzja dokanalikowa i aktywna sekrecja kanalikowa), kałem, żółcią, śliną, śluzem dróg oddechowych, potem, mlekiem matki i wydychanym powietrzem. Tempo eliminacji ksenobiotyku określają stała eliminacji i okres połowicznej eliminacji (półtrwania). Stała eliminacji to odsetek zmniejszania się stężenia ksenobiotyku (we krwi lub narządzie) w jednostce czasu (gdy eliminacja zachodzi z kinetyką zerowego rzędu). Natomiast okres połowicznej eliminacji (półtrwania) ksenobiotyku to czas, w którym jego stężenie zmniejszy się do połowy wartości wyjściowej.

Metabolizm ksenobiotyków

W biotransformacji ksenobiotyków wyróżnia się dwie fazy mające na celu zwiększenie polarności ich metabolitów, a co za tym idzie wzrost rozpuszczalności w wodzie ułatwiający wydalenie z moczem lub żółcią. W fazie I metabolizmu ksenobiotyków dochodzi do niezwykle różnorodnych reakcji chemicznych, m.in. utlenienia, dehalogenacji, desulfuracji, deaminacji, demetylacji, hydroksylacji lub rzadziej, redukcji substratu, przede wszystkim dzięki układowi monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 (CYP). Umożliwia to sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarkowym bądź octowym, aminokwasami lub glutationem, czy też acetylację, sulfatację lub metylację w fazie II (ryc. 233-1). W tzw. fazie III przemian związków obcych (nieuznawanej za odrębną fazę przez niektórych badaczy) uczestniczą transportery błonowe, takie jak glikoproteina P, białka oporności wielolekowej czy polipeptyd transportujący aniony organiczne 2. Etap ten to przede wszystkim aktywny (energozależny), przezbłonowy, skierowany do światła jelita transport ksenobiotyków o charakterze antyportu. Redukuje on ilość substancji toksycznych doprowadzanych do wątroby za pośrednictwem układu krążenia wrotnego. W enterocytach zachodzi też metabolizm wymienionych produktów fazy II do reaktywnych metabolitów (np. rodników episulfonowych).

Głównym narządem metabolizującym ksenobiotyki jest wątroba, ale enzymy i inne białka I, II i III fazy w mniejszej ilości występują również w innych narządach, np. w nadnerczach, nerkach, jelicie cienkim, płucach, mózgu, śledzionie, grasicy i szpiku kostnym.

Cytochrom P450

Nadrodzina cytochromu P450 (CYP) to wielogenowa grupa enzymów - hemoprotein, o masie cząsteczkowej 43-60 tys. daltonów, należących do monooksygenaz zewnętrznych, czyli enzymów uzyskujących elektrony za pośrednictwem białek współpracujących. U człowieka opisano 18 rodzin genowych i 44 podrodziny CYP (57 genów, 58 pseudogenów). Cytochromy P450 są zlokalizowane w błonach mikrosomalnych, błonie jądrowej, mitochondrialnej i plazmolemie. Są to jedne z najbardziej wszechstronnych biokatalizatorów, ponieważ katalizują ponad 60 rodzajów reakcji chemicznych. Według przyjętej nomenklatury różne enzymy CYP zalicza się do tej samej rodziny (pierwsza liczba arabska w nazwie), jeżeli zawierają > 40% homologicznych sekwencji aminokwasowych, a do podrodziny (duża litera), jeśli > 55%. Druga liczba arabska w nazwie oznacza konkretny enzym, np. CYP2E1 (metabolizujący alkohol etylowy).

Różnorodność substratów CYP jest imponująca, obejmuje zarówno ksenobiotyki, jak i liczne związki endogenne. Rodziny CYP1, CYP2, CYP3 oraz częściowo CYP4 są u ssaków związane głównie z przemianami ksenobiotyków, podczas gdy pozostałe rodziny zaangażowane są głównie w przemiany związków endogennych (tab. 233-2). Funkcjonalnie izoformy CYP różnią się między sobą przede wszystkim specyficznością substratową oraz podatnością na indukcję i inhibicję. Cytochromy P450 zaangażowane w biotransformację ksenobiotyków cechuje stosunkowo niska specyficzność substratowa przy znacznej indukcyjności, rozumianej jako zależny od dawki substratu wzrost ekspresji CYP i aktywności monooksygenazowej. Izoformy zaangażowane w przemiany związków endogennych mają większą specyficzność substratową, ale mniejszą indukcyjność w porównaniu z izoformami metabolizującymi ksenobiotyki.

