1Wprowadzenie
W roku 1903 urodzony we Włoszech Michał Siemionowicz Cwiet (z matki Włoszki i ojca z Ukrainy), pracujący w Katedrze Botaniki Uniwersytetu Warszawskiego, rozdzielił barwniki roślinne, wykorzystując zjawisko adsorpcji w kolumnie wypełnionej różnymi substancjami (m.in. węglanem wapnia). Po ekstrakcji za pomocą rozpuszczalników uzyskiwał wyraźnie rozdzielone strefy. W celu opisania tego zjawiska greckimi słowami oznaczającymi "barwę" (grec. ?????) i "zapis" (grec. ?????) utworzył nowe słowo - "chromatografia", oznaczające dosłownie "zapisywanie barw" [1]. Cwiet zmarł w roku 1919 w Woroneżu (Rosja) i gdyby jeszcze za jego życia odkrycie to zostało docenione, zapewne zostałby laureatem Nagrody Nobla.
Obecnie metody chromatograficzne, ze względu na możliwości szybkiego rozdzielania i oznaczania analitów także w próbkach o złożonych matrycach, należą do najbardziej rozpowszechnionych metod instrumentalnych w chemii analitycznej. Różnymi metodami chromatograficznymi można rozdzielać i analizować składniki polarne i niepolarne; kwasowe, obojętne i zasadowe; organiczne i nieorganiczne oraz monomery, oligomery i polimery. W zależności od właściwości fizykochemicznych badanej próbki i jej składników do ich rozdzielania należy zastosować odpowiedni rodzaj chromatografii. Metody chromatograficzne są powszechnie stosowane zarówno na skalę preparatywną, jak i analityczną, a chromatografy gazowe i cieczowe są najbardziej rozpowszechnionymi na świecie przyrządami analitycznymi.
Wpływ chromatografii na rozwój nauki jest niepodważalny [2], a za prace związane z metodami chromatograficznymi wielokrotnie przyznawano Nagrody Nobla. Wykaz laureatów tych nagród, którzy w swoich pracach zajmowali się teorią i zastosowaniami metod chromatograficznych, podano w tab. 1.1.
Tabela 1.1. Wybrani laureaci Nagrody Nobla, których prace były związane z metodami rozdzielania
Rok przyznania nagrody
Laureaci
Kraj pochodzenia laureata
Tematyka badawcza
1915
Richard Matrin Willstätter
Niemcy
badania barwników w roślinach, w szczególności chlorofilu
1937
Walter Norman Haworth
Paul Karrer
Anglia, Szwajcaria
badania karotenoidów
i witamin
1939
Adolf Friedrich Johann Butenandt,
Leopold Ružička
Niemcy, Szwajcaria
badania polietylenów, terpenów i hormonów
1948
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
Szwecja
zastosowania metod chromatograficznych
i elektroforezy kapilarnej
1951
Edwin Mattison McMillan
Glenn Theodore Seaborg
USA
rozdzielanie pierwiastków promieniotwórczych
1952
Archer John Martin
Richard Laurence Synge
Wielka Brytania
chromatografia podziałowa
1955
Vincent du Vigneaud
USA
badania hormonów
1958
Frederick Sanger
Wielka Brytania
badania insuliny
i aminokwasów
1961
Melvin Calvin
USA
badania mechanizmów fotosyntezy
1970
Luis Federico Leloir
Argentyna
biosynteza węglowodanów
1972
Moore Standford
Christian Anifinsen
William Howard Stein
USA
badania RNA metodami separacyjnymi
1980
Paul Berg
Walter Gilbert
Frederic Sanger
USA
badania biochemiczne kwasów nukleinowych
2008
Osamu Shimoura
Matrin Chalfie
Roger Tsien
USA
odkrycie białka zielonej fluorescencji
2018
Frances Arnold
George Smith
Gregory Winter
USA
opracowanie metody fagowej do peptydów i przeciwciał
Polscy uczeni mieli i mają znaczący wkład w rozwój metod i technik chromatograficznych. Spośród nich warto w tym miejscu wymienić takie postaci jak profesorowie: Andrzej Waksmundzki, Zdzisław Suprynowicz, Edward Soczewiński, Zygfryd Witkiewicz, Bogusław Buszewski, Rajmund Dybczyński, czy twórca chromatopolarografii prof. Wiktor Kemula.
Chromatografię można zdefiniować jako fizykochemiczną metodę rozdzielania mieszanin w wyniku ich podziału pomiędzy fazę ruchomą i nieruchomą. Istnieje kilka sposobów podziału chromatografii i technik chromatograficznych. Jeżeli fazą ruchomą jest gaz, to mówimy o chromatografii gazowej (GC - ang. Gas Chromatography), a gdy jest nią ciecz, to o chromatografii cieczowej (LC - ang. Liquid Chromatography). Jeżeli fazą ruchomą jest płyn w stanie nadkrytycznym, to taki rodzaj chromatografii nazywamy chromatografią nadkrytyczną (SFC - ang. Supercritical Fluid Chromatography). Inny sposób podziału chromatografii oparty jest na rodzaju fazy stacjonarnej. Jeżeli jest nią ciało stałe (adsorbent), to dotyczy to chromatografii adsorpcyjnej, a jeżeli jest nią ciecz, to chromatografii podziałowej.
Chromatografię można również podzielić na chromatografię kolumnową (z fazą nieruchomą umieszczoną w kolumnie) i chromatografię planarną (z fazą nieruchomą umieszczoną na płaszczyźnie). Najczęściej stosowaną odmianą chromatografii cieczowej jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - ang. High Performance Liquid Chromatography). Metodą chromatografii gazowej można rozdzielać i analizować około 20 % znanych związków chemicznych, a metodą chromatografii cieczowej (w tym jonowej) około 80 %. Ogólny podział chromatografii i technik chromatograficznych (nieobejmujący technik elektromigracyjnych, takich jak m.in. elektroforeza kapilarna) przedstawiono na rys. 1.1. Zgodnie z nim chromatografia jonowa (ang. Ion Chromatography, IC) stanowi odmianę wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej, która różni się od HPLC m.in. stosowanymi rodzajami faz stacjonarnych i ruchomych, inertnymi materiałami, z których wykonane są części mające bezpośredni kontakt z eluentem, a przede wszystkim zakresem zastosowań.
Rys. 1.1. Rodzaje chromatografii i technik chromatograficznych
Podział metod chromatografii cieczowej ze względu na polarność fazy ruchomej i fazy stacjonarnej przedstawiono na rys. 1.2.
Rys. 1.2. Podział technik chromatografii cieczowej ze względu na polarność fazy stacjonarnej i ruchomej
Literatura dotycząca podstaw teoretycznych i zastosowań metod chromatograficznych jest obszerna. W Polsce do najważniejszej pozycji w tym zakresie należą Podstawy chromatografii Zygfryda Witkiewicza, wydane po raz pierwszy przez Wydawnictwa Naukowo-Techniczne w roku 1992 [3], a wznawiane pod różnymi tytułami kilkakrotnie w kolejnych latach [4, 5].
W przypadku chromatografii jonowej i technik pokrewnych w języku angielskim ukazało się wiele pozycji literaturowych [6-10]. Istnieje też wiele materiałów firmowych, zamieszczonych na stronach producentów sprzętu i akcesoriów do chromatografii jonowej [11-13]. Materiały te mogą stanowić cenne źródło praktycznej wiedzy na jej temat, szczególnie dla początkujących użytkowników. Jeśli chodzi o literaturę polskojęzyczną na ten temat, to w roku 1998 Dariusz Pogodzki na zlecenie firmy AGA Analytical opublikował broszurę dotyczącą chromatografii jonowej [14]. W roku 2005 Wydawnictwa Naukowo-Techniczne wydały książkę Rajmunda Michalskiego zatytułowaną Chromatografia jonowa. Podstawy i zastosowania [15], której kolejne wydania ukazały się w roku 2015 [16] i 2020 [17]. W roku 2015 ukazała się książka pod jego redakcją, w której opisano zastosowania w analityce środowiskowej technik łączonych: chromatografii jonowej-spektrometrii mas (IC-MS) oraz chromatografii jonowej ze spektrometrią mas z wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (IC-ICP-MS) w analityce środowiskowej [18]. W roku 2007 ukazało się kolejne wydanie Encyclopedia of Chromatography, a w niej po raz pierwszy ukazały się rozdziały autorstwa Rajmunda Michalskiego dotyczące różnych aspektów chromatografii jonowej [19-23]. W kolejnym wydaniu z roku 2010 opublikowano 8 obszernych rozdziałów na ten sam temat, w tym 6 zaktualizowanych [24-31].
Od roku 2005 organizowane są przez niego międzynarodowe konferencje naukowe poświęcone teorii i praktyce chromatografii jonowej. Od roku 2007 konferencjom tym towarzyszyły monografie, w których zamieszczone są prace specjalistów z zakresu chromatografii jonowej i metod pokrewnych [32-42]. Monografie te stanowią cenne źródło wiedzy i uzupełnienie niniejszej książki. Tytuły poszczególnych prac w nich zamieszczonych podano w niniejszej książce po wykazie literatury.
