ROZDZIAŁ 1Genomy, transkryptomy i proteomy
1.1. DNA
1.2. RNA i transkryptom
1.3. Białka i proteom
Znane nam życie jest definiowane przez genomy niezliczonych organizmów, z którymi dzielimy naszą planetę. Każdy organizm ma genom zawierający informację biologiczną potrzebną do powstania tego organizmu i utrzymania go przy życiu. Większość genomów, w tym genom człowieka i wszystkich innych komórkowych form życia, jest zbudowana z DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego), choć niektóre wirusy mają genom zbudowany z RNA (kwasu rybonukleinowego). DNA i RNA są polimerami składającymi się z łańcuchów monomerycznych podjednostek, zwanych nukleotydami. Każda cząsteczka DNA składa się z dwóch owiniętych wokół siebie polinukleotydów tworzących podwójną helisę - dwie nici utrzymywane razem dzięki wiązaniom chemicznym łączącym dwa sąsiadujące nukleotydy w strukturę zwaną parą zasad.
Genom człowieka, który jest typowym genomem zwierząt wielokomórkowych, składa się z dwóch odrębnych części (rys. 1.1):
- genomu jądrowego, składającego się z 3 100 000 000 par zasad DNA, podzielonego na 24 cząsteczki; długość najkrótszej z nich wynosi 47 000 000, a najdłuższej 249 000 000 par zasad, każda z nich tworzy oddzielny chromosom; te 24 chromosomy to 22 autosomy i dwa chromosomy płci, X i Y - w sumie, ludzki genom jądrowy zawiera mniej więcej 44 500 genów;
- genomu mitochondrialnego, kolistej cząsteczki DNA o długości 16 569 nukleotydów, która w ilości do dziesięciu kopii znajduje się w organellach wytwarzających energię, zwanych mitochondriami - ludzki genom mitochondrialny zawiera tylko 37 genów.
Każda z ok. 3 × 1013 komórek ciała dorosłego człowieka ma swoją własną kopię lub kopie genomu jądrowego. Jedynymi wyjątkami są niektóre rodzaje komórek, jak czerwone krwinki, które w stanie pełnego zróżnicowania nie mają jądra. Większość komórek jest diploidalna, czyli ma po dwie kopie każdego autosomu plus dwa chromosomy płci: XX u kobiet, a XY u mężczyzn - łącznie 46 chromosomów. Tak jest w przypadku komórek somatycznych, w przeciwieństwie do komórek płciowych, czyli gamet, które są haploidalne i mają tylko 23 chromosomy - po jednym z każdej pary autosomów i jeden chromosom płci. Każda komórka ma również wiele kopii genomu mitochondrialnego: 2 000-7 000 kopii w komórkach somatycznych, takich jak komórki serca i wątroby, oraz ponad 100 000 kopii w każdym oocycie.
Rys. 1.1. Jądrowe i mitochondrialne składniki genomu człowieka
Genom jest magazynem informacji biologicznej, jednak sam nie może przekazać tej informacji komórce. Wykorzystanie informacji biologicznej zawartej w genomie wymaga skoordynowanej aktywności enzymów i innych białek, które biorą udział w złożonych reakcjach biochemicznych prowadzących do ekspresji genomu (rys. 1.2). Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom, zbiór cząsteczek RNA pochodzących od genów aktywnych w komórce w danym momencie. Transkryptom powstaje w procesie transkrypcji - kopiowania (dosłownie: przepisywania) pojedynczych genów na cząsteczki RNA. Następnym produktem ekspresji genomu jest proteom - repertuar białek komórki, określający rodzaj reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać. Białka tworzące proteom są syntetyzowane w procesie translacji (dosłownie: tłumaczenia, przekładu z) niektórych pojedynczych cząsteczek RNA obecnych w transkryptomie.
Niniejsza książka opisuje genomy i ekspresję genomów. Wyjaśnia, w jaki sposób bada się genomy (część 1), jak są one zorganizowane (część 2), jak funkcjonują (część 3) oraz jak się replikują i ewoluują (część 4). Jeszcze do niedawna nie było możliwości napisania takiej książki. Od lat 50. XX w. biolodzy molekularni badali pojedyncze geny lub małe grupy genów. Dzięki tym badaniom powstała bogata wiedza dotycząca działania genów. Dopiero przez ostatnie kilka lat dostępne są techniki umożliwiające badanie całych genomów. Pojedyncze geny są nadal intensywnie badane, jednak dane dotyczące poszczególnych genów są teraz interpretowane w kontekście genomu jako całości. Ten nowy, szerszy aspekt odnosi się nie tylko do genomów, ale również do całej biochemii i biologii komórki. Nie wystarcza już zrozumienie pojedynczego szlaku biochemicznego czy procesu wewnątrzkomórkowego. Obecnie wyzwaniem jest biologia systemów, która stara się powiązać te szlaki i procesy w sieć opisującą całościowe funkcjonowanie żyjącej komórki i żyjącego organizmu.
Niniejsza książka prowadzi przez naszą wiedzę o genomach i pokazuje, że ta ekscytująca dziedzina badań leży u podstaw pogłębiającego się zrozumienia działania układów biologicznych. Na początek musimy zwrócić uwagę na podstawowe prawa biologii molekularnej, omawiając główne cechy trzech typów cząsteczek biologicznych związanych z genomem i jego ekspresją: DNA, RNA i białek.
1.1. DNA
Rys. 1.2. Ekspresja genomu. Genom określa transkryptom, a transkryptom określa proteom
DNA odkrył w 1869 r. Johann Friedrich Miescher, szwajcarski biochemik pracujący w Tybindze w Niemczech. Pierwsze ekstrakty otrzymane przez Mieschera z ludzkich białych krwinek były nieoczyszczoną mieszaniną DNA i białek chromosomowych. W następnych latach Miescher przeniósł się do Bazylei w Szwajcarii, gdzie obecnie znajduje się instytut badawczy jego imienia. Otrzymał tam czyste próbki kwasu nukleinowego ze spermy łososia. Testy chemiczne przeprowadzone przez Mieschera wykazały, że DNA jest kwasem bogatym w fosfor, oraz sugerowały, że pojedyncze cząsteczki są bardzo duże. Jednak dopiero w latach 30. XX w., gdy do badania DNA zastosowano metody biofizyczne, w pełni oszacowano olbrzymią długość polimerycznych łańcuchów.
Geny zbudowane są z DNA
Fakt, że geny zbudowane są z DNA, jest dzisiaj tak dobrze znany, iż trudno uzmysłowić sobie, że przez 75 lat od jego odkrycia nie podejrzewano, jaka jest jego prawdziwa rola. Dopiero W.S. Sutton w 1903 r. zdał sobie sprawę, że wzory dziedziczenia genów odpowiadają zachowaniu się chromosomów w czasie podziałów komórki. Obserwacja ta doprowadziła do zaproponowania teorii chromosomowej, mówiącej, że geny znajdują się w chromosomach. Badania komórek metodami cytochemicznymi, wykorzystującymi barwniki specyficznie wiążące się tylko z jednym typem cząsteczek, wykazały, że chromosomy zawierają mniej więcej równe ilości DNA i białek. W tym czasie biolodzy uświadomili sobie, że muszą istnieć miliony różnych genów i dlatego materiał genetyczny musi występować w wielu różnych formach. Wydawało się, że tego wymagania nie spełnia DNA, ponieważ na początku XX w. sądzono, iż wszystkie cząsteczki DNA są takie same. Z drugiej strony wiedziano, że białka są bardzo zmiennymi, polimerycznymi cząsteczkami, z których każda składa się z różnej kombinacji dwudziestu chemicznie różnych aminokwasowych monomerów (sekcja 1.3). Dlatego uważano, że geny są zbudowane z białek, a nie z DNA.
Błędy w rozumieniu struktury DNA pokutowały do późnych lat 30., kiedy to ustalono, że DNA, podobnie jak białka, cechuje ogromna zmienność. Przypuszczenie, że białka są materiałem genetycznym, pozostawało początkowo silne, ale ostatecznie wykluczono je na podstawie dwóch ważnych doświadczeń.
- Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty wykazali, że DNA jest aktywnym składnikiem czynnika transformującego - ekstraktu z komórek bakteryjnych, który po zmieszaniu z niezjadliwym szczepem Streptococcus pneumoniae przekształcał te bakterie w szczep wirulentny, wywołujący zapalenie płuc po wszczepieniu myszom (rys. 1.3A). W 1944 r., kiedy opublikowano wyniki tego doświadczenia, tylko kilku mikrobiologów zdało sobie sprawę, że transformacja obejmuje przeniesienie genów z ekstraktu komórkowego do żywych bakterii. Jednak gdy zaakceptowano ten fakt, prawdziwe znaczenie "eksperymentu Avery'ego" stało się jasne: geny bakteryjne muszą być zbudowane z DNA.
- Alfred Hershey i Martha Chase zastosowali znakowanie izotopami, by wykazać, że gdy hodowle bakteryjne zainfekuje się bakteriofagami (rodzajem wirusów, zwanych również fagami), to głównym składnikiem bakteriofagów wnikającym do komórki jest DNA (rys. 1.3B). Była to istotna obserwacja, ponieważ wiedziano już, że w czasie cyklu infekcyjnego geny infekujących bakteriofagów kierują syntezą nowych bakteriofagów oraz że ta synteza zachodzi w bakteriach. Jeżeli DNA jest jedyną cząsteczką infekujących bakteriofagów wnikającą do komórki, to wynika z tego, że geny tych bakteriofagów muszą być zbudowane z DNA.
