C1. Historia mikrobiologii i pierwsze odkrycia

Historia bakteriologii

Dopiero po wynalezieniu mikroskopu (przez braci Janssen ok. 1590 roku) udało się zaobserwować drobnoustroje jako maleńkie struktury występujące na różnych powierzchniach. Robert Hooke odwiedzał europejskie dwory, pokazując na nich zarodnikotwórcze struktury tworzone przez pleśnie, a w roku 1660 opublikował pierwszą pracę poświęconą drobnoustrojom (Micrographia). Pierwszym człowiekiem, który zobaczył prokarioty pod mikroskopem, był Antoni van Leeuwenhoek; dokonał tego w roku 1676. Wyniki swoich badań nad tymi "żyjątkami" (ang. animicules) przedstawił Towarzystwu Królewskiemu w Londynie. Teoria samorództwa zahamowała jednak dalsze badania, ponieważ zakładała, że za spontaniczne powstawanie pleśni i innych organizmów psujących niezabezpieczoną żywność odpowiada siła boska. Przekonanie, że organizmy żywe mogły narodzić się z materii nieożywionej, powstało w czasach Arystotelesa (384-322 p.n.e.), a zostało obalone (ale nie całkowicie odrzucone) w wyniku eksperymentów przeprowadzonych w 1861 roku przez Pasteura, z wykorzystaniem kolb z łabędzimi szyjami. Pozwoliły one na długoterminowe przechowywanie bulionu wołowego w niezmienionym stanie, a proces jego psucia rozpoczął się dopiero wówczas, gdy do bulionu wprowadzono ponownie przenoszący się w powietrzu, niewidzialny czynnik zanieczyszczający.

Za ojca założyciela bakteriologii jako nauki uważa się Ferdinanda Cohna, który zaproponował klasyfikację bakterii na podstawie ich morfologii, a w roku 1875 jako pierwszy użył terminu "Bacillus". Krótko potem, w latach 1876-1884, swoje przełomowe prace zaczął publikować Robert Koch, który wykazał niepodważalny związek między bakteriami a chorobami (tzw. postulaty Kocha). Martinus Beijerinck opracował technikę hodowli wzbogacającej, a w roku 1889 wyhodował pierwszą czystą kulturę Rhizobium, rok przed tym, jak Winogradski dowiódł zależności między tlenem a nitryfikacją bakterii. Beijerinck dał również początek wirusologii jako nauce, a pracując dla holenderskiego przedsiębiorstwa produkującego drożdże, związał mikrobiologię i biotechnologię. Na przełomie XIX i XX wieku zaczęło wychodzić pierwsze pismo poświęcone mikrobiologii ("Journal of Bacteriology", publikowany do dziś przez Amerykańskie Towarzystwo Mikrobiologiczne), ponadto nazwano wówczas wiele organizmów, które do dziś badamy, przy czym klasyfikowano je inaczej, niż czynimy to obecnie. Przez wiek XX i na początku wieku XXI bakterie były i są modelowymi systemami dla badań biochemicznych, czego ukoronowaniem było zsekwencjonowanie genomu Haemophilus influenzae w roku 1995 przez Ventera i współpracowników.

Główne podgrupy

Wysiłki pierwszych bakteriologów (Cohna, Kocha i Beijerincka) skupiały się na identyfikacji i klasyfikacji bakterii (rozdział B1). Opierali się oni jednak na morfologii (ogólnym kształcie) organizmów, a jako że większość bakterii pod mikroskopem wygląda jak pałeczka, zaś na płytkach agarowych tworzy kolonie białe lub kremowe, podejście to miało swe ograniczenia. Opracowane w 1884 roku barwienie (metoda Grama) przez duńskiego lekarza Hansa Christiana Grama umożliwiło podzielenie prokariotów na dwie grupy, które jak okazało się później, różniły się strukturą ściany komórkowej. Bakterie Gram-dodatnie barwiły się na fioletowo (fioletem krystalicznym), zaś ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych pozwalała na usunięcie barwnika. Bakterie Gram-dodatnie o małej zawartości par GC tworzą obecnie typ Firmicutes, zaś te o dużej zawartości par GC - typ Actinobacteria (rozdział C6), ale okazało się, że bakterie Gram-ujemne są znacznie bardziej zróżnicowane pod względem fenotypowym i genetycznym. Przez pewien czas zaliczano do nich także archeony. Obecnie typowe bakterie Gram-ujemne znajdują się w typie Proteobacteria.

Dziś odróżniamy bakterie od archeonów i potrafimy je podzielić na dalsze grupy (typy taksonomiczne) na podstawie filogenezy. Trzeba jednak podkreślić, że istnieje wiele własności fizjologicznych i metabolicznych, które są rozpowszechnione wśród przedstawicieli należących do różnych typów domeny Bacteria. Na przykład do żadnego konkretnego typu nie należą bakterie zdolne do wywołania chorób człowieka, ani te zdolne do denitryfikacji, ani też beztlenowce czy bakterie zdolne do przeprowadzania fotosyntezy. Większość gatunków bakterii cechuje się unikatowymi własnościami, które mogą znacząco odróżniać je od innych przedstawicieli tego samego rodzaju, a niektóre z tych cech występują u różnych bakterii o odmiennej filogenezie.

C2. Różnorodność prokariotów

Różnorodność morfologiczna

Modelowy organizm wykorzystywany w bakteriologii, Escherichia coli, ma kształt pałeczki i liczy 3 mikrometry długości i 1 mikrometr średnicy. Do pałeczek zaliczamy wiele różnych bakterii. Pałeczki występują we wszystkich grupach taksonomicznych bakterii, jak i archeonów. Sprawia to, że w przeciwieństwie do klasyfikacji organizmów wyższych kształt nie stanowi miarodajnego kryterium klasyfikacji prokariotów (tab. 1), choć jest to jednocześnie jedna z nielicznych własności rozróżniających komórki widoczne pod mikroskopem optycznym. Kształt niektórych prokariotów wywarł wpływ na ich nazewnictwo. Rodzaj Bacillus, należący do bakterii Gram-dodatnich, obejmuje gatunki zwane laseczkami (łac. bacillus - kijek, laska), podczas gdy do innego rodzaju bakterii Gram-dodatnich, Streptococcus (oba rodzaje są z typu Firmicutes), należą gatunki o kształcie kulistym (ziarniaki, łac. coccus - ziarenko) o średnicy 1 mikrometra.

Bakterie i archeony to bytujące samodzielnie, jednokomórkowe mikroorganizmy, które rozmnażają się najczęściej w wyniku podziału poprzecznego (rozdział C9), w związku z czym po podziale zarówno komórka rodzicielska, jak i komórka potomna są zwykle tych samych rozmiarów. Kształt większości bakterii jest prosty, regularny (kulisty, cylindryczny itp.), choć istnieją od tej reguły wyjątki, np. bakteria Stella humosa ma kształt gwiazdy. Niektóre bakterie, takie jak należący do promieniowców Streptomyces coelicolor, rozwijają się w postaci długich strzępek zawierających wiele kopii chromosomów, pojęcie pojedynczej komórki może w jego przypadku budzić wątpliwości.

W warunkach stresu komórki wielu prokariotów zmniejszają się, czyli wchodzą w tzw. fazę spoczynkową. Najmniejsze wegetatywne prokarioty to morskie ultramikrobakterie, takie jak Sphingopyxis alaskensis, których średnica wynosi mniej niż 0,3 mikrometra, zaś szacowana objętość komórki nie przekracza 1 mikrometra sześciennego. Do najmniejszych bakterii kolonizujących organizm człowieka zaliczamy mikoplazmy i chlamydie - rozmiary Mycoplasma genitalium wynoszą zaledwie 0,2 na 0,3 mikrometra. Choć wydają się one maleńkie w porównaniu z komórkami eukariotycznymi (2-200 mikrometrów), Zespół ds. Badań Przestrzeni Kosmicznej Narodowej Akademii Nauk USA wyliczył, że teoretycznie najmniejszy zdolny do przeżycia organizm mógłby mieć kształt kuli o średnicy 0,17 mikrometra. Przy obliczaniu tego minimalnego rozmiaru wzięto pod uwagę minimalny zestaw genów, rybosomy oraz inne składniki komórki niezbędne do przeżycia.

Pod mikroskopem optycznym organizmy takie jak Bacillus megaterium (4 × 1,5 mikrometra) i cyjanobakteria Oscillatoria (50 × 8 mikrometrów) wydają się wyjątkowo dużych rozmiarów w porównaniu z E. coli. Największym znanym nauce prokariotem jest bakteria siarkowa Thiomargarita namibiensis, osiągająca długość 750 mikrometrów i średnicę w zakresie 100-250 mikrometrów. Można ją zobaczyć "gołym" okiem. Organizmy blisko z nią spokrewnione są zdolne do wytwarzania filamentów złożonych z wielu komórek, o długości nawet kilku centymetrów. Bakterie te, jak również m.in. Epulopiscium fishelsoni (symbiont pokolcowatych, osiągający długość 600 mikrometrów, a w miejscu najszerszym liczący 75 mikrometrów), mają nieco więcej cytoplazmy niż pojedyncza komórka E. coli, a większość objętości ich komórki stanowią wakuole. Ponieważ transport wielu substratów i metabolitów prokariotów odbywa się głównie dzięki dyfuzji, to cała cytoplazma dużej komórki musi znajdować się blisko błony komórkowej, co jest osiągnięte dzięki wakuolom, które pozwalają na zwiększenie rozmiarów bakterii.

