ROZDZIAŁ

1

Historia początków enzymologii

Procesy enzymatyczne, w gruncie rzeczy, ludzie wykorzystywali od czasów starożytnych m.in. do wytwarzania pieczywa, sera, wina, piwa oraz obróbki skóry, co zostało opisane w wielu znalezionych tekstach antycznych. Jednak wyjaśnienie podstawowej natury jednego z tego rodzaju procesów - trawienia mięsa w żołądku - zaczęło się dopiero w połowie XVIII stulecia dzięki doświadczeniom francuskiego przyrodnika R.A. Reaumura (1683-1757) prowadzonych na myszołowach. Podając tym ptakom kawałeczki mięsa w perforowanych tubkach metalowych uczony stwierdził, że pokarm mięsny degradowany jest nie w sposób mechaniczny, a wskutek chemicznego trawienia "solwentem", tj. sokiem żołądkowym. Natomiast kawałeczki kości ulegały jedynie rozmiękczeniu, a podawane tkanki roślinne były raczej oporne wobec trawienia żołądkowego. Te wyniki potwierdził i uzyskał szereg nowych danych o procesie trawienia włoski uczony L. Spallanzani (1729-1799) w eksperymentach na indykach. On też udowodnił, że chemiczny sposób trawienia ma miejsce także w przypadku innych zwierząt i człowieka. Ponadto Spallanzani przeprowadził doświadczenia in vitro, stosując pobrany sok żołądkowy. Stwierdził zależność szybkości trawienia od ilości soku oraz od temperatury, a także dostrzegł ograniczoną stabilność substancji trawiącej w soku poza żołądkiem.

Natomiast w roku 1789 wybitny chemik francuski A.L. Lavoisier - m.in. odkrywca życiodajnej roli tlenu - za pomocą metod analizy ilościowej ustalił bilans substratów i produktów fermentacji alkoholowej, chociaż natura siły sprawczej tego procesu pozostawała wciąż nieznana. Chemik niemieckiego pochodzenia K.S. Kirchhoff, pracujący w Petersburskiej Akademii Nauk, w 1814 roku opublikował wyniki badań świadczące o tym, że ekstrakt z kiełków jęczmienia powoduje przekształcenie skrobi w cukier, czyli według obecnej terminologii, wykazuje aktywność amylazy. Francuscy chemicy A. Payen i J.F. Persoz w roku 1833 poczynili dalszy krok, traktując stężonym etanolem ekstrakt wodny słodu, a po rozpuszczeniu w wodzie wytrąconego i wysuszonego osadu upewnili się, że ten preparat efektywnie rozkłada skrobię na cukier. Aktywnej substancji dali nazwę diastaza. Był to faktycznie pierwszy przykład częściowego oczyszczenia biokatalizatora. Wkrótce w podobny sposób niemiecki uczony T. Schwann uzyskał preparat pepsyny (1836).

W drugiej połowie XIX w. duże zainteresowanie wielu badaczy wywoływała fermentacja alkoholowa z udziałem drożdży. Światowej sławy mikrobiolog francuski L. Pasteur był głęboko przekonany, że przeprowadzać ten proces mogą tylko żywe komórki drożdży. Oponowali mu natomiast uznani w świecie naukowcy jak fizjolog C. Bernard, chemicy M. Berthelot i J. Liebig twierdząc, że drożdże posiadają katalizator, który w sposób chemiczny dokonuje fermentacji, i mieli rację, ale to jeszcze wymagało udowodnienia. W roku 1878 W.F. Kuhne dla określenia takiego rodzaju katalizatora natury biologicznej zaproponował termin enzym. Termin ten pochodzi z greki i oznacza "w drożdżach". Tym niemniej termin ten upowszechnił się w odniesieniu do wszystkich biokatalizatorów różnego pochodzenia, chociaż merytorycznego sensu w takiej nazwie pozostało niewiele. Wreszcie niemiecki uczony E. Buchner w roku 1897 uzyskał, stosując silną prasę, bezkomórkowy "sok drożdżowy", który katalizował reakcję fermentacji alkoholowej. Był to przekonujący dowód działania enzymów bez udziału żywych komórek.

