A5 Mutacje DNA

Zagadnienia kluczowe

Mutacje

Mutacją jest każda zmiana sekwencji DNA organizmu powstająca w wyniku działania czynników chemicznych i/lub fizycznych bądź błędów w replikacji DNA. Mutacje utrwalają się w procesie podziału komórki. Charakter mutacji oraz jej skutki w organizmie opisują pojęcia genotypu i fenotypu. W organizmach występują fenotypy dzikie (naturalne) i zmutowane. Istnieją mutacje punktowe i rozległe. Wpływ na funkcjonowanie białek mają mutacje z większym prawdopodobieństwem kodujących odcinków genów.

Mutacje punktowe

Mutacją punktową nazywamy zmianę pojedynczej zasady. Mutacje zmiany sensu zmieniają pojedyncze zakodowane aminokwasy. Mutacje typu nonsens tworzą kodony stopu, czego efektem są skrócone polipeptydy. Mutacje fazy odczytu polegają na wstawianiu lub usuwaniu zasad prowadząc do przesunięcia ramki odczytu. Mutacje ciche dotyczą trzecich zasad kodonów i nie zmieniają kodowanych aminokwasów. Ciche mutacje gromadzą się w DNA jako polimorfizmy. Mutacje punktowe powodują różne następstwa w biologicznej aktywności zakodowanych białek.

Mutacje rozległe

Mutacje rozległe zmieniają dłuższe sekwencje DNA. Delecje usuwają nukleotydy ze struktur DNA. Usunięte sekwencje mogą być różnej długości - od pojedynczej zasady do całego genu. Insercje dodają nukleotydy do struktur DNA. Niewielkie wstawki lub usunięcia nazywamy ogólnie 'indelami'. Przegrupowania polegają na przestawieniach segmentów senkwencji DNA w obrębie genów lub poza nimi. Efektem mutacji rozległych jest zwykle całkowita utrata aktywności kodowanych białek.

Mutacje i choroby

Mutacje DNA mogą być przyczyną chorób genetycznych i nowotworowych. Podłożem chorób genetycznych są mutacje odziedziczone. W takich przypadkach mutacja powstaje w komórce zarodkowej, a obciążony nią osobnik nosi ją w swoich komórkach i może przekazywać następnym pokoleniom. Mutacje związane z rozwojem nowotworów występują w komórkach somatycznych, często w genach kontrolujących podziały komórek.

Mutacje na poziomie organizmu

Mutacje można definiować w kategoriach wytwarzanych przez nie fenotypów. Odnosi się to głównie do mutantów bakteryjnych. Mutanty auksotroficzne nie syntetyzują podstawowych metabolitów. Mutanty wrażliwe na temperaturę przestają rosnąć w warunkach podwyższonych temperatur. Mutanty oporne na antybiotyki zachowują żywotność w ich obecności. Mutanty regulatorowe tracą zdolność nadzorowania ekspresji genów lub operonów.

Tematy powiązane

(A3) Kod genetyczny (F3) Geny i rak (F1) Choroby genetyczne

Mutacje

Sekwencje DNA tworzące geny determinują kolejność aminokwasów w zakodowanych przez nie białkach. Zachowanie tych sekwencji w niezmienionej postaci jest ogromnie ważne, gdyż zmiany kolejności aminokwasów mają wpływ na funkcjonowanie białek, co z kolei może mieć szkodliwy lub zgubny wpływ na organizm. Zmiany sekwencji DNA bywają następstwem oddziaływania czynników chemicznych i/lub fizycznych oraz rzadkich błędów w procesach replikacji. Zmiany takie nazywamy mutacjami. Mutacje utrwalają się przez replikację DNA i są przekazywane komórkom potomnym przy ich podziale.

W opisie roli i zachowania mutacji w organizmach istotne są dwa pojęcia: genotypu i fenotypu. Pierwszego z tych terminów używamy do opisu wanantów genu, w którym występuje. Drugi termin opisuje efekty mutacji występujące w organizmie. Organizm, w którym występuje zwykły fenotyp właściwy dla danego gatunku, nazywamy dzikim (np. rośliny lub zwierzęta dziko żyjące w naturalnych środowiskach). Organizm, którego fenotyp uległ zmianie w wyniku mutacji, nazywany jest mutantem. Istnieją dwie formy mutacji: mutacje punktowe, w których zmieniona została jedna zasada w określonej pozycji w genie, oraz mutacje rozległe obejmujące zmianę długich fragmentów sekwencji DNA. Ważna jest lokalizacja mutacji w genie. Mutacje w kodujących odcinkach genów mają wpływ na kodowane przez nie białka. Mutacje w odcinkach międzygenowych, czyli niekodujących, nie mają zwykle takiego wpływu.

Mutacje punktowe

Mutacje punktowe należą do kilku kategorii różniących się zakresem wpływu na białka kodowane przez geny.

Mutacje zmiany sensu

Te mutacje punktowe dotyczą zmiany pojedynczych zasad zmieniających kodony w sposób powodujący zmiany kodowanych aminokwasów (Rys. 1a). Mutacje takie występują zwykle w jednej z pierwszych dwóch zasad kodonu. Redundancja (degeneracja) kodu genetycznego oznacza, że ze zmianą trzeciej zasady kodonu wiąże się mniejsze prawdopodobieństwo modyfikacji aminokwasu. Efekty mutacji zmiany sensu w skali całego organizmu bywają różne. Większość białek toleruje niewielkie zmiany kolejności aminokwasów, lecz zmiany aminokwasów w częściach cząsteczek białkowych ważnych strukturalnie bądź funkcjonalnie mogą mieć negatywny wpływ na organizm i tworzyć zmutowany fenotyp.

Mutacje typu nonsens

Mutacje tego typu zmieniają kodony aminokwasów na kodony stop (Rys. 1b). W procesie translacji mutacja taka powoduje przedwczesne jej zakończenie, czego rezultatem jest białko o skróconej strukturze molekularnej, w którym brakuje części końcowego odcinka karboksylowego[2]. Mutacje tej grupy mają zwykle istotny wpływ na aktywność zakodowanych białek i tworzą zmutowane fenotypy.

Mutacje zmiany fazy odczytu

Ten rodzaj mutacji polega na wstawieniu dodatkowych zasad do sekwencji DNA stanowiącej gen bądź usunięciu z niej niektórych zasad. Jeśli liczba zasad wstawionych lub usuniętych nie jest wielokrotnością liczby 3, to następuje przesunięcie ramek odczytu i rybosomy będą odczytywały inne grupy kodonów w całym zakresie mutacji, co może znacznie zmienić sekwencję aminokwasów w rozkodowywanym białku (Rys. 1c). Mutacje zmiany fazy odczytu wywierają zwykle poważny wpływ na zakodowane białka i wiążą się ze zmutowanymi fenotypami.

Mutacje ciche (milczące)

Mutacja może dotyczyć trzeciej zasady kodonu i wówczas - dzięki redundancji kodu genetycznego - aminokwas nie będzie zmieniony (Rys. 1d). Ciche (milczące, synonimiczne) mutacje nie mają wpływu na zakodowane białka i nie tworzą zmutowanych fenotypów, mają natomiast skłonność do gromadzenia się w DNA organizmów, gdzie noszą nazwę polimorfizmów. Mutacje te zwiększają zróżnicowanie sekwencji DNA osobników i gatunków.

Mutacje punktowe zastępujące purynę pirymidyną lub na odwrót nazywane są transwersjami, a zastąpienia dwóch puryn lub dwóch pirymidyn - tranzycjami.

Mutacje rozległe

Mutacje rozległe powodują poważne alteracje DNA, często dotyczące długich fragmentów jego sekwencji. Spotykane są liczne odmiany takich mutacji.

Rysunek 1. (a) Mutacja punktowa zmiany sensu. (b) Mutacja punktowa typu nonsens. (c) Mutacja punktowa zmiany fazy odczytu. (d) Mutacja punktowa cicha

Delecje

Z tymi mutacjami wiąże się utrata jakichś części sekwencji DNA (Rys. 2a). Ich zakresy są bardzo zróżnicowane. Utraconym elementem może być pojedynczy nukleotyd lub znacznie dłuższy fragment DNA - w niektórych przypadkach obejmujący cały gen.

Insercje

W tym przypadku mutacja jest rezultatem włączenia do DNA dodatkowych nukleotydów, zwykle z innych części chromosomu (Rys. 2b). Podobnie jak w przypadku delecji, insercje mogą obejmować pojedyncze nukleotydy lub znacznie dłuższe ich sekwencje.

Niewielkie mutacje skracające lub wydłużające określa się wspólnym terminem 'indeli'.

Przegrupowania

Te mutacje polegają na zamianie miejscami segmentów sekwencji DNA należących do jednego genu lub pochodzących spoza niego (Rys. 2c). Prostym przykładem przegrupowania jest inwersja, w której fragment sekwencji DNA jest usuwany, a następnie wstawiany w tej samej pozycji, tylko z przeciwną orientacją kierunkową.

Mutacje rozległe, zwłaszcza związane ze znacznymi zmianami sekwencji w obrębie genów, z reguły w poważnym zakresie wpływają na zakodowane białka i często wiążą się ze zmutowanymi fenotypami.

Mutacje i choroby

U ludzi i innych organizmów wyższych mutacje DNA odgrywają istotną rolę w rozwoju chorób. W szczególności mogą być podłożem chorób genetycznych, takich jak hemofilia i mukowiscydoza (zwłóknienie torbielowate), a także przyczyniać się do rozwoju zmian nowotworowych.

Przyczyną chorób genetycznych są mutacje odziedziczone, przekazywane potomstwu przez rodziców. Mogą wystąpić losowo w dowolnej komórce, zwykle jednak mutacja zaistniała w pojedynczej komórce nie wpływa na cały organizm, ponieważ komórki są stale odnawiane. Mutacja powstała w komórce rozrodczej (w plemniku lub w komórce jajowej) może być przekazana w procesie poczęcia, i w takim przypadku będzie obecna w każdej komórce potomka, który stanie się jej nosicielem i może przekazać ją następnym pokoleniom. Zakres zmutowanych genów jest bardzo szeroki, dlatego istnieje wiele postaci chorób genetycznych.

Mutacje związane z rozwojem zmian nowotworowych powstają w zdrowych komórkach somatycznych. Zmiany takie rozwijają się często w powiązaniu z mutacjami w genach nadzorujących podziały komórek. Mutacje tego rodzaju często obdarzają komórki zdolnością dzielenia się w sposób niekontrolowany, co prowadzi do rozwoju guzów nowotworowych.

Rysunek 2. (a) Delecja. (b) Insercja. (c) Mutacja przegrupowująca (rearanżacja)

Mutacje na poziomie organizmu

Niezależnie od klasyfikacji mutacji w kategoriach zmian w sekwencji DNA, istnieją też ich definicje opisujące fenotypy zmutowanych organizmów. Takie podejście ma zastosowanie do komórek prokariotycznych i eukariotycznych, zwykle jednak bywa kojarzone z mutantami bakteryjnymi. Według tych kryteriów zdefiniowano wiele zmutowanych fenotypów.

Mutanty auksotroficzne

Mutanty tej grupy nie produkują pewnych związków w wyniku mutacji genu kodującego któryś z enzymów z podstawowych szklaków biochemicznych, np. szlaku biosyntezy jakiegoś aminokwasu. Mutant a takiego można wyizolować wyłącznie hodując na podłożu suplementowanym brakującym metabolitem. Na przykład: tryptofanowy auksotrof E. coli nie syntetyzuje tryptofanu i musi go pozyskiwać z pożywki wzrostowej. Przeciwieństwem auksotrofów są prototrofy, niemające specjalnych zapotrzebowań pokarmowych.

Mutanty wrażliwe na temperaturę

Wzrost tych mutantów ograniczają warunki, w jakich prowadzi się ich hodowlę. Ich komórki rozwijają się wyłącznie w określonych przedziałach temperatury. W temperaturach zbyt wysokich nie rozwijają się i obumierają. Mutacje, których są nośnikami, zwykle wiążą się z aminokwasami ważnymi dla podtrzymania struktury białka. W podwyższonej temperaturze białka tych mutantów denaturują i tracą swą aktywność, czego efektem jest zmutowany fenotyp.

Mutanty oporne na antybiotyki

Antybiotyki niszczą dzikie szczepy bakteryjne, nie mają jednak żadnego wpływu na oporne mutanty. Oporność na antybiotyk może powstać w wieloraki sposób, na przykład wiąże się z mutacją genu kodującego białko, będące celem antybiotyku.

Mutanty regulatorowe

W tym przypadku mutanty tracą zdolność regulacji ekspresji genu lub operonu. Na przykład: istnieją regulatorowe mutanty E. coli wykonujące ekspresję genów potrzebnych w metabolizmie laktozy, nawet gdy substancji tej nie ma w środowisku. Mutanty takie, nazywane też konstytutywnymi, powstają zwykle w wyniku mutacji białkowej genu kodującego represory lac.

A6 Mutageny i naprawa DNA

Zagadnienia kluczowe

Mutageny

Mutacje powstają w wyniku rzadkich błędów w replikacji DNA lub w wyniku działania na DNA czynników chemicznych i/lub fizycznych, zwanych mutagenami. Zmiany w strukturze nukleotydów powodują modyfikacje parowania zasad, które po replikacji DNA utrwalają się. Inne mutageny tworzą fizyczne zniekształcenia DNA blokujące jego replikację i/lub transkrypcję.

Mutageny chemiczne

Wiele substancji chemicznych ma działanie mutagenne. Zastępowanie normalnych zasad przez ich obce zamienniki podczas replikacji DNA powoduje zmiany w tworzeniu par zasad mogące być przyczyną mutacji. Pomiędzy zasady podwójnej helisy dostają się czynniki interkalujące powodujące wstawianie dodatkowych zasad w procesie replikacji, czego efektem są mutacje zmiany ramki odczytu. Wiele chemicznych mutagenów modyfikuje zasady, często poprzez dodawanie grup alkilowych lub arylowych, bądź przez deaminację. DNA podlega również mutacjom spontanicznym w wyniku reakcji z substancjami normalnie obecnymi w komórkach. Zasady DNA mogą być uszkadzane także przez reaktywne formy tlenu (ROS) występujące w komórkach oddychających tlenowo.

Mutageny fizyczne

Czynnikiem wywołującym rozległe uszkodzenia cząsteczek DNA jest promieniowanie jonizujące, takie jak promieniowanie rentgenowskie i promieniowanie ?. Wchłanianie promieniowania ultrafioletowego przez zasady prowadzi do tworzenia się dimerów cyklobutylowych między sąsiednimi zasadami pirymidynowymi. Silnym mutagenem są również promieniowanie cieplne i wysoka temperatura.

Naprawa DNA

Ewolucyjną reakcją organizmów na obecność wielu czynników mutujących DNA był i jest rozwój licznych złożonych mechanizmów naprawczych obejmujących trzy kategorie: naprawa przez usuwanie, naprawa bezpośrednia oraz naprawa niedopasowanych zasad.

Naprawa przez usuwanie

Odpowiedni enzym naprawczy tworzy w sąsiedztwie uszkodzonego nukleotydu jednoniciowe 'nacięcie' (tj. przerwanie wiązań chemicznych), po czym nukleaza usuwa uszkodzony nukleotyd wraz z zasadami sąsiednimi. Następnie polimeraza DNA wypełnia lukę prawidłową strukturą DNA, a ligaza zamyka 'pole operacyjne'.

Naprawa bezpośrednia

Ten mechanizm polega na odwróceniu strukturalnych alteracji uszkodzonych nukleotydów. Ważnym przykładem jest fotoreaktywacja polegająca na naprawie dimerów tyminy przez enzymy zwane fotoliazami DNA przerywające wiązania powstałe podczas dimeryzacji.