1.1. Podstawowe parametry opisujące procesy chromatograficzne
Chromatograficzne rozdzielanie składników mieszaniny jest funkcją wielu efektów termodynamicznych i kinetycznych zachodzących w układzie chromatograficznym. Wykrycie w detektorze jednego ze składników wyodrębnionych z mieszaniny powoduje pojawienie się na wykresie piku, którego pole powierzchni lub wysokość jest proporcjonalna do stężenia oznaczanego składnika. Składniki chromatografowanej mieszaniny opuszczające po rozdzieleniu kolumnę są wykrywane przez detektor, a odpowiadające im piki są rejestrowane w postaci chromatogramu. Mogą one mieć niesymetryczny kształt, co związane jest z procesami dyfuzji i przepływu fazy ruchomej przez kolumnę.
Czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie analitycznej nazywa się całkowitym czasem retencji. To czas od momentu wprowadzenia analizowanej próbki do kolumny analitycznej do momentu zarejestrowania maksimum piku odpowiadającego tej substancji. Jest to więc suma czasu, w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny, i czasu potrzebnego do przejścia tej substancji od dozownika do detektora, gdyby takiego oddziaływania nie było.
Iloraz ilości substancji, wyrażonej w molach, znajdującej się w fazie stacjonarnej i ilości tej samej substancji w fazie ruchomej wyraża tzw. współczynnik retencji, k, który określa wzór
w którym Cs oznacza stężenie substancji chromatografowanej w fazie stacjonarnej, Cr - stężenie tej substancji w fazie ruchomej, Vs - objętość fazy stacjonarnej, Vr - objętość fazy ruchomej, K - stałą podziału.
Współczynnik retencji k można obliczyć, wykorzystując zmierzone wartości czasu retencji. W praktyce jest on stosunkiem czasu, w jakim substancja chromatografowana przebywa w fazie stacjonarnej, do czasu jej przebywania w fazie ruchomej. Im większą wartość ma współczynnik retencji k, tym silniej substancja oddziałuje z fazą stacjonarną. Wielkością służącą porównywaniu selektywności różnych faz stacjonarnych jest retencja względna, r, rozdzielanych substancji. Określa się ją jako stosunek czasu retencji dwóch substancji chromatografowanych, z których na przykład jedna jest wzorcem, a druga ma podobne do niego właściwości. Wartość r może być większa lub mniejsza od 1, a im bardziej różni się od jedności, tym lepiej te dwie substancje są rozdzielone. Podobne zależności istnieją dla dwóch sąsiednich pików na chromatogramie i są one określone przez współczynnik rozdzielenia, ?, którego wartość jest zawsze większa od 1.
Podstawowe parametry chromatograficzne, takie jak selektywność fazy stacjonarnej i sprawność kolumny, są charakteryzowane przez parametr nazywany rozdzielczością pików, Rs, którego obliczanie przedstawiono na rys. 1.3.
Rys. 1.3. Sposób obliczania rozdzielczości pików
Rozdzielczość pików substancji A i B oblicza się na podstawie równania
w którym Rs oznacza rozdzielczość pików A i B, tR1 - czas retencji pierwszego piku, tR2 - czas retencji drugiego piku, w1 - szerokość pierwszego piku przy podstawie, w2 - szerokość drugiego piku przy podstawie.
Piki są tym lepiej rozdzielone, im wartość Rs jest większa. Gdy wartość ta wynosi 1, piki o zbliżonej wysokości są rozdzielone w 96 %. W metodach znormalizowanych, w których wykorzystuje się metody chromatograficzne, wymaga się zazwyczaj, aby rozdzielczość dwóch sąsiadujących pików nie była mniejsza niż 1,5. Jeśli jest większa, rozdzielczość jest wprawdzie lepsza, ale wymaga to dłuższego prowadzenia rozdzielania, co z kolei wiąże się z wyższymi kosztami i dłuższym czasem rozdzielania.
Szerokość pików chromatografowanych substancji zależy od liczby półek (N), a ich rozdzielczość od selektywności fazy stacjonarnej. Właściwości kolumn określone są ich sprawnością, którą charakteryzuje się wysokością półki H, a dokładnie wysokością równoważną półce (WRP), czyli najmniejszą długością odcinka kolumny chromatograficznej, w której osiąga się stan równowagi między stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i w fazie stacjonarnej. Van Deemter i współprac. [43] opracowali teorię rozdzielania na podstawie prac Martina i Synge'a [44]. Sprawność kolumny chromatograficznej w dużym stopniu zależy od wielkości cząstek fazy stacjonarnej i rośnie ze zmniejszaniem się ich średnicy. Uwzględniając długość kolumny L, wysokość (w mm) równoważną półce oblicza się na podstawie wzoru
Wykorzystując zależność wartości WRP od liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej u, można wykreślić zależność nazywaną wykresem van Deemtera, a na jego podstawie określić sprawność kolumny, jak przedstawiono to na rys. 1.4.
Rys. 1.4. Wykres van Deemtera
Równanie van Deemtera ma postać
przy czym H oznacza wysokość równoważną półce, u - liniową prędkość przepływu fazy ruchomej, A, B, C są wielkościami stałymi dla danej kolumny, fazy stacjonarnej, fazy ruchomej oraz temperatury i charakteryzują A - dyfuzję wirową, B - dyfuzję cząsteczkową w fazie ruchomej, C - opór przenoszenia masy.
Dyfuzję wirową opisuje wzór
A = 2 - ? - dp
w którym ? oznacza współczynnik upakowania, dp - średnicę cząstek wypełnienia kolumny.
Stała A zależy od wypełnienia i upakowania kolumny, stała B od rodzaju fazy ruchomej, a stała C od współczynnika podziału substancji chromatografowanej między fazy stacjonarną i ruchomą oraz od grubości warstwy fazy stacjonarnej.
Wysokość równoważna półce przy optymalnej prędkości fazy ruchomej dla większości kolumn stosowanych w chromatografii jonowej wynosi od 0,015 do 0,20 mm. Zależność rozdzielczości od selektywności kolumny opisanej współczynnikiem rozdzielenia, ?, i sprawnością kolumny wyrażoną liczbą półek, N, opisuje równanie
w którym N oznacza liczbę półek (sprawność kolumny), k - współczynnik retencji, ? - współczynnik rozdzielenia.
Współczynnik rozdzielenia oblicza się na podstawie wzoru
w którym k2 i k1 to odpowiednio współczynniki retencji substancji, którym odpowiadają drugi i pierwszy pik w rozważanej parze pików. Na podstawie tego równania można obliczyć wymaganą liczbę półek, N, w celu uzyskania zakładanej rozdzielczości pików przy określonej selektywności:
Na przykład przy wartości współczynnika ? =1,05 kolumna ma 16 000 półek, a przy ? =1,01 ich liczba wynosi 367 000. Liczbę półek można zwiększyć różnymi sposobami, np. przez wydłużenie kolumny, zmniejszenie wielkości cząstek fazy stacjonarnej i/lub optymalizację przepływu fazy ruchomej. Liczba półek, a zatem sprawność kolumny chromatograficznej wzrasta ze zmniejszaniem się wartości WRP. Należy jednak pamiętać, że liczba półek nie jest wprost proporcjonalna do długości kolumny, co oznacza, że 2-krotne wydłużenie kolumny nie poprawia 2-krotnie jej sprawności.
Jednym z czynników decydujących o rozdzielczości pików jest wysokość złoża jonitu lub długość kolumny. Jeśli duże ilości jonów mają być rozdzielone i oznaczone ilościowo, to lepiej zastosować krótszą kolumnę, niż zwiększać stężenie eluentu, ponieważ eluent o dużym stężeniu może szybko przeciążyć supresor. Ponadto przy krótszej kolumnie niższe będzie ciśnienie na wylocie z kolumny, a zatem można będzie zastosować większe natężenia przepływu. W przypadku jonów silnie spolaryzowanych, eluujących późno w formie szerokich pików, konieczna może być zmiana kolumny na krótszą. Odwrotną zasadę stosuje się w przypadku składników, które eluowane są bardzo szybko (np. kwasy organiczne o małej masie cząsteczkowej), gdzie dobre wyniki daje zastosowanie dłuższych kolumn lub dwóch kolumn połączonych szeregowo. Aniony i kationy o dużym promieniu jonowym wskutek hydratacji mogą być eluowane szybciej z kolumny wypełnionej fazą stacjonarną o niskim niż o wysokim stopniu usieciowania. Niestety mniejsze cząstki fazy stacjonarnej powodują wzrost ciśnienia, co stanowi istotne ograniczenie dla tradycyjnych układów do chromatografii cieczowej. Z drugiej strony przyczyniło się do rozwoju ultraszybkiej chromatografii cieczowej [45].