Tabela 233-2. Wybrane najważniejsze klinicznie izoformy cytochromu P450 (CYP) wraz z przykładami metabolizowanych przez nie leków, używek i narkotyków.

Izoforma CYP

Spektrum substratów

Leki

Używki, narkotyki

CYP1A2

Agomelatyna, amitryptylina, flufenazyna, fluwoksamina, haloperidol, imipramina, klomipramina, klozapina, olanzapina, paracetamol, perfenazyna, teofilina, tiorydazyna, zyprazydon

Kofeina, ecstasy (MDMA)

CYP2C9

Amitryptylina, bupropion, diklofenak, fenytoina, fluoksetyna, ibuprofen, losartan, naproksen, paroksetyna, piroksykam, tolbutamid, S-warfaryna, tamoksyfen, tapentadol

AM-2201, JWH-018, kofeina, marihuana (THC)

CYP2C19

Amitryptylina, bupropion, citalopram, cyklofosfamid, diazepam, escitalopram, fenobarbital, imipramina, klomipramina, klopidogrel, klorazepat, klozapina, lanzoprazol, moklobemid, omeprazol, pantoprazol, perfenazyna, tiorydazyna, R-warfaryna

Marihuana, ecstasy (MDMA), NBOMes

CYP2D6

Amitryptylina, arypiprazol, atomoksetyna, buprenorfina, chlorpromazyna, dekstrometorfan, dezipramina, donepezil, duloksetyna, flufenazyna, fluoksetyna, haloperidol, imipramina, karwedilol, klomipramina, klozapina, kodeina, metadon, metoprolol, mirtazapina, morfina, nortryptylina, oksykodon, olanzapina, ondansetron, paliperydon, paroksetyna, perfenazyna, prometazyna, propafenon, rysperydon, sertindol, sertralina, timolol, tiorydazyna, tramadol, wenlafaksyna, zuklopentyksol

4-metoksyamfetamina (PMA), amfetamina, dekstrometamfetamina, ecstasy (MDMA), NBOMes, nikotyna

CYP3A4

Alprazolam, amitryptylina, arypiprazol, buprenorfina, buspiron, citalopram, cyklosporyna, dekstrometorfan, diazepam, diltiazem, estradiol, fentanyl, fluoksetyna, haloperidol, hydrokortyzon, klonazepam, klorazepat, klozapina, kodeina, kwetiapina, metadon, midazolam, morfina, oksykodon, paliperydon, paroksetyna, perfenazyna, pimozyd, progesteron, rysperydon, sertindol, sertralina, sibutramina, tamoksyfen, trazodon, wenlafaksyna, werapamil, większość statyn, zaleplon, zyprazydon, zolpidem, zopiklon, zuklopentyksol

Kofeina, kokaina, marihuana, ecstasy (MDMA), metoksetamina (MXE)

Największe znaczenie w ludzkiej biologii i medycynie ma podrodzina CYP3A, gdyż uczestniczy w metabolizowaniu aż 40-60% wszystkich obecnie stosowanych leków. Stanowi ona ok. 30% całkowitej ilości cytochromu P450 w ludzkiej wątrobie, a izoforma 3A4 wykazuje największą zawartość i najszerszą specyficzność substratową wśród wszystkich wątrobowych CYP.

Modulatory metabolizmu ksenobiotyków

Enzymy metabolizujące ksenobiotyki (drug-metabolizing enzymes, DMEs) podlegają złożonej, wielopoziomowej regulacji ekspresji białka i aktywności enzymatycznej. Ekspresja białek CYP w obrębie rodzin podlega różnym mechanizmom modulacji, najczęściej zależnym od tzw. receptorów jądrowych. Zdarza się jednak, że izoformy reprezentujące podrodziny podlegają podobnej kontroli w obrębie określonej rodziny CYP. Bezpośredni wpływ mają zarówno czynniki endogenne, głównie hormony i cytokiny, jak i egzogenne, np. leki. Te złożone zależności między metabolizmem ksenobiotyków i związków endogennych na poziomie receptorowym przedstawiono w sposób schematyczny na ryc. 233-2.