Naprawa niedopasowanych zasad

Ten system koryguje błędy replikacji DNA, identyfikując niedopasowania nukleotydów i dokonując podstawień prawidłowych zasad. System rozpoznaje, która z niedopasowanych zasad jest prawidłowa, identyfikując rodzicielską nić DNA na podstawie jej metylacji.

Genotoksyczność

Genotoksyczność dotyczy rozpoznawania czynników uszkadzających DNA i powodujących jego mutacje. Komercyjne testy na zwierzętach są obecnie powszechnie zastępowane systemami używającymi do tego celu bakterii lub hodowli komórek zwierzęcych.

Najszerzej znanym jest test Amesa oceniający zdolność potencjalnych mutagenów do odwracania (rewersji) mutacji w operonie histydynowym Salmonella typhimurium. Mutageny tworzą większe ilości rewertantów. Test ten, w formie zmodyfikowanej, może służyć do wykrywania prokancerogenów po dodaniu ekstraktu ze szczurzej wątroby. W podobnych testach mogą być używane linie komórek zwierzęcych. Mutageny powodujące uszkodzenia chromosomów nazywane są klastogenami. Można je wykrywać, oceniając ich zdolność do wywoływania wymiany chromatyd siostrzanych (SCE - ang. sister Chronatid Exchange)). Te występują spontanicznie, lecz szybkość i zakres indukcji zależy w dużym stopniu od mutagenów. SCE są wykrywalne tylko wtedy, gdy dwie chromatydy tego samego chromosomu mają różne zabarwienie. Osiąga się to, kodując komórki przez dwa podziały na bromodeoksyurydyną przed barwieniem.

Tematy powiązane

(A1) Struktura DNA(A5) Mutacje DNA

Mutageny

Mutacje mogą powstawać w wyniku błędów w procesie replikacji DNA. Zdarzenia takie są niezwykle rzadkie i u bakterii występują średnio raz na 1010 wstawianych nukleotydów, a w organizmach wyższych prawdopodobnie nieco częściej. Wskaźnik ten nazywamy tempem mutacji spontanicznych. Jego wartości rosną, gdy komórki podlegają wpływom czynników chemicznych i/lub fizycznych zwanych mutagenami, wchodzących w bezpośrednie reakcje z DNA i modyfikujących struktury pojedynczych nukleotydów. Może to prowadzić do zaburzenia lub całkowitego braku parowania zasad, jak w sytuacji gdy podczas replikacji DNA nieprawidłowa zasada zostanie włączona naprzeciw zasady zmodyfikowanej, zmieniając sekwencję DNA. W takich przypadkach kolejne replikacje utrwalają powstałą zmianę, co oznacza obecność mutacji w sekwencji DNA (Rys. 1). Niektóre mutageny, działając w inny sposób, powodują poważne fizyczne zniekształcenia w DNA, blokujące jego replikację bądź transkrypcję.

Wielka rozmaitość substancji naturalnych i syntetycznych, organicznych i nieorganicznych, może reagować z DNA, zmieniając jego strukturę i tworząc mutacje. Większość mutagenów chemicznych to kancerogeny, czyli substancje rakotwórcze. Ponadto, mutacje DNA powoduje wiele czynników fizycznych. Należą do nich promieniowania jonizujące, takie jak promieniowanie rentgenowskie i promieniowanie ?, a także promieniowania niejonizujące, zwłaszcza ultrafioletowe i cieplne.

Mutageny chemiczne

Bardzo wiele substancji chemicznych może powodować mutacje DNA. Niektóre mutageny chemiczne są analogami zasad. Ich struktury molekularne są podobne do zasad występujących normalnie w DNA, w związku z czym polimerazy mogą je wbudowywać w struktury DNA podczas replikacji. Prowadzi to do powstawania mutacji w następstwie zmian parowania zasad. Jednym z przykładów jest 5-bromouracyl (5BU) - analog zasadowy tyminy. 5BU normalnie łączy się w parę z adeniną, lecz niewielka zmiana jego struktury zwana przesunięciem tautomerycznym powoduje parowanie z guaniną. Po replikacji DNA pierwotną parę zasad TA zastępuje para GC na jednej z nici potomnych, co prowadzi do mutacji punktowej (Rys. 2).

Innymi mutagenami chemicznymi są czynniki interkalujące. Są to płaskie cząsteczki zakłócające replikację DNA poprzez wnikanie między sąsiadujące pary zasad podwójnej helisy. Przykładem jest bromek etydyny - cząsteczka zawierająca cztery pierścienie o wymiarach podobnych do zasadowej pary puryna-pirymidyna. Stwierdzono, że związek ten działa interkalująco na podwójną helisę, rozsuwając nieznacznie pary zasad (Rys. 3). Nie jest całkiem jasne, w jaki sposób zakłóca to replikację, efektem ogólnym jest jednak wprowadzenie pojedynczego nukleotydu w pozycji interkalującej, co skutkuje mutacją zmiany ramki odczytu w genie.

Działanie wielu mutagenów polega na chemicznej modyfikacji zasad. Niektóre powodują dodawanie grup alkilowych lub arylowych. Przykładami są: sulfonian metylometanowy i etylonitrozomocznik - substancje dodające grupy metylowe do zasad w różnych pozycjach (Rys. 4). Do innych modyfikacji zasad należy deaminacja. Na przykład: kwas azotawy deaminuje cytozynę, wytwarzając uracyl (Rys. 5), tworzący parę zasad z adeniną, co powoduje po replikacji zmianę pary GC na AT. Deaminacja adeniny na analog guaniny, zwany hipoksantyną, powoduje zastępienie pary zasad AT przez GC.

Rysunek 1. Mechanizmy mutacji. (a) Mutacje powstające w wyniku błędów podczas replikacji DNA. (b) Mutacje powstające w wyniku zmian strukturalnych w nukleotydach, prowadzących do zmian parowania zasad

Mutacje mogą również zachodzić spontanicznie w wyniku chemicznej reakcji DNA z niektórymi substancjami występującymi normalnie w komórkach. Na przykład: w następstwie spontanicznej deaminacji cytozyna może zamieniać się w uracyl. Ponadto, cytozyna, występująca czasem w formie 5-metylocytozyny, może w wyniku deaminacji zamieniać się w tyminę. Bardzo częstą spontaniczną modyfikacją jest depurynacja będąca rezultatem przerwania wiązania między deoksyrybozą i jej zasadą purynową (Rys. 6). Uszkodzenia zasad mogą być także wynikiem obecności reaktywnych form tlenu (ROS), takich jak nadtlenki, w tym nadtlenek wodoru, i rodniki hydroksylowe, występujących we wszystkich komórkach aerobowych.

Rysunek 2. (a) Struktura 5-bromouracylu. (b) Mutacja DNA spowodowana przez 5-bromouracyl

Mutageny fizyczne

Wysokoenergetyczne promieniowania jonizujące, takie jak promieniowanie rentgenowskie i promieniowanie ?, powodują rozległe uszkodzenia cząsteczek DNA w postaci przerwań ciągłości nici oraz zniszczeń cukrów i zasad. Promieniowania niejonizujące w postaci światła ultrafioletowego są wchłaniane przez zasady i mogą powodować zmiany strukturalne. W szczególności, promieniowanie ultrafioletowe może być przyczyną formowania się struktur zwanych dimerami cyklobutylowymi między sąsiadującymi pirymidynami, a w szczególności tyminami (Rys. 7). Dimeryzacja powoduje ciaśniejsze upakowanie zasad i może skutkować delecjami po replikacji. Ważnym mutagenem środowiskowym są także promieniowanie cieplne i wysoka temperatura. Pod wpływem tych czynników w cząsteczkach DNA powstają miejsca apurynowe w polinukleotydach, co po replikacji może być przyczyną mutacji punktowych lub delecji.

Naprawa DNA

Konieczność zachowania w nienaruszonym stanie sekwencji DNA tworzących geny, mimo obecności licznych czynników mogących je zmieniać, zmusiła organizmy do rozwijania zapobiegających mutacjom metod naprawy uszkodzeń DNA. Mechanizmy naprawcze są zróżnicowane i złożone, można jednak wyodrębnić trzy główne ich typy.

Naprawa przez usuwanie

Rysunek 3. (a) Struktura bromku etydyny. (b) Efekt mutagenny bromku etydyny

Rysunek 4. Przykłady (a) czynników alkilujących oraz (b) zasad alkilowanych

Rysunek 5. Deaminacja cytozyny przez kwas azotawy do postaci uracylu

Rysunek 6. Depurynacja DNA

Ten system naprawy, mimo swej złożoności, jest przypuszczalnie najczęściej wykorzystywany przez organizmy. Tą metodą naprawianych jest wiele różnych typów uszkodzeń, w tym dimery piramidynowe. Proces zaczyna się od rozpoznania uszkodzonych nukleotydów przez jeden z wielu enzymów oraz oznakowania ich do naprawy. Znakowanie ma formę 'nacięć' jednej z nici podwójnej helisy w miejscach sąsiadujących z uszkodzeniem, ewentualnie polega na usunięciu nieprawidłowej zasady, po której pozostaje luka. W kolejnym kroku nukleaza usuwa zaznaczony nukleotyd wraz z pewną liczbą sąsiednich. Następnie polimeraza DNA (polimeraza DNA I w E. coli) syntetyzuje nową sekwencję DNA w celu uzupełnienia brakujących zasad, a ligaza łączy ją z istniejącą cząsteczką, odtwarzając pierwotną strukturę DNA (Rys. 8).

Rysunek 7. Powstawanie dimerów tyminowych pod wpływem promieniowania ultrafioletowego

Rysunek 8. Naprawa DNA przez usuwanie

Naprawa bezpośrednia

Ta forma naprawy DNA, występująca znacznie rzadziej, polega na odwracaniu zmian strukturalnych powstających w nukleotydach. Ważnym przykładem naprawy bezpośredniej jest fotoreaktywacja naprawiająca dimery pirymidynowe tworzone przez promieniowanie ultrafioletowe. Enzymy zwane fotoliazami DNA, uaktywniane przez światło widzialne, naprawiają dimery pirymidynowe, eliminując wiązania powstające podczas dimeryzacji. Fotoliazy DNA występują w bakteriach, w mikroorganizmach eukariotycznych i w roślinach.

Naprawa niedopasowanych zasad

Ten system koryguje błędy powstające podczas replikacji DNA polegające na kojarzeniu niedopasowanych nukleotydów. Istnieje grupa enzymów oznaczających niezgodności i naprawiających je bezpośrednio. Ważne jest, że system potrafi ocenić, która z niedopasowanych zasad jest prawidłowa; dokonuje tego, porównując rodzicielską nić DNA, której sekwencje są prawidłowe, z nicią potomną, czyli zreplikowaną, zawierającą sekwencję zmutowaną. W bakteriach E. coli nić rodzicielska jest łatwa do rozpoznania, ma bowiem 'etykietki' w postaci grup metylowych dowiązanych do zasad adeninowych.

Genotoksyczność

Jest to niedawno powstała gałąź toksykologii identyfikująca mutageny występujące w środowisku. Większość czynników rakotwórczych, czyli kancerogenów, to także mutageny. Identyfikacja mutagenów uznana została za ważną w wielu dziedzinach, ze szczególnym uwzględnieniem: leków, dodatków do artykułów spożywczych, produktów rolnych, zanieczyszczeń środowiska oraz chemikaliów związanych z wieloma procesami produkcji przemysłowej. W związku z tym powstała konieczność opracowania testów identyfikujących niebezpieczne związki chemiczne. Wczesne systemy testowe opierały się na badaniach małych ssaków, takich jak szczury lub myszy, były one jednak czasochłonne, bardzo drogie i silnie krytykowane z przyczyn etycznych. Opracowano następnie szereg testów in vitro wykorzystujących bakterie oraz komórki zwierzęce hodowane w kulturach tkankowych. W wielu krajach istnieje prawny obowiązek poddawania nowych chemikaliów różnym testom przed ich zatwierdzeniem przez instytucje rządowe.

Najszerzej znanym jest test Amesa bardzo szybko identyfikujący mutageny. Wykorzystuje się w nim bakterie z gatunku Salmonella typhimurium mające mutację w operonie histydyny (Sekcja A7) i z tego powodu niezdolne do jej syntezy. Organizmy takie nazywamy auksotrofami histydynowymi (his-). Testowanie związków chemicznych polega na ustaleniu ich zdolności bądź niezdolności do rewersji tej mutacji. Procedura testowa jest bardzo prosta: umieszcza się mutanty his- na płytce Petriego z agarem zawierającym tylko śladowe ilości histydyny; następnie na powierzchni agaru umieszcza się kryształ lub dysk filtrujący z roztworem testowanego związku; bakterie rosną w krótkim czasie do wyczerpania się histydyny, po czym jedynymi bakteriami zdolnymi do kontynuacji wzrostu i tworzenia kolonii są te, w których nastąpiła rewersja i które mają zdolność syntezy histydyny, czyli są jej prototrofami (his+); jeśli testowany związek nie jest mutagenny, to na płytce z agarem znajdzie się kilka kolonii rewertantów rozmieszczonych losowo; jeśli badana substancja jest mutagenna, wówczas liczba kolonii bakteryjnych będzie znacznie większa i będą one skupione wokół miejsca, w którym badana substancja została umieszczona na płytce Petriego. Z pewnością możliwe jest opracowanie wersji testu pozwalających określać w sposób ilościowy stopień mutagenności badanych próbek oraz tworzyć wykresy reakcji w funkcji ich dawek.

W celu identyfikacji maksymalnej liczby mutagenów używane są dwa typy mutantów his- - z substytucją pojedynczych zasad oraz z mutacjami ramek odczytu (Sekcja A5). Pozwala to wykrywać mutageny różnie działające na DNA. Możliwa jest także genetyczne zwiększenie przepuszczalności bakterii w stosunku do testowanych związków, jak również redukcja ich zdolności naprawy uszkodzonego DNA. Zwiększa to dokładność wykrycia aktywności mutagennej.

Niektóre związki o znanych właściwościach rakotwórczych przejawiają je dopiero po konwersji do postaci mutagennych pod działaniem enzymów znajdujących się w ciele. Substancje takie nazywamy prokancerogenami. Działania enzymów zamieniają je w kancerogeny bezpośrednie. Badania prokancerogenów testem Amesa dają wyniki negatywne, test można jednak zaadaptować z uwzględnieniem tego czynnika. Wątroba jest bogatym źródłem enzymów uaktywniających prokancerogeny. Ekstrakty wątrobowe zawierające te enzymy można dodawać do testowanych związków. Następuje wówczas aktywacja prokancerogenu, czego efektem jest zwiększona liczba rewertantów. Test Amesa jest szybki; można go przeprowadzić w ciągu 48 godzin. Jest również tani i łatwy do ujęcia ilościowego. Posłużył już do identyfikacji mutagenności wielu związków chemicznych, w tym niektórych farb do włosów, uniepalniaczy i barwników spożywczych.

Jedyną wadą oryginalnego testu Amesa jest to, że identyfikuje mutagenność u bakterii, a nie u ssaków. Z tego powodu opracowano wiele analogicznych testów z wykorzystaniem linii komórkowych w kulturach tkanek zwierzęcych. Testy te są bardzo podobne do testu Amesa, wykorzystują jednak inne systemy selekcji i geny testowe.

