2ZIARENKOWCE GRAMDODATNIE - STAPHYLOCOCCUS, STREPTOCOCCUS I INNEEligia M. Szewczyk
W tym rozdziale przedstawiono ziarenkowce gramdodatnie wyrastające na podłożach w warunkach tlenowych: tlenowce i względne beztlenowce. Ziarenkowce bezwzględnie beztlenowe opisano w rozdziale 14.
Przedstawione tu rodzaje należą do odrębnych grup, różniących się zawartością guaniny i cytozyny w DNA. Rodzaje zaklasyfikowane do typu Firmicutes to bakterie o małej zawartości G + C, a Actinobacteria - o dużej. W nowej klasyfikacji tych drobnoustrojów rodzaj Staphylococcus umieszczony jest w rzędzie Bacillales. Do tego rzędu przeniesiono też rodzaj Gemella, którego klasyfikacja na poziomie rodziny jest jednak ciągle nieustalona.
Typ
Klasa
Rząd
Rodzina
Rodzaj
"Actinobacteria"
Actinobacteria
Micrococcales
Micrococcaceae
Micrococcus
Firmicutes
Bacilli lub Firmibacteria
Bacillales
Staphylococcaceae
Staphylococcus
incertae sedis
Gemella
Lactobacillales
Aerococcaceae
Abiotrophia Aerococcus
Carnobacteriaceae
GranulicatellaAlloiococcus
Enterococcaceae
Enterococcus
Lactobacillaceae
Pediococcus
Leuconostocaceae
Leuconostoc
Streptococcaceae
Lactococcus Streptococcus
Wspólną cechą opisanych tu bakterii jest kulisty lub owalny kształt komórek i tworzenie układów popodziałowych (par, tetrad, pakietów lub łańcuszków). Ziarenkowce te są komensalami wchodzącymi w skład mikrobiomu człowieka i zwierząt, bytującymi na skórze, błonach śluzowych górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego, niektóre są chorobotwórcze. Są to drobnoustroje, które można znaleźć w tych samych materiałach klinicznych, wyrastające na podłożach wzbogaconych stosowanych w pierwszych etapach diagnostyki w warunkach tlenowych.
Na podstawie zdolności wytwarzania katalazy opisane tutaj ziarenkowce można podzielić na katalazododatnie - rodzaje Staphylococcus, Alloiococcus i Micrococcus oraz katalazoujemne - rodzaje Streptococcus i Enterococcus oraz inne rodzaje paciorkowcopodobne.
Rodzaj Staphylococcus
Gronkowce zawdzięczają swoją nazwę skojarzeniu wyglądu układów ich komórek w preparatach mikroskopowych z wyglądem kiści winogron. Są szeroko rozpowszechnione. Mogą być też przyczyną groźnych ropnych infekcji w obrębie wszystkich układów.
Klasyfikacja i znaczenie kliniczne
Rodzaj Staphylococcus obejmuje już ponad 50 gatunków i podgatunków, z których przeszło połowa związana jest z człowiekiem, stanowiąc jego mikrobiom, ale także powodując choroby. Część z nich często izolowana jest także od zwierząt, wiele znaleziono w fermentowanej żywności lub tylko w środowisku, jak np. S. edaphicus wyizolowany z lodu na Antarktydzie. Niektóre gatunki dotychczas charakteryzowane są jako tylko zwierzęce (np. S. galinarum, S. rostri, S. microti, S. simiae), ale inne uznawane wcześniej za typowo zwierzęce, sporadycznie wprawdzie, izolowano jako czynnik etiologiczny infekcji u ludzi (np. S. hyicus).
Gronkowce pod względem filogenetycznym stanowią grupę jednorodną i mocno oddzieloną od innych rodzajów. Wewnątrz rodzaju obserwujemy jednak znaczne zróżnicowanie, które może być pomocne przy prowadzeniu diagnostyki. W praktyce klinicznej ciągle spotyka się podział gronkowców na koagulazododatnie (gatunek: Staphylococcus aureus subsp. aureus) i koagulazoujemne (CNS - ang. coagulase negative staphylococci; gatunki: S. epidermidis, S. saprophyticus subsp. saprophyticus i inne). Wynika on z zaobserwowanej przed wielu laty zdolności wykrzepiania przez S. aureus osocza (próba na koagulazę) i braku tej cechy u pozostałych, znanych wtedy gatunków. Należy jednak zaznaczyć, że obecnie wiemy, iż aktywność koagulazy wykazują także inne gatunki gronkowców spotykane w materiałach izolowanych od ludzi. Jednocześnie wśród szczepów klinicznych uznawanego za koagulazododatni gatunku S. aureus opisano także takie, które nie wykazywały tej cechy. W tej sytuacji cecha ta straciła na znaczeniu przy identyfikacji do gatunku. Gatunki gronkowców koagulazododatnich i ich rezerwuary przedstawiono w tabeli 2.1.
Tabela 2.1. Gronkowce koagulazododatnie
Gatunki
Wytwarzanie koagulazy
Izolacje z infekcji u ludzi
Główny rezerwuar
S. aureus ssp. aureus
+
częste
człowiek
S. argenteus
+
częste ?*
człowiek
S. aureus ssp. anaerobius
+
sporadyczne
zwierzęta (kozy, owce)
S. simiae
+
nie opisane
zwierzęta (małpy)
S. intermedius
+
rzadkie
zwierzęta (psy, koty)
S. pseudintermedius
+
rzadkie
zwierzęta (psy, koty)
S. delphini
+
nie opisane
zwierzęta (delfiny)
S. lutrae
+
sporadyczne
zwierzęta (wydry)
S. schleiferi ssp. coagulans
+
sporadyczne
zwierzęta (psy)
S. hyicus
+/-
sporadyczne
zwierzęta (świnie)
S. agnetis
+/-
nie opisane
zwierzęta (świnie)
* Wobec braku powszechnie stosowanych rutynowych metod identyfikacji tego nowo opisanego gatunku cecha ta jest trudna do oceny.
Gatunki gronkowców nie wytwarzających koagulazy, które przez wiele lat uznawano za nieszkodliwe komensale człowieka, a co za tym idzie, zanieczyszczenie badanych materiałów klinicznych, wykazują bardzo zróżnicowaną chorobotwórczość, a często i wielolekooporność, i ich identyfikacja do gatunku jest obecnie potrzebna.
Pod względem genetycznym, biorąc pod uwagę sekwencje genów kodujących 16S rRNA i trzy białka (rpoB, dnaJ, tuf), gatunki gronkowców tworzą bliżej spokrewnione klastry, które łączy wiele cech. Można na tej podstawie podzielić je na podobne fenotypowo grupy, co może ułatwiać identyfikację. W tabeli 2.2 przedstawiono najważniejsze gatunki gronkowców izolowanych od ludzi i ich cechy. Wśród nich znajdują się nowe gatunki opisane w latach 2013-2018. Ich nazwy zostały podkreślone. Gatunki wyróżnione grubą czcionką mają udokumentowane duże znaczenie kliniczne. W codziennej praktyce przeważnie posługujemy się tylko nazwą gatunku z pominięciem nazwy podgatunku w sytuacji, gdy są one jednobrzmiące.
Gronkowce kolonizują skórę każdego człowieka, będąc ważnym składnikiem jego mikrobiomu. Jednocześnie większość izolowanych od ludzi gatunków może spowodować chorobę. Zależy to od wyposażenia określonego szczepu w czynniki chorobotwórczości i od stanu odporności pacjenta. Gronkowce preferują miejsca wilgotne, wiele gatunków często izoluje się z określonych przestrzeni w obrębie ciała. Najliczniej i najpowszechniej spotykany jest gatunek S. epidermidis. Wyizolować go można ze skóry wszystkich okolic ciała i błon śluzowych. Mniejsze populacje S. hominis i S. haemolyticus najczęściej bytują w miejscach z licznymi gruczołami potowymi, S. capitis spotykany jest na skórze głowy, a S. auricularis w zewnętrznym przewodzie słuchowym. S. saccharolyticus izolowany bywa przede wszystkim ze skóry twarzy, szczególnie czoła, preferuje on głębsze odcinki kanalików gruczołów skóry. Jest to wśród gronkowców gatunek beztlenowy, jedyny, obok izolowanego od zwierząt podgatunku S. aureus subsp. anaerobius. S. lugdunensis lokuje się najczęściej w rejonie pach i pachwin, a S. saprophyticus ssp. saprophyticus w rejonie krocza. S. aureus kolonizuje szczególnie często przedsionek nosa, ale także inne wilgotne miejsca na skórze. Można go znaleźć u około 30% osób, a wśród personelu szpitalnego nawet i 90%. Jego obecność, choć jest pozbawiona doraźnych skutków, trudno jednak uznać za zjawisko normalne wobec wyposażenia tego gatunku w liczne czynniki chorobotwórczości. Ten rodzaj długotrwałej kolonizacji określamy często jako nosicielstwo.
Tabela 2.2. Podział na grupy filogenetycznego i fenotypowego podobieństwa gatunków gronkowców izolowanych z różną częstością z przypadków klinicznych od ludzi
Grupy podobieństwa
Częste infekcje zwierząt
Wytwarzanie koagulazy
Wrażliwość na nowobiocynę
Wytwarzanie oksydazy
fenotyp
filogeneza
S. aureus ssp. aureusS. argenteus S. aureus ssp. anaerobius
+
+
+
+
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
-
-
-
S. epidermidisS. capitis ssp. capitisS. capitis ssp. urealyticusS. capraeS. saccharolyticus
+
-
-
-
-
-
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
-
-
-
-
-
S. warneriS. pasteuri
-
-
wrażliwy
wrażliwy
-
-
S. haemolyticusS. hominis ssp. hominisS. jettensisS. petrasii ssp. croceilyticusS. petrasii ssp. petrasiiS. petrasii ssp. pragensis
-
-
-
-
-
-
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
-
-
-
-
-
-
S. ludgunensis
-
wrażliwy
-
S. chromogenes
-
wrażliwy
-
S. intermediusS. pseudintermediusS. schleiferi ssp. schleiferiS. schleiferi ssp. coagulans
+
+
+
+
-
+
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
-
-
-
-
S. auricularis
-
wrażliwy
-
S. simulans
-
wrażliwy
-
S. pettenkoferiS. massilensis
-
-
wrażliwy
wrażliwy
-
-
S. saprophyticus ssp. saprophyticusS. equorum ssp. equorumS. xylosus
+
-
-
-
oporny
oporny
oporny
-
-
-
S. cohnii ssp. cohniiS. cohnii ssp. urealyticusS. arlettae
+
-
-
-
oporny
oporny
oporny
S. sciuri ssp. sciuriS. lentus
+
-
-
oporny
oporny
+
+
Gronkowce: S. aureus i S. epidermidis od wielu lat pozostają na czele listy drobnoustrojów powodujących zakażenia szpitalne. Wynika to przede wszystkim z ich szerokiego rozprzestrzenienia i powszechnej kolonizacji skóry i śluzówek człowieka oraz łatwego nabywania przez nie genów oporności na wiele antybiotyków. W konsekwencji łatwo dochodzi do selekcji szczepów opornych w szpitalu. Szczególne niebezpieczeństwo stanowią tu rozprzestrzeniające się klonalnie szczepy tzw. gronkowców meticylinoopornych: MRSA (ang. methicillin resistant S. aureus) i MRSE (ang. methicillin resistant S. epidermidis) czy MRCNS (ang. methicillin resistant coagulase negative staphylococci). Szczepy takie wykazują oporność nie tylko na antybiotyki ?-laktamowe, ale często także na większość stosowanych w lecznictwie antybiotyków innych grup. Prowadzone są liczne badania poświęcone szczepom opornym, które rozprzestrzeniają się klonalnie nie tylko w szpitalach, ale i innych środowiskach, i stanowią poważny problem terapeutyczny. Więcej informacji na ten temat zawarto w rozdziale 39.
Gronkowce są czynnikami etiologicznymi bardzo szerokiego zakresu schorzeń i mogą być izolowane prawie z każdego rodzaju materiału klinicznego.
Infekcje gronkowcowe mogą mieć zdecydowanie ciężki przebieg, gdy dotyczą osób o zaburzonej funkcji układu odpornościowego. Za ich rozwój odpowiedzialne są liczne, zlokalizowane na powierzchni lub wydzielane do środowiska czynniki chorobotwórczości tych bakterii. Pozwalają one na kolonizację, mnożenie i rozprzestrzenianie bakterii oraz działają hamująco na mechanizmy pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej (inwazyny). Choroby gronkowcowe mogą też wynikać z działania toksyn białkowych wydzielanych zewnątrzkomórkowo. Struktury komórkowe, białka powierzchniowe, enzymy i toksyny, które mogą się składać na chorobotwórczość gronkowców, pokazano w tabeli 2.3. Należy jednak pamiętać, że wyposażenie różnych szczepów w obrębie gatunku może być nieraz krańcowo różne, co przekłada się na prawdopodobieństwo wywołania przez nie określonych infekcji i ich przebieg. Dlatego w procesie diagnostycznym często stosuje się obok wykrywania bakterii ocenę ich toksynotwórczości, jednak rzadko dotyczy to gronkowców.
Czynniki chorobotwórczości sprzyjające kolonizacji i rozwojowi infekcji znaleziono u różnych gatunków gronkowców. Większość z nich po raz pierwszy była zbadana i opisana u S. aureus. Szczepy gronkowców złocistych dysponują też zwykle największą ich liczbą. Wiele genów kodujących czynniki chorobotwórczości jest spotykana u szczepów licznych gatunków. Jednak ich ekspresja, a co za tym idzie, działanie chorobotwórcze są najlepiej wyrażone tylko u niektórych z nich. Toksyny białkowe, a w tym toksyny immunomodulujące powodujące choroby o ciężkim nieraz przebiegu, są wytwarzane przede wszystkim przez S. aureus. Adhezyny i białka odpowiedzialne za budowanie biofilmów są bardzo ważną cechą chorobotwórczości spotykaną najczęściej u S. epidermidis i niektórych innych pokrewnych im gatunków.