Różnorodność siedlisk

Prokarioty mogą rozwijać się w warunkach skrajnej temperatury i pH, przy różnym stężeniu tlenu i przy dużych dawkach promieniowania. Dzięki temu zdołały skolonizować całą planetę, dostarczającą im substratów do wzrostu. Sposób wzrostu mikroorganizmów dostarcza możliwości ich opisu, dokonywanego według ich zdolności do wykorzystywania do rozwoju określonych związków (-trofia) lub tolerancji na określone warunki fizyko-chemiczne (-filia). Tak więc organizm wykorzystujący do wzrostu związki organiczne nazywamy heterotrofem, zaś organizm tolerujący atmosferyczne stężenie tlenu to aerofil. Zakres nazewnictwa przedstawia tab. 2.

Odkryto bakterie i grzyby rozwijające się w śniegu, zaś górny limit temperaturowy dla życia bakterii wynosi ok. 96°C (Aquifex aeolicus). Rekord tolerancji wysokiej temperatury pobiły jednak archeony - ich przedstawiciel, Pyrolobus fumarii, bytuje w temperaturze 113 stopni Celsjusza. Na powierzchni Ziemi nie mamy do czynienia z tak wysokimi temperaturami - są one ograniczone do występujących na dużych głębokościach czarnych kominów hydrotermalnych. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje wiele gatunków archeonów bytujących w bardzo niskich lub w bardzo wysokich temperaturach, stąd też powszechnie uważa się tę grupę organizmów za ekstremofile.

Tab. 2. Powszechnie stosowany opis mikroorganizmów

Wymagania wzrostowe

Opis

Przykład

Węgiel ze związków organicznych

Heterotrofia

Escherichia coli

Węgiel z dwutlenku węgla

Autotrofia

Paracoccus denitrificans

Węgiel ze związków C1

Metylotrofia

Methylobacterium extorquens

Energia słoneczna

Fototrofia

Rhodobacter sphaeroides

Energia ze związków nieorganicznych

Litotrofia

Acidithiobacillus ferrooxidans

Energia ze związków organicznych

Heterotrofia

Escherichia coli

Azot cząsteczkowy

Diazotrofia

Rhizobium leguminosarum

Tlen atmosferyczny

Aerofilia

Pseudomonas aeruginosa

Obniżony poziom tlenu

Mikroaerofilia

Campylobacter jejuni

Brak tlenu

Beztlenowość

Clostridium tetani

Wysokie stężenie soli

Halofilia

Halobacterium salinarum

Wysoka zasadowość

Alkalifilia

Bacillus pseudofirmus

Wysoka kwasowość

Acydofilia

Lactobacillus acidophilus

Niska temperatura (<0 do 12 stopni Celsjusza)

Psychrofilia

Psychromonas profunda

"Normalna" temperatura (10 do 47 stopni Celsjusza)

Mezofilia

Escherichia coli

Umiarkowanie wysoka temperatura (40 do 68 stopni Celsjusza)

Termofilia

Geobacillus (Bacillus) stearothermophilus

Wysoka temperatura (68 do 98 stopni Celsjusza)

Hipertermofilia

Thermus aquaticus

Bardzo wysoka temperatura (90 do ponad 110 stopni Celsjusza)

Skrajna hipertermofilia

Pyrodictium occultum

W celu wskazania na więcej niż jedną właściwość fizjologiczną danego organizmu terminy można ze sobą łączyć, np. archeon Acidianus breyerli można nazwać hipertermofilnym chemolitoautotrofem. Termin "obligatoryjny" ("bezwzględny") można stosować w celu stwierdzenia, że wzrost danego organizmu jest ograniczony do określonych warunków, np. Methylococcus capsulatus może rozwijać się tylko w obecności metanu, wobec czego jest on obligatoryjnym metanotrofem.

C3. Kultury bakterii w laboratorium

Podłoża hodowlane

Mikrobiolog mający zamiar wyhodować drobnoustroje w laboratorium musi podjąć wiele decyzji. Biomasa wprowadzana do podłoża hodowlanego nosi nazwę inokulum, a jeden z pierwszych wyborów, jakich trzeba dokonać, dotyczy rodzaju podłoża do inokulacji: czy ma być ono stałe, czy płynne. Podłoże wybiera się tak, by odpowiadało źródłu inokulum, którym może być kultura mieszana, złożona z wielu różnych gatunków mikroorganizmów, lub czysta kultura, złożona tylko z jednego gatunku. Podłoża stałe umieszczane są zazwyczaj w okrągłych, sterylnych, plastikowych pojemnikach z pokrywką (szalkach Petriego), a zestala je agar. Za pomocą sterylnej igły bądź plastikowej ezy dokonuje się posiewu redukcyjnego, zaś za pomocą głaszczki posiewu powierzchniowego danej hodowli drobnoustrojów.

Mikroorganizmy cechują się niesłychaną różnorodnością metaboliczną (rozdziały C2, C5 i E4), wobec czego wymagają dostosowanego składu podłoża. Niektóre organizmy syntetyzują wszystkie składniki komórki z prostych źródeł węgla i energii, takich jak glukoza, a do ich wzrostu wystarczy podłoże minimalne (syntetyczne/zdefiniowane). Podłoże takie zawiera sole nieorganiczne azotu, fosforu, siarki, magnezu, potasu oraz żelaza i może być uzupełnione pierwiastkami śladowymi, takimi jak cynk, mangan, bor, kobalt, miedź, nikiel, chrom czy molibden. Organizm potrzebuje bardzo niewielkich ilości tych pierwiastków; są one wykorzystywane jako grupy prostetyczne pewnych enzymów (np. dehydrogenaza alkoholowa zawiera cynk). Prawdziwie minimalne podłoże nie zawiera żadnych związków, których organizm nie wymaga do wzrostu, ale jeśli dostarczy się organizmowi dodatkowe witaminy, takie jak ryboflawina, tiamina, kwas nikotynowy, pirydoksyna, pantotenian wapnia, biotyna, kwas foliowy czy witaminę B12, jego wzrost będzie z reguły przebiegał szybciej. Witaminy również dostarczane są w minimalnych ilościach, wystarczających do udziału w syntezie enzymów, ale nie tak dużych, by mogły pełnić rolę źródła węgla i/lub energii.

Podczas hodowania wybranych auksotrofów (rozdział F3), czyli bakterii wymagających np. aminokwasów, konieczne może okazać się uzupełnienie podłoża minimalnego wszystkimi dwudziestoma aminokwasami lub pewną ich grupą. Jest to niezbędne często w przypadku patogenów, które żyjąc w organizmie gospodarza zwierzęcego, straciły zdolność do syntezy jednego lub wszystkich enzymów uczestniczących w szlakach syntezy aminokwasów. Określanie wymagań aminokwasowych jest czasochłonne i kosztowne, w związku z czym można wówczas wykorzystać podłoże złożone.

Podłoża złożone mają charakter zdefiniowany w tym sensie, że do roztworu dodawane są znane ilości jonów buforowych, jak i określone ilości ekstraktów z roślin, zwierząt czy drożdży. Popularne podłoże złożone, bulion Luria Bertani, zawiera 5 g NaCl na litr, zaś węgiel, energia, pierwiastki śladowe i inne czynniki wzrostu dostarczane są w 5 g ekstraktu drożdżowego na litr i 10 g tryptonu na litr. Trypton to kazeina (białko mleka) strawiona enzymami trzustkowymi, stąd dokładny jego skład, rozumiany jako stężenie molowe aminokwasów, krótkich peptydów itd., jest nieznany i różni się w zależności od producenta. Nieznany jest także skład ekstraktu drożdżowego, czyli hydrolizatu drożdży piekarniczych (Saccharomyces cerevisiae). Patogenne bakterie wywołujące bakteremię hoduje się często na podłożu złożonym, zawierającym krew w całości lub krew po częściowej hydrolizie, która dostarcza niezbędnych czynników wzrostu, ale również może być wskaźnikiem obecności organizmów hemolitycznych, które wytwarzają koliste przejaśnienia wokół kolonii na czerwonym podłożu z krwią.

Podłoża płynne można umieścić w rozmaitych pojemnikach, adekwatnych do wymagań tlenowych hodowanego organizmu. Beztlenowce fakultatywne i beztlenowce można hodować w odpowiednich butelkach, których zawartość jest łagodnie wytrząsana w celu jej wymieszania, podczas gdy w przypadku tlenowców, najczęściej wykorzystywanych w badaniach, prowadzi się z reguły hodowle okresowe (rozdział D2) w kolbach Erlenmeyera. Kolby te mają stożkowy kształt, a ich objętość wynosi od 5 ml do 5 l. Wypełnia się je do 10% objętości, tak by podłoże płynne miało wystarczającą powierzchnię dla transferu tlenu do hodowli (rozdział D2). Inokulacja podłoży płynnych i stałych, jak i przenoszenie hodowli z jednego pojemnika do drugiego bez przedostania się do nich organizmów zanieczyszczających to tzw. technika aseptyczna.

Przez ostatnie 100 lat podłoża hodowlane dopracowywano zarówno pod względem składu, jak i użyteczności. Skład podłoży selekcyjnych i różnicujących umożliwia wzrost tylko jednego rodzaju lub grupy organizmów. Dla przykładu podłoże minimalne zawierające metanol, pełniący rolę źródła węgla i energii, dopuszcza wyłącznie wzrost metylotrofów, organizmów zdolnych do metabolizmu zredukowanych związków C1. Podłoże można udoskonalić, tak by miało charakter diagnostyczny. Z kolei stałe podłoże Bairda Parkera umożliwia wzrost zaledwie kilku rodzajów organizmów, w tym Micrococcus i Staphylococcus, przy czym jedynie w wyniku wzrostu Staphyloccus aureus powstają siwo-czarne świecące kolonie o białych brzegach i oddzielone od siebie strefą 2-5 mm. Ten kształt kolonii przypominającej żółtko jest pierwszą wskazówką obecności potencjalnych patogenów, zanim jeszcze przeprowadzi się bardziej szczegółowe analizy.