Czynniki niszczące chromosomy nazywane są klastogenami. Identyfikuje się je również za pomocą testów. Testy tej grupy można przeprowadzać z wykorzystaniem linii komórkowych, zwierząt laboratoryjnych, a nawet roślin. Polegają one na wykrywaniu w chromosomach nieprawidłowości, takich jak nieciągłości, przestawienia, chromosomy pierścieniowe, dwucentryczności i translokacje. Częstość tych zniekształceń zwykle jest niska. Alternatywą dla wyszczególniania aberracji chromosomalnych jest zliczanie wymian chromatyd siostrzanych (SCE, ang. sister chromatid exchange) polegających na wymianie materiału między dwiema chromatydami tego samego chromosomu, który to proces zachodzi spontanicznie z niską częstotliwością we wszystkich typach komórek. Może on występować w mitozie i mejozie. Jego użyteczność wynika z faktu, że w następstwie działania klastogenów częstość SCE rośnie znacznie szybciej niż ogólna liczba zniekształceń chromosomów. SCE można wykrywać z zastosowaniem wielu procedur wykorzystujących semikonserwatywną naturę replikacji DNA (Sekcja A1). Istotą stosowanej w nich techniki jest zróżnicowane barwienie chromatyd pozwalające łatwo wykrywać ich wymianę. Służy do tego złożona metoda barwienia, poprzedzona hodowlą kultur komórkowych w serii dwóch cyklów podziałów w obecności bromodeoksyurydyny (BrdU), będącej analogiem tymidyny, która zostaje włączona do nowo syntetyzowanego DNA w miejsce tymidyny i zmienia właściwości chromatyd tak, że jedna zabarwia się ciemniej, a druga jaśniej.

A7 Regulacja ekspresji genów

Zagadnienia kluczowe

Regulacja ekspresji genów

Niektóre białka występują we wszystkich komórkach organizmu, a inne tylko w niektórych i w określonym czasie. Liczne szlaki regulacyjne decydują o 'włączaniu' i 'wyłączaniu' genów. Działają one na różnych poziomach; najważniejszym z nich jest kontrola transkrypcji, w której niektóre geny nadzorują transkrypcję innych.

Regulacja transkrypcji w prokariotach

Wiele genów bakteryjnych skonfigurowanych jest we wspólnie regulowane operony, kodujące białka o powiązanych ze sobą funkcjach. Operony indukowalne, takie jak operon lac, kodują enzymy działające w szlakach metabolicznych i są indukowane przez właściwe dla tych szlaków substraty. Operony reprymowalne, takie jak operon trp, kodują enzymy działające w szlakach biosyntezy. Ekspresja genu jest regulowana przez końcowy produkt szlaku bądź przez atenuację.

Operon lac

Ten operon zawiera trzy geny (lacZ, Y, A) kodujące enzymy, których E. coli potrzebuje do metabolizmu laktozy. Geny są transkrybowane z pojedynczego promotora, a ich ekspresja jest indukowana przez laktozę. Laktoza przekształcana jest do allolaktozy, która wiąże represor lac, uniemożliwiając mu wiązanie operatora lac i umożliwiając transkrypcję operonu. Po wykorzystaniu laktozy represor lac odzyskuje zdolność wiązania operatora lac i transkrypcja zostaje zablokowana.

Represja kataboliczna

Ten mechanizm regulacyjny pozwala E. coli tłumić operon lac w obecności glukozy. Białko CAP (ang. catabolite activator protein) wiąże cAMP i stymuluje transkrypcję operonu lac poprzez wiązanie promotora lac. Poziomy cAMP są regulowane przez glukozę hamującą cyklazę adenylanową. Kiedy glukoza jest dostępna, poziomy cAMP są niskie, i wówczas CAP nie wiąże promotora lac, a operon jest transkrybowany na niskim poziomie. Gdy stężenia glukozy są niskie, poziomy cAMP rosną, CAP wiąże promotor lac i stymuluje transkrypcję operonu. Represja kataboliczna zapewnia, że w warunkach równoczesnej dostępności glukozy i laktozy glukoza używana jest w pierwszej kolejności.

Operon trp

Ten operon zawiera pięć genów kodujących enzymy niezbędne do syntezy tryptofanu pod kontrolą jednego promotora. Represor trp wiąże się z operatorem trp w obecności tryptofanu i blokuje transkrypcję operonu. Przy braku tryptofanu represor trp nie tworzy tego wiązania i transkrypcja operonu jest kontynuowana.

Atenuacja

Ten mechanizm regulacyjny umożliwia precyzyjne dostrajanie ekspresji operonu trp i innych operonów. Sekwencje mRNA zawarte między promotorem trp i pierwszym genem operonu trp mogą tworzyć dużą strukturę łodygi-pętli (in. szpilki do włosów) niemającą wpływu na transkrypcję bądź mniejszą pętlę terminacyjną. Krótki obszar kodujący znajdujący się powyżej zawiera kodony tryptofanu. Kiedy poziomy tryptofanu są odpowiednie, polimeraza RNA transkrybuje odcinek do którego rybosom następnie przyłącza się i przeprowadza translację, co zapobiega tworzeniu się większej struktury łodygi--pętli oraz pozwala pętli terminacyjnej zakończyć transkrypcję. Przy braku tryptofanu rybosom zatrzymuje się, polimeraza RNA idzie naprzód i tworzy się duża struktura łodygi-pętli. Formowanie się pętli terminacyjnej jest zablokowane i transkrypcja operonu jest kontynuowana.

Regulacja przez alternatywne czynniki sigma

Alternatywne czynniki ? zmieniają specyficzność bakteryjnej polimerazy RNA, pozwalając jej rozpoznawać promotory różnych genów.

Regulacja transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Komórki eukariotów regulują ekspresję genów głównie przez zmiany szybkości transkrypcji. Interakcje między polimerazą RNA II i podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi prowadzą do tworzenia się transkrypcyjnego kompleksu inicjacyjnego TIC (ang. transcription iniciation complex) w sekwencji TATA. Inne czynniki transkrypcyjne zmieniają szybkość inicjacji transkrypcji poprzez wiązania z sekwencjami promotorowymi i wpływ na stabilność TIC. Na szybkość transkrypcji wpływają również odległe sekwencje zwane 'wzmacniaczami' i 'tłumikami'.

Czynniki transkrypcyjne

Promotory genów mają wiele miejsc wiązań czynników transkrypcyjnych, z których każdy może mieć wpływ na przebieg transkrypcji. Wpływ sumaryczny zależy od współpracy między tymi czynnikami. Czynniki transkrypcyjne mają strukturę modularną, na którą składają się domeny wiązania DNA, oraz transaktywacyjne z charakterystycznymi motywami strukturalnymi. Czynniki transkrypcyjne działają w trybie kombinatorycznym, tworząc formy hetero- i homodimerów. Mogą również tłumić transkrypcję za pomocą mechanizmów pośrednich i bezpośrednich.

Regulacja ekspresji genów przez hormony i cytokiny

Hormony i cytokiny działają na komórki docelowe, zmieniając wzory transkrypcji genów. Hormony steroidowe przenikają do wnętrza komórki i wiążą się z białkami swych receptorów, uwalniając je od działania białek hamujących. Receptory dimeryzują i są przemieszczane do jądra, gdzie wiążą się z promotorami genów docelowych, uruchamiając transkrypcję. Hormony polipeptydowe i cytokiny wiążą się z białkami receptorów na powierzchniach komórek docelowych. Aktywacja genu jest uruchamiana przez transdukcję sygnału, w której sieć białek jest sekwencyjnie uaktywniana przez fosforylację białka.

Regulacja potranskrypcyjna przez interferencję RNA

Interferencja RNA (RNAi) zachodzi wówczas, gdy dwuniciowy RNA przetwarzany jest przez enzymy Drosha i Dicer w mikroRNA (miRNA) lub w krótkie fragmenty małego interferującego RNA (siRNA), zwykle długości 22 par zasad (bp). Elementy te łączą się z białkiem, w tym z białkiem argonaute, tworząc indukowany przez RNA kompleks hamujący (RISC). RNA staje się jednoniciowy i prowadzi kompleks do komplementarnego mRNA, gdzie wiąże się i może katalizować przecinanie mRNA. W przypadkach niepełnej zgodności zasad może nie dokonywać przecinania, lecz blokować translację. Dane o sekwencji genomu mogą być wykorzystywane do generowania antysensownego RNAi są bardzo skuteczne jako procedura eksperymentalnej redukcji ekspresji genów w celu obserwacji efektów fenotypowych.

Różnicowanie i rozwój

Różnicowanie i rozwój komórek i tkanek w organizmach wielokomórkowych odbywa się w trybie długoterminowej epigenetycznej regulacji genów obejmującej molekularne modyfikacje DNA i histony regulujące dostępność DNA dla polimerazy RNA.

Tematy powiązane

(A2) Geny(B2) Genomy prokariotów

(A4) Od DNA do białek(B3) Genomy eukariotów

(A8) Epigenetyka (C11) Geny w rozwoju i modyfikacje chromatyny

Regulacja ekspresji genów

Z nielicznymi tylko wyjątkami genetyczne kodowanie białek i ekspresja genów decydują o tym, jakie białka obecne są w komórkach i tkankach. Niektóre białka występują we wszystkich komórkach, a inne jedynie w niektórych ich typach i w określonym czasie. Dlatego ekspresja genów musi być regulowana. Dotyczy to w równym stopniu jednokomórkowych prokariotów i wielokomórkowych organizmów eukariotycznych. Geny mogą być włączane i wyłączane w zależności od tego, czy kodowane przez nie białka mają być obecne czy nie, a we wzorze ekspresji muszą być również uwzględniane ich zmiany ilościowe.

Ekspresja genów może być regulowana na wielu poziomach, z uwzględnieniem aktywności i stabilności białek oraz translacji mRNA w rybosomach, jednak najważniejsze mechanizmy regulacyjne związane są z transkrypcją (Sekcja A4). Zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych dotyczy to w szczególności genów kodujących białka, których funkcją jest nadzorowanie transkrypcji innych białek, mechanizmy różnią się jednak znacznie między tymi dwoma królestwami.

Regulacja transkrypcji u prokariotów

Ważnym elementem regulacji transkrypcji genów w bakteriach jest organizacja genów w operony. Są to jednostki transkrypcyjne, w których określone geny, zwykle kodujące białka powiązane funkcjonalnie, są regulowane łącznie. Istnieją też inne geny kodujące białka regulacyjne kontrolujące ekspresję genów zgrupowanych w operonach. W E. coli zidentyfikowano wiele różnych operonów. Większość z nich obejmuje geny kodujące białka związane z biosyntezą aminokwasów lub metabolizmem składników pokarmowych. Operony dzielą się na indukowalne i reprymowalne. Operony indukowalne zawierają geny kodujące enzymy związane ze szlakami katabolicznymi. Ekspresja takich genów kontrolowana jest przez substraty tychże szlaków. Przykładem operonu indukowalnego jest operon lac kodujący enzymy niezbędne w metabolizmie laktozy. Operony reprymowalne zawierają geny kodujące enzymy związane ze szlakami biosyntezy, a ekspresja tych genów kontrolowana jest przez produkt końcowy szlaku, który może hamować ekspresję operonu bądź kontrolować ją za pomocą alternatywnego mechanizmu zwanego atenuacją. Przykładem operonu reprymowalnego jest operon trp kodujący enzymy uczestniczące w biosyntezie tryptofanu.

Operon lac

Ten operon obejmuje trzy geny kodujące enzymy potrzebne bakterii E. coli do wykorzystywania cukru, laktozy. Są to: permeaza laktozy transportująca laktozę do komórek, ?-galaktozydaza hydrolizująca laktozę na cukry składowe (glukozę i galaktozę) oraz transacetylaza ?-galaktozydu, również uczestnicząca w hydrolizie laktozy. Enzymy te są normalnie obecne w E. coli w bardzo niskich stężeniach, lecz w obecności laktozy ich poziomy gwałtownie rosną. Trzy geny tworzące operon lac, znane jako lacZ, Y i A, kodują odpowiednio: ?-galaktozydazę, permeazę laktozy i transacetylazę ?-galaktozydu. Geny te są ułożone sekwencyjnie i transkrybowane jako pojedynczy mRNA pod kontrolą pojedynczego promotora. Inny gen regulacyjny, lac I, którego ekspresja odbywa się niezależnie, znajduje się powyżej operonu i koduje białko zwane represorem lac, nadzorujące ekspresję genów lacZ, Y i A. Pod nieobecność laktozy represor lac wiąże się z sekwencją DNA zwaną operatorem, umiejscowioną między promotorem lac i początkiem genu lacZ. Związany z operatorem represor lac blokuje wiązanie się polimerazy RNA z promotorem lac, uniemożliwiając transkrypcję genów lac. Kiedy komórka napotyka laktozę, kilka obecnych w niej cząsteczek enzymów lac umożliwia jej pobór i metabolizm. Allolaktoza, izomer laktozy wytwarzany jako produkt pośredni w metabolizmie laktozy działa jak induktor: wiąże się z represorem, zmieniając jego konformację w sposób uniemożliwiający wiązanie z operatorem. Miejsce wiązania się polimerazy RNA nie jest już blokowane i transkrypcja operonu może postępować. W wielkich ilościach wytwarzane są cząsteczki enzymów, które pobierają laktozę i metabolizują ją. Po wyczerpaniu jej zasobów represor lac powraca do swojej pierwotnej konformacji i ponownie wiąże się z operatorem lac, uniemożliwiając transkrypcję i wyłączając operon (Rys. 1).

Represja kataboliczna

Tym terminem określa się dodatkowy mechanizm regulacyjny pozwalający operonowi lac wyczuwać obecność glukozy będącej alternatywnym i preferowanym w stosunku do laktozy źródłem energii. W przypadku równoczesnej obecności glukozy i laktozy komórki wykorzystują glukozę w pierwszej kolejności, nie wydatkując energii na rozkład laktozy do cukrów składowych. Obecność glukozy w komórce wyłącza operon lac za pomocą mechanizmu zwanego represją kataboliczną, w którym uczestniczy białko regulacyjne zwane białkowym aktywatorem katabolicznym (CAP) (Rys. 2). CAP wiąże się z sekwencją DNA powyżej promotora lac i intensyfikuje wiązanie polimerazy RNA, co prowadzi do zwiększonej transkrypcji operonu. Jednakże, CAP działa w opisany sposób tylko w obecności pochodnej ATP zwanej cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP), na którego stężenie ma wpływ glukoza. Enzym cyklaza adenylanowa, katalizujący syntezę cAMP, jest hamowany przez glukozę. Kiedy komórka ma dostęp do glukozy, cyklaza adenylanowa jest hamowana i stężenia cAMP są niskie. W tych warunkach CAP nie wiąże się powyżej promotora i transkrypcja operonu lac przebiega na bardzo niskim poziomie. Kiedy, przeciwnie, poziom glukozy jest niski, cyklaza adenylanowa nie jest hamowana, stężenia cAMP są wyższe i CAP wiąże się, zwiększając transkrypcję operonu. W przypadkach równoczesnej obecności glukozy i laktozy operon lac będzie transkrybowany na niskim poziomie. Gdy jednak glukoza jest już całkowicie wykorzystana, proces represji katabolicznej zatrzymuje się i transkrypcja operonu lac wzrasta, umożliwiając wykorzystanie dostępnej laktozy.

Operon trp

Ten operon obejmuje pięć genów kodujących enzymy uczestniczące w biosyntezie aminokwasu tryptofanu. Podczas ekspresji tych genów pojedynczy mRNA transkrybowany jest z położonego wyżej promotora. Ekspresję operonu reguluje poziom tryptofanu w komórce (Rys. 3). Gen nadzorujący położony powyżej operonu trp koduje białko zwane represorem trp, które wiąże się z sekwencją DNA zwaną operatorem trp położoną poniżej promotora trp i częściowo nakładającą się z nim. Gdy tryptofan znajduje się w komórce, wiąże się z białkiem represora trp, umożliwiając mu wiązanie z sekwencją operatora trp i utrudniając wiązanie polimerazy RNA z promotorem trp, a tym samym wstrzymując transkrypcję operonu. W warunkach braku tryptofanu represor trp traci zdolność wiązania się z operatorem trp i wówczas transkrypcja operonu postępuje. Tryptofan, będący końcowym produktem enzymów kodowanych przez operon trp, współdziała więc jako korepresor z białkowym represorem trp, hamując własną syntezę przez hamowanie produktu końcowego.

