6Skale funkcjonalne i ich zastosowanieKarolina Aragon-Gawińska

Jeśli czegoś nie można zmierzyć, nie można tego ulepszyć.

Lord Kelvin

Wprowadzenie

Skale funkcjonalne są coraz szerzej stosowane w praktyce klinicznej specjalistów zajmujących się chorobami nerwowo-mięśniowymi. Za ich pomocą możemy monitorować i obiektywizować stan pacjenta, oceniać skuteczność interwencji terapeutycznych albo stopień nasilenia choroby i jej przełożenie na codzienne funkcjonowanie. Skale funkcjonalne są niezastąpione w badaniach klinicznych, w których nierzadko stanowią pierwszorzędowy punkt końcowy i są wyznacznikiem skuteczności przedmiotu badania. Przełożenie stanu sprawności pacjenta na wynik punktowy, mimo że nieodzownie wiąże się z uproszczeniem, stanowi wartościowe i praktyczne narzędzie w praktyce klinicznej i komunikacji między badaczami.

Jakie cechy powinna mieć wartościowa skala oceny?

Skale funkcjonalne powinny łączyć w sobie dwie główne cechy - przydatność kliniczną oraz rzetelność naukową. W tej pierwszej zwracamy uwagę, żeby skala była dość prosta i przejrzysta, przyjazna użytkownikowi, możliwa do wykonania w stosunkowo krótkim czasie i niewymagająca bardzo wyspecjalizowanych sprzętów. Pomimo że bardziej kompleksowe skale funkcjonalne wymagają specjalnego przeszkolenia, a w badaniach klinicznych również okresowej certyfikacji osób je stosujących, prostota i dostępność skali jest podstawowym warunkiem jej prawidłowego zastosowania.

Z drugiej strony, żeby skalę funkcjonalną wprowadzono do szerokiego stosowania, musi ona spełniać pewne podstawowe warunki wynikające z metodologii badań naukowych [1].

Warunki te możemy podzielić na trzy główne grupy:

1. Wiarygodność (reliability) - wyniki uzyskane za pomocą skali są dokładne, stałe i powtarzalne. Wiarygodność jest oceniana na podstawie kilku elementów. Do najważniejszych należą: prawidłowość i powtarzalność jej wykonywania przez osobę badającą (intrarater reliability), a także inne osoby badające tego samego pacjenta (interrater reliability), oraz stałość jej wykonywania w czasie (test-retest reliability). Im wyższa wiarygodność skali, tym mniejsze ryzyko błędu mogącego wynikać ze strony badacza, pacjenta lub samej skali.

2. Ważność (validity) - przydatność danej skali do oceny funkcjonalnej pacjentów z daną jednostką chorobową lub grupą chorób. Ważność skali dla danej choroby powinna być potwierdzona w badaniu klinicznym, co może być jednak niewykonalne dla niektórych bardzo rzadkich chorób.

3. Czułość na zmiany (responsiveness lub sensitivity to change) - skala powinna być w stanie wychwycić istotne klinicznie zmiany stanu funkcjonalnego. Zarówno poprawa, jak i pogorszenie formy pacjenta powinno korelować ze zmianą w punktacji, najlepiej w sposób liniowy. Wiele skal osiąga jednak tzw. efekt sufitu (ceiling effect) lub efekt podłogi (floor effect). Są to sytuacje, w których dana skala, pomimo osiągnięcia przez pacjenta jej końcowych wartości (bliskich minimum lub maksimum punktacji), nie wychwytuje dalszych zmian w stanie funkcjonalnym, tj. poprawy lub pogorszenia.

Skala funkcjonalna polega nie tyle na ilościowym pomiarze siły danej grupy mięśniowej, co stara się oceniać sprawność konkretnej czynności ruchowej. Skale mogą być wypełniane wyłącznie przez badacza (przeszkolonego profesjonalistę, zazwyczaj lekarza lub fizjoterapeutę), mogą zawierać elementy oceny przedmiotowej i podmiotowej pacjenta lub mogą być w całości zależne od oceny pacjenta. W niektórych skalach uwzględnia się jeszcze dodatkowe parametry - np. z badań elektrofizjologicznych lub spirometrii. Skale zależne od badacza polegają na wykonywaniu przez pacjenta konkretnych zadań, a punkty są przyznawane w zależności od tego, jak płynnie i poprawnie realizowana jest dana czynność. Dopuszcza się często możliwość kompensacji ruchowych, ale jest to odzwierciedlone w punktacji. Przykładem skali zależnej od pacjenta są kwestionariusze, w których pacjent ocenia trudności z wykonywaniem danych czynności (np. odkręcanie butelki) bądź częstość i nasilenie występowania niektórych objawów (np. podwójne widzenie lub zaburzenia mowy w miastenii w skali MG-ADL).

Wady i ograniczenia zastosowania skal

Każda skala funkcjonalna jest w pewnym stopniu zależna od oceny osoby badającej. Ponadto skale oceniające pacjenta w sposób punktowy mogą być zależne od jego dyspozycji w danym dniu. W trakcie badania u pacjenta może pojawić się zmęczenie lub zniechęcenie, wpływające na końcowy wynik. Wreszcie, nawet najbardziej dopracowane skale nie oceniają wszystkich istotnych w codziennym życiu funkcjonalności.

? Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., PZWL Wydawnictwo Lekarskie, Warszawa 2023

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Środki finansowe uzyskane w ramach współpracy wydawnictwa z reklamodawcami zostały przeznaczone w całości na wsparcie druku i dystrybucji książki. Reklamodawcy nie mieli żadnego, bezpośredniego lub pośredniego wpływu na zawartość merytoryczną podręcznika.

Wydawca: Stella Nowośnicka-Pawlitko

Redaktor prowadzący: Anna Gardyniak

Redaktor: Arkadiusz Gudowski

Producent: Anna Bączkowska

Projekt okładki i stron tytułowych: Katarzyna Konior/bluemango.pl

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2023r. (Wydanie I)

Warszawa 2023

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

ISBN 978-83-01-22936-8

DOI: https://doi.org/10.53271/2022.053

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2

02-460 Warszawa

pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Michał Latusek

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: br.pzwl@pwn.pl

Wszystkie prawa zastrzeżone. Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy

prof. dr hab. n. med. Anna Kostera-Pruszczyk

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr hab. n. med. Anna Potulska-Chromik

Katedra i Klinika NeurologiiWarszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

***

lek. Karolina Aragon-Gawińska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr hab. n. med. Piotr Bienias

Klinika Chorób Wewnętrznych i Kardiologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus

mgr Małgorzata Burlewicz

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr hab. n. med. Małgorzata Dorobek

Zespół Kliniczno-Badawczy Fizjologii Stosowanej

Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. Mirosława Mossakowskiego PAN w Warszawie

Klinika Neurologii

Centralny Szpital Kliniczny MSWiA w Warszawie

lek. Anna Frączek

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

lek. Aleksandra Jastrzębska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr hab. n. med. Maria Jędrzejowska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

prof. dr hab. n. med. Anna M. Kamińska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr n. med. Biruta Kierdaszuk

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

prof. dr hab. n. med. Stanisław Kłęk

Klinika Chirurgii Onkologicznej

Narodowy Instytut Onkologii - Państwowy Instytut Badawczy im. Marii Skłodowskiej-Curie Oddział w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Andrzej Kochański

Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. Mirosława Mossakowskiego PAN w Warszawie

prof. dr hab. n. med. Magdalena Kuźma-Kozakiewicz

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr n. med. Marta Lipowska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr n. med. Anna Łusakowska

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr n. biol. Anna Macias

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr hab. n. med. Agnieszka Madej-Pilarczyk

Poradnia Genetyczna

Zakład Genetyki Medycznej

Instytut "Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka"

dr n. med. Edyta Maj

II Zakład Radiologii Klinicznej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

dr hab. n. med. Monika Nojszewska

Katedra i Klinika NeurologiiWarszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

dr n. med. Andrzej Opuchlik

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

prof. dr hab. n. med. Piotr Pruszczyk

Klinika Chorób Wewnętrznych i Kardiologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus

dr n. med. Dariusz Rokicki

Klinika Pediatrii Żywienia i Chorób Metabolicznych

Instytut "Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka"

lek. Edyta Rosiak

II Zakład Radiologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

dr n. med. Barbara Ryniewicz

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

prof. dr hab. n. med. Jarosław Sławek

Zakład Pielęgniarstwa Neurologiczno-Psychiatrycznego

Wydział Nauk o Zdrowiu

Gdański Uniwersytet Medyczny;

Oddział Neurologii i Udarowy

Szpital św. Wojciecha

"Copernicus" sp. z o.o. w Gdańsku

dr n. k. fiz. Agnieszka Stępień

Katedra Fizjoterapii Klinicznej

Wydział Rehabilitacji Akademii Wychowania Fizycznego w Warszawie

Centrum Rehabilitacji Funkcjonalnej Orthos

dr n. med. Piotr Szczudlik

Katedra i Klinika Neurologii

Warszawski Uniwersytet MedycznyERN EURO-NMD

mgr Jan Sznajder

Katedra Podstaw Fizjoterapii

Akademia Wychowania Fizycznego w Warszawie

dr hab. n. med. Kazimierz Tomczykiewicz

Poradnia Chorób Mięśni Kliniki Neurologicznej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

prof. dr hab. Katarzyna Tońska

Wydział Biologii

Instytut Genetyki i Biotechnologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

dr hab. n. med. Janusz Trzebicki

I Klinika Anestezjologii i Intensywnej Terapii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

dr n. med. Ewa Więsik-Szewczyk

Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii, Alergologii i Immunologii Klinicznej

Wojskowy Instytut Medyczny - Państwowy Instytut Badawczy

Centralny Szpital Kliniczny MON

Przedmowa

Drodzy Czytelnicy, Szanowni Państwo,

choroby nerwowo-mięśniowe (NMD) należą do grupy tzw. chorób rzadkich. Oznacza to, że na każdą z NMD choruje nie więcej niż 5 osób na 10 tys. populacji. Do dziś skatalogowano ponad 600 chorób monogenowych z tej grupy, opracowano nowe metody i kryteria diagnostyczne wielu chorób nabytych, poprawiło się rokowanie i oczekiwany czas przeżycia. Szacunkowe dane epidemiologiczne wskazują, że chorych z NMD jest co najmniej dwukrotnie więcej niż chorych ze stwardnieniem rozsianym, a podobnie dużo jak chorych z chorobą Parkinsona. Łączna populacja chorych z NMD w Polsce to wobec tego 90-100 tys. osób, w pełnym przekroju wiekowym. Oznacza to, że każdy neurolog dziecięcy i neurolog w Polsce ma pod swoją opieką chorych z NMD.

Brak uniwersalnych markerów biologicznych, brak standardów postępowania w wielu chorobach rzadkich, trudności diagnostyczne i niewystarczająca wiedza na temat tych chorób sprawiają, że część pacjentów przechodzi swoistą odyseję diagnostyczną, zanim zostanie postawione rozpoznanie i włączone odpowiednie leczenie. Zjawisko to nie tylko obciąża pacjenta i jego bliskich emocjonalnie, naraża na liczne, czasem zbędne procedury medyczne, generuje dodatkowe koszty w systemie ochrony zdrowia, ale przede wszystkim oddala w czasie możliwość leczenia. W przypadku wielu chorób wczesne rozpoznanie pozwala na wdrożenie farmakoterapii lub właściwej proaktywnej opieki interdyscyplinarnej zmniejszającej ryzyko powikłań, czasem nie tylko u pacjenta, ale również u innych chorych w jego rodzinie. Postęp, jaki się dokonał w diagnostyce, klasyfikacji, a także w leczeniu tej grupy chorób, zainspirował nas do podjęcia prac nad przygotowaniem monografii, którą oddajemy do Państwa rąk. Zamiarem naszym było stworzenie nowoczesnego podręcznika dla neurologów, neurologów dziecięcych, genetyków klinicznych oraz wszystkich lekarzy, którzy chcieliby poszerzyć swoją wiedzę w zakresie zarówno diagnostyki, jak i leczenia chorób nerwowo-mięśniowych.

Minęło ponad 15 lat od wydania książki Choroby nerwowo-mięśniowe pod redakcją prof. Ireny Hausmanowej-Petrusewicz. Wielu Autorów tego dzieła nie ma już niestety wśród nas, jednak Ich praca była dla nas inspiracją. Zespół Autorek i Autorów obecnej monografii to kolejne pokolenie neuromiologów, pracownicy, wychowankowie i współpracownicy Kliniki Neurologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego oraz znakomici eksperci z innych ośrodków w Polsce, od lat zajmujący się chorobami nerwowo-mięśniowymi. Wszystkim dziękujemy za przyjęcie zaproszenia do współtworzenia tej książki i ich ogromne zaangażowanie.

Klinika Neurologii WUM od ponad 60 lat rozwija ekspertyzę w dziedzinie chorób nerwowo-mięśniowych, a od 2016 r. jest członkiem Europejskiej Sieci Referencyjnej dla NMD (ERN EURO-NMD). Tradycja zapoczątkowana przez Nasze wspaniałe Nauczycielki i Nauczycieli, wybitnych polskich neuromiologów z zespołu stworzonego przed laty przez prof. Irenę Hausmanową-Petrusewicz, kontynuowana jest przez zespoły kierowane przez prof. Huberta Kwiecińskiego i prof. Annę Kamińską. Należeli do nich m.in. prof. Barbara Emeryk-Szajewska, prof. Katarzyna Rowińska-Marcińska, prof. Anna Fidziańska, prof. Hanna Jędrzejowska, dr hab. Barbara Badurska-Modrzycka, prof. Irena Niebrój-Dobosz, dr hab. Jerzy Kopeć, dr med. Aniela Kopeć, dr med. Maria "Hala" Strugalska-Cynowska, dr med. Hanna Drac, dr med. Barbara Ryniewicz, dr hab. Małgorzata Gaweł.

Dziękujemy wspaniałym lekarkom i lekarzom w całej Polsce, którzy z oddaniem i entuzjazmem diagnozują i leczą dzieci i dorosłych z chorobami nerwowo-mięśniowymi. Dzięki naszej wspólnej pracy możliwy był w ostatnich latach ogromny sukces diagnostyki i leczenia chorych z rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA). W ciągu zaledwie trzech lat od refundacji pierwszego przełomowego leku i jednego roku od rejestracji trzeciego leku w tym wskazaniu w Polsce mamy dostęp do wszystkich trzech nowatorskich terapii, powszechnych badań przesiewowych noworodków i terapii prowadzonej w 35 ośrodkach pediatrycznych i dla dorosłych. To dowód wielkiego potencjału polskiego środowiska neurologicznego. Odpowiednio wzmacniając ten potencjał, możemy i w innych chorobach nerwowo-mięśniowych wprowadzić modelowe rozwiązania na miarę europejską. Dziękujemy fizjoterapeutom, genetykom klinicznym, kardiologom, pulmonologom, anestezjologom, ortopedom, radiologom, neurofizjologom klinicznym i wielu innym, którzy nie boją się naszych pacjentów, są otwarci na ich potrzeby, wspólnie z nami budują standardy opieki. Mamy świadomość, że ta monografia nie wyczerpuje wszystkich zagadnień związanych z opieką interdyscyplinarną, tyle wyzwań jeszcze przed nami.

Dziękujemy wielu ludziom dobrej woli, menedżerom zdrowia, dziennikarzom, społecznikom i decydentom za to, że choroby rzadkie obecne są w debacie publicznej i wreszcie toczy się dynamicznie proces zmian systemowych, który przyczyni się do równouprawnienia naszych pacjentów, skróci odyseję diagnostyczną i poprawi dostęp do nowoczesnych terapii i rokowanie.

A przede wszystkim dziękujemy naszym Pacjentom i ich Rodzinom za okazywane nam zaufanie. Za wielką radość, którą czerpiemy z każdego, nawet drobnego Ich sukcesu. Mamy równocześnie trudną, bolesną niekiedy świadomość, jak wiele jeszcze jest do zrobienia. To mobilizuje nas do stałego rozwijania wiedzy i uzyskiwania dostępu do nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych. Dziękujemy organizacjom pacjenckim za współpracę. Jesteśmy pewne, że w chorobach rzadkich tylko działając wspólnie, jesteśmy w stanie wypracować odpowiednie rozwiązania systemowe.

Mamy nadzieję na życzliwe przyjęcie tej monografii przez Czytelników. Staraliśmy się przekazać najnowszy stan wiedzy w formie przydatnej dla lekarzy praktyków. Chcemy, aby książka ta wspierała codzienną pracę kliniczną, przyczyniając się do poprawy standardu opieki nad pacjentami z chorobami nerwowo-mięśniowymi.