Chociaż z naszej perspektywy te dwa doświadczenia dostarczają podstawowych danych, mówiących, że geny są zbudowane z DNA, jednak w tamtych czasach nie było łatwo przekonać biologów. Obydwa eksperymenty miały ograniczenia dające sceptykom możliwość argumentowania, że białka jednak mogą być materiałem genetycznym. Na przykład wątpiono w specyficzność deoksyrybonukleazy - enzymu, którego Avery z kolegami używali do inaktywacji czynnika transformującego. Wynik ten (główna część dowodu, że czynnik transformujący to DNA) byłby nieważny, gdyby, co wydawało się możliwe, enzym ten zawierał choć śladowe ilości zanieczyszczającej proteazy i tym samym mógłby również degradować białka. Również eksperyment z bakteriofagami nie był rozstrzygający, co Hershey i Chase podkreślili, publikując swoje wyniki: "Nasze doświadczenia pokazują, że jest możliwy fizyczny podział faga T2 na część genetyczną i niegenetyczną... Na chemiczną identyfikację części genetycznej musimy jednak poczekać, dopóki nie będzie znana odpowiedź na kilka pytań". Z perspektywy czasu te dwa eksperymenty są ważne wcale nie z powodu wniosków, jakie z nich wyciągnięto, ale dlatego, że uświadomiły biologom, iż DNA może być materiałem genetycznym i dlatego warto prowadzić nad nim badania. To właśnie to zainspirowało Watsona i Cricka do pracy nad DNA. I to właśnie ich odkrycie struktury podwójnej helisy (linii śrubowej) dało, jak zobaczymy poniżej, odpowiedź na zagadkowe pytanie o sposób replikacji genów i ostatecznie przekonało świat naukowy o tym, że geny zbudowane są z DNA.
DNA jest polimerem zbudowanym z nukleotydów
Rys. 1.3. Dwa eksperymenty, które sugerowały, że geny są zbudowane z DNA. (A) Avery z kolegami wykazali, że czynnik transformujący jest zbudowany z DNA. Dwie górne części pokazują, co się dzieje, gdy myszy zostaną zainfekowane niezjadliwymi bakteriami Streptococcus pneumoniae, samymi lub z czynnikiem transformującym - ekstraktem komórkowym z wirulentnego szczepu S. pneumoniae. Gdy dodawany jest czynnik transformujący, mysz umiera, ponieważ geny w czynniku transformującym przekształcają niezjadliwe bakterie w formę wirulentną. Takie wirulentne bakterie można było następnie wyizolować z płuc martwej myszy. Dolna część pokazuje, że traktowanie czynnika transformującego proteazą lub rybonukleazą nie daje żadnych efektów, inaktywuje go jednak deoksyrybonukleaza.(B) W doświadczeniu Hersheya i Chase wykorzystano bakteriofagi T2. Zbudowane są one z cząsteczki DNA zawartej w kapsydzie białkowym, złożonym z główki i ogonka z włóknami umożliwiającymi bakteriofagowi przyłączenie się do powierzchni bakterii i wstrzyknięcie genów do komórki. DNA bakteriofagów wyznakowano 32P, a białka 35S. Kilka minut po infekcji hodowlę wytrząsano w wytrząsarce, by odłączyć puste cząsteczki fagowe od powierzchni komórki. Następnie hodowlę wirowano, w wyniku czego na dnie probówki otrzymywano osad z bakterii z genami fagowymi, a lżejsze cząstki fagowe pozostawały w supernatancie. Hershey i Chase wykazali, że osad bakteryjny zawierał 70 % składników faga wyznakowanych 32P (DNA) i tylko 20 % materiału wyznakowanego 35S (białka fagowe). W kolejnym doświadczeniu, niepokazanym tutaj, Hershey i Chase wykazali, że nowe fagi, powstałe po zakończeniu cyklu infekcyjnego, zawierały mniej niż 1 % białek fagów rodzicielskich. Więcej szczegółów na temat cyklu infekcyjnego bakteriofagów na rys. 2.27
Nazwiska Jamesa Watsona i Francisa Cricka są tak mocno związane z DNA, że zwykle nie pamięta się o tym, iż w październiku 1951 r., kiedy zaczynali współpracę, szczegółowa struktura polimeru DNA była już znana. Ich wkładem nie jest określenie struktury DNA per se, ale wykazanie, że w żywych komórkach dwa łańcuchy DNA są zwinięte, tworząc podwójną helisę. Dlatego musimy najpierw zapoznać się z tym, co Watson i Crick wiedzieli, zanim rozpoczęli swoje badania.
DNA jest liniowym, nierozgałęzionym polimerem, zbudowanym z monomerycznych podjednostek - czterech różnych chemicznie nukleotydów, które mogą być połączone w różnej kolejności, tworząc łańcuchy składające się z setek, tysięcy, a nawet milionów jednostek. Każdy z nukleotydów w polimerze DNA zawiera trzy składniki (rys. 1.4):
- 2'-deoksyrybozę, która jest pentozą, rodzajem cukru zawierającym pięć atomów węgla; atomy węgla noszą numery 1' (jeden prim), 2' itp.; nazwa "2'-deoksyryboza" oznacza, że cukier ten jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa (-OH) połączona z atomem węgla 2' została zastąpiona przez wodór (-H);
- zasadę azotową - cytozynę, tyminę (jednopierścieniowe pirymidyny) albo adeninę, guaninę (dwupierścieniowe puryny); zasada azotowa jest połączona z resztą cukrową wiązaniem ?-N-glikozydowym, łączącym atom węgla 1' reszty cukrowej z atomem azotu numer 1 pirymidyny lub atomem azotu numer 9 puryny;
- grupę fosforanową składającą się z jednej, dwóch lub trzech połączonych reszt fosforanowych związanych z atomem węgla 5' reszty cukrowej; reszty fosforanowe oznaczono symbolami ?, ? i ?; reszta ?-fosforanowa bezpośrednio łączy się z resztą cukrową.
Cząsteczka składająca się z cukru i zasady azotowej nazywana jest nukleozydem; przyłączenie reszty fosforanowej zamienia ją w nukleotyd. Komórki zawierają nukleotydy z jedną, dwiema lub trzema resztami fosforanowymi, ale jako substraty w procesie syntezy DNA wykorzystywane są tylko trifosforany nukleozydów. Pełne chemiczne nazwy czterech nukleotydów, które w reakcji polimeryzacji tworzą DNA, to:
- 2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan,
- 2'-deoksycytydyno-5'-trifosforan,
- 2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan,
- 2'-deoksytymidyno-5'-trifosforan.
Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: dATP, dCTP, dGTP i dTTP lub, gdy mówimy o sekwencji DNA, A, C, G i T.
Rys. 1.4. Struktura nukleotydu. (A) Ogólna struktura deoksyrybonukleotydu - rodzaju nukleotydu występującego w DNA. (B) Cztery zasady azotowe występujące w deoksyrybonukleotydach
W cząsteczce polinukleotydu pojedyncze nukleotydy połączone są wiązaniem fosfodiestrowym, łączącym atomy węgla 5' i 3' (rys. 1.5). Struktura tego wiązania wskazuje, że w czasie reakcji polimeryzacji następuje usunięcie z nukleotydu dwóch zewnętrznych grup fosforanowych (? i ?) i zastąpienie nim grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 3' następnego nukleotydu (rys. 1.6). Należy zwrócić uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się grupa trifosforanowa połączona z atomem węgla 5' (koniec 5' lub koniec 5'P), a na drugim - grupa hydroksylowa połączona z atomem węgla 3' (koniec 3' lub koniec 3'OH). Oznacza to, że polinukleotyd ma określoną orientację chemiczną, zapisywaną jako 5' ? 3' (w dół na rys. 1.5) lub 3' ? 5' (w górę na rys. 1.5). Ważną konsekwencją polarności (biegunowości) wiązania fosfodiestrowego jest to, że reakcja chemiczna, która wydłużałaby polimer DNA w kierunku 5' ? 3', jest różna od reakcji, w wyniku której następowałoby wydłużanie w kierunku 3' ? 5'. W organizmach żywych występują polimerazy DNA zdolne do przeprowadzania reakcji tylko w kierunku 5' ? 3', co powoduje dodatkowe znaczące komplikacje w procesie replikacji (tworzenia wiernej kopii) dwuniciowej cząsteczki DNA (sekcja 15.3).
Odkrycie podwójnej helisy
Rys. 1.5. Krótki polinukleotyd DNA z zaznaczoną strukturą wiązania fosfodiestrowego. Zwróć uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne
Przed rokiem 1950 wiele różnych dowodów wskazywało, że cząsteczki DNA w komórce zbudowane są z dwóch lub więcej polinukleotydów w jakiś sposób ze sobą połączonych. Wyjaśnienie natury tej struktury mogło pomóc zrozumieć, jak działają geny. Dlatego Watson i Crick, jak też inni badacze, starali się rozwikłać strukturę DNA. Jak pisze Watson w książce The Double Helix (1968, tłum. pol. Podwójna spirala 1974), ich praca była desperackim wyścigiem z amerykańskim biochemikiem Linusem Paulingiem, który początkowo zaproponował błędny model potrójnej helisy. Dzięki temu Watson i Crick zyskali czas potrzebny do ukończenia struktury podwójnej helisy. Trudno dzisiaj oddzielić fakty od fikcji, szczególnie jeśli chodzi o rolę, jaką odegrała Rosalind Franklin. Jej badania z zastosowaniem dyfrakcji rentgenowskiej dostarczyły olbrzymiej ilości danych doświadczalnych, potwierdzających model podwójnej helisy. Ona sama była bardzo bliska rozwikłania tej struktury. Jedno jest pewne - odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w sobotę 7 marca 1953 r. było najważniejszym wydarzeniem w biologii XX w.
Odkrycie podwójnej helisy można uważać za jeden z pierwszych multidyscyplinarnych biologicznych projektów badawczych. By wywnioskować, jaka jest struktura podwójnej helisy, Watson i Crick wykorzystali cztery rodzaje danych.
- Wykorzystanie różnego rodzaju danych biofizycznych umożliwiło wydedukowanie, jakie są podstawowe cechy tej struktury. Zawartość wody we włóknach DNA była szczególnie istotna, ponieważ umożliwiała określenie gęstości włókna. Liczba łańcuchów w helisie oraz odległość między nukleotydami musiała być zgodna z gęstością włókna. Model potrójnej helisy Paulinga był oparty na błędnych pomiarach gęstości sugerujących, że cząsteczka DNA ma strukturę upakowaną w większym stopniu niż w rzeczywistości.
- Wzory dyfrakcji promieni rentgenowskich (sekcja 11.1), w większości otrzymane przez Rosalind Franklin, sugerowały szczegóły helikalnej struktury DNA (rys. 1.7).