Rysunek 1. Regulacja operonu lac (a) przy nieobecności oraz (b) w obecności induktora

Rysunek 2. Represja kataboliczna operonu lac

Rysunek 3. Operon tryptofanowy

Atenuacja

Operon trp wykorzystuje też alternatywną strategię kontrolowania transkrypcji, zwaną atenuacją, precyzyjnie dostrajającą poziom ekspresji (Rys. 4). Fragment sekwencji mRNA zlokalizowany między promotorem trp a pierwszym genem trp może tworzyć dwie struktury łodygi-pętli. Względne położenia sekwencji są takie, że obie struktury nie mogą powstawać równocześnie: w danym czasie może istnieć tylko jedna z nich. Struktura większa, bardziej stabilna, niewpływająca na transkrypcję, występuje przed mniejszą działającą jako terminator transkrypcji. Jeśli tworzy się ta ostatnia, to następuje zatrzymanie transkrypcji przed dotarciem do pierwszego genu, co oznacza zahamowanie ekspresji. Atenuacja wykorzystuje fakt, że w bakteriach transkrypcja i translacja są powiązane: rybosomy wiążą się z mRNA w trakcie jego syntezy i rozpoczynają translację białek. Transkrybowane cząsteczki mRNA mogą już być w kontakcie z jednym lub wieloma rybosomami. Wiązania rybosomów z mRNA trp decydują o tym, które z dwóch struktur łodygi-pętli mogą powstawać, a więc i o terminacji procesu. Nieco powyżej obszaru łodygi pętli znajduje się krótka otwarta ramka odczytu, zawierająca 14 kodonów i kodon stop, odczytywana przed genami struktury; dwa z tych 14 kodonów kodują tryptofan. Gdy stężenia tryptofanu są odpowiednie, rybosom przeprowadza translację obszaru kodującego podążając tuż za polimerazą RNA. W tych okolicznościach obecność rybosomu zapobiega tworzeniu się większej struktury łodygi-pętli, zezwalając na powstanie pętli terminacyjnej, i wówczas transkrypcja się kończy. Przy braku tryptofanu translacja przez rybosom obszaru kodującego zostanie wstrzymana. Polimeraza RNA pójdzie do przodu i będzie mogła powstać struktura łodygi-pętli pierwszego typu. Formowanie pętli terminacyjnej jest wówczas wstrzymane i transkrypcja operonu może być kontynuowana. Szybkości translacji przez rybosom obszarów kodujących nie są jednakowe w różnych transkryptach. Gdy poziomy tryptofanu w środowisku są umiarkowane, niektóre transkrypcje będą się kończyły, a inne nie, co umożliwia precyzyjną regulację poziomów transkrypcji operonu. Ogólnie biorąc, represor trp decyduje o włączaniu i wyłączaniu operonu, a atenuacja determinuje efektywność transkrypcji; oba mechanizmy zależą od stężenia tryptofanu w komórce. Atenuacja pozwala komórkom syntetyzować tryptofan dokładnie zgodnie z ich zapotrzebowaniem.

Atenuacja nie ogranicza się do operonu trp i występuje w co najmniej sześciu innych operonach kodujących enzymy biosyntezy aminokwasów. Niektóre operony, takie jak trp i phe, są nadzorowane przez represory i atenuację, a inne, takie jak his, leu i thr, tylko przez atenuację.

Rysunek 4. Atenuacja w operonie trp. (a) W warunkach obfitości tryptofanu rybosom wyklucza tworzenie się dużej pętli, pozwalając na tworzenie się pętli terminacyjnej (terminatora); (b) Przy niedoborach traptofanu rybosom zatrzymuje się, umożliwiając formowanie się dużej pętli i blokując powstawanie terminatora

Regulacja przez alternatywne czynniki sigma

Bakteryjna polimeraza RNA składa się z pięciu odrębnych podjednostek polipeptydowych (po dwie ?, ?, ?' i ?). Inna podjednostka, zwana czynnikiem sigma (?), dokonuje inicjacji transkrypcji, rozpoznając sekwencję DNA bakteryjnego promotora. Bakterie, w tym E. coli, tworzą alternatywne czynniki sigma rozpoznające różne zbiory promotorów i pobudzające polimerazę RNA do transkrypcji różnych zestawów genów. Mechanizm ten wykorzystywany jest jako sposób regulacji ekspresji genów, gdy warunki środowiskowe zmuszają do zasadniczej zmiany wzoru ekspresji. Czynnikiem najczęściej używanym przez E. coli jest czynnik ?70. Alternatywne czynniki ? są wykorzystywane w wielu sytuacjach, w tym w reakcji na szok termiczny u E. coli oraz podczas sporulacji u Bacillus subtilis.

Regulacja transkrypcji u eukariotów

Regulacja transkrypcji genów polega na interakcji promotorów genów z białkami wiążącymi DNA nazywanymi czynnikami transkrypcyjnymi (Rys. 5). Transkrypcja genu przez polimerazę RNA inicjowana jest przez promotor, a skuteczność tej inicjacji może być modyfikowana przez interakcje między krótkimi sekwencjami regulacyjnymi DNA obecnymi w promotorze oraz białkami będącymi czynnikami transkrypcyjnymi. Sekwencje ragulacyjne obecne w promotorze znajdują się na tym samym chromosomie (podwójnej helisie DNA), co sekwencja kodująca, i są określane jako działające w układzie cis.

W komórkach eukariotycznych wszystkie geny kodujące białka transkrybowane są przez polimerazę RNA II. Transkrypcję rozpoczyna formacja transkrypcyjnego kompleksu inicjacyjnego (TIC), obejmująca wiązanie polimerazy RNA II oraz pewnej liczby związanych z nią białek, zwanych podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi z promotorem DNA w charakterystycznej sekwencji znanej jako TATA box. Ma ona sekwencję 5'TATA(A/T)A(A/T)3' i znajduje się w większości genów eukariotycznych, choć nie we wszystkich i jest umiejscowiona około 25 bp przed miejscem inicjacji transkrypcji. Jej funkcją jest lokowanie polimerazy RNA w położeniu prawidłowym z punktu widzenia inicjacji transkrypcji. Niektóre geny, zwłaszcza te, których ekspresja odbywa się wyłącznie w specyficznych tkankach lub komórkach, nie mają TATA box'u, lecz sekwencję inicjującą umiejscowioną zwykle przed miejscem startu transkrypcji. Inne geny, zwykle o niskich poziomach ekspresji, nie posiadają TATA box'u ani elementu inicjującego.

Efektywność inicjacji transkrypcji, a w konsekwencji ilości wytwarzanego mRNA, zależy od dodatkowych czynników transkrypcyjnych wiążących inne sekwencje DNA znajdujące się w promotorze i mogących reagować z białkami TIC, wpływając na jego stabilność.

Rysunek 5. Regulacja ekspresji genów u eukariotów

Czynniki transkrypcyjne mogą zmniejszać lub zwiększać szybkość transkrypcji. Istnieje wiele takich czynników, z których każdy rozpoznaje i wiąże sekwencję DNA w promotorze. W różnych promotorach są to różne sekwencje, a miejsca wiązania są zwykle opisywane jako sekwencje consensus (najwyższej zgodności) i istnieją w wielu wariantach. Czynniki transkrypcyjne syntetyzowane są w cytoplazmie, ale efekty ich działań objawiają się w jądrze komórkowym. Jako takie określane są często terminem czynników działającym w układzie trans.

Na szybkość transkrypcji genu mają również wpływ elementy sekwencji zwane wzmacniaczami, których lokalizacje mogą być odległe o tysiące par zasad od miejsca startu transkrypcji. Wzmacniacze mają zwykle długości 100-200 bp, zawierają sekwencje wiążące czynniki transkrypcyjne i mogą przyśpieszać transkrypcję sprzężonych z nimi genów. Położenia wzmacniaczy w stosunku do genów, na które działają, mogą być różne; mogą też być umiejscowione powyżej lub poniżej nich. Działania wzmacniaczy są niezależne od ich orientacji i są równie skuteczne w obu kierunkach. Interakcje między wzmacniaczem i promotorem polegają na tworzeniu pętli wokół znajdującego się między nimi DNA w celu odpowiedniego zbliżenia. Niektóre wzmacniacze zawierają sekwencje wiążące czynniki transkrypcyjne mające negatywny wpływ na transkrypcję. Nazywane tłumikami (silencerami), mogą być odpowiedzialne za ograniczenia ekspresji genów do określonych typów komórek. Działanie wzmacniaczy i tłumików polega zwykle na otwieraniu lub zamykaniu struktur chromatyny (Sekcja A8). Istnieją też inne odległe sekwencje, zwane elementami kontrolnymi locus, mające wpływ na ekspresję całych klasterów genów poprzez kontrolowanie dostępu białek transkrypcyjnych do DNA. Przykładem są obszary kontrolne LCR (ang. Locus Control Region) nadzorujące ekspresję rodzin genów globinowych (Sekcja C11).

Czynniki transkrypcyjne

Czynniki transkrypcyjne to wiele różnych białek regulujących ekspresję genów. Należy je odróżniać od podstawowych czynników transkrypcyjnych wchodzących w reakcje z polimerazą RNA II i tworzących TIC. Istnieje wiele wzorów działania czynników transkrypcyjnych: niektóre występują tylko w niektórych typach komórek, a inne - przeciwnie - we wszystkich ich typach. Czynniki transkrypcyjne działają w trybie kombinatorycznym, wchodząc w reakcje ze sobą nawzajem. Często wymaga to tworzenia homodimerów z cząsteczkami tego samego czynnika transkrypcyjnego lub heterodimerów z innymi takimi czynnikami.

Czynniki transkrypcyjne mają strukturę modularną złożoną z wyodrębnionych domen białkowych o specyficznych funkcjach. Powszechnie występują trzy typy tych domen:

- domeny wiążące DNA - przykłady: motywy HTH (helix-turn-helix), palec cynkowy, domeny podstawowe;

- domeny dimeryzacyjne - przykłady: suwaki leucynowe, motywy HLH (helix-loop-helix);

- domeny transaktywacyjne - bogate w aminokwasy kwasowe.

Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą hamować transkrypcję. Dokonuje się to w różnych trybach. Niektóre reagują bezpośrednio z transkrypcyjnymi kompleksami inicjacyjnymi. Inne działają pośrednio wieloma sposobami, a między innymi: (i) blokując miejsca wiązań DNA z aktywującymi czynnikami transkrypcyjnymi; (ii) tworząc dimery pozbawione domen wiążących DNA; (iii) wiążąc białka represorów z domenami aktywacyjnymi innych czynników transkrypcyjnych.

Regulacja ekspresji genów przez hormony i cytokiny

Hormony to substancje wytwarzane przez komórki, których działanie na inne komórki modyfikują w wieloraki sposób ich funkcje, a w szczególności zmieniają wzory transkrypcji genów. Cząsteczki hormonów mogą być niewielkie, jak w przypadkach steroidów, takich jak estrogeny i glukokortykoidy, oraz polipeptydów, takich jak insulina. Cytokiny to białka działające podobnie jak hormony, często wchodzące w interakcje z komórkami krwi. Hormony i cytokiny modulują ekspresję genów w komórkach docelowych różnymi sposobami. Hormony steroidowe są rozpuszczalne w tłuszczach, mogą więc przenikać przez błony komórkowe, wnikając do cytoplazmy, gdzie wiążą się z czynnikami transkrypcyjnymi zwanymi receptorami hormonów steroidowych. Wiązania te uwalniają receptory hormonów steroidowych od inhibitorów białkowych, umożliwiając ich dimeryzację i translokację do jądra komórkowego, gdzie aktywowana jest transkrypcja genów docelowych przez wiązanie z sekwencjami promotorowymi. Hormony polipeptydowe i cytokiny działają inaczej niż hormony steroidowe, wiążąc się z białkami receptorów na powierzchniach komórek docelowych. Aktywację genu wyzwala proces zwany transdukcją sygnału, w którym sieć białek jest sekwencyjnie aktywowana przez fosforylację białek lub proteolizę. Prowadzi to do stymulacji genów docelowych przez wiązanie czynników transkrypcyjnych z sekwencjami promotorowymi genów.

Potranskrypcyjna regulacja ekspresji genów przez interferencję RNA

Ekspresja genów może być również regulowana przez zapobieganie translacji mRNA. Interferencja RNA (RNAi) polega na parowaniu zasad między cząsteczkami RNA i mRNA, przez co te ostatnie stają się dwuniciowe. Może to utrudniać translację i/lub powodować degradację mRNA. Interferujący RNA nazywany jest antysensownym, jest bowiem komplementarny do sensownego mRNA kodującego aminokwasy. Wykorzystano go w produkcji pierwszych komercyjnych roślin modyfikowanych genetycznie, którymi były pomidory Flavrsavr o zredukowanej aktywności enzymu poligalakturonazy. Enzym ten zmiękcza dojrzałe pomidory i przyspiesza ich gnicie, a bez niego owoce te mogą dojrzewać przed zbiorem (Sekcja G3). Technika ta jest powszechnie używana w procesach eksperymentalnej redukcji ekspresji genów w celu obserwacji zmian fenotypów.

Eukarioty używają mechanizmów RNAi do regulacji ekspresji genów. Dwuniciowe RNA powstają przez parowanie wewnętrzne lub przez hybrydyzację mRNA i antysensownego RNA. Dwuniciowy RNA jest cięty na krótkie interferujące RNA (siRNA) długości 21-28 bp przez enzym o nazwie 'Dicer' (dosł. 'kostkujący'), który kroi RNA 'w kostki'. siRNA łączą się z białkami, m.in. z rodziny argonaute, stając się jednoniciowymi i zachowując nić antysensowną. Kompleks RNA-białko nazywany jest kompleksem hamującym indukowanym przez RNA (RISC). Tworzy on pary z komplementarnym mRNA. Jeśli dopasowanie jest prawidłowe lub niemal prawidłowe, wówczas mRNA jest cięty, co prowadzi do jego degradacji, a RISC może fragmentować inne mRNA. W przypadku niedopasowań mRNA nie może ulec cięciu, lecz translacja może zostać zatrzymana. Doskonale sparowane małe RNA nazywamy krótkimi RNA interferującymi (siRNA), a małe RNA z niewielkimi błędami parowania - mikroRNA (miRNA). Sekwencje docelowe w mRNA znajdują się często, choć nie wyłącznie, w obszarach nieulegających translacji na obu końcach.

MikroRNA powstają z genów mir występujących w roślinach, w organizmach bezkręgowców (około 100 genów) i kręgowców (około 250 genów) oraz w niektórych grzybach. Geny te mają odwrócone sekwencje które mogą tworzyć strukturę łodygi pętli. Struktury łodygi-pętli są odcinane przez Drosha i 'przykrawane' przez dicer do 22 par zasad na nić (18 zasad sparowanych, dwunukleotydowe jednoniciowe zakończenia 3'). W eksperymentalnym hamowaniu ekspresji genów do projektowania siRNA wykorzystuje się dane sekwencjonowania genomu. Dwuniciowy (ds) RNA może być tworzony przez wklejanie sekwencji między promotory i wtedy transkrybowane są obie nici. dsRNA mogą być transfektowane do kultur komórkowych bądź wstrzykiwane do komórek lub organizmów, i wówczas uruchamiają RNAi. Umożliwia to obserwację efektów fenotypowych utraty genów bez czasochłonnego i kosztownego tworzenia nieaktywnych mutantów. Opisane procedury mogą być stosowane w badaniach kultur komórek ludzkich oraz organizmów, w których manipulacje genetyczne są utrudnione. Są one szczególnie użyteczne w badaniu genów o nieznanych funkcjach.