Większość podłoży stosowanych w mikrobiologii nadaje się do badania tlenowców, a do hodowli beztlenowców, w szczególności tych, dla których tlen jest szkodliwy (niektóre gatunki należące do rodzaju Clostridium i przedstawiciele archeonów), wymagane są specjalne warunki. Całkowita eliminacja tlenu jest trudna do osiągnięcia, ale możliwa dzięki technikom opracowanym przez Hungate'a.

Przechowywanie i reaktywacja mikroorganizmów

Bakterie i archeony są niezwykle odporne na skrajne warunki - wiele z nich, nawet w stanie wegetatywnym, jest w stanie przetrwać zamrożenie lub wysuszenie, bez szkodliwego wpływu. Sprawia to, że duża część prokariotów - choć w żadnym razie nie wszystkie - może być przechowywana przez dekady jako zagęszczona (np. w wyniku wirowania) biomasa. W warunkach laboratoryjnych długoterminowe przechowywanie takiej biomasy polega często na jej zamrożeniu w temperaturze -70 stopni Celsjusza w 50-procentowym roztworze glicerolu, choć należy pamiętać, że czasem prowadzi to do śmierci komórek. Alternatywą jest mrożenie w roztworze dimetylosulfotlenku (DMSO), lecz w przeciwieństwie do komórek eukariotycznych prokarioty rzadko wymagają przechowywania w ciekłym azocie. Większe laboratoria stać na zakup sprzętu do suszenia po zamrożeniu, czyli liofilizacji hodowlowli. Jest to zdecydowanie najskuteczniejsza metoda długoterminowego przechowywania komórek. Krótkoterminowe (tj. trwające maksymalnie tydzień) przechowywanie na potrzeby laboratoryjne polega z reguły na posiewie redukcyjnym bakterii na podłożu stałym znajdującym się w odpowiednim naczyniu (szalce Petriego lub 30-mililitrowej butelce). Okres przechowywania jest jednocześnie okresem głodzenia komórek, które w związku z tym muszę być reaktywowane na podłożu złożonym, tak by nie doświadczyły zbyt dużego stresu.

Sterylizacja

Po zakończeniu badania mikrobiologicznego żywe mikroorganizmy powinny być zniszczone w bezpieczny sposób. Podobnie też przed rozpoczęciem eksperymentu inaktywowane powinny być wszystkie żywe komórki, tak by występowało wyłącznie pożądane inokulum. Nastręcza to mikrobiologom problemów, szczególnie tym, którzy pracują z patogenami, termofilami lub bakteriami wytwarzającymi spory. Wiele pospolitych patogenów bakteryjnych atakujących człowieka zabija proces pasteryzacji (poddanie ich działaniu temperatury 71,7 stopnia Celsjusza przez 15 sekund), który nie wpływa znacząco na podłoże i dlatego też wykorzystywany jest w konserwacji żywności. Sterylizacja ciepłem wilgotnym, przez wrzącą wodę lub gorącą parę, zabija większość komórek wegetatywnych, jak i niektóre wirusy, ale nie termofile i endospory. Z kolei autoklawowanie skażonego sprzętu (działanie przez ponad 15 minut temperatury 121 stopni Celsjusza, osiąganej dzięki zastosowaniu ciśnienia wyższego niż ciśnienie atmosferyczne o 15 psi, czyli 100 kPa) zabija wszystkie komórki i wirusy oraz endospory, ale nie da się go zastosować do poliwęglanów (z których wykonanych jest wiele plastikowych pojemników). Ponadto powoduje karmelizację wielu węglowodanów będących składnikami podłoża. Do pracy ze składnikami wrażliwymi na tak wysoką temperaturę stosuje się następujące metody:

- Tyndalizacja - kilkukrotne podgrzewanie do temperatury 90-100 stopni Celsjusza przez 10 minut i następujące po nim schładzanie i inkubacja trwająca 1-2 dni. Proces umożliwia kiełkowanie endospor w podłożu, ale kolejne podgrzewanie ostatecznie je zabija.

- Promieniowanie UV - zabija komórki żywe, ale nie przenika przez nieprzezroczyste pojemniki i roztwory o dużej objętości.

- Promieniowanie gamma - zabija komórki żywe, ale wywołuje kruchość poliwęglanów i polipropylenu.

- Filtracja podłoży - Filtry 0,22 ?m są odpowiednie do sterylizacji roztworów wodnych zawierających termolabilne składniki, ale trudno jest skutecznie filtrować ich większe (> 500 ml) objętości z zachowaniem sterylności.

C4. Badanie liczby drobnoustrojów

Otrzymywanie czystej kultury

Pojęcie kultury czystej stanowi samo jądro mikrobiologii w jej klasycznym wydaniu, a ponadto jest fundamentem postulatów Kocha (zob. Instant Notes in Medical Microbiology). Jeśli organizm jest zdolny do wzrostu na agarze, może zostać poddany posiewowi redukcyjnemu w celu otrzymania pojedynczych kolonii, z których każda powinna powstać z jednej komórki prokariotycznej (ryc. 1). Odpowiada za to rozcieńczanie związane z każdą kolejną rundą posiewu redukcyjnego i sterylizacją ezy. W pierwszym posiewie inokulum na płytkę dostają się miliony bakterii, ale po każdym przeciągnięciu ezy po płytce jest ich coraz mniej, a komórki są coraz bardziej oddalone od siebie. Ponieważ eza jest za każdym razem sterylizowana, w ostatniej linii posiewu (przed okresem inkubacji) może znajdować się mniej niż 10 komórek.

Wiele komórek prokariotycznych nie jest zdolnych do wzrostu na płytkach agarowych. W takim przypadku proces rozcieńczania służący otrzymaniu kultury czystej przeprowadza się w płynnym bulionie. Sterylną pipetą pobiera się jeden mililitr wyjściowej hodowli płynnej i dodaje się do 9 ml nowego sterylnego podłoża (dziesięciokrotne rozcieńczenie, zapisywane jako 10-1). Rozcieńczenie 10-1 jest dokładnie mieszane, po czym zostanie z niego pobrany 1 ml i dodany do 9 ml nowego sterylnego podłoża (stukrotne rozcieńczenie, zapisywane jako 10-2). Proces powtarzany jest jeszcze 10 lub 12 razy, a następnie rozcieńczenia zostają poddane inkubacji. Największe rozcieńczenia nie wykażą żadnego wzrostu, a podłoże w innych stanie się mętne. Wzrost obserwowany w największym rozcieńczeniu będzie prawdopodobnie wynikiem inokulacji mniej niż 10 komórkami. Gdy taki proces wykonamy jednocześnie w dziesięciu powtórzeniach, to ostatecznie może to doprowadzić do otrzymania czystej kultury, bowiem wzrost w 3-4 powtórzeniach na 10, jednego z rozcieńczeń, będzie wynikał z pierwotnej obecności jednej komórki. Taki sposób może też zostać wykorzystany do określenia liczby bakterii w metodzie najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN; zob. niżej).

Analiza liczby prokariotów

W mikrobiologii ważne często jest poznanie liczby komórek przypadających na mililitr próbki. Możemy być prawie pewni, że w pobranej próbce znajdziemy wiele gatunków prokariotów, w tym ten, którego poszukujemy, byleby próbka była wystarczająco duża i została pobrana z siedliska, które sprzyja wzrostowi danego organizmu. Jest prawdopodobne, że w jajkach znajdziemy bakterie Salmonella, ale pytanie brzmi "Czy jajka te są zdatne do spożycia?". Aby tak było, w ilości jajek zjadanych na surowo musi znajdować się taka liczba Salmonella, która nie spowoduje zatrucia. Liczba komórek Salmonella, które wywołają zatrucie pokarmowe, wynosi ok. 40, możemy więc założyć, że jeśli jaja mają być bezpieczne, na ich tuzin powinno przypadać mniej niż 40 komórek Salmonella. Takie limity są podstawą standardów stosowanych w przemyśle spożywczym - widzimy więc, że szacowanie liczby bakterii jest kluczową praktyką w tej gałęzi gospodarki. W medycynie występowanie jednej lub dwóch komórek Staphylococcus aureus na 10 cm kwadratowych skóry człowieka uważa się za sytuację normalną, ale obecność 104 komórek na mm2 może być już przyczyną poważnych problemów dermatologicznych. W mikrobiologii środowiskowej względne liczby organizmów w mililitrze próbki wody z rzeki mogą wskazywać, które gatunki są w tym środowisku dominujące.

Liczbę prokariotów w próbce można wyrazić na dwa sposoby: jako ich liczbę łączną i jako liczbę komórek żywych. Ta pierwsza miara odnosi się do liczby komórek żywych i martwych, ta druga zaś tylko do tych komórek, które są zdolne do wzrostu w analizowanych warunkach. Do określania liczby całkowitej służy rozcieńczanie próbki w ustalonej ilości buforu i następnie liczenie komórek za pomocą hemocytometru. Hemocytometr to specjalne szkiełko mikroskopowe (i przykrywające je szkiełko nakrywkowe), dzięki któremu pod mikroskopem widzimy "kratki" określonej wielkości (będące de facto studzienkami o znanej objętości). Znając liczbę komórek przypadających na studzienkę, można następnie otrzymać liczbę komórek w ml badanej próbki. Podobną pod względem samej koncepcji metodą jest cytometria przepływowa, polegająca na elektronicznym zliczaniu cząstek w małej próbce poprzez przepuszczanie wiązki lasera przez kapilarę o szerokości mniej więcej jednej komórki.