1.2. Terminy i definicje stosowane w chromatografii jonowej
W roku 2004 Wydawnictwo Naukowe PWN wydało pierwszy słownik poświęcony chromatografii i elektroforezie [46], a w roku 2015 ukazał się 5-języczny (polski, angielski, niemiecki, ukraiński i rosyjski) słownik Chromatografia i techniki elektromigracyjne [47]. Obydwa tak cenne i potrzebne słowniki ukazały się dzięki inicjatywie i pracy prof. Zygfryda Witkiewicza oraz jego współpracowników.
Chromatografia jonowa (IC - ang. Ion Chromatography) jest odmianą wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosowaną do rozdzielania i oznaczania nieorganicznych i organicznych anionów i kationów oraz substancji jonogennych po ich wcześniejszym przeprowadzeniu w formy jonowe. W literaturze spotkać można określenie chromatografia jonowymienna (I-EC - ang. Ion-Exchange Chromatography), która różni się od chromatografii jonowej, chociaż obydwa te rodzaje chromatografii oparte są na tych samych, znanych od dawna procesach wymiany jonowej.
W chromatografii jonowej wyróżnia się cztery główne sposoby rozdzielania oparte na różnych właściwościach faz stacjonarnych i wynikającej z tego zdolności wymiany jonów. Należą do nich:
- chromatografia jonowa z tłumieniem przewodnictwa (ang. Suppressed Ion Chromatography)
- chromatografia jonowa bez tłumienia przewodnictwa (ang. Non-Suppressed Ion Chromatography),
- chromatografia wykluczania jonów (IEC - ang. Ion Exclusion Chromatography).
- chromatografia z tworzeniem par jonowych (IPC, MPIC - ang. Ion Pair Chromatography).
W literaturze anglojęzycznej można spotkać się także z następującymi skrótami:
- HPIC (ang. High Performance Ion Chromatography), czyli wysokosprawna chromatografia jonowa,
- HPIEC (ang. High Performance Ion Exclusion Chromatography), czyli wysokosprawna chromatografia wykluczania jonów,
- MPIC (ang. Mobile Phase Ion Chromatography), czyli chromatografia z tworzeniem par jonowych.
W literaturze zamiennie są wciąż stosowane określenia: chromatografia jonowa z supresją, nazywana również dwukolumnową chromatografią jonową lub chromatografią jonową z tłumieniem przewodnictwa (ang. Dual-Column Ion Chromatography lub Suppresed Ion Chromatography) oraz chromatografia jonowa jednokolumnowa lub chromatografia jonowa bez tłumienia przewodnictwa (ang. Single Column Ion Chromatography lub Non-Suppressed Ion Chromatography). Nie są to określenia ścisłe, chociaż są często stosowane szczególnie w literaturze anglojęzycznej.
Określenie chromatografia jonowa z tłumieniem przewodnictwa (lub dwukolumnowa chromatografia jonowa) dotyczyło początkowo przyrządu do chromatografii jonowej zawierającego dwie kolumny, tj. kolumnę analityczną i kolumnę tłumienia (nie licząc przedkolumny). Od lat 80. XX wieku, gdy kolumny tłumienia zaczęto zastępować supresorami (urządzeniami spełniającymi tę samą funkcję, co kolumny tłumienia), przyrządy takie składały się z kolumny analitycznej i supresora, chociaż nadal stosowano nazwę chromatografia z tłumieniem przewodnictwa. W języku polskim tę najczęściej stosowaną odmianę chromatografii jonowej nazywa się chromatografią jonową z tłumieniem przewodnictwa.
Drugą odmianą chromatografii jonowej jest chromatografia jonowa bez tłumienia przewodnictwa. Nazwę tę wprowadzono do literatury anglojęzycznej w roku 1980, kiedy to Gjerde i współprac. [48] opracowali i opisali odmianę chromatografii jonowej opartą na wykorzystaniu eluentów o bardzo niskim przewodnictwie, co spowodowało, że w tej odmianie chromatografii jonowej nie stosuje się kolumny tłumienia lub supresora. Ten rodzaj chromatografii jonowej nazywa się chromatografią jonową bez tłumienia przewodnictwa.
Przegląd głównych metod chromatografii jonowej z uwzględnieniem mechanizmu rozdzielania, grup funkcyjnych w wymieniaczach jonowych, zalecanych eluentów, oznaczanych analitów oraz metod detekcji podano w tab. 1.2.
Tabela 1.2. Chromatografia jonowa i techniki pokrewne
Metoda
Mechanizm rozdzielania
Grupa funkcyjna wymieniacza
Typowe eluenty
Przykładowe anality
Metody detekcji
Chromatografia anionowymienna
wymiana jonowa
-NR3+
Na2CO3 + NaHCO3, NaOH, KOH
(w chromatografii jonowej z tłumieniem przewodnictwa)
kwas benzoesowy, kwas ftalowy, aromatyczne i alifatyczne kwasy karboksylowe, kwasy sulfonowe
(w chromatografii jonowej bez tłumienia przewodnictwa)
F-, Cl-, Br-, I-, SCN-, CN-, OCN-, ClO2-, ClO3-, ClO4-, BrO3-, H2PO42-, HPO32-,P2O74-, NO2-, NO3-, N2O32-, S2-, SO32-, SO42-, S2O32-, S2O62-, SeO32-, SeO42-, AsO32-, WO42-, MnO42-, CrO42--, AsO32-, SiO32-, SiF6-, BF4-,
kwasy karboksylowe, tiole, węglowodany
konduktometryczna, UV/Vis,
amperometryczna, MS, ICP-MS
Chromatografia kationowymienna
wymiana jonowa
-SO3-
H2SO4, HCl, HNO3, Hmsa
(w chromatografii jonowej z tłumieniem przewodnictwa)
HNO3, kwas winowy, H2dpa
(w chromatografii jonowej bez tłumienia przewodnictwa)
Li+, Na+, K+, NH4+, Rb+,
Cs+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Sr2+,
aminy alifatyczne
konduktometryczna, UV/Vis, MS, ICP-MS
-SO3-/NR3+
H2pdca, kwas szczawiowy
Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, Pb2+, Mn2+, Cd2+, Al3+, Ga3+, V4+, V5+, lantanowce, aktynowce
UV/Vis, MS, ICP-MS
Chromatografia wykluczania jonów
wykluczanie jonów
-SO3-/NR3+
woda, rozcieńczone roztwory wodne kwasów mineralnych,
kwas oktanosulfonowy,
kwas perfluorobutanowy
ClO4-, I-, BrO4-, Cl-, NO2-, NO3-,
kwasy karboksylowe, aldehydy, borany, krzemiany, węglowodany, aminy
konduktometryczna, UV/Vis, amperometryczna
Chromatografia
z tworzeniem anionowych par jonowych
tworzenie par jonowych
neutralna
NH3aq, tmaOH
(wodorotlenek tetrametyloamoniowy),
tpaOH (wodorotlenek tetrapropyloamoniowy), tbaOH(wodorotlenek tetrabutyloamoniowy)
F-, Cl-, Br-, I-, SCN-, CN-,
ClO3-, ClO4-, BrO3-, NO2-, NO3-, SO32-, SO42-, SeO32-, SeO42-, anionowe środki powierzchniowo czynne, kompleksy metali, aromatyczne kwasy karboksylowe
konduktometryczna UV/Vis
Chromatografia
z tworzeniem kationowych par jonowych
neutralna
HCl, kwas heksanosulfonowy, kwas oktanosulfonowy
Li+, Na+, K+, NH4+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Sr2+, alkiloaminy, alkanoloaminy, kationowe środki powierzchniowo czynne, związki sulfonowe i fosfoniowe
konduktometryczna, U/Vis
1.2.1. Chromatografia jonowa (IC)
Zjawisko wymiany jonowej zostało naukowo opisane ponad 170 lat temu w publikacji dotyczącej filtracji roztworów soli metali grup 1. i 2. układu okresowego przez różnego rodzaju gleby zawierające glinokrzemiany [49]. Z kolei w roku 1917 Folin i Bell [50] opisali wykorzystanie wymieniaczy jonowych do oznaczania amoniaku w moczu. Inne przykłady zastosowań wymiany jonowej w analizie chemicznej w okresie przed powstaniem chromatografii jonowej opisano w pracach Korkischa [51] oraz Riemana i Waltona [52].
Jednym z twórców współczesnej chromatografii jonowej jest Hamish Small, który swoje pierwsze prace związane z zastosowaniami metod separacyjnych do rozdzielania nieorganicznych jonów prowadził już w latach 50. ubiegłego wieku w Anglii w laboratoriach firmy Harwell AEC [53]. Po powrocie do USA pod koniec lat 50. XX wieku wraz ze swoim zespołem z firmy Dow Physical Research Laboratory (Midland, USA) kontynuował badania nad możliwościami zastąpienia klasycznych metod mokrych, stosowanych do tej pory w analizie jonów, metodami chromatografii cieczowej.