Rys. 1.6. Synteza polinukleotydu DNA następuje w wyniku reakcji polimeryzacji. Reakcja syntezy zachodzi w kierunku 5' ? 3'. Nowo dodawany nukleotyd jest przyłączany do węgla 3' na końcu istniejącego polinukleotydu. Reszty fosforanowe ? i ? są usuwane z dodawanego nukleotydu w formie cząsteczki pirofosforanu
Rys. 1.7. Wykonany przez Rosalind Franklin rentgenogram dyfrakcyjny nr 51, otrzymany przy użyciu włókna DNA. Kształt krzyża świadczy o tym, że DNA ma strukturę helikalną. Stopień zaczernienia wewnątrz rombowej powierzchni nad, pod i po obu stronach krzyża wskazuje, że szkielet cukrowo-fosforanowy jest położony na zewnątrz helisy (rys. 1.9). Na podstawie położenia różnych plam tworzących ramiona krzyża można obliczyć wymiary cząsteczki, takie jak średnica, przyrost długości helisy na parę zasad i skok helisy (tab. 1.1). "Brakujące plamy" (zaznaczone strzałkami przerwy w każdym z ramion krzyża) wskazują na względne ułożenie dwóch polinukleotydów. To dzięki tym brakującym plamom Watson i Crick doszli do wniosku, że na zewnętrznej powierzchni helisy znajdują się dwa rowki o różnej głębokości (rys. 1.9) (przedruk z R. Franklin, R.G. Gosling (1953). Nature 171:740-741, za zgodą Springer Nature)
- Proporcje ilościowe zasad azotowych, odkryte przez Erwina Chargaffa z Uniwersytetu Columbia w Nowym Jorku, umożliwiły wydedukowanie, w jaki sposób polinukleotydy są połączone w podwójnej helisie. Chargaff prowadził długotrwałe serie chromatograficznych badań próbek DNA z różnych źródeł. Wykazał, że chociaż organizmy różnią się zawartością poszczególnych zasad, jednak molowa ilość adeniny jest zawsze równa ilości tyminy, a ilość guaniny ilości cytozyny (rys. 1.8). Takie proporcje ilościowe zasad doprowadziły do sformułowania praw łączenia się zasad w pary, co było podstawą odkrycia struktury podwójnej helisy.
- Konstruowanie modeli (w skali) możliwych struktur DNA było jedyną znaczącą metodą wprowadzoną przez samych Watsona i Cricka. Takie modele umożliwiały sprawdzanie wzajemnego położenia różnych atomów, by upewnić się, że pary zasad tworzące wiązanie nie są za bardzo od siebie oddalone oraz że inne atomy nie są na tyle blisko, by na siebie oddziaływać.
Łączenie się zasad w pary i asocjacja warstwowa stabilizują podwójną helisę
Rys. 1.8. Doświadczenie Chargaffa pokazujące stosunek ilościowy zasad azotowych w DNA. Z różnych organizmów ekstrahowano DNA i traktowano go kwasem, by poddać hydrolizie wiązania fosfodiestrowe i uwolnić wolne nukleotydy. Ilość każdego nukleotydu oszacowano chromatograficznie. Dane pokazują wyniki uzyskane przez Chargaffa. Wyniki te wykazały, że w granicach błędu doświadczalnego ilość adeniny jest równa ilości tyminy, a ilość guaniny - ilości cytozyny
Podwójna helisa jest prawoskrętna. Oznacza to, że gdyby była spiralnymi schodami, po których wspinalibyśmy się w górę, to zewnętrzna poręcz schodów byłaby po naszej prawej stronie. Dwa łańcuchy są przeciwnie skierowane (rys. 1.9A). Helisę stabilizują dwa rodzaje oddziaływań chemicznych.
- Łączenie się zasad w pary (parowanie zasad) polega na utworzeniu wiązań wodorowych między adeniną w jednym a tyminą w drugim łańcuchu lub między cytozyną w jednym a guaniną w drugim łańcuchu (rys. 1.9B). Wiązania wodorowe są lekkimi oddziaływaniami elektrostatycznymi między atomem o ładunku ujemnym (jak tlen czy azot) a atomem wodoru związanym z innym atomem elektroujemnym. Wiązania wodorowe są dłuższe i dużo słabsze od wiązań kowalencyjnych. Typowa dla nich energia wiązania to 8-29 kJ - mol-1 w temperaturze 25° C, w porównaniu z energią do 348 kJ - mol-1 dla wiązania kowalencyjnego między dwoma atomami węgla. Wiązania wodorowe stabilizują nie tylko strukturę podwójnej helisy DNA, lecz także struktury drugorzędowe w białkach. Dwie kombinacje par zasad, A łączy się z T i G łączy się z C, tłumaczą proporcje ilościowe zasad odkryte przez Chargaffa. Są to jedyne dopuszczalne pary zasad. Ograniczenie to wynika częściowo z geometrii zasad azotowych i względnego położenia atomów, które mogą uczestniczyć w wytworzeniu wiązania wodorowego. Poza tym tylko puryna i pirymidyna mogą łączyć się ze sobą. Para puryna- -puryna byłaby zbyt duża, by zmieścić się wewnątrz helisy, a para pirymidyna-pirymidyna byłaby zbyt mała.
Rys. 1.9. Struktura podwójnej helisy DNA. (A) Dwa schematy podwójnej helisy. Po lewej - struktura helisy, w której szkielet cukrowo-fosforanowy każdego polinukleotydu przedstawiono jako szarą wstążkę, z parami zasad w kolorze zielonym. Po prawej - struktura chemiczna trzech par zasad (B) A tworzy parę z T, a G z C. Przedstawiono ogólny schemat zasad, wiązania wodorowe zaznaczono przerywaną linią. Zwróć uwagę, że para G - C łączy się za pomocą trzech wiązań wodorowych, podczas gdy para A - T za pomocą tylko dwóch wiązań wodorowych
- Asocjacja warstwowa (oddziaływania warstwowe) jest związana z siłami przyciągania między sąsiednimi parami zasad i zwiększa stabilność podwójnej helisy po połączeniu się zasad w pary. Asocjacja warstwowa nazywana jest czasami oddziaływaniami typu ?-?, ponieważ sądzi się, że uczestniczą w nich elektrony p tworzące wiązania podwójne w strukturach puryny i pirymidyny. Jednak hipoteza ta jest obecnie kwestionowana i prowadzone są badania testujące możliwy udział jakiegoś rodzaju oddziaływań elektrostatycznych w asocjacji warstwowej.
Obydwa rodzaje oddziaływań, zarówno łączenie się zasad w pary, jak i asocjacja warstwowa, są ważne w utrzymaniu razem dwóch polinukleotydów. Zjawisko łączenia się zasad w pary ma również szczególne znaczenie ze względu na jego implikacje biologiczne. Z ograniczenia, że A może łączyć się tylko z T, a G tylko z C wynika, że w procesie replikacji DNA może powstać dokładna kopia cząsteczki rodzicielskiej. W procesie tym sekwencja istniejącej nici dyktuje sekwencję nowej nici. Mechanizm ten nazwano syntezą DNA zależną od matrycy i jest on wykorzystywany przez wszystkie komórkowe polimerazy DNA (sekcja 2.1). Łączenie się zasad w pary jest prostym i eleganckim mechanizmem umożliwiającym replikację cząsteczek DNA. Dlatego bardzo szybko po opublikowaniu struktury podwójnej helisy przez Watsona i Cricka wszyscy biolodzy byli pewni, że geny są naprawdę zbudowane z DNA.
Podwójna helisa jest strukturą elastyczną
Podwójna helisa opisana przez Watsona i Cricka, pokazana na rys. 1.9A, nazywana jest formą B DNA lub B-DNA. Ma charakterystyczne wymiary:
- średnicę helisy - 2,37 nm;
- przyrost długości helisy na parę zasad - 0,34 nm;
- skok helisy (odcinek przypadający na jeden skręt helisy) - 3,4 nm, co odpowiada dziesięciu parom zasad na skręt.
Przyjęto, że DNA w komórce występuje głównie w formie B. Dzisiaj jest jednak oczywiste, że cząsteczki genomowego DNA nie mają jednorodnej struktury. Wynika to z tego, że nukleotydy w helisie charakteryzują się elastycznością, która pozwala ich cząsteczkom przybierać nieco różne kształty. Aby mogła zmienić się konformacja cząsteczki, musi się nieco zmienić względne położenie atomów w nukleotydzie. Istnieje wiele możliwości, ale do najważniejszych zmian konformacyjnych należą:
- rotacja wokół wiązania ?-N-glikozydowego, która zmienia orientację zasady w stosunku do reszty cukrowej; dwie możliwe orientacje nazywane są konformacją anti i konformacją syn (rys. 1.10A); rotacja zasady wpływa na względne położenie dwóch polinukleotydów;
Rys. 1.10. Zmiana konfiguracji przestrzennej nukleotydów wpływa na konformację podwójnej helisy. (A) Konformacja anti- i konformacja syn- -deoksyadenozyny. Te dwie konformacje różnią się orientacją zasady azotowej w stosunku do reszty cukrowej nukleozydu. Rotacja wokół wiązania ?-N-glikozydowego przekształca jedną konformację w drugą. Pozostałe trzy nukleozydy również występują w konformacji anti lub syn (B) Konformacja cukrów (ang. sugar pucker). Położenie atomów węgla w pierścieniu cukru w konfiguracji przestrzennej C2'-endo i C3'-endo
- zmiany konformacji cukrów (ang. sugar pucker) wpływają na ich trójwymiarowy kształt; pierścień rybozy, wchodzącej w skład nukleotydu, nie jest płaski - widok tej struktury z boku pokazuje, że jeden atom lub dwa atomy węgla są zlokalizowane powyżej lub poniżej płaszczyzny pierścienia cukrowego (rys. 1.10B); w konfiguracji C2'-endo atom węgla 2' położony jest powyżej tej płaszczyzny, atom węgla 3' tuż poniżej; natomiast w konformacji C3'-endo atom węgla 3' jest położony powyżej, a atom węgla 2' poniżej; ponieważ atom węgla 3' wchodzi w skład wiązania fosfodiestrowego łączącego cukier z sąsiednim nukleotydem, te dwie konfiguracje pierścienia cukru różnie wpływają na konformację szkieletu cukrowo-fosforanowego.