Tabela 2.3. Czynniki chorobotwórczości gronkowców
- Peptydoglikan ściany komórkowej
- Kwasy tejchojowe
- Białka (receptory) wiążące glikoproteinową macierz (ECM) komórek i osocza: fibronektynę, witronektynę, lamininę, elastynę, plazminogen i inne oraz receptor dla fibrynogenu - czynnik skupiania (CF - ang. clumping factor)
- Hemaglutyniny
- Białko A
- Otoczki
- Śluz zewnątrzkomórkowy (ESS - ang. extracellular slime substance)
- Proteinaza serynowa
- Hialuronidaza
- Koagulaza
- Białko Map (ang. MHC class II analog protein)
- Stafylokinaza (fibrynolizyna)
- Nukleazy
- FAME (ang. fatty acid modifying enzyme)
- Lipazy i fosfolipazy
- Lipoproteaza (SOF - ang. serum opacity factor)
- Czynnik hamujący agregację płytek krwi
- EDIN (ang. epidermal cell differentiation inhibitor-A)
- Siderofory
- Hemolizyny: ?-toksyna
?-toksyna (sfingomielinaza C)
?-toksyna
?-toksyna
- Leukocydyna Pantona-Valentina
- Enterotoksyny: SEA-SEU (ang. staphylococcal enterotixin A-U)
- Toksyna zespołu wstrząsu toksycznego TSST-1, TSST-2
- Toksyny epidermolityczne (eksfoliatyny): ET-A, ET-B, ET-D
S. aureus (gronkowiec złocisty) może być przyczyną miejscowych infekcji dotyczących praktycznie wszystkich tkanek i narządów oraz zakażeń uogólnionych, często zagrażających życiu. Do najczęściej spotykanych, zarówno w szpitalu, jak i poza nim, infekcji wywoływanych przez gronkowce złociste należą ropne stany zapalne skóry i tkanek miękkich: czyraki, jęczmienie, liszajec, ropnie, ropowice oraz zapalenie szpiku kostnego, septyczne zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc i rzadziej opon mózgowych. Wielooporne gronkowce złociste (MRSA) izolowane są z krwi i zakażonych przez szczepy szpitalne ran pooperacyjnych i implantów (HA-MRSA - ang. hospital acquired infections MRSA). Odnotowuje się także wzrost zakażeń wieloopornymi szczepami o charakterystycznym profilu patogenności szerzącymi się pozaszpitalnie. Są one przyczyną poważnych epidemicznie się szerzących infekcji skóry i tkanek miękkich (CA-MRSA - ang. community acquired infections MRSA). Infekcje szczepami wieloopornymi gronkowców złocistych stanowią obecnie największe zagrożenie i wyzwanie kliniczne.
Gronkowce złociste mogą być przyczyną zakażeń zwierząt: ssaków i ptaków, ale trzeba pamiętać o różnicowaniu ich od innych koagulazododatnich gatunków.
Chorobotwórczość S. aureus zależy od bardzo dużej liczby czynników. Ich inwazyjność warunkują adhezyny, a wśród nich receptory wiążące glikoproteiny macierzy (ECM - ang. extracellular matrix) komórek organizmu. Ważniejsze z nich to receptor dla fibronektyny, receptor fibrynogenu osocza - czynnik skupiania komórek (CF - ang. clumping factor) czy białko A mające zdolność wiązania immunoglobulin poprzez fragment Fc, a tym samym zapobiegające opsonizacji ich komórek. Dodatkowo, przeciwstawianie się układowi odpornościowemu i niszczenie tkanek wzmagają liczne enzymy (stafylokinaza, hialuronidaza i wiele innych), a także działające wielokierunkowo ?-, ?-, ?-, ?-hemolizyny oraz leukocydyna. Leukocydyna Pantona-Valentina (PV) jest ważną toksyną charakteryzującą wielooporne szczepy odpowiedzialne za epidemiczne zakażenia pozaszpitalne (CA-MRSA).
Gronkowce złociste mogą wytwarzać specyficzne toksyny immunomodulujące, nazywane też toksynami pirogennymi. Są to tzw. superantygeny działające nadmiernie pobudzająco i mitogennie w stosunku do limfocytów T. Ich aktywność prowadzi do znacznej nadprodukcji cytokin, a w konsekwencji do zapaści naczyniowej i wstrząsu. Szczepy je wytwarzające są przyczyną - czynnikiem etiologicznym wymienionych niżej schorzeń o typowym tylko dla nich przebiegu.
- Gronkowcowe zatrucie pokarmowe z gwałtownymi wymiotami ustępujące, zwykle samoistnie, po kilku godzinach. Jest to szybko objawiający się skutek spożycia pokarmu, w którym mnożące się S. aureus wytworzyły ciepłostałą (100°C, 30 minut), oporną na działanie soku żołądkowego enterotoksynę. Gronkowce mogą wytwarzać wiele serologicznie różnych odmian tej toksyny oznaczanych jako SE z kolejnymi literami alfabetu. Toksyny SEA do SEE są preformowane i natychmiast wydzielane przez gronkowce, które znajdą się w żywności. Jej spożycie daje szybki efekt zatrucia pokarmowego (od 30 minut do najdalej 6 godzin) jako wynik podrażnienia ośrodka wymiotnego w mózgu.
- Zespół wstrząsu toksycznego (TSS - ang. toxic shock syndrome) obejmujący szereg ciężkich objawów, takich jak biegunka, wymioty, zapaść naczyniowa, czasem prowadząca do niewydolności narządów i śmierci, wynikających z nadmiernego pobudzenia układu immunologicznego. Odpowiedzialna za nie jest toksyna zespołu wstrząsu toksycznego (TSST - ang. toxic shock syndrome toxin) wytwarzana przez szczepy noszące kodujący ją gen. Produkują ją one w mikroaerofilnym środowisku, które stwarza najlepsze warunki do jej ekspresji. Warunki takie mogą powstać w ranach pooperacyjnych czy wokół bardzo chłonnych tamponów używanych w czasie menstruacji.
- Zespół skóry oparzonej (SSS - ang. scalded skin syndrome) (łac. dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter) występujący u noworodków oraz wynikające z działania tej samej toksyny ciężkie zmiany martwicze (TEN - ang. toxic epidermal necrolysis) starszych dzieci i dorosłych to efekt działania kolejnej toksyny immunomodulującej wytwarzanej przez S. aureus - toksyny epidermolitycznej (eksfoliatyny). Toksyna ta powoduje powstawanie rozległych pęcherzy, złuszczanie naskórka i odsłanianie skóry właściwej na dużych przestrzeniach (zespół Rittera; choroba Lyella) lub powstawanie mniej rozległych zmian: liszajca pęcherzowego bądź wysypki rumieniowej (płonicy gronkowcowej). Toksyna ta ma też działanie proteazy niszczącej połączenia komórek warstwy ziarnistej nabłonka, stąd w warstwie tej nie można znaleźć bakterii ani leukocytów. Choroba może być sprowokowana agresywną antybiotykoterapią. Pacjenci powinni być izolowani, gdyż bardzo zakaźne toksynotwórcze szczepy mają dużą łatwość rozprzestrzeniania się.
S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy), S. haemolyticus i S. lugdunensis to gronkowce koagulazoujemne najczęściej izolowane z materiałów klinicznych, szczególnie z krwi. S. epidermidis, a szczególnie jego wielooporne szczepy (MRSE), jest notowany jako najczęstsza przyczyna szpitalnej sepsy. Gatunki te powodują infekcje przede wszystkim u pacjentów z obniżonym poziomem odporności: wcześniaków, osób poddanych chemioterapii w leczeniu nowotworów, biorców przeszczepów - szczególnie szpiku kostnego. Są przyczyną bakteriemii, a często i sepsy u pacjentów poddanych długotrwałemu dożylnemu cewnikowaniu (obwodowe cewniki naczyniowe, dojścia centralne) lub zabiegom kardiochirurgicznym. S. epidermidis swoją szczególną chorobotwórczość zawdzięcza dużym zdolnościom adhezyjnym zależnym od wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu (ESS - ang. extracellular slime substance) i receptorów dla wielu białek ECM pozwalających na tworzenie na powierzchniach tkanek i wszczepów biofilmu. Dlatego często izolowany jest od pacjentów, u których zastosowano różnego rodzaju cewniki czy endoprotezy. Tego rodzaju schorzenia mogą być także wywoływane przez podobnie wyposażone szczepy innych gatunków gronkowców koagulazoujemnych. S. haemolyticus może także powodować zapalenia wsierdzia, sepsę, zapalenie otrzewnej, często jako infekcje pooperacyjne. Gatunek ten wydziela między innymi cytolizyny przyczyniające się do rozprzestrzeniania zakażenia. S. lugdunensis obok sepsy może być przyczyną ropni mózgu, przewlekłego zapalenia stawów czy licznych infekcji w obrębie tkanek miękkich.
S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) jest gatunkiem notowanym klinicznie jedynie jako przyczyna zakażeń dróg moczowych. U młodych kobiet jest to drugi po Escherichia coli, choć występujący znacznie rzadziej czynnik etiologiczny tej choroby. Choroba rozwija się po wcześniejszej kolonizacji okolic krocza tymi bakteriami, S. saprophyticus bowiem nie występuje powszechnie wśród rezydentów skóry. Kolonizacji sprzyjają warunki beztlenowe, dlatego źródłem wstępującego zakażenia dróg moczowych może być przewód pokarmowy - po zjedzeniu skażonej żywności lub pochwa - po przeniesieniu bakterii drogą płciową. Do zakażenia może też dojść na pływalniach. Warunki beztlenowe wzmagają wytwarzanie przez S. saprophyticus hemaglutyniny - adhezyny odpowiedzialnej za ich chorobotwórczość.
Morfologia, wymagania wzrostowe, izolacja
Komórki gronkowców są gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się jednak nieregularnie. Ziarenkowce te osiągają rozmiary na ogół nie przekraczające 1 ?m i są nieruchliwe. Charakterystyczny układ gron obserwowany jest w preparatach wykonywanych z hodowli na pożywkach stałych, spotykane są także mniejsze układy złożone z 2-4 komórek, a czasem - z hodowli płynnych - krótkie łańcuszki.
Gronkowce są w większości względnymi beztlenowcami, wyrastają więc zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, jednak natlenianie podłoża (np. przez wstrząsanie) na ogół wzmaga wzrost. Komórki gronkowców są podatne na lizę lizostafiną - specyficznym enzymem rozcinającym mostki glicynowe poprzecznego usieciowania peptydoglikanu ściany, ale oporne na lizozym. Stanowi to ich cechę diagnostyczną (Aneks P-43, P-44).
Wiele gatunków gronkowców potrzebuje do wzrostu określonych aminokwasów i witamin, ale wymagania te zaspokajają nawet proste podłoża bakteriologiczne: woda peptonowa czy zwykłe podłoże agarowe. Wzrost tych bakterii jest jednak bardziej obfity na podłożach bogatszych, np. podłożu TSA (Triptic Soy Agar) lub TSA z krwią. Gładkie, okrągłe, lekko wypukłe kolonie tworzą się po 24 godzinach hodowli w temperaturze 30-35°C. Ocena morfologii kolonii po 5 dniach hodowli na agarze P (Aneks P-1) może mieć duże znaczenie diagnostyczne. Zabarwienie kolonii (kremowe do pomarańczowego) ujawnia się po ekspozycji na światło i hodowli w temperaturze pokojowej i będzie miało duże znaczenie przy różnicowaniu z S. argenteus, który barwnika nie wytwarza, jego kolonie pozostają białe.
Na agarze z krwią wokół kolonii szczepów niektórych gatunków (S. aureus, S. argenteus, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. cohnii) pojawia się różnej wielkości strefa hemolizy typu ?, zwykle lepiej widoczna po 48 godzinach lub po hodowli w atmosferze CO2 (Aneks P-5). Cechy morfologii kolonii najważniejszych gatunków pokazano w tabeli 2.4.
Na podłożu płynnym gronkowce zazwyczaj tworzą męt, czasem z kłaczkowatym osadem. Izolację gronkowców z materiałów klinicznych, w których są inne drobnoustroje towarzyszące, ze środowiska czy z żywności, ułatwiają wybiórcze podłoża, takie jak podłoże Chapmana, podłoże z mannitolem i NaCl czy podłoże Baird-Parkera (Aneks I-10, I-42, I-2) wykorzystujące ich dużą oporność na stres osmotyczny. Gronkowce są halotolerantami.
Identyfikacja gatunków gronkowców
Różnicowanie w obrębie rodzaju opiera się na określeniu cech biologicznych i biochemicznych. Cechy identyfikacyjne gatunków najczęściej wywołujących schorzenia przedstawiono w tabeli 2.4.
Gronkowce złociste identyfikuje się najczęściej przez wykazanie: zdolności wytwarzania koagulazy (Aneks P-62), obecności czynnika ich skupiania w osoczu (CF - ang. clumping factor) (Aneks P-53), hemolizy typu ? oraz rozkładu mannitolu. Trudności diagnostyczne mogą sprawiać, rzadko wprawdzie spotykane, koagulazoujemne szczepy S. aureus. Powszechnie używane są komercyjne szybkie testy wykorzystujące obecność na powierzchni komórek S. aureus receptora wiążącego fibrynogen (czynnik CF) oraz białka A wiążącego immunoglobulinę poprzez fragment Fc.
Tabela 2.4. Różnicowanie najczęściej chorobotwórczych dla ludzi gatunków rodzaju Staphylococcus
Cechy
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. haemolyticus
S. hominis
S. caprae
S. lugdunensis
Wygląd kolonii*
duże (> 5 mm) kremowożółte
małe (< 4 mm) białoszare
duże (> 5 mm) przeważnie białe
duże (> 5 mm) często kremowe
małe (< 4 mm) często kremowe
duże (> 5 mm) bezbarwne
małe (< 5 mm) często kremowe
Hemoliza
+ (typ ?)
-
-
+ (typ ?)
-
+ (typ ?)
opóźniona
+ (typ ?)
słaba
Koagulaza
+
-
-
-
-
-
-
CF
+
-
-
-
-
-
+
Białko A
+
-
-
-
-
-
-
Rozkład mannitolu (tlenowo)
+
-
+/-
+/-
-
różnie
-
Fosfataza alkaliczna
+
+
-
-
-
+
-
Rozkład trehalozy (tlenowo)
+
-
+
+
+/-
+
+
Wrażliwość na nowobiocynę
wrażliwy
wrażliwy
oporny
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
wrażliwy
Wrażliwość na bacytracynę
wrażliwy
wrażliwy
różnie
oporny
wrażliwy
wrażliwy
oporny
* Po inkubacji przez 3 doby w 35°C i dodatkowe 2 doby w temperaturze pokojowej na świetle.
Nowo opisany gatunek S. argenteus jest bardzo podobny do S. aureus i w biochemicznych systemach identyfikacyjnych praktycznie nie do odróżnienia. Z tego powodu obecnie nie potrafimy dokładnie ocenić, jak szeroko jest rozprzestrzeniony. Jedyne opisywane fenotypowe różnice to brak zabarwienia kolonii (brak produkcji stafyloksantyny), szczególnie dobrze widoczny po hodowli na agarze czekoladowym oraz dodatnia u części opisanych dotychczas szczepów próba na ureazę. Gatunek daje też odmienny od S. aureus profil w MALDI-TOF MS, co wymaga jednak wprowadzenia go do bazy danych przez producentów oprogramowania. Oba gatunki dają taki sam produkt w PCR dla 16S rRNA i genu nucA, co uniemożliwia identyfikację molekularną tą metodą. Przydatne jest typowanie MLST. Jego chorobotwórczość i wykazywana lekooporność są przyczyną intensywnego poszukiwania metod jego rutynowej identyfikacji.