Anna Kostera-Pruszczyk Anna Potulska-Chromik

1Badanie histopatologiczne w diagnostyce chorób mięśniAnna M. Kamińska, Biruta Kierdaszuk

Wprowadzenie

W procesie diagnostycznym chorób nerwowo-mięśniowych wstępne rozpoznanie ustalane jest na podstawie wywiadu i badania klinicznego pacjenta oraz wyników badań biochemicznych, immunologicznych i elektrofizjologicznych. W sytuacji, w której inne dostępne techniki, w tym badania genetyczne, nie pozwalają na jego potwierdzenie, w wielu przypadkach kolejnym badaniem jest biopsja mięśnia, czyli ocena histopatologiczna wycinka mięśnia szkieletowego. Zastosowanie technik histochemicznych i immunohistochemicznych pozwala na określenie rodzaju procesu chorobowego (pierwotnie mięśniowy czy neurogenny), dostarcza informacji o jego przebiegu (ostry czy przewlekły) oraz o stopniu zaawansowania choroby. Uzupełnienie diagnostyki o badanie wycinka mięśniowego w mikroskopie elektronowym daje podstawy do rozpoznania takich chorób, jak dystrofia oczno-gardłowa, miopatia mitochondrialna i wtrętowe zapalenie mięśni. Wynik biopsji mięśnia może także pomóc w wyborze dalszych badań genetycznych lub w interpretacji wyniku badania genetycznego (weryfikacja potencjalnej patogenności wariantów stwierdzonych w badaniach next-Generation Sequencing, NGS). Bioptat mięśnia jest również materiałem biologicznym wykorzystywanym w diagnostyce niektórych mitochondriopatii (rozdz. 5: Badania genetyczne w diagnostyce chorób mitochondrialnych).

Wskazania do biopsji mięśnia

Wskazaniami do wykonania biopsji mięśnia są: osłabienie mięśni, bóle mięśni, nietolerancja wysiłku fizycznego, podwyższona aktywność kinazy kreatynowej (creatine kinase, CK), mioglobinuria i rabdomioliza. W większości przypadków chorób pierwotnie mięśniowych przewlekłe osłabienie dotyczy mięśni proksymalnych kończyn górnych i dolnych, a wynik badania histopatologicznego potwierdza miopatię lub dystrofię mięśniową. Z kolei osłabienie mięśni gałkoruchowych i opadanie powiek może sugerować miopatię mitochondrialną. Spoczynkowe bóle mięśni mogą występować w przebiegu miopatii zapalnych, zaś bóle związane z wysiłkiem fizycznym są charakterystyczne dla miopatii metabolicznych - glikogenoz, miopatii tłuszczowych, a czasem także miopatii mitochondrialnych. Wykazano, że biopsja mięśnia jedynie w około 2% przypadków izolowanych dolegliwości bólowych mięśni wykazuje zmiany specyficzne [1]. Podwyższona aktywność kinazy kreatynowej może występować w przebiegu zarówno przewlekłych, jak i ostrych chorób pierwotnie mięśniowych. Wartość CK zależy od stopnia nasilenia zmian martwiczych w mięśniu. Jest najwyższa w miopatiach zapalnych, polekowych, metabolicznych oraz w dystrofinopatiach. Przed kwalifikacją pacjenta z podejrzeniem choroby nerwowo-mięśniowej do wykonania biopsji mięśnia zawsze należy wykluczyć możliwe przyczyny przy użyciu innych, o wiele mniej inwazyjnych metod, odznaczających się wysoką swoistością diagnostyczną, jak na przykład badań genetycznych w dystrofii mięśniowej Duchenne'a lub Beckera, podejrzeniu dystrofii miotonicznej typu 1 lub 2 czy badania metodą suchej kropli krwi (dried blood spot, DBS) w chorobie Pompego. W przypadku wystąpienia mioglobinurii i rabdomiolizy biopsję można wykonać dopiero po ustąpieniu ostrych objawów.

Technika wykonania biopsji mięśnia

Ze względu na konieczność odpowiedniego opracowania wycinka i zastosowania specjalnych barwień biopsja mięśnia powinna być wykonywana w specjalistycznym ośrodku. Możliwość zastosowania różnorodnych technik diagnostycznych oraz doświadczenie w ocenie tkanki mięśnia szkieletowego umożliwia rozpoznanie procesu chorobowego. W każdym przypadku laboratorium powinno być poinformowane o wstępnym rozpoznaniu, wieku pacjenta, mięśniu, z którego pobrano wycinek, oraz o lekach stosowanych przez pacjenta. Szczególne znaczenie dla oceny wycinka ma przyjmowanie leków z grupy glikokortykosteroidów oraz statyn. Ważnym etapem jest wybór odpowiedniego mięśnia do biopsji. Przede wszystkim powinien on wykazywać objawy choroby. Jednak w przewlekłych procesach związanych z dużym zanikiem mięśnie mogą być przerośnięte tkanką łączną i tłuszczową, co uniemożliwia ocenę wycinka. Podobnie mięsień bez cech osłabienia może nie wykazać żadnych odchyleń. Dlatego w procesach przewlekłych należy wybrać mięsień ze średnio zaawansowanym uszkodzeniem, a w procesach ostrych mięsień z ciężkim lub średnio zaawansowanym uszkodzeniem. Najczęściej wycinek pobiera się z mięśni proksymalnych - mięśnia naramiennego, dwugłowego ramienia i głowy bocznej mięśnia czworogłowego uda. Dla tych mięśni zostały opracowane normy oceny wycinka i składu procentowego poszczególnych typów włókien. W przypadku selektywnego zajęcia mięśni dystalnych badaniu można poddać mięsień brzuchaty łydki, piszczelowy przedni lub strzałkowy krótki. Należy unikać mięśni poddawanych w ostatnim czasie badaniu elektromiograficznemu (EMG) lub iniekcjom domięśniowym. Pomocna w doborze mięśnia do biopsji u pacjentów skąpoobjawowych może być wcześniejsza ocena układu mięśniowego metodą rezonansu magnetycznego, wskazująca mięśnie wykazujące cechy patologii.

Biopsję wykonuje się zwykle po znieczuleniu miejscowym 1% roztworem lidokainy, u dzieci stosowane są inne protokoły znieczulenia. W celu uniknięcia artefaktów nie należy bezpośrednio nastrzykiwać wybranego miejsca środkiem znieczulającym oraz pamiętać o możliwości zmiażdżenia mięśnia na skutek manipulowania pęsetą. Nie ma uzasadnienia wykonywanie biopsji w znieczuleniu ogólnym u pacjenta z chorobą pierwotnie mięśniową i możliwym ryzykiem hipertermii złośliwej. Biopsja powinna być wykonywana przez doświadczonego chirurga lub neurologa, który zna anatomię układu mięśniowego. Wyróżnia się dwie metody pobierania wycinka - biopsję otwartą i igłową. Większość ośrodków neuromiologicznych preferuje wykonywanie biopsji metodą otwartą ze względu na większą czułość w wykrywaniu drobnych zmian wieloogniskowych i brak ograniczeń wiekowych pacjenta. Ryzyko powikłań takiego zabiegu jest niewielkie, a w większości przypadków nie ma konieczności szycia powięzi szwem rozpuszczalnym. Zazwyczaj brzegi powięzi po równoległym do przebiegu włókien nacięciu schodzą się samoistnie. Zaleca się zdjęcie szwów skórnych zazwyczaj w 7.-8. dobie. Po zagojeniu rany na skórze pozostaje niemal niewidoczna jednocentymetrowa blizna [2, 3].

Opracowanie biopsji mięśnia

Pobrany wycinek mięśniowy powinno się od razu włożyć do zamkniętego suchego pojemnika i umieścić w termosie z lodem. Nie należy umieszczać pobranej tkanki w suchym lodzie, ponieważ może dojść do zamrożenia wycinka i powstania artefaktów. Podobnie nie powinno się wkładać wycinka do soli fizjologicznej ani innego płynu. Odpowiednio opisany wycinek należy jak najszybciej dostarczyć do laboratorium. Czas transportu nie powinien przekraczać 2 godzin.

Wycinek mięśnia przygotowywany jest do obejrzenia w mikroskopie świetlnym i elektronowym. Pobrany wycinek dzieli się na cztery części. Po jednej części jest przeznaczone do oceny w mikroskopie świetlnym i elektronowym, jeden fragment jest zatapiany w parafinie, a ostatni, po zamrożeniu, jest przechowywany w temperaturze -70°C i później wykorzystywany w części przypadków do badań genetycznych. Fragment do oceny w mikroskopie świetlnym, odpowiednio ustawiony, aby uzyskać przekroje poprzeczne włókien, jest zamrażany w izopentanie schłodzonym w ciekłym azocie do temperatury -160°C. W wyniku zastosowania tej metody po skrojeniu w kriostacie w temperaturze od -23°C do -25°C otrzymuje się tzw. skrawki świeżo mrożone (fresh frozen sections) grubości 7-10 ?m [4, 5].

Zgodnie z rekomendacjami European Reference Network EURO-NMD Neuromuscular Pathology Working Group z 2019 roku w celu oceny morfologicznej wykorzystywane są metody histologiczne, histochemiczne, immunohistochemiczne i ultrastrukturalne [6-11]. W mikroskopie świetlnym skrawki poddaje się barwieniu przy użyciu następujących rutynowych metod:

1) hematoksylina i eozyna (HE);

2) trichrom Gomoriego (TG);

3) barwienie na obecność tłuszczów - Oil red O (ORO) lub czernią Sudanu;

4) kwaśny odczynnik Schiffa (periodic acid-Schiff, PAS);

5) kwaśna fosfataza (acid phosphatase);

6) barwienie na aktywność enzymów utleniających:

a) dehydrogenazy bursztynianowej (succinate dehydrogenase, SDH),

b) dehydrogenazy zredukowanego dinukleotydu pirydynowego (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase, NADH),

c) dehydrogenazy mleczanowej (lactate dehydrogenase, LDH),

d) oksydazy cytochromu c (cytochrome c oxidase, COX);

7) metoda na aktywność ATPaz - ATPazy miozynowej w pH 9,4 oraz po preinkubacji ATPazy kwaśnej (pH 4,3 i pH 4,6).

W oparciu o rekomendacje European Reference Network EURO-NMD Neuromuscular Pathology Working Group należy także wykonać barwienia na obecność łańcuchów ciężkich miozyny, cząsteczek MHC klasy I i białka p62. Ponadto w przypadku podejrzenia poszczególnych jednostek chorobowych, jak: dystrofii mięśniowych, miopatii zapalnych, miopatii z gromadzeniem białek, miopatii wrodzonych, miopatii mitochondrialnych, miopatii toksycznych czy glikogenoz, lista barwień histochemicznych i immunohistochemicznych powinna być odpowiednio rozszerzona. Na przykład dla oceny wycinka w kierunku dystrofii mięśniowych wskazane będzie oznaczenie dystrofiny, utrofiny, sarkoglikanów, laminy A/C, kaweoliny-3, emeryny, teletoniny, COL6, a także wykonanie badania Western blot dla dystrofiny, dysferliny, kalpainy-3, sarkoglikanów. Przy miopatiach zapalnych zalecane jest oznaczenie p62, CD68, CD8, CD20, C5b-9, CD31, fosfatazy zasadowej, a czasem także ocena MHC klasy II, CD45/CD3, CD169, CD138, MUM1, MxA i ISG15. W przypadku miopatii z gromadzeniem białek wymieniane są barwienia na obecność p62, TDP-43, Lamp2, Dys1, MHC klasy I, C5b-9, desminy, myotiliny, ubikwityny, a czasem także LC3, FHL1, filaminy-C, BAG3, HSP70, HSP90, ?B-krystaliny, CD68 i CD45. Przy podejrzeniu miopatii toksycznych można wykonać badania na obecność CD45, CD68, LC3. Z kolei diagnostyka w kierunku glikogenoz może być uzupełniona o ocenę aktywności poszczególnych enzymów, jak fosfofruktokinaza i fosforylaza. Podejrzenie miopatii mitochondrialnych można potwierdzić, wykonując barwienie metodą SDH i COX, a w części przypadków za pomocą oceny spektrofotometrycznej można wykazać zaburzenia w funkcjonowaniu poszczególnych kompleksów łańcucha oddechowego. Wszystkie wymienione powyżej metody dają możliwość pełnej oceny histologicznej i immunohistochemicznej pobranego wycinka mięśnia [11]. Obecnie nadal toczy się dyskusja dotycząca zakresu badań uważanych za podstawowe i dodatkowe w poszczególnych typach miopatii.

W celu oceny biopsji w mikroskopie elektronowym po pobraniu odpowiedni fragment wycinka utrwala się aldehydem glutarowym i zatapia w żywicach epoksydowych (m.in. Spurr, Araldite, Epon). Półcienkie skrawki, służące do oceny wstępnej preparatu w mikroskopie świetlnym, barwi się błękitem toluidyny. Pozwala to na wybranie fragmentu zawierającego zmiany do oceny w mikroskopie elektronowym. Skrawki ultracienkie podlegają barwieniu octanem uranylu i dobarwieniu cytrynianem ołowiu [10].

Ocena biopsji mięśnia

Za pomocą klasycznych metod histologicznych w mikroskopii świetlnej określane są między innymi kształt i wielkość włókien mięśniowych. Średnica włókna mięśniowego zależy od wieku pacjenta, u dorosłych waha się pomiędzy 10 ?m a 70 ?m. Mała średnica włókien może być efektem zahamowania rozwoju, może występować w przebiegu wielu procesów chorobowych, jak miopatie i dystrofie mięśniowe, odnerwienie, stany wyniszczenia, a także w czasie fizjologicznego starzenia się. Z kolei wskutek nadmiernej aktywności włókna dochodzi do jego powiększenia, co skutkuje utrudnionym dopływem tlenu do jego wnętrza i ostatecznie rozszczepieniem oraz martwicą. Do innych ocenianych zmian należą: centralna lokalizacja jąder komórkowych, obecność włókien ulegających martwicy, martwicy z fagocytozą lub regeneracji, włókien szkliwiejących, rozszczepionych lub włókien okrężnych, jak również występowanie złogów i wodniczek. Wodniczki mogą być efektem procesu zwyrodnieniowego włókien, mogą także gromadzić różne substancje, jak tłuszcze, glikogen, fragmenty cytoplazmy. W biopsji można stwierdzić przerost tkanki łącznej i tłuszczowej oraz nacieki zapalne z komórek jednojądrzastych. Za charakterystyczne cechy uszkodzenia miopatycznego uznaje się martwicę włókien, włókna regenerujące i centralnie położone jądra, zaś za zmiany neurogenne uważa się grupowy zanik włókien. Wymienione zmiany zaliczane są do nieswoistych, czyli mogących wystąpić w wielu różnych chorobach nerwowo-mięśniowych. Liczne centralnie położone jądra, włókna zanikłe w postaci tzw. nuclear clumps oraz zanik włókien typu 2 można przykładowo stwierdzić w dystrofii miotonicznej typu 2. Jednak, podobnie jak w dystrofii miotonicznej typu 1, obserwuje się zwykle charakterystyczny obraz kliniczny, a w badaniu EMG - wyładowania miotoniczne. Dlatego obecnie badaniem rozstrzygającym o rozpoznaniu jest badanie genetyczne, a biopsja nie powinna być rutynowo wykonywana przy podejrzeniu zaburzeń miotonicznych. Zmiany swoiste, czyli charakterystyczne dla danego schorzenia, zostały wymienione w tab. 1.1 [12]. Jednak obecność pojedynczych zmian swoistych w badanym wycinku nie daje w większości przypadków podstaw do rozpoznania określonej jednostki chorobowej.

Tabela 1.1.

Zmiany w biopsji mięśnia charakterystyczne dla danej miopatii (na podstawie [9])

Zmiany

Rozpoznanie

"central core"

miopatia "central core"

"multiminicore"

miopatia "multiminicore"

struktury nitkowate

miopatia nemalinowa

agregaty tubularne

miopatia z tubularnymi agregatami

włókna szmatowate

mitochondriopatie

gromadzenie glikogenu

glikogenozy

gromadzenie tłuszczu

miopatie tłuszczowe

gromadzenie desminy

miopatia miofibrylarna

małe włókna z pojedynczymi i ośrodkowo położonymi jądrami

miopatia miotubularna

układ aktywności enzymów utleniających w kształcie "szprych rowerowych" i zanik włókien typu 1

miopatia centronuklearna

"czapeczki"

miopatia "czapeczek"

rimmed vacuoles, tubulofilamentarne wtręty w cytoplazmie i/lub w jądrach

wtrętowe zapalenie mięśni

Rycina 1.1.

Zmiany nieswoiste w biopsji mięśnia, HE, powiększenie × 200: A. Włókna ulegające martwicyz fagocytozą. B. Włókna przerosłe ulegające rozszczepieniu. C. Naciek komórek jednojądrzastych.