Badania nad zastosowaniem metod chromatograficznych do rozdzielania jonów metali były prowadzone w okresie II wojny światowej w ramach prac nad budową bomby atomowej (projekt "Manhattan"). Przełom nastąpił dopiero w roku 1971, kiedy to Small i jego współpracownicy zaproponowali i zbadali chromatograficzną metodę oznaczania litu, sodu i potasu z wykorzystaniem wymiany jonowej i detekcji konduktometrycznej. Zastosowali oni sulfonowany kopolimer styrenowo-diwinylobenzenowy (PS/DVB) o pojemności wymiennej około 0,02 mval/g1. W tym czasie był to jedyny dostępny w handlu jonit stosowany w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Rozwijanie chromatogramu trwało ponad 2 godziny, niemniej selektywność rozdzielania oznaczanych jonów oraz czułość detekcji były zadowalające. Jak wspomina Small, to ważne, historyczne wydarzenie miało miejsce w dniu 9 listopada 1971 roku [54]. W kilka dni po sukcesie w rozdzielaniu kationów wykorzystano tę samą metodę do rozdzielania anionów.
Chromatografia jonowymienna była zasadniczo metodą preparatywną, ponieważ wykrywanie za pomocą detektora konduktometrycznego jonów obecnych w próbce na tle fazy ruchomej, którą był stężony eluent, sprawiało poważne trudności. Kluczowym zagadnieniem było wykorzystanie odpowiednich wypełnień w kolumnach analitycznych oraz opracowanie metody obniżania przewodnictwa eluentu (który również był elektrolitem) tak, aby możliwe było wykrywanie rozdzielonych jonów z wykorzystaniem detektora konduktometrycznego. Eluenty do rozdzielania anionów, stosowane w początkowym okresie rozwoju chromatografii jonowej, miały charakter zasadowy (np. NaOH, fenolany, Na2CO3), natomiast eluenty do rozdzielania kationów charakter kwasowy (np. roztwory kwasu siarkowego, czy kwasu metanosulfonowego).
Początkowo do obniżania przewodnictwa eluentu (supresji) stosowano drugą kolumnę (kolumnę tłumienia) umiejscowioną za kolumną analityczną, a przed detektorem konduktometrycznym. Zawierała ona fazę stacjonarną o dużej pojemności. W wyniku zachodzących w niej reakcji jony eluentu tworzyły produkty o niskim przewodnictwie, takie jak H2O (gdy stosowano eluenty w postaci wodnych roztworów wodorotlenków) lub H2CO3 (jeżeli używano eluentów węglanowych). W połowie lat 1970. metoda była już dopracowana na tyle, że firma Dow Chemicals sprzedała licencję na supresję konduktometryczną firmie Durrum Instruments, która wkrótce dla potrzeb komercyjnych zmieniła nazwę na Dionex, będący obecnie częścią koncernu Thermo Fischer Scientific. Opracowanie zasad supresji przyczyniło się w zasadniczy sposób do powstania chromatografii jonowej, która szybko została zaakceptowana jako rutynowa metoda analizy anionów i kationów przede wszystkim w wodach i ściekach.
We wrześniu 1975 firma Dionex zdecydowała się przedstawić pierwszy komercyjny chromatograf jonowy (Dionex, Model 10) podczas zjazdu Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego w Chicago. Rok 1975 oficjalnie uważany jest za rok powstania chromatografii jonowej, a praca Smalla i współprac. [55] za kamień milowy w rozwoju tej metody separacyjnej. W roku 1977 autorzy tej pracy otrzymali w Pittsburgu nagrodę w dziedzinie chemii analitycznej za przedstawioną koncepcję chromatografii jonowej i jej zastosowania.
Jak wspomniano uprzednio, podstawową barierą w powstaniu chromatografii jonowej był brak możliwości rozróżniania przewodnictwa analizowanych jonów na tle wysokiego przewodnictwa fazy ruchomej. Stosowane do tego celu kolumny tłumienia wymagały systematycznej regeneracji, co wiązało się z koniecznością przerywania analiz, a ponadto charakteryzowały się niestabilnością linii zerowej i rozmywaniem pików oraz trudnościami z rozdzielaniem par jonów, takich jak m.in. Cl-/NO2- czy Na+/NH4+. Było to przyczyną poszukiwań nowych rozwiązań metodycznych i aparaturowych. Paradoksalnie, gdy pokonano już najważniejszą barierę w rozwoju IC, czyli opracowano technikę supresji, okazało się, że w określonych warunkach (odpowiednich faz stacjonarnych i ruchomych) supresja może jednak nie być konieczna. Na przełomie lat 70. i 80. ubiegłego wieku Gjerde i współprac. [56] po raz pierwszy zastosowali układ do chromatografii jonowej pozbawiony kolumny tłumienia, oparty na specjanych fazach stacjonarnych i eluentach o bardzo niskich przewodnictwach.
Krótko po tej publikacji nastąpiła szybka komercjalizacja chromatografii jonowej bez tłumienia przewodnictwa przez firmę Wescan Company, a nieco później firmy Waters, Shimadzu, Metrohm i inne.
Główną zaletą chromatografii jonowej bez tłumienia przewodnictwa było uproszczenie przyrządu, który nie musiał zawierać kolumny tłumienia lub supresora.
W roku 1981 firma Dionex wprowadziła na rynek pierwsze chromatografy jonowe, w których głowice pomp wykonano bez użycia części metalowych. W początkowym okresie rozwoju chromatografii jonowej nie stosowano kwasowych eluentów, a próbki o niskim pH rozcieńczano wodą przed analizą tak, aby nie niszczyły głowic pomp i innych metalowych części w chromatografie. Obecnie wszystkie części chromatografu jonowego, z którymi bezpośredni kontakt ma eluent oraz analizowana próbka, są wykonywane w całości z tworzyw inertnych, takich jak keton polidieterowy (PEEK - ang. Poly Ether-Ether Ketone). Polimer ten jest odporny chemicznie, reaguje wyłącznie ze stężonymi kwasami i wykazuje zmniejszoną odporność na działanie tylko niektórych rozpuszczalników organicznych, takich jak dichlorometan, sulfid tlenek dimetylowy czy tetrahydrofuran.
W roku 1984 firma Dionex wprowadziła pierwsze oprogramowanie komputerowe do obsługi chromatografów, a pod koniec 1985 roku ulepszony supresor o większej niż dotychczas wydajności. Kolejne ważne wydarzenie miało miejsce w roku 1986, kiedy to wprowadzono supresor mikromembranowy (MMS - ang. MicroMembrane SuppressorTM), który umożliwiał zastosowanie elucji gradientowej. W efekcie nastąpiło rozszerzenie listy analizowanych anionów na praktycznie wszystkie substancje zdysocjowane w zakresie pH od 0 do 14, w tym wiele związków organicznych. W roku 1990 wprowadziła ona na rynek autosupresory typu SRS (ang. Self Regenerated Suppressor), do regeneracji których potrzebna była tylko czysta woda. Był to pierwszy istotny krok do realizacji celu, jakim była zasada Just Add Water, czyli zminimalizowanie operacji związanych z przygotowaniem eluentów, co zwiększało zarówno bezpieczeństwo pracy z odczynnikami, jak i obniżało ryzyko popełniania błędów przy ich przygotowaniu. Jej efektem było opracowanie i pojawienie się na rynku automatycznych generatorów eluentów, wprowadzonych do sprzedaży w roku 1998. Wszystko, co musiał wykonywać analityk, w zakresie przygotowania próbki, to wlać dejonizowaną wodę do generatora eluentu i za pomocą programu komputerowego określić jego skład i stężenie.
Chromatografia jonowa, jako odmiana chromatografii cieczowej wymaga stosowania tych samych lub podobnych urządzeń (pomp, dozowników, detektorów), jakie stosowane są w wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
Klasyczny chromatograf do HPLC, zbudowany z elementów metalowych mających styczność z eluentem, nie jest odpowiedni do stosowania jako chromatograf jonowy ze względu na agresywne chemicznie eluenty o szerokim zakresie pH, stosowane w chromatografii jonowej. Obok rodzaju wypełnienia w kolumnie analitycznej, rodzaju i stężenia eluentu, a także rodzaju detektora, ważnym elementem chromatografu cieczowego jest pompa eluentu oraz dozownik próbki. W chromatografii jonowej stosuje się pompy jednotłokowe, pompy z podwójnymi tłokami równoległymi oraz szeregowe pompy dwutłokowe. Można je podzielić na pompy izokratyczne lub gradientowe, z gradientem po stronie niskiego lub wysokiego ciśnienia. Pompy stosowane w chromatografii jonowej nie różnią się zasadniczo od stosowanych w HPLC. Powinny one charakteryzować się odpowiednimi zakresami objętościowymi wydatku, maksymalnym ciśnieniem roboczym, odtwarzalnością oraz małym zakresem pulsacji wydatku [57]. Do wprowadzania próbek do kolumny analitycznej w chromatografii jonowej stosuje się przede wszystkim automatyczne zawory dozujące (np. firmy Rheodyne). Pojemność pętli dozowniczej wynosi zazwyczaj od 10 ?L do 1000 ?L. W przypadku manualnego podawania próbki do kolumny błąd wstrzykiwania może dochodzić do 10 %, a gdy stosuje się automatyczne dozowniki próbek, zwykle nie przekracza od 2-3 %.