Na początku XX w. znakomity chemik niemiecki E. Fischer zaproponował model interakcji substratu i enzymu jako swego rodzaju klucza i zamka, co tłumaczyło wysoką specyficzność katalizy. W tym samym czasie (1903) francuski uczony V. Henri opublikował pracę zawierającą matematyczny model kinetyki enzymatycznej, w którym istnieje stan pośredni "kompleks enzym-substrat", natomiast w r. 1913 L. Michaelis i M. Menten uzupełnili ten podstawowy model, a równanie kinetyczne odtąd przyjęto kojarzyć z ich nazwiskami.

Godne uwagi jest to, że jeszcze około sto lat temu nie było pewności, jakiego rodzaju substancję stanowią sobą enzymy. Uzyskiwane preparaty enzymatyczne były wówczas z reguły niewystarczająco oczyszczone, co nie pozwalało na dokładne określenie ich składu chemicznego. Ponadto jony metali i różne grupy prostetyczne w składzie niektórych enzymów utrudniały i gmatwały analizę. Dopiero w 1926 r. amerykański biochemik J. Sumner uzyskał w postaci kryształów enzym ureazę z nasion konwalii, a dokonana przez niego skrupulatna analiza wykazała, że jest to substancja białkowa ze śladowymi ilościami niklu. Wkrótce (1930) D. Nortrop i wsp. wyodrębnili białkowe kryształy pepsyny i trypsyny. Wnioski z tych odkryć były jednoznaczne: enzymy są białkami zbudowanymi z aminokwasów.

Natomiast w składzie niektórych enzymów oprócz białka badacze stwierdzali obecność związków prostetycznych. W wyniku dogłębnych badań zostały więc odkryte w latach 30. XX w. przez H. Eulera i O. Warburga najpierw koenzymy nikotynoamidowe i flawinowe, a wkrótce przez innych biochemików - dalszy szereg koenzymów. Przykładowo, struktura tiaminy i jej formy koenzymatycznej została odkryta w 1936 r. przez R. Williamsa. Tak przedstawia się w skrócie początkowy etap rozwoju enzymologii.

TABELA 1.1.

Wybrane odkrycia w enzymologii

Data

Autorzy

Odkrycie

1956

A. Kornberg

polimeraza DNA

1961

C. Anfinsen

renaturacja rybonukleazy

1963

J. Monod, J. Wyman, J. Changeux

allosteryczna regulacja enzymów

1965

D. Philips

mechanizm działania lizozymu

1969

R. Merrifield

chemiczna synteza rybonukleazy

1970

W. Arber, H. Smith, D. Nathans

restryktazy i ich zastosowanie

1970

D. Baltimore, H. Temin

odwrotna transkryptaza

1983

K. Mullis

reakcja łańcuchowa polimerazy DNA

Od połowy XX wieku nastąpił ilościowy i jakościowy wzrost badań z zakresu biochemii w ogóle, jak również jej enzymologicznej gałęzi z zastosowaniem pojawiających się nowych technik i metod. Nie sposób w tym krótkim rozdziale wymienić wszystkich osiągnięć w dziedzinie enzymologii. Ogólnie można zaznaczyć, że w latach 50-80. ubiegłego wieku eksponencjalnie zwiększała się liczba odkrytych, wyizolowanych z różnych źródeł i oczyszczonych do stanu jednorodności enzymów. Za tym szło badanie ich struktury oraz mechanizmów funkcjonowania i regulacji. Nie oznacza to jednak, że koniec ubiegłego stulecia i początek nowego przebiegał już bez odkryć enzymologicznych, chociaż niewątpliwie na pierwszy plan wysunęły się badania w zakresie interdyscyplinarnej genomiki, w której enzymy odgrywają zresztą też ważną rolę. W tabeli 1.1 wymieniamy kilka spektakularnych odkryć z drugiej połowy XX wieku.

ROZDZIAŁ

2

Ogólna charakterystyka enzymów

2.1.

Moc katalityczna

Wszechobecne w żywych ustrojach biokatalizatory białkowej natury o nazwie enzymy wykazują wybitne zdolności do przyspieszania szybkości reakcji chemicznych rzędu milionów razy. Czynią to one, poza nielicznymi wyjątkami, w warunkach całkiem fizjologicznych, czyli w umiarkowanej temperaturze, przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym oraz w środowisku nie będącym zazwyczaj ekstremalnie kwasowym lub zasadowym. Ta duża sprawność katalityczna enzymów polega na silnym obniżaniu bariery energetycznej, tj. energii aktywacji reakcji: ?G? (ryc. 2.1).