Zmiany konformacyjne, wynikające z rotacji wokół wiązania ?-N-glikozydowego oraz zmian w konformacji pierścienia cukrowego, mogą prowadzić do dużych zmian w ogólnej strukturze helisy. Od lat 50. XX w. wiadomo, że wymiary podwójnej helisy ulegają zmianie, gdy zmienia się względna wilgotność włókien zawierających cząsteczki DNA. Na przykład zmodyfikowana wersja podwójnej helisy, zwana A-DNA, ma średnicę 2,55 nm, przyrost długości helisy na parę zasad wynosi 0,23 nm, a skok helisy - 2,5 nm, co odpowiada 11 parom zasad na skręt (tab. 1.1). Podobnie jak forma B, forma A jest prawoskrętną helisą, w której orientacja zasady w stosunku do reszty cukrowej odpowiada konformacji anti. Podstawowa różnica między formami A i B dotyczy konformacji cukrów. Pierścienie cukrowe w B-DNA występują w konfiguracji C2'-endo, a w A-DNA w konfiguracji C3'-endo. Inne prawoskrętne wersje podwójnej helisy to: B'-, C-, C'-, C''-, D-, E- i T-DNA.
Możliwa jest również bardziej drastyczna zmiana konformacji, prowadząca do powstania lewoskrętnej formy Z-DNA, w której szkielet cukrowo-fosforanowy ma nieregularny, zygzakowaty kształt. Z-DNA jest ciaśniej zwiniętą wersją podwójnej helisy o skoku 12 par zasad na skręt i średnicy tylko 1,84 nm (tab. 1.1). Wiadomo, że podwójna helisa ma taką formę w rejonach zawierających powtórzone motywy GC, tzn. w takich, w których sekwencja obu nici to ...GCGCGCGC..., gdzie wszystkie nukleotydy guaninowe mają konformację syn i C3'-endo, a wszystkie nukleotydy cytozynowe konformację anti i C2'-endo.
Tabela 1.1. Cechy różnych form podwójnej helisy DNA
Cecha
A-DNA
B-DNA
Z-DNA
Typ helisy
prawoskrętna
prawoskrętna
lewoskrętna
Średnica helisy (nm)
2,55
2,37
1,84
Odległość między sąsiednimi parami zasad (nm)
0,23
0,34
0,38
Przyrost długości na skręt helisy (skok) (nm)
2,5
3,4
4,6
Liczba zasad na skręt
11
10
12
Orientacja zasady azotowej
anti
anti
mieszana
Konformacja cukru
C3?-endo
C2?-endo
mieszana
Same dane dotyczące wymiarów różnych form podwójnej helisy nie odzwierciedlają najbardziej znaczącej różnicy między nimi. Istotna nie jest średnica czy skok helisy, ale to, w jakim stopniu wewnętrzne obszary helisy są dostępne z jej powierzchni. Rysunek 1.9A pokazuje, że powierzchnia formy B DNA nie jest całkowicie gładka, ale że spiralnie biegną wzdłuż niej dwa rowki. Jeden z nich, stosunkowo szeroki i głęboki, nazywany jest większym rowkiem. Drugi, węższy i płytszy, to mniejszy rowek. DNA-A również ma dwa rowki, jednak w tej konformacji większy rowek jest głębszy, a mniejszy rowek płytszy niż w DNA-B (rys. 1.11). Forma Z-DNA jest zdecydowanie inna - większy rowek praktycznie nie istnieje, a mniejszy jest bardzo wąski i głęboki. W każdej z form DNA część powierzchni wewnętrznej przynajmniej jednego rowka jest utworzona przez grupy chemiczne zasad azotowych. Z rozdziału 11 dowiemy się, że ekspresja informacji genetycznej zawartej w genomie zachodzi za pośrednictwem białek wiążących DNA, które wiążą się do podwójnej helisy i regulują aktywność znajdujących się w niej genów. By spełniać swoją funkcję, każde białko wiążące DNA musi specyficznie wiązać się do sekwencji położonej obok genu, którego aktywność reguluje. Jest to możliwe, gdyż białko wiążące DNA oddziałuje z dnem rowka i może z mniejszą lub większą dokładnością "czytać" sekwencję nukleotydową bez otwierania helisy, a więc bez rozrywania wiązań łączących pary zasad. Wynika stąd, że białka wiążące DNA, które mają strukturę umożliwiającą im rozpoznanie specyficznej sekwencji nukleotydów, na przykład w formie B DNA, mogą nie być zdolne do rozpoznania tej samej sekwencji w cząsteczce DNA o innej konformacji. Jak dowiemy się z sekcji 11.3, zmiany konformacyjne wzdłuż cząsteczki DNA oraz polimorfizm strukturalny wynikający z sekwencji nukleotydów mogą determinować specyficzność oddziaływań między genomem a białkami wiążącymi DNA.
1.2. RNA i transkryptom
Rys. 1.11. Modele form A, B i Z podwójnej helisy. Większy i mniejszy rowek na powierzchni cząsteczek oznaczono odpowiednio literami M i m (dzięki uprzejmości R.S. Wheelera, na licencji GFDL 1.2)
Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom (rys. 1.2) - zbiór cząsteczek RNA pochodzących od genów aktywnych w komórce w danym momencie. Cząsteczki RNA tworzące transkryptom są syntetyzowane w procesie transkrypcji (przepisywania z DNA na RNA). W tej sekcji poznamy strukturę RNA i przyjrzymy się dokładniej różnym rodzajom cząsteczek RNA występującym w komórce.
RNA jest drugim rodzajem polinukleotydu
Rys. 1.12. Różnice struktury chemicznej DNA i RNA. (A) RNA jest zbudowany z rybonukleotydów, w skład których wchodzi cukier ryboza, a nie 2'-deoksyryboza. W cząsteczce rybozy do węgla 2' przyłączona jest grupa hydroksylowa, a nie atom wodoru. (B) RNA zamiast tyminy zawiera pirymidynę o nazwie uracyl
RNA jest polinukleotydem podobnym do DNA, ale różnią go dwie istotne cechy chemiczne (rys. 1.12). Po pierwsze cukrem wchodzącym w skład RNA jest ryboza, po drugie RNA zawiera uracyl zamiast tyminy. Dlatego cztery nukleotydy, substraty w syntezie RNA, to:
- adenozyno-5'-trifosforan,
- cytydyno-5'-trifosforan,
- guanozyno-5'-trifosforan,
- urydyno-5'-trifosforan.
Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: ATP, CTP, GTP i UTP lub A, C, G i U.
W polinukleotydzie RNA, podobnie jak w DNA, występują wiązania 3'-5' fosfodiestrowe. Są one jednak mniej stabilne niż w DNA, co wynika pośrednio z obecności grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 2' reszty cukrowej. Cząsteczki RNA rzadko mają długość większą niż kilka tysięcy nukleotydów. Chociaż występują w nich liczne rodzaje wiązań wewnątrzcząsteczkowych, powstałych dzięki łączeniu się zasad w pary (na przykład rys. 5.6A), jednak w większości cząsteczki RNA są jedno-, a nie dwuniciowe.
Enzymy odpowiedzialne za transkrypcję DNA na RNA nazwano polimerazami RNA zależnymi od DNA. Jak wynika z nazwy, przeprowadza on reakcję enzymatyczną polimeryzacji RNA z rybonukleotydów, która jest zależna od DNA. Oznacza to, że sekwencja nukleotydów w cząsteczce DNA - matrycy dyktuje sekwencję nukleotydów w syntetyzowanej cząsteczce RNA (rys. 1.13). Nazwę enzymu można skrócić do polimeraza RNA. Należy jednak pamiętać, by z kontekstu wynikało, że chodzi o ten właśnie enzym, i nie mylić go z polimerazą RNA zależną od RNA, enzymem biorącym udział w replikacji i ekspresji genomów niektórych wirusów. Od strony chemicznej zależna od matrycy synteza RNA odpowiada syntezie DNA (rys. 1.6). Rybonukleotydy są dodawane jeden po drugim do wydłużającego się końca 3' transkryptu RNA. Rodzaj włączanego nukleotydu określają reguły łączenia się zasad w pary: A tworzy parę z T lub U, G tworzy parę z C. Podczas dodawania każdego kolejnego nukleotydu usuwane są z niego grupy fosforanowe ? i ?, a z nukleotydu znajdującego się na końcu łańcucha polinukleotydowego usuwana jest grupa hydroksylowa przy węglu 3' reszty cukrowej - dokładnie tak samo jak podczas polimeryzacji DNA.
Rodzaje RNA w komórce
Rys. 1.13. Synteza RNA zależna od matrycy. Synteza transkryptu RNA zachodzi w kierunku 5' ? 3'. Matryca DNA jest odczytywana w kierunku 3' ? 5', a jej sekwencja determinuje sekwencję transkryptu dzięki łączeniu się komplementarnych zasad w pary
Typowa bakteria zawiera 0,05-0,10 pg RNA, co stanowi ok. 6 % jej całkowitej masy. Dużo większa komórka ssaków zawiera również więcej RNA (20-30 pg), jednak stanowi to tylko 1 % jej masy.
Najlepszym sposobem poznania rodzajów RNA w komórce jest podzielenie ich na kategorie i podkategorie w zależności od pełnionych przez nie funkcji. Istnieje wiele możliwości takiego podziału, jednak schemat pokazany na rys. 1.14 wydaje się najbardziej poglądowy. RNA dzielimy przede wszystkim na RNA kodujący i RNA niekodujący. RNA kodujący obejmuje tylko jedną klasę cząsteczek - RNA informacyjne (mRNA, ang. messenger RNA), które są transkryptami genów kodujących białka, a więc ulegają translacji na białka w drugim etapie ekspresji genomu. Cząsteczki mRNA rzadko stanowią więcej niż 4 % całkowitego RNA w komórce, charakteryzują się krótkim okresem półtrwania i są szybko degradowane wkrótce po syntezie. Okres półtrwania bakteryjnych mRNA wynosi nie więcej niż kilka minut, a u eukariontów większość mRNA jest degradowana w ciągu kilku godzin po syntezie. Tak szybki proces degradacji oznacza, że skład transkryptomu nie jest stały i może się szybko zmieniać dzięki zmianie tempa syntezy poszczególnych mRNA.