Szacuje się, że wartość rocznej produkcji aparatury i akcesoriów do chromatografii gazowej w roku 2022 wyniosła około 28 mld USD, a wysokosprawnej chromatografii cieczowej około 11 mld USD. W tym około 2 mld USD to wartość sprzedaży chromatografów jonowych. W roku 2022 na świecie sprzedano około 4500 chromatografów jonowych, a w minionych latach opisano w literaturze ponad 1500 metod analitycznych opartych na chromatografii jonowej i technikach pokrewnych [58]. Do największych producentów sprzętu i akcesoriów do chromatografii jonowej należą firmy: Dionex (Kalifornia, USA), która obecnie stanowi część firmy Thermo Fischer Scientific, oraz firma Metrohm (Herisau, Szwajcaria). Udział w rynku chromatografii jonowej innych firm, takich jak Qingdao Shenghan, Tosoh Bioscience, Shimadzu, Qingdao Ion Chromate Tograph, Membrapure, Mitsubishi Chemical Analytech, Qingdao Puren Instrument, East & West Analytical Instruments; Qingdao Luhai, Sykam oraz Cecil Instruments jest mniejszy. Najważniejsze wydarzenia poprzedzające powstanie chromatografii jonowej oraz etapy jej rozwoju i popularyzacji podano w tab. 1.3.
Tabela 1.3. Najważniejsze wydarzenia poprzedzające powstanie chromatografii jonowej oraz etapy jej rozwoju i popularyzacji
Rok
Wydarzenie
1903
odkrycie przez M.S. Cwieta chromatografii jako metody rozdzielania substancji
1935
synteza i wykorzystanie pierwszych sulfonowanych i aminowanych polimerów (prace Adamsa, Holmesa i d'Alelio) [59]
1947
prace McBurneya dotyczące zastosowania aminowanych żywic PS/DVB jako wymieniaczy jonowych [60]
1952
Nagroda Nobla (dla brytyjskich uczonych Martina i Synge'a) w dziedzinie chemii za opracowanie teorii rozdzielania, która do dzisiaj jest podstawową teorią wszystkich nowoczesnych metod chromatograficznych
1953
opracowanie przez Wheatona i Baumana podstaw teoretycznych chromatografii wykluczania jonów
1967
mikroporowate wymieniacze jonowe (prace Corte'a, Meyera i Kunina) [61]
1969
synteza wymieniaczy "błonkowatych" (prace Kirklanda) [62]
1971
opracowanie chromatograficznej metody oznaczania litu, sodu i potasu z zastosowaniem wymiany jonowej i detekcji konduktometrycznej przez Smalla i współprac.
1975
publikacja fundamentalnej pracy Smalla, Stevensa i Baumana, dotyczącej analizy anionów i kationów metodą chromatografii jonowej z detekcją konduktometryczną [55]
1975
prezentacja pierwszego komercyjnego chromatografu jonowego podczas zjazdu Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego; opracowanie chromatografii jonowej jako nowej metody analitycznej
1976-1980
opracowanie chromatografii z tworzeniem par jonowych (w wyniku prac m.in. Watersa, Bidlingmeiera i Horvata)
1980
opracowanie chromatografii jonowej bez tłumienia przewodnictwa (prace Gjerde i współpracowników)
1981
wprowadzenie na rynek chromatografów jonowych, w których elementy mające styczność z eluentem wykonane były całkowicie bez użycia części metalowych
1981
wprowadzenie supresorów membranowych
1984
pierwsze programy komputerowe do obsługi chromatografów jonowych i interpretacji uzyskiwanych wyników
1984
uznanie przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (ang. United States Environmental Protection Agency, US EPA) i Amerykańskie Towarzystwo Badań i Materiałów (ang. American Society for Testing and Materiale, ASTM) chromatografii jonowej jako referencyjnej metody analizy jonów w wodach i ściekach
Koniec XX wieku
opracowanie przez Międzynarodową Organizację Normalizacyjną (ang. International Standard Organisation, ISO) oraz i inne organizacje norm wykorzystujących chromatografię jonową do oznaczania jonów w wodach i ściekach oraz badania gazowych zanieczyszczeń powietrza
Obecnie
opracowanie nowych faz stacjonarnych i bardziej efektywnych supresorów, nowych metod przygotowania próbek do analizy, programów do optymalizacji rozdzielania, miniaturyzacja przyrządów, wielowymiarowa i kapilarna chromatografia jonowa, techniki łączone IC-MS, IC-ICP-MS
W chromatografii jonowej wypełnienia kolumn stanowią zazwyczaj fazy stacjonarne z naniesionymi na nie grupami funkcyjnymi o stałym ładunku, w których bezpośrednim otoczeniu znajdują się odpowiednie przeciwjony zapewniające elektryczną obojętność układu. W kolumnach anionowymiennych grupami funkcyjnymi są najczęściej czwartorzędowe zasady amoniowe, a w kolumnach kationowymienych grupy sulfonowe. Gdy przeciwjony zostaną zastąpione przez jony substancji analizowanej, zostają czasowo zatrzymane w kolumnie. Rozdzielane jony próbki różnią się między sobą czasem przebywania wewnątrz kolumny, wynikającym z różnicy ich powinowactwa do fazy stacjonarnej. Jest to klasyczny mechanizm wymiany jonowej wykorzystywany w chromatografii jonowej do rozdzielania anionów i kationów. Proces wymiany jonowej jest odwracalny, a reakcje wymiany jonowej zachodzą stechiometrycznie. W wyniku klasycznych mechanizmów wymiany jonowej i zróżnicowanego powinowactwa jonów analitu do fazy stacjonarnej następuje ich rozdzielanie i z kolumny analitycznej są one wymywane w różnych czasach retencji.
Chromatografia jonowa, w której stosuje się wysokosprawne kolumny analityczne, wypełnione jednorodnymi cząstkami o małych średnicach, i najczęściej detekcję konduktometryczną, wywodzi się z chromatografii jonowymiennej. W porównaniu z klasyczną chromatografią jonowymienną chromatografia jonowa jest metodą wydajniejszą, szybszą, bardziej czułą i dającą bardzo dobrą powtarzalność uzyskiwanych wyników. Chromatografia jonowa jest przede wszystkim metodą analityczną, a chromatografia jonowymienna metodą preparatywną. Najważniejsze różnice pomiędzy chromatografią jonowymienną i chromatografią jonową podano w tab. 1.4.
Tabela 1.4. Podstawowe różnice pomiędzy chromatografią jonowymienną i chromatografią jonową
Chromatografia jonowymienna
Chromatografia jonowa
Stężone eluenty (0,1-10 mol/L)
Rozcieńczone eluenty (0,1-10 mmol/L)
Oznaczanie pojedynczych składników
Analiza mieszaniny różnych jonów
Jonity o dużej pojemności wymiennej
Jonity o małej pojemności wymiennej
Brak supresora
Konieczny supresor (w chromatografii jonowej z tłumieniem przewodnictwa)
Powolne analizy i niepowtarzalne wyniki
Szybkie analizy i powtarzalne wyniki
Detekcja klasycznymi metodami
w zależności od analizowanego składnika
Najczęściej detekcja konduktometryczna
Wykrywalność na poziomie mg/L
Wykrywalność na poziomie ?g/L
Schemat blokowy chromatografu jonowego z kolumną analityczną oraz supresorem w wersji anionowymiennej i kationowymiennej oraz zachodzącymi w nich reakcjami wymiany jonowej przedstawiono na rys. 1.5.
* Tylko w chromatografii jonowej z tłumieniem przewodnictwa.
Rys. 1.5. Schemat blokowy chromatografu jonowego z detektorem konduktometrycznym
Zasada działania chromatografu jonowego jest następująca. Ze zbiornika eluentu, przez przedkolumnę, tłoczony jest eluent do kolumny analitycznej, wypełnionej odpowiednim wymieniaczem jonowym. Za pomocą dozownika do strumienia eluentu wprowadzana jest próbka, której jony są rozdzielane w kolumnie analitycznej. Następnie (tylko w chromatografii jonowej z tłumieniem przewodnictwa) eluat kierowany jest do supresora (kolumny tłumienia), w którym w wyniku zachodzących reakcji wymiany jonowej jony eluentu tworzą słabo zdysocjowany kwas lub wodę, a jony analitu w postaci dobrze zdysocjowanych soli lub wodorotlenków trafiają do detektora konduktometrycznego. Sygnał z detektora jest rejestrowany w postaci piku chromatograficznego. Dalej przedstawiono reakcje chemiczne zachodzące podczas procesu chromatografowania na przykładzie rozdzielania anionów.