RYCINA 2.1.

Uproszczony profil energetyczny reakcji A ? B obrazujący, że pod wpływem odpowiedniego enzymu silnie obniża się energia aktywacji (?G?). ?G° oznacza różnicę energii swobodnej substratu (A) i produktu reakcji (B)

Bez osiągnięcia energii aktywacji reakcja chemiczna jest nie do uruchomienia, nawet gdy substancja A posiada znacznie większą energię swobodną niż substancja B. Cząsteczki A znajdujące się w roztworach wodnych, jak to zwyczajnie ma miejsce w komórce, mogą pokonać barierę energetyczną w wyniku, na przykład, podgrzewania roztworu. Zwiększa to intensywność chaotycznych ruchów cząsteczek sprzyjających ich przypadkowym zderzeniom dostarczającym energii, co pozwala niektórym z nich osiągnąć aktywacyjny poziom energetyczny. Natomiast obecność odpowiedniego enzymu, silnie obniżającego próg energetyczny, zapewnia drastyczny wzrost liczby cząsteczek A pokonujących tę barierę i przechodzących w postać B z utratą oczywiście porcji energii równej różnicy GA - GB. Utrata energii w takiej reakcji egzoergicznej (termodynamicznie łatwej) może polegać na wydzielaniu ciepła do środowiska. Należy pamiętać, że chociaż enzymy doskonale dają sobie radę z obniżaniem energii aktywacji reakcji chemicznych, to jednak i one nie są wszechmocne w aspekcie termodynamiki. Według praw termodynamiki procesy przebiegają bowiem w kierunku prowadzącym do obniżenia energii swobodnej układu, czyli do zwiększenia stopnia jego nieuporządkowania (entropii). Enzymy nie potrafią więc wpływać na GA i GB oraz, co za tym idzie, na ogólny kierunek reakcji, która oczywiście ustaje po osiągnięciu pewnego stanu równowagi. Stan ten jest powiązany ze zmianą energii swobodnej (?G°) w sposób opisany równaniem 2.1 w postaci ogólnej:

?G° = -2,303 - R - T - log Keq (2.1)

gdzie:

?G° - zmiana energii swobodnej,

R - stała gazowa,

T - temperatura w skali Kelvina,

Keq - stała równowagi reakcji.

Keq może być wyrażona jako stosunek stężenia substancji o swobodnej energii niższej do substancji z wyższą energią ([B]/[A]) lub jako szybkość reakcji w kierunku naprzód w odniesieniu do szybkości wstecznej (kn/kw). Enzymy w tym układzie bardzo przyspieszają szybkość reakcji w obu kierunkach w jednakowym stopniu, co prowadzi do szybkiego osiągnięcia stanu równowagi, uwarunkowanego wyłącznie energią swobodną substratu i produktu.

Może powstać pytanie, czy zawsze enzymy przekształcają substancje o większej energii swobodnej w produkty mające mniejszą energię? Ogólnie ujmując, odpowiedź powinna być twierdząca. Wiemy jednak, że anaboliczną część przemian biochemicznych stanowią reakcje enzymatyczne prowadzące do biosyntez, gdzie z substratów o mniejszej energii swobodnej powstają produkty energetycznie zasobniejsze. Czyżby to zaprzeczało prawom termodynamiki? W żadnym razie. Enzymy są zdolne do katalizy takiego rodzaju reakcji pod warunkiem, że potrafią jednocześnie hydrolizować cząsteczkę uniwersalnego nośnika energii ATP z uwalnianiem z tego tytułu około 30 kJ/mol energii. Takie sprzężenie defosforylacji ATP i syntezy wysokoenergetycznego produktu nadaje sumarycznemu procesowi charakter egzoergiczny, czyli termodynamicznie możliwy do realizacji.

Tak więc, duża moc katalityczna enzymów polega na olbrzymim przyspieszeniu szybkości reakcji wskutek obniżenia jej energii aktywacji bez ingerencji w energię swobodną substratu i produktu oraz bez zmian wartości stałej równowagi. Innymi słowy, enzymy silnie przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi. W tabeli 2.1 są podane szybkości reakcji (kkat) katalizowanych przez kilka wybranych enzymów, w wymiarze liczby cząsteczek substratu przekształconych przez cząsteczkę enzymu w ciągu sekundy.