Coraz częściej koagulazododatnie: S. intermedius i później opisany S. pseudintermedius - gatunki patogenne dla psów i kotów bywają także izolowane ze skóry i infekcji u ludzi. Szczepy S. intermedius mogą wykazywać dodatni CF. Ich identyfikacja może wymagać połączenia metod fenotypowych i genetycznych. W odróżnieniu od S. aureus gatunki te nie wytwarzają barwnika, wynik testu PYR jest dodatni i są wrażliwe na 8 ?g/mL akryflawiny; w badaniach genetycznych można się posłużyć sekwencją genu tuf lub sekwencją kodującą ?-hemolizynę S. pseudintermedius. Inne gatunki koagulazododatnich gronkowców izolowanych od psów i innych zwierząt (tab. 2.1) nie dają zwykle dodatniej próby na CF.
Identyfikacja pozostałych gatunków gronkowców wymaga oceny licznych cech, poczynając od określenia wrażliwości na nowobiocynę (Aneks P-45; tab. 2.2), poprzez badanie dodatkowo: rozkładu ksylozy, sacharozy, maltozy, fruktozy, laktozy, mannozy, trehalozy, redukcji azotanów, aktywności enzymów: fosfatazy, ureazy i wielu testów krążkowych (np. wrażliwość na polimyksynę B, bacytracynę czy lizostafinę - Aneks P-47, P-41, P-43). Zwykle wykonuje się tę identyfikację, używając odpowiednio zestawionych wielu prób biochemicznych w szeroko dostępnych handlowo testach diagnostycznych, jak np. API Staph (Aneks Z-3). Różnicowanie gronkowców koagulazoujemnych jest trudne, szczególnie dla gatunków S. hominis, S. haemolyticus i S. warneri. Identyfikacja gatunków najczęściej wywołujących schorzenia, na podstawie prób przedstawionych w tabeli 2.4, powinna być możliwa u blisko 90% szczepów. W niektórych przypadkach pomocna może być także próba wrażliwości na polimyksynę B, na którą większość wymienionych tu gatunków jest wrażliwa, a S. aureus i wiele szczepów S. epidermidis (ale nie wszystkie) wykazują oporność. W różnicowaniu z S. aureus kłopot może sprawić także izolowany z materiałów klinicznych od ludzi koagulazoujemny gatunek S. lugdunensis, który daje dodatnią próbę na CF, a także powoduje hemolizę, choć zwykle słabą, na agarze z krwią. Trudności może też sprawiać identyfikacja S. caprae spotykanego w materiałach klinicznych i często błędnie klasyfikowanego jako S. haemolyticus lub S. hominis (tab. 2.4). Wśród szczepów izolowanych od zwierząt w diagnostyce zwraca uwagę koagulazoujemny, CF-dodatni, S. sciuri subsp. rodentium, który daje dodatni test lateksowy Staph-Latex i, będąc zanieczyszczeniem, może być potraktowany jako S. aureus. Współcześnie stosowane w laboratoriach systemy automatów czy półautomatów opartych na cechach biochemicznych oraz MALDI-TOF MS pozwalają zidentyfikować większość opisanych tu gatunków (Aneks Z-3, Z-4).
Molekularne metody identyfikacji gronkowców są wykorzystywane nie tyle do rutynowej diagnostyki, ile do ich typowania do celów epidemiologicznych. Szczególnie przydatne są metody genetyczne oparte na rybotypowaniu i sondy genetyczne do oznaczania produktów PCR, na przykład dla genów gap, nuc czy używane do wykrywania szczepów meticylinoopornych sondy wykrywające gen mecA.
Identyfikacja Staphylococcus aureus jako czynnika etiologicznego zatruć pokarmowych (patrz też rozdział 28)
Posiew próbek żywności na podłoże wybiórcze typu Baird-Parkera (Aneks I-2) ma na celu poszukiwanie gronkowców złocistych, a wśród nich szczepów zdolnych do wytwarzania enterotoksyn. Zatrucie toksyną gronkowcową jest jednym z najczęściej spotykanych zatruć pokarmowych. Zwykle są to zatrucia po spożyciu lodów, kremów, sałatek czy wędlin. Gronkowce dostają się do nich z rąk czy nosogardzieli ludzi (zwykle nosicieli) zatrudnionych przy ich przygotowywaniu. Mnożące się bakterie wytwarzają toksyny, których nie niszczy obróbka cieplna zabijająca bakterie. Dlatego bardzo często nie można ich wyhodować z podejrzanej żywności czy materiału klinicznego. Nawet jeśli bakterie znajdą się razem z żywnością w organizmie człowieka, nie wytwarzają tam toksyn, stąd choroba jest krótka i zależy od ilości spożytej toksyny. Objawia się ostrymi wymiotami, bólami brzucha i poczuciem ogólnego zatrucia, a jeśli towarzyszy im biegunka, to jest ona wodnista i nie zawiera krwi.
Na ogół, ponieważ objawy są charakterystyczne, a choroba krótkotrwała, nie jest prowadzona diagnostyka. Może ona polegać na poszukiwaniu toksyny lub toksynotwórczych szczepów w żywności i wymiocinach lub, znacznie rzadziej, w kale. Toksyny SA do SE wykrywa się metodami enzymoimmunofluorescencyjnymi (ELFA), testem odwróconej biernej aglutynacji lateksowej (RPLA - ang. reverse passiv latex agglutination) lub przez western-immunoblotting. Badania takie wykonuje się rutynowo, często metodami zautomatyzowanymi, przy ocenie mikrobiologicznej jakości żywności, szczególnie produktów mlecznych.
Rodzaj Micrococcus
Mikrokoki nie są filogenetycznie spokrewnione z rodzajami opisanymi w tym rozdziale, mimo że przez wiele lat tak właśnie uważano.
W rodzaju Micrococcus opisano kilkanaście gatunków, z których część może wchodzić w skład mikrobiomu skóry człowieka. Kilka z nich, podobnie jak jeden ze szczepów wzorcowych Micrococcus luteus, okazało się bliższych rodzajowi Kocuria i zostało do niego przeniesionych. Bakterie te uważane są za niechorobotwórcze, ale opisano pojedyncze przypadki ich izolacji z infekcji oportunistycznych. Znajduje się je w produktach spożywczych i w powietrzu. Można je też często spotkać, jako zanieczyszczenie, w materiałach klinicznych.
Ziarenkowce z rodzaju Micrococcus są podobne morfologicznie, ale większe od gronkowców i osiągają średnicę komórek przekraczającą 2 ?m. W odróżnieniu od gronkowców są tlenowcami; zawartą w pożywce glukozę utleniają, choć zdolność rozkładu tego substratu mają tylko niektóre gatunki tego rodzaju. M. luteus, na przykład, jej nie ma. Mikrokoki tak jak gronkowce wytwarzają katalazę i, w odróżnieniu od większości gronkowców, oksydazę. Mają także niewielkie wymagania odżywcze i też są halotolerantami (np. rosną w obecności 5% NaCl). Są jednak w odróżnieniu od gronkowców oporne na furazolidon (Aneks P-40). Ich kolonie dość łatwo można odróżnić, są wyraźnie zabarwione w odcieniach od cytrynowożółtego do czerwonego.
Różnicowanie gronkowców od morfologicznie podobnych ziarenkowców gramdodatnich
W praktyce spotykamy się z koniecznością różnicowania gronkowców z innymi ziarenkowcami gramdodatnimi izolowanymi z tych samych materiałów klinicznych. Gronkowce od paciorkowców i enterokoków różni przede wszystkim dodatnia próba na katalazę, trudniejsze może być różnicowanie ich względem mikrokoków i Rothia mucilaginosa. Pomocne mogą się okazać próby zgromadzone w tabeli 2.5.
Mikrokoki odróżnia od gronkowców, obok oporności na furazolidon i dodatniej próby na oksydazę, zdolność wyrastania na podłożu z nieorganicznym źródłem azotu. Cecha ta nie jest spotykana wśród gronkowców związanych z człowiekiem.
Niekiedy zachodzi potrzeba różnicowania gronkowców od podobnych, słabo katalazododatnich ziarenkowców Rothia mucilaginosa (dawniej Stomatococcus mucilaginosus), które opisano w rozdziale 3. W tabeli 2.5 jako jedną z cech wymieniono wrażliwość Rothia mucilaginosa na bakteriofagi gronkowcowe, która to cecha w dobie sięgania po terapie fagowe może być istotna.
Tabela 2.5. Porównanie niektórych cech podobnych do gronkowców ziarenkowców gramdodatnich
Rodzaj
Morfologia komórek
Wymagania wzrostowe
Katalaza
Oksydaza
Rozkład eskuliny
Wzrost na podłożu McConkeya
Wzrost w obecności 5% NaCl
Wrażliwość na furazolidon
Receptory dla fagów gronkowcowych
Staphylococcus
grona różnej wielkości
małe
+
-
-
-
+
wrażliwe
+
Enterococcus
krótkie łańcuszki
małe
-
-
+
+
+
BD
-
Micrococcus
duże komórki; tetrady
małe
+
+
-
-
+
oporne
-
Rothia mucilaginosa
owalne, czasem wydłużone; pary
duże
+/-
(reakcja słaba)
-
+
-
-
BD
+
Rodzaj Streptococcus
Ziarenkowce tego rodzaju nazywane są paciorkowcami ze względu na charakterystyczny układ komórek, które, dzieląc się w jednej płaszczyźnie, często nie rozłączają się całkowicie i tworzą długie łańcuszki jak paciorki.
Paciorkowce nie wytwarzają katalazy i cecha ta różni je od katalazododatnich gronkowców. Podobnie jak gronkowce, charakteryzują się metabolizmem fermentacyjnym z kwasem mlekowym jako głównym metabolitem.
Klasyfikacja i znaczenie kliniczne
Rodzaj Streptococcus obejmuje już sto kilkadziesiąt gatunków i podgatunków. W ostatnich czterech latach do listy dopisano ich trzydzieści. Wiele z nich odgrywa istotną rolę jako patogeny ludzi i zwierząt lub wchodzi w skład mikrobiomu jamy ustnej oraz górnych odcinków układu oddechowego i pokarmowego człowieka. Badania filogenetyczne oparte na analizie rRNA pozwoliły na wyróżnienie dużych grup gatunków bardzo blisko spokrewnionych. W tabeli 2.6 pokazano wszystkie te grupy, ale tylko te gatunki, które były dotychczas izolowane od człowieka.
W stosunku do poprzednich klasyfikacji systematyka i podział paciorkowców na grupy uległy zmianie. W rodzaju Streptococcus pozostały tylko bakterie względnie beztlenowe, paciorkowce bezwzględnie beztlenowe okazały się blisko spokrewnione z innymi taksonami. Na przykład izolowany od ludzi dawny S. pleomorphus został wykluczony z rodzaju Streptococcus, reklasyfikowany do rodziny Erysipelotrichaceae i jest obecny w klastrze podobieństwa razem z gatunkami rodzaju Eubacterium. Nie znalazł jednak miejsca w tym rodzaju. Jego pozycja w systematyce wymaga dalszych badań.
Tabela 2.6. Grupy i gatunki paciorkowców izolowanych od człowieka
Grupa
Gatunek
Paciorkowce ropotwórcze (ang. Pyogenic)
S. pyogenes S. agalactiaeS. dysgalactiae subsp. equisimilis S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae S. equi subsp. zooepidemicus
Grupa Bovis
S. gallolyticus subsp. gallolyticus S. infantarius subsp. infantiarius S. gallolyticus subsp. pasteurianus S. lutetiensis
Grupa Mitis
S. mitis
S. pneumoniae
S.pseudopneumoniae
S. oralis
S. sanguinis
S. australis
S. parasanguinis
S. cristatus
S. gorgonii
S. oligofermentans
S. infantis
S. peroris
S. sinensis
Grupa Mutans
S. mutans S. sobrinusS. ratti
Grupa Salivarius
S. salivarius S. vestibularis
Grupa Anginosus
S. anginosus S. intermediusS. constelatus subsp. constelatus S. constelatus subsp. pharyngisS. constelatus subsp. viborgensis
Paciorkowce ropotwórcze są blisko spokrewnione i tworzą nadal wspólną grupę, ale nie ma wśród nich zaliczanego do niej wcześniej pneumokoka S. pneumoniae, który został zaklasyfikowany do grupy Mitis.
Dawniej wyróżniane jako jedna grupa paciorkowce jamy ustnej tworzą kilka odrębnych genetycznie grup określanych jako Mitis, Mutans, Salivarius i Anginosus i gromadzą gatunki o różnych cechach i chorobotwórczości. Wcześniej nazywano je też "paciorkowcami zieleniącymi" ze względu na rodzaj wywoływanej hemolizy na podłożu z krwią i określano jako gatunek "Streptococcus viridans". Nie ma takiego gatunku i ta nazwa nie powinna być już używana.
Szczepy S. bovis izolowanego także od ludzi zostały ostatecznie zaliczone, zależnie od biotypu, do gatunków S. gallolyticus i S. pasteurianus - przedstawicieli grupy Bovis, a gatunek S. bovis przestał istnieć.
Inny, niezwykle ułatwiający identyfikację, podział paciorkowców na grupy serologiczne opiera się na budowie antygenowej składników ich ściany komórkowej: wielocukru swoistego C (grupy A, B, C, F, G) lub kwasu lipotejchojowego (grupy D i N). System podziału opierający się na różnicach w tej budowie stworzyła Lancefield w celu identyfikacji tzw. paciorkowców ?-hemolizujących - grupy gatunków, których szczepy mogą wywoływać na agarze z krwią hemolizę typu ?. Szczepy takie znajdują się w obrębie wielu gatunków w różnych grupach tych ziarenkowców. Z czasem poszerzano liczbę grup serologicznych, ale u niektórych gatunków nie rozpoznano antygenów, a u innych okazało się, że dają one reakcje krzyżowe lub że w obrębie jednego gatunku spotykane są szczepy zawierające różne antygeny grupowe. Podział serologiczny zachował swą przydatność diagnostyczną, obejmuje ponad 20 grup, ale w praktyce wykorzystywany jest tylko do ograniczonej liczby gatunków (tab. 2.7). System ten jest szeroko stosowany, gdyż pozwala na szybką identyfikację gatunków najważniejszych w patologii człowieka. Opiera się na nim wiele rodzajów szybkich testów identyfikacyjnych: próby lateksowe czy immunoenzymatyczne, na przykład paskowe, pozwalające na wykrycie infekcji spowodowanej przez S. pyogenes w ciągu kilku minut od pobrania wymazu z gardła, także od razu w gabinecie lekarza.
Tabela 2.7. Grupy serologiczne paciorkowców o znaczeniu klinicznym
Grupa serologiczna wg Lancefield
Gatunek
A
(GAS - ang. group A streptococci)
S. pyogenesnieliczne szczepy S. anginosus i S. constelatus subsp. constelatus
B
(GBS - ang. group B streptococci)
S. agalactiaenieliczne szczepy S. parasanguinis
C
S. dysgalactiae subsp. equisimilisS. constelatus subsp. pharyngisS. equi subsp. zooepidemicus
D
S. gallolyticus subsp. gallolyticus S. pasterurianusEnterococcus faecalis Enterococcus faecium
F
niektóre paciorkowce grupy Anginosus
G
m.in. zwierzęce paciorkowce ropotwórcze (np. S. canis)
R lub S
S. suis
W pierwotnym schemacie Lancefield w grupie D umieszczone są także gatunki obecnie wyodrębnione jako rodzaje np. Enterococcus. Ziarenkowce te mają bowiem w swojej ścianie antygeny (kwasy lipotejchojowe) charakterystyczne dla paciorkowców. Paciorkowce zaliczane do grupy N według Lancefield należą do rodzaju Lactococcus (paciorkowce mleczne). Gatunki tego rodzaju izolowane są z mleka i produktów mlecznych, ale ostatnio Lactococcus garvieae opisywany jest jako patogen zwierzęcy (ryby) zagrażający człowiekowi.