W ostatnim czasie metody te są uzupełniane przez technikę ilościowej PCR (qPCR). Pozwala ona na określenie liczby kopii pojedynczych genów. Jeśli na przykład uda nam się określić liczbę kopii genu 16S rRNA na ml, będziemy mieli pewne rozeznanie co do liczby bakterii. Choć metoda ta ma trochę wad (nie mamy pewności czy genom wszystkich bakterii zawiera tylko jedną kopię tego - lub jakiegokolwiek innego - genu), dzięki niej jesteśmy w stanie w tym samym czasie obliczać stosunek liczebności wielu różnych eukariotów i prokariotów poprzez przeprowadzanie równoległych eksperymentów na tej samej próbce, z wykorzystaniem zestawów specyficznych starterów. Wskazówką, czy komórki są żywe, czy uśpione, może być obecność ATP. Ogólną aktywność próbki można więc oszacować, dokonując (chemicznego) pomiaru ilości ATP. Podobnie też jedynie żywe komórki mogą przeprowadzać transkrypcję DNA, wobec czego dokonując pomiaru stężenia mRNA (RNA przekaźnikowego) genów rybosomowych za pomocą qPCR z odwrotną transkrypcją, można sprawdzić, ile komórek jest żywych. Zakłada się, że transkrypty te będą gromadzić się wyłącznie w aktywnych komórkach.

Najczęściej stosowaną i wartościową poznawczo metodą badania liczby prokariotów jest określanie liczby komórek żywych. Zwykle robi się to, stosując metodę seryjnych rozcieńczeń (ryc. 2). W tej metodzie wykorzystuje się płytki agarowe, a wynik przedstawia w postaci liczby jednostek tworzących kolonię (jtk) ml-1 (ang cfu - colony forming unit). Nie jest to wartość równoważna rzeczywistej liczbie komórek żywych, ponieważ uwzględnia tylko te gatunki, które utworzą widoczne kolonie na danym podłożu i w danych warunkach inkubacji, wybranych na potrzeby przeprowadzanego eksperymentu. Liczbę komórek w wyjściowej próbce ustala się, rozpoczynając od policzenia kolonii na tej z płytek, która zawiera największą liczbę łatwo dostrzegalnych kolonii. Zazwyczaj wartość ta wynosi mniej niż 200 kolonii na płytkę, różni się jednak w zależności od rozmiaru kolonii. Ekwiwalentną metodą obliczania liczby prokariotów, które nie rosną na agarze, jest technika najbardziej prawdopodobnej liczby, w ramach której do oszacowania liczby w próbce wyjściowej służy posiew różnych rozcieńczeń tej próbki na podłoże płynne w wielu powtórzeniach.

Jednym z najbardziej precyzyjnych sposobów liczenia wszelkich mikroskopijnych cząstek jest sortowanie komórek na podstawie ich fluorescencji (FACS, ang. flourescence-activated cell sorting). Możliwe jest opracowanie barwników fluorescencyjnych, które będą odmiennie barwić komórki żywe i martwe. Próbka wprowadzana jest do wąskiej kapilary, o średnicy równej zaledwie szerokości jednej komórki i przechodzi przez wiązkę lasera. Laser wzbudza barwnik fluorescencyjny i wzbudzenie to przechodzi do detektora. Detektor połączony jest z bramką położoną tuż poniżej lasera, który po włączeniu przemieści komórkę do pojemnika. Komórki niefluorescencyjne nie spowodują otwarcia bramki i przemieszczą się do drugiego naczynia. Można obliczyć, ile razy bramka się otwiera wskutek wzbudzenia, a po zestawieniu uzyskanego wyniku z szybkością przepływu przez wiązkę lasera można podać dokładną liczbę komórek w próbce.

C5. Obserwacja mikroorganizmów

Mikroskopia optyczna - technika starej daty!

Spośród organizmów klasyfikowanych jako drobnoustroje gołym okiem można zobaczyć tylko większych przedstawicieli grzybów i zielenic. Kilka mikroorganizmów ma rozmiar od 200 do 500 mikrometrów i można je zobaczyć przy użyciu lupy, jednak rozmiar komórek zdecydowanej większości drobnoustrojów waha się w granicach od 1 do 10 mikrometrów. Aby je zobaczyć, trzeba więc zastosować znaczne powiększenie, w związku z czym do ich obserwacji używa się mikroskopów.

Pierwsze mikroskopy miały proste, pojedyncze soczewki, zapewniające powiększenie wystarczające do obserwacji drożdży, protistów i większych bakterii. Pionierzy mikroskopii, Robert Hooke (1665) i Antoni van Leeuwenhoek (1684), korzystali właśnie z nich i za ich pomocą zaobserwowali drobnoustroje i je szkicowali. Współczesne mikroskopy optyczne to mikroskopy złożone - zbudowane z soczewki obiektywu (o powiększeniu nawet 100-krotnym) i soczewki okularu (o powiększeniu zazwyczaj 10-krotnym) (ryc. 1), które łącznie dają powiększenie 1000-krotne. Przy maksymalnym powiększeniu do optymalizacji skupiania światła i do poprawy rozdzielczości stosuje się olejek nakładany między preparatem a obiektywem (ryc. 2). Granica rozdzielczości mikroskopu optycznego wynosi ok. 0,2 mikrometra (oznacza to możliwość rozróżnienia dwóch czarnych punktów oddalonych od siebie o 0,2 mikrometra) i wynika z fizycznych właściwości szklanych soczewek. Poziom rozdzielczości i powiększenia mikroskopu optycznego pozwala zobaczyć pod nim większość prokariotów, szczególnie jeśli do zwiększenia kontrastu między tłem a preparatem zastosuje się barwnik.

W mikroskopii optycznej do wizualizacji komórek drobnoustrojów można stosować szereg barwników, w tym fiolet krystaliczny i safraninę, które stosowanie są także w barwieniu Grama (rozdział C1). Spory bakterii można barwić zielenią malachitową, zaś elementy budowy grzybów błękitem bawełnianym w laktofenolu. Ze wszystkimi barwnikami należy obchodzić się bardzo ostrożnie, ponieważ z samej swojej natury są one toksyczne dla komórek, w tym także dla komórek obserwatora!

Do maksymalizacji kontrastu między preparatem a tłem służy wiele technik mikroskopowych, m.in. kontrast fazowy, fluorescencja i ciemne pole. Mikroskopia kontrastowo-fazowa umożliwia uzyskanie kontrastu pomiędzy różnymi częściami obserwowanego preparatu nie z powodu różnic ich współczynników absorpcji, ale drobnych różnic ich współczynników załamania prowadzących do niewielkich przesunięć fazy fali świetlnej przez nie przechodzącej. Wykorzystuje interferencję dwóch wiązek światła - wiązki światła ugiętego na preparacie i wiązki światła przechodzącego bezpośrednio przez tło preparatu. Na drodze tej drugiej wiązki znajduje się tzw. pierścień fazowy wprowadzający dodatkowe przesunięcie fazowe, dzięki czemu w obrazie interferencyjnym drobne różnice współczynników załamania poszczególnych części preparatu uwidaczniane są jako obszary o istotnie różnym kontraście (ryc. 3). Mikroskopia ciemnego pola polega na bocznym oświetlaniu preparatu. W mikroskopie widać tylko światło rozproszone przez preparat (ryc. 4), a obiekt prezentuje się na ciemnym tle. Z kolei mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje to, że niektóre cząsteczki po ich wzbudzeniu światłem lub innym promieniowaniem emitują światło o innej długości fali. Niektóre drobnoustroje zawierają związki naturalnie fluorescencyjne (chlorofile i inne barwniki). Barwniki fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do znakowania wybranych struktur lub procesów. Do wzbudzenia fluorescencji wykorzystywane jest powszechnie światło w zakresie UV, to zaś wymaga odrębnego źródła oświetlenia.

Rozwój mikroskopii optycznej w ostatnim czasie

Do nowych osiągnięć w obszarze mikroskopii optycznej zaliczamy opracowanie mikroskopów cyfrowych. Zastępujący soczewki obiektywu i okularu aparat CCD generuje obraz cyfrowy preparatu, który zostaje wyświetlony na ekranie i może być przeglądany, opatrywany uwagami i przechowywany w komputerze. Do kolejnych przełomów w polu mikroskopii optycznej należy mikroskopia interferencyjno-różniczkowa, mikroskopia sił atomowych oraz skaningowa mikroskopia konfokalna. Za pomocą wszystkich tych technik można wygenerować trójwymiarowy obraz o wyższej głębi ostrości niż ta uzyskiwana w tradycyjnej mikroskopii optycznej.

W mikroskopii interferencyjno-różniczkowej wykorzystywana jest wiązka światła spolaryzowanego, która rozdziela się na dwie wiązki, przechodzące przez preparat. Wiązki te następnie zbiegają się w soczewkach obiektywu. Generowany w ten sposób obraz wynika z efektu interferencji wywołanego drobnymi zmianami fazy wynikającymi z przejścia wiązek przez preparat. Organelle komórki pod mikroskopem z kontrastem interferencyjno-różniczkowym cechuje trójwymiarowość.