Niektóre wirusy wytwarzają dsRNA uruchamiający system hamowania w celu niszczenia wirusowego RNA. Ten sam mechanizm funkcjonuje również w metylacji DNA, kondensacji heterochromatyny centromerowej oraz modyfikacji chromatyny zawierającej transpozony lub sekwencje powtarzalne. Wydaje się, że jest to powodowane niskimi poziomami transkrypcji sekwencji w przeciwnym kierunku, być może w innym locus, czego następstwem jest tworzenie się komplementarnych nici RNA zdolnych do parowania. RNAi bierze udział w regulacji epigenetycznej (Sekcja A8).

Różnicowanie i rozwój

Transkrypcja genów wymaga dostępu polimerazy RNA do DNA. Eukarioty wyłączają niektóre geny, modyfikując chromatynę i czyniąc je niedostępnymi. Obejmuje to metylację DNA cytozyn oraz metylację specyficznych aminokwasów w histonach. Chromatyna staje się tak ścisła, że jest niedostępna, dopóki kompleks resturkturyzacji chromatyny nie odwróci zmian. Wyłączanie jest półtrwałe; utrzymuje się podczas podziałów somatycznych, a w rozwoju do końca życia organizmu. W niektórych przypadkach może przenosić się na kolejne pokolenia (Sekcje A8 i C11).

Dane oryginału:

BIOS Instant Notes. Genetics

fourth edition

Hugh Fletcher, Ivor Hickey

Copyright ? Taylor & Francis Group

All rights reserved

Authorised translation from the English language edition published by Taylor & Francis, a member of the Taylor & Francis Group.

Wydanie polskie:

Projekt okładki i strony tytułowej Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Chritoph Burgstedt/Shutterstock

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja merytoryczna Katarzyna Tońska

Korekta Anna Wasilewska

Produkcja Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w Internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright ? for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA, Warszawa 2000, 2004, 2010, 2021

ISBN 978-83-01-21907-9

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2021r. (Wydanie IV)

Warszawa 2021

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288; infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Przedmowa do wydania IV

Obecne wydanie Krótkich wykładów z genetyki zostało znacznie zmienione i rozszerzone. W sekcji poświęconej genetykce molekularnej dokonaliśmy gruntownej rewizji treści, ograniczając ilość informacji szczegółowych. Opisom procesów transkrypcji i translacji nadaliśmy bardziej zwięzłą i zwartą formę, wprowadzając jednocześnie w tej Sekcji materiał dotyczący mutacji DNA i ich naprawy. Zmodyfikowaliśmy także Sekcję E poświęconą technologii DNA, poszerzając problematykę wykorzystania w badaniach tego związku zdolności nici DNA do znajdowania nici komplementarnych i parowania. Skoncentrowaliśmy się na opisie koncepcji i zasad, pozostawiając zawiłości podręcznikowi Krótkich wykładów biologii molekularnej. Wprowadziliśmy nową jednostkę wykładu poświęconą sekwencjonowaniu DNA z intencją przedstawienia rozwoju tej technologii w minionym czterdziestoleciu. Początkowo znalezienie pojedynczego genu i poznanie jego sekwencji wymagało lat pracy. Obecnie sekwencjonowanie całego genomu człowieka trwa kilka dni. Ilości danych uzyskiwanych w procesach sekwencjonowania są dziś tak gigantyczne, że ich przechowywanie i analiza stały się problemem trudniejszym od samego sekwencjonowania. Pojawiło się także ryzyko produkcji danych dla samej produkcji oraz problemy związane z ich jakością, towarzyszące wszelkiej produkcji masowej. Jest oczywiste, że nie istnieje 'wzorcowa sekwencja genomu ludzkiego'. Każdy indywidualny genom haploidalny zawiera wiele mutacji recesywnych, ale prace w ramach programu "1000 Genomes Project" pozwoliły na pozyskanie danych genomowych od 1000 osób z różnych części świata w celu możliwości prowadzenia istotnych badań porównawczych. Obecnie poszukiwanie związków między sekwencjami wariantowymi, czyli mutacjami, z konkretnymi wieloczynnikowymi chorobami, takimi jak choroba wieńcowa, wymaga sekwencjonowania rozległych obszarów genomu w celu identyfikacji wariantów. W programie "1000 Genomes Project" udokumentowano już 95% wariantów najbardziej interesujących części ludzkiego genomu, w związku z czym każdy badacz rozpoczynający nowe studium może wybrać odpowiedni wariant, wiedząc czego szukać od samego początku. Istnieje uzasadnione przypuszczenie, że niektóre geny zostaną w przyszłości uznane za niefunkcjonalne u znacznej większości ludzi.

Sekcje dotyczące biotechnologii i organizmów transgenicznych zostały zaktualizowane; dodaliśmy również materiał poświęcony klonowaniu zwierząt i komórkom macierzystym. Zagadnienia te należą do najwyżej zaawansowanej genetyki stosowanej. Genetycznie projektowane ziemniaki są obecnie uprawiane w Europie, między innymi w celu produkcji biodegradowalnych tworzyw sztucznych, ale obawa przed protestami wciąż ogranicza produkcję do celów spożywczych. Innym nowym tematem są 'Geny w rozwoju'; materiał ten opisuje ogólnie rolę regulacji genów w procesie powstawania ciał o określonych kształtach i cechach. Rzuca on również światło na pochodzenie wszystkich zwierząt od wspólnych przodków, okazuje się bowiem, że te same geny kształtują analogiczne części ciał much, ssaków i ryb. Genetyka mendlowska nie zmieniła się od czasów Mendla, tak jak prawa grawitacji od czasów Newtona, wciąż jednak odkrywamy nowe mechanizmy genetyczne. Genetyka jest nadal nauką szybko rozwijającą się, której przedstawicielom przyznano ostatnio szereg Nagród Nobla, czujemy się więc uprzywilejowani mogąc przekazywać część tej wiedzy następnemu pokoleniu genetyków.

Wykaz skrótów

3D

trójwymiarowy

5BU

5-bromouracyl

AAV

(z ang. Adeno-Associated Virus) wirus stowarzyszony z adenowirusem

ADA

(z ang. adenine deaminase) deaminaza adeninowa

ADP

difosforan adenozyny

AIDS

(z ang. Aquired Immune Deficiency Syndrome) zespół nabytego niedoboru odpornościowego

ATP

trifosforan adenozyny

BAC

(z ang. Bacterial Artificial Chromosome) sztuczny chromosom bakteryjny

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

bp

(z ang. base pair) para zasad

BMD

(z ang. Becker muscular dystrophy) dystrofia mięśniowa Beckera

BrdU

bromodeoksyurydyna

cAMP

cykliczny adenozynomonofosforan

CAP

białko aktywujące katabolizm

cdk

kinaza cyklinozależna

cDNA

komplementarny DNA

CFTR

błonowy regulator przewodnictwa

cM

centymorgan

OUN

ośrodkowy układ nerwowy

CODIS

Combined DNA Index System

Col

plazmid kolicynowy

CYP

cytochrom P450

DALI

Distance Matrix ALIgnment

dATP

5'-trifosforan 2'-deoksyadenozyny

dCTP

5'-trifosforan 2'-deoksycytozyny

dd

dideoksy (nukleotyd)

ddNTP

trifosforan dideoksynukleotydu

dGTP

5'-trifosforan 2'-deoksyguanozyny

DIG

(z ang. DIGoksygenin) digoksygenina

DMD

(z ang. Duchenne Muscular Dystrophy) dystrofia mięśniowa Duchenne'a

DNA

kwas deoksyrybonukleinowy

DNMT

(1,2,3) metylotransferaza DNA (z różnymi liczbami)

dNTP

trifosforan deoksynukleotydu

ds

(z ang. Double Stranded) dwuniciowy

dTTP

5'-trifosforan 2'-deoksytymidyny

ESC

(z ang. Embryonic Stem Cell) zarodkowa komórka macierzysta

EST

(z ang. Expressed Sequence Tags) sekwencyjne znaczniki ekspresji

F

plazmid niosący czynnik płci

F'

plazmid niosący czynnik płci zawierający DNA gospodarza

FISH

(z ang. Fluorescent In Situ Hybridisation) hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

FMR

gen związany z zespołem łamliwego chromosomu X

FSHD

(z ang. FacioScapuloHumeral Dystrophy) dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramieniowa

GDP

difosforan guanozyny

GMO

(z ang. Genetically Modified Organism) organizm modyfikowany genetycznie

GTP

trifosforan guanozyny

GWAS

(z ang. Genome Wide Association Studies) całogenomowe badanie asocjacyjne

HD

(z ang. Huntington Disease) choroba Huntingtona

HFr

szczep wykazujący wysoką częstość rekombinacji

HIV

(z ang. Human Immunodeficiency Virus) ludzki wirus niedoboru odporności

HLH

(z ang. Helix-Loop-Helix) helisa-pętla-helisa

hnRNA

heterogenny jądrowy RNA

Hox

(z ang. HOmeoboX) gen homeotyczny

HSA

(z ang. Human Serum Albumin) ludzkie białko surowicze

HUGO

Human Genome Organization

ICM

(z ang. Inner Cell Mass) wewnętrzna masa komórkowa

IGF2

insulinopodobny czynnik wzrostu typu 2

IGFR

receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu

IL2RG

receptor gamma interleukiny 2

iPS

(z ang. induced Pluripotent Stem cells) indukowane komórki pluripotentne

kb

tysiąc zasad (tysiąc par zasad)

kDa

kilodalton

LCR

(z ang. Locus Control Region) obszar kontrolny locus genomowego

LINE

(z ang. Long Interspersed Nuclear Elements) długie rozproszone elementy jądrowe

LTR

(z ang. Long Terminal Repeat) długie powtórzenia końcowe

MCS

(z ang. Multiple Cloning Site) miejsce wielokrotnego klonowania (polilinker)

mtDNA

DNA mitochondrialny

MECP

białko wiążące metylowane CpG

miRNA

mikro RNA

mRNA

RNA matrycowy (z ang. messenger RNA)

MSL

białka letalne specyficznie dla mężczyzn (z ang. Male-Specific Lethal)

NOR

(z ang. Nucleolus Organizer) organizator jąderka

OMIM

Online Mendelian Inheritance in Man

ORF

(z ang. Open Reading Frame) otwarta ramka odczytu

PAC

(z ang. P1 Artficial Chromosome) sztuczny chromosome P1

PCR

(z ang. Polymerase Chain Reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy

PKU

(z ang. Phenylketonuria) fenyloketonuria

pms

(z ang. postmeiotic segregation) segregacja postmejotyczna

pp

pirofosforan

PSI-BLAST

Position Sensitive Iterated BLAST

QTL

(z ang. Quantitative Trait Locus) locus cechy ilościowej

R

(z ang. Resistance) oporność

RF

(z ang. Replicative Form) forma replikacyjna

RFLP

(z ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

RISC

(z ang. RNA-Induced Silencing Complex) kompleks wyciszający indukowany przez RNA

RNA

kwas rybonukleinowy

RNAi

interferencja RNA

ROS

(z ang. Reactive Oxygen Species) reaktywne formy tlenu

RPE65

białko nabłonka barwnikowego siatkówki, 65 kilodaltonów

rRNA

RNA rybosomalny

RT-PCR

(z ang. Reverse Transcription PCR) reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją

SAR

(z ang. Scaffold Attachment Regions) rejony łącznikowe z rusztowaniem

SCE

(z ang. Sister Chromatid Exchange) wymiana chromatyd siostrzanych

SCID

(z ang. Severe Combined ImmunoDeficiency) ciężki złożony niedobór odporności

SINE

krótkie rozproszone elementy jądrowe

siRNA

krótki interferujący RNA

SNP

(z ang. Single Nucleotide Polymorphism) polimorfizm pojedynczego nukleotydu

SnRNP

małe jądrowe nukleoproteiny

ss

(z ang. single stranded) jednoniciowy

SSR

(z ang. Simple Sequence Repeat) proste powtórzenie sekwencji

STR

(z ang. Short Tandem Repeats) mikrosatelita

STS

miejsca znakowane sekwencją

TF

(z ang. Transcription Factor) czynnik transkrypcyjny

TIC

(z ang. Transcription Iniciation Complex) transkrypcyjny kompleks inicjacyjny

Tm

temperatura topnienia (DNA itp.)

TPMT

S-metylotransferaza tiopuryny

tRNA

RNA transportujący

URL

(z ang. Uniform Resource Location) ujednolicony format adresowania zasobów internetowych

UV

promieniowanie ultrafioletowe

VNTR

(z ang. Variable Number of Tandem Repeats) minisatelita

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolylo-?-D-galaktopiranozyd

YAC

(z ang. Yeast Artificial Chromosome) sztuczny chromosom drożdżowy

A1 Struktura DNA

Zagadnienia kluczowe

Nukleotydy

DNA jest polimerem zbudowanym z łańcuchów monomerów nukleotydowych. Każdy nukleotyd zawiera cukier, zasadę i grupę fosforanową. Cukrem jest 2'-deoksyryboza zawierająca pięć atomów węgla oznaczanych 1' (jeden-prim), 2' itd. Istnieją cztery typy zasad: adenina i guanina mają po dwa pierścienie węglowo-azotowe i są purynami; tymina i cytozyna mają pierścienie i są pirymidynami. Zasady są powiązane z węglem 1' deoksyrybozy. Cukier plus zasada tworzą nukleozyd. Nukleotyd ma jedną, dwie lub trzy grupy fosforanowe powiązane z węglem 5' cukru. Nukleotydy występują jako indywidualne cząsteczki lub w formie spolimeryzowanej w strukturach DNA i RNA.

Polinukleotydy DNA

Połączone nukleotydy trifosforanowe z czterema zasadami tworzą łańcuchy polinukleotydowe DNA. Podczas polimeryzacji dwie grupy fosforanowe odpadają i nukleotydy wiążą się za pomocą pozostałych takich grup. Wiązanie fosfodiestrowe powstaje między grupą fosforanową 5' jednego nukleotydu i grupą hydroksylową 3' nukleotydu następnego. Polinukleotyd ma wolną grupę fosforanową 5' na jednym końcu (zwanym końcem 5') oraz wolną grupę OH na drugim (zwanym końcem 3'). Kolejność (sekwencja) zasad koduje informację genetyczną odczytywaną w kierunku: 5' ? 3'. Polinukleotydy są bardzo długie. Mogą mieć 4n sekwencji.

Podwójna helisa

Cząsteczki DNA składają się z dwóch nici polinukleotydowych splecionych ze sobą w formie podwójnej helisy (in. spirali). Trzon cząsteczki tworzą połączenia cukru z grupami fosforanowymi. Zasady zwrócone są do wewnątrz i ułożone w stos jedna nad drugą. Łańcuchy (nici) polinukleotydowe mają przeciwne zwroty (są przeciwbieżne). Podwójna helisa jest prawoskrętna z pełnym skrętem o 360° co 10 zasad. W helisie znajduje się bruzda większa wchodząca w interakcje z białkami oraz bruzda mniejsza. Zidentyfikowano też warianty struktur DNA zawierających Z DNA z helisą lewoskrętną.

Komplementarne parowanie zasad

Podwójną helisę stabilizują wiązania wodorowe między zasadami dwóch nici. Dostępna przestrzeń między niciami ogranicza interakcje zasad w taki sposób, że puryny zawsze tworzą pary z pirymidynami. Zatem: A wchodzi w interakcje tylko z T, a G tylko z C. Nazywa się to komplementarnym parowaniem zasad. Ograniczenie parowania zasad oznacza, że sekwencje zasad należących do dwóch nici są wzajemnie uzależnione oraz że sekwencja jednej determinuje i przewiduje sekwencję drugiej. Umożliwia to zachowanie informacji genetycznej podczas replikacji DNA i ekspresji genów. Naruszenie wiązań wodorowych między zasadami przez wysoką temperaturę, czynniki chemiczne lub działanie enzymów powoduje rozdzielenie nici podwójnej helisy.