Ekspresja DMEs jest uwarunkowana genetycznie (patrz 311), a także zależna od wieku, płci, rodzaju tkanki oraz statusu hormonalnego. Wykazano ponadto, że ekspresja białek CYP jest tkankowo specyficzna oraz ulega zmianie w stanach chorobowych, np. cukrzycy czy marskości wątroby. Modyfikacja narażenia na ksenobiotyki poprzez rodzaj diety, stosowane leki, używki oraz czynniki środowiskowe może więc powodować istotne zmiany w aktywności tego układu enzymatycznego.

Interakcje lekowe

Interakcje między przyjmowanymi przez pacjenta lekami i/lub innymi ksenobiotykami (suplementami diety, używkami, narkotykami, dopalaczami) to istotny problem współczesnej medycyny. Ryzyko wystąpienia niekorzystnych interakcji zależy od liczby równocześnie stosowanych leków - przy dwóch lekach wynosi 13%, przy pięciu - 58%, a przy siedmiu i więcej - aż 82%. Interakcjom leków, oprócz polipragmazji, sprzyjają również choroby przewlekłe oraz wiek (skrajne grupy wiekowe - osoby starsze i dzieci). W tabeli 233-3 przedstawiono definicje podstawowych pojęć dotyczących interakcji farmakologicznych. Wśród rodzajów możliwych interakcji w zależności od mechanizmu wyróżnia się m.in.:

- interakcje farmaceutyczne - niezgodności recepturowe fizyczne i chemiczne w trakcie sporządzania preparatów;

- interakcje farmakokinetyczne - oddziaływania między przyjętymi ksenobiotykami powodujące zmiany procesów ADME i w efekcie zmiany stężeń w kompartmentach ciała;

- interakcje farmakodynamiczne - oparte głównie na mechanizmach receptorowych (np. inhibicja, zmiana przepuszczalności błon) i pozareceptorowych (np. fizykochemiczne, ingerencje biochemiczne przez fałszywe metabolity).

Interakcje farmakokinetyczne polegają na wzajemnym oddziaływaniu na siebie leków, których wynikiem są zmiany dotyczące losów leku w ustroju. Zmiany te można określić ilościowo. Typowym przykładem jest konkurowanie dwóch leków o ten sam izoenzym CYP, a także jego indukcja/inhibicja, prowadząca ostatecznie do zmniejszenia/wzrostu stężenia substratu (tab. 233-4). Ponieważ zahamowanie metabolizmu danego leku może prowadzić do wzrostu jego stężenia aż do poziomów toksycznych i śmiertelnych, w medycynie sądowej tego rodzaju interakcje mają największe znaczenie.

Interakcje farmakodynamiczne polegają z kolei na działaniu co najmniej dwóch leków synergistycznie lub antagonistycznie na ten sam receptor, narząd wykonawczy lub procesy sprzężenia zwrotnego, co skutkuje wzmocnieniem lub osłabieniem działania, w tym działań niepożądanych i potencjalnych fatalnych powikłań farmakoterapii.

Zapamiętanie wszystkich prawdopodobnych interakcji jest niemożliwe, nawet przy ograniczeniu się do leków, coraz popularniejsze staje się wykorzystanie specjalnych źródeł internetowych, baz danych lub dedykowanych programów analizujących możliwe interakcje w sposób automatyczny. Mogą być one wykorzystane również przez biegłych podczas opracowywania opinii (patrz 239).

Tabela 233-3. Słowniczek wybranych pojęć dotyczących interakcji farmakologicznych.