Badania histochemiczne pozwalają na rozróżnienie włókien oksydacyjnych (typu 1) i glikolitycznych (typu 2), zmian o charakterze "central core" oraz cech uszkodzenia neurogennego, takich jak grupowanie włókien jednego typu i zanik grupowy. Przy pomocy barwienia metodą ORO lub czernią Sudanu można wykazać obecność tłuszczu we włóknach mięśniowych. Barwienia PAS, barwienia z użyciem PAS i diastazy, a także barwienia na aktywność fosforylaz pozwalają potwierdzić podejrzenie glikogenoz. W przebiegu miopatii zapalnych często znajduje się nacieki limfocytarne w tkance łącznej okołopęczkowej lub rozproszone w obrębie pęczków. Metody histochemiczne pozwalają także wykazać zmiany w strukturze mitochondriów, czyli włókna szmatowate (ragged-red fibers, RRF), niedobory enzymatyczne, obecność wodniczek czy charakterystycznych struktur, takich jak zmiany typu "central core" i struktury nitkowate. Układ aktywności enzymów utleniających przypominający "szprychy rowerowe" jest charakterystyczny dla miopatii centronuklearnych.

Metody immunohistochemiczne pozwalają na potwierdzenie obecności różnych białek w komórce mięśniowej, jej błonie lub w jądrze komórkowym. W dystrofii mięśniowej Duchenne'a można wykazać całkowity brak dystrofiny, w dystrofii Beckera zaś jej częściowy brak. Ponadto metody immunohistochemiczne pozwalają wykazać brak dysferliny, kalpainy-3, sarkoglikanów, emeryny, laminy A/C, jak również złogi desminy, ?-amyloidu czy innych cząsteczek.

Ocena biopsji w mikroskopie elektronowym może pomóc w potwierdzeniu rozpoznania. Metoda ta umożliwia wykrycie wielu charakterystycznych zmian ultrastrukturalnych, takich jak: układ sarkomerów w miopatiach nemalinowych, obłoniony glikogen w chorobie Pompego, wtręty zarówno wewnątrzjądrowe, jak i cytoplazmatyczne we wtrętowym zapaleniu mięśni, wtręty wewnątrzjądrowe w dystrofii oczno-gardłowej oraz mitochondria z parakrystalicznymi wtrętami opisywane w miopatiach mitochondrialnych.

Rycina 1.2.

Zmiany ultrastrukturalne w badaniu wycinka mięśnia w mikroskopie elektronowym: A. Obłoniony glikogen w chorobie Pompego, powiększenie × 20 000. B. Wtręty wewnątrzjądrowe w dystrofii oczno-gardłowej, powiększenie × 25 000. C. Parakrystaliczne wtręty w zmienionych mitochondriach w miopatii mitochondrialnej, powiększenie × 6000.

Podsumowując, należy podkreślić, że biopsja mięśnia stanowi istotny element w diagnostyce chorób nerwowo-mięśniowych. Na jej podstawie określany jest charakter procesu chorobowego i stopień jego zaawansowania. Stwierdzenie zmian patognomonicznych, takich jak wtręty wewnątrzjądrowe w dystrofii oczno-gardłowej czy obłoniony glikogen w chorobie Pompego, wskazuje ostateczną diagnozę. Należy jednak podkreślić, że zgodnie z aktualnymi rekomendacjami rozpoznanie choroby Pompego powinno być ustalane na podstawie badania enzymatycznego potwierdzającego niedobór kwaśnej maltazy, uzupełnionego o badanie genetyczne. Wynik badania histopatologicznego mięśnia może wpłynąć zarówno na rozpoznanie, jak i na dalsze postępowanie terapeutyczne. Przykładem jest opracowanie Lai i wsp., gdzie odpowiednio u 47% i 33% pacjentów zmieniono diagnozę lub leczenie po otrzymaniu opisu wycinka mięśnia [13]. Jednak nie zawsze biopsja pozwala rozstrzygnąć wątpliwości kliniczne, czasem mimo wyraźnych objawów jej wynik nie wskazuje na uszkodzenie mięśni. Ograniczeniem jest też brak możliwości jednoczesnej oceny wycinków pobranych z kilku miejsc. Dlatego przy podejrzeniu choroby nerwowo-mięśniowej wskazania do wykonania biopsji mięśnia należy ustalać w oparciu o wywiad rodzinny, wyniki innych badań i możliwości diagnostyki genetycznej.

Piśmiennictwo

1. Filosto M., Tonin P., Vattemi G., Bertolasi L., Simonati A., Rizzuto N. i Tomelleri G.: The role of muscle biopsy in investigating isolated muscle pain. Neurology. 2007, 68(3): 181-186.

2. Brink J.: Open Muscle Biopsy. Operative Techniques in General Surgery. 2002, 4(3): 235-238.

3. Joyce N.C., Oskarsson B. i Jin L.W.: Muscle biopsy evaluation in neuromuscular disorders. Phys Med Rehabil Clin N Am. 2012, 23(3): 609-631.

4. Anderson J.R.: Recommendations for the biopsy procedure and assessment of skeletal muscle biopsies. Virchows Arch. 1997, 431(4): 227-233.

5. Nix J.S. i Moore S.A.: What every neuropathologist need to know: The muscle biopsy. J Neuropathol Exp Neurol. 2020, 79(7): 719-733.

6. Fidziańska A.: Histopatologia mięśni. W: Hausmanowa-Petrusewicz I. (red.): Choroby nerwowo-mięśniowe. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999: 88-103.

7. Fidziańska A.: Ultrastruktura prawidłowej i zmienionej komórki mięśniowej. W: Hausmanowa-Petrusewicz I. (red.): Choroby nerwowo-mięśniowe. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999: 104-125.

8. Strugalska M.H.: Histochemiczny aspekt chorób mięśni. W: Hausmanowa-Petrusewicz I. (red.): Choroby nerwowo-mięśniowe. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999: 126-145.

9. Fidziańska A.: Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce chorób mięśniowych. W: Hausmanowa-Petrusewicz I. (red.): Choroby nerwowo-mięśniowe. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999: 146-153.

10. Dubowitz V. i Sewry C.A.: The procedure of muscle biopsy. W: Dubowitz V. i Sewry C.A.: Muscle biopsy. A practical approach. Saunders: Elsevier, 2007: 3-39.

11. Udd B., Stenzel W., Oldfors A., Olivé M., Romero N., Lammens M., Kusters B., Sewry C., Goebel H.-H., Evangelista T.: 1st ENMC European meeting: The EURO-NMD pathology working group Recommended Standards for Muscle Pathology. Neuromuscul Disord. 2019, 29(6): 483-485.

12. Kamińska A.: Histopatologia i histochemia mięśnia szkieletowego w normie i uszkodzeniach pierwotnie mięśniowych. W: Drozdowski W. (red.): Postępy w diagnostyce i leczeniu chorób mięśni. Kraków: Wydawnictwo Medycyna Praktyczna, 2004: 11-12.

13. Lai C.H., Melli G., Chang Y.J., Skolasky R.L., Corse A.M., Wagner K.R. i Cornblath D.R.: Open muscle biopsy in suspected myopathy: Diagnostic yield and clinical utility. Eur J Neurol. 2010, 17(1): 136-142.

2Badania genetyczne w diagnostyce chorób nerwowo-mięśniowych: choroby monogenowe Maria Jędrzejowska

Wprowadzenie

Do chorób nerwowo-mięśniowych zalicza się kilkaset różnych jednostek chorobowych, rzadkich lub ultrarzadkich. Większość z nich ma podłoże genetyczne i uwarunkowana jest monogenowo (wiąże się z uszkodzeniem pojedynczego genu). Do chwili obecnej z objawami klinicznymi chorób nerwowo-mięśniowych powiązano ponad 600 genów.

Do niedawna algorytm diagnostyczny chorób nerwowo-mięśniowych obejmował zebranie wywiadu (w tym rodzinnego), ocenę kliniczną, badania dodatkowe, m.in.: aktywność kinazy kreatynowej (creatine kinase, CK), badania elektrofizjologiczne, biopsję mięśnia). Wysunięte na tej podstawie podejrzenie kliniczne weryfikowano badaniem genetycznym, o ile było ono możliwe. W niektórych jednostkach chorobowych, relatywnie częstych, o zdefiniowanym fenotypie i homogennym podłożu molekularnym, badanie genetyczne wysunęło się w procesie diagnostycznym na plan pierwszy. W przypadku podejrzenia rdzeniowego zaniku mięśni, dystrofii mięśniowej Duchenne'a czy dystrofii miotonicznej celowane badania genetyczne wykonywane są w pierwszej kolejności. W niektórych przypadkach badanie genetyczne stanowi wręcz rodzaj przesiewu celowanego, np. badanie w kierunku rdzeniowego zaniku mięśni (spinal muscular artophy, SMA) w diagnostyce dziecka wiotkiego czy badanie delecji/duplikacji genu DMD w przypadku hiper-CK-emii.

W ostatnim okresie obserwujemy jednak tendencję do całkowitego odwrócenia procesu diagnostycznego i rozpoczynania diagnostyki każdego przypadku od badań genetycznych, czyli przejście "od genotypu do fenotypu". Punktem zwrotnym stało się wdrożenie do celów diagnostycznych wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania następnej generacji (next generation sequencing, NGS). Umożliwiają one równoczasowe sekwencjonowanie olbrzymiej liczby krótkich fragmentów DNA (deoxyribonucleic acid, kwas deoksyrybonukleinowy), a tym samym równoległe badanie wielu genów. Dzięki tej metodzie diagnostycznej znacznie zwiększył się odsetek rozpoznań w klinicznie niespecyficznej grupie chorób nerwowo-mięśniowych. Niestety, jak każda technika, tak i sekwencjonowanie następnej generacji, niesie ze sobą istotne ograniczenia. Nie każdą chorobę da się zdiagnozować przy pomocy NGS i nie każdy wynik badania NGS przyniesie konkluzywne rozpoznanie. Tym samym, na obecnym poziomie wiedzy, zebranie jak najszerszych informacji o pacjencie, prawidłowe myślenie kliniczne oraz szczegółowa diagnostyka, wciąż pozostają niezastąpione. Kluczowy staje się także odpowiedni dobór badania genetycznego i umiejętność jego interpretacji, aby uniknąć niebezpieczeństwa związanego z nadinterpretacją VUS (wariantu o niepewnym lub nieznanym znaczeniu, variant of uncertain or unknown significance).

DM1/DM2 (myotonic dystrophy 1/2) - dystrofia miotoniczna typu 1 i typu 2; DMD (Duchenne muscular dystrophy) - Dystrofia mięśniowa Duchenne'a; EMG (electromyography) - elektromiografia; FSHD (fascioscapulohumeral muscular dystrophy) - dystrofii twarzowo-łopatkowo-ramieniowej; MRI (magnetic resonance imaging) - obrazowanie rezonansem magnetycznym; NCV (nerve conduction velocity) - elektroneurografia; NGS (next generation sequencing) - sekwencjonowania nowej generacji; OPMD (oculopharyngeal muscular dystrophy) - dystrofia oczno-gardłowa; SBMA (spinal-bulbar muscular atrophy) - opuszkowo-rdzeniowy zanik mięśni; SMA (spinal muscular artophy) - rdzeniowy zanik mięśni; WES (whole exome sequencing) - sekwencjonowanie całej sekwencji kodującej genomu, tzn. eksomu; WGS (whole genome sequencing) - sekwencjonowanie całego genomu.

Rycina 2.1.

Miejsce badań genetycznych w diagnostyce chorób nerwowo-mięśniowych - przejście od genotypu do fenotypu. A. Klasyczny algorytm diagnostyczny chorób nerwowo-mięśniowych. B. Odwrócony algorytm diagnostyczny chorób nerwowo-mięśniowych - "od genotypu do fenotypu".

Kiedy wykonać celowane badanie genetyczne?

Szeregu chorób nerwowo-mięśniowych nie da się zdiagnozować przy pomocy techniki NGS. Dzieje się tak przede wszystkim ze względu na typ defektu molekularnego wiązanego z daną jednostką chorobową, którego na obecnym poziomie rozwoju technologicznego NGS "nie widzi". Do tego typu defektów należą mutacje dynamiczne oraz duże delecje/duplikacje (uzyskanie wyniku staje się coraz bardziej możliwe; zależy jednak od stosowanej metody uzyskania danych NGS). Dużym problemem interpretacyjnym jest także obecność w naszym materiale genetycznym bardzo podobnych do siebie genów/regionów genomu (tzw. pseudogenów), nierozróżnianych wysokoprzepustowymi technikami sekwencjonowania. W takim przypadku nie wiemy, czy zidentyfikowany w badaniu defekt dotyczy genu właściwego, czy jego bliźniaczo podobnego odpowiednika, którego uszkodzenie nie powoduje jednak choroby.

Dlatego w przypadku kilku ważnych i częstych schorzeń nerwowo-mięśniowych musimy wybrać celowane badanie genetyczne ukierunkowane na konkretny defekt molekularny. Należą do nich:

1. Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (Duchenne muscular dystrophy, DMD)

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a, jak i inne dystrofinopatie, wiązana jest z uszkodzeniem genu DMD. Około 70% identyfikowanych wariantów genu DMD stanowią delecje i duplikacje. Do wykrycia ww. defektów wskazane jest badanie metodą MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) jako pierwsze badanie diagnostyczne. Dopiero brak delecji/duplikacji w genie DMD jest wskazaniem do sekwencjonowania genu.

2. Rdzeniowy zanik mięśni (spinal muscular atrophy, SMA)

U około 96% pacjentów z SMA identyfikuje się obualleliczną utratę (brak obu kopii) genu SMN1. Do wykrycia ww. defektu wskazane jest badanie metodą MLPA lub RT-PCR (real-time polymerase chain reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym). Wraz z wprowadzeniem do programu badań przesiewowych noworodków analizy w kierunku SMA każdy noworodek ma wykluczoną obualleliczną delecję genu SMN1. Badania przesiewowe w kierunku SMA nie identyfikują 2-3% dzieci z rzadkimi mutacjami punktowymi genu SMN1. W przypadku objawów sugerujących SMA nadal metodą diagnostyczną z wyboru jest badanie metodą MLPA, a w przypadku potwierdzenia obecności jednej kopii SMN1 sekwencjonowanie genu SMN1 w kierunku mutacji punktowych.

3. Dystrofia miotoniczna typu 1 i typu 2 (myotonic dystrophy 1 and 2, DM1 i DM2)

Obie choroby związane są z mutacjami dynamicznymi, czyli zwielokrotnieniem (ekspansją) liczby sekwencji powtórzonych (DM1 - ekspansja powtórzeń CTG w genie DMPK, DM2 - ekspansja powtórzeń CTTG w genie CNBP [inna nazwa ZNF9]). Badaniem genetycznym z wyboru jest badanie techniką RP-PCR (powtórzona PCR, repeat-primed PCR).

4. Dystrofia twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)

U 95% pacjentów z rozpoznaniem klinicznym FSHD stwierdza się delecję powtórzonych fragmentów D4Z4 w regionie subtelomerowym chromosomu 4q35 (tzw. FSHD1). Ze względu na rodzaj defektu, powiązanie objawów z konkretnym haplotypem oraz obecność podobnych regionów w innych częściach genomu, badaniem z wyboru nadal jest technika Southern blot.

5. Choroba Charcota-Mariego-Tootha typu 1A (CMT1A)

Wiązana jest z duplikacjami genu PMP22. Jest przyczyną około 50% wszystkich zachorowań na neuropatie genetycznie uwarunkowane. Delecje genu PMP22 wiązane są obrazem klinicznym dziedzicznej neuropatii z nadwrażliwością na ucisk (HNPP). Celem wykrycia delecji/duplikacji genu PMP22 stosuje się technikę MLPA, rzadziej RT-PCR.

Do rzadszych, ale istotnych klinicznie schorzeń nerwowo-mięśniowych, wiązanych z mutacjami dynamicznymi, należą także: choroba Kennedy'ego (spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA; gen AR), dystrofia oczno-gardłowa (oculopharyngeal muscular dystrophy, OPMD; gen PABPN1) oraz stwardnienie zanikowe boczne z otępieniem czołowo-skroniowym (frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis 1, FTDALS1; gen C9orf72rf), stanowiące około 40% rodzinnych zachorowań na stwardnienie boczne zanikowe (amyotrophic lateral sclerosis, ALS).

Znajomość obrazu klinicznego ww. schorzeń jest konieczna, by w określonych sytuacjach klinicznych podjąć odpowiednią decyzję diagnostyczną. Badania w kierunku DMD, SMA, CMT1A czy DM1/DM2 często wykonuje się w ramach diagnostyki różnicowej lub dla wykluczenia np. DMD w przypadku hiperCK-emii, rdzeniowego zaniku mięśni (SMA, spinal muscular artophy) w zespole dziecka wiotkiego, CMT1A przy podejrzeniu neuropatii genetycznie uwarunkowanej.