Struktura RNA

W RNA tyminę zastępuje uracyl, a 2-deoksyrybozę ryboza. Normalną formą RNA jest pojedyncza nić polinukleotydowa; jednakże, krótkie odcinki sparowanych zasad mogą występować między sekwencjami komplementarnymi.

Replikacja DNA

W tym procesie komórka kopiuje swój DNA przed podziałem. DNA jest kopiowany w kierunku 5' ? 3' przez polimerazy DNA używające pojedynczych łańcuchów DNA jako wzorców. Replikacja jest półzachowawcza (semikonserwatywna). Helikaza rozdziela nici podwójnej helisy. DNA jest syntetyzowany w sposób ciągły na nici wiodącej oraz w sposób nieciągły w segmentach (fragmenty Ozakiego) na nici opóźnionej. Syntezę DNA przez polimerazę DNA inicjuje krótka wstępna synteza RNA z udziałem polimerazy RNA, zwanej prymazą. Sekwencja inicjująca zastępowana jest później przez DNA. Ligaza DNA łączy fragmenty Okazakiego wiązaniem fosfodiestrowym.

Tematy powiązane

(A5) Mutacje DNA(A4) Od DNA do białek

Nukleotydy

Zdolność DNA do przechowywania informacji genetycznej, warunkująca reprodukowalność komórek, wiąże się ze strukturą cząsteczek DNA. DNA jest polimerem, którego cząsteczki mają formę długich łańcuchów monomerów, zwanych nukleotydami. Dlatego cząsteczki DNA nazywane są polinukleotydami. Każdy nukleotyd składa się z trzech części: cukru, pierścieniowej struktury zawierającej azot, zwanej zasadą, oraz grupy fosforanowej. Cukier zawarty w DNA jest pięciowęglową pentozą zwaną 2'-deoksyrybozą, w której grupę -OH przy węglu 2' rybozy zastępuje atom wodoru (Rys. 1). Atomy węgla w cukrze są ponumerowane od 1' do 5'. Przy liczbach tych stawia się apostrofy (') odczytywane jako prim dla odróżnienia od liczb odnoszących się do atomów zasad. Numeracja ta jest ważna, wskazuje bowiem miejsca, w których inne komponenty nukleotydu powiązane są z cukrem.

Każdy nukleotyd zawiera jedną z czterech zasad: adeninę, guaninę, tyminę lub cytozynę (Rys. 2). Są to złożone cząsteczki zawierające pierścieniowe struktury z węglem i azotem. W adeninie i guaninie znajdują się dwa pierścienie węglowo-azotowe; zasady te nazywamy purynami. Cytozyna i tymina mają pierścienie pojedyncze i nazywane są pirymidynami. Zasady połączone są z cukrem wiązaniem między węglem 1' cukru i atomem azotu w pozycji 9 w purynach lub w pozycji 1 w pirymidynach. Połączenie cukru z zasadą nazywane jest nukleozydem (Rys. 3a).

Rysunek 1. Struktura 2'-deoksyrybozy

Rysunek 2. Zasady w DNA

Rysunek 3. Struktury (a) nukleozydów, (b) nukleotydów

Nukleotydy zawierają grupy fosforanowe (PO4) związane z węglem 5' cukru (Rys. 3b). Nukleozyd nazywany jest nukleotydem, gdy dołączona jest do niego grupa fosforanowa. Możliwe jest dowiązanie jednej, dwóch lub trzech takich grup połączonych ze sobą. Grupy fosforanowe oznaczane są jako ?, ? i ?, gdzie ? wiąże się bezpośrednio z cukrem. Nukleotydy występują w komórkach jako cząsteczki indywidualne (ich trifosforany pełnią ważne funkcje w komórkach jako nośniki energii wykorzystywane w reakcjach enzymatycznych) lub spolimeryzowane, jak w przypadkach kwasów nukleinowych (DNA lub RNA).

Polinukleotydy DNA

Nukleotydy trifosforanowe łączą się w polinukleotydy. Cztery z nich używane są w syntezie polinukleotydów DNA: 2'-deoksyadenozyno 5'-trifosforan (dATP lub A), 2'-deoksytymidyno 5'-trifosforan (dTTP lub T), 2'-deoksycytozyno 5'-trifosforan (dCTP lub C) oraz 2'-deoksyguanozyno 5'-trifosforan (dGTP lub G). Fosforany ? i ? odpadają podczas polimeryzacji i jednostki nukleotydowe wiążą się za pośrednictwem pozostałych reszt fosforanowych. Fosforan 5' jednego nukleotydu tworzy wiązanie z węglem 3' następnego nukleotydu, eliminując podczas reakcji grupę -OH przy węglu 3'. Wiązanie takie nazywane jest wiązaniem 3'-5' fosfodiestrowym (C-O-P) (Rys. 4). Łańcuch polinukleotydowy ma wolną grupę 5' trifosforanową na jednym końcu jako koniec 5' oraz wolną grupę 3' hydroksylową na drugim końcu, zwaną końcem 3'. Rozróżnienie to daje polinukleotydowi DNA biegunowość, w związku z czym cząsteczkę DNA można opisać jako 5' ?3' lub 3'?5'.

Czynnikiem kodującym informację genetyczną w polinukleotydach DNA jest kolejność zasad. Jest ona zawsze zapisywana w kierunku 5'?3' (enzymy polimerazy kopiują cząsteczki DNA w tym właśnie kierunku). Polinukleotydy mogą być bardzo długie, bez wyraźnej górnej granicy liczby nukleotydów i bez ograniczeń ich kolejności. Maksymalna liczba sekwencji zasad w polinukleotydzie wynosi 4n, gdzie n jest liczbą nukleotydów. Jest to liczba ogromna. Na przykład: polinukleotyd zawierający sześć zasad może być uporządkowany jako 46 = 4096 różnych sekwencji.

Rysunek 4. Wiązania fosfodiestrowe łączą nukleotydy w polinukleotyd DNA

Podwójna helisa

Cząsteczki DNA mają bardzo specyficzną i charakterystyczną strukturę trójwymiarową nazywaną podwójną helisą (in. podwójną spiralą) (Rys. 5). Strukturę DNA rozpoznali i opisali w roku 1953 pracujący w Cambridge Watson i Crick, wykorzystując rentgenowskie obrazy dyfrakcyjne uzyskane przez Franklin i Wilkinsa. Cząsteczka DNA ma formę dwóch splecionych łańcuchów polinukleotydowych tworzących podwójną helisę. Rdzeń zewnętrzny cząsteczki tworzy jej część cukrowo-fosforanowa. Zasady, będące molekułami płaskimi, zwrócone są do wewnątrz ku sobie, lekko odśrodkowo i ułożone w stos podobny do stosu talerzy.

Rysunek 5. Podwójna helisa

Obrazy podwójnej helisy uzyskane metodą dyfrakcji rentgenowskiej ukazują powtarzające się wzorce wiązań odzwierciedlające regularność struktury DNA. Pełen skręt podwójnej helisy o 360° obejmuje 10 zasad. Jego długość wynosi 34 ?, a odstęp między sąsiednimi zasadami - 3,4 ?. Średnica helisy wynosi 20 ?. Podwójna helisa nazywana jest strukturą przeciwrównoległą. Jedna z jej nici ma kierunek 5'?3', a druga 3'?5'. Tylko przeciwrównoległe polinukleotydy tworzą stabilne helisy. Podwójna helisa nie jest absolutnie regularna i w jej oglądzie zewnętrznym można dostrzec bruzdę większą i bruzdę mniejszą. Pełnią one ważne funkcje w interakcjach z białkami, w procesach replikacji DNA oraz w ekspresji informacji genetycznej. Podwójna helisa jest prawoskrętna. W porównaniu ze spiralnymi schodami oznacza to, że przy 'wchodzeniu' trzon cukrowo-fosforanowy mielibyśmy po prawej stronie.

Gdy kryształy cząsteczek DNA powstają w różnych warunkach, wówczas tworzą się liczne wariantowe ich formy. Forma obecna w komórkach nazywana jest formą B. Inna forma, zwana formą A, ma nieco bardziej zwięzłą strukturę. Istnieją też formy C, D, E i Z, których osobliwością jest lewoskrętność helis. Zidentyfikowano obszary chromosomów zawierające niestandardowe struktury, takie jak Z-DNA.

Komplementarne parowanie zasad

Zasady dwóch łańcuchów polinukleotydowych wchodzą ze sobą w interakcje. Przestrzenie między polinukleotydami decydują o tym, że dwupierścieniowe puryny reagują z jednopierścieniowymi pirymidynami. Tak więc, tymina zawsze reaguje z adeniną, a guanina z cytozyną. Interakcje te stabilizują wiązania wodorowe powstające między zasadami. Między A i T tworzą się dwa wiązania, a między G i C - trzy. Zatem, wiązania G-C są silniejsze od wiązań A-T. Sposób łączenia się zasad w pary między dwiema niciami DNA nosi nazwę komplementarnego parowania zasad i ma fundamenalne znaczenie (Rys. 6). Kombinacje inne niż G-C i A-T nie działają, ponieważ są zbyt duże lub zbyt małe, by mogły pasować do wnętrza helisy, bądź też nie układają się prawidłowo z punktu widzenia tworzenia wiązań wodorowych. Skoro G musi się zawsze wiązać z C, a A z T, zatem sekwencje dwóch nici pozostają we wzajemnej relacji i mówi się o nich, że są komplementarne, co znaczy, że sekwencja jednej nici przewiduje i determinuje sekwencję drugiej. Oznacza to, że jedna nić może być wykorzystana do replikacji drugiej. Opisany mechanizm komplementarnego parowania zasad ma podstawowe znaczenie dla zachowania informacji genetycznej oraz przekazywania jej innym komórkom w procesach ich podziału. Komplementarne parowanie zasad ma także zasadnicze znaczenie w ekspresji informacji genetycznej oraz transkrypcji sekwencji DNA do RNA matrycowego (mRNA) i translacji białek.

Rysunek 6. Komplementarne parowanie zasad. Wiązania wodorowe pokazano liniami przerywanymi

Podwójną helisę stabilizują wiązania wodorowe między parami zasad. Wiązania te mogą być uszkodzone przez wysoką temperaturę i niektóre substancje chemiczne. Skutkuje to rozpadem podwójnej helisy na dwie nici. Cząsteczkę taką nazywamy zdenaturowaną. W komórkach enzymy mogą rozłączać nici podwójnej helisy w celu kopiowania DNA oraz ekspresji informacji genetycznej.

Struktura RNA

Struktura RNA jest podobna do DNA, istnieje jednak szereg ważnych różnic. W RNA rybozę zastępuje 2'-deoksyryboza, a zasadę tyminową inna zasada, mianowicie uracyl mogący się również parować z adeniną (Rys. 7). Ponadto, cząsteczki RNA mają normalnie formę pojedynczych nici polinukleotydowych nietworzących podwójnej helisy. Możliwe jest jednak parowanie zasad między kompementarnymi częściami tej samej nici RNA, czego efektem są krótkie odcinki dwuniciowe.

Replikacja DNA

DNA jest kopiowany przez enzymy zwane polimerazami DNA. Reagując z DNA jednoniciowym, syntetyzują one nową nić komplementarną z pierwotną. Synteza DNA przebiega zawsze w kierunku 5'?3'. Replikacja taka nazywana jest semikonserwatywną (Rys. 8). Oznacza ona, że każda skopiowana cząsteczka DNA zawiera jedną nić pochodzącą z cząsteczki rodzicielskiej oraz nową nić pochodną, będącą wynikiem syntezy podczas replikacji.

Mechanizm replikacji DNA jest bardzo podobny u większości organizmów. Proces ten musi być bardzo dokładny, ponieważ najmniejszy nawet odsetek błędów skutkuje utratą ważnej informacji genetycznej. Jego dokładność zapewnia zdolność polimeraz DNA do sprawdzania poprawności osadzania zasad w syntetyzowanej nici. Proces ten nazywany jest korektą replikacyjną. Ocenia się, że jedna na 5 miliardów zasad osadzana jest nieprawidłowo.

Rysunek 7. Struktury rybozy i uracylu

Rysunek 8. Replikacja semikonserwatywna

Podczas replikacji DNA podwójne helisy całego DNA znajdującego się w komórce są stopniowo rozplatane, czego rezultatem są segmenty DNA jednoniciowego nadającego się do kopiowania przez polimerazy. Rozplatanie podwójnej helisy zaczyna się w położeniu zwanym miejscem inicjacji replikacji i stopniowo postępuje wzdłuż cząsteczki, zwykle w obu kierunkach. Miejsca inicjacji zawierają zwykle sekwencje obfitujące w pary zasad A-T.

Rysunek 9. Miejsce inicjacji replikacji i widełki replikacyjne

Obszar, w którym helisa jest rozplatana i w którym dokonuje się synteza nowego DNA, nazywamy widełkami replikacyjnymi (Rys. 9). W obszarze tym zachodzi szereg odrębnych zdarzeń:

- Rozdzielanie nici podwójnej helisy. To działanie katalizuje enzym helikaza.

- Synteza nici wiodących i opóźnionych. Synteza DNA za pomocą polimeraz DNA odbywa się tylko w kierunku 5'?3'. Dwie nici podwójnej helisy mają przeciwne ukierunkowania (5'?3' oraz 3'?5'), dlatego replikacja każdej z nich wymaga nieco innych mechanizmów. Jedna nić, zwana wiodącą, kopiowana jest w kierunku zgodnym z kierunkiem rozplatania, może więc być syntetyzowana w sposób ciągły (Rys. 10a). Druga nić, zwana opóźnioną, syntetyzowana jest w kierunku przeciwnym, musi być więc kopiowana metodą nieciągłą. Nić opóźniona syntetyzowana jest jako ciąg segmentów zwanych fragmentami Okazakiego (Rys. 10b).

- Inicjacja. Polimerazy DNA potrzebują krótkiego obszaru podwójnej helisy do zainicjowania syntezy DNA. Zapewnia go polimeraza RNA zwana prymazą, zdolna do inicjacji syntezy na matrycy jednoniciowego DNA. Prymaza syntetyzuje krótką wstępną sekwencję RNA według matrycy DNA, tworząc krótki odcinek dwuniciowy. Następnie polimeraza DNA zapoczątkowuje syntezę DNA, zaczynając od wstępnej sekwencji RNA (inicjatora RNA). W przypadku nici opóźnionej synteza kończy się, gdy proces napotyka następną sekwencję inicjującą. W tym momencie inna polimeraza DNA usuwa inicjatora RNA, zastępując go sekwencją DNA (Rys. 11).

- Ligacja. Ostatnim krokiem niezbędnym do zakończenia syntezy nici opóźnionej jest łączenie fragmentów Okazakiego wiązaniami fosfodiestrowymi. To zadanie wykonuje enzym ligaza DNA (Rys. 11).

Rysunek 10. (a) Replikacja nici wiodącej. (b) Replikacja nici opóźnionej

Rysunek 11. Proces syntezy nici opóźnionej

A2 Geny

Zagadnienia kluczowe

Struktura genów

Gen[1] jest jednostką informacji i odnosi się do konkretnego segmentu DNA kodującego sekwencję aminokwasów lub polipeptydów. Komórki ciała ludzkiego zawierają około 21 000 genów rozmieszczonych w 23 chromosomach. Geny są rozproszone i oddzielone od siebie niekodującym międzygenowym DNA. Informacje zakodowane są na nici matrycowej kierującej syntezą cząsteczek RNA. Każda z dwóch nici DNA może pełnić rolę matrycową. Cząsteczki DNA mają ogromną zdolność przechowywania informacji genetycznej.