Antagonizm

Zjawisko, gdy co najmniej dwa leki wykazują przeciwne, różnokierunkowe działanie, wskutek czego hamują lub znoszą wzajemnie swoje efekty; w zależności od mechanizmu wyróżnia się antagonizm kompetycyjny (konkurowanie o ten sam receptor), niekompetycyjny, funkcjonalny i chemiczny

Dystrybucja leku

Rozmieszczenie leku w tkankach i narządach

Indukcja

Wzbudzenie lub przyspieszenie procesu, np. reakcji enzymatycznej

Inhibicja

Zahamowanie lub opóźnienie procesu, np. reakcji enzymatycznej

Interakcja lekowa

Wpływ jednego leku na końcowy efekt działania drugiego równocześnie przyjmowanego leku; może polegać na wzmacnianiu/osłabianiu działania lub skracaniu/przedłużaniu czasu działania

Poli(farmako)terapia

Kojarzenie leków, które w wyniku synergizmu swojego działania pozwalają na poszerzenie efektu terapeutycznego bez równoczesnego istotnego potęgowania ryzyka występowania działań niepożądanych

Polipragmazja

Jednoczasowe stosowanie leków, które nie tylko nie uzupełniają i nie wzmacniają swojego efektu terapeutycznego, ale znacząco zwiększają ryzyko wystąpienia polekowych działań niepożądanych

Synergizm

Zjawisko, gdy zastosowanie dwóch lub więcej leków wykazuje silniejsze działanie niż podanie ich oddzielnie (zgodne, jednokierunkowe działanie leków); wyróżnia się synergizm addycyjny (sumacja), kiedy efekt końcowy jest sumą działania poszczególnych leków, i synergizm hiperaddycyjny (potencjalizacja), gdy efekt końcowy jest większy niż suma działania poszczególnych leków

Tabela 233-4. Wybrane leki hamujące aktywność najważniejszych izoenzymów CYP i zwiększające w ten sposób stężenie ich substratów.

Izoforma CYP

Inhibitory

CYP1A2

Cyprofloksacyna, cymetydyna, disulfiram, doustne hormonalne środki antykoncepcyjne, enoksacyna, erytromycyna, flutamid, fluwoksamina, izoniazyd, ketokonazol, klarytromycyna, lewofloksacyna, meksyletyna, moklobemid, ofloksacyna, norfloksacyna, omeprazol, propafenon, tiklopidyna, werapamil

CYP2D6

Amiodaron, bupropion, celekoksyb, cymetydyna, dekstrometorfan, dekstropropoksyfen, difenhydramina, duloksetyna, fenotiazyny, flekainid, fluoksetyna, haloperidol, indynawir, klomipramina, kwas walproinowy, kwetiapina, lanzoprazol, meksyletyna, metadon, metoklopramid, metoprolol, moklobemid, nilotynib, pindolol, propafenon, propranolol, rysperydon, rytonawir, terbinafina, tiklopidyna, tymolol, trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne

CYP3A4

Acetazolamid, amiodaron, atazanawir, cyprofloksacyna, cyklosporyna, cymetydyna, cyzapryd, danazol, delawirdyna, diltiazem, doustne hormonalne środki antykoncepcyjne, efawirenz, erytromycyna, flukonazol, indynawir, itrakonazol, izoniazyd, ketokonazol, klarytromycyna, klotrimazol, kwas walproinowy, lopinawir, metadon, metronidazol, mifepriston, mikonazol, miłorząb japoński, nelfinawir, nilotynib, norfloksacyna, omeprazol, rytonawir, sakwinawir, statyny (atorwastatyna, fluwastatyna), terbinafina, trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne, trazodon, troleandomycyna, werapamil, zafirlukast

Bibliografia

1. Bazire S.: Psychotropic drug directory 2014. Lloyd-Reinhold Communications, Warwickshire 2014.

2. Fulton M.M., Allen E.R.: Polypharmacy in the elderly: a literature review. J. Am. Acad. Nurse Pract., 2005, 17: 123-132.

3. Kostka-Trąbka E., Woroń J.: Interakcje leków w praktyce klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2016.

4. Mozayani A., Raymon L. (red.): Handbook of drug interactions. A clinical and forensic guide. Springer, New York 2012.

5. Murray R.K., Granner D.K., Rodwell V.W. (red.): Biochemia Harpera. Wyd. VI. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008.

6. Ortiz de Montellano P.R. (red.): Cytochrome P450: structure, mechanism, and biochemistry. 4th edition. Springer-Verlag, New York 2015.