Sekwencjonowanie następnej generacji

Jeżeli obraz kliniczny nie sugeruje jednej z wymieniowych wyżej jednostek chorobowych o specyficznym podłożu genetycznym lub dane kliniczne wskazują na chorobę / grupę chorób o heterogennym podłożu molekularnym, to metodą z wyboru staje się technika sekwencjonowania następnej generacji . Badanie to dostępne jest w kilku opcjach diagnostycznych. Można równolegle sekwencjonować określone z góry grupy genów (tzw. panele genowe), całą sekwencję kodującą naszego genomu (tzn. eksom - whole exome sequencing, WES), a nawet cały genom (whole genome sequencing, WGS). Poszczególne opcje różnią się ilością i jakością uzyskanych danych bioinformatycznych oraz ceną. Wybór warto dostosować do sytuacji klinicznej.

Panele genowe

W przypadku paneli genowych uzyskujemy dobrej jakości dane o określonych grupach genów, np. wiązanych z dystrofią obręczowo-kończynową. Wybór genów analizowanych w danym panelu zależy jednak od laboratorium oferującego dany zestaw. Przed zleceniem badania warto zatem przejrzeć listę genów objętych badaniem. Takie podejście diagnostyczne wydaje się metodą z wyboru w przypadku określonego, już zawężonego podejrzenia klinicznego.

Badanie eksomu (WES)

Sekwencjonowanie eksomowe daje informacje o sekwencji regionów kodujących wszystkich genów, czyli w przybliżeniu o 1,5% informacji zawartej w genomie. Szacuje się, że w obrębie eksomu zlokalizowanych jest około 85% wariantów sprawczych odpowiedzialnych za choroby monogenowe. Ceną dużej ilości danych uzyskanych z analizy eksomowej jest ich gorsza jakość, np. w porównaniu z badaniem panelowym. Dla blisko 10% sekwencji nie uzyskuje się danych optymalnej jakości (tzw. pokrycie). Tym samym ocena występowania wariantów w tych regionach jest ograniczona/niemożliwa. Podejście eksomowe jest szczególnie użyteczne, jeśli na podstawie obrazu klinicznego i dotychczas wykonanych badań nie udało się wysunąć konkretnego podejrzenia klinicznego lub lista genów wiązanych z danym schorzeniem / grupą schorzeń jest bardzo szeroka. Analizę danych eksomowych można prowadzić dwojako: albo w kierunku dominujących u pacjenta objawów klinicznych, które wiązane są wg algorytmów i baz danych (Exomiser, Phenomizer, OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man - baza danych o wszystkich opisanych chorobach uwarunkowanych genetycznie występujących u człowieka) z określonymi genami, albo analizując wybraną grupę genów (np. wszystkie wiązane z chorobami nerwowo-mięśniowymi). Ogromną rolę odgrywa klinicysta. Od właściwie sprecyzowanego pytania zależy w dużej mierze skuteczność uzyskania wyniku informacyjnego. Zarówno według zaleceń ACMG (American College of Medical Genetics - Association for Molecular Pathology), jak i EuroGentest, dane bioinformatyczne są zawsze analizowane w kontekście objawów klinicznych pacjenta i tylko warianty korespondujące z obrazem klinicznym powinny być sprawozdawane. Każdorazowo należy zatem określić zakres badania i/lub opisać precyzyjnie objawy kliniczne. Opis symptomatologii systematyzuje baza Human Phenotype Ontology (HPO, https://hpo.jax.org/app). Jest to baza danych ujednolicająca terminologię medyczną poprzez przyporządkowanie numerów konkretnym objawom klinicznym (np.: HP: 0009073 - progressive proximal muscle weakness; HP: 0006844 - absent patellar reflexes; HP: 0006380 - knee flexion contracture). Na podstawie tak sporządzonej listy objawów diagnosta laboratoryjny może wytypować podejrzane warianty. Warto pamiętać, że przy ilości danych uzyskanych z analizy bioinformatycznej eksomu na obecnym poziomie wiedzy, dokładne przenalizowanie wszystkich genów nie jest możliwe i owocuje generowaniem niekonkluzywnych wyników. Każdorazowo kluczowa jest dobra współpraca z ośrodkiem wykonującym badanie, a w szczególności z diagnostą laboratoryjnym analizującym dane bioinformatyczne. Często zauważa on wariant, który teoretycznie nie wiąże się jednoznacznie z oberwanym fenotypem, ale po pogłębionej analizie klinicznej okazuje się wariantem sprawczym. Z uwagi na ograniczone w praktyce kontakty klinicysty z diagnostą coraz częściej stosuje się tzw. szerokie panele genowe. Jest to nic innego jak badanie eksomu z analizą określonej z góry grupy genów, np. wszystkich związanych z chorobami nerwowo-mięśniowymi (aktualna lista patrz: [11]). Uzyskuje się wówczas informację o wszystkich podejrzanych wariantach w obrębie zleconej do przeanalizowania grupy genów.

W przypadku wyników eksomowych ACMG dopuszcza także raportowanie tzw. secondary findings, czyli patogennych wariantów w genach istotnych dla życia człowieka, nie związanych jednak z chorobą podstawową. Ich zidentyfikowanie umożliwia podjęcie określonych działań, np. profilaktycznych, modyfikujących ryzyko i przebieg zachorowania w przyszłości oraz istotnych z punktu widzenia rodziny chorego. Aktualna lista obejmuje 73 takie geny [12]. Wiązane są przede wszystkim z chorobami nowotworowymi (np. TP53, BRCA1, BRCA2), ale także neurologicznymi, jak choroba Wilsona czy stwardnienie guzowate.

Badanie genomu (WGS)

Sekwencjonowanie pełnogenomowe pozwala na uzyskanie danych całej informacji genetycznej naszego genomu jądrowego. W chwili obecnej nie jest rutynowo używane do diagnostyki ze względu na swoją wysoką cenę oraz ograniczone możliwości interpretacji zidentyfikowanych wariantów w obszarach niekodujących. Takie podejście coraz szerzej wykorzystywane jest w badaniach naukowych, a z czasem będzie nabierać znaczenia w kontekście diagnostycznym.

Interpretacja wyników metodą sekwencjonowania następnej generacji

Ostateczny wynik badania NGS jest efektem współpracy szeregu specjalistów: informatyków, bioinformatyków i diagnostów laboratoryjnych. Największym wyzwaniem analizy NGS jest liczba uzyskiwanych danych i ich interpretacja w kontekście klinicznym. Dla przykładu u pojedynczego chorego w badaniu eksomu uzyskuje się > 90 tys. różnic w porównaniu z eksomem referencyjnym. W przypadku analizy genomu ta liczba może sięgać kilku milionów. Po zawężeniu ilości danych poprzez odrzucenie wariantów częstych (> 5% w populacji) w analizie eksomu pozostaje do oceny zwykle kilka tysięcy zmian. Dlatego tak kluczowe są wskazania kliniczne - podanie objawów choroby, w kontekście których rozpatrywane będą uzyskane dane, lub zakresu analizy badanych genów. W przypadku ograniczenia analizy do panelu nerwowo-mięśniowego (ponad 600 genów) szczegółowej analizie poddawanych jest około 200 wariantów. Analiza patogenności wariantów prowadzona przez diagnostę laboratoryjnego obejmuje: typ uszkodzenia (warianty nonsensowne, zmiany sensu, splicingowe itd.), predykcję in silico (patogenność ocenianą na podstawie programów komputerowych), częstość w bazach danych: genetycznych (zawierających dane osób chorych, m.in. HGMD, ClinVar, Varsome) i populacyjnych (osób potencjalnie zdrowych, np. gnomAD, bazy własne danego laboratorium) oraz analizę segregacji. Na tej podstawie dany wariant jest klasyfikowany do jednej z pięciu klas: patogenny, prawdopodobnie patogenny, wariant o nieznanej patogenności (VUS), wariant prawdopodobnie łagodny i łagodny. Istotne klinicznie są warianty patogenne i prawdopodobnie patogenne. Te zwykle wiążą się z chorobą i są raportowane w wyniku. Najtrudniejszym elementem jest ocena wariantów o nieznanej patogenności, czyli takich, których na obecnym poziomie wiedzy nie możemy jednoznacznie ani powiązać z objawami, ani też zdyskwalifikować. Kluczowym elementem oceny patogenności jest również analiza segregacji zmian w rodzinie, to znaczy sprawdzenie, czy dany wariant(y) występuje(-ą) u rodziców/rodzeństwa. W przypadku chorób o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym konieczne jest potwierdzenie występowania wariantów w układzie trans, czyli oburodzicielskiego pochodzenie zmian (po jednym wariancie od każdego rodzica). Zdarza się bowiem, że dwa warianty w tym samym genie występują na jednym allelu (pochodzą od jednego rodzica) - wówczas nie mają one znaczenia klinicznego. Z kolei obecność wariantu o dziedziczeniu autosomalnym dominującym u zdrowego bezobjawowego rodzica podważa jego patogenność. Analiza segregacji w rodzinie niejednokrotnie zmienia kwalifikację patogenności danego wariantu. W przypadku choroby o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym wariant typu VUS, który występuje razem z wariantem patogennym, a analiza segregacji potwierdza oburodzicielskie dziedziczenie, staje się wariantem prawdopodobnie patogennym. Bez analizy segregacji wariantów w rodzinie nie można uznać diagnostyki genetycznej za ukończoną, zwłaszcza w przypadku nowych, nieraportowanych wariantów.

Jak każdy wynik diagnostyczny, także i wynik badania NGS warto próbować samemu interpretować. Nie zawsze pochodzi on z laboratorium, które znamy i do którego mamy zaufanie. W wyniku badania genetycznego powinien być obecny zapis zidentyfikowanego wariantu (zgodny z zalecaniami HGVS), jednostka chorobowa z nim powiązana, sposób dziedziczenia choroby, ekson w którym zidentyfikowano wariant, pochodzenie wariantu (de novo, rodzicielskie), zygotyczność. Powinna się także znaleźć informacja, czy wariant jest znany i opisany w bazach, czy też jest wariantem nowym, dotąd nieopisywanym. Jeśli wariant jest nowy, zawsze warto zwrócić uwagę na typ defektu, jaki powoduje. Częściej patogenne są zmiany prowadzące do skrócenia produktu białkowego (nonsensowne oraz powodujące zaburzenia składania). Także im rzadsza zmiana, tym większa szansa na jej patogenność.

Uzyskanie wyniku badania genetycznego nie kończy diagnostyki. W przypadku wyników badań NGS trzeba przede wszystkim odpowiedzieć na pytanie, czy zidentyfikowany/-e wariant/-y koresponduje/-ą z obserwowanym obrazem klinicznym. Dotyczy to zwłaszcza odwróconego modelu diagnostyki "genotyp-fenotyp", w którym badania genetyczne są wykonywane jako pierwsze. Klinicysta zobowiązany jest przejrzeć bazy chorób (GeneReviews, OMIM) oraz opisy literaturowe i sprawdzić spójność wyników z obrazem klinicznym. Tylko przy pełnej zgodności oraz potwierdzeniu segregacji zidentyfikowanych wariantów może rozpoznać daną jednostkę chorobową. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości lub gdy wyniki analizy NGS są niejednoznaczne (warianty nowe, nieopisywane lub VUS), wskazane jest pogłębienie diagnostyki klinicznej. Warto pamiętać, że na bazie rozpoznania nie tylko planowane są badania profilaktyczne i postępowanie terapeutyczne, lecz także podejmowane decyzje odnośnie do prokreacji w rodzinie. Coraz częściej wynik badania genetycznego jest też podstawą kwalifikacji do wdrożenia leczenia przyczynowego.

Podsumowanie

Badania genetyczne są niezwykle istotnym, często kluczowym elementem diagnostyki chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak nawet przy zastosowaniu najnowszych metod nie udaje się ustalić przyczyny genetycznej około 40% tych schorzeń. Dlatego każdorazowo diagnostyka powinna być rozpoczęta od wywiadu, w tym rodzinnego, oraz oceny obrazu klinicznego. Na tej podstawie należy podjąć decyzję, czy proces diagnostyczny rozpocząć od pogłębienia diagnostyki klinicznej, wykonać celowane badania genetyczne czy też diagnostykę metodami sekwencjonowania następnej generacji. W chorobach o ciężkim przebiegu i nieznanym rokowaniu wskazane jest równoległe prowadzenie diagnostyki klinicznej i badań genetycznych.

Piśmiennictwo

1. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K. i Rehm H.L.; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee: Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015, 17(5): 405-424.

2. Matthijs G. i in. (red.): EuroGentest. Guidelines for diagnostic next generation sequencing. Pobrano 6.12.2021 z: http://www.eurogentest.org/fileadmin/templates/eugt/pdf/NGS_Guidelines/EuroGentest_NGS_guidelines_2014_-_final_draft_02-12-2014_v2.pdf.

3. OMIM: Online Mendelian Inheritance In Man [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: https://omim.org.

4. Human Phenotype Ontology [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: https://hpo.jax.org/app.

5. GeneReviews [strona czasopisma]. Pobrano 6.12.2021 z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116.

6. Human Genome Variation Society [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: http://www.hgvs.org/.

7. ClinVar [strona archiwum]. Pobrano 6.12.2021 z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/.

8. Human Gene Mutation Database [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php.

9. Varsome [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: https://varsome.com.

10. gnomAD [strona główna]. Pobrano 6.12.2021 z: https://gnomad.broadinstitute.org/.

11. Bonne G. i Rivier F.: GeneTable of Neuromuscular Disorders. Pobrano 6.12.2021 z: http://www.musclegenetable.fr.

12. Miller D.T., Lee K., Chung W.K., Gordon A.S., Herman G.E., Klein T.E., Stewart D.R., Amendola L.M., Adelman K., Bale S.J., Gollob M.H., Harrison S.M., Hershberger R.E., McKelvey K., Richards C.S., Vlangos C.N., Watson M.S. i Martin C.L.; ACMG Secondary Findings Working Group: ACMG SF v3.0 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: A policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2021, 23(8): 1381-1390. Pobrano 6.12.2021 z: https://www.acmg.net/PDFLibrary/41436_2021_1172_OnlinePDF-1.pdf.

3Badania genetyczne w chorobach mitochondrialnychKatarzyna Tońska

Wprowadzenie

W roku 1987 ukazały się dwa artykuły opisujące mutacje mitochondrialnego DNA (mtDNA) - pierwszy opisywał rozległe delecje, drugi wariant punktowy - wskazując je jako przyczynę choroby mitochondrialnej (odpowiednio zespołu Kaernsa-Sayre'a i dziedzicznej neuropatii wzrokowej Lebera, Leber hereditary optic neuropathy, LHON). Choć mitochondrialny DNA został zsekwencjonowany kilka lat wcześniej, to od tej chwili możemy mówić o możliwościach diagnostyki genetycznej chorób mitochondrialnych. W pierwszych latach badań cała uwaga poświęcona była właśnie mitochondrialnemu DNA - z jednej strony dlatego, że znana była jego sekwencja, co przy ówczesnych, ograniczonych możliwościach było znacznym plusem, z drugiej, ponieważ można było łatwo wychwycić związek pomiędzy chorobą związaną z zaburzeniem funkcjonowania systemu fosforylacji oksydacyjnej, odmatczynym dziedziczeniem i patogennym wariantem mtDNA. Z czasem jasne się stało, że choroby dziedziczące się w sposób odmatczyny, związane z nieprawidłowościami w mtDNA, stanowią tylko część, i to mniejszą, całego spektrum chorób mitochondrialnych, a ich diagnostyka molekularna stawała przed kolejnymi wyzwaniami.

Mitochondrialny DNA

Choroby mitochondrialne mogą być dziedziczone na kilka sposobów, a poznanie genetycznej historii rodziny i przeprowadzenie analizy rodowodu może wspomóc diagnostykę genetyczną nie tylko na samym początku, kiedy zastanawiamy się nad możliwym podłożem molekularnym choroby, lecz także na dalszych etapach, gdy weryfikujemy możliwe rozpoznania. Zwykle jako pierwszy wskazuje się mitochondrialny typ dziedziczenia ze względu na oczywisty związek z mitochondrialnym DNA.