W ramach mikroskopii sił atomowych żywy, nawodniony preparat skanowany jest za pomocą igły mikroskopowej o tak niewielkim rozmiarze, że rejestruje ona drobne siły odpychania występujące między igłą a preparatem. Igła skanująca preparat rejestruje zmiany w topografii (ryc. 5). Dane są następnie poddawane przetwarzaniu komputerowemu, którego rezultatem jest pojawienie się szczegółowych, obrazów trójwymiarowych. Technika ta nie wymaga używania żadnych chemicznych utrwalaczy ani powłok, dzięki czemu unika się artefaktów pojawiających się w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (zob. niżej).

W skaningowej laserowej mikroskopii konfokalnej wykorzystuje się źródło światła laserowego oraz komputer, aby uzyskać trójwymiarowe obrazy cyfrowe grubych preparatów. Precyzja wiązki laserowej, ogniskowanej przez mały otwór, gwarantuje, że w danym momencie oświetlana jest tylko jedna płaszczyzna preparatu (ryc. 6). Dostosowując ogniskową, można obserwować różne warstwy okazu i przy użyciu danych cyfrowych tworzyć złożone obrazy. Do ich udoskonalenia stosuje się barwienie fluorescencyjne i sztuczne barwniki. CSLM jest szczególnie przydatna dla ekologów drobnoustrojów badających biofilmy i gleby.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna i skaningowa

W transmisyjnej mikroskopii elektronowej do tworzenia obrazów preparatów zamiast fotonów wykorzystuje się elektrony. Podwaliny pod tę technikę położyła krystalografia rentgenowska, minęło jednak trochę lat, zanim dostosowano ją na użytek analizy preparatów biologicznych. W mikroskopie elektronowym wiązki elektronów skupia szereg soczewek elektromagnetycznych (ryc. 7). Wnętrze mikroskopu utrzymywane jest w wysokiej próżni, tak by ruch elektronów w kierunku preparatu i przez niego nie był zakłócony. Elektrony przechodzą przez preparat i trafiają na ekran elektroluminescencyjny na potrzeby wizualizacji. Preparaty biologiczne z samej swej istoty stają się w próżni niestabilne, wobec czego przed umieszczeniem ich w niej należy je utrwalić (najczęściej za pomocą aldehydu glutarowego i paraformaldehydu, a następnie tlenku osmu (VIII), pozbawić wody i ustabilizować w żywicy. Głębokość preparatu, na którą mogą dotrzeć elektrony, jest bardzo niewielka, w związku z czym preparaty biologiczne należy pociąć na cienkie warstwy o grubości 1 mikrometra, z reguły za pomocą noża diamentowego. Warstwy te są przezroczyste dla elektronów, a do wzmocnienia kontrastu preparatu wykorzystuje się barwniki metalowe, np. cytrynian ołowiu czy octan uranylu. Technikę tę stosuje się powszechnie w analizach struktur wewnątrzkomórkowych, a obecnie osiągnęła ona rozdzielczość poziomu molekularnego. Jeśli opisane wyżej techniki utrwalania chemicznego zastąpi się utrwalaniem i stabilizacją niską temperaturą (ang. cryo fixation), ograniczone zostanie powstawanie artefaktów tkankowych za sprawą tradycyjnej obróbki próbek. Mikroskop elektronowy może służyć również do badania wirusów i budowy organelli z wykorzystaniem barwienia negatywnego. Preparatowi nadaje się kontrast dzięki zastosowaniu kwasu fosfowolframowego.

Zewnętrzne elementy budowy mikroorganizmów można obserwować w dużym powiększeniu dzięki skaningowej mikroskopii elektronowej. Preparat stabilizowany jest poprzez utrwalanie chemiczne bądź utrwalanie niską temperaturą, pokrywany warstwą materiału przewodzącego (węgla lub złota/platyny) i skanowany wiązką elektronów. Elektrony albo zostają odbite, albo przechodzą przez preparat, zaś obraz cyfrowy powstaje z połączenia uzyskanych danych. Widać na nim struktury trójwymiarowe (ryc. 8). Technikę tę udoskonala się, tak by można ją było stosować do analizy preparatów, nie w wysokiej próżni, lecz w warunkach zbliżonych do otoczenia.

Wstęp

Czwarte wydanie Krótkich wykładów z mikrobiologii bazuje na zmianach wprowadzonych w edycji trzeciej; niniejszy podręcznik lepiej wpasowuje się też w całą serię. Zdecydowaliśmy, że pominiemy w nim fragmenty dotyczące procesów biochemicznych składających się na główne szlaki metaboliczne i ogólny metabolizm DNA (więcej informacji na ten temat czytelnik znajdzie w innych książkach z serii Krótkie wykłady). W zamian rozszerzone zostały wykłady na temat procesów biochemicznych u bakterii i archeonów, przy czym jednocześnie zależało nam na uniknięciu szczegółowego omówienia technik molekularnych nowej generacji. Mimo że sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, mikromacierze i inne techniki związane z kwasami nukleinowymi wywierają ogromny wpływ na mikrobiologię, metody te są lepiej opisane w innych książkach. Usunęliśmy także fragmenty poświęcone infekcjom bakteryjnym, ponieważ również w tym przypadku są one szczegółowo omawiane w innych tekstach z serii Krótkie wykłady. Niemniej we wszystkich rozdziałach w dalszym ciągu nawiązujemy do procesów chorobotwórczych u człowieka, ponieważ nie da się całkowicie zerwać związków między mikrobiologią a medycyną. W szczególności odnosi się to do rozdziału poświęconego wirusologii, który został uzupełniony w taki sposób, by odzwierciedlić zmiany, jakie nastąpiły w tym obszarze w zakresie terminologii i praktyk badawczych.

Tak jak poprzednio, słowa "bakterie" używamy na opisanie organizmów z domeny Bacteria, a nie - tak jak czyniono to wcześniej - mikroorganizmów nieeukariotycznych. W odniesieniu do tej ostatniej grupy posługujemy się terminem "prokarioty", obejmującym zarówno bakterie (Bacteria), jak i archeony (Archaea). Poczynione w wydaniu trzecim przewidywania, że do czasu kolejnej edycji książki taksonomia mikroorganizmów zostanie poddana rewizji, okazały się, jeśli chodzi o prokarioty, nieprawidłowe, ale w odniesieniu do eukariotów musieliśmy już wprowadzić znaczące zmiany w poświęconych im rozdziałach, tak by odzwierciedlić współczesne podejście taksonomiczne. Zrewidowaliśmy również taksonomię grzybów, zgodnie z postępami uczynionymi w badaniach nad nimi. Można z dużym prawdopodobieństwem przyjąć, że przez następnych kilka lat ta grupa organizmów nadal będzie cieszyć się zainteresowaniem naukowców.

Autorzy pragną podziękować pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych i Medycznych na Oxford Brooks University oraz Wydziału Nauk Biologicznych w Birkbeck College za pomoc w przygotowywaniu tej książki. Jesteśmy niezmiennie wdzięczni także naszym przyjaciołom i rodzinom za ich nieustające wsparcie, jak również wszystkim, którzy podpowiedzieli nam, w jaki sposób możemy ulepszyć poprzednie wydanie tekstu.

A1. Świat drobnoustrojów

Co to są mikroorganizmy?

Mikroorganizmy to różnorodna grupa organizmów, na którą składają się wirusy, organizmy jednokomórkowe (archeony, bakterie, protisty, niektóre grzyby i niektóre zielenice) oraz niewielka liczba organizmów cechujących się strukturą wielokomórkową (większe grzyby i zielenice). Mikroorganizmy o większych rozmiarach charakteryzują się posiadaniem włóknistej plechy lub tworzą struktury parenchymatyczne, niewykazującej jednak rzeczywistego zróżnicowania na poszczególne tkanki. Większości mikroorganizmów nie jesteśmy w stanie dostrzec bez użycia mikroskopu.

Mikrobiologia

Mikrobiologia to nauka o mikroorganizmach. Dziedzina ta obejmuje współcześnie zarówno badania nad biologią molekularną mikroorganizmów, ich ekologią funkcjonalną, jak również nad ich strukturą i fizjologią. Narodziny tej dyscypliny datuje się na wiek XVII, kiedy to za pomocą prostego mikroskopu Leeuwenhoek odkrył istnienie bakterii. W latach 50. i 60. XIX wieku Louis Pasteur w drodze prostych eksperymentów, wykorzystując sterylny bulion wołowy, ostatecznie obalił akceptowaną przez długi czas teorię samorództwa, tłumaczącą powstawanie mikroorganizmów; w ten właśnie sposób mikrobiologia stała się nauką głównego nurtu.

Na początku mikrobiologia sprowadzała się do badania środowisk w rodzaju gleby lub osadu i analiz naturalnych procesów fermentacji oraz infekcji; dopiero gdy pod koniec XIX wieku Robert Koch opracował technikę izolowania czystych kultur bakterii, nauka ta przeszła do etapu redukcjonistycznego, w którym mikroorganizmy mogły być izolowane i charakteryzowane w laboratoriach.

W XX wieku mikrobiologowie odkryli i opisali wiele nowych mikroorganizmów, w tym nową domenę mikroorganizmów (Archaea), nowe patogeny bakteryjne, takie jak Legionella i MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus - oporny na metycylinę Staphylococcus aureus, czyli gronkowiec złocisty), i grupę patogenów związanych z HIV (wirusem nabytego niedoboru odporności), do której należy także grzyb Pneumocystis. Odkrycie unikatowych zespołów mikroorganizmów bytujących w warunkach skrajnych i cechujących się występowaniem termostabilnych polimeraz DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego) utorowało drogę do nowych osiągnięć w dziedzinie biologii molekularnej.