Drugi rodzaj RNA nazwano niekodującym, ponieważ nie ulega translacji na białka. Alternatywna nazwa to RNA funkcjonalny, co odzwierciedla fakt, że RNA niekodujacy spełnia istotną rolę w komórce. Istnieje wiele rodzajów funkcjonalnego RNA, najważniejsze z nich to:
Rys. 1.14. RNA występujące w komórce. Schemat pokazuje rodzaje RNA (łącznie z prekursorowymi RNA opisanymi poniżej) obecne we wszystkich organizmach oraz te, które występują tylko w komórkach eukariotycznych
- RNA rybosomowe (rRNA) - obecne we wszystkich organizmach i przeważnie stanowiące najliczniejszą klasę RNA w komórce; w aktywnie dzielących się bakteriach stanowią one ponad 80 % całkowitego RNA; cząsteczki te są składnikiem rybosomów, struktur, na których zachodzi synteza białek (sekcja 13.3);
- RNA transportujące (tRNA) (ang. transfer RNA) - małe cząsteczki, które również biorą udział w syntezie białek i podobnie jak rRNA występują we wszystkich organizmach; funkcją tRNA jest dostarczenie aminokwasów do rybosomu i zapewnienie, że aminokwasy są łączone w kolejności zapisanej w sekwencji nukleotydowej mRNA ulegającego translacji (sekcja 13.3).
rRNA i tRNA to dwie najważniejsze kategorie niekodujących RNA, jednak znanych jest wiele innych rodzajów cząsteczek RNA pełniących wyspecjalizowane funkcje w komórkach eukariotycznych lub bakteryjnych. U eukariontów takie RNA są zwykle klasyfikowane do dwóch grup: krótkie niekodujące RNA (sncRNA) (ang. short noncoding RNA), nie dłuższe niż 200 nukleotydów, i długie niekodujące RNA (lncRNA) (ang. long noncoding RNA), dłuższe niż 200 nukleotydów. Różne funkcje tych niekodujących RNA zostaną omówione w rozdziale 12.
Wiele RNA jest syntetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe
Oprócz opisanych powyżej dojrzałych cząsteczek RNA komórki zawierają również cząsteczki prekursorowe. Wiele RNA, szczególnie u eukariontów, jest wyjściowo syntetyzowanych jako prekursorowe transkrypty pierwotne, czyli pre-RNA, które muszą ulec procesowi dojrzewania, zanim będą mogły pełnić swoje funkcje.
Najważniejszym etapem procesu dojrzewania jest składanie RNA (ang. splicing), polegające na usuwaniu fragmentów z prekursorowego RNA. Niektóre geny eukariotyczne są nieciągłe i zawierają wewnętrzne segmenty, które są kopiowane w czasie transkrypcji, a następnie wycinane z pre-RNA (rys. 1.15). Te wycinane segmenty to introny, natomiast eksony to segmenty, które są ze sobą składane, by stworzyć dojrzały RNA. Introny występują w niektórych genach kodujących rRNA i tRNA, ale najczęściej w genach kodujących białka. Dlatego składanie pre-mRNA jest bardzo istotną częścią procesu prowadzącego do syntezy części transkryptomu kodującej białka (sekcja 12.4). Składanie RNA zachodzi w jądrze, w którym nieposkładane cząsteczki pre-mRNA tworzą frakcję jądrowego RNA zwaną heterogennym jądrowym RNA (hnRNA, ang. heterogenous nuclear RNA).
Składanie nie jest jedynym rodzajem cięcia występującym w trakcie procesu dojrzewania pre-RNA. Wiele cząsteczek rRNA i tRNA jest początkowo synetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe, które zawierają kopię więcej niż jednej cząsteczki. Dlatego pre-rRNA i pre-tRNA muszą być w procesie dojrzewania cięte na kawałki, co prowadzi do powstania dojrzałych RNA (rys. 1.16). Ten typ dojrzewania występuje zarówno u prokariontów, jak i eukariontów.
Rys. 1.15. Składanie eukariotycznego mRNA. Z pre-mRNA są wycinane introny, a eksony są ponownie łączone ze sobą i tworzą funkcjonalny mRNA. Eksony w obrębie genu zaznaczono na zielono, a w obrębie pre-mRNA i mRNA - na niebiesko
Inne etapy procesu dojrzewania prowadzą do zmian na końcach cząsteczki RNA. Takie modyfikacje końców zachodzą w czasie syntezy eukariotycznych mRNA, z których większość na końcu 5' ma dołączoną strukturę zwaną czapeczką, a na końcu 3' - ogon poli(A). Czapeczka to zmodyfikowany nukleotyd o nazwie 7-metyloguanozyna, który jest przyłączany do pierwszego nukleotydu pre-mRNA poprzez nietypowe wiązanie trifosforanowe (rys. 1.17A). Pierwszy i drugi nukleotyd pre-mRNA może być również modyfikowany przez dodanie grupy metylowej. Czapeczka jest potrzebna w procesie inicjacji translacji mRNA, w wyniku której syntetyzowane jest białko. Ogon poli(A) składa się z łańcucha nukleotydów adeninowych, o długości do 250 nukleotydów, obecnych na końcu 3' cząsteczki mRNA. mRNA jest cięty blisko końca 3', a następnie do tego nowo powstałego końca 3' dodawane są adeniny przez polimerazę RNA niezależną od matrycy, zwaną polimerazą poli(A) (rys. 1.17B). Nie w pełni rozumiemy rolę procesu poliadenylacji, jednak wiadomo, że mRNA jest degradowany, jeśli brakuje ogona poli(A) lub jest on krótszy niż zwykle.
Rys. 1.16. Dojrzewanie bakteryjnych pre-rRNA. Bakteryjne pre-rRNA zawierają po jednej kopii każdego z trzech rodzajów rRNA, które po połączeniu z białkami rybosomowymi tworzą rybosom bakteryjny. Następujące po sobie reakcje cięcia i przycinania uwalniają dojrzałe rRNA z cząsteczki prekursorowej
dodatkowa modyfikacja w czapeczce typu 2
Rys. 1.17. Modyfikacja końców 5' i 3' eukariotycznych mRNA. (A) Struktura czapeczki na końcu 5' mRNA. Czapeczkę typu 0 tworzy zmodyfikowany nukleotyd 7-metyloguanozyna połączony wiązaniem trifosforanowym 5'-5' z pierwszym nukleotydem pre-mRNA. Przyłączenie dodatkowych grup metylowych w zaznaczonych pozycjach prowadzi do powstania czapeczki typu 1 i czapeczki typu 2. (B) Poliadenylacja końca 3' mRNA. Sekwencja ogona poli(A) nie jest zakodowana w DNA, a więc nie jest syntetyzowana przez polimerazę RNA w procesie transkrypcji genu. Ogon poli(A) jest dodawany po transkrypcji przez polimerazę poli(A)
Końcowym etapem w procesie dojrzewania RNA są modyfikacje chemiczne. Niektóre zasady azotowe w rRNA i tRNA wszystkich organizmów są modyfikowane poprzez metylację, deaminację (usunięcie grupy -NH2) i/lub podstawienie siarki (wymiana atomu tlenu na atom siarki). Niektóre zasady podlegają również wewnętrznym rearanżacjom, które prowadzą do zmiany położenia poszczególnych grup i/lub przekształcenia wiązań podwójnych w pojedyncze (rys. 1.18). Nie wiadomo, jaki jest cel wielu takich modyfikacji, choć opisano ich funkcję w pewnych specyficznych przypadkach. W tRNA niektóre ze zmodyfikowanych nukleotydów są rozpoznawane przez enzymy przyłączające aminokwas do końca 3' cząsteczki, co ma kluczowe znaczenie dla funkcji tRNA w syntezie białek. Właściwy aminokwas musi być przyłączony do odpowiedniej cząsteczki tRNA i uważa się, że modyfikacje tRNA umożliwiają zachodzenie tego procesu z odpowiednią specyficznością. Również eukariotyczne mRNA podlegają modyfikacjom chemicznym. Niektóre z tych modyfikacji zmieniają właściwości łączenia się w pary zasad nukleotydów i w ten sposób zmieniają sekwencję mRNA, a także mogą zmienić sekwencję aminokwasów kodowanego białka (rys. 1.19A). Ten typ modyfikacji chemicznej nazywany jest redagowaniem RNA. Inne modyfikacje nie zmieniają sekwencji mRNA, np. N7-metyloguanina w dalszym ciągu łączy się w parę z C (rys. 1.19B). Chociaż takie modyfikacje nie zmieniają sekwencji kodowanego białka, mogą jednak wpływać na proces translacji mRNA (sekcja 12.5).
Różne definicje transkryptomu
Rys. 1.18. Przykłady chemicznie zmodyfikowanych zasad występujących w rRNA i tRNA. Na pomarańczowo zaznaczono różnice między zasadą standardową i pochodzącą od niej zasadą zmodyfikowaną
Rys. 1.19. Modyfikacje chemiczne eukariotycznych mRNA. (A) Redagowanie RNA prowadzi do zmian w sekwencji nukleotydowej mRNA. (B) Modyfikacje, takie jak przekształcenie guaniny w N7-metyloguaninę, nie wpływają na łączenie się zasad w pary, a więc nie zmieniają sekwencji nukleotydowej
Chociaż większość biologów definiuje obecnie transkryptom jako cały RNA komórki, jednak ten wprowadzony w 1997 r. termin początkowo odnosił się tylko do mRNA. mRNA stanowi mniej niż 4 % całego komórkowego RNA, ale często jest uważany za jego najistotniejszy składnik, ponieważ zawiera kodujące RNA wykorzystywane w kolejnym etapie ekspresji genomu. Nawet u najprostszych organizmów, takich jak bakterie i drożdże, wiele genów kodujących białka jest aktywnych tylko w pewnym okresie. Dlatego mRNA komórki nie jest jednorodny i zawiera kopie setek, jeśli nie tysięcy różnych genów. Cały mRNA komórki określa zestaw białek wytwarzanych przez komórkę, determinując jej biochemiczne właściwości. Celem wielu wcześniejszych badań transkryptomu było zidentyfikowanie wszystkich lub jak największej liczby komórkowych mRNA, aby zrozumieć ogólny wzór ekspresji genów oraz to, jak ten wzór się zmienia, na przykład wtedy, gdy komórka rakowacieje. Ten rodzaj badań jest ważny również dzisiaj, ale ponieważ skupia się na mRNA, ciągle istnieje tendencja, by mówiąc o transkryptomie, odnosić się tylko do mRNA komórki.