7. Woroń J., Siwek M., Filipczak-Bryniarska I. i wsp.: Nieprawidłowości farmakoterapii w medycynie paliatywnej - praktyczne aspekty. Medycyna Paliatywna w Praktyce, 2014, 8: 134-144.

8. Woroń J., Siwek M., Wasik A.: Interakcje leków w psychiatrii. AsteriaMed, Gdańsk 2019.

9. Zhou S.: Cytochrome P450 2D6 structure, function, regulation and polymorphism. CRC Press, Boca Raton 2016.

234Diagnostyka zatruć śmiertelnychGrzegorz Buszewicz

W ramach medycyny sądowej wykrycie lub wykluczenie śmiertelnego zatrucia jest najważniejszym celem badań toksykologicznych.

Toksykolodzy sądowi w tym zakresie pełnią podwójną funkcję:

- weryfikują wstępne ustalenia organów ścigania poczynione na podstawie tzw. okoliczności towarzyszących śmierci gwałtownej i/lub weryfikują ustalenia lekarzy medycyny sądowej podjęte na podstawie oględzin i sekcji zwłok;

- wykrywają (diagnozują) śmiertelne zatrucia w przypadkach, gdy nie ustalono, czy była to śmierć naturalna (zgon wskutek naturalnego procesu starzenia), zgon z powodu samoistnych zmian chorobowych, czy śmierć gwałtowna (patrz 014); przy braku wstępnych ustaleń stosowane są badania wielokierunkowe lub nieukierunkowane.

Śmierć gwałtowna to skutek zadziałania szkodliwego czynnika zewnętrznego, w tym m.in. urazu chemicznego.

Zadania toksykologów sądowych polegają na współpracy zarówno z medykami sądowymi, jak i osobami prowadzącymi postępowanie wyjaśniające (prokuratorami). Są oni pierwszymi i głównymi odbiorcami ekspertyz, a podjęte przez nich czynności wstępne, które poprzedzają wykonanie analiz laboratoryjnych materiału biologicznego pobranego ze zwłok determinują tzw. strategię badań (patrz 235-237). Te wstępne czynności (ustalenia) obejmują ocenę:

- dowodów "osobowych":

- zeznań świadków;

- wyjaśnień osób podejrzanych o popełnienie przestępstwa;

- innych informacji (np. notatek urzędowych) o okolicznościach śmierci, które nawiązują do medyczno-sądowej klasyfikacji zatruć - np. podejrzenie samobójstwa, zabójstwa itp. (patrz 231 i 232);

- dowodów "materialnych", czyli wyników oględzin, badań specjalistycznych, przeszukań i wizji lokalnych, w tym:

- oględzin zewnętrznych oraz sekcji zwłok;

- specjalistycznych badań kryminalistycznych;

- oględzin miejsca znalezienia zwłok;

- historii choroby (gdy zgony zostały poprzedzone pobytem w szpitalu);

- badań toksykologicznych dowodów rzeczowych zabezpieczonych w miejscu znalezienia zwłok.

Osiągnięcie celu, czyli wykrycie lub wykluczenie śmiertelnego zatrucia, wymaga użycia adekwatnych środków, czyli sprawdzonych pod względem dowodowym (zwalidowanych) metod instrumentalnych zastosowanych zgodnie z odpowiednim dla danej sprawy (danego przypadku) schematem postępowania diagnostycznego (ryc. 234-1). Jest to tzw. strategia badań toksykologicznych (patrz 236), która ułatwia wykonanie dowodowej ekspertyzy toksykologicznej przy optymalnym nakładzie pracy (czas, liczba zaangażowanych osób) i użytych środków materiałowych (aparatura, odczynniki itp.).

Bibliografia

1. A simplified guide to forensic toxicology. National Forensic Science Technology Center, Largo 2013. http://www.forensicsciencesimplified.org/tox/Toxicology.pdf [dostęp 03.09.2020].

2. Hearn W.L., Druid H.: Strategies for post-mortem toxicological investigation. W: Drug abuse handbook (red. S.B. Karch). CRC Press, Boca Raton 2007; s. 1026-1052.

3. Hearn W.L., Walls H.Ch.: Introduction to postmortem toxicology. W: Postmortem toxicology of abused drugs (red. S.B. Karch). CRC Press, Boca Raton 2008; s. 1-10.