Jony analitu (np. F- i Cl-) wraz z jonami eluentu przechodzą przez kolumnę analityczną, w której zachodzą następujące reakcje wymiany jonowej:
jonit-NR3+HCO3- + Na+ + F- ? jonit-NR3+ F- + Na+ + HCO3-
oraz
jonit-NR3+HCO3- + Na+ + Cl- ? jonit-NR3+ Cl- + Na+ + HCO3-
W wyniku zróżnicowanego powinowactwa jonów analitu do fazy stacjonarnej następuje ich rozdzielanie i są one wymywane z kolumny analitycznej w różnych czasach retencji na tle NaHCO3. Następnie trafiają do supresora, w którym wymieniaczem jest sulfonowany kationit o dużej pojemności. Zachodzą w nim następujące reakcje chemiczne:
jonit-SO3-H+ + Na+ + HCO3- ? jonit-SO3-Na+ + H2CO3
Jony eluentu NaHCO3 w wyniku zachodzących reakcji zostają przeprowadzone w bardzo słabo zdysocjowany kwas węglowy. Jednocześnie jony analitu (F- i Cl-) w supresorze reagują zgodnie z równaniem
jonit-SO3-H+ + Na+ + F- ? jonit-SO3-Na+ + H+ + F-
oraz
jonit-SO3-H+ + Na+ + Cl- ? jonit-SO3-Na+ + H+ + Cl-
W ten sposób w wyniku zachodzących reakcji wymiany jonowej w kolumnie analitycznej i w supresorze do detektora trafiają jony analitu w postaci silnie zdysocjowanych kwasów na tle słabo zdysocjowanego kwasu węglowego (lub wody w wypadku stosowania eluentu NaOH lub KOH). Uzyskany sygnał związany z przewodnictwem jonów analitu jest wystarczająco wysoki, aby za pomocą detektora konduktometrycznego zarejestrować piki rozdzielanych jonów na tle słabego sygnału związanego z przewodnictwem H2CO3 lub H2O.
W przypadku rozdzielania kationów kolumna wypełniona jest wymieniaczem z grupami sulfonowymi, a eluentem jest np. wodny roztwór HCl. Jony analitu (np. Na+ i K+) wraz z jonami eluentu przechodzą przez kolumnę analityczną, w której zachodzą następujące reakcje wymiany jonowej:
jonit-SO3-H+ + Na+ + Cl- ? jonit-SO3-Na+ + H+ + Cl-
oraz
jonit-SO3-H+ + K+ + Cl- ? jonit-SO3-K+ + H+ + Cl-
W wyniku zróżnicowanego powinowactwa jonów analitu do fazy stacjonarnej następuje ich rozdzielanie i z kolumny analitycznej są wymywane w różnych czasach retencji jony analitu na tle silnie zdysocjowanego HCl. Następnie przechodzą one do supresora, w którym wymieniaczem jest anionit o dużej pojemności z czwartorzędowymi grupami amoniowymi, jako grupami funkcyjnymi. Zachodzą w niej następujące reakcje wymiany jonowej:
jonit- NR3+OH- + H+ + Cl- ? jonit- NR3+ Cl- + H2O
W wyniku zachodzących reakcji powstaje woda, a jony analitu (Na+ i K+) reagują z wymieniaczem w supresorze zgodnie z równaniem
jonit- NR3+OH- + Na+ + Cl- ? jonit- NR3+Cl- + Na+ + OH-
oraz
jonit- NR3+OH- + K+ + Cl- ? jonit- NR3+Cl- + K+ + OH-
W wyniku zachodzących reakcji w kolumnie analitycznej i w supresorze do detektora trafiają jony analitu w postaci silnie zdysocjowanych wodorotlenków na tle wody.
Popularność chromatografii jonowej wynika z wielu przyczyn. W przypadku analizy anionów metody kolorymetryczne i potencjometryczne powszechnie znane i dostępne stosuje się do jednoczesnego oznaczania zaledwie jednego lub dwóch jonów. Obecnie dostępne na rynku elektrody jonoselektywne umożliwiają analizę kilkudziesięciu jonów. Elektrody jonoselektywne z powodu powolnej kinetyki reakcji są mało odporne na interferencje, aczkolwiek w niektórych przypadkach (np. oznaczania fluorków) wciąż są bardzo użyteczne. Podobne ograniczenia dotyczą metod przepływowych, pomijając układy wielokanałowe.
Nieco inaczej przedstawiała się sytuacja w przypadku analizy kationów. Do ich oznaczania stosuje się nadal z powodzeniem metody kolorymetryczne, elektrochemiczne oraz przede wszystkim metody spektroskopowe, takie jak atomowa spektrometria absorpcyjna (AAS - ang. Atomic Absorption Spectrometry). Chromatografia jonowa charakteryzuje się dobrą wykrywalnością kationów, porównywalną z metodami spektroskopowymi, a przy małych stężeniach jest nawet bardziej dokładna. Często jednak konieczne jest oznaczenie w próbce zarówno anionów jak i kationów, a wtedy chromatografia jonowa, umożliwiająca uzyskanie większej ilości informacji za pomocą jednego przyrządu, jest metodą bardziej użyteczną. Pamiętać należy o jonach amonowych, które nie są wykrywane metodami spektroskopowymi.
Oprócz klasycznej chromatografii aniono- i kationowymiennej technikami pokrewnymi do IC są chromatografia wykluczania jonów (IEC) oraz chromatografia jonowa z tworzeniem par jonowych (IPC).
1.2.2. Chromatografia wykluczania jonów (IEC)
Technika ta po raz pierwszy została opisana przez Wheatona i Baumana [63] w roku 1953, czyli jeszcze przed powstaniem komercyjnie dostępnych chromatografów jonowych. Głównym parametrem opisującym retencję w przypadku czystego mechanizmu wykluczania jonów jest stała dysocjacji, której wartości są dobrze określone dla szeregu związków.
Mechanizmy rozdzielania są złożone i obejmują m.in. hydrofobową adsorpcję, wykluczanie steryczne, wymianę jonową, czy oddziaływania typu van der Waalsa. W chromatografii wykluczania jonów wykorzystuje się zjawisko równowagi membranowej Donnana. Porowaty wymieniacz jonowy pełni funkcję półprzepuszczalnej membrany, oddzielającej dwie fazy ciekłe: fazę ruchomą od formy wodnej, zawartej w porach wymieniacza. Membrana ta jest przepuszczalna tylko dla substancji niezjonizowanych lub słabo zjonizowanych, które ulegają podziałowi pomiędzy te dwie fazy, a ich migracja przez kolumnę jest opóźniona. Natomiast substancje zjonizowane, nieprzenikające do wnętrza porów fazy stacjonarnej, nie są zatrzymywane w kolumnie i opuszczają ją w czasie odpowiadającym czasowi retencji substancji nieoddziałujących z fazą stacjonarną [64].
Cechą charakterystyczną chromatografii IEC jest ten sam ładunek elektryczny zdysocjowanych grup funkcyjnych jonowymiennej żywicy i analizowanych jonów. Anality charakteryzujące się ujemnym ładunkiem, np. zdysocjowane kwasy, są rozdzielane na kationicie zawierającym anionowe grupy funkcyjne, a próbki zawierające jony naładowane dodatnio rozdzielane są na anionicie zawierającym kationowe grupy funkcyjne (np. jony tetraalkiloamoniowe). W pewnym sensie mamy tu do czynienia z sytuacją odwrotną do chromatografii jonowej, w której aniony rozdzielane są na anionicie, a kationy na kationicie.
Cechą charakterystyczną komercyjnie dostępnych kolumn do chromatografii wykluczania jonów jest ich duża pojemność. Osiąga się ją przez zwiększenie wymiarów kolumny i stężenia grup funkcyjnych złoża oraz przez stosowanie wymieniaczy jonowych o dużej pojemności. Jako złoże wykorzystuje się zazwyczaj makroporowaty, całkowicie sulfonowany, kopolimer styrenu i diwinylobenzenu, charakteryzujący się dużą pojemnością wymienną. Ponieważ stężenie jonów w fazie stacjonarnej jest zazwyczaj znacznie większe niż w fazie ruchomej, następuje osmotyczny przepływ wody do żywicy, powodujący jej pęcznienie. Proces ten zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia jonów w fazie ruchomej i wzrostem stopnia usieciowania żywicy. Dlatego retencja substancji kwasowych i zasadowych oznaczanych metodą chromatografii IEC jest zależna od ich stałych dysocjacji. Mocne, całkowicie zdysocjowane, kwasy lub zasady są elektrostatycznie odpychane od złoża. W konsekwencji są one wymywane nierozdzielone w objętości martwej kolumny.