Szersza definicja pojęcia "transkryptom" obejmuje wszystkie rodzaje RNA w komórce i odzwierciedla nasze rosnące zrozumienie tego, jak ważne funkcje w określeniu biochemicznych własności komórki odgrywają niekodujące RNA. W szczególności sncRNA zwane mikroRNA (miRNA) regulują ekspresję genów w komórkach eukariotycznych, biorąc udział w procesie degradacji tych cząsteczek mRNA, których produkty nie są już potrzebne (sekcja 12.6). Komórki ludzkie mogą syntetyzować ok. 1000 rodzajów miRNA, specyficznych dla pojedynczych mRNA lub małych grup mRNA. Zrozumienie tego, jaki rodzaj miRNA jest syntetyzowany w poszczególnych komórkach, oraz tego, jak wzór syntezy miRNA zmienia się w czasie choroby, jest niezbędnym uzupełnieniem równorzędnych badań nad mRNA. Dlatego ma sens objęcie definicją "transkryptom" wszystkich RNA w komórce, ponieważ skupienie się tylko na mRNA prowadzi do pominięcia istotnej roli pozostałych części transkryptomu w regulacji ekspresji informacji biologicznej zakodowanej w genomie.
1.3. Białka i proteom
Kolejnym produktem ekspresji genomu jest proteom (rys. 1.2), zestaw białek komórki określający, jakie reakcje biochemiczne dana komórka może przeprowadzać. Białka te są syntetyzowane w procesie translacji cząsteczek RNA wchodzących w skład transkryptomu.
Cztery hierarchiczne poziomy struktury białka
Rys. 1.20. Ogólna struktura aminokwasu. Ogólna struktura wszystkich aminokwasów jest taka sama. Zbudowane są one z atomu węgla ? połączonego z atomem wodoru, grupą karboksylową, grupą aminową i grupą R. Aminokwasy różnią się między sobą grupami R (rys. 1.24)
Białka, podobnie jak DNA, są liniowymi, nierozgałęzionymi polimerami. Monomeryczna podjednostka w białkach nazywana jest aminokwasem (rys. 1.20), a polimer - polipeptydem. Jego długość rzadko przekracza 2000 jednostek.
Tradycyjnie uważa się, że białka mają cztery różne poziomy struktury, które są hierarchiczne. Białko budowane jest stopniowo i każdy poziom struktury zależy od poziomu poprzedzającego.
- Struktura pierwszorzędowa białka powstaje przez połączenie aminokwasów w polipeptyd przez wiązania peptydowe. Polipeptydy są syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji między grupą karboksylową jednego aminokwasu a grupą aminową drugiego aminokwasu (rys. 1.21). Zwróćmy uwagę na to, że podobnie jak w przypadku polinukleotydów dwa końce polipeptydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się wolna grupa aminowa i dlatego nazywa się go końcem aminowym, końcem NH2 lub końcem N. Na drugim - wolna grupa karboksylowa i nazywa się go końcem karboksylowym, końcem COOH lub końcem C. Kierunek polipeptydu można więc zapisać albo jako N ? C (od lewej do prawej na rys. 1.21) albo jako C ? N (od prawej do lewej na rys. 1.21).
- Struktura drugorzędowa to różne konformacje, jakie może przybierać polipeptyd. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych to helisa ? i harmonijka ? (? kartka) (rys. 1.22). Obydwie te struktury są stabilizowane głównie przez wiązania wodorowe, które powstają między różnymi aminokwasami w polipeptydzie. Większość polipeptydów ma wystarczającą długość, by sfałdować się w serie struktur drugorzędowych, jedna po drugiej, wzdłuż cząsteczki.
Rys. 1.21. Aminokwasy w polipeptydach połączone są wiązaniami peptydowymi. Na rysunku pokazano reakcję chemiczną, w wyniku której dwa aminokwasy zostają połączone wiązaniem peptydowym. Jest to reakcja kondensacji, ponieważ w jej wyniku uwolniona zostaje cząsteczka wody
Rys. 1.22. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych występujących w białkach: (A) helisa ?, (B) harmonijka ? (? kartka). Łańcuch polipeptydowy pokazano schematycznie. Dla jasności pominięto grupy R. Obydwie struktury są stabilizowane przez wiązania wodorowe między grupami C = O i N-H wchodzącymi w skład różnych wiązań peptydowych. Pokazana na rysunku harmonijka ? jest przeciwbieżna - dwa łańcuchy są skierowane przeciwnie. Istnieją również harmonijki ?, w których łańcuchy są skierowane zgodnie
- Struktura trzeciorzędowa jest wynikiem zwijania struktur drugorzędowych polipeptydu w trójwymiarową konfigurację (rys. 1.23). Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana przez różne rodzaje oddziaływań. Są to głównie wiązania wodorowe między poszczególnymi aminokwasami, oddziaływania elektrostatyczne między naładowanymi grupami R aminokwasów (rys. 1.24) oraz efekty hydrofobowe decydujące o tym, że aminokwasy mające niepolarne łańcuchy boczne (tzn. charakteryzujące się "awersją do wody") muszą być schowane przed wodą i wchodzą w skład wewnętrznych części białka. Możliwe jest również powstawanie kowalencyjnych wiązań disulfidowych, zwanych też mostkami dwusiarczkowymi, które powstają między cysteinami znajdującymi się w różnych miejscach polipeptydu.
- Struktura czwartorzędowa powstaje przez połączenie dwóch lub więcej polipeptydów w białko składające się z kilku podjednostek, z których każda sfałdowana jest w strukturę trzeciorzędową. Nie wszystkie białka tworzą struktury czwartego rzędu. Jest to cecha wielu białek pełniących skomplikowane funkcje, w tym białek biorących udział w ekspresji genomu. Niektóre struktury czwartorzędowe utrzymują się dzięki wiązaniom disulfidowym między różnymi polipeptydami. Dzięki temu powstają zbudowane z wielu podjednostek stabilne białka, które niełatwo rozdzielić na części składowe. Inne struktury czwartorzędowe są luźniejszym połączeniem podjednostek stabilizowanym przez wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Oznacza to, że białka te mogą rozpadać się na składowe polipeptydy lub wymieniać swoje podjednostki zależnie od funkcjonalnych wymagań komórki.
Różnorodność białek wynika z różnorodności aminokwasów
Rys. 1.23. Trzeciorzędowa struktura białka. Hipotetyczna struktura białka składającego się z trzech helis ? (spirale) i czteroniciowej harmonijki ? (strzałki)
Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy są chemicznie różne. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstawania różnych kombinacji reaktywności chemicznych, od których zależy nie tylko ogólna struktura powstającego białka, lecz także umiejscowienie grup aktywnych na jego powierzchni, co determinuje właściwości chemiczne białka.
Rys. 1.24. Struktura grup R aminokwasów. Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rysunku to te, które są tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. W przypadku proliny pokazano strukturę całego aminokwasu, nie tylko grupy R, ponieważ ma ona nietypową budowę. Grupa R proliny jest połączona wiązaniem nie tylko z węglem ?, lecz także ze związaną z nim grupą aminową
Tabela 1.2. Skróty nazw aminokwasów
Aminokwas
Skrót
Skrót trzyliterowy
Skrót jednoliterowy
Alanina
Ala
A
Arginina
Arg
R
Asparagina
Asn
N
Kwas asparaginowy
Asp
D
Cysteina
Cys
C
Kwas glutaminowy
Glu
E
Glutamina
Gln
Q
Glicyna
Gly
G
Histydyna
His
H
Izoleucyna
Ile
I
Leucyna
Leu
L
Lizyna
Lys
K
Metionina
Met
M
Fenyloalanina
Phe
F
Prolina
Pro
P
Seryna
Ser
S
Treonina
Thr
T
Tryptofan
Trp
W
Tyrozyna
Tyr
Y
Walina
Val
V
Przyczyną różnorodności aminokwasów są grupy R, które bardzo różnią się strukturą i są inne w każdym aminokwasie. Białka zbudowane są z 20 aminokwasów (rys. 1.24, tab. 1.2). Niektóre mają małe grupy R, o stosunkowo prostej budowie, jak atom wodoru w glicynie lub grupa metylowa w alaninie. Inne aminokwasy, jak fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna, mają duże aromatyczne łańcuchy boczne o złożonej strukturze. Większość grup R jest nienaładowana w pH 7,4 - "fizjologicznym pH" większości komórek i tkanek. Dwa aminokwasy są naładowane ujemnie (kwas asparaginowy i glutaminowy), a trzy dodatnio (arginina, histydyna i lizyna). Część aminokwasów ma polarne łańcuchy boczne (np. seryna i treonina), w innych są one niepolarne (np. alanina, leucyna i walina).
Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rys. 1.24 to te tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. Są to więc aminokwasy łączone ze sobą w czasie translacji cząsteczek mRNA na białka. Jednak chemiczna różnorodność białek nie ogranicza się tylko do tych 20 aminokwasów. Dwa czynniki powodują zwiększenie różnorodności białek:
Rys. 1.25. Struktura selenocysteiny i pirolizyny. Na czerwono zaznaczono różnice między selenocycteiną a cysteiną oraz między lizyną a pirolizyną
- w czasie syntezy białka do łańcucha polipeptydowego mogą być włączane przynajmniej dwa dodatkowe aminokwasy nietypowe - selenocysteina i pirolizyna (rys. 1.25); ich włączenie zależy od zmodyfikowanego sposobu odczytu kodu genetycznego;
- niektóre białka są modyfikowane w procesie ich obróbki potranslacyjnej przez dodanie nowych grup chemicznych, np. hydroksylację, acetylację albo fosforylację, lub przez przyłączenie dużych łańcuchów bocznych składających się z reszt cukrowych (sekcja 13.4).
Dlatego białka charakteryzują się ogromną chemiczną zmiennością, z której część jest określana przez genom, a reszta jest wynikiem procesu obróbki potranslacyjnej.