Rodziny genów

Niektóre geny zgrupowane są w klasterach będących operonami lub rodzinami wielogenowymi. Operony występują w bakteriach i zawierają geny współnadzorowane z powiązanymi z nimi funkcjami. Rodziny wielogenowe występują w organizmach wyższych i zawierają geny identyczne lub podobne do nadzorowanych koordynacyjnie. Proste rodziny wielogenowe zawierają geny identyczne, których produkty potrzebne są w dużych ilościach. Złożone rodziny wielogenowe zawierają geny bardzo podobne, kodujące białka z powiązanymi funkcjami.

Ekspresja genów

Informacje biologiczne zakodowane w genach udostępniane są w trybie ekspresji genów. W procesie tym dokonuje się synteza kopii RNA genów, które następnie kierują syntezą białek. Dogmat centralny głosi, że transfer informacji następuje z DNA do RNA, a następnie do białek. Funkcjonowanie komórek zależy od skoordynowanej aktywności wielu białek. Ekspresja genów zapewnia ich syntezę w odpowiednich miejscach i czasie.

Promotory genów

Ekspresja genów jest ściśle uregulowana. Nie wszystkie geny obecne w komórce są aktywne, a różne typy komórek korzystają z ekspresji różnych genów. Ekspresja genów jest regulowana przez segment DNA zwany promotorem, położony powyżej sekwencji kodującej. Wiąże on polimerazę RNA oraz skojarzone białkowe czynniki transkrypcyjne, inicjując syntezę cząsteczki RNA.

Introny i eksony

Kodująca sekwencja genu rozpada się na ciąg segmentów zwanych eksonami, oddzielonych sekwencjami niekodującymi, zwanymi intronami, stanowiącymi zwykle większą część sekwencji genowej. Liczba i rozmiary intronów są różne w różnych genach. Introny są usuwane z transkryptów RNA w procesie zwanym splicingiem, poprzedzającym syntezę białek. Introny są zwykle nieobecne w genach bakteryjnych.

Pseudogeny

Istnieją kopie niektórych genów zawierające zmiany w sekwencji nabyte w procesie ewolucyjnym i uniemożliwiające produkcję białek. Nazywane pseudogenami, reprezentują ewolucyjne relikty genów pierwotnych. Ich przykładami są pseudogeny globinowe.

Tematy powiązane

(A7) Regulacja ekspresji genów

(A8) Epigenetyka i modyfikacje chromatyny

(B2) Genomy prokariotów

(B3) Genomy eukariotów

Struktura genów

Informacja biologiczna potrzebna organizmowi do rozmnażania zawarta jest w jego DNA. Czynnikiem kodującym jest kolejność zasad w cząsteczkach DNA. Są one zorganizowane w formie dużej liczby genów, z których każdy zawiera instrukcje syntezy polipeptydów. W kategoriach fizycznych gen jest określonym segmentem DNA, którego specyficzna sekwencja zasad koduje kolejność aminokwasów w strukturze polipeptydu. Długości genów bardzo się różnią - od niecałych stu do kilku milionów par zasad. W organizmach wyższych geny występują w ciągach bardzo długich cząsteczek DNA zwanych chromosomami. W ciałach ludzkich zidentyfikowano do tej pory 20 563 geny kodujące białka, rozmieszczone w 23 chromosomach. Geny są znacznie rozproszone w cząsteczkach DNA i rozdzielone sekwencjami, które nie wydają się zawierać użytecznych informacji; ogół tych sekwencji nazywamy DNA międzygenowym (in. intergenowym). DNA międzygenowe bywają bardzo długie; np. w organizmach ludzkich sekwencje genowe zajmują mniej niż 30% całkowitego DNA. Nośnikiem informacji biologicznej jest tylko jedna z dwóch nici podwójnej helisy DNA, nazywana nicią matrycową i wykorzystywana w konstrukcji sekwencji komplementarnej cząsteczki RNA kierującej syntezą polipeptydu. Nić tę inaczej nazywa się antysensowną lub niekodującą. Drugą nić nazywamy kodującą lub sensowną. Każda z nici podwójnej helisy może być potencjalnie nicią matrycową: indywidualne geny mogą być rozmieszczone na różnych niciach.

Zdolność cząsteczek DNA do przechowywania informacji jest gigantyczna. Dla cząsteczki DNA zawierającej n zasad liczba różnych kombinacji czterech zasad wynosi 4n. Nawet dla bardzo krótkich cząsteczek liczba różnych możliwych sekwencji jest ogromna. W praktyce jednak liczba sekwencji zawierających użyteczne informacje jest ograniczona. Tym niemniej zdolność kodowania danych biologicznych pozostaje bardzo duża.

Rodziny genów

Większość genów rozmieszczona jest losowo wzdłuż chromosomów, niektóre są jednak zorganizowane w grupy lub klastery. Istnieją dwa typy klasterów: operony (Rys. 1) i rodziny wielogenowe (Rys. 2).

Operony to klastery genów występujące u bakterii. Zawierają geny uporządkowane w sposób skoordynowany i kodują białka o ściśle powiązanych funkcjach. Przykładem jest operon lac bakterii E. coli zawierający trzy geny kodujące enzymy potrzebne tej bakterii do rozkładu laktozy. Kiedy laktoza jest dostępna jako źródło energii, wówczas potrzebne są jednocześnie wszystkie enzymy zakodowane w operonie lac. Grupowanie genów w operonach umożliwia ich skoordynowane włączanie i wyłączanie w tym samym czasie, co pozwala organizmowi efektywnie wykorzystywać zasoby (Rys. 1).

W organizmach wyższych operony nie występują, a zgrupowania genów mają formę rodzin wielogenowych. W odróżnieniu od operonów, geny należące do rodziny wielogenowej są identyczne lub bardzo do siebie podobne, a ich działanie nie jest koordynowane. Taka forma grupowania genów jest przypuszczalnie efektem zapotrzebowania na wiele kopii tych samych genów, zaspokajanego przez ich duplikację utrwaloną w procesie ewolucji. Niektóre rodziny wielogenowe istnieją jako oddzielne klastery w różnych chromosomach; konfiguracje takie powstały prawdopodobnie w wyniku przegrupowań DNA w procesie ewolucji związanych z rozpadem klasterów. Rodziny wielogenowe mogą być proste lub złożone. W prostych rodzinach wielogenowych (Rys. 2a) geny są identyczne. Przykładem jest gen RNA rybosomalnego 5S. W organizmach ludzkich istnieje około 2000 kopii tego genu zgrupowanych w klasterach, co świadczy o dużym zapotrzebowaniu komórek na jego produkt. Złożone rodziny wielogenowe (Rys. 2b) zawierają geny bardzo do siebie podobne, ale nie identyczne. Przykładem jest rodzina genowa globiny kodująca serię polipeptydów (globiny ?, ?, ?, ?, ?) różniące się między sobą tylko kilkoma aminokwasami. Polipeptydy globinowe łączą się w kompleksy z udziałem molekularnego kofaktora zwanego hemem, czego rezultatem są embrionalne i dojrzałe formy hemoglobiny - białka transportującego tlen w krwiobiegu.

Rysunek 1. Operon lac. Trzy geny (lacZ, Y i A) są zgrupowane i nadzorowane łącznie

Ekspresja genów

Informacje biologiczne przechowywane w cząsteczkach DNA zapisane są w formie kolejności zasad. Ekspresja genów jest procesem, w którym informacje te zostają udostępnione komórkom. Sposób wykorzystania informacji genetycznych opisuje dogmat centralny, wprowadzony po raz pierwszy przez Cricka, zgodnie z którym informacje te są transferowane z DNA do RNA, a następnie do białek (Rys. 3). W procesie ekspresji następuje kopiowanie informacji genetycznej połączone z nadzorowaniem syntezy cząsteczek RNA o komplementarnej strukturze. Ta część ekspresji nosi nazwę transkrypcji. Następnie RNA kieruje syntezą polipeptydu, w którym dobór i kolejność aminokwasów jest określana przez kolejność zasad w sekwencji RNA. Ta część procesu ekspresji genów nazywana jest translacją. Dobór i uporządkowanie aminokwasów w cząsteczce białka determinuje jej trójwymiarową strukturę, która z kolei odpowiada jego funkcji lub decyduje o niej. Dogmat centralny głosi, że transfer informacji może odbywać się tylko w jednym kierunku - od DNA do RNA, a następnie do białek - i jest procesem nieodwracalnym. Wyjątki od tej reguły znajdujemy w retrowirusach posiadających enzym nazywany odwrotną transkryptazą, kopiujący RNA do DNA. Funkcjonowanie komórek, a tym samym żywych organizmów zależy od skoordynowanej aktywności wielu różnych białek. Informacja genetyczna zawarta w genach gra rolę zbioru instrukcji syntezy białek w odpowiednich miejscach i czasie.

Rysunek 2. Rodziny wielogenowe. (a) Proste. (b) Złożone

Rysunek 3. Dogmat centralny (u góry) i odwrotna transkrypcja (u dołu)

Promotory genów

Ekspresja informacji biologicznej zapisanej w genach jest w wysokim stopniu regulowana i precyzyjnie nadzorowana. Nie wszystkie geny zawarte w DNA komórki ulegają równoczesnej ekspresji, a różne geny uaktywniają się w różnych typach komórek. Całokształt genów aktywnych w danym czasie określa cechy komórki oraz jej funkcje w organizmie. Na przykład: zupełnie inne geny są aktywne w komórkach mięśniowych, a inne w komórkach krwi. Ekspresję genów nadzoruje segment sekwencji DNA znajdujący się powyżej sekwencji kodującej i nazywany promotorem. Sekwencje DNA zabezpieczone w obrębie promotora są rozpoznawane i wiązane przez polimerazę RNA i inne skorelowane białka, zwane czynnikami transkrypcyjnymi, których zadaniem jest synteza transkryptu genu w RNA. Ekspresja genów w komórce jest więc określona przez sekwencję promotora i jego zdolność do wiązania polimerazy RNA oraz czynników transkrypcyjnych.

Introny i eksony

Jedną z najbardziej zdumiewających cech genów jest to, że w organizmach wyższych informacje kodujące są zwykle podzielone na ciągi segmentów sekwencji DNA zwanych eksonami. Eksony rozdzielone są sekwencjami niezawierającymi użytecznych informacji, nazywanymi intronami (Rys. 4). Liczba intronów jest zróżnicowana w szerokim zakresie - od 0 do 50 w niektórych genach. Różne są też długości eksonów i intronów, przy czym te ostatnie są zwykle dłuższe i wypełniają większą część sekwencji genu. Zanim informacja genetyczna zostanie wykorzystana w syntezie białka, introny muszą być usunięte z cząsteczek RNA w procesie zwanym składaniem (ang. splicing), po którym pozostają tylko eksony i ciągła informacja kodująca. Introny występują wyłącznie w organizmach wyższych i zwykle nie spotykamy ich w bakteriach.

Pseudogeny

Istnieją geny podobne do innych, w których dokładna analiza kolejności zasad ujawnia błędy dyskwalifikujące je jako źródła użytecznej informacji biologicznej. Geny te nazywane są pseudogenami (Sekcja B3) i pochodzą od genów, które w procesie ewolucji zostały obarczone błędami lub mutacjami w sekwencjach DNA, czyniącymi ich biologiczne informacje wadliwymi i nienadającymi się do sterowania syntezą białek. Pseudogeny są więc reliktami przyszłości ewolucyjnej. W procesie ich ewolucji podstawa wyjściowa ulegała zmianom, powodując utratę informacji biologicznej, co stawało się przyczyną zmian jeszcze szybszych oraz istotnego odejścia sekwencji pseudogenu od genu pierwotnego. Przykładem jest szereg pseudogenów globinowych obecnych w klasterach genowych globiny.

Rysunek 4. Introny i eksony

A3 Kod genetyczny

Zagadnienia kluczowe

Ekspresja genów

Informacja genetyczna zakodowana jest w sekwencjach zasad w cząsteczkach DNA jako ciąg genów. Ekspresja genów to termin używany dla określenia sposobów odkodowywania przez komórki informacji niezbędnej do syntezy białek potrzebnych do ich funkcjonowania. Polega ona na syntezie cząsteczek komplementarnego RNA, których sekwencja określa porządek aminokwasów w syntetyzowanych białkach. Sekwencja genu w DNA jest kolinearna z sekwencją aminokwasów w polipeptydzie.

Kod genetyczny

Aminokwasy kodowane są przez 64 trójki zasad zwane kodonami, kodujące 20 aminokwasów. Większość aminkwasów ma w kodzie więcej niż jeden kodon. Fakt ten, nazywany degeneracją lub redundancją kodu genetycznego, sprzyja ona minimalizacji efektów mutacji. Kodony wskazujące ten sam aminokwas nazywane są synonimicznymi; różnią je trzecie zasady w trójkach, tworzące tzw. pozycje 'chwiejne'. AUG jest kodonem inicjującym i koduje metioninę. Istnieją trzy kodony terminacyjne: UAG, UGA i UAA.

Ramki odczytu

Z każdej sekwencji mogą być odczytane trzy zestawy kodonów, w zależności od tego, która zasada wybrana jest jako początkowa. Wszystkie zestawy kodonów nazywane są ramkami odczytu. Kodon inicjujący określa ramkę odczytu dla sekwencji kodującej białko. Inne ramki odczytu zawierają kodony terminacyjne i nie są wykorzystywane w syntezie białek. Sekwencję kodonów ograniczoną kodonami inicjującym i terminacyjnym nazywamy ramką otwartą.

Uniwersalność kodu

Kod genetyczny jest uniwersalny, co znaczy, że występuje i funkcjonuje we wszystkich organizmach oraz wykorzystuje te same kodony dla poszczególnych aminokwasów. Jednakże, wyjątki od standardowej interpretacji kodonów występują w genomach mitochondrialnych oraz w niektórych organizmach jednokomórkowych.

Tematy powiązane

(A4) Od DNA do białek

Ekspresja genów

Informacje niezbędne do reprodukcji organizmu znajdują się w jego DNA, zakodowane w sekwencjach zasad i zorganizowane w ciągi genów. Ekspresja genów to termin używany do opisu procesu odkodowywania przez komórki i wykorzystywania tych informacji w celu syntezy białek pełniących w komórkach wielorakie funkcje. W procesie ekspresji genów informacje kopiowane są z DNA do RNA w toku syntezy cząsteczek RNA, w których kolejność zasad jest komplementarna do matrycy DNA. Następnie RNA nadzoruje syntezę białek, w których sekwencje aminokwasów są określone przez kolejności zasad w RNA. Dla każdego genu sekwencja DNA jest kolinearna z sekwencją aminokwasów polipeptydu przezeń zakodowanego, co znaczy, że kolejność zasad w kierunku 5'?3' kodującej nici DNA określa strukturalny porządek zakodowanego polipeptydu - od grupy aminowej do końca wodorotlenowego -OH.

Kod genetyczny

Kod genetyczny opisuje sposób interpretacji kolejności zasad w DNA w kategoriach sekwencji aminokwasów podczas syntezy białka. Sekwencja DNA zwana genem obejmuje ciąg jednostek mających postać trójek zasad. Każda taka trójka, nazywana kodonem, definiuje określony aminokwas. Kombinacje czterech zasad w DNA i RNA mogą tworzyć ogółem 43 = 64 kodony kodujące 20 występujących w białkach aminokwasów (Tabela 1). Liczba kodonów jest większa od liczby aminokwasów, zatem wszystkie aminokwasy - z wyjątkiem metioniny i tryptofanu - kodowane są przez więcej niż jeden kodon. Ta cecha kodu genetycznego nazywana jest jego degeneracją bądź redundancją. Kodony specyfikujące te same aminokwasy, nazywane synonimicznymi, są zwykle podobne. Na przykład: ACU, ACC, ACA i ACG specyfikują aminokwas treoninę. Różnice między synonimami dotyczą zwykle trzecich pozycji kodonów, nazywanych pozycjami chwiejnymi (wobble). Redundancja kodu genetycznego minimalizuje efekty mutacji, zmniejszając prawdopodobieństwo przenoszenia się alteracji kolejności zasad w kodzie na dobór i kolejność aminokwasów w syntetyzowanych białkach oraz nieprawidłowego ich funkcjonowania w komórkach. Z 64 możliwych kodonów 61 koduje aminokwasy. Pozostałe trzy - UAG, UGA i UAA - nie kodują aminokwasów, lecz w procesie syntezy białek sygnalizują zakończenie procesu, dlatego nazywane są kodonami terminacyjnymi lub kodonami stop. Kodon metioniny AUG sygnalizuje rozpoczęcie syntezy białka, nosi więc nazwę kodonu inicjującego. Tak więc, wszystkie polipeptydy zaczynają się od metioniny, choć czasem jest ona przenoszona na dalszą pozycję sekwencji.