Relacje taksonomiczne paciorkowców są coraz lepiej poznawane, głównie dzięki badaniom genetycznym. Jednak nadal jeszcze opisane gatunki okazują się bardzo zróżnicowane wewnętrznie i dlatego są często trudne do identyfikacji. Sugeruje to także przyszłe zmiany w taksonomii. Zmiany te obserwuje się także w ocenie ich chorobotwórczości.
Z materiałów klinicznych od ludzi izolowane są przede wszystkim S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae i S. dysgalactiae. Z krwi, w przypadkach pierwotnego zapalenia wsierdzia, szczególnie od młodych pacjentów, izolowane są paciorkowce ?-hemolizujące wszystkich grup, ale najczęściej gatunki: S. sanquinis, S. mitis, S. mutans, S. anginosus. Opisywane są wytwarzane przez nie adhezyny (w tym lipoproteiny), które w dużej mierze są odpowiedzialne za zapoczątkowującą chorobę kolonizację i inicjację tworzenia bakteryjnego biofilmu.
S. pyogenes (paciorkowce ropotwórcze grupy A, GAS) są spośród paciorkowców najczęstszym i najważniejszym czynnikiem etiologicznym infekcji. Jednak u około 5% ludzi dorosłych i 15% lub nawet więcej dzieci mogą stanowić część mikrobiomu, nie powodując objawów chorobowych, bytując na błonach śluzowych górnych dróg oddechowych. Człowiek jest ich jedynym rezerwuarem. Zakażenie następuje drogą kropelkową, przez kontakt lub zakażone przedmioty. Schorzenie może się również rozwinąć w wyniku aktywacji kolonizującego szczepu endogennego.
Paciorkowce te mogą być przyczyną infekcji miejscowych, dotyczących przede wszystkim gardła i skóry, oraz zagrażających życiu infekcji uogólnionych. Za ich chorobotwórczość odpowiedzialnych jest wiele czynników. Szczepy paciorkowców mają różne w nie wyposażenie, stąd mogą się znacząco różnić patogennością, wywoływać infekcje o różnym przebiegu. Do najważniejszych czynników ich zjadliwości należy silnie immunogenne, umiejscowione na powierzchni komórek, a także w fimbriach, białko M kodowane przez gen emm. Białko to osłabia aktywność układu odpornościowego, wiążąc fibrynogen z surowicy, ułatwiając adhezję i blokując wiązanie dopełniacza do peptydoglikanu, co hamuje fagocytozę. Pokłada się w nim nadzieje przy opracowywaniu szczepionki zapobiegającej chorobom powodowanym przez S. pyogenes. Wykrywanie odmian serologicznych białka M może służyć typowaniom epidemiologicznym. Znanych jest obecnie ponad 200 różnych typów serologicznych tego białka. W różnych krajach i regionach dominują różne serotypy wiązane z różnymi chorobami paciorkowcowymi. W Europie i Ameryce Północnej w ostatnich latach były to serotypy M1, M28, M89, M3, M12, M4 i M6 odpowiedzialne za około 50-70% zakażeń paciorkowcami. W Polsce w tym czasie dominowały M1 i M12. Działanie wielu innych składników powierzchni komórek S. pyogenes, także uwalnianych przez nie substancji zewnątrzkomórkowych (np. enzymów, w tym licznych proteaz i toksyn cytolitycznych) i również toksyn immunomodulujących (pirogennych) SPE, składa się na złożoną i różnorodną chorobotwórczość tych bakterii. Wytwarzana przez paciorkowce tego gatunku tlenowrażliwa hemolizyna - streptolizyna O jest silnie immunogenna, a powstające w przebiegu choroby przeciwciała (antystreptolizyny) są istotnym markerem diagnostycznym. Wysokie, narastające miano tych przeciwciał wykazane w dwukrotnym badaniu serologicznym (miano antystreptolizyn O - ASO) wskazuje na istniejącą infekcję paciorkowcową. Wiedza na temat czynników chorobotwórczości S. pyogenes ciągle się poszerza, najważniejsze z nich wymieniono w tabeli 2.8.
Tabela 2.8. Najważniejsze czynniki chorobotwórczości S. pyogenes
- Otoczka hialuronowa HA
- Kwasy lipotejchojowe (LTA)
- Białko F wiążące fibronektynę
- Białko GRAB (ang. G-related ?2M-binding protein)
- Białko M
- Streptolizyna O (cytolizyna, hemolizyna)
- Streptolizyna S (cytolizyna, hemolizyna)
- Streptokinazy (fibrynolizyny) A, B
- Nukleazy (np. streptodornaza)
- Hialuronidaza
- Proteazy (peptydaza serynowa, lipoproteaza SOF i inne)
- Glikohydrolaza NAD
- Toksyny pirogenne SPE (ang. streptococcal pyrogenic exotoxin):
Toksyna A - erytrogenna, immunomodulująca (SPE A)
Toksyna B - proteaza cysteinowa (SPE B)
Toksyna C - erytrogenna, immunomodulująca (SPE C)
SmeZ (ang. streptococcal mitogenic exotoxin) i inne
S. pyogenes wywołuje nieinwazyjne stany zapalne i ropne gardła oraz migdałków podniebiennych, czasem powikłane ropniem okołomigdałkowym lub pozagardłowym, ropnym zapaleniem węzłów chłonnych i ucha środkowego. Spowodowane przez ten gatunek infekcje dolnych dróg oddechowych są rzadkie. Ropne infekcje skóry, których czynnikiem etiologicznym jest S. pyogenes, to przede wszystkim liszajec i niesztowica. Szczepy wytwarzające toksynę pirogenną (przede wszystkim toksynę SPE A) mogą być przyczyną płonicy (łac. scarlatina) - swoistej, zakaźnej, wysypkowej choroby wieku dziecięcego.
Paciorkowce S. pyogenes są również odpowiedzialne za szybko rozprzestrzeniające się w pierwotnie jałowych płynach i tkankach, uogólnione i stanowiące zagrożenie życia zakażenia inwazyjne. Należą do nich zakażenie połogowe i bakteriemia, której może towarzyszyć ostre zapalenie wsierdzia, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, septyczne zapalenie stawów. Są to także ropne zapalenia tkanki łącznej podskórnej (łac. cellulitis) oraz choroba o swoistym przebiegu - róża (łac. erysipelas). Inwazyjne szczepy wytwarzające toksynę pirogenną B (SPE B) są odpowiedzialne za drastyczny przebieg martwiczego zapalenia powięzi (łac. fascitis necrotisans) lub zespołu wstrząsu toksycznego STSS (ang. streptococcal toxic shock syndrome), podobnego do tego, jaki wywołuje gronkowcowa toksyna TSST-1.
Nieropnym zapaleniem skóry i tkanki podskórnej związanym z toczącą się lub przebytą infekcją paciorkowcową jest rumień guzowaty.
Następstwami infekcji wywołanych przez paciorkowce ropotwórcze, chorobami o podłożu immunologicznym, są gorączka reumatyczna i ostre kłębuszkowe zapalenie nerek. Mechanizm chronicznego schorzenia, jakim jest gorączka reumatyczna, nie jest dobrze poznany. Wiadomo, że przeciwciała przeciwko białku M reagują krzyżowo z miozyną mięśnia sercowego, prowadząc do choroby z autoagresji. Wyjątkowo oporna na degradację w organizmie ściana komórkowa S. pyogenes prowokuje, jako efekt mimikry molekularnej, powstawanie reakcji immunologicznych ukierunkowanych na tkanki o podobnych epitopach antygenowych: zapalenie mięśnia sercowego prowadzące do nabytej wady serca i reumatyczne zapalenie stawów. Choroba dotyczy dzieci w wieku 5-15 lat i występuje zwykle jako powikłanie po anginie paciorkowcowej. Gorączki reumatycznej nie należy mylić z najczęściej występującą chorobą reumatyczną o podłożu autoimmunologicznym - reumatoidalnym zapaleniem stawów (reumatyzm, gościec stawowy). Ostre kłębkowe zapalenie nerek jest chorobą, w której przebiegu dochodzi do tworzenia i odkładania w nerkach kompleksów immunologicznych, co prowadzi zazwyczaj do nieodwracalnego uszkodzenia tego narządu. Wskazuje się na związek między typem serologicznym białka M szczepu GAS a obrazem klinicznym. Inne szczepy powodują zakażenia gardła i gorączkę reumatyczną, a inne odpowiedzialne są za ropne infekcje skóry i zapalenie kłębuszków nerkowych. Ostatnio zaobserwowano związek między infekcją spowodowaną przez GAS a neurologicznym zespołem Gillesa de la Tourette'a - chorobą tików.
Nazwa drobnoustroju S. agalactiae (paciorkowiec bezmleczności, GBS) wynika z jego pierwotnie wykrytej chorobotwórczości dla zwierząt hodowlanych. U człowieka S. agalactiae jest składnikiem mikrobiomu jamy ustnej, nosogardzieli, przewodu pokarmowego i pochwy. Paciorkowiec ten może jednak wywoływać niebezpieczne zakażenia noworodków i dlatego powinien być eliminowany u ciężarnych jeszcze przed porodem. W Polsce wprowadzono rutynowe badanie wymazów z pochwy i odbytu u kobiet między 35 a 37 tygodniem ciąży. Na świecie odsetek kobiet, u których wykryto skolonizowanie GBS w czasie ciąży, wynosi 18%. W obrębie gatunku wykryto 10 serotypów, ale najczęściej izolowane są serotypy I-V. Inwazyjna postać infekcji wiązana jest z serotypem III, który wykrywa się u 25% zakażonych kobiet. Do infekcji u dziecka dochodzi podczas przechodzenia przez kanał rodny, ale zakażenie może dotyczyć także płodu. We wczesnym okresie (w czasie pierwszego tygodnia życia) pojawia się bakteriemia i zapalenie płuc, kiedy choroba rozwinie się później (u niemowląt) najczęściej opisywane jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych lub sepsa. Diagnostykę tych zakażeń opisano w rozdziale 33.
U dorosłych, u których szczególną predyspozycję stanowią cukrzyca i alkoholizm, S. agalactiae może wywołać zapalenie pęcherza moczowego i odmiedniczkowe zapalenie nerek, rzadziej inne infekcje.
S. dysgalactiae początkowo uważany za drobnoustrój zwierzęcy, często jest izolowany także od ludzi. Rozdzielenie udziału podgatunków w infekcjach na ten, który powoduje je tylko u ludzi (S. dysgalactiae subsp. equisimilis) czy chorobotwórczy tylko dla zwierząt (S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae), jest kwestionowane. S. dysgalactiae może stanowić składnik mikrobiomu gardła osób zdrowych. Jest jednak także chorobotwórczy - izolowany z różnych ropnych infekcji: zapalenia gardła, migdałków podniebiennych i zapalenia płuc, a także ropnych stanów zapalnych skóry i tkanki podskórnej. Może wywoływać martwicze zapalenie powięzi, a także być czynnikiem etiologicznym chorób uogólnionych: sepsy z ostrym zapaleniem wsierdzia, zakażenia połogowego, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oraz zapalenia kości i szpiku kostnego. Gatunek ten jest jeszcze stosunkowo słabo poznany, ale wykryto u niego czynniki chorobotwórczości podobne do tych, jakie występują u S. pyogenes, np. powierzchniowe białko M i toksynę powodującą niespecyficzną aktywację układu odpornościowego.
S. pneumoniae (pneumokok; dwoinka zapalenia płuc) jest czynnikiem etiologicznym płatowego zapalenia płuc i najczęstszą przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc u człowieka. Może wywoływać uogólnione, ciężkie zakażenia inwazyjne, ale także zapalenie oskrzeli, zatok i ucha środkowego. Jest on, obok Neisseria meningitidis i Haemophilus influenzae, jednym z trzech najważniejszych drobnoustrojów wywołujących bakteryjne (ropne) zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Zwracają uwagę pojawiające się coraz częściej wielooporne, w tym oporne na penicylinę, szczepy pneumokoków. Pneumokok może być wyizolowany z gardła zdrowych osób. Kolonizacja gardła przez S. pneumoniae jest bardzo częsta wśród dzieci przedszkolnych.
Opisany niedawno pokrewny gatunek S. pseudopneumoniae, którego szczepy nazywane były wcześniej pneumokokami nietypowymi, powoduje zapalenia spojówek (także epidemiczne), zapalenia ucha środkowego i zaostrzenia w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP).
Za zjadliwość szczepów S. pneumoniae odpowiada wiele czynników, przy czym najważniejsza jest gruba polisacharydowa otoczka wykazująca silne działanie antyfagocytarne. O jej znaczeniu świadczy fakt, że szczepy jej pozbawione nie są chorobotwórcze. Wielocukry budujące otoczkę występują w około 90 odmianach antygenowych. Szczepy dysponujące tylko niektórymi z nich są odpowiedzialne za większość zachorowań. Epidemiologiczna ocena częstości zachorowań spowodowanych przez określone serotypy pozwala na dobór odpowiednich szczepów do konstrukcji składu szczepionek i ewentualne jego modyfikowanie. W rozprzestrzenianiu się zakażenia mają znaczenie wytwarzane przez te bakterie inwazyny i toksyny: proteaza IgA1, powierzchniowe białka PspA, PsaA i SpsA, cytolizyny - m.in. pneumolizyna i leukocydyna; enzymy - fibrynolizyna, hialuronidaza i inne. Wytwarzana przez pneumokoki autolizyna przypuszczalnie ułatwia rozprzestrzenianie się szkodliwych białek w organizmie. Autolizyna ta jest też odpowiedzialna za rozpad komórek w materiałach klinicznych i w późnych fazach hodowli, co może utrudniać diagnostykę.
Większość gatunków grup: Mitis, Mutans, Salivarius i Anginosus stanowi ważny element mikrobiomu jamy ustnej i gardła. Zasiedlają one też fragmenty układów moczowego i płciowego. Jednak, jeśli przedostaną się do krwi (np. po ekstrakcji zęba), mogą być przyczyną ciężkich infekcji: sepsy, powolnego zapalenia wsierdzia, zapalenia kości i szpiku kostnego, zapalenia płuc i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Najczęściej wywołują schorzenia u ludzi gatunki należące do grupy Anginosus (zwykle S. anginosus). Z kolei paciorkowce z grupy Mutans odpowiedzialne są w dużej mierze za tworzenie płytki nazębnej i inicjowanie próchnicy zębów. Charakterystyczną cechą bakterii tej grupy jest szczególnie obfite wytwarzanie wielocukrów śluzu zewnątrzkomórkowego (lewanu, dekstranu). Śluz ten odpowiedzialny jest za ich silne właściwości adhezyjne.