Powiązanie transkryptomu z proteomem
Proteom składa się z białek obecnych w danym momencie w komórce. Uważa się, że typowa komórka ssaków, np. hepatocyt wątroby, zawiera 10 000-20 000 różnych rodzajów białek - ok. 8 × 109 pojedynczych cząsteczek. Łącznie to ok. 0,5 ng białka, co stanowi 18-20 % całkowitej masy komórki. Liczba cząsteczek poszczególnych białek jest bardzo zmienna - od 20 000 cząsteczek na komórkę dla najmniej licznych, do ponad 100 milionów dla najliczniejszych. Każde białko występujące w komórce w liczbie większej niż 50 000 cząsteczek na komórkę jest uważane za stosunkowo liczne. W typowej komórce ssaków ok. 2000 białek należy do tej kategorii. Gdy porównuje się proteomy różnych komórek ssaków, obserwuje się tylko niewielkie różnice dotyczące klasy białek licznych. Sugeruje to, że większość z nich należy do białek metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping proteins), biorących udział w podstawowych reakcjach biochemicznych w komórce. Białka związane z wyspecjalizowanymi funkcjami komórki są przeważnie stosunkowo nieliczne, chociaż istnieją wyjątki, np. ogromne ilości hemoglobiny w komórkach czerwonych krwinek.
Proteom jest syntetyzowany w procesie translacji mRNA, który jest częścią składową transkryptomu. Na początku lat 50. XX w., wkrótce po odkryciu struktury podwójnej helisy DNA, wielu biologów molekularnych starało się wymyślić, w jaki sposób aminokwasy mogłyby przyłączać się do mRNA w uporządkowany sposób. Jednak we wszystkich proponowanych modelach przynajmniej kilka wiązań musiałoby być krótszych lub dłuższych niż dopuszczalna odległość zgodna z prawami chemii fizycznej i dlatego wszystkie te modele odrzucono. Niepewność tę ostatecznie rozwiał w 1957 r. Francis Crick, przewidując istnienie cząsteczki adaptorowej, która mogłaby łączyć mRNA z syntetyzowanym polipeptydem. Wkrótce potem uświadomiono sobie, że cząsteczkami adaptorowymi są tRNA. Po uznaniu tego faktu zwrócono uwagę na rybosomy - struktury, na których syntetyzowane są białka. Stopniowo zrozumiano szczegóły procesu translacji mRNA na białka (sekcja 13.3).
Rys. 1.26. Kod genetyczny. Kodony w mRNA są odczytywane w kierunku 5'? 3'. Objaśnienie trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów - tab. 1.2
Innym aspektem procesu syntezy białek, który interesował biologów molekularnych w latach 50. XX w., był problem informacyjny odnoszący się do drugiego istotnego powiązania transkryptomu z proteomem: kod genetyczny powinien określać, w jaki sposób sekwencja mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku. W latach 50. XX w. zorientowano się, że kod genetyczny, aby mógł kodować informację o wszystkich 20 aminokwasach wchodzących w skład białek, musi być kodem trójkowym. Oznacza to, że jeden znak kodu, czyli kodon, musi składać się z trzech nukleotydów. Kod dwuliterowy miałby tylko 42 = 16 kodonów, co nie wystarcza do zakodowania wszystkich 20 aminokwasów, podczas gdy kod trzyliterowy może mieć 43 = 64 kodony. Kod genetyczny rozszyfrowano w latach 60. XX w. na podstawie analizy polipeptydów powstałych po translacji syntetycznych mRNA o znanej lub przewidywalnej sekwencji w bezkomórkowych systemach translacji. Zastosowano również testy wykorzystujące oczyszczone rybosomy i pozwalające określić, jakie aminokwasy wiążą się z rybosomem w obecności mRNA o znanej sekwencji. Po ukończeniu tych doświadczeń okazało się, że 64 kodony można podzielić na grupy. Kodony wchodzące w skład jednej grupy kodują ten sam aminokwas (rys. 1.26). Tylko tryptofan i metionina kodowane są przez jeden kodon, wszystkie pozostałe aminokwasy przez dwa, trzy, cztery lub sześć kodonów. Dlatego mówimy, że kod genetyczny jest zdegenerowany. Kod ma także cztery kodony przestankowe, które określają w mRNA miejsce rozpoczęcia i zakończenia translacji sekwencji nukleotydowej (rys. 1.27). Kodonem inicjacyjnym jest zwykle trójka 5'-AUG-3', kodująca również metioninę, co powoduje, że większość nowo zsyntetyzowanych polipeptydów rozpoczyna się od metioniny. Jako inicjacyjne, szczególnie u bakterii, mogą być również wykorzystywane inne kodony, takie jak 5'-GUG-3' i 5'-UUG-3'. Trzy kodony terminacyjne to 5'-UAG-3', 5'-UAA-3' i 5'-UGA-3'.
Rys. 1.27. Położenie kodonów przestankowych w mRNA
Kod genetyczny nie jest uniwersalny
Tabela 1.3. Przykłady odstępstw od standardowego kodu genetycznego
Organizm
Kodon
Standardowo koduje
W tym przypadku koduje
(A) Genomy mitochondrialne
Ssaki
UGA
stop
Trp
AGA, AGG
Arg
stop
AUA
Ile
Met
Drosophila
UGA
stop
Trp
AGA
Arg
Ser
AUA
Ile
Met
Saccharomyces cerevisiae
UGA
stop
Trp
CUN
Leu
Thr
AUA
Ile
Met
Grzyby
UGA
stop
Trp
Kukurydza
CGG
Arg
Trp
(B) Genomy jądrowe i prokariotyczne
Niektóre pierwotniaki
UAA, UAG
stop
Gln
Candida cylindracea
CUG
Leu
Ser
Euplotes sp.
UGA
stop
Cys
Mycoplasma sp.
UGA
stop
Trp
(C) Zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu
Różne organizmy
UGA
stop
selenocysteinę
Archeony
UAG
stop
pirolizynę
Skróty: N - dowolny nukleotyd
Początkowo sądzono, że kod genetyczny musi być taki sam we wszystkich organizmach. Uważano, że po powstaniu kodu jakakolwiek jego zmiana byłaby niemożliwa, gdyż wprowadzałaby nowe znaczenie poszczególnych kodonów. Prowadziłoby to do dużych zmian w sekwencji aminokwasowej białek. Rozumowanie to wydaje się trafne, ale, co dziwne, w rzeczywistości kod genetyczny nie jest uniwersalny. Kod przedstawiony na rys. 1.26 jest wykorzystywany w ogromnej większości genów prawie we wszystkich organizmach, choć odstępstwa od tej zasady są często spotykane. W szczególności genomy mitochondrialne często wykorzystują kod niestandardowy (tab. 1.3A). Po raz pierwszy odkryła to w 1979 r. grupa Frederika Sangera z Cambridge w Wielkiej Brytanii. Badacze ci stwierdzili, że wiele ludzkich genów mitochondrialnych zawiera kodony 5'-UGA-3', które zazwyczaj pełnią funkcję kodonów terminacyjnych. Kodony te występowały w pozycjach środkowych, w których nie spodziewano się zatrzymywania translacji. Analiza sekwencji białek kodowanych przez te geny wykazała, że kodon 5'-UGA-3' jest w ludzkich mitochondriach kodonem tryptofanowym oraz że w tym szczególnym systemie genetycznym jest to tylko jedno z czterech odstępstw od kodu standardowego. Również w innych organizmach geny mitochondrialne wykazują odstępstwa od standardowego kodu genetycznego. Jednak przynajmniej w jednym z tych przypadków, a mianowicie zastosowania kodonu 5'-CGG-3' jako kodonu tryptofanowego w mitochondriach roślin, prawdopodobnie jest to korygowane w procesie redagowania RNA przed rozpoczęciem translacji.
Rys. 1.28. Zmiana znaczenia kodonu 5'-UGA-3' zależna od kontekstu. Kodon 5'-UGA-3' kodujący selenocysteinę jest odróżniany dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka-pętelka. U Prokaryota (pokazane na rysunku) struktura ta położona jest tuż poniżej kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3'UTR
Niestandardowy kod jest również wykorzystywany w genomach jądrowych niższych Eukaryota. Często modyfikacja ogranicza się do niewielkiej grupy organizmów i przeważnie polega na zmianie znaczenia kodonów terminacyjnych (tab. 1.3B). Wśród Prokaryota modyfikacje są rzadsze, znany jest jeden przypadek u Mycoplasma. Ważniejszą zmianą kodu jest zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu, z którą mamy do czynienia, gdy syntetyzowane białko zawiera selenocysteinę lub pirolizynę. Białka zawierające pirolizynę występują rzadko, prawdopodobnie tylko w grupie archeonów (rozdz. 8). Jednak białka zawierające selenocysteinę są dość rozpowszechnione u wielu organizmów. Należy do nich np. peroksydaza glutationowa, chroniąca komórki człowieka i innych ssaków przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Selenocysteina jest kodowana przez kodon 5'-UGA-3', a pirolizyna przez kodon 5'-UAG-3'. W omawianych organizmach kodony te mają więc podwójne znaczenie, ponieważ są również ciągle wykorzystywane jako kodony terminacyjne (tab. 1.3C). Kodon 5'-UGA-3' kodujący selenocysteinę jest odróżniany od prawdziwych kodonów terminacyjnych dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka-pętelka (ang. stem-loop), w której pętelka tworzy się przez zagięcie mRNA do tyłu i jednoczesne powstawanie par zasad tworzących łodyżkę utrzymującą całą strukturę (rys. 1.28). U Prokaryota struktura ta położona jest tuż poniżej (ang. downstream) kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3'UTR, tzn. w części mRNA znajdującej się poniżej kodonu terminacyjnego. W procesie rozpoznania kodonu selenocysteinowego niezbędne jest oddziaływanie między strukturą łodyżka-pętelka a specjalnym białkiem biorącym udział w translacji tych mRNA. Podobny system działa prawdopodobnie przy rozpoznawaniu kodonu pirolizynowego.