Mitochondrialny DNA człowieka ma długość niespełna 16 600 par zasad i formę kolistą (ryc. 3.1). Zlokalizowany jest w macierzy mitochondrialnej i wraz ze związanymi z nim białkami tworzy nukleoid przyłączony do wewnętrznej błony mitochondrialnej. W pojedynczej komórce, w zależności od jej rodzaju i stanu energetycznego, zarówno liczba mitochondriów, jak i liczba cząsteczek mtDNA, mogą się różnić. W plemnikach jest około 50 cząsteczek mtDNA, a w komórce jajowej nawet kilkaset tysięcy. Komórki somatyczne zawierają kilkaset do kilku tysięcy cząsteczek mtDNA. Z punktu widzenia genetyka oznacza to, że w odniesieniu do mitochondrialnego DNA nie można stosować terminów homozygota i heterozygota, które są zarezerwowane dla komórek/osobników diploidalnych. W przypadku, gdy wszystkie cząsteczki mtDNA mają jednakową sekwencję, mówi się o homoplazmii, gdy zaś w komórce występuje więcej niż jeden ich rodzaj (na przykład te o prawidłowej sekwencji i z wariantem patogennym) o heteroplazmii. Mitochondrialny DNA u ludzi, jak u większości zwierząt, dziedziczony jest odmatczynie. Wprawdzie podczas zapłodnienia mitochondria znajdujące się we wstawce plemnika są wprowadzane do komórki jajowej, ale tam ulegają aktywnej degradacji. W literaturze opisano zaledwie kilka przypadków możliwego odojcowskiego lub oburodzicielskiego dziedziczenia mtDNA, a część z nich wciąż wzbudza wątpliwości. Nie ma zatem podstaw, żeby podważać tezę o wyłącznie odmatczynym dziedziczeniu mtDNA.

Rycina 3.1.

Schemat budowy mtDNA człowieka. Zwrot strzałek wskazuje kierunek odczytu informacji genetycznej.

Z przekazywaniem mtDNA podczas podziałów komórkowych, a także z pokolenia na pokolenie, wiąże się kilka zjawisk mających jednocześnie implikacje zarówno kliniczne, jak i diagnostyczne. Zakłada się, że podczas podziału mitotycznego heteroplazmatycznej komórki oba typy mtDNA rozdzielane są do komórek potomnych losowo. Oznacza to, że nawet w przypadku braku presji selekcyjnej, wraz z rozwojem, w wyniku takich losowych podziałów komórki i tkanki mogą różnić się między sobą proporcją dwóch typów mitochondrialnego DNA. Przyjmując, że wyjściowa heteroplazmia dotyczy wariantu patogennego, czyli mamy do czynienia z mieszaniną cząsteczek o prawidłowej i nieprawidłowej sekwencji, należy jeszcze uwzględnić presję selekcyjną. Powoduje ona, że w tkankach dzielących się, takich jak tkanka krwiotwórcza, może zachodzić segregacja w kierunku genotypu prawidłowego, zaś w tkankach postmitotycznych, jak tkanka mięśniowa czy nerwowa, nie. W konsekwencji tkanki, dla których prawidłowy mtDNA ma największe znaczenie, bo w największym stopniu opierają się na metabolizmie tlenowym, borykają się potencjalnie z najwyższym udziałem jego nieprawidłowych cząsteczek. Oznacza to także, że badanie molekularne przeprowadzone na DNA izolowanym z krwi obwodowej może nie dawać przydatnych klinicznie wyników.

Z kolei przy przekazywaniu mtDNA z pokolenia na pokolenie podczas rozwoju żeńskiej linii płciowej występuje zjawisko wąskiego gardła (bottleneck) skutkujące tym, że oocyty heteroplazmatycznej matki mogą w znacznym stopniu różnić się między sobą. Mechanizm wąskiego gardła jest roztrząsany od lat osiemdziesiątych XX wieku i wciąż nie ma pełnego obrazu. Sugeruje się trzy współdziałające ze sobą mechanizmy (ryc. 3.2). Pierwszym jest gwałtowny spadek liczby kopii mtDNA w pierwotnych żeńskich komórkach płciowych, po którym następuje szybki ich przyrost, aby w dojrzałym oocycie osiągnąć setki tysięcy kopii. Drugi zakłada nierównomierną replikację cząsteczek mtDNA. Niektóre z nich miałyby replikować się częściej niż inne. Te dwa mechanizmy prowadzą niejako do efektu założyciela - tylko część populacji wyjściowej daje początek setkom tysięcy kopii w dojrzałym oocycie. Trzeci mechanizm zakłada, że po replikacji potomne cząsteczki mtDNA pozostają w tym samym nukleoidzie, tworząc pęczek cząsteczek o jednakowej sekwencji. Takie właśnie pęczki segregowałyby następnie do komórek potomnych i ostateczna heteroplazmia zależałaby od tego, ile jakich pęczków znajdzie się w oocycie.

W efekcie książkowy obraz rodowodu rodziny, w której występuje choroba wynikająca z mutacji mtDNA i wszystkie dzieci chorej kobiety są chore, często nie jest prawdziwy (ryc. 3.3). Dzieci chorej kobiety nie muszą być chore - jeśli poziom nieprawidłowych cząsteczek w konkretnych tkankach nie przekroczy pewnej wartości progowej, powyżej której ujawniają się objawy choroby, będą zdrowe. Także zakres i nasilenie objawów choroby pomiędzy chorującym

Rycina 3.2.

Modele wąskiego gardła w rozwoju komórek linii płciowej żeńskiej: A. W pierwotnych komórkach płciowych żeńskich liczba cząsteczek mtDNA ulega obniżeniu, po czym gwałtownie wzrasta, dając setki tysięcy w dojrzałym oocycie. B. Nie wszystkie cząsteczki mtDNA ulegają replikacji z taką samą częstością, jeśli częściej replikują cząsteczki prawidłowe, to poziom patogennego wariantu będzie niższy, jeśli z patogennym wariantem, to będzie on dominował w dojrzałym oocycie. C. Jeśli po replikacji potomne cząsteczki mtDNA nie rozdzielają się, tworząc "pęczek" cząsteczek o jednakowej sekwencji, to docelowa heteroplazmia zależeć będzie od tego, ile i jakich "pęczków" znajdzie się w dojrzałym oocycie. Być może wszystkie modele są prawdziwe i współuczestniczą w procesie dziedziczenia mtDNA.

rodzeństwem może się znacznie różnić w zależności od wyjściowej heteroplazmii komórki jajowej, jak i dalszej segregacji tkankowej podczas rozwoju organizmu. Co więcej, pojedyncze rozległe delecje mtDNA mogą w ogóle nie być dziedziczone, a liczne rozległe delecje mtDNA dziedziczone w sposób mendlowski.

Rycina 3.3.

Rodowód rodziny z patogennym wariantem mtDNA m.3243A>G. U członków rodziny spokrewnionych w linii matczynej prowadzi on do różnych objawów - od migren po pełnoobjawowy zespół MELAS.

Mitochondrialny DNA koduje zaledwie 13 białek wchodzących w skład czterech z pięciu kompleksów systemu fosforylacji oksydacyjnej (ryc. 3.1), 22 cząsteczki tRNA niezbędne i wystarczające do przeprowadzenia translacji kodowanych w mtDNA białek oraz 2 cząsteczki rRNA wchodzące w skład rybosomu mitochondrialnego. Na prawidłowe funkcjonowanie systemu fosforylacji oksydacyjnej składa się współdziałanie białek kodowanych przez ponad 1000 kolejnych genów zlokalizowanych w jądrze komórkowym.

Genom jądrowy

Zarówno z perspektywy podłoża molekularnego, jak i diagnostyki genetycznej, geny jądrowe, których patogenne warianty mogą być przyczyną chorób mitochondrialnych, należą do różnych kategorii. Są to geny kodujące podjednostki systemu fosforylacji oksydacyjnej, geny kodujące białka odpowiedzialne za składanie kompleksów systemu fosforylacji oksydacyjnej, geny związane z utrzymaniem prawidłowej liczby kopii i jakości mtDNA oraz geny, których związek z chorobami mitochondrialnymi jest luźny.

Geny jądrowe kodujące podjednostki systemu fosforylacji oksydacyjnej

System fosforylacji oksydacyjnej zbudowany jest z 83 białek wchodzących w skład 5 wielopodjednostkowych kompleksów, z czego zaledwie 13 kodowanych jest w mitochondrialnym DNA. Największy jest kompleks I - dehydrogenaza NADH, składający się z 44 podjednostek (14 podstawowych: 7 kodowanych mitochondrialnie i 7 jądrowo oraz 30 dodatkowych - kodowanych jądrowo). Wśród genów jądrowych prawie wszystkie zlokalizowane są na autosomach, a choroby z nimi związane dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny. Gen kodujący jedną podjednostkę (NDUFA1) położony jest na chromosomie X i związany z zespołem Leigha o dziedziczeniu recesywnym sprzężonym z chromosomem X. To właśnie zespół Leigha, często w swojej najcięższej, dziecięcej postaci, jest najczęstszą prezentacją deficytu kompleksu I - związanego z patogennymi wariantami genów jądrowych kodujących podjednostki kompleksu I.

Kompleks II, najmniejszy, składa się jedynie z 4 kodowanych jądrowo podjednostek. Jest on o tyle ciekawy, że dehydrogenaza bursztynianowa jest jednocześnie elementem systemu fosforylacji oksydacyjnej i cyklu Krebsa. Patogenne warianty genów SDH związane są z autosomalnie dominującą predyspozycją do przyzwojaków i guzów chromochłonnych - zatem związane są z nowotworzeniem. Równocześnie recesywne patogenne warianty genów SDHA, SDHB i SDHD prowadzą do deficytu kompleksu II i choroby mitochondrialnej, często także manifestującej się jako zespół Leigha.

Kompleks III, czyli oksydoreduktaza koenzym Q-cytochrom c, to 10 podjednostek, z czego 1 kodowana mitochondrialnie, a pozostałe jądrowo i autosomalnie. Deficyt kompleksu III jest bardzo rzadką przyczyną choroby mitochondrialnej. Zwykle ujawnia się w dzieciństwie i towarzyszy mu kwasica mleczanowa. Ze względu na niewielką liczbę opisanych przypadków trudno jest przedstawić bardziej spójną korelację genotyp-fenotyp w przypadku tego deficytu.

Przedostatni, IV kompleks systemu fosforylacji oksydacyjnej, a jednocześnie ostatni kompleks składający się na łańcuch oddechowy, czyli oksydaza cytochromowa, jest drugim co do wielkości kompleksem z trzema podjednostkami kodowanymi mitochondrialnie. W genomie jądrowym znajduje się 16 genów (w tym jeden na chromosomie X) odpowiadających podjednostkom tego kompleksu, choć ze względu na specyficzność tkankową nie wszystkie kodowane przez nie białka są jednocześnie obecne w każdej komórce. Od niedawna wydaje się, że do listy białkowych podjednostek oksydazy cytochromowej należy dodać NDUFA4, dotychczas lokalizowaną w obrębie kompleksu I. Patogenne warianty opisano w kilku jądrowych genach kodujących podjednostki kompleksu IV. I w tym przypadku trudno znaleźć jest wspólny mianownik dla chorych z mutacjami w jądrowych genach kodujących podjednostki oksydazy cytochromowej. Znacznie częściej deficyt tego kompleksu wiąże się z mutacjami genów kodujących białka odpowiedzialne za jego składanie.

Syntaza ATP, będąca ostatnim, V kompleksem systemu fosforylacji oksydacyjnej, zbudowana jest z 20 podjednostek, z czego dwie kodowane są mitochondrialnie. Opisano wiele wariantów patogennych genów kodujących mitochondrialne podjednostki syntazy ATP, a mutacje genów jądrowych są rzadkie (znalezione w trzech z nich) i dziedziczą się autosomalnie recesywnie.

Geny kodujące białka odpowiedzialne za składanie kompleksów systemu fosforylacji oksydacyjnej

System fosforylacji oksydacyjnej jako zestaw pięciu kompleksów białkowych wymaga nie tylko starannego złożenia tych kompleksów, lecz także umieszczania grup prostetycznych itp. O ile mutacje genów kodujących podjednostki systemu fosforylacji oksydacyjnej są rzadkie, często mają charakter prywatny i opisywane są u osób, których rodzice byli spokrewnieni, o tyle w co najmniej kilku genach kodujących białka niezbędne do prawidłowej biogenezy kompleksów opisano liczne patogenne warianty, będące częstą przyczyną chorób mitochondrialnych. Zwykle mają charakter autosomalny recesywny i są związane z ciężką postacią choroby ujawniającej się w dzieciństwie. Poniżej kilka przykładów.

Z defektem składania kompleksu I wiążą się patogenne warianty genu ACAD9 o autosomalnym recesywnym charakterze. Choroba ujawnia się w dzieciństwie i manifestuje encefalopatią, kwasicą mleczanową i kardiomiopatią przerostową.

Najczęściej jednak, szczególnie w Polsce, opisuje się zespół Leigha wynikający z deficytu kompleksu IV, powodowany przez mutacje genów SURF1 lub SCO2. Oba kodowane przez nie białka zaangażowane są w biogenezę oksydazy cytochromowej - SURF1 jest niewątpliwie niezbędne do jej składania, lecz jego dokładna funkcja nie jest dobrze poznana, a SCO2 jest odpowiedzialne za transport jonu miedzi do centrum aktywnego. Mutacje SURF1 są najczęstszą przyczyną zespołu Leigha w Polsce, mutacje SCO2 mogą zaś dawać obraz zarówno zespołu Leigha, zespołu podobnego do zespołu Leigha, jak i zbliżony do rdzeniowego zaniku mięśni. Wszystkie mają charakter autosomalny recesywny.

Geny związane z utrzymaniem prawidłowej liczby kopii i jakości mtDNA

Za odpowiednią ilość i jakość mitochondrialnego DNA odpowiada cały garnitur różnych klas białek zaangażowanych w kilka procesów zachodzących w mitochondriach. Pierwszą grupą są białka bezpośrednio zaangażowane w funkcjonowanie mtDNA w procesie replikacji, transkrypcji i rekombinacji mtDNA (która ma znaczenie naprawcze), następną - enzymy związane z biosyntezą nukleotydów w cytoplazmie i szlakiem ich odzysku w mitochondriach. O ile wpływ zaburzeń replikacji czy biosyntezy nukleotydów na liczbę kopii i jakość mtDNA wydaje się oczywisty, o tyle trudniej wykazać związek w przypadku kolejnych dwóch grup białek - odpowiedzialnych za dynamikę sieci mitochondrialnej (podziały i łączenie się mitochondriów) oraz transport przez błony mitochondrialne (różne, niezwiązane ze sobą białka transportowe). Patogenne warianty genów zaangażowanych w powyższe procesy wiążą się ze spadkiem liczby kopii mtDNA (deplecja) lub pojawieniem się licznych rozległych jego delecji. Zwiększona może być także częstość mutacji punktowych.

Choć mtDNA zlokalizowany jest w mitochondriach, cały aparat niezbędny do jego replikacji i transkrypcji kodowany jest jądrowo. Najczęstszą przyczyną niestabilności mtDNA są autosomalne recesywne warianty patogenne genu POLG, kodującego katalityczną podjednostkę polimerazy gamma - jedynej replikacyjnej polimerazy w ludzkich mitochondriach. Obraz kliniczny związany z takim defektem molekularnym może być bardzo szeroki - od ciężkiego zespołu Alpersa-Huttenlochera, wiążącego się z deplecją mtDNA, szczególnie w wątrobie, poprzez spektrum ataksji-neuropatii, do postępującej zewnętrznej oftalmoplegii (izolowanej lub z innymi objawami nerwowo-mięśniowymi), którym towarzyszą liczne rozległe delecje mtDNA w mięśniu. Opisywane są także w literaturze warianty POLG o charakterze dominującym prowadzące do PEO, jednak są one rzadkie. Za dominującą postać PEO i PEO+ zwykle odpowiadają patogenne warianty genu TWNK, którego produkt - helikaza DNA Twinkle - bierze udział w replikacji. Podobnie jak w przypadku PEO związanego z defektem POLG, w mięśniach pacjentów znajdują się liczne rozległe delecje mtDNA.

Zaburzenia biosyntezy nukleotydów zwykle wiążą się z ciężkim, ujawniającym się w okresie noworodkowym lub w dzieciństwie zespołem deplecyjnym mającym postać miopatii (warianty patogenne genu TK2), encefalomiopatii (RRM2B), encefalopatii związanej z uszkodzeniem wątroby (DGUOK) czy zespołu mitochondrialnej encefalomiopatii dotyczącej układu nerwowego, żołądka i jelit (TYMP) i dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny.