Gwałtowny postęp, jaki dokonał się w zakresie technik wykorzystywanych w biologii molekularnej, umożliwił powrót mikrobiologii do badania środowisk naturalnych. Techniki w rodzaju DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis - elektroforeza w gradiencie żelu denaturującego), SCCP (ang. single-stranded conformation polymorphism) - polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych), mikromacierze DNA i hybrydyzacja in situ to narzędzia, dzięki którym możemy analizować ekologię zespołów mikroorganizmów na poziomie molekularnym. Oto jak mikrobiologia wróciła do swych korzeni!

Bakterie, archeony i eukarioty

Na świat mikroorganizmów składają się trzy główne linie, z których wszystkie - jak się sądzi - wyewoluowały od jednego wspólnego przodka (ryc. 1). Linie te formalnie nazywamy domenami; wyodrębniono je na podstawie sekwencji genów wspólnych wszystkim organizmom (rozdział B3). Omawiane domeny to bakterie (wcześniej nazywane eubakteriami), archeony (wcześniej nazywane archebakteriami) i eukarioty. Cechą odróżniającą eukarioty od archeonów i bakterii jest posiadanie przez te pierwsze jądra. Wygodnie jest klasyfikować linie pozbawione jądra (tj. bakterie i archeony) jako prokarioty. Wszystkie prokarioty to mikroorganizmy, podczas gdy do eukariotów zaliczamy nie tylko mikroskopijne grzyby, zielenice i protisty (rozdziały H i I), ale również makroorganizmy, takie jak rośliny wyższe i zwierzęta.

Struktura komórki prokariotycznej charakteryzuje się nieobecnością jądra, jak również organelli dostarczających energię, takich jak mitochondria i chloroplasty. Prokarioty uzyskują bowiem energię w drodze fosforylacji substratowej i fosforylacji oksydacyjnej (zachodzącej w błonach komórkowych; rozdział E). Oprócz tych kluczowych różnic prokarioty od eukariotów różni szereg własności biochemicznych i fizjologicznych, z których najważniejsze przedstawia tab. 1. Różnice między bakteriami i archeonami (rozdział C6) omówione zostały w innych książkach.

Ryc. 1. Trzy główne linie, które wyewoluowały od wspólnego przodka

Tematy omawiane w podręczniku

W obecnym wydaniu zrezygnowaliśmy z omawiania patogenności bakterii, skupiając się w zamian na ich systematyce, fizjologii i biochemii. Z uwagi na ich znaczenie dla ludzkości patogeny bakteryjne należą do najlepiej zbadanych drobnoustrojów; szczegółową wiedzę na temat wywoływanych przez nie chorób prezentuje książka Krótkie wykłady. Mikrobiologia medyczna.

Systematyka

Systematyka bakterii pozwala naukowcom nazywać, klasyfikować i identyfikować bakterie i archeony w logiczny sposób. Znaczenie biologii molekularnej dla badań mikrobiologicznych ilustruje pierwszorzędna rola, jaką w filogenetyce drobnoustrojów odgrywa sekwencjonowanie 16S rRNA (rybosomowego kwasu rybonukleinowego).

Mikrobiologia ogólna

Historia mikrobiologii jako nauki jest długa i skomplikowana, a przy tym należy mieć na uwadze, że dopiero zaczynamy w pełni pojmować różnorodność ekologiczną, biochemiczną i genetyczną drobnoustrojów. Do analizy wzrostu drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych służy wiele wyrafinowanych technik. Nasza wiedza na temat mikroorganizmów poszerzyła się, możemy więc teraz w pełni opisać strukturę komórki prokariotycznej. Poznanie mechanizmów podziału komórek mikroorganizmów i sposobów ich poruszania się doprowadziło ponadto do ważnych przełomów w biologii eukariotów. Dysponujemy rozległą wiedzą na temat mikrobiologicznych podstaw chorób człowieka, natomiast dopiero teraz zaczynamy rozumieć, jak istotną rolę drobnoustroje pełnią w obiegu biogeochemicznym pierwiastków.

Wzrost drobnoustrojów

Sposób wzrostu prokariotów w hodowlach okresowych i ciągłych może być przedmiotem modelowania matematycznego, dzięki któremu odkrywamy ograniczenia wynikające z warunków laboratoryjnych. Modele te wskazują, że przy projektowaniu jakiegokolwiek sprzętu używanego do hodowania w pierwszym rzędzie należy mieć na uwadze optymalizację wymagań tlenowych bakterii.

Biologia molekularna

Mikrobiologia zawsze była nierozerwalnie związana z postępami w obszarze genetyki, metabolizmu DNA i inżynierii genetycznej in vitro i in vivo w całym obszarze biologii. Zasady rządzące replikacją DNA, transkrypcją, której produktem jest mRNA, i translacją, której produktem jest białko, po raz pierwszy opisano na przykładzie Escherichia coli. Łącząc te rozpoznania z naszą szczegółową wiedzą na temat regulacji transkrypcji i mechanizmów transferu DNA między komórkami, możemy teraz wykorzystywać bakterie jako niezwykle pomocne narzędzia technologii rekombinacji DNA.

Drobnoustroje eukariotyczne

Omówionych zostanie wiele odrębnych grup drobnoustrojów eukariotycznych, wyróżnionych w klasyfikacji strony internetowej Tree of Life. Przedmiotem tej części książki jest także ogólna biologia komórki i proces podziału komórkowego drobnoustrojów eukariotycznych, jak również - w osobnych rozdziałach - budowa, fizjologia i rozmnażanie grzybów oraz fotosyntetycznych i niefotosyntetycznych protistów. Uwagę poświęcono także korzystnym i szkodliwym wpływom każdej z tych grup drobnoustrojów na środowisko, jak i omówiono taksonomię i patogenność protistów pasożytniczych.

Wirusy

Wirusy to niezwykle różnorodna grupa infekcyjnych czynników niekomórkowych, które są aktywne tylko wówczas, gdy pasożytują na komórce żywej (zwierzęcej, roślinnej, bakteryjnej itp.). W celu objaśnienia podstawowych pojęć wirusologicznych, w tym budowy wirusów na poziomie molekularnym, wybraliśmy wirusy istotne z medycznego punktu widzenia. Są one ważne w kontekście taksonomicznym, ale także - jak pokazują dalsze rozdziały - odgrywają znaczącą rolę w opracowywaniu szczepionek profilaktycznych i terapii przeciwwirusowych. Przyglądamy się tu fazom cyklu replikacji (namnażania) wirusa, omawiając także najważniejsze ich warianty, i opisujemy skutki kliniczne infekcji dla całego organizmu. Zamieściliśmy w tej części także krótkie wprowadzenie do zagadnienia mniej zbadanych czynników infekcyjnych - wiroidów, występujących u roślin, i prionów, wywołujących u ssaków choroby neurologiczne.

B1. Systematyka prokariotów

Klasyfikacja i taksonomia

Wraz z pojawieniem się metod molekularnych granice między identyfikacją, klasyfikacją a zależnościami ewolucyjnymi się zatarły. W bakteriologii klasyfikacja to po prostu metoda porządkowania informacji. U podłoża tego porządkowania może, ale nie musi, leżeć jakiś sens. Możemy stwierdzić, że będziemy klasyfikować bakterie na podstawie koloru ich kolonii hodowanych na płytkach agarowych, w związku z czym wyróżnionych zostanie niewiele bakterii żółtych i czerwonych, podczas gdy ich większość zostanie zaliczona do grupy białej i kremowej. Na wczesnym etapie rozwoju mikrobiologii organizmy klasyfikowano na podstawie ich kształtu; najliczniejszą grupę tworzyły wówczas bakterie o kształcie pałeczki (niektóre z nich zwane są laseczkami), a mniej liczne były ziarniaki, bakterie nitkowate itp. Warto podkreślić, że klasyfikacje te były arbitralne, choć nadal są w użyciu. Mikrobiologowie klasyfikują też organizmy na podstawie ich zdolności do wzrostu w określonych warunkach wzrostu (beztlenowce, chemolitotrofy, metylotrofy itp.; rozdziały C2 i D1).

Podstawowym narzędziem klasyfikacji wykorzystywanym w mikrobiologii, jak i w pozostałych obszarach biologii, jest systematyka Linneusza. Jest to system hierarchiczny, w ramach którego grupy wyższego rzędu dzielą się hierarchicznie na grupy niższe, aż do poziomu gatunku (ryc. 1).

Ryc. 1. Pełna systematyka Linneusza

Oto pełna klasyfikacja Escherichia coli: Bacteria (domena), Proteobacteria (typ), Gammaproteobacteria (klasa), Enterobacteriales (rząd), Enterobacteriaceae (rodzina), Escherichia (rodzaj) i coli (gatunek). Każdy z tych poziomów nazywamy taksonem. Omawiana systematyka pozwala biologom na precyzyjną identyfikację organizmu we wszystkich domenach i królestwach wyłącznie na podstawie jego rodzaju i gatunku. Pełna nazwa E. coli to jest jej taksonomia, zaś system Linneusza to klasyfikacja taksonomiczna.

W tym tekście do opisywania bakterii i archeonów (prokarioty) stosuje się prawidłowe nazwy domen i królestw. W nieco starszych modelach klasyfikacyjnych domeny nosiły nazwy Eubacteria (bakterie właściwe) i Archaebacteria, które pod pewnymi względami były bardziej obrazowe.