Powiązanie proteomu z biochemią komórki
Końcowym wynikiem ekspresji informacji genetycznej zakodowanej w genomie jest białko, którego biologiczne właściwości determinuje sfałdowana struktura i przestrzenne rozmieszczenie grup chemicznych na jej powierzchni. Dzięki temu, że genom koduje różnego rodzaju białka, może on budować i zachowywać proteom, którego ogólne właściwości biologiczne tworzą podstawy życia. Proteom spełnia tę rolę dzięki ogromnej różnorodności struktur białkowych, które mogą się tworzyć. Pozwala to białkom pełnić wiele biologicznych funkcji, do których należą:
- kataliza biochemiczna przeprowadzana przez specyficzny rodzaj białek zwanych enzymami - enzymy są katalizatorami reakcji głównych szlaków metabolicznych dostarczających komórce energię, oraz reakcji biosyntetycznych, w wyniku których powstają kwasy nukleinowe, białka, węglowodany i tłuszcze; kataliza biochemiczna kieruje również ekspresją genomu przez aktywność enzymów, takich jak polimeraza RNA;
- struktura, na poziomie komórkowym determinowana przez białka budujące cytoszkielet - jej utrzymanie jest podstawową funkcją części białek zewnątrzkomórkowych; przykładem jest kolagen, ważny składnik kości i ścięgien;
- ruch zależny od białek kurczliwych, z których najbardziej znane to aktyna i miozyna, tworzące włókna cytoszkieletu;
- transport różnych związków chemicznych w organizmie związany z istotną aktywnością białek, np. hemoglobina transportuje tlen we krwi, a albumina osocza - kwasy tłuszczowe;
- regulacja procesów komórkowych, w której pośredniczą białka sygnałowe, takie jak czynniki transkrypcyjne wiążące się z genomem i wpływające na poziom ekspresji zarówno pojedynczych genów, jak i grup genów (sekcja 12.3); aktywność grup komórek regulują i koordynują zewnątrzkomórkowe hormony i cytokiny, z których wiele jest białkami, np. insulina kontrolująca poziom cukru we krwi lub interleukiny - grupa cytokin regulujących podział i różnicowanie komórek;
- ochrona organizmu i poszczególnych komórek jest funkcją wielu białek, takich jak przeciwciała oraz białka uczestniczące w procesie krzepnięcia krwi;
- funkcje magazynowania są związane z białkami takimi jak ferrytyna, która gromadzi żelazo w wątrobie, oraz gliadyny - białka zapasowe, które są magazynem aminokwasów w nasionach pszenicy w stanie spoczynkowym.
Dzięki tak zróżnicowanym funkcjom białek proteom może przekształcić zapisany w genomie plan w zasadnicze właściwości procesów życia.
Podsumowanie
- Każdy organizm na naszej planecie ma genom przechowujący informację biologiczną.
- Większość genomów jest zbudowana z DNA, z wyjątkiem niektórych genomów wirusowych zbudowanych z RNA.
- Ekspresja genomu to proces, w którym informacja zawarta w genomie jest przekazywana do komórki.
- Pierwszym produktem ekspresji genomu jest transkryptom - zbiór cząsteczek mRNA powstałych po transkrypcji genów aktywnych w komórce w określonym czasie.
- Kolejnym produktem jest proteom - zbiór białek komórki określający charakter reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać.
- Dowody eksperymentalne potwierdzające, że geny są zbudowane z DNA, otrzymano po raz pierwszy w latach 1945-1952, jednak dopiero odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w 1953 r. przekonało biologów, że DNA jest faktycznie materiałem genetycznym.
- DNA jest nierozgałęzionym polinukleotydem zbudowanym z wielu kopii czterech chemicznie różnych nukleotydów.
- W podwójnej helisie dwa polinukleotydy są owinięte wokół siebie tak, że zasady azotowe znajdują się wewnątrz cząsteczki.
- Polinukleotydy łączą się wiązaniami wodorowymi pomiędzy zasadami: A zawsze tworzy parę z T, a G - zawsze z C.
- RNA jest również polinukleotydem, ale poszczególne nukleotydy mają inną strukturę niż nukleotydy w DNA. RNA jest zwykle jednoniciowy.
- Komórki zawierają różne rodzaje RNA, między innymi mRNA, które są transkryptami genów kodujących białka, a także wiele innych niekodujących RNA.
- Wiele RNA jest syntetyzowanych wyjściowo jako cząsteczki prekursorowe. Aby uzyskać ostateczną formę, podlegają one dojrzewaniu - reakcjom cięcia i łączenia końców oraz modyfikacjom chemicznym.
- Białka są również nierozgałęzionymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi.
- Sekwencja aminokwasów jest pierwszorzędową strukturą białka. Struktury wyższego rzędu - drugorzędowa, trzeciorzędowa i czwartorzędowa - tworzą się przez zwinięcie struktury pierwszorzędowej w trójwymiarowe konformacje oraz przez łączenie się pojedynczych polipeptydów w białka składające się z wielu podjednostek.
- Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy mają różne właściwości chemicznie. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstania białek różniących się reaktywnością chemiczną.
- Białka są syntetyzowane w procesie translacji, zgodnie z zasadami kodu genetycznego określającego, jaki aminokwas jest kodowany przez daną trójkę (tryplet) nukleotydów.
- Kod genetyczny nie jest uniwersalny. Odstępstwa od jego zasad występują w mitochondriach i u niższych eukariontów. Niektóre kodony w obrębie jednego genu mogą mieć dwa różne znaczenia.
Krótkie pytania otwarte
1. Kiedy odkryto DNA; wykazano, że DNA jest materiałem genetycznym, odkryto strukturę DNA? Kiedy scharakteryzowano pierwszy genom?
2. Jakie dwa rodzaje oddziaływań chemicznych stabilizują strukturę podwójnej helisy?
3. Dlaczego specyficzne łączenie się zasad w pary (A łączy się z T, a G z C) jest podstawą wierności procesu replikacji DNA?
4. Jakie są istotne różnice chemiczne między RNA a DNA?
5. Dlaczego niekodujące RNA nazywane są również funkcjonalnymi RNA?
6. Przedstaw różne etapy w procesie dojrzewania cząsteczek RNA.
7. Czy komórki kiedykolwiek mogą nie mieć transkryptomu? Uzasadnij swoją odpowiedź.
8. Dlaczego wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i oddziaływania hydrofobowe odgrywają ważną rolę w pierwszorzędowej, drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze białek?
9. Dlaczego białka mogą tak bardzo różnić się strukturalnie i funkcjonalnie, skoro są syntetyzowane tylko z 20 aminokwasów?
10. Chemiczna różnorodność białek wynika z tego, że składają się one z 20 aminokwasów, a także z dwóch dodatkowych czynników. Jakie to czynniki i jakie mają znaczenie?
11. W jaki sposób kodon 5'-UGA-3' funkcjonuje zarówno jako kodon stop, jak i kodon dla zmodyfikowanego aminokwasu selenocysteiny?
12. W jaki sposób genom kieruje aktywnością biologiczną komórki?
Pytania problemowe
1. W tekście jest stwierdzenie, że Watson i Crick odkryli strukturę podwójnej helisy DNA w sobotę 7 marca 1953 r. Uzasadnij to stwierdzenie.
2. Przedyskutuj, dlaczego podwójna helisa prawie natychmiast uzyskała ogólną akceptację jako właściwa struktura DNA.
3. Jakie eksperymenty doprowadziły do rozszyfrowania kodu genetycznego w latach 60. XX w.?
4. Dlaczego polipeptydy mogą występować w wielu różnych formach strukturalnych, a polinukleotydy nie?
5. Uważa się, że transkryptom i proteom są, odpowiednio, pośrednim i końcowym produktem ekspresji genomu. Oceń zalety i ograniczenia tych definicji dla naszego zrozumienia ekspresji genomu.
Literatura uzupełniająca
Książki i artykuły opisujące odkrycie podwójnej helisy oraz inne ważne momenty przełomowe w badaniach DNA
Brock T.D. (1990). The Emergence of Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (Opisuje szczegółowo prace nad czynnikiem transformującym oraz doświadczenia Hersheya i Chase).
Judson H.F. (1996). The Eighth Day of Creation. Makers of the revolution in Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (Bardzo poczytny opis rozwoju biologii molekularnej do lat 90.).
Kay L.E. (1996). The Molecular Vision of Life. Oxford University Press. Oxford. (Zawiera szczegółowe wyjaśnienie, dlaczego początkowo uważano, że geny są zbudowane z białek).
Lander E.S., Weinberg R.A. (2000). Genomics: Journey to the center of biology. Science 287: 1777-1782. (Krótki opis genetyki i biologii molekularnej od Mendla do sekwencji genomu ludzkiego).
Maddox B. (2003). Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA. HarperCollins, London.
McCarty M. (1986). The Transforming Principle: Discovering that Genes are Made of DNA. Norton, London.
Olby R. (2012). The Path to the Double Helix. Dover Publications, Mineola. New York. (Naukowa relacja opisująca badania, które doprowadziły do odkrycia podwójnej helisy).
Watson J.D. (1968). The Double Helix. Atheneum. London. (Najważniejsze odkrycie XX w. opisane w stylu opery mydlanej).
Artykuły oryginalne i przeglądowe opisujące ważne aspekty dotyczące struktury DNA, RNA i białek
Altona C., Sundaralingam M. (1972). Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides: a new description using the concept of pseudorotation. Journal of the American Chemical Society 94:8205-8212. (Informacje na temat konformacji cukrów).
Eisenberg D. (2003). The discovery of the ?-helix and ?-sheet, the principal structural features of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:11207-11210.
Pauling L., Corey R.B. (1951). The pleated sheet, a new layer configuration of polypeptide chains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 37:251-256. (Pierwszy opis harmonijki ? - ? kartki).
Pauling L., Corey R.B., Branson H.R. (1951). The structure of proteins: two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 37:205-211 (Pierwszy opis helisy ?).
Ravichandran S., Subramani V.K., Kim K.K. (2019). Z-DNA in the genome: From structure to disease. Biophys. Rev. 11:383-387.
Watson J.D., Crick F.H.C. (1953). Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:737-738. (Naukowy opis odkrycia struktury podwójnej helisy DNA).
Yakovchuk P., Protozanova E., Frank-Kamenetskii M.D. (2006). Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix. Nucleic Acids Research 34:564-574.
Zacharias M. (2020). Base-pairing and base-stacking contributions to double-stranded DNA formation. J. Phys. Chem B 124:10345-10352.
Zasoby internetowe
Protein Data Bank. https://www.wwpdb.org/. Archiwum informacji o trzeciorzędowych strukturach białek i kwasów nukleinowych.
Kody genetyczne. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi. Informacje o niestandardowych kodach genetycznych u różnych gatunków; także na stronie https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_genetic_codes.