Prawidłowa dynamika mitochondriów - ich zdolność do przemieszczania się, warunkowana prawidłowym podziałem i łączeniem się fragmentów sieci mitochondrialnej, ma znaczenie szczególne w komórce nerwowej, gdzie dla prawidłowego metabolizmu energetycznego mitochondria muszą przemieszczać się na duże odległości wzdłuż aksonu. Sztandarowym przykładem zaburzenia tego procesu są mutacje genu MNF2 kodującego mitofuzynę 2, zaangażowaną w łączenie się zewnętrznych błon mitochondriów. Prowadzą one do jednej z postaci zespołu Charcota-Mariego-Tootha, ale opisano także w literaturze przypadek autosomalnego dominującego zaniku nerwów wzrokowych, któremu towarzyszyły rozległe delecje mtDNA. Autosomalny dominujący zanik nerwów wzrokowych (typu Kjera) jest także najczęstszą manifestacją patogennych wariantów genu OPA1 kodującego białko wewnętrznej błony mitochondrialnej, odpowiedzialne z jednej strony za prawidłowe formowanie grzebieni mitochondrialnych, a z drugiej za prawidłowe połączenie się wewnętrznych błon mitochondrialnych podczas fuzji mitochondriów. Ze względu na ograniczenie objawów do nerwu wzrokowego u pacjentów z zanikiem nerwów wzrokowych typu Kjera nie ocenia się ilości ani jakości mtDNA, jednak ok. 20% pacjentów rozwija dalsze objawy nerwowo-mięśniowe, którym towarzyszy pojawienie się licznych rozległych delecji w mięśniach.

Jako przykład ostatniej klasy białek - odpowiedzialnych za transport - można podać translokator nukleotydów adeninowych ANT1, kodowany przez gen SLC25A4. Jego patogenne warianty mogą wiązać się zarówno z pojawieniem się delecji mtDNA, jak i deplecji, i mogą być odpowiedzialne za autosomalną dominującą postępującą zewnętrzną oftalmoplegię lub zespoły deplecyjne dziedziczące się zarówno w sposób autosomalny dominujący, jak i recesywny.

Wyżej opisane grupy genów wraz z procesami, za które odpowiadają kodowane przez nie produkty, obrazują klasyczne podejście do podłoża genetycznego chorób mitochondrialnych. Wraz z postępem wiedzy granice pomiędzy chorobą mitochondrialną jako chorobą wynikającą z nieprawidłowej funkcji systemu fosforylacji oksydacyjnej a innymi chorobami wynikającymi z dysfunkcji mitochondriów czy też defektem systemu fosforylacji oksydacyjnej towarzyszącym chorobie o pierwotnie niemitochondrialnym podłożu staje się coraz mniej wyraźna. Co więcej, należy brać pod uwagę, że choroba może być wynikiem mutacji nie pojedynczego genu, a dwóch lub większej ich liczby. Poszukiwanie podłoża molekularnego w takich przypadkach niezwykle się komplikuje.

Techniki analizy kwasów nukleinowych w kontekście diagnostyki molekularnej chorób mitochondrialnych

Analiza mitochondrialnego DNA

Choć do analizy mtDNA wykorzystuje się zasadniczo taki sam wachlarz technik biologii molekularnej jak w przypadku analizy DNA jądrowego i aby go poznać, wystarczyłoby sięgnąć do podręcznika genetyki medycznej, to ze względu na wielokopiowość tego genomu i idącą za nią heteroplazmię, dystrybucję tkankową czy efekt wąskiego gardła pewne techniki szczególnie dobrze nadają się do tego celu, a niektóre powinno stosować się jedynie w ostateczności. Za każdym razem zaś interpretacja uzyskanych wyników może nastręczać więcej problemów niż w przypadku analizy DNA jądrowego. I tak heteroplazmia i dystrybucja tkankowa wariantów mtDNA będzie miała wpływ na dobór materiału do badania. Rodzaj poszukiwanego wariantu (mutacja punktowa czy delecja?) zarówno na rodzaj materiału, jak i dobór techniki itp.

Materiał do badań genetycznych

W przypadku mitochondrialnego DNA sprawą niezwykle ważną jest dobór odpowiedniego materiału. Może on się różnić w zależności do tego, z jaką chorobą mamy do czynienia, czy poszukujemy wariantów punktowych, czy delecji lub deplecji, a nawet od tego, jakiego konkretnie wariantu punktowego poszukujemy. Poniższe przykłady powinny dobrze zobrazować złożoność tego zagadnienia.

Dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera powodowana jest przez patogenne punktowe warianty mtDNA (o niedawno opisanym jądrowym podłożu choroby niżej). Obecność takiego wariantu (na przykład najczęstszego m.11778G>A w genie kodującym 4 podjednostkę dehydrogenazy NADH) jest warunkiem koniecznym, lecz niewystarczającym do rozwoju choroby, która charakteryzuje się niską penetracją (ok. 50% u mężczyzn i zaledwie 10% u kobiet). Patogenne warianty prowadzące do tej choroby są zwykle homoplazmatyczne lub bliskie homoplazmii we wszystkich tkankach organizmu. W takim przypadku do badania można wykorzystać dowolny materiał biologiczny od pacjenta. W praktyce zwykle oznacza to pobranie krwi obwodowej, ale nic nie stoi na przeszkodzie, aby badania przeprowadzić z wykorzystaniem na przykład wymazu policzkowego.

Najczęstszą przyczyną zespołu MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes; miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mleczanowa, występowanie incydentów podobnych do udarów) jest patogenny wariant punktowy w mitochondrialnym genie kodującym tRNA leucynowy m.3243A>G. Na marginesie warto wspomnieć, że wariant ten może być także przyczyną miopatii mitochondrialnej, cukrzycy z głuchotą czy też izolowanej głuchoty. Wariant ten z genetycznego punktu widzenia prezentuje wszelkie możliwe niuanse dziedziczenia mitochondrialnego - charakteryzuje się dużą zmiennością tkankową, dużym rozrzutem heteroplazmii podczas dziedziczenia z pokolenia na pokolenie i wynikającą z nich znaczną zmiennością objawów pomiędzy członkami jednej rodziny. W najpowszechniej stosowanym w genetyce klinicznej materiale biologicznym, czyli w leukocytach krwi obwodowej poziom wariantu m.3243A>G jest zwykle niski, czasem rzędu kilku procent, a nawet wariant ten może być niewykrywalny. Do jego wykrycia najlepiej nadaje się tkanka mięśniowa, gdzie poziom wariantu osiąga kilkadziesiąt procent. Wiąże się to jednak z inwazyjną procedurą biopsji mięśnia, szczególnie nieprzyjemną w odniesieniu do dzieci. Jako że konieczność przeprowadzenia badania genetycznego nie powinna być przyczyną decyzji o biopsji, jeśli taka nie jest planowana z innych względów klinicznych, to można wykorzystać komórki znajdujące się w osadzie moczu czy cebulki włosowe, w których poziom tego wariantu (ale też wielu innych patogennych wariantów mtDNA) jest wyższy niż w leukocytach krwi obwodowej i często niewiele tylko niższy niż w mięśniu poprzecznie prążkowanym (ryc. 3.4).

Rycina 3.4.

Rodowód rodziny z patogennym wariantem mtDNA m.8993T>C. U probanda zdiagnozowano zespół Leigha. U spokrewnionych w linii matczynej zdrowych (w momencie badania) członków rodziny przeprowadzono analizę poziomu patogennego wariantu w kilku tkankach. Poziom heteroplazmii różnił się pomiędzy osobami badanymi i między tkankami tej samej osoby. K - DNA izolowany z krwi obwodowej; M - DNA izolowany z bioptatu mięśnia; F - DNA izolowany z hodowli fibroblastów.

Zespół Alpersa-Huttenlochera, którego przyczyną pierwotną są patogenne warianty jądrowego genu POLG, związany jest z obecnością deplecji mtDNA w wątrobie, a także licznymi rozległymi delecjami mtDNA - zarówno w wątrobie, jak i w mięśniach. Jeśli badania genetyczne rozpoczynają się od analizy mtDNA (co w tym przypadku nie jest konieczne), to próba stwierdzenia obecności deplecji czy delecji mtDNA w leukocytach krwi obwodowej się nie powiedzie, a najbardziej wiarygodne wyniki uzyska się z wykorzystaniem bioptatu wątroby.

W przypadku innych chorób związanych z delecjami mtDNA materiałem pierwszego wyboru powinien być bioptat mięśnia, a o ile z przyczyn klinicznych biopsja nie jest planowana, podobnie jak przy wariancie m.3243A>G warto skorzystać z osadu moczu czy cebulek włosowych. Należy mieć też na uwadze, że delecje mtDNA na niskim poziomie heteroplazmii mogą pojawiać się wraz z wiekiem jako objaw naturalnego starzenia się. Ich obecność stwierdzano u osób starszych w mózgu, mięśniach czy skórze. Oznacza to, że dodatni wynik badania w kierunku delecji u osoby starszej należy interpretować ostrożnie i w odniesieniu do wyników innych badań oraz stanu klinicznego.

W przypadku zespołów deplecyjnych dobór optymalnej tkanki do badania genetycznego zależeć będzie od przebiegu choroby. Jeśli wiąże się ona z miopatią, to wiarygodne wyniki badań uzyskamy dla bioptatu mięśnia, jeżeli z hepatopatią - lepsze wyniki otrzymamy z bioptatu wątroby.

Już powyższe przykłady pokazują, że uzyskanie wiarygodnego wyniku analizy mitochondrialnego DNA wymaga ścisłej współpracy pomiędzy lekarzem prowadzącym a laboratorium genetycznym. Badania komplikuje też fakt, że w momencie ich rozpoczęcia często choroba pacjenta nie jest precyzyjnie zdefiniowana (szczególnie w przypadku osób dorosłych), a co za tym idzie - trudno zawęzić poszukiwania jej genetycznego podłoża. Może okazać się, że potrzebna będzie nie tylko analiza mitochondrialnego DNA i nie skończy się na pojedynczym badaniu. W praktyce zatem przy podejrzeniu choroby mitochondrialnej pobiera się krew obwodową i izoluje DNA z leukocytów, jeśli przeprowadzana jest biopsja mięśnia, to zabezpiecza się fragment bioptatu do badań genetycznych, a w porozumieniu z laboratorium także inny materiał, jak osad moczu (powinien zostać dostarczony do laboratorium szybko) czy włosy (których zaletą jest łatwość przechowywania).

Na koniec jeszcze warto rozważyć wykorzystanie materiału archiwalnego. Zamrożone bioptaty mięśnia przygotowane w sposób identyczny jak do przeprowadzenia badań histochemicznym mogą być przechowywane w ciekłym azocie czy w temp. -80°C przez wiele lat bez utraty swojej przydatności do badań genetycznych. Niekiedy pojawia się jednak konieczność wykorzystania materiału biologicznego utrwalonego i zachowanego pod postacią bloczka parafinowego czy wręcz preparatów mikroskopowych. Niestety takie przechowywanie materiału wiąże się z jego uszkodzeniem i fragmentacją. Można z niego wyizolować DNA, jednak należy się liczyć z tym, że nawet jeśli sama izolacja okaże się skuteczna, analiza genetyczna się nie powiedzie. Jednym ze sposobów zachowania materiału od pacjenta do dalszej analizy, w przypadku gdy na bieżąco niemożliwe jest przeprowadzenie danych badań, jest założenie hodowli fibroblastów skóry. Plusem takiego rozwiązania jest możliwość dysponowania w przyszłości żywym materiałem biologicznych. W przypadku analizy mtDNA trzeba mieć świadomość, że poziom wariantów punktowych mtDNA w fibroblastach skóry często jest niski, a z czasem w hodowli jeszcze spada, delecji zaś zwykle w ogóle nie udaje się utrzymać.

Poszukiwanie wariantów punktowych mtDNA

Do poszukiwania wariantów punktowych można wykorzystać wiele metod, a wybór zależeć będzie od zakresu badania (czy trzeba sprawdzić obecność jednego, kilku wariantów, czy też zsekwencjonować cały mtDNA), potrzeby oznaczenia heteroplazmii (może wystarczy tylko informacja o obecności wariantu) oraz zakresu metod stosowanych w danym laboratorium (w tym samym celu można wykorzystać różne metody).

Jeśli badanie ma na celu sprawdzenie obecności jednego lub kilku homoplazmatycznych wariantów patogennych mtDNA, jak to ma miejsce w przypadku podejrzenia dziedzicznej neuropatii wzrokowej Lebera (trzy najczęstsze warianty: m.11778G>A, m.3460A>G, m.14484T>C), wybór metod jest bardzo szeroki, bo badanie ma charakter jakościowy i można się nie niepokoić niskim poziomem wariantu. W praktyce często stosuje się sekwencjonowanie metodą Sangera (ryc. 3.5) - sekwencjonuje się trzy fragmenty obejmujące te trzy najczęstsze warianty. Podejście takie ma tę zaletę, że pozwala także na stwierdzenie obecności innych, rzadszych patogennych wariantów lokalizujących się w obrębie sekwencjonowanego fragmentu. Można także zastosować techniki nastawione na wykrycie tylko tych konkretnych wariantów, jak PCR specyficzny dla allelu (dzięki zastosowaniu konkretnych starterów namnażany jest tylko DNA zawierający dany wariant), czy PCR-RFLP (jeśli wariant wprowadza lub usuwa miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, jego obecność można stwierdzić poprzez namnożenie fragmentu obejmującego ten wariant i trawienie enzymem restrykcyjnym, ryc. 3.4) oraz wiele innych.

Rycina 3.5.

Homoplazmatyczny rzadki patogenny wariant mtDNA m.3635G>A, prowadzący do dziedzicznej neuropatii wzrokowej Lebera. Wariant jest zlokalizowany w genie MT-ND1, kodującym podjednostkę kompleksu I, a wariant wprowadza zmianę aminokwasową p.Ser110Asn.

W przypadku, gdy istnieje potrzeba określenia poziomu heteroplazmii lub obawa, że wariant będzie obecny na niskim jej poziomie, nie sprawdzi się sekwencjonowanie metodą Sangera. Czułość sekwencjonowania metodą Sangera w wykrywaniu heteroplazmii ocenia się na 15-20%, co oznacza, że warianty o jej niższym poziomie, a taki może być obecny w leukocytach krwi obwodowej, mogą zostać pominięte i uznane za tło. Również ocena ilościowa heteroplazmii w przypadku jej wyższego poziomu, choć można ją przeprowadzić, nie jest wiarygodna ze względu na wiele rund amplifikacji zarówno podczas przygotowywania matrycy do sekwencjonowania (PCR), jak i samego sekwencjonowania. Lepsze wyniki daje technika PCR-RFLP, która przy zastosowaniu znakowania izotopowego w ostatnim cyklu PCR może nawet pozwolić na wykrycie heteroplazmii na poziomie poniżej 10%, a dla wyższych jej poziomów daje wiarygodne wyniki. Gdy jest stosowana bez znakowania radioizotopowego, pozwala na oszacowanie heteroplazmii własnym okiem. Z uwagi na jej niski koszt, łatwość zaprojektowania i przeprowadzenia dobrze nadaje się do weryfikacji obecności rzadkich wariantów w różnych tkankach pacjenta czy u członków jego rodziny, czyli badań na ograniczoną skalę.

Jeżeli planowane są badania większej grupy osób w kierunku jakiegoś wariantu wraz z oznaczeniem heteroplazmii, warto zastosować metodę opartą na PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR). Pozwala ona na jednoczesną analizę wielu prób i bardzo dokładne oznaczenie heteroplazmii. W przeliczeniu na próbę nie jest też droga, pod warunkiem analizy wielu prób jednocześnie. Jej ustawienie może być jednak czasochłonne i pracochłonne, więc nie nadaje się zbyt dobrze do badania pojedynczych rodzin czy rzadkich wariantów.

Część patogennych wariantów mtDNA na tyle często stanowi przyczynę choroby, że warto jest przeprowadzić u pacjenta testy sprawdzające ich obecność przed zaplanowaniem badań na szerszą skalę. Jeśli jednak okaże się, że badania takie dadzą wynik ujemny, a ze względu na obraz kliniczny choroby lub odmatczyne dziedziczenie istnieje znaczne prawdopodobieństwo rzadkiej mutacji mtDNA, warto przeprowadzić sekwencjonowanie całego mitochondrialnego DNA. Można do tego celu wykorzystać metodę Sangera, jednak jest ona praco- i czasochłonna (mtDNA sekwencjonuje się w ponad dwudziestu fragmentach) oraz, jak wcześniej wspomniano, niezbyt dobrze nadaje się do oceny heteroplazmii. Zamiast niej znacznie lepiej zastosować sekwencjonowanie następnej generacji (sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, NGS, next-generation sequencing). Podczas pojedynczego sekwencjonowania generowane są setki tysięcy odczytów długości 150-200 par zasad. Sekwencje kolejnych odczytów przyrównane do sekwencji referencyjnej zachodzą na siebie, a każde miejsce w genomie mitochondrialnym jest odczytywane wielokrotnie (pokrycie wynosić może wiele tysięcy razy). Dzięki temu uzyskuje się nie tylko dużą dokładność badania, lecz także precyzyjną informację o heteroplazmii (ryc. 3.6). W zależności od liczby odczytów można oznaczać heteroplazmię nawet rzędu kilku procent. Liczba próbek, którą można zanalizować jednorazowo, zależy od zastosowanego urządzenia, chemii i potrzeb, jednak zwykle analizuje się ich co najmniej kilkadziesiąt. Koszt pojedynczego doświadczenia jest wprawdzie bardzo duży, ale przy jednoczesnej analizie wielu prób cena za poznanie sekwencji pojedynczej próby jest kilkukrotnie niższa niż przypadku sekwencjonowania Sangera.