Identyfikacja prokariotów

Dysponując metodą taksonomii prokariotów i używając jej do opisu i identyfikowania gatunków, mikrobiolog może umieścić dany organizm w tych ramach klasyfikacyjnych. Po uzyskaniu czystej kultury organizm nazywany jest izolatem, któremu nadaje się numer ułatwiający jego odróżnienie od innych organizmów w laboratorium. Izolaty mogą być identyczne genetycznie, mimo że zostały pobrane ze środowiska naturalnego w różnym czasie i miejscu.

Z reguły przyporządkowanie nowej bakterii do odpowiedniego rodzaju nie budzi zastrzeżeń, wobec czego omawiany izolat może zostać nazwany, dajmy na to, szczepem Parococcus NCIMB 844. W odniesieniu do bakterii i archeonów, z uwagi na ich ogromną różnorodność genetyczną, pojęcie gatunku nastręcza większych trudności niż w przypadku królestwa zwierząt. Do opisania organizmów tego samego gatunku o różniących się nieco własnościach stosuje się pojęcie biowaru; na biowary Orientalis i Mediaevalis dzieli się na przykład wywołującą dżumę bakterię Yersinia pestis. Różniące się szczepy tego samego gatunku dzieli się czasem na podgatunki, na przykład patogen roślin Pectobacterium carotovorum zawiera dwa podgatunki: atroseptica i carotovorum. W tym przypadku podgatunek obejmuje przedstawicieli gatunku wywołujących określone choroby roślin. W badaniach mikrobiologicznych kłopot z definicją gatunku sprawia, że przy opisywaniu danego organizmu najlepiej jest zachować pierwotny kod izolatu, dzięki czemu możliwe będzie odtworzenie jego historii w różnych laboratoriach.

Choć wśród mikrobiologów panuje zgoda co do klasyfikowania poszczególnych bakterii i archeonów do poziomu rodzaju, wciąż na rozstrzygnięcie czeka kwestia definicji podstawowej jednostki różnorodności genetycznej, mianowicie gatunku. Definicja gatunku należącego do określonego rodzaju (np. na podstawie homologii DNA w procencie nie mniejszym od wyznaczonego progu) niekoniecznie sprawdza się w odniesieniu do gatunku należącego od innego rodzaju, co stanowi szczególny problem w przypadku taksonów zdominowanych przez patogeny człowieka (rozdział B2). Jeśli zaś nie jesteśmy w stanie w prawidłowy i spójny sposób zdefiniować gatunku, problematyczna staje się procedura identyfikacji organizmu do tego właśnie poziomu. Metody identyfikacji prokariotów, czyli sposoby klasyfikowania nowych izolatów, omawiane są szerzej w rozdziale B2.

Filogeneza prokariotów

Filogeneza to opis zależności ewolucyjnych w obrębie taksonów i między nimi. Badania mikrobiologiczne (inaczej niż przypadku badań nad roślinami czy zwierzętami) zamiast na morfologii opierają się w ogromnym stopniu na sekwencjach DNA stanowiących źródło danych filogenetycznych; nauka ta to filogenetyka. Klasyfikacja bakterii i archeonów w przeważającym stopniu odzwierciedla ich filogenezę, a przynajmniej naszą obecną wiedzę filogenetyczną. Zawsze istnieje oczywiście przestrzeń do debat nad danym systemem klasyfikacji; uczeni wciąż dyskutują na temat prawidłowości statusu filogenetycznego i taksonomicznego wielu gatunków i rodzajów.

B2. Identyfikacja bakterii

Identyfikacja bakterii

Choć do identyfikacji i klasyfikacji bakterii coraz powszechniej stosuje się metody molekularne (rozdział B3), większość badań identyfikacyjnych prowadzonych w laboratoriach na całym świecie wciąż opiera się na tańszych metodach biochemicznych i metodach badających wzrost hodowli. Co więcej, pełna identyfikacja każdej bakterii spełniająca standardy publikacyjne musi być wieloetapowa, tj. obejmować molekularną, biochemiczną i odnoszącą się do wzrostu charakterystykę danego szczepu. Jeśli bakterię można wyhodować z próbki klinicznej lub środowiskowej, pierwszym etapem procesu jej identyfikacji i klasyfikacji są badania nad jej wzrostem, po których następuje analiza enzymów wykrywanych w danym szczepie i - wreszcie - molekularna analiza genomu.

Identyfikacja na podstawie charakterystyki wzrostu

Niezidentyfikowany izolat bakteryjny może być pasażowany na różnych rodzajach podłoży stałych i płynnych w celu usprawnienia jego identyfikacji. Ogólnie rzecz biorąc, podłoża dzielą się na dwa typy: podłoża selektywne umożliwiają wzrost jednego rodzaju bakterii przy jednoczesnym zahamowaniu wzrostu innych bakterii oraz podłoża różnicujące, zwane też podłożami diagnostycznymi, zawierające z reguły jakiś wskaźnik, którego zmiana (np. koloru) powiązana jest z pewną unikatową właściwością biochemiczną danej grupy drobnoustrojów (rozdział C3). Jeśli uda się uzyskać czystą kulturę szczepu, można przeprowadzić barwienie Grama i analizę morfologiczną. Po uzyskaniu pełnego obrazu wzrostu organizmu przeprowadza się szczegółową analizę zdolności wykorzystywania przez ten organizm cukrów (i sprawdza się, czy w trakcie ich rozkładu produkowany jest kwas), a także stwierdza się występowanie określonych enzymów. Właściwości podsumowuje się i określa ich wartość punktową, zestawiając ją ze znanymi właściwościami innych organizmów, czego wynikiem jest podstawowa taksonomia numeryczna. Można nabyć odpłatne zestawy półautomatyzujące cały proces, ale ograniczają się one tylko do wybranych grup prokariotów, w szczególności do bakterii jelitowych. W przypadku większości izolowanych ze środowiska niepatogennych bakterii i archeonów wskazówek należy szukać w poświęconym identyfikacji prokariotów Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria.

Inne metody identyfikacji

Jeśli dany organizm może być hodowany w tych samych warunkach co wiele innych szczepów referencyjnych, mikrobiolog dysponuje dodatkowymi metodami identyfikacji. Lipidy czystej kultury mogą zostać poddane ekstrakcji, estryfikacji, a następnie badaniu za pomocą (chromatografii gazowej [GC]. Metoda FAME wymaga porównania komputerowego uzyskanych wyników ze składem lipidowym innych organizmów hodowanych dokładnie w ten sam sposób na dokładnie takim samym podłożu. Jest to procedura szybka i niedroga, jednak skomplikowany może być proces interpretacji i może nie dać się go przeprowadzić w odniesieniu do organizmów rozwijających się w nietypowych warunkach. Profil FAME każdego organizmu zmienia się w zależności od wykorzystywanego podłoża hodowlanego. Wariantem omawianej metody jest analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA, ang. phospholipid linked fatty acid analysis) o charakterze bardziej specyficznym i cechująca się większą czułością.

Jako że łatwiejsze i tańsze staje się sekwencjonowanie DNA, obecnie standardową metodą uzupełniającą wyniki analiz biochemicznych i fizjologicznych jest sekwencjonowanie genu 16S rRNA (rozdział B3). Choć podejście to jeszcze bardziej rozmywa granice między identyfikacją a filogenezą, wyniki można pozyskać łatwo i niskim kosztem; uwzględnianie wyłącznie danych sekwencyjnych może jednak wprowadzać badacza w błąd.

Identyfikacja patogenów

Do pewnego stopnia, a konkretnie jeśli idzie o identyfikację organizmów chorobotwórczych, mikrobiologia medyczna znajduje się w ogonie mikrobiologii jako nauki. Z uwagi na koszty wciąż przeprowadza się tu rutynową identyfikację patogenów na podstawie klasycznych metod bakteriologicznych. Sprowadza się to zazwyczaj do: izolacji lub wzbogacenia bakterii z preparatu klinicznego za pomocą bulionu lub agaru, przygotowania czystej kultury z hodowli pierwotnej uzyskanej, identyfikacji bakterii pod mikroskopem, opisania charakterystyki jej wzrostu i czasem także przeprowadzenia PCR. Z uwagi na to, że metoda ta bazuje na hodowli patogenów, wiele z nich umykało uwadze naukowców. Dla przykładu przez lata nie wiedziano, że najczęstszym patogenem wywołującym zatrucie pokarmowe są bakterie z rodzaju Campylobacter, ponieważ były kłopoty z ich hodowaniem w laboratorium. Niektóre bakterie są żywe, lecz niedające się hodować (VNBC, ang. viable but non-culturable), co oznacza, że można jest wykryć, ale nie można wyhodować ich w laboratorium). W mikrobiologii środowiskowej ten termin funkcjonuje już od dawna. Jeśli mikrobiologia medyczna przyjmie do wiadomości ich istnienie, to wzrośnie poprawność diagnoz, jako że koszty PCR stopniowo spadają.

Identyfikacja i nazewnictwo patogenów opiera się raczej na objawach zgłaszanych przez pacjenta aniżeli na ogólnych właściwościach samego mikroorganizmu. Dla przykładu rodzaje bakterii jelitowych są bardzo blisko spokrewnione na poziomie genetycznym, ale wywołują wiele różnych chorób u człowieka (tab. 1). Dzięki analizom prowadzonym na poziomie molekularnym istnieje obecnie coraz większa jasność co do tego, że patogenne gatunki rodzaju Bacillus, bakterii Gram-dodatnich, mogą stanowić w istocie jeden, ten sam gatunek i różnią się tylko zestawami plazmidów.