Liczba gatunków paciorkowców, które mogą być przyczyną zakażeń u ludzi, zwiększa się. Gatunki dotychczas opisywane jako typowo zwierzęce, były już izolowane od człowieka jako czynniki etiologiczne chorób. Należą do nich między innymi S. iniae zaliczany do grupy paciorkowców ropotwórczych, nie typujący się według schematu Lancefield oraz nie zaliczany do żadnej z wymienionych grup paciorkowców, a także S. suis, którego szczepy należą do grup Lancefield S lub R. Oba drobnoustroje wywołują hemolizę i mają szereg cech upodabniających je do innych, chorobotwórczych paciorkowców i enterokoków, w tym także zdolności immunomodulujące. Gatunki te stały się w ostatnich latach przyczyną groźnych odzwierzęcych chorób ludzi, a nawet odzwierzęcych epidemii, przede wszystkim w Azji.
Kolejny paciorkowiec z grupy ropotwórczych: S. canis izolowano od ludzi z zakażonych ran. Gatunki S. equi subsp. equi i S. equi subsp. zooepidemicus są niezwykle istotne w weterynarii, ale opisywano także zakażenia ludzi np. po wypiciu zakażonego mleka. S. equinus jest chorobotwórczy dla koni, ale znajdowano go także w materiałach klinicznych pochodzących od ludzi.
Niektóre paciorkowce z grupy Bovis mogą być u człowieka czynnikiem etiologicznym zapalenia wsierdzia; rzadziej wywołują zakażenia dróg moczowych, zapalenia opon mózgowych czy sepsę noworodków.
Podobnie jak w przypadku innych bakterii, zwiększa się grupa gatunków paciorkowców, które zidentyfikowano jako składniki mikrobiomu, jak np. niedawno wykryty w żołądku S. timonensis.
Morfologia, cechy hodowlane i różnicowanie
Paciorkowce są małymi (0,5-1 ?m) ziarniakami barwiącymi się gramdodatnio. W preparatach bezpośrednich z materiału klinicznego gatunki izolowane z jamy ustnej często wykazują pleomorfizm. W starszych hodowlach komórki mogą się barwić metodą Grama niejednolicie lub być gramujemne. Na płynnych podłożach tworzą łańcuszki komórek lub dwoinek (pneumokoki), nieraz znacznej długości. W materiale klinicznym widoczne są zwykle dwoinki lub bardzo krótkie łańcuszki. Wiele gatunków tworzy otoczki, jednak w preparatach z hodowli nie są one widoczne. W preparatach z materiału klinicznego (plwocina, ropa, bioptaty), na tle elementów tych materiałów, dobrze widoczne są otoczki pneumokoków, otaczające dwoinki o wydłużonym, lancetowatym kształcie.
Paciorkowce mają duże wymagania wzrostowe. Są względnymi beztlenowcami. Wiele gatunków, szczególnie z grup Mutans, Anginosus oraz S. pneumoniae i S. pseudopneumoniae, lepiej rośnie, jeśli w atmosferze jest 5% CO2. Wzrost w tych warunkach pozwala odróżnić od siebie te dwa ostatnie gatunki, gdyż tylko S. pseudopneumoniae jest wtedy oporny na optochinę i nie rozpuszcza się w żółci. W atmosferze normalnej oba gatunki zachowują się tak samo - są wrażliwe na optochinę i rozpuszczają się w żółci.
Widoczny wzrost paciorkowców pojawia się po 24 godzinach hodowli w 37°C. Na pożywkach płynnych, np. na bulionie Todda-Hewitta (Aneks I-38), mogą rosnąć w postaci ziarnistego osadu na dnie lub, rzadziej, zmętnienia z małym osadem (S. pneumoniae). Izoluje się je i hoduje na wzbogaconych złożonych podłożach zawierających np. wyciąg sercowo-mózgowy, a dodatkowo krew lub surowicę. Pożywki wybiórcze pozwalające na izolowanie paciorkowców z materiału klinicznego zawierają 0,02% azydku sodowego, który hamuje wzrost gramujemnych bakterii towarzyszących (Aneks I-41). Na pożywkach stałych z krwią tworzą otoczone strefą hemolizy kolonie: bardzo drobne (S. pyogenes, niektóre paciorkowce jamy ustnej) lub większe (1 mm) z dużą strefą hemolizy (S. eąuisimilis), czy też płaskie (2 mm) z bardzo małym rąbkiem hemolizy (S. agalactiae) albo szare, czasem z pępkowatym wgłębieniem na środku (S. pneumoniae). O dalszym postępowaniu identyfikacyjnym decyduje jednak typ hemolizy.
W jednym z pierwszych schematów porządkujących paciorkowce do celów diagnostycznych podzielono je ze względu na typ hemolizy, jaki wywołują na pożywkach z krwią baranią lub końską (Aneks P-5). Podział wyróżnił paciorkowce ?-hemolizujące, których hemolizyny powodują rozpuszczenie krwinek - wokół kolonii powstaje wtedy całkowite przejaśnienie, i ?-hemolizujące, pod których wpływem krwinki nie ulegają pełnemu rozpadowi, co sprawia, że strefa przejaśnienia jest nieprzejrzysta i wyraźnie zazieleniona. Podział ze względu na rodzaj hemolizy jest użyteczny do dziś i znacznie usprawnia diagnostykę, którą, po ocenie typu hemolizy, prowadzi się już dla mniejszej liczby gatunków. Pewnym utrudnieniem może być to, że w obrębie niektórych gatunków poszczególne szczepy mogą się różnić typem hemolizy (tab. 2.9).
Izolacja z materiału klinicznego katalazoujemnych ziarenkowców, których kolonie są otoczone strefą hemolizy ?, sugeruje podjęcie próby określenia ich przynależności do grupy serologicznej według schematu Lancefield (Aneks S-2). Kolejne etapy to badanie wrażliwości na bacytracynę i kotrimoksazol (Aneks P-41, P-42), a w przypadku dalszych wątpliwości - następne próby pokazane w tabeli 2.10.
Tabela 2.9. Rodzaje hemolizy wywoływanej przez paciorkowce
Grupa filogenetyczna/gatunek
Typ hemolizy na agarze z krwią
RopotwórczeS. pyogenes
?
S. agalactiae
S. equisimilis
S. canis
S. equi subsp. equi
S. equi subsp. zooepidemicus
?
?
?
?
?
BovisS. gallolyticus
S. pasteurianus
S. equinus
brak
?
? lub brak
MitisS. mitis
S. oralis
S. sanguis
S. pneumoniae
?
?
?
?
MutansS. mutans
S. sobrinus
? lub brak
? lub brak
SalivariusS. salivarius
brak
AnginosusS. anginosus
S. intermedius
S. constelatus
? lub brak
? lub brak
? lub ? lub brak
InneS. suis
? lub ?
Gatunki rodzaju Enterococcus
E. faecalis
E. faecium
? lub brak
? lub brak
Tabela 2.10. Różnicowanie najważniejszych paciorkowców ?-hemolizujących
Gatunek
Grupa serologiczna
Wrażliwość na bacytracynę
Wrażliwość na kotrimoksazol (SXT)
Test CAMP
Rozkład hipuranu sodu
Test PYR
S. pyogenes
A
wrażliwe
oporne
-
-
+
S. agalactiae
B
oporne
oporne
+
+
-
S. equisimilis
C
oporne
wrażliwe
-
-
-
S. constelatus
F lub A
oporne
wrażliwe
-
-
-
W przypadku podejrzenia o przynależność do gatunku S. agalactiae można wykonać próbę na rozkład hipuranu i test synergistycznej hemolizy CAMP (Aneks P-4, P-34). Obok S. pyogenes dodatni wynik testu PYR (Aneks P-38), wynikający z wytwarzania enzymu pirolidonyloaryloamidazy, dają także enterokoki.
Wśród paciorkowców ?-hemolizujących zwykle poszukuje się pneumokoków. Ich identyfikacji służą dwie pierwsze próby wymienione w tabeli 2.11 - wykazanie wrażliwości na optochinę i rozpuszczalności w żółci (Aneks P-46, P-31). S. pneumoniae różni się wynikami tych prób od większości pozostałych paciorkowców ?-hemolizujących najczęściej izolowanych od człowieka. Wiąże się to z aktywacją przez żółć i optochinę autolizyn tych paciorkowców. S. pneumoniae identyfikuje się także metodami serologicznymi, poszukując antygenów wielocukrów otoczkowych. Antygenów otoczkowych pneumokoków można poszukiwać w moczu osób chorych. Najczęściej wykonuje się odczyny lateksowe (Aneks S-6). Złotym standardem typowania serologicznego szczepów jest jednak reakcja "pęcznienia otoczek" w kontakcie dwoinek pneumokoków ze specyficznymi przeciwciałami przeciw otoczkom różnych typów. Duża różnorodność ich antygenów pozwala na dochodzenia epidemiologiczne.
Tabela 2.11. Różnicowanie paciorkowców ?-hemolizujących
Grupa filogenetyczna/gatunek
Wrażliwość na optochinę
Rozpuszczalność w żółci
Rozkład eskuliny
Próba VP
Rozkład mannitolu
Ureaza
Antygen grupy serologicznej D
Bovis
S. gallolyticusS. pasteurianus
oporne
-
+
+
różnie w obrębie grupy
-
+
+-
Mitis
S. mitis S. sanguinis S. oralis S. pneumoniae
różnie w obrębie grupy
różnie w obrębie grupy
-
-
-
-
-
oporne oporne oporne wrażliwe
-
-
-
+
Mutans S. mutans S. sobrinus
oporne
-
+
+
+
-
-
Salivarius S. salivarius
oporne
-
+
+
-
+
-
Anginosus S. anginosus S. intermedius S. constelatus
oporne
-
+
+
-
-
-
S. pasteurianus i większość szczepów S. gallolyticus można zidentyfikować na podstawie obecności antygenu D. Od typujących się także w grupie D enterokoków odróżnia je wrażliwość na kotrimoksazol i ujemny test PYR.
Identyfikacja pozostałych gatunków jest trudna i wymaga zastosowania dalszych prób przedstawionych w tabeli 2.11, które niekiedy pozwalają tylko na przyporządkowanie do grupy. To jednak przy standardowej diagnostyce najczęściej bywa wystarczające.
Identyfikację paciorkowców najczęściej opiera się na testach immunologicznych i handlowych gotowych zestawach prób wykrywających ich cechy metaboliczne i pozwalających na numeryczny odczyt (Aneks Z-3). Wobec rosnącej liczby przypadków zakażeń dotychczas rzadko spotykanymi gatunkami paciorkowców, szerzej wprowadza się też metody genetyczne. Trzeba jednak pamiętać, że są one często, podobnie jak MALDI-TOF MS, zawodne przy rozróżnieniu S. pneumoniae, S. pseudopneumoniae i S. mitis.
Rodzaj Enterococcus (paciorkowce kałowe; enterokoki)
Klasyfikacja i chorobotwórczość
Enterokoki, dawniej klasyfikowane jako paciorkowce (Streptococcus) grupy D, w wyniku badań filogenetycznych uzyskały status oddzielnego rodzaju. Nie wszystkie gatunki tego rodzaju mają w ścianie komórkowej antygen D.
Wyodrębniono ponad 50 gatunków rodzaju Enterococcus. Większość z nich stanowi część mikrobiomu jelitowego ssaków i ptaków, ale są też gatunki, które izolowano tylko z roślin i wody. U ludzi, oprócz przewodu pokarmowego, gdzie bytują u ponad 90% populacji, można je znaleźć na skórze, w drogach moczowych i pochwie. W materiałach klinicznych pochodzących od ludzi dominują E. faecalis (do niedawna znacząco częściej izolowany) i E. faecium, a spośród pozostałych gatunków sporadycznie spotykane są: E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium, E. raffinosus i E. hirrae.
Enterokoki to patogeny oportunistyczne, które mogą powodować infekcje poza swoim fizjologicznym miejscem bytowania, szczególnie u osób z niepełnosprawnym układem odpornościowym. Mogą być przyczyną zakażeń dróg moczowych, ran, bakteriemii, zapalenia wsierdzia. Są często izolowane od pacjentów z wielodrobnoustrojowymi infekcjami wewnątrzbrzusznymi. E. faecalis częściej wywołuje schorzenia w obrębie jamy brzusznej, a E. faecium dróg moczowych i zakażenia ran. W ostatnich latach enterokoki coraz częściej są izolowane jako przyczyna zakażeń szpitalnych i jako takie mogą stanowić poważny problem terapeutyczny.
Wśród czynników chorobotwórczości tych bakterii opisano szereg substancji warunkujących kolonizację, a wśród nich białka wiążące fibrynogen i kolagen, a także enzymy (hialuronidazę, żelatynazę, proteinazę serynową) sprzyjające rozprzestrzenianiu zakażenia. Cytolizyna E. faecalis wykazuje aktywność bakteriocyny, a jednocześnie działanie letalne w modelach zwierzęcych - stanowią ją dwa peptydy modyfikowane potranslacyjnie. Grupa adhezyn nazwanych substancją agregującą (AS) wytwarzana przez E. faecalis i E. faecium powoduje powstawanie skupisk enterokoków, co ułatwia im przeżywanie wewnątrz fagocytów, a także wymianę genetyczną między szczepami. Adhezyna AS należy do grupy intensywnie ostatnio badanych białek z konserwatywnym motywem LPXTG zlokalizowanym we fragmencie C-końcowym i obecnym u wielu gramdodatnich ziarenkowców. Komórki tych bakterii zawierają dużą różnorodność plazmidów i transpozonów związanych z opornością na antybiotyki i wytwarzaniem czynników chorobotwórczości. Niebezpieczeństwo związane z wywoływanymi przez enterokoki infekcjami wynika w największej mierze z ich szerokiej naturalnej oraz nabytej wielooporności na antybiotyki.
Morfologia, cechy hodowlane
Enterokoki to gramdodatnie, nieco owalne, duże (do 2,5 ?m) ziarenkowce. W preparatach tworzą pary, krótkie łańcuszki lub nieregularne skupiska.
Są względnie beztlenowe, ale preferują warunki beztlenowe. Wyrastają na pożywkach prostych w temperaturze 35-37°C w ciągu 18-24 godzin, a większość gatunków, w tym E. faecalis i E. faecium, mnoży się także w 10°C i 45°C. Na pożywkach płynnych tworzą zmętnienie, na stałych budują najczęściej duże (2 mm) szarawoprzejrzyste kolonie. Na agarze z krwią, niektóre, rzadko spotykane szczepy, mogą powodować hemolizę ? lub ?, zwykle jednak nie hemolizują krwinek.