Rycina 3.6.

Analiza mitochondrialnego DNA z zastosowaniem NGS. A. W badaniu przeprowadzonym na DNA izolowanym z bioptatu mięśnia stwierdzono obecność heteroplazmatycznego, patogennego wariantu m.12706T>C w genie MT-ND5, kodującym podjednostkę kompleksu I. Wariant wprowadza zmianę aminokwasową p.Phe124Leu. Poziom heteroplazmii wyniósł 50%. B. Analiza pokrycia wskazuje na obecność rozległej delecji. Zastosowanie narzędzia eKLIPse pozwoliło na określenie zakresu delecji (obejmuje nukleotydy - 10624-15542). Analiza przeprowadzona przez dr Agnieszkę Piotrowską-Nowak przy użyciu programu CLS Genomic Workbench.

Analiza delecji mtDNA

Najpowszechniej stosowaną techniką analizy rozległych delecji mtDNA jest długi PCR (long PCR), najlepiej taki, który obejmuje swym zakresem cały mitochondrialny DNA. W takim przypadku startery lokalizuje się w obrębie obszaru kontrolnego, który rzadko ulega delecji. Badanie jest czułe, stosunkowo szybkie i mało pracochłonne, ale ma jeden podstawowy mankament - jest badaniem jakościowym, a nie ilościowym. Pod pojęciem rozległa delecja/delecje kryje się utrata kilku tysięcy par zasad, co biorąc pod uwagę zwartą konstrukcję genetyczną mtDNA oznacza co najmniej kilka genów, które nie mają swoich jądrowych odpowiedników i wszystkie są niezbędne do życia. Oznacza to, że w praktyce nie spotyka się homoplazmatycznych delecji mtDNA - zawsze część materiału genetycznego ma prawidłową długość. Podczas PCR jednak zwykle preferencyjnie namnażane są krótsze cząsteczki mtDNA - te z delecją. Zatem nawet jeśli faktyczny poziom heteroplazmii jest niższy, w wyniku badania możemy nie obserwować cząsteczek pełnej długości (ryc. 3.7). Aby określić poziom heteroplazmii, można zastosować PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem dwóch sond - jednej

Rycina 3.7.

Analiza długości mtDNA przeprowadzana metodą długiego PCR z zastosowaniem starterów pozwalających na namnożenie całego mtDNA. 1 - jeden prążek na wysokości ok. 16 500 bp oznacza wynik prawidłowy; 2 - oprócz prążka o prawidłowej wielkości, ok. 16 500 bp, obecne liczne prążki odpowiadające cząsteczkom krótszym - wynik wskazuje na obecność licznych rozległych delecji; 3 - oprócz prążka o prawidłowej wielkości, ok. 16 500 bp, obecny dodatkowy prążek wskazujący na istnienie frakcji cząsteczek krótszych, pozbawionych znacznej części mtDNA, czyli pojedynczej rozległej delecji, m - marker (standard) wielkości DNA. Badanie przeprowadzone przez dr Magdalenę Kaliszewską.

do obszaru nieulegającego delecji i drugiej do obszaru, który w części cząsteczek delecji uległ. Wzajemny stosunek sygnałów z tych dwóch sond pozwoli określić poziom heteroplazmii. Jest to metoda dobra, lecz dość trudna do optymalizacji. W przypadku pojedynczej delecji przydatne może być także określenie jej zakresu. Można to zrobić albo wykorzystując sekwencjonowanie metodą Sangera, albo NGS (ryc. 3.6).

Analiza deplecji mtDNA

Liczba kopii mtDNA wykazuje znaczną zmienność w organizmie i zależy od rodzaju komórki oraz jej stanu energetycznego; różni się także pomiędzy osobnikami. Dodatkowo może się zmieniać wraz z wiekiem, a także mogą na nią wpływać przyjmowane leki (np. analogi nukleotydów). Wszystko to powoduje, że wiarygodne określenie liczby kopii w kontekście potencjalnej deplecji nie jest sprawą prostą. Do badania wykorzystuje się PCR w czasie rzeczywistym, tym razem stosując sondę wykrywającą mtDNA oraz sondę do jakiegoś genu jądrowego, który nie wykazuje zmienności liczby kopii (u każdej osoby występuje po jednym z alleli na każdym z chromosomów homologicznych). Sygnał z sondy jądrowej odpowiada dwóm kopiom genu jądrowego - porównując do niego sygnał sondy komplementarnej do mtDNA, ustala się jego liczbę kopii. Aby takie badanie było wiarygodne, konieczne jest określenie prawidłowej liczby kopii dla licznej grupy kontrolnej w odpowiednim wieku i dla konkretnej tkanki. Dodatkowo znaczenie ma metoda izolacji DNA, gdyż różne metody mogą w różnym stopniu wybiórczo bardziej wydajnie izolować mitochondrialny lub jądrowy DNA, co w konsekwencji może mieć wpływ na uzyskiwane wyniki. Sprawia to, że ocena liczby kopii przeprowadzana jest stosunkowo rzadko.

Analiza genów jądrowych

W zależności od rodzaju choroby, a co za tym idzie - jej podłoża molekularnego, zarówno zakres badań, jak i konkretne metody mogą się bardzo różnić. Poniżej zostaną przedstawione przykładowe podejścia diagnostyczne.

Analiza pojedynczych genów

Jeśli dana choroba ma dobrze zdefiniowane podłoże molekularne, które ogranicza się do patogennych wariantów jednego genu lub kilku genów, albo też warianty niewielu genów odpowiadają za znaczną część przypadków tej choroby, stosuje się podejście oparte na analizie pojedynczych genów. Przykładem dobrze ilustrującym ten przypadek jest zespół Alpersa-Huttenlochera powodowany w zasadzie wyłącznie przez recesywne warianty genu POLG. W przypadku rozpoznania tej choroby diagnostyka molekularna będzie skupiać się zatem tylko na tym jednym genie. Spektrum wariantów patogennych tego genu w populacji polskiej jest już dobrze poznane. Choć kilka z nich jest częstszych od pozostałych, to ze względu na to, że jest ich dość dużo, a w wielu rodzinach występują warianty prywatne, sekwencjonowanie obszaru kodującego genu POLG wraz z granicami ekson-intron jest rozsądnym rozwiązaniem. Sekwencjonowanie genu POLG powinno być także pierwszym krokiem podczas diagnostyki molekularnej chorób ze spektrum ataksji-neuropatii oraz, wraz z genem TWNK i ewentualnie SLC25A4, w przypadku postępującej zewnętrznej oftalmoplegii z licznymi rozległymi delecjami mtDNA.

Niedawno ukazała się praca wiążąca dziedziczną neuropatię wzrokową Lebera z autosomalnymi recesywnymi wariantami genu DNAJC30 u osób, u których wykluczono patogenne warianty mtDNA. Zaobserwowano też wyraźny efekt założyciela. Wydaje się, że analiza tego niewielkiego, posiadającego tylko jeden ekson genu powinna zostać wprowadzona do diagnostyki molekularnej LHON.

Sekwencjonowanie następnej generacji

U wielu pacjentów ograniczenie poszukiwania molekularnego podłoża ich choroby do jednego genu lub kilku genów jest dalece niewystarczające. Wynika to albo z faktu, że zespół podobnych objawów składających się na konkretną dobrze zdefiniowaną chorobę może być, u różnych osób, powodowany patogennymi wariantami różnych genów, albo z tego, że objawy pacjenta wprawdzie w znacznym stopniu spełniają kryteria choroby mitochondrialnej, jednak nie wpisują się w żadną jej dobrze zdefiniowaną postać. Z tą drugą sytuacją mamy często do czynienia u osób dorosłych. W takim przypadku po wykluczeniu najczęstszej przyczyny choroby albo od razu wykorzystuje się sekwencjonowanie następnej generacji, pozwalające na jednoczesną analizę wielu genów, a nawet całego genomu (ryc. 3.8). Podobnie jak podczas sekwencjonowania mtDNA, przy zastosowaniu NGS uzyskuje się wiele odczytów dla każdej sekwencjonowanej pozycji, choć liczby te sięgają kilkudziesięciu, a nie setek czy tysięcy razy (takie pokrycie wystarczy do oceny, jaki nukleotyd znajduje się w danej pozycji na obu allelach). W zależności od potrzeb, możliwości i przyjętych założeń stosuje się kilka podejść diagnostycznych: od sekwencjonowania panelu genów, czyli kilkudziesięciu, kilkuset lub kilku tysięcy genów związanych z daną chorobą lub grupą chorób (najszersze panele obejmują wszystkie geny, które dotychczas powiązano z chorobami genetycznymi), poprzez sekwencjonowanie eksomu, czyli wszystkich znanych obszarów ulegających ekspresji (kilka procent genomu), po sekwencjonowanie całego genomu. Wraz ze wzrostem sekwencjonowanego obszaru nie tylko wzrasta koszt badania (co przy stale spadających kosztach sekwencjonowania niebawem może przestać mieć znaczenie), ale przede wszystkim zwiększa się ilość analizowanych danych oraz poziom skomplikowania ich analizy. Podczas sekwencjonowania panelowego i sekwencjonowania eksomu z pokryciem umożliwiającym analizę poznaje się sekwencję obszarów kodujących, czyli eksonów badanych genów, oraz sekwencje styków ekson-intron. Pozostałe obszary nie są sekwencjonowane lub ich pokrycie jest skrajnie niskie.

Rycina 3.8.

Wynik analizy jądrowego DNA przeprowadzony techniką NGS. Znaleziono heterozygotyczny patogenny dominujący wariant c.310G>T (p.Asp104Tyr) w genie SLC25A4 u pacjenta z miopatią mitochondrialną. Wariant obecny jest mniej więcej w połowie odczytów.

Sekwencjonowanie panelowe pozwala na znalezienie przyczyny choroby, jeśli jest ona związana z patogennymi wariantami genu już wcześniej powiązanego z tą chorobą lub w ogóle z jakąś chorobą genetyczną. Możliwe jest znalezienie nowych wariantów w już wcześniej powiązanych z chorobą genach, jednak nie będzie możliwe powiązanie z chorobą genów spoza panelu. Jest to podejście ściśle diagnostyczne, jego wielką zaletą jest względna prostota analizy i ograniczenie ryzyka tak zwanych przypadkowych znalezisk (incidental finding) czyli wariantów patogennych niezwiązanych z przyczyną choroby (na przykład wariantów związanych z dziedziczną predyspozycją do nowotworów). To podejście diagnostyczne jest także zalecane przez EuroGentest i European Society of Human Genetics. W przypadku chorób mitochondrialnych możliwe jest opracowanie własnego panelu genów, na przykład obejmującego geny z zestawu MitoCarta, w którym znajdują się geny dotychczas powiązane z chorobami mitochondrialnymi. MitoCarta jest regularnie aktualizowana. Taki panel może zostać wzbogacony o analizę mtDNA i stanowić dogodne narzędzie diagnostyczne. Możliwe jest także wykorzystanie paneli wszystkich genów o znaczeniu klinicznym. Tu najpopularniejszy jest panel Illumina TruSight One.

Sekwencjonowanie eksomu jest podejściem pozwalającym nie tylko na znalezienie patogennych wariantów genów już powiązanych z chorobą, lecz także na odkrycie nowych. Zwykle wykorzystywane jest w badaniach naukowych albo jako podstawa do filtrowania wyników (patrz niżej).

Najszerszym podejściem jest sekwencjonowanie genomu, które pozwala nie tylko na powiązanie z chorobą nowych ulegających ekspresji obszarów DNA, lecz także na znalezienie wariantów patogennych w obszarach niekodujących (warianty głęboko intronowe, promotorowe czy inne obszary regulacyjne). Wprawdzie uważa się, że ok. 90% wariantów patogennych zlokalizowanych jest w obszarze kodującym, jednak dane te mogą być przeszacowane. Niestety aktualnie dysponujemy narzędziami niewystarczającymi do efektywnego wykorzystywania możliwości sekwencjonowania całego genomu.

Biorąc pod uwagę niezwykłą różnorodność kliniczną chorób mitochondrialnych, nakładanie się wielu objawów na objawy innych chorób nerwowo-mięśniowych oraz możliwość, że fenotyp pacjenta jest wynikiem złożenia się dwóch chorób, dobrym pomysłem, który jednocześnie jest zgodny z zaleceniami European Society of Human Genetics, ale nie ogranicza możliwości analitycznych, jest zastosowanie na poziomie laboratorium genetycznego techniki pozwalającej na analizę większej części materiału genetycznego (eksomu lub genomu), ale analizowanie tylko jego części o znaczeniu klinicznym, czyli w pierwszym rzędzie skoncentrowanie się na genach powiązanych z chorobami mitochondrialnymi i mtDNA. Takie postępowanie pozwala na wielokrotne filtrowanie danych w przyszłości - wraz z rozwojem nauki (powiązanie kolejnych genów z fenotypem pacjenta) czy uzyskiwaniem nowych informacji o przebiegu choroby u pacjenta bądź członków jego rodziny.

Podłoże molekularne choroby nie musi ograniczać się do jednego genu. W ostatnich latach pojawiają się kolejne doniesienia o bardziej złożonym, kilku- lub wielogenowym podłożu chorób nerwowo-mięśniowych. Podobnie w przypadku chorób mitochondrialnych można oczekiwać, że na obraz choroby może składać się współdziałanie kilku wariantów genetycznych, z których każdy cechuje jedynie umiarkowana patogenność. W takim przypadku analiza na szerszą skalę powinna dać lepsze rezultaty. Niestety obecnie nie dysponujemy dobrymi narzędziami pozwalającymi na sprawne wychwytywanie bardziej złożonego podłoża molekularnego.

Sekwencjonowanie następnej generacji sprawdza się znakomicie jako narzędzie do wykrywania wariantów punktowych (włączając w to delecje i insercje o zakresie od jednego nukleotydu do kilkudziesięciu nukleotydów). Nieco więcej trudności nastręcza analiza zmienności liczby kopii (copy number variation, CNV), w tym przypadku opierająca się na analizie pokrycia danego obszaru względem pokrycia innych obszarów (obszar delecji charakteryzuje się pokryciem niższym niż przeciętne, obszar duplikacji - wyższym). Analiza CNV nie ma większego znaczenia w kontekście chorób mitochondrialnych. Większe delecje znajdowano w niewielu genach powiązanych z tą grupą chorób - są stosunkowo częste w genie OPA1, opisywano je także, choć w jednostkowych przypadkach, w genie POLG.

Proponowane algorytmy diagnostyki molekularnej w przypadku wybranych chorób mitochondrialnych

Stworzenie jednego, spójnego algorytmu dla wszystkich chorób mitochondrialnych wydaje się niemożliwe. Natomiast decyzje o przeprowadzeniu badań genetycznych, ich zakresie i wykorzystywanym materiale biologicznych podejmuje się na podstawie wielu zmiennych: objawów klinicznych, wyników badań laboratoryjnych, histologicznych i obrazowych, biorąc jednocześnie pod uwagę dostęp do badań genetycznych i możliwości ich finansowania. Poniżej znajduje się kilka propozycji postępowania w przypadku konkretnych chorób mitochondrialnych.

Dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera - w pierwszym rzędzie należy sprawdzić obecność częstych patogennych wariantów mtDNA prowadzących do choroby (m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>C), ewentualnie rozszerzając analizę o wszystkie geny mitochondrialne kodujące podjednostki kompleksu I (jeśli stosowane jest NGS, można zsekwencjonować cały mtDNA). Wydaje się, że w przypadku negatywnych wyników kolejnym krokiem powinno być sekwencjonowanie genu DNAJC30.

Zespół MELAS - w pierwszej kolejności należy sprawdzić obecność wariantu mtDNA m.3243A>G; następnie przeprowadzić badanie w kierunku rozległej delecji i zsekwencjonować cały mtDNA.

Zespół MERRF (padaczka miokloniczna z włóknami szmatowatymi, myoclonic epilepsy with ragged red fibers) - w pierwszej kolejności należy sprawdzić obecność wariantu mtDNA m.8344A>G; następnie przeprowadzić badanie w kierunku rozległej delecji i zsekwencjonować cały mtDNA.