Temperatura kolumny wpływa na dwa podstawowe parametry chromatograficzne. Jej wzrost zwiększa dyfuzję i sprawność kolumny. Zwiększenie selektywności uzyskuje się wraz ze spadkiem temperatury. Efektywność rozdzielania w IEC można modyfikować przez zmianę pH eluentu (ponieważ pH decyduje o stopniu dysocjacji analitów) lub przez dodawanie do eluentu modyfikatorów organicznych (np. acetonitrylu czy izopropanolu). W przypadku prostych kwasów karboksylowych ich czasy retencji rosną wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej. Kwasy di- i trikarboksylowe (np. kwas szczawiowy i cytrynowy) eluują później, a silnie zdysocjowane kwasy nieorganiczne zgodnie z mechanizmami rozdzielania wymywają się z kolumny analitycznej w objętości martwej.
Już w roku 1964 Harlow i Morman [65] stwierdzili, że fazy stacjonarne o wysokim stopniu usieciowania (12 %) są odpowiednie do rozdzielania słabych kwasów karboksylowych, a dla kwasów silnie zdysocjowanych najlepsze są fazy stacjonarne o stopniu usieciowania zaledwie 2 %. Obecnie w kolumnach analitycznych stosowanych w chromatografii wykluczania jonów najczęściej stosuje się fazy stacjonarne o stopniu usieciowania 8 %. W pełni sulfonowane żywice jonowymienne mogą być stosowane do rozdzielania prostych i złożonych alkoholi, aldehydów, a nawet fenoli. W przypadku tych ostatnich są one eluowane na niepolarnej fazie przy użyciu mieszanin acetonitryl/woda lub metanol/woda. Do roztworu dodaje się buforu fosforanowego w celu zahamowania niewielkiej dysocjacji fenoli na aniony fenolanowe. Charakterystyki kolumn analitycznych do IEC zestawiono w tab. 1.5.
Tabela 1.5. Kolumny analityczne stosowane w chromatografii wykluczania jonów
Parametr
Kolumna
Nazwa kolumny
IonPac ICE-AS1
IonPac
ICE-AS6
Metrosep Organic Acids
PRP-X300
Rezex ROA Organic Acid
Shim-Pack SCR-102 H
ORH-801
Producent
Thermo Fischer Scientific
Thermo Fischer Scientific
Metrohm
Hamilton
Phenomenex
Shimadzu
Interaction Chemical
Wymiary kolumny, mm
250 × 9
250 × 9
250 × 7,8
250 × 4,1
300 × 8
300 × 8
300 × 6,5
Grupy funkcyjne
sulfonowe
sulfonowe i karboksylowe
sulfonowe
sulfonowe
sulfonowe
sulfonowe
sulfonowe
Średnica cząstek, ?m
7,5
8
5
7
8
7
8
Przykładowe zastosowania do rozdzielania
słabych nieorganicznych kwasów i małocząsteczkowych kwasów karboksylowych
alifatycznych hydroksykwasów i alkoholi
słabych kwasów nieorganicznych i organicznych
alifatycznych kwasów karboksylowych
słabych kwasów organicznych, węglowodanów, alkoholi
słabych kwasów organicznych
alifatycznych kwasów karboksylowych
W chromatografii wykluczania jonów wybór eluentów jest ograniczony. W najprostszym przypadku można wykorzystać czystą wodę dejonizowaną. Zakwaszenie fazy ruchomej hamuje dysocjację, co poprawia kształt pików. Wśród kwasów mineralnych najczęściej stosowany jest kwas siarkowy, zwłaszcza przy zastosowaniu bezpośredniej detekcji UV. Dobre rozdzielanie uzyskuje się, stosując kwas tridekafluoroheptanowy w zakresie stężeń pomiędzy 0,5 i 10 mmol/L. Kwas oktanosulfonowy wykazuje podobne właściwości elucyjne i nadaje się również do rozdzielania boranów i węglanów. Do wykrywania kwasu borowego przez pomiar konduktometryczny należy stosować mieszaninę kwasu oktanosulfonowego i mannitolu.
W przypadku popularnej kolumny analitycznej Dionex IonPac ICE-AS6 jako eluenty zalecane są krótkołańcuchowe perfluorowane kwasy tłuszczowe, takie jak kwas perfluoromasłowy. Do detekcji wykorzystuje się zazwyczaj detektory fotometryczne w zakresie długości fali 250-280 nm dla kwasów aromatycznych i 200-220 nm dla kwasów alifatycznych. Tylko kwasy i zasady o pośrednich wartościach stałych dysocjacji, w zakresie od 10-7 do 10-2, mogą być rozdzielane tą techniką (przy założeniu czystego mechanizmu wykluczania jonów). Większej retencji należy więc oczekiwać dla kwasów charakteryzujących się większymi wartościami pKa, jak to zostało wykazane przez Tanakę i współprac. [66]. Analogiczna zależność dla zasad została opisana przez Haddada i współprac. [67].
Chromatografia wykluczania jonów jest stosowana przede wszystkim do rozdzielania słabych kwasów nieorganicznych, kwasów organicznych, alkoholi, aldehydów, aminokwasów, a także grupowego rozdzielania związków jonowych od niejonowych. Istnieje możliwość efektywnego rozdzielania tą techniką aminokwasów, białek, alkoholi oraz aldehydów w różnych matrycach (wodzie morskiej, wodzie mineralnej, płynach biologicznych, żywności, winie, detergentach, czy w ściekach).
W połączeniu z detekcją amperometryczną można techniką IEC oznaczać siarczany(IV) i arseniany(III). Opisana przez Kima i Kima w roku 1986 metoda [68] jest obecnie standardową metodą oznaczania jonów S2- i AsO2-, zamieszczoną w katalogu norm AOAC (ang. Association Of Analytical Communities). Metoda ta jest selektywna i nie wymaga specjalnego przygotowania próbki do analizy. Jej wadą jest szybka degradacja powierzchni elektrody (do 40 % po około 8 godzinach ciągłej pracy detektora amperometrycznego).
Krótkołańcuchowe alkohole I-, II- i III-rzędowe mogą być oznaczane metodą chromatografii wykluczania jonów z eluentem HClO4. W przeciwieństwie do klasycznej HPLC ten rodzaj chromatografii jonowej pozwala oznaczać nie tylko alkohole I-rzędowe, ale i inne. W przypadku aldehydów są one oznaczane po utlenieniu do kwasów karboksylowych. Najważniejsze zalety IEC to trwałość kolumn (umożliwia to analizę wielu próbek bez konieczności wstępnego ich oczyszczania), łatwość oddzielania związków jonowych od niejonowych oraz możliwość stosowania detekcji konduktometrycznej. Do próbek o złożonej matrycy stosowane mogą być układy dwuwymiarowe: chromatografia wykluczania jonów-chromatografia jonowa (ICE-IC). Schemat takiego układu przedstawiono na rys. 1.6.
Rys. 1.6. Schemat układu IEC-IC
Koncepcja ta została wprowadzona przez Richa i współprac. [69], którzy zastosowali układ ICE-IC do rozdzielania i oznaczania kwasu pirogronowego i mlekowego w surowicy krwi. W tamtych czasach nie było możliwości efektywnego rozdzielenia głównych nieorganicznych anionów i kwasów karboksylowych techniką IC, wielowymiarowy układ IEC-IC okazał się więc w tym zakresie bardzo użyteczny. Techniki dwuwymiarowe, takie jak ICE-IC, znajdują zastosowanie m.in. do oznaczania śladowych zanieczyszczeń anionowych w ultraczystych stężonych kwasach, takich jak HF czy H3PO4, które mają kluczowe znaczenie w przemyśle produkcji półprzewodników [70]. Wykorzystanie techniki łączonej IEC-ICP-MS do oznaczania krzemianów w wodzie morskiej opisali Hioki i współprac. [71], a Sakai i współprac. [72] opisali jej zastosowanie z detekcją chemiluminescencyjną do oznaczania krzemianów w wodach.
1.2.3. Chromatografia z tworzeniem par jonowych (IPC)
Podstawy teoretyczne oraz zastosowania chromatografii z tworzeniem par jonowych opisano w pracach [73, 74]. W tej odmianie IC jony substancji oznaczanej X oddziałują z lipofilowymi jonami L (stanowiącymi składnik eluentu), tworząc kompleks typu XL. Kompleks ten może być odwracalnie wiązany z niepolarną powierzchnią fazy stacjonarnej S, tj. fazą o polarności mniejszej niż eluent, tworząc kompleks XLS. Rozdzielane jony próbki (w postaci kompleksów XL) różnią się między sobą czasem przebywania w kolumnie, wynikającym z ich różnych powinowactw do niepolarnej powierzchni fazy stacjonarnej, co stanowi przyczynę rozdzielenia.
Według alternatywnego modelu lipofilowe jony eluentu są adsorbowane na powierzchni fazy nieruchomej, tworząc kompleks typu LS. W wyniku tego na powierzchni niepolarnej fazy stacjonarnej powstaje dynamiczny wymieniacz jonowy, z którym oddziałują jony substancji rozpuszczonej X. Jony o charakterze hydrofobowym, np. sulfoniany alkilowe i arylowe, mogą penetrować wnętrze warstwy utworzonej przez kompleks LS, a o ich czasie przebywania decyduje zjawisko adsorpcji. Jony bardziej hydrofilowe penetrują tylko strefę zewnętrzną, a o ich czasie przebywania w kolumnie decyduje mechanizm wymiany jonowej.