Identyfikacja i różnicowanie
Zdolność do wzrostu na zwykłych pożywkach, a także na bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl czy 40% soli żółci wyraźnie odróżnia izolowane od ludzi gatunki rodzaju Enterococcus od paciorkowców, jednak decydujące jest wykazanie ich innych cech przedstawionych w tabeli 2.12. Kałowe paciorkowce mają zdolność wyrastania na podłożu BE - z żółcią i eskuliną, zabarwiając na czarno pożywkę już w 1-4 godziny po posiewie. Jedyne paciorkowce również rosnące na tej pożywce: szczepy z grupy Bovis zaczerniają pożywkę dopiero po kilkunastu godzinach (Aneks I-43). Podobieństwo do ?-hemolizujących szczepów E. faecalis może wykazywać S. pyogenes, który daje także dodatni wynik testu PYR (Aneks P-38). Jednak wyniki pozostałych prób wymienionych w tabeli 2.10, ocena wzrostu na podłożach i wykonanie prób charakterystycznych dla paciorkowca ropotwórczego powinny rozstrzygnąć wszystkie wątpliwości.
Zdecydowaną większość infekcji u ludzi wywołują dwa gatunki enterokoków: E. faecalis i E. faecium. Podstawową cechą je różnicującą jest wytwarzanie przez E. faecium ?-galaktozydazy (Aneks P-52) i zdolność rozkładu arabinozy, ale także, jeśli szczep jest hemolizujący, rodzaj hemolizy na agarze z krwią. Pomocna jest także próba na redukcję chlorku tetrazoliowego TTC (Aneks P-75). Czasem istnieje potrzeba identyfikowania innych gatunków, z których te najczęściej izolowane z materiałów klinicznych od ludzi oraz ich cechy podano w tabeli 2.13.
Tabela 2.12. Różnicowanie izolowanych z przypadków klinicznych enterokoków z niektórymi paciorkowcami
Enterococcus
Paciorkowce grupy Bovis
Streptococcus pyogenes
Hemoliza
brak lub ? lub ?
brak lub ?
?
Antygen wielocukrowy C wg Lancefield
D
D
A
Wzrost i zaczernienie na agarze BE
+
+
-
Test PYR
+
-
+
Wzrost 6,5% NaCl
+
-
-
Tabela 2.13. Różnicowanie w obrębie rodzaju Enterococcus
E. faecalis
E. faecium
E. avium
E. casseliflavus
E. durans
E. gallinarum
E. raffinosus
Hemoliza
brak
lub ?
brak
lub ?
? lub brak
?
? lub ?
? lub ?
? lub brak
Antygen D wg Lancefield
+
+
+
+
+
+
+
Ruch
-
-
-
+
-
+
-
Rozkład mannitolu
+
+
+
+
-
+
+
Rozkład arabinozy
-
+
+
+
-
+
+
Dihydrolaza argininy
+
+
-
+
+
+
-
Żółte kolonie
-
-
-
+
-
-
-
Poszukiwanie do celów epidemiologicznych wieloopornych szczepów enterokoków w kale może być wykonywane przez posiew np. na podłoże agarowe z arabinozą z dodatkiem cefaleksyny i aztreonamu (Aneks I-17). Badanie takie (wymaz z odbytnicy) jest w niektórych szpitalach na świecie rutynowym postępowaniem w stosunku do nowo przyjmowanych do szpitala pacjentów. Szczególne niebezpieczeństwo stanowią bowiem szczepy oporne na wankomycynę (VRE - ang. vancomycin resistant enterococci). Nosicielstwo tych ostatnich, badane szeroko w USA, dotyczy aż kilku procent osób hospitalizowanych, które po przyjęciu do szpitala powinny być izolowane od pozostałych chorych.
Opisanych jest wiele genetycznych i molekularnych metod identyfikacji enterokoków. Metody te mogą być oparte na sekwencjonowaniu części genu 16S rRNA. W przypadku gatunków najczęściej izolowanych od ludzi przydatne są metody oparte na amplifikacji materiału genetycznego NAAT (ang. nucleic acid amplification tests) z zastosowaniem starterów skierowanych na ligazę D-Ala:D-Ala (ddlE. faecalis ddlE. faecium) oraz geny VanA, VanB i VanC. Opracowana jest też metoda MLSA wykorzystująca geny rpoA, pheS i atpA.
Ziarenkowce podobne do paciorkowców zależne pokarmowo od innych bakterii - NVS (ang. nutritionally variant streptococci)
Wśród podobnych do paciorkowców bakterii izolowanych z gardła i z dróg moczowych opisano grupę gatunków, które wykazują szczególne cechy. Wyrastają one satelitarnie wokół kolonii innych bakterii, co - jak się okazało - wynika z ich szczególnych potrzeb pokarmowych. Do wzrostu wymagają bowiem bogatej, złożonej pożywki wzbogaconej dodatkowo L-cysteiną lub chlorowodorkiem pirydoksalu. Drobniutkie kolonie są widoczne dopiero po 48 godzinach hodowli na tych pożywkach.
Pozycja taksonomiczna tych bakterii przez wiele lat była niejasna, klasyfikowano je wśród tzw. paciorkowców zieleniących. Obecnie zaliczono je do dwóch rodzajów: Abiotrophia i Granulicatella. Ziarenkowce te odgrywają istotną rolę w patologii człowieka, stanowiąc czynnik etiologiczny około 6% infekcyjnych zapaleń wsierdzia. Izolowano je także w przypadkach innych infekcji. Szczególnie ważne są gatunki Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens i G. elegans. Są one fenotypowo podobne i ich różnicowanie może się oprzeć na niewielu cechach: A. defectiva wytwarza ?- i ?-galaktozydazę, G. adiacens ?-glukuronidazę, a G. elegans dihydrolazę argininy. Cechy różnicujące te bakterie względem innych katalazoujemnych ziarenkowców gramdodatnich przedstawiono w tabeli 2.14.
Rodzaj Alloiococcus
Jedyny przedstawiciel tego rodzaju A. otidis jest często izolowany z płynu pobieranego w przebiegu tympanocentezy z ucha środkowego w przypadkach uporczywego, połączonego z wysiękiem zapalenia ucha u dzieci (OME - ang. otitis media with effusion). Ziarenkowce te mogą tam tworzyć mieszane biofilmy z Haemophilus influenzae i Moraxella catarrhalis. Uważa się, że skład mikrobiomu jamy nosowo-gardłowej ma decydujący wpływ na rozwój tej infekcji.
A. otidis są owalne i w preparatach tworzą dwoinki lub tetrady. Przypominają ziarenkowce paciorkowcopodobne Granulicatella, z którymi filogenetycznie klasyfikowane są do tej samej rodziny: Carnobacteriaceae, ale wyrastają na agarze z krwią, choć kolonie są widoczne dopiero po 48 godzinach w 37°C. Powodują hemolizę ?. Są tlenowcami, nie wyrastają w warunkach beztlenowych. Ważną wyróżniającą je cechą jest to, że tak jak gronkowce są katalazododatnie. Wyrastają w obecności 6,5% NaCl na agarze z żółcią i eskuliną. Wytwarzają pirolidonyloarylamidazę (test PYR +), arylamidazę leucyny oraz ?-galaktozydazę (ONPG), ale nie wytwarzają dihydrolazy argininy (Aneks P-17). Nie wytwarzają kwasu z wielu cukrów: w tym arabinozy, maltozy, mannozy, mannitolu, sorbitolu czy ramnozy. W identyfikacji można skorzystać z prób zawartych w API Strep.
Inne ziarenkowce paciorkowcopodobne
W materiałach klinicznych pochodzących od ludzi można czasem spotkać drobnoustroje podobne do paciorkowców. Mogą być obecne jako element mikrobiomu np. kobiecego mleka albo stanowić zanieczyszczenie środowiskowe. Są to zazwyczaj także katalazoujemne ziarenkowce z rodzajów Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc i Pediococcus. Bakterie tych rodzajów wyjątkowo mogą wywoływać infekcje oportunistyczne, a ich obecność w materiałach klinicznych jest zwykle przypadkowa. Istnieje niekiedy konieczność odróżnienia ich od rodzajów i gatunków uznanych za chorobotwórcze. Pomocne w tym mogą być cechy wskazane w tabeli 2.14.
Tabela 2.14. Niektóre cechy różnicujące katalazoujemne ziarenkowce gramdodatnie
Rodzaj
Morfologia komórek na podłożu płynnym
Wzrost 10°C
Wzrost 45°C
Test PYR
Naturalna wrażliwość na wankomycynę (krążek 30 ?g)
Antygen D wg Lancefield
Wzrost 6,5% NaCl
Gaz z glukozy
Abiotrophia
pary, krótkie łańcuszki
-
-
+
wrażliwe
-
-
-
Granulicatella
pleomorficzna, pojedyncze pary, łańcuszki
-
-
+
wrażliwe
-
-
-
Lactococcus
pary, czasem łańcuszki
+
-
V
wrażliwe
-
V
-
Aerococcus
pary i większe skupiska
V
-
+
wrażliwe
-
+
-
Gemella
pary, czasem łańcuszki
-
-
+
wrażliwe
-
-
-
Leuconostoc
łańcuszki, otoczki
+
V
-
oporne
- (65%)
V
+
Pediococcus
pary i większe skupiska
-
V
-
oporne
+ (95%)
V
-
Streptococcus
krótkie i długie łańcuszki
-
-
-
wyj.
S. pyogenes
wrażliwe
-
-
-
Enterococcus
pary, większe skupiska
+
+
+
wrażliwe
+
+
-
1EWOLUCJA, TAKSONOMIA, DIAGNOSTYKAEligia M. Szewczyk
Genom mikroorganizmów składa się z genów, które ulegają ewolucyjnym zmianom wynikającym z wymiany czy utraty lub pozyskania nowych sekwencji. Zawarte w nich informacje przekładają się na dziesiątki i setki cech wynikających z ekspresji kodowanych białek lub cząsteczek regulujących. Ewolucja dokonuje się dzięki dwóm podstawowym procesom: zmienności i selekcji. Zmienność dotyczy zawartego w komórkach DNA, a selekcja wybiera te cechy lub komórki, w których powstałe zmiany genotypu przyniosły korzystne w warunkach środowiskowych zmiany fenotypu.
Cechy wszystkich organizmów w dużej mierze są odbiciem struktury ich genomów i już za czasów Linneusza pozwalały na tworzenie porządkujących je systemów opartych na ich zewnętrznym podobieństwie, mających jednak źródło w ich wspólnym ewolucyjnym pochodzeniu. Z racji zastosowanych wtedy metod obarczone były one licznymi błędami. Współczesny system korzysta z narzędzi genetycznych, które pozwalają budować najbardziej wierne drzewa pokrewieństw, wywodzące współczesne organizmy od wspólnego przodka.
Zmienność genetyczna bakterii jest warunkowana procesami horyzontalnej wymiany genów (HGT - ang. horizontal gene transfer), transpozycją i mutacjami. Zmiany w DNA bakterii są na ogół łatwo zauważalne. Mogą to być jednak także drobne zmiany sekwencji nukleotydów, które gromadzą się w przebiegu ewolucji. Zmiany te, nie mając wpływu na ekspresję cech, stanowią informację dla taksonomów chcących ustalić pokrewieństwo między obecnie żyjącymi organizmami i wykazać dywergencję poszczególnych grup i gatunków w przebiegu ewolucji.
Przebieg lub raczej konsekwencje ewolucji odzwierciedlają drzewa podobieństw pokazujące filogenezę poszczególnych taksonów. Przełomem w badaniach pokrewieństwa prokariotów, ale i wszystkich organizmów żywych stało się porównywanie sekwencji małej podjednostki rybosomowego RNA (SSU - ang. small ribosomal subunit). W przypadku komórek prokatiotycznych jest to cząstka o stałej sedymentacji 16S pochodząca z podjednostki (30S) ich rybosomów. Takie rybosomy można jednak też znaleźć w plastydach roślin i mitochondriach zwierzęcych. Marker ten i jego funkcjonalny odpowiednik 18S rRNA rybosomów komórek eukariotycznych stanowią obecnie podstawowy znacznik ewolucji wspólny dla całego świata istot żywych. Znaczenie sekwencji SSU jako elementu wyznaczającego pokrewieństwo wynika przede wszystkim z jego bardzo powolnych ewolucyjnie przeobrażeń. Większość zmian w tej cząsteczce powstających na drodze mutacji uszkadza ją i eliminuje, a tylko nieliczne zachowują się, stanowiąc piętno istotne dla badań porównawczych. Sekwencje nukleotydów rRNA określa się jako skrajnie konserwatywne. Dla badań filogenetycznych jest to bardzo pożyteczna cecha. Można ją wykorzystać do konstruowania historii związków ewolucyjnych, gdyż zmiany w długim okresie zachodzą w możliwych do przewidzenia odstępach. Dlatego rRNA określa się mianem zegara molekularnego lub filogenetycznego chronometru. Badania filogenetyczne oparte na wynikach uzyskanych z użyciem tego nowego narzędzia stały się podstawą zasadniczych zmian w taksonomii organizmów. W 1977 roku na jego podstawie Woese i Fox wskazali na filogenetyczną odrębność prokariotycznych Archaea. Konsekwencją tego odkrycia była zmiana taksonomii na jej najwyższych piętrach. Zaproponowano utworzenie trzech domen: Archaea - obejmującej różne od bakterii właściwych organizmy prokariotyczne, Bacteria - bakterie właściwe i Eucarya obejmujące wszystkie organizmy zawierające w komórkach jądro. Podział ten stał się podstawą nowego spojrzenia na ewolucję, a w ślad za tym taksonomię, także taksonomię bakterii.
Podstawą taksonomii filogenetycznej stała się zatem struktura 16S rRNA, którego chromosomowym odpowiednikiem jest rDNA. Na podstawie tych sekwencji oraz świadczących o pokrewieństwie wyjątkowych polimorfizmów typu insercji lub delecji - CSI (ang. conserved signature insertions/deletions) zasugerowano drogę ewolucyjną poszczególnych współczesnych grup drobnoustrojów. Rodzaj wydzielonych grup i kolejność ich oddzielania się od pnia przodka przedstawiono schematycznie w tabeli 1.1. Pokazuje ona, że najdawniej, zaraz po Archaea wyodrębnioną grupą, a zatem grupą ewolucyjnie bardzo starą, są bakterie gramdodatnie o małej zawartości guaniny i cytozyny w DNA (G + C mol%): Firmicutes, a wśród nich ważne w mikrobiologii medycznej rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium i wiele innych. Nieco młodsze są bakterie gramdodatnie o dużej zawartości G + C (Actinobacteria). Po wyodrębnieniu Spirochaetes przyszła dopiero kolej na wielką grupę pałeczek gramujemnych, a wśród nich beztlenowe Bacteroides czy Prevotella w obrębie Bacteroidetes. Filogenetycznie najmłodsze są Proteobacteria, obejmujące między innymi ?-Proteobacteria, do których zaliczane są na przykład pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae i wiele innych pałeczek, często izolowanych od ludzi.
Tabela 1.1. Dywergencja grup drobnoustrojów w przebiegu ewolucji (wg Gupty i wsp.)