Tab. 2. Choroby wywoływane przez blisko spokrewnione gatunki rodzaju Bacillus

Gatunek

Choroba

B. subtilis

Gatunek niepatogenny

B. anthracis

Wąglik

B. cereus

Zakażenie przewodu pokarmowego

B. thuringiensis

Patogen zakażający owady

B3. Analizy filogenetyczne na podstawie sekwencji genu rRNA

Filogeneza bakterii

Wzajemne pokrewieństwo bakterii omówione jest w innym miejscu tej książki (rozdział C6), w kontekście ich różnorodności. Większość głównych typów taksonomicznych bakterii (Cyanobacteria, Proteobacteria itp.) ustanowiono na podstawie klasycznych metod taksonomicznych i pozostają one w mocy od dekad. Dzięki pojawieniu się w ostatnim czasie molekularnych metod filogenetycznych w laboratoriach mikrobiologicznych można prowadzić więcej analiz filogenetycznych.

Pojęcie zegara molekularnego

Mikrobiolog powinien móc umieścić jakikolwiek organizm w kontekście jego związków z innymi organizmami i w kontekście ewolucji, począwszy od ich wspólnego przodka. Aby było to możliwe, należy wybrać zegar ewolucyjny, który będzie odzwierciedlał drobne zmiany zachodzące w organizmie na przestrzeni czasu. Potencjał uzyskania statusu zegara ewolucyjnego mają makrocząsteczki komórkowe, takie jak białka i kwasy nukleinowe, aby jednak były zegarem idealnym, muszą spełniać poniższe kryteria:

- Muszą występować powszechnie, tj. u wszystkich znanych nauce organizmów (a przypuszczalnie także u wszystkich organizmów, które dopiero zostaną odkryte).

- Muszą wykazywać homologię funkcjonalną, tj. dana cząsteczka musi mieć tę samą funkcję u wszystkich organizmów. Można zakładać, że cząsteczki pełniące różne funkcje są zbyt różnorodne, by odzwierciedlać jakiekolwiek podobieństwo sekwencji.

- Muszą wykazywać konserwację sekwencji. Idealny zegar powinien mieć zarówno regiony o wysokim stopniu konserwowania sekwencji, które zmieniają się bardzo wolno w długim okresie, jak i regiony o umiarkowanej zmienności, a także charakteryzujące się hiperzmiennościa, tak by odzwierciedlone zostały niedawne zmiany.

Naukowcy zaproponowali już wiele zegarów makromolekularnych, w tym cytochrom c (rozdział E2), ATPazę (rozdział E2), białko RecA (rozdział F9) i 16S/18S rRNA. Większość zegarów białkowych nie spełnia kryterium uniwersalności, szczególnie z uwagi na bakterie i archeony, który nie mają typowego łańcucha transportu elektronów. Obecnie najpowszechniej używanymi zegarami są: 16S rRNA u bakterii i archeonów, a u eukariotów jego odpowiednik - 18S rRNA.

Rybosomowy RNA (rRNA)

Małe, średnie i duże cząsteczki rRNA są idealnymi zegarami. Wykazano, że pełnią one te same funkcje u wszystkich znanych nauce organizmów, a także mają regiony o wysokiej konserwacji oraz regiony o wysokiej zmienności. Związek RNA z białkami rybosomowymi sprawia, że te części rRNA, które są osadzone głęboko w strukturze białkowej, wykazują niewielkie tendencje do zmian, ponieważ każda zmiana musi być odzwierciedlona w strukturze białka. Zmiany dotyczące białek rybosomowych lub rRNA zachodzące w regionach, w których prowadzą do niestabilności rybosomu, powodują śmierć organizmu i nie utrzymują się w następnych pokoleniach. Z drugiej strony istnieją też regiony hiperzmienne. To te części rRNA, które nie oddziałują bezpośrednio z białkami rybosomowymi, wobec czego mogą się w nich gromadzić mutacje.

Spośród trzech cząsteczek rRNA prokariotów (5S, 16S i 23S, zob. rozdział F5) najlepszą równowagą między zawartością informacji genetycznej (5S jest za krótki) i łatwością sekwencjonowania (23S jest za długi) odznacza się 16S rRNA. O atrakcyjności tej cząsteczki świadczy liczba wpisów w Ribosomal Database Project, w którym według edycji 10 (v23) w grudniu 2010 roku znajdowało się 1 483 016 sekwencji bakteryjnych. Należy wspomnieć, że wykorzystywanie tej cząsteczki ma kilka wad, przede wszystkim chodzi o to, że genom wielu bakterii zawiera więcej niż jedną kopię genu 16S rRNA, a kopie te często różnią się sekwencją nukleotydową. Może to wprowadzać zamęt i kontrowersje w zależności od tego, która z sekwencji zostanie wykorzystywana jako matryca, co potwierdza potrzebę podejścia wielofazowego.

Otrzymywanie sekwencji genu 16S rRNA

Fragmenty DNA zawierające część lub całość genu 16S rRNA pozyskuje się zazwyczaj metodą PCR. Startery projektuje się tak, by przyłączały się do konserwowanych regionów genu; czasem możliwe jest wykorzystywanie jednego zestawu starterów do amplifikacji 16S z wielu bakterii o dużym zróżnicowaniu filogenetycznym (zestaw starterów uniwersalnych). Nie istnieje jednak zestaw starterów, który pozwoliłby na amplifikację wszystkich genów wszystkich bakterii i wszystkich archeonów, w związku z czym opracowuje się wiele zestawów starterów specyficznych dla danego typu lub grupy. Dzięki kombinacji tych zestawów możliwe jest przeprowadzenie amplifikacji większości znanych nauce organizmów z czystej kultury wyizolowanej ze środowiska lub hodowli mieszanej.

Otrzymanie sekwencji metodą PCR zajmuje niewiele czasu, ale sama ta technika ma pewne ograniczenia. W PCR mogą powstawać chimery, produkty PCR zbudowane z końca 5' genu danego gatunku i końca 3' genu innego gatunku. Choć do eliminacji błędnych sekwencji z wyników końcowych służą programy komputerowe, w sytuacji gdy analizowane są organizmy rzadko występujące lub dotąd niezidentyfikowane, wykrycie błędów może nastręczać trudności. Z tego właśnie powodu istniały wątpliwości, czy w domenie archeonów powinien być wydzielany typ Korarchaeota. Dziesięć lat badań tych organizmów potwierdziło, że jest to wcześnie odgałęziająca się grupa archeonów.

Analizy bioinformatyczne genu 16S rRNA

Po amplifikacji i zsekwencjonowaniu produktu PCR genu 16S rRNA należy ustalić jego zależności filogenetyczne z innymi sekwencjami. Na wstępne rozeznanie bliskich pokrewieństw pozwala jego przyrównanie do jednej lub wielu znanych sekwencji. Można tego dokonać za pomocą programów takich jak BLAST (Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej). Aby zyskać rzeczywisty wgląd w zależności filogenetyczne, sekwencja genu 16S rRNA powinna być jednocześnie porównywana z jak największą liczbą innych sekwencji.

Na początku otrzymana sekwencja musi zostać przyrównana do wszystkich lub wybranych sekwencji pozyskanych wcześniej. Ponieważ geny 16S rRNA mogą różnić się długością, w celu osiągnięcia idealnego przyrównania można wykorzystać programy takie jak CLUSTAL (Europejski Instytut Bioinformatyki, EBI). Przyrównane sekwencje są następnie przycinane, tak by końce 5' i 3' były odpowiadającymi sobie zasadami, po czym zostają wczytane do programu generującego drzewo filogenetyczne.

Idealne przedstawienie zależności filogenetycznych powinno mieć charakter wielowymiarowy, ale biorąc pod uwagę ograniczenia trójwymiarowości naszego wszechświata i to, że w nauce przyjęła się konwencja przedstawiania dwuwymiarowego w formie drukowanej, "drzewo" jest dobrym kompromisem. Do jego opracowania służą dwa główne algorytmy: łączenie sąsiadów i maksymalna parsymonia. Łączenie sąsiadów to metoda oparta na dystansie ewolucyjnym i bazująca na macierzy różnic w zbiorze danych. Gałęzie powstającego w tej procedurze drzewa mają długość proporcjonalną do dystansu ewolucyjnego, dostosowaną statystycznie na okoliczność mutacji wstecznych. Maksymalna parsymonia to trudniejsze do omówienia zagadnienie, ponieważ gałęzie powstającego tą metodą drzewa mają długość proporcjonalną do minimalnej zmiany w sekwencji koniecznej do powstania nowej gałęzi.

Z zastosowaniem dwóch omówionych metod z jednego zbioru danych można otrzymać drzewa różniące się pewnymi szczegółami, np. liczbą gałęzi. Aby otrzymać przybliżoną sumę wszystkich możliwych drzew, stosuje się tzw. bootstraping, dzięki któremu uzyskuje się wartość ufności dla obecności każdej z gałęzi. Co więcej, drzewa oparte na metodzie łączenia sąsiadów i drzewa parsymoniczne na podstawie tego samego zbioru danych mogą dawać zupełnie inne wyniki, stąd też żadna z tych metod nie jest uważana za "słuszniejszą". Dlatego żadne drzewo nie powinno być uważane za najlepszy możliwy wynik uzyskany na podstawie dostępnych danych i nie powinno ono unieważniać żadnych innych informacji.