Główną zaletą chromatografii z tworzeniem par jonowych jest jej duża elastyczność, która umożliwia dostosowanie warunków chromatograficznych do danego rodzaju próbek. Ta zaleta wynika z dużej różnorodności parametrów eksperymentalnych, które wpływają na retencję [75], a którymi są
- rodzaj lipofilowego przeciwjonu w fazie ruchomej,
- stężenie lipofilowego przeciwjonu w fazie ruchomej,
- rodzaj modyfikatora organicznego,
- stężenie modyfikatora organicznego w fazie ruchomej,
- rodzaj i stężenie dodatków nieorganicznych,
- pH eluentu,
- temperatura kolumny.
Chromatografia z tworzeniem par jonowych to technika, w której do fazy ruchomej dodaje się substancji tworzącej jony hydrofobowe (np. C7H15SO3-). Jony te oddziałują z jonami składników próbki, tworząc obojętne pary jonów, które ulegają rozdzieleniu chromatograficznemu. Typowe odczynniki stosowane w chromatografii z tworzeniem par jonowych to, w przypadku oznaczania anionów: NH3aq, wodorotlenki tetrametyloamoniowy, tetrapropyloamoniowy i tetrabutyloamoniowy, a w przypadku kationów HCl, HClO4 oraz kwasy heksanosulfonowy, heptanosulfonowy i oktanosulfonowy. Dodawanie lipofilowych substancji, takich jak kwas alkanosulfonowy lub czwartorzędowe aminy, do fazy ruchomej pozwala oznaczać tego rodzaju anality w odwróconym układzie faz [76].
Do rozdzielania metodą chromatograficzną z tworzeniem par jonowych jako jony lipofilowe są dodawane czwartorzędowe zasady amoniowe. Rodzaj przeciwjonu w parze jonowej w dużym stopniu zależy od zastosowanej metody detekcji. Jeśli jest to detekcja konduktometryczna z supresją, to odczynnik pary jonowej jest używany w postaci wodorotlenkowej. To samo dotyczy rozdzielania kationów, które przeprowadza się albo z długołańcuchowymi kwasami alkanosulfonowymi, albo z kwasami mineralnymi. Wybór jonu lipofilowego zależy wyłącznie od stopnia hydrofobowości jonów analitu. Do oddzielenia jonów nieaktywnych powierzchniowo niezbędny jest odczynnik hydrofobowy; z drugiej strony oddzielenie jonów o długich łańcuchach alkilowych wymaga silnie hydrofilowego odczynnika. Inną metodą kontrolowania retencji jest zmiana stężenia odczynnika pary jonowej. W zakresie stężeń do 0,02 mol/L retencja analitu zależy prawie liniowo od stężenia odczynnika pary jonowej.
W chromatografii par jonowych dodaje się rozpuszczalników organicznych, takich jak acetonitryl lub metanol, do wodnej fazy ruchomej jako modyfikatorów organicznych. Ponieważ cząsteczki rozpuszczalnika są adsorbowane na powierzchni fazy stacjonarnej, pozostają one w równowadze konkurencyjnej z jonami lipofilowymi, rywalizując o centra aktywne na fazie stacjonarnej dostępne do adsorpcji. Zastąpienie acetonitrylu metanolem powoduje konieczność zwiększenia zawartości rozpuszczalnika w fazie ruchomej, aby uzyskać porównywalne czasy retencji. Różnica selektywności uzyskana z metanolem jako modyfikatorem organicznym wynika ze zdolności metanolu do tworzenia wiązań wodorowych.
Dodatki nieorganiczne, takie jak węglan sodu, są dodawane do fazy ruchomej, aby kontrolować retencję dwu- i wielowartościowych anionów. Po dodaniu węglanu sodu do eluentu spadek retencji anionów dwuwartościowych jest znacznie większy niż jednowartościowych, co poprawia kształt ich pików. Przy analizie jonów wielowartościowych konieczna może być zmiana pH fazy ruchomej przez dodanie odpowiednich kwasów lub zasad. Ponieważ retencja jonów wielowartościowych wzrasta wraz ze stopniem dysocjacji, wartość pH wpływa na retencję przez determinowanie stopnia dysocjacji. Kwas borowy jest szczególnie odpowiedni do obniżania pH, podczas gdy wzrost pH eluentu osiąga się za pomocą wodorotlenku sodu. W przeciwieństwie do wartości pH eluentu temperatura kolumny rzadko ma znaczenie dla optymalizacji rozdzielania. Retencja może być nieco zmniejszona przez podniesienie temperatury kolumny.
Ta odmiana chromatografii jonowej jest alternatywą stosowaną do oznaczania silnie spolaryzowanych jonów, takich jak tiosiarczany czy chlorany(VII), które były silnie zatrzymywane na typowych wymieniaczach jonowych. Jest ona szczególnie użyteczna w rozdzielaniu par jonów, które na typowych wymieniaczach anionowymiennych są eluowane blisko siebie (np. NO3-/ClO3- czy benzoesan/NO3-), oraz tlenowych jonów siarki, takich jak S2O62- czy S2O82- [77]. Chromatografia z tworzeniem par jonowych nadaje się również do oznaczania kompleksów metali. Aby można było je rozdzielić chromatograficznie, muszą być termodynamicznie trwałe. Dużą trwałość wykazują kompleksy metal-edta i metal-dtpa. Do wydzielenia kompleksu Gd-dtpa, który ma duże znaczenie jako środek kontrastowy w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego, jako odczynnik pary jonowej stosuje się tbaOH. IEC można stosować do rozdzielania strukturalnie izomerycznych amin i czwartorzędowych związków amoniowych oraz aryloalkiloamin, barbituranów i alkaloidów. To samo dotyczy analizy anionów powierzchniowo czynnych, takich jak aromatyczne kwasy sulfonowe, tolueno-, kumeno- i ksylenosulfoniany, siarczany eterów alkoholi tłuszczowych, alkilobenzenosulfoniany i estry metylowe kwasów alkanosulfonowych o długich łańcuchach.
1.2.4. Inne techniki chromatograficzne wykorzystywane do oznaczania jonów
W metodach separacyjnych rzadko mamy do czynienia z jednym mechanizmem rozdzielania. Dlatego wymiana jonowa pojawia się w wielu metodach separacyjnych, nie tylko w klasycznej chromatografii jonowej. Jedną z nich jest chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC - ang. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), która może służyć do rozdzielania substancji polarnych i średniopolarnych [78]. W tej technice mamy do czynienia z wieloma mechanizmami rozdzielania. Jeden z nich opiera się na wykorzystaniu bezpośrednich oddziaływań pomiędzy fazą stacjonarną i fazą ruchomą, jak i zastosowaniu wody z dodatkiem modyfikatora jonowego. Najczęściej jego zawartość nie przekracza 0,1 % objętości, co powoduje, że na powierzchni ziaren sorbentu tworzy się warstwa eluentu o zwiększonej zawartości wody. Migrujące przez kolumnę chromatograficzną anality podlegają oddziaływaniom, które zachodzą pomiędzy warstwą fazy ruchomej o dużej zawartości składnika organicznego a warstwą zaadsorbowanej wody.
Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii HILIC to najczęściej żel krzemionkowy modyfikowany grupami aminowymi, amidowymi, cyjanowymi bądź grupami hydroksylowymi lub polarne polimery. Fazę ruchomą stanowi natomiast mieszanina rozpuszczalników organicznych z wodą. Im większa jest zawartość wody w eluencie, tym siła elucji fazy ruchomej jest większa.
W kolumnach analitycznych na powierzchni hydrofilowej fazy stacjonarnej tworzy się cienka warstwa wody zaadsorbowanej z eluentu. Wtedy następuje podział polarnego analitu pomiędzy hydrofilową warstwę wodną na powierzchni stacjonarnej a mniej hydrofilowym rozpuszczalnikiem (np. acetonitrylem) [79]. Elucja oznaczanych substancji następuje najczęściej w kolejności od najmniej do najbardziej polarnych. Jednak od tej reguły są wyjątki. Występują one szczególnie wtedy, kiedy fazą stacjonarną jest modyfikowany żel krzemionkowy. Można powiedzieć, że technika ta łączy w sobie elementy chromatografii w normalnym układzie faz, w odwróconym układzie faz oraz wymiany jonowej. HILIC nadaje się szczególnie do oznaczania analitów, które w technice RP-HPLC są wymywane blisko objętości martwej, i obejmuje zarówno związki polarne jak i jonowe, które są rozpuszczalne w fazie ruchomej (wodzie).
Do rozdzielania nieorganicznych jonów stosowana jest również chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RPLC - ang. Reversed Phase Liquid Chromatography). Przegląd takich zastosowań opisali Gennaro i Angelino [80].