Taksonomia prokariotów jako dyscyplina zbierająca dane dotyczące klasyfikacji, nomenklatury i opisu tej grupy organizmów jest dziedziną otwartą. Nie ma przyjętego oficjalnego systemu, którym należałoby się kierować, a tworzone listy są wypadkową licznych danych bioinformatycznych. Uzgodniono jednak, że podstawą obecnej taksonomii są sekwencje SSU. Nowe techniki badawcze przynoszą rocznie wiele setek tysięcy nowych sekwencji tego fragmentu. Liczba zdeponowanych w bazach danych SSU organizmów prokariotycznych przekroczyła już cztery miliony i przyrasta w sposób logarytmiczny. Napływ nowych danych tworzy problemy, do których należy ich wiarygodność i znaczenie dla badania filogenezy i tworzenia taksonomii. Największą wartość mają sekwencje o długości większej niż 1400 nukleotydów, w których udział dwuznacznych miejsc byłby mniejszy niż 4%, a brakujących pozycji nie byłoby więcej niż 10, gdyż poziom konserwatywności tego fragmentu jest różny w różnych jego regionach. Jednak zaledwie 23% zdeponowanych sekwencji SSU jest dłuższych niż 900 bp.
Podkreśla się, że opisy taksonomiczne muszą obejmować wysokiej jakości sekwencje SSU, ale też sekwencje pełnego genomu, obejmujące nie mniej niż 99% jego długości, określone najwyżej w kilku segmentach. Podstawą rekonstrukcji genealogicznych muszą być zestawy genów konserwatywnych w obu tych źródłach. Liczba poznanych sekwencji genomów prokariotycznych przekroczyła już wprawdzie 150 tysięcy, ale w większości są one zaledwie częściowe. Niemniej daje to pole dla systemów bioinformatycznych wyszukujących podobieństwa i różnice. Badania takie pozwalają znajdować inne niż rDNA konserwatywne fragmenty, które można wykorzystywać do ustalania zależności między organizmami na różnych poziomach taksonomicznych. Większe zróżnicowanie genetyczne badanego genu czy fragmentu (mniejsza konserwatywność) stwarza możliwość wykorzystania go na niższym poziomie taksonomicznym. Sekwencje, które okazały się szczególnie przydatne, to odcinki międzygenowe, pseudogeny oraz geny kodujące niektóre białka komórkowe, które w procesie ewolucji szybciej niż rDNA ulegały zmianom. Niektóre z nich wymieniono w tabeli 1.2.
Tabela 1.2. Niektóre białka o konserwatywnych sekwencjach przydatne w ustalaniu filogenetycznych związków bakterii
Białka szoku termicznego Hsp 70, Hsp 60, Hsp 75
Syntaza alanylo-tRNA
Syntaza asparaginylo-tRNA
Dehydrogenaza glutaminianowa
CTP syntaza
Hydrolaza pirofosforanu (PPaza)
Podjednostki polimerazy RNA (RpoB, RpoC, RpoD)
Czynniki elongacyjne: EF 1? /Tu, EF-Tu, Ef-G/2
Białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12
Gyrazy GyrA, Gyr B
Białko uczestniczące w rekombinacji i naprawie DNA RecA
Na podstawie sekwencji SSU określane są granice taksonomiczne dla taksonów wyższych niż gatunek. Zmienność drobnoustrojów postępuje zaskakująco szybko, stąd drzewa filogenetyczne na niższych poziomach taksonomicznych są bardzo złożone, a nawet trudne do wykreślenia. Przyczyną tego jest horyzontalna wymiana genów (HGT) zachodząca nie tylko w obrębie szczepów czy gatunków, ale także rodzajów, a czasem bardziej odległych filogenetycznie taksonów. Obok procesów rekombinacyjnych związanych z koniugacją, transformacją czy transdukcją wymiana genów między bakteriami dokonuje się także przez czynniki fagopodobne GTA (ang. gene transfer agents) czy też przez nanorurki (ang. nanotubes). Ocenia się, że w przebiegu ewolucji prawie wszystkie geny zostały dotknięte horyzontalną wymianą ich fragmentów, a między niektórymi rodzajami zjawisko powtórzyło się do kilkuset razy. Zapewne z tego powodu tak trudne jest zdefiniowanie pojęcia gatunku bakterii. Powinna to być kategoria opisująca monofiletyczną, zwartą genetycznie, podobną i wyposażoną w odróżniające cechy grupę izolatów. Jednak wyznaczenie mierzalnych parametrów do jej opisu zależy od przyjętej perspektywy i dlatego definicja ta, w przypadku bakterii, jest bardzo niedoskonała. Obecne w SSU zmiany powstałe na przestrzeni czasu okazały się zbyt małe, by narzędzie to stało się wystarczająco dyskryminacyjne w przypadku niższych taksonów i przydatne w rutynowej diagnostyce w identyfikacji "do gatunku" czy "do wirotypu". Na tym poziomie sekwencja ta, jako jedyna cecha, pomocna jest w genetycznej identyfikacji tylko nielicznych bakterii.
Mimo trudności, jakie dotyczą organizmów prokariotycznych, konieczne było stworzenie definicji gatunku. Przyjęto kryteria, które określają, że jest nim grupa szczepów (w tym jeden uznany za szczep wzorcowy), które łączy przynajmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA wykazanego na drodze DDH (hybrydyzacja DNA-DNA). Różnica temperatur topnienia (?Tm) hybrydy badanej i w pełni homologicznej wyniesie wtedy 5°C lub będzie niższa. Wobec dużego usprawnienia techniki sekwencjonowania kryterium to bywa zastępowane przez łatwiejsze do wykazania ANI (ang. average nucleotide identity), podobieństwo genów wspólnych, ortologów. Wykazano, że podobieństwo na poziomie 96% ANI odpowiada homologii 70% DDH. W 2006 roku podwyższono wymagany próg identyczności sekwencji 16S rRNA z 97% do 98,7%. U wielu gatunków znaczenie ma udział zasad G + C w DNA genomu; dopuszcza się różnice wśród szczepów w obrębie gatunku o nie więcej niż 3 mol%. Zakłada się, że cecha ta w obrębie rodzaju może różnić gatunki tylko o 10 mol%, ale są rodzaje, jak na przykład Rickettsia, w których odsetek ten jest niższy. W definicji gatunku bierze się jednak także pod uwagę podobieństwo genów kodujących cechy podstawowego metabolizmu komórkowego (ang. housekeeping genes) i innych charakterystycznych dla określonej grupy drobnoustrojów cech genotypowych. Odpowiednio dobrane sekwencje dostarczają dodatkowych ważnych markerów molekularnych do identyfikacji bakterii wielu grup. Jednak muszą być one specyficzne dla każdego gatunku. Do celów diagnostycznych należy bowiem wybrać te geny, które należą do rdzenia pangenomu danego gatunku. Pangenom jest zbiorem wszystkich genów obecnych w genomach ogółu szczepów tworzących gatunek. Jest on wielokrotnie większy niż genom każdego z nich. Dlatego znalezienie wystarczająco dyskryminacyjnych sekwencji wspólnych jest nieraz trudnym zadaniem.
Budowanie taksonomii może się opierać na dwóch podstawowych systemach: systemie filogenetycznym badającym pokrewieństwo na podstawie cech najwcześniej wyrażonych w ewolucji (kladystyka), ale i fenetycznym bazującym na cechach obecnie prezentowanych fenotypowo. We współczesnej taksonomii znajdują swoje miejsce oba te systemy. W podziałach kladystycznych dokonuje się wyboru cech, nadając im różną wagę i rangę, w podejściu fenetycznym (numerycznym) rozpatruje się bardzo liczną grupę cech, nadając im jednakową rangę i poddając wyniki analizie matematycznej. Taksonomia numeryczna wykorzystuje wiele fenotypowych cech drobnoustrojów, buduje na ich podstawie dendrogramy i wylicza w analizie numerycznej współczynniki podobieństwa poszczególnych szczepów. Leży ona u podstaw handlowych testów obejmujących zestawy prób biochemicznych do identyfikacji różnych grup bakterii, np. systemu API.
Największą liczbę dostępnych danych analizuje się w taksonomii polifazowej, która zakłada integrację danych pochodzących z analizy filogenezy oraz cech genotypowych i fenotypowych identyfikowanego organizmu (tab. 1.3). Jest to taksonomia zmierzająca do uzyskania konsensusu wynikającego z porównywania tych wszystkich cech. Przytoczona tu tabela autora tego systemu nie zawiera jeszcze, jako źródła informacji taksonomicznej, pełnej sekwencji genomowego DNA, ale zdaniem wielu badaczy będzie ona dołączona i zastąpi część wskazywanych pierwotnie przez Vandamme'a cech charakteryzujących materiał genetyczny.
Tabela 1.3. Cechy i metody badawcze uwzględniane w taksonomii polifazowej (zmodyfikowane wg Vandamme'a)
DNA genomowy
mol% G + Cwzory restrykcyjne (RFLP, PFGE) wielkość genomu hybrydyzacja DNA-DNAANI
Segmenty DNA
fingerprinting oparty na PCR: rybotypowanie, ARDRA, RAPD, AFLP sondy genetyczne sekwencjonowanie DNA
RNA
sekwencjeprofile masy cząsteczkowej
Białka
wzory elektroforetyczne: białka komórkowe; białka ściany wzory elektroforetyczne izoenzymów
Markery chemotaksonomiczne
komórkowe kwasy tłuszczowekwasy mykolowehydrofobowe łańcuchy boczne lipidów: izoprenoidy i kwasy tłuszczowe i ich estry
lipidy polarne membrany cytoplazmatycznejbenzochinony i naftochinony (menachinony) poliaminy kowalencyjnie wiązane z peptydoglikanem elementy ściany komórkowej, peptydoglikan wielocukry zewnątrzkomórkowe
Cechy fenotypowe
morfologia cechy biologicznemetabolizm (w systemach numerycznych) enzymologia (zymogramy) budowa antygenowa
RFLP - ang. restriction fragment lenght polymorphism; PFGE - ang. pulsed-field electrophoresis; AFLP - ang. amplified fragment length polymorphism; RAPD - ang. random amplified polymorphic DNA; ARDRA - ang. amplified ribosomal DNA restriction analysis.
Aktualnie strategia postępowania identyfikacyjnego nieznanego szczepu rozpoczyna się od oceny wyniku badania MALDI-TOF MS (ang. matrix-assisted-laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry), następnie obejmuje analizę podobieństwa sekwencji 16S rRNA na poziomie 98,7%, a w przypadku odmienności sięga się po porównanie identyczności sekwencji ortologów i/lub sekwencjonowanie. Ocena szeregu cech fenotypowych i charakterystyka chemotaksonomiczna dopełniają schematu badania. Postępowanie to może pozwolić na zakwalifikowanie badanego szczepu do gatunku już znanego lub na opisanie nowych gatunków, jak to było w przypadku dołączonego do LPSN (ang. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) w 2014 roku Enterobacter massiliensis.
Według przyjętej obecnie zasady SSSD (ang. single strain species description) w obrębie każdego gatunku jeden szczep stanowi zawsze wzorzec (ang. type strain) - jest to zazwyczaj izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (szczep referencyjny, typowy). Szczepy takie są przechowywane i odpłatnie udostępniane z kolekcji muzealnych. Do największych należą: kolekcja amerykańska ATCC - American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA; kolekcja czeska CNCTC - Czech National Collection of Type Cultures, National Institute of Public Heath, Praha; niemiecka DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; szwedzka CCUG - Culture Collection, University of Göteborg czy JCM - Japan Collection of Microorganisms. Polska Kolekcja Drobnoustrojów PCM - Polish Collection of Microorganisms, znajdująca się w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, dysponuje dużą kolekcją szczepów bakterii i bakteriofagów i ma status IDA (ang. International Depositary Authority), źródła szczepów do celów patentowych.
Nazwanie gatunku na podstawie opisu pojedynczego szczepu, a tym samym podejście, w którym także opis gatunku opiera się na cechach, jakie demonstruje ten szczep wzorcowy, jest jednak obecnie krytykowane. Wydaje się, że już w niedalekiej przyszłości podstawą klasyfikacji drobnoustrojów może się stać zapis pełnej sekwencji genomów wielu szczepów danego gatunku oraz wyniki bardziej zaawansowanych technik molekularnych. Obserwujemy bowiem ogromny postęp w metodach badawczych określanych mianem OMICS (od końcówek angielskich nazw: proteomics, transcryptomics czy culturomics). Dysponujemy także wysokowydajnymi systemami chemotaksonomicznymi, takimi jak np. MALDI-TOF MS lub ICP-FT MS (ang. high field ion cyclotron fourier transform mass spectroscopy), które mogą zbadać wiele szczepów określonego taksonu i w konsekwencji lepiej pokazać zróżnicowanie wewnątrz- i międzygatunkowe. Duże znaczenie przypisywane jest włączaniu najnowszych metod porównawczych stosowanych w badaniach metabolomicznych. Podkreśla się, że potrzebne są nowe zasady pozwalające na wskazanie tych szczególnych właściwości, które odróżnią nowy takson od jemu pokrewnych.
Klasyfikacja bakterii, zdaniem wielu badaczy, musi korzystać z licznych narzędzi badawczych, szczególnie wówczas, gdy ma służyć identyfikacji lub opisowi nieznanych gatunków. Mimo ogromnej liczby nowych, nieznanych sekwencji 16S rRNA deponowanych w bazach danych, rocznie opisuje się znacznie mniej nowych gatunków. Wprowadzenie nowego gatunku na listę drobnoustrojów wymaga bowiem, obok opublikowania w NCBI nieznanej dotychczas sekwencji ich małej podjednostki RNA (SSU), także wskazania miejsca izolacji oraz podania charakterystyki fenotypowej różnicującej go od gatunków już znanych, co wymaga jego hodowli. Przeprowadzana jest też analiza nowej nazwy, trzeba też wskazać miejsca zdeponowania szczepu wzorcowego w kolekcjach. Opis tego gatunku musi być zaakceptowany przez grono redakcyjne i opublikowany jako pełnotekstowa praca w International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Oczekuje się także, chociaż obecnie zrealizowano to zaledwie w przypadku kilkuset gatunków, wskazania miejsca dostępu do pełnej sekwencji jego genomu. Coraz częściej sugeruje się, że także sam DNA wyekstrahowany z tych bakterii powinien być, podobnie jak wzorcowe szczepy, deponowany w kolekcjach dostępnych publicznie.