Ramki odczytu

Oprócz identyfikacji startu syntezy białka, kodon inicjujący określa ramkę odczytu dla sekwencji RNA. W zależności od tego, która z zasad została wybrana jako początek kodonu, z każdej sekwencji mogą być odczytane trzy różne zestawy kodonów. W praktyce, podczas syntezy białka normalnie tylko jedna ramka odczytu zawiera użyteczną informację; w pozostałych dwóch znajdują się zwykle kodony stop, co wyklucza ich wykorzystanie do kierowania syntezą białka (Rys. 1). Zestaw kodonów powtarzających się w sposób ciągły, ograniczony na początku kodonem inicjującym, a na końcu kodonem terminacyjnym, nazywany jest otwartą ramką odczytu (ORF). Takie zestawy wykorzystuje się do identyfikacji sekwencji DNA kodujących białka w procesach sekwencjonowania genomów.

Tabela 1. Kod genetyczny

Pozycja II

Pozycja I (koniec 5')

U

C

A

G

Pozycja III (koniec 3')

U

Phe UUU

Ser UCU

Tyr UAU

Cys UGU

U

Phe UUC

Ser UCC

Tyr UAC

Cys UGC

C

Leu UUA

Ser UCA

Stop UAAA

Stop UGA

A

Leu UUG

Ser UCG

Stop UAG

Trp UGG

G

C

Leu CUU

Pro CCU

His CAU

Arg CGU

U

Leu CUC

Pro CCC

His CAC

Arg CGC

C

Leu CUA

Pro CCA

Gln CAA

Arg CGA

A

Leu CUG

Pro CCG

Gln CAG

Arg CGG

G

A

Ile AUU

Thr ACU

Asn AAU

Ser AGU

U

Ile AUC

Thr ACC

Asn AAC

Ser AGC

C

Ile AUA

Thr ACA

Lys AAA

Arg AGA

A

Met AUG

Thr ACG

Lys AAG

Arg AGG

G

G

Val GUU

Ala GCU

Asp GAU

Gly GGU

U

Val GUC

Ala GCC

Asp GAC

Gly GGC

C

Val GUA

Ala GCA

Glu GAA

Gly GGA

A

Val GUG

Ala GCG

Glu GAG

Gly GGG

G

Uniwersalność kodu

Początkowo kod genetyczny uważano za uniwersalny, co oznaczało przekonanie, że wszystkie organizmy rozpoznają poszczególne kodony jako te same aminokwasy. Od zasady uniweralności istnieją jednak rzadkie wyjątki. Na przykład: zwierzęce mitochondria mają niewielkie genomy DNA zawierające około 20 genów, w których występują odstępstwa od reguł kodu genetycznego. Różnice te związane są głównie z kodonami start i stop, tj. inicjującymi i terminacyjnymi. Na przykład: UGA, będący normalnie kodonem terminacyjnym, koduje tryptofan, natomiast AGA i AGG, normalnie kodujące argininę, są kodonami terminacyjnymi, a AUA, kodujący normalnie izoleucynę, koduje metioninę. Panuje pogląd, że istnienie tych genetycznych osobliwości jest możliwe, ponieważ mitochondrium jest układem zamkniętym. Znaleziono jednak u organizmów jednokomórkowych kilka przykładów niestardardowej interpretacji kodonów poza genomami mitochondrialnymi. Na przykład: u niektórych pierwotniaków UAA i UAG, będące normalnie kodonami stopu, kodują kwas glutaminowy.

Rysunek 1. Każda sekwencja DNA może być odczytana jako trzy różne ramki odczytu, zależnie od tego, która z zasad zostanie wybrana jako początek kodonu

A4 Od DNA do białek

Zagadnienia kluczowe

Wstęp

Ekspresja genów przebiega w trzech etapach: transkrypcji, obróbki RNA i translacji. W etapie translacji informacje zakodowane w kwasach nukleinowych konwertowane są w sekwencje aminokwasów w rybosomach.

Transkrypcja RNA

Polimerazy RNA tworzą kopie sekwencji nici matrycowej DNA. Produkt tej operacji nazywany jest transkryptem RNA. Proces transkrypcji jest podobny do replikacji DNA realizowanej przez polimerazy DNA. Transkrypcja zaczyna się od sekwencji promotorowej w DNA i kontynuuje do osiągnięcia sekwencji terminatora. U eukariotów różne polimerazy transkrybują ściśle określone zbiory genów.

Obróbka RNA

Pierwotny transkrypt poprzedzający RNA matrycowy (mRNA) jest długi i zawiera introny, które usuwane są w spliceosomach. Alternatywny splicing umożliwia tworzenie różnych wariantów białek na podstawie tego samego genu. U prokariotów mRNA nie wymaga obróbki. Obróbka RNA obejmuje również modyfikacje obszarów 5' i 3' mRNA.

Translacja

Proces translacji dokonuje się w rybosomach i rozpoczyna od kodonu inicjującego AUG. Sekwencje nukleotydów odczytywane są w trójkach przez cząsteczki RNA transportującego (tRNA) dostarczające odpowiednie aminokwasy. Antykodon cząsteczki tRNA wiąże się z komplementarnym kodonem mRNA. Transferaza peptydylowa tworzy wiązania między uporządkowanymi aminokwasami, formując powstające polipeptydy. Białka mogą być po translacji chemicznie modyfikowane.

Tematy powiązane

(A2) Geny

(A7) Regulacja ekspresji genów

(F3) Geny i rak

Wstęp

Procedura ekspresji genów, czyli przejścia od informacji zakodowanych w sekwencjach nukleotydów do syntezy białek, dzieli się na trzy etapy. Sekwencje zasad zawarte w DNA są kopiowane do RNA w procesie transkrypcji. Informacje pozostają w kodzie kwasu nukleinowego. Cząsteczki RNA są następnie przetwarzane do form nadzorujących syntezę białek w rybosomach, w których informacje genetyczne przechowywane w kwasie nukleinowym poddawane są translacji, czyli tworzeniu odpowiednich sekwencji aminokwasów.

Transkrypcja RNA

Syntezy RNA dokonują enzymy zwane polimerazami RNA, używające DNA jako wzorca. Jedna z dwóch nici podwójnej helisy nazywana jest matrycową, a druga kodującą.

Rysunek 1. Transkrypcja nici matrycowej DNA tworzy transkrypt RNA zawierający te same sekwencje co kodująca nić DNA

RNA powstaje w wyniku kopiowania z nici matrycowej DNA, a syntetyzowane cząsteczki RNA są uporządkowane podobnie jak w nici kodującej (Rys. 1). Sekwencje genowe są zwykle zgodnie z sekwencją nici kodującej. Inną nazwą nici kodującej jest: nić sensowna *(+) oraz nić kodująca. Utworzona w tym procesie cząsteczka RNA nazywa się transkryptem.

Podczas transkrypcji RNA jest syntetyzowany przez polimeryzację podjednostek trifosforanu rybonuklotydu (ATP, UTP, GTP, CTP). 3'-OH jednego rybonukleotydu reaguje z 5'-fosforanem innego, tworząc wiązanie fosfodiestrowe. Kolejność dodawania rybonukleotydów do powstającego łańcucha RNA jest określona przez kolejność zasad w matrycowym DNA. W toku syntezy RNA w kierunku 5'?3' z udziałem polimerazy RNA dodawane są nowe rybonukleotydy do łańcucha rosnącego w kierunku wolnego końca 3' w procesie podobnym do syntezy DNA (Sekcja 1).

Kontynuacja transkrypcji nosi nazwę fazy elongacji. W jej toku tylko niewielkie porcje podwójnej helisy są rozplatane w danym czasie. Obszar rozpleciony zawiera nowo utworzone zasady RNA zgodne z nicią matrycową DNA i obejmuje 12-17 takich zasad. Końcowy produkt transkrypcji odpowiada nie tylko kodującemu obszarowi DNA, lecz także jego obszarom końcowym 5' i 3'. U eukariotów transkrypt pierwotny ma budowę złożoną, zawiera bowiem zarówno kodujące eksony, jak i niekodujące introny (Sekcja A2). Specyficzne sekwencje w DNA sygnalizują zakończenie transkrypcji.

U eukariotów trzy oddzielne polimerazy RNA transkrybują różne zbiory genów. Polimeraza RNA II transkrybuje geny kodujące białka oraz geny regulacyjne mikroRNA. Większość genów kodujących strukturę kwau nukleinowego rybosomu, czyli rybosomalnego RNA transkrybuje polimeraza RNA III, a geny kodujące cząsteczki tRNA biorące udział w translacji transkrybuje polimeraza RNA I.

Obróbka RNA

U eukariotów pierwotny transkrypt (pre-mRNA) utworzony na podstawie genów kodujących białka jest długi i głównie złożony z sekwencji zawierających skopiowane niekodujące introny. Segmenty te są usuwane w procesie zwanym składaniem (ang. splicing). U prokariotów mRNA nie podlega obróbce, a translacja zawartej w nim informacji zaczyna się nawet przed zakończeniem transkrypcji. Geny prokariotów zwykle nie zawierają intronów i proces splicingu nie jest konieczny.

Splicing odbywa się w jądrze. Introny typu 1 zawierają miejsca aktywne w RNA i usuwają się. W przypadkach intronów typu 2 specyficzne sekwencje nukleotydów na ich końcach 5' i 3' rozpoznawane są przez kompleksy białkowe małych rybonukleoprotein jądrowych (snRNP) oraz specyficzne cząsteczki RNA. Połączenie pre-mRNA i snRNP nazywane jest spliceomem, którego zadaniem jest zwinięcie pre-mRNA do konformacji (postaci) odpowiedniej do splicingu, po czym intronowe sekwencje RNA są wycinane, a sąsiadujące z nimi sekwencje eksonowe scalane (Rys. 2). snRNP występujące w tej samej komórce lub w różnych komórkach mogą się różnić, co umożliwia regulację i modyfikację przebiegu splicingu. Różne wzorce splicingu można zaobserwować dla takiego samego mRNA w różnych tkankach, co pozwala organizmowi tworzyć wiele wariantów białek na podstawie tego samego 'genu'. Wzorce te ulegają często patologicznym zmianom w guzach nowotworowych (Sekcja F3).

U eukariotów pre-mRNA, niezależnie od splicingu, są również modyfikowane w obszarach końcowych 5' i 3'. N końcach 5' występuje modyfikacja zwana przykrywaniem czapeczki (ang. capping), polegająca na dodawaniu zmodyfikowanego nukleotydu 7-metyloguanozyny. Na końcach 3' niemal wszystkich mRNA dodawane są długie ogony adenin. Dojrzałe cząsteczki mRNA mogą być teraz poddane procesowi translacji w rybosomach w cytoplazmie komórki.

Translacja

Translacja odbywa się w rybosomach. Kluczową rolę w tym procesie grają cząsteczki RNA transferowego (in. transportującego, przenoszącego, tRNA), dostarczające aminokwasy do rybosomów w porządku zgodnym z sekwencją mRNA, co zapewnia ich łączenie we właściwej kolejności (Rys. 3). W komórkach znajduje się zwykle 31-40 indywidualnych rodzajów tRNA, z których każdy wiąże jeden konkretny z 20 aminokwasów. W rezultacie na jeden aminokwas może przypadać więcej niż jeden tRNA. Warianty tRNA wiążące ten sam aminokwas noszą nazwę izoakceptorów. Przed rozpoczęciem translacji każdy aminokwas zostaje kowalencyjnie połączony ze swym tRNA, który rozpoznaje następnie wskazujące nań kodony w mRNA. Wiązanie aminokwasu z odpowiednim tRNA nazywamy aminoacylacją lub ładowaniem. Każdy aminokwas jest kowalentnie wiązany z końcem ramienia akceptora tRNA przez enzym nazywany syntetazą aminoacylo tRNA. Dla poszczególnych aminokwasów istnieją odrębne takie enzymy, z których każdy może ładować wszystkie izoakceptory tRNA swojego aminokwasu.

Rysunek 2. Splicing pre-mRNA. Pierwotny transkrypt zawiera introny (pola czarne), eksony (pola jasno szare) oraz obszary niepodlegające translacji 3' i 5'. Po splicingu cząsteczki mRNA introny są usunięte i cząsteczka jest gotowa do przyłączania czapeczki na końcu 5' oraz dodawania poli-A na końcu 3', przed eksportem do cytoplazmy w celu translacji

Po dołączeniu odpowiedniego aminokwasu tRNA rozpoznaje jego kodon w mRNA, pozwalając umieścić ten aminokwas we właściwej pozycji, zgodnie z sekwencją mRNA. Zapewnia to dokładną translację kodów zawartych w mRNA na odpowiadającą im sekwencję aminokwasów. Rozpoznanie kodonu odbywa się za pośrednictwem pętli antykodonu w tRNA, a dokładniej trzech nukleotydów tworzących antykodon, który wiąże kodon przez komplementarne parowanie zasad. Kiedy dwa aminokwasy są do siebie zbliżone, enzym transferaza peptydylowa tworzy między nimi wiązanie peptydowe, i w ten sposób następuje wydłużanie powstającego łańcucha polipeptydowego. Cztery zasady obecne w DNA mogą utworzyć 64 kodony. Trzy z nich działają jako sygnały do zatrzymania procesu translacji, a pozostałe 61 koduje 20 aminokwasów, z których składają się białka (Sekcja A3).

Rybosomy istnieją jako oddzielne wielkie i małe podjednostki. Pierwszy krok translacji polega na związaniu podjednostki małej rybosomu z mRNA. Translacja zaczyna się zwykle od sekwencji AUG (w bakteriach czasami wykorzystywane są GUG lub UUG) kodującej metioninę i nazywanej kodonem inicjującym translacji.

Translacja przebiega wzdłuż mRNA, poczynając od miejsca inicjacji, przy czym aminokwasy łączone są wiązaniami peptydowymi. Początkowa metionina jest usuwana z powstającego polipeptydu. RNA matrycowe (mRNA) mogą uczestniczyć w translacji równocześnie w wielu rybosomach, tworząc struktury zwane polisomami. Proces translacji zatrzymują kodony terminacyjne (Sekcja A3).

Polipeptydy są dalej przetwarzane przez enzymy modyfikujące niektóre aminokwasy. Może to obejmować dodawanie niewielkich grup chemicznych; przykładami takich procesów są: metylacja, hydroksylacja i formylowanie. Często dodawane są łańcuchy cukrów w procesie zwanym glikozylacją. Ogólnie biorąc, wszystkie białka wystające poza komórkę są glikozylowane. Proces ten odbywa się w aparatach Golgiego. Konkretny przykład dotyczy ludzkich erytrocytów, gdy krew grupy A ma N-acetylogalaktozaminę w łańcuchu polisacharydowym, zwaną substancją H. We krwi grupy B zamiast niej jest galaktoza, a komórki krwi grupy AB mają obydwie substancje przyłączone do odrębnych łańcuchów. We krwi grupy 0 występuje niezmodyfikowana substancja H.

Rysunek 3. Rola tRNA w translacji