Kontrowersyjną kwestią, która coraz częściej pojawia się w dyskusjach, jest stworzenie zasad klasyfikacji tych drobnoustrojów, których obecność i odrębność od tych już poznanych jest stwierdzona jedynie na podstawie sekwencji ich DNA. Są to sekwencje najczęściej wykryte w badaniach metagenomicznych. Bakterie te, jeśli nie udało się ich wyhodować, są obecne jedynie jako dane in silico. Mamy świadomość, że spośród mikroorganizmów obecnie żyjących na ziemi umiemy wyhodować zaledwie 1-2%. Mimo rozwoju nowych technik, dzięki dziedzinie nazwanej kulturomika, z pewnością długo jeszcze nie będziemy umieli namnożyć ich tak, by zbadać właściwości wszystkich tych, których sekwencje 16S rRNA zostały poznane. Tym samym nie będziemy mogli spełnić kryteriów niezbędnych obecnie do opisania ich jako nowych gatunków. Wydaje się jednak, że wciągnięcie ich do odpowiednio zbudowanego systemu klasyfikacji jest potrzebne, a więc nieuchronne. Do spisu gatunków prokariotów zawartego w LPSN już obecnie dołączono nazwy poprzedzone słowem Candidatus. Są to nowe nazwy przyjęte dla szczepów wzorcowych, które jeszcze nie spełniają wszystkich warunków przyjętych jako niezbędne do zaakceptowania ich jako nowego gatunku, ale wiedza o nich, zwykle przede wszystkim pochodząca z analizy genomu, jest już bardzo duża.
Współpraca różnych grup badawczych i jednostek naukowych tworzących bazy gromadzące sekwencje mikroorganizmów i konstruujących na ich podstawie drzewa podobieństw pozwoliła na tworzenie projektów scalających otrzymywane przez nie dane. Obecnie, w 2018 roku, wiodącym projektem jest, obok baz NBCI i Greengenes, projekt LTP - The All-Species Living Tree' Project. Trzeba jednak podkreślić, że nie istnieje żadna oficjalna klasyfikacja organizmów prokariotycznych. Potrzeba tworzenia systemów porządkujących ich zbiór jest jednak oczywista. Obecnie najbogatszym i uaktualnianym źródłem wskazującym na pokrewieństwo i bogactwo poszczególnych jednostek taksonomicznych jest utworzona przed 20 laty przez profesora J. Euzeby'ego internetowa lista LPSN powszechnie dostępna na stronie www.bacterio.net. Jest na niej obecnie ponad piętnaście tysięcy sześćset gatunków i prawie sześćset podgatunków bakterii. Ostatnia znacząca aktualizacja drzewa pokrewieństw została sporządzona w lipcu 2018 roku (www.bacterio.net/-classifphyla.html). Połączono w niej dane dostarczone przez Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea (TOBA) taksonomii NCBI (National Centre for Biotechnology Information), Taxonomic Outline of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology oraz sugestie LTP (Living Tree Project). Obejmuje ona 2 domeny, 39 typów, 89 klas i 1 podklasę, 197 rzędów i 20 podrzędów, 446 rodzin i 2857 rodzaje. W tabeli 1.4 zawarte są wszystkie dotychczas nazwane najwyższe taksony obecne na tej liście klasyfikacyjnej. W stosunku do wersji z 2012 roku pokazanej w poprzednim wydaniu tej książki jest ona wyraźnie liczniejsza. Wiele jednak wyższych jednostek systematycznych pozostaje nienazwanych. Wydzielono je jednak, bo genetyczna charakterystyka zaliczonych do nich gatunków wskazuje na ich odmienność, co powoduje, że nie mieszczą się w innych nazwanych jednostkach. Pokazuje to, jak bardzo dynamiczny jest obecnie proces tworzenia klasyfikacji prokariotów. Po opisy poszczególnych jednostek taksonomicznych LPSN kieruje do bazy internetowej, e-książki, jaką jest Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (BMSA).
W tabeli 1.4 widać, jaki, w gruncie rzeczy niewielki, udział w świecie organizmów prokariotycznych mają bakterie o uznanej chorobotwórczości dla ludzi i zwierząt stanowiące obiekt zainteresowania rutynowej diagnostyki bakteriologicznej. Znacznie obszerniejsza, obejmująca więcej klas jest obecnie lista tych prokariotów, które wykryto w organizmie człowieka w czasie badań ludzkiego mikrobiomu, a których obecności nie wiąże się z chorobami infekcyjnymi. O mikrobiomie człowieka mowa jest w rozdziale 22 tej książki.
Żaden z systemów taksonomicznych nie jest pozbawiony wad. Żaden też nie może być uznany za ostateczny i zamknięty. Obecnie przyjęty system oparty na szkielecie, jakim jest SSU, uzupełniany jest wynikami uzyskiwanymi innymi metodami molekularnymi, obejmującymi inne markery oraz dane uzyskiwane w wyniku sekwencjonowania. Niekiedy jednak otrzymywane w ten sposób dane nie w pełni pokrywają się z wynikami uzyskiwanymi przez analizę cech fenotypowych. Trzeba pamiętać, że geny wyznaczają jedynie potencjalne możliwości komórek, a środowisko bytowania wymusza naturalną selekcję będącą podstawą ich ewolucji. Dlatego tylko analiza wielu cech, w tym szeroko pojętego fenotypu, która pozwala na stworzenie całościowego (holistycznego) obrazu, szczególnie najniższych jednostek taksonomicznych: gatunków i podgatunków, daje szansę na ich precyzyjne sklasyfikowanie.
Każdy proces diagnostyczny prowadzony w laboratorium klinicznym zaczyna się od wyznaczenia kierunku badań. Trzeba określić, jakie mikroorganizmy znajdują się w przesłanym materiale pobranym od pacjenta, w jakiej są proporcji i które z nich należy uznać za czynnik etiologiczny infekcji. To trudne zadanie, w którego rozwiązaniu biorą udział różne osoby: lekarz kierujący próbkę do badania i mikrobiolodzy - diagności wykonujący badanie. W przypadku próbek klinicznych istotna jest znajomość patogenezy chorób i metod diagnostycznych, które pozwolą na szybkie otrzymanie wyniku. Nie jest obecnie możliwe rutynowe zastosowanie metod metagenomiki do badania każdej pobranej próbki. Tylko takie badanie określiłoby, na podstawie zawartego w niej DNA, pełną różnorodność będących w niej drobnoustrojów, ich liczebność i proporcje, a także obecność genów toksyn czy oporności. Wskazuje się jednak na możliwość nieodległego w czasie zastosowania sekwencjonowania nowej generacji (NGS) połączonego z opartymi na odpowiednich algorytmach systemami opracowania otrzymywanych danych.
Tabela 1.4. Wyższe taksony organizmów prokariotycznych obecne w klasyfikacji LPSN w 2018 r.
Domeny
Typy (Phylum)
Liczba nazwanych klas
Typy obejmujące uznane patogeny człowieka
Archaea
Crenarchaeota
1
Euryarchaeota
8
Korarchaeota
-
Nanoarchaeota
-
Thaumarchaeota
1
Bacteria
Acidobacteria
3
Actinobacteria
6
??
Aquificae
1
Armatimonadetes
2
Bacteroidetes
6
??
Balneolaeota
1
Caldiserica
1
Calditrichaeota
-
Chlamydiae
1
??
Chlorobi
3
Chloroflexi
7
Chrysiogenetes
1
Cyanobacteria
-
Deferribacteres
1
Deinococcus-Thermus
1
Dictyoglomi
1
Elusimicrobia
1
Fibrobacteres
3
Firmicutes
7
??
Fusobacteria
1
Gemmatimonadetes
2
Kiritimatiellaeota
1
Lentisphaerae
2
Nitrospira/Nitrospirae
1
Planctomycetes/Planctobacteria
2
Proteobacteria
7
??
Rhodothermaeota
1
Spirochaetes/Spirochaetae
1
??
Synergistetes
1
Tenericutes
1
??
Thermodesulfobacteria
1
Thermotogae
1
Verrucomicrobia
3
Obecnie w zdecydowanej większości przypadków opieramy się na metodach hodowlanych, przynajmniej w początkowym etapie badania. Diagnostyka bakteriologiczna polega na izolacji, wyborze i określeniu cech komórek drobnoustrojów zawartych w próbce. Zastosowanie w niej coraz to nowych i coraz doskonalszych technik badawczych pozwala na osiągnięcie celu, jakim jest bezbłędne przyporządkowanie ich do właściwego taksonu oraz określenie profilu jego wrażliwości na leki. W powszechnym użyciu są systemy biochemiczne wykorzystujące metody turbidymetryczne i kolorymetryczne zarówno manualne, jak i coraz bardziej zautomatyzowane. Różne modele aparatów pozwalają na jednoczesne badanie wielu próbek i otrzymywanie wyników nawet już po kilku godzinach od pobrania. Coraz powszechniej stosowane są metody spektrofotometryczne, przede wszystkim wspomniana wcześniej MALDI-TOF MS. W tym systemie jonizacja całych komórek mikroorganizmów z użyciem promieniowania laserowego i przyspieszenie ruchu powstałych cząstek w próżni w polu elektrycznym pozwalają na uzyskanie wzorów białkowych - wysokospecyficznych, spektrofotometrycznych profili molekularnych. Niezwykła szybkość tego oznaczenia ograniczona nawet do 10 minut oraz dostępność specjalnie przystosowanych do tych oznaczeń aparatów stawiają je obecnie na czele wysokoprzepływowych technik wskazywanych do wykorzystania w rutynowej praktyce. Proponowane są także metody elektromigracji oparte na specyfice biopolimerów powierzchniowych komórek bakteryjnych, których różnorodność pozwala na traktowanie ich jako biokoloidów charakterystycznych dla danego gatunku. W przypadku niektórych materiałów bardzo pomocne są metody immunomikroskopowe. W rutynowych postępowaniach diagnostycznych wykorzystywane są także metody molekularne poszukujące w zawartych w próbce kwasach nukleinowych określonych, charakterystycznych dla patogenów sekwencji, w tym różne warianty techniki PCR czy amplifikacji w stałej temperaturze. Metody te i ich obecne wykorzystywanie opisane są w rozdziale 38 tej książki. Poszukiwania nowych metod trwają, gdyż cel, czyli pewność i jednoznaczność identyfikacji, jak najkrótszy czas jej uzyskania, a także jak najniższe koszty dla wielu taksonów ciągle nie są osiągnięte.
Stosowane nawet najnowsze metody diagnostyczne, mimo czasem entuzjastycznych opinii pojawiających się w literaturze, często zawodzą, a przyczyn tego stanu jest wiele. Bezpośrednie badanie materiałów klinicznych, nawet takich, w których nie należy się spodziewać różnorodności bakterii, jest trudne do zrealizowania. Zastosowanie zaawansowanych metod najczęściej wymaga oczyszczania materiałów klinicznych, co wydłuża nawet najkrótszą procedurę. W przypadku badania MALDI-TOF MS wykonywanego np. bezpośrednio z krwi trzeba usunąć białka inne niż drobnoustrojowe. Obiecujące proste techniki molekularne szybko wykryją w mieszaninie różnych kwasów nukleinowych DNA poszukiwanych patogenów, ale nie dają pewności, że pochodzi on z żywych bakterii odpowiedzialnych za właśnie toczącą się infekcję.
W większości technik pierwszym i najtrudniejszym etapem jest wskazanie, które z obecnych w materiale klinicznym bakterii są rzeczywistym czynnikiem etiologicznym. Wiedza, jaką przyniosły ostatnie lata, pokazująca, jak liczne i różnorodne bakterie zasiedlają ciało człowieka, każe z jeszcze większym zastanowieniem o tym decydować. Diagnosta-mikrobiolog względnie łatwo podejmie decyzję, znajdując w materiale klinicznym bezwzględne patogeny, jednak wiele infekcji ma charakter mieszany, a najwięcej bakterii izolowanych w laboratoriach, uznawanych za przyczynę infekcji, stanowią patogeny oportunistyczne, które równie dobrze mogą być w badanej próbce składnikiem mikrobiomu obecnego w stanie zdrowia.
W rutynowych procedurach laboratoryjnych badanie próbki pochodzącej od pacjenta zaczyna się więc najczęściej posiewem na odpowiednie podłoża stałe. Ważna jest, a w przypadku niektórych materiałów podstawowa, liczba kolonii powstałych w wyniku tego posiewu, ale i różnorodność bakterii pozostających w próbce w mniejszości. Dobra decyzja diagnosty co do rodzaju podłoża, a potem ocena wyniku posiewu decyduje o dalszym postępowaniu. Ten etap jest najtrudniejszy do wykonania i musi trwać kilka, a najczęściej kilkanaście godzin. Dalszy etap: wybór techniki identyfikacji bakterii zależy zwykle od profilu i wyposażenia laboratorium. Nowoczesne techniki biochemiczne i spektrofotometryczne mają wiele ograniczeń, jednak wydaje się, że największym ograniczeniem jest wielkość i konstrukcja baz danych, na których podstawie odczytywane są wyniki. Automatyczne techniki biochemiczne prawidłowo identyfikują wprawdzie około 80% bakterii, ale, jak podkreśla się w badaniach, pewność identyfikacji dotyczy tylko ich rodzaju. W przypadku MALDI-TOF MS, mimo że niektóre bazy obejmują nawet cztery tysiące gatunków, nierzadkie są sytuacje, gdy wynik identyfikacji rozdziela prawdopodobieństwo przyporządkowania między dwa, a czasem i trzy gatunki. Przyczyna tkwi zapewne w przedstawionej wyżej zasadzie identyfikacji gatunków na podstawie SSSD. Wobec bogactwa pangenomów wielu gatunków zasada ta może prowadzić do błędów. W przypadku metod molekularnych tak często wskazywanych jako szybkie i bardzo czułe przeszkodą jest właśnie owa czułość, która pozwala wykryć w materiale klinicznym DNA patogenu długo po tym, jak już w organizmie nie ma żywych komórek. Podkreśla się też niebezpieczeństwo wykrycia zanieczyszczeń pochodzących z pobierania, transportu czy procedur badawczych i oparcia diagnozy na takim właśnie wyniku.
Szeroka wiedza mikrobiologa prowadzącego badanie diagnostyczne w postępowaniu klinicznym ma istotne znaczenie. Brak wskazania patogenu i określenia profilu jego wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe prowadzi do terapii empirycznej, zwykle szerokowidmowej, w konsekwencji generującej wielooporność i niszczenie naturalnego mikrobiomu pacjenta.
We współczesnej diagnostyce bakteriologicznej wykorzystywane są różne narzędzia pozwalające na identyfikację bakterii na różnym poziomie ich klasyfikacji. Najbardziej pożądana jest identyfikacja do gatunku, a w dochodzeniach epidemiologicznych identyfikacja szczepu. Wyższe poziomy klasyfikacyjne rzadko są przedmiotem rutynowego zainteresowania mikrobiologów praktyków, chociaż z pewnością będą wykorzystywane, gdy powszechne stanie się diagnozowanie dysbiozy, ważne w chorobach nieinfekcyjnych. W tej książce na początku każdego rozdziału przedstawiono przynależność taksonomiczną każdego z opisanych rodzajów. Obecny tu podział na rozdziały daleki jest jednak od podziałów ściśle opartych na podobieństwie filogenetycznym. Nie ma on bowiem w diagnostyce tak wielkiego znaczenia, jak przy tworzeniu taksonomii. Wyznaczone rozdziałami grupy drobnoustrojów charakteryzuje wiele cech wspólnych, istotnych dla diagnosty, lekarza i epidemiologa.