Zespół Kaernsa-Sayre'a, Zespół Pearsona - należy przeprowadzić badanie w kierunku rozległej delecji mtDNA.

Zespół Leigha - w pierwszej kolejności należy przeprowadzić analizę genów SURF1 i SCO2. W przypadku uzyskania negatywnych wyników lub w przypadku dowodów na odmatczyne dziedziczenie choroby trzeba sprawdzić obecność któregoś z wariantów w mitochondrialnym genie MT-ATP6 m.8993T>G, m.8993T>C, a następnie zsekwencjonować cały mtDNA. Jeśli wyniki są negatywne, rozważyć analizę panelu genów z zastosowaniem NGS.

Zespół Alpersa-Huttenlochera, spektrum ataksja-neuropatia - należy przeprowadzić sekwencjonowanie genu POLG.

Postępująca zewnętrzna oftalmoplegia lub zespół PEO+ - należy przeprowadzić test w kierunku obecności licznych rozległych delecji mtDNA, jeśli wynik jest pozytywny, zsekwencjonować gen POLG, jeśli wywiad rodzinny nie wyklucza dziedziczenia autosomalnego dominującego, trzeba przeprowadzić sekwencjonowanie genów TWNK i SLC25A4. Jeżeli wyniki są negatywne, a weryfikacja obrazu klinicznego podtrzymuje podejrzenie choroby mitochondrialnej, rozważyć analizę panelu genów z zastosowaniem NGS.

Podejrzenie zespołu deplecyjnego - można oznaczyć poziom mtDNA w tkance objętej objawami, a następnie korelować objawy pacjenta z dysfunkcją konkretnego genu. Wydaje się jednak, że ze względu zarówno na koszty, jak i czas, lepiej jest od razu przeprowadzić sekwencjonowanie panelu genów z zastosowaniem NGS.

W przypadku, gdy choroba nie przyjmuje dobrze zdefiniowanej formy, zwykle na początku sprawdza się obecność najczęstszych patogennych wariantów punktowych i rozległych delecji w mtDNA, ewentualnie sekwencjonuje cały mtDNA. Jeśli wyniki są negatywne, kliniczna diagnoza choroby mitochondrialnej zostaje utrzymana i nie pojawiły się nowe przesłanki mogące nakierować badania na konkretny gen, należy rozważyć analizę panelu genów z zastosowaniem NGS.

Nowe potencjalnie patogenne warianty genetyczne

Stosowanie metod sekwencjonowania wysokoprzepustowego, oprócz znacznego przyspieszenia odkrywania genów powiązanych z chorobami genetycznymi człowieka i przyspieszenia diagnostyki, spowodowało konieczność analizy milionów wariantów w każdej próbie i podejmowania decyzji o ich znaczeniu klinicznym. Zgodnie z zaleceniami EuroGentest i European Society of Human Genetics warianty klasyfikuje się jako łagodne, potencjalnie łagodne, o nieznanej/niepewnej patogenności, potencjalnie patogenne lub patogenne. Jako podstawę do określenia patogenności wykorzystuje się informacje o populacyjnej częstości danego wariantu, jego potencjalnym wpływie na aktywność kodowanego produktu (zwykle na podstawie bioinformatycznej predykcji patogenności), danych literaturowych o związku danego genu i wariantu z chorobą czy też wyników badań funkcjonalnych. Największą trudność sprawiają te warianty, które ostatecznie są klasyfikowane jako warianty o nieznanej patogenności, co zwykle oznacza brak danych do jednoznacznego określenia patogenności. W takim przypadku oraz w przypadku części wariantów określonych jako potencjalnie patogenne pomóc mogą badania funkcjonalne, czy na modelu komórkowym, czy w organizmie modelowym.

W odniesieniu do wariantów jądrowych jako potencjalnej przyczyny choroby mitochondrialnej sposób postępowania nie różni się od wykorzystywanego w przypadku innych chorób mendlowskich. W przypadku wariantów mtDNA istnieje jednak kilka zasad oceny patogenności dla nich specyficznych. Aby wariant mtDNA uznać za patogenny, musi on spełniać możliwie największą liczbę z poniższych kryteriów:

wariant musi być najlepszym kandydatem w mtDNA na wariant patogenny;

wariant musi być obecny u pacjentów, ale nieobecny w grupie kontrolnej i populacyjnych bazach danych. Tylko najczęstsze warianty patogenne o niskiej penetracji, jak wariant m.11778A>G, były stwierdzane w populacji ogólnej u osób fenotypowo zdrowych;

wariant musi być wykrywany na różnym mitochondrialnym tle genetycznym. Oznacza to konieczność znalezienia co najmniej dwóch niespokrewnionych rodzin, w których dany wariant miałby stanowić przyczynę choroby. W praktyce jest to bardzo trudne;

poziom mtDNA z wariantem musi korelować z fenotypem, czyli osoby o cięższych objawach powinny mieć wyższą heteroplazmię wariantu niż osoby o objawach lżejszych lub zdrowe. Aby to sprawdzić, określa się poziom heteroplazmii u członków rodziny spokrewnionych w linii matczynej, wykorzystując DNA izolowany z łatwego do pozyskania w sposób nieinwazyjny materiału biologicznego - wymazów policzkowych, włosów, osadu moczu czy krwi obwodowej;

wariant musi naruszać miejsca konserwowane ewolucyjnie i domeny istotne funkcjonalnie. Do sprawdzenia tego przydatne są narzędzia bioinformatyczne do oceny patogenności. W przypadku mtDNA dobrymi narzędziami są: mitimpact - przewidujący patogenność wariantów w obszarach kodujących białka oraz mitotip (działa w obrębie bazy danych MITOMAP) - oceniający patogenność wariantów genów kodujących tRNA;

przekazaniu mtDNA do innej linii komórkowej musi towarzyszyć przeniesienie defektu na poziomie komórkowym lub molekularnym. Spełnienie tego warunku wymaga badań funkcjonalnych. Wykorzystuje się do nich linie komórkowe nieposiadające mtDNA (tzw. Rho0) oraz wyprowadzone od pacjenta linie komórkowe fibroblastów czy limfoblastów. Następnie przeprowadza się enukleację i fuzję uzyskanych cytoplastów z komórkami Rho0. W ten sposób mitochondrialny DNA znajdujący się w cytoplazmie linii komórkowej zostaje przeniesiony do komórki Rho0. Następnie trzeba sprawdzić, czy wraz z przeniesieniem mtDNA została przeniesiona dysfunkcja systemu fosforylacji oksydacyjnej. Do badania można wykorzystać także płytki krwi, dzięki czemu unika się jednego etapu procedury, czyli enukleacji. Metoda ta jest dość pracochłonna i długotrwała, a jeśli wariant wyjściowo był heteroplazmatyczny, to jego poziom czy we krwi, czy w fibroblastach mógł być niski, a hodowla mogła wpłynąć na dalsze jego obniżenie. W wielu przypadkach procedura okazuje się niestety nieskuteczna.

Korzyści z uzyskania diagnozy molekularnej

Choroby mitochondrialne, podobnie jak wiele innych chorób o podłożu dziedzicznym, są postrzegane jako te, w których istnieje niewiele możliwości terapeutycznych, a większość z nich to leczenie objawowe, które tylko w niewielkim stopniu poprawia stan pacjenta. Warto podkreślić, że nawet jeśli uzyskanie wyniku badania genetycznego nie wpłynie w znaczącym stopniu na leczenie, to kończy często wieloletnią odyseję diagnostyczną. Poza tym pozwala na podejmowanie bardziej świadomych decyzji odnośnie do swojego zdrowia i dalszych planów życiowych. Poniżej kilka mniej lub bardziej pozytywnych przykładów pokazujących, w jaki sposób uzyskanie diagnozy molekularnej może wpłynąć na leczenie lub w inny sposób zmodyfikować życie chorego lub jego rodziny.

Pierwszym dobrym przykładem jest dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera. Od kilku lat w Unii Europejskiej jest zarejestrowany lek będący analogiem koenzymu Q10 - idebenone (nazwa handlowa Raxone). Polscy pacjenci z potwierdzoną obecnością patogennych wariantów mtDNA odpowiedzialnych za chorobę są leczeni tym preparatem. Prowadzone są także badania nad terapią genową, a ich wyniki są dość optymistyczne.

W przypadku mutacji genu TK2 zaburzającego mitochondrialny szlak odzysku nukleotydów dobre efekty przynosi doustna terapia deoksynukleozydami cytydynowymi i tymodynowymi oraz monofosforanami deoksynukleozydów cytydynowych i tyminowych. Jest ona prowadzona w pojedynczych ośrodkach na świecie w ramach tzw. humanitarnego stosowania leku (compassionate use treatment). Dotychczas nie podejmowano prób podobnego leczenia w przypadku innych chorób mitochondrialnych związanych z zaburzeniami szlaku biosyntezy nukleotydów. Niestety są to choroby na tyle rzadkie, że trudno przeprowadzić wiarygodne badania kliniczne, ze względu na skrajnie małą liczbę pacjentów.

W przypadku zespołu Alpersa-Huttenlochera często pierwszym objawem jest padaczka. Nierzadko pierwszym stosowanym lekiem przeciwpadaczkowym jest kwas walproinowy, który w przypadku tej choroby gwałtownie przyspiesza proces uszkadzania wątroby i w krótkim czasie doprowadza do śmierci ze względu na jej niewydolność. Uzyskanie diagnozy molekularnej (zwykle dopiero w przypadku kolejnego dziecka w rodzinie) pozwala na prowadzenie innego leczenia przeciwpadaczkowego.

Ostatni przykład dotyczy patogennych wariantów mtDNA. W przypadku kobiety, która ma patogenny wariant mtDNA prowadzący do ciężkiej, śmiertelnej choroby dziecka, od kilku lat możliwe jest przeprowadzenie mitochondrialnej terapii zastępczej w celu zapobieżenia przekazaniu patogennego wariantu potomstwu. Procedura opiera się na zapłodnieniu pozaustrojowym, które obejmuje wykorzystanie, oprócz komórki jajowej matki, także komórki jajowej od zdrowej dawczyni. Z obu komórek pobiera się wrzeciono kariokinetyczne (jeśli procedura przeprowadzana jest przed zapłodnieniem) lub przedjądrza (jeśli procedura przeprowadzana jest po zapłodnieniu) następnie wrzeciono lub przedjądrza z komórki matki wprowadza się do pozbawionego jądrowego materiału genetycznego oocytu dawczyni. Procedura ta jest dostępna dla pacjentek w Wielkiej Brytanii od roku 2018. Wiadomo też o jednym dziecku z rodziny obciążonej zespołem Leigha, które urodziło się w wyniku tej procedury w Meksyku. Jest ona także oferowana w kilku klinikach jako sposób leczenia niepłodności, choć nie istnieją żadne wiarygodne raporty o jej skuteczności w tym zakresie.

Piśmiennictwo

1. Granadillo De Luque J.L., Luna M., Hernández-Reina L., Arteaga-Diaz C. i Arteaga-Díaz J.M.: Case studies of two families with MIDD and MELAS: Heteroplasmy level in m.3243A>G mutation and the first report on m.3271T>C mutation in Colombia. Case Reports. 2016, 2(1): 27-36.

2. Ghezzi D. i Zeviani M.: Human diseases associated with defects in assembly of OXPHOS complexes. Essays Biochem. 2018, 62(3): 271-286.

3. Hyslop L.A., Blakeley P., Craven L., Richardson J., Fogarty N.M., Fragouli E., Lamb M., Wamaitha S.E., Prathalingam N., Zhang Q., O'Keefe H., Takeda Y., Arizzi L., Alfarawati S., Tuppen H.A., Irving L., Kalleas D., Choudhary M., Wells D., Murdoch A.P., ... i Herbert M.: Towards clinical application of pronuclear transfer to prevent mitochondrial DNA disease. Nature. 2016, 534(7607): 383-386.

4. Piekutowska-Abramczuk D., Kaliszewska M., Sułek A., Jurkowska N., Ołtarzewski M., Jabłońska E., Trubicka J., Głowacka A., Ciara E., Kowalski P., Langiewicz-Wojciechowska K., Tesarova M., Zeman J., Kierdaszuk B., Kuczyński D., Chmielewski D., Szymańska E., Bakuła A., Łusakowska A., Lipowska M., ... i Pronicka E.: The frequency of mitochondrial polymerase gamma related disorders in a large Polish population cohort. Mitochondrion. 2019, 47: 179-187.

5. Piekutowska-Abramczuk D., Popowska E., Pronicka E., Karczmarewicz E., Pronicki M., Kmieć T. i Krajewska-Walasek M.: SURF1 gene mutations in Polish patients with COX-deficient Leigh syndrome. J Appl Genet. 2001, 42(1): 103-108.

6. Pronicka E., Piekutowska-Abramczuk D., Szymańska-Dębińska T., Bielecka L., Kowalski P., Luczak S., Karkucińska-Więckowska A., Migdał M., Kubalska J., Zimowski J., Jamroz E., Wierzba J., Sykut-Cegielska J., Pronicki M., Zaremba J. i Krajewska-Walasek M.: The natural history of SCO2 deficiency in 36 Polish children confirmed the genotype-phenotype correlation. Mitochondrion. 2013, 13(6): 810-816.

7. Schon K.R., Ratnaike T., van den Ameele J., Horvath R. i Chinnery, P.F.: Mitochondrial diseases: A diagnostic revolution. Trends Genet. 2020, 36(9): 702-717.

8. Stenton S.L., Sheremet N.L., Catarino C.B., Andreeva N.A., Assouline Z., Barboni P., Barel O., Berutti R., Bychkov I., Caporali L., Capristo M., Carbonelli M., Cascavilla M.L., Charbel Issa P., Freisinger P., Gerber S., Ghezzi D., Graf E., Heidler J., Hempel M., ... i Prokisch H.: Impaired complex I repair causes recessive Leber's hereditary optic neuropathy. J Clin Invest. 2021, 131(6): e138267.

9. Wei W. i Chinnery P.F.: Inheritance of mitochondrial DNA in humans: Implications for rare and common diseases. J Intern Med. 2020, 287(6): 634-644.

10. Gene group: Mitochondrial respiratory chain complexes, HUGO Gene Nomenclature Committee. Pobrano 8.12.2021 z: https://www.genenames.org/data/genegroup/#!/group/639.

11. Mitochondrial donation treatment, Human Fertilisation and Embryology Authority. Pobrano 8.12.2021 z: https://www.hfea.gov.uk/treatments/embryo-testing-and-treatments-for-disease/mitochondrial-donation-treatment/.

12. MITOMAP: A human mitochondrial genome database, Foswiki. Pobrano 8.12.2021 z: https://mitomap.org/MITOMAP.

13. MitImpact 3D [strona główna]. Pobrano 8.12.2021 z: https://mitimpact.css-mendel.it.

4Badania obrazowe w diagnostyce miopatiiEdyta Rosiak

Wprowadzenie

Ze względu na różnorodność przebiegu klinicznego chorób pierwotnie mięśniowych, oprócz oceny poziomu kinazy kreatynowej we krwi, badań elektrofizjologicznych, histopatologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych, istotnym elementem uzupełniającym stała się diagnostyka obrazowa. U pacjentów z podejrzeniem dziedzicznych lub nabytych chorób mięśni w celu wykrycia zmian w mięśniach szkieletowych i oceny ciężkości zajęcia poszczególnych mięśni możemy posłużyć się takimi technikami obrazowania jak rezonans magnetyczny czy ultrasonografia. Dzięki diagnostyce obrazowej możemy również monitorować przebieg choroby i leczenia, a za pomocą odpowiednich sekwencji w rezonansie magnetycznym możemy określić aktywność procesu chorobowego zachodzącego w mięśniach. Ciągły postęp w diagnostyce obrazowej mięśni stymulowany jest rozwojem badań molekularnych i zestawianiem wykrytych wariantów genetycznych z obrazem klinicznym.

Metody diagnostyki obrazowej

Tomografia komputerowa była stosowana pod koniec XX wieku do oceny stopnia zajęcia mięśni w chorobach nerwowo-mięśniowych. Pozwalała wykryć cechy degeneracji tłuszczowej w mięśniach położonych zarówno powierzchownie, jak i głęboko.

Typowo tkanka mięśniowa ma współczynnik osłabienia promieniowania ok. 50 j.H. (jednostek Hounsfielda), a jej densyjność może być obniżona poprzez pojawienie się w jej obrębie tkanki tłuszczowej o współczynniku osłabienia promieniowania w zakresie od -100 do -50 j.H.

Tomografia komputerowa została wyparta przez ultrasonografię i rezonans magnetyczny nie tylko z powodu szkodliwości promieniowania jonizującego, ale lecz także przez niską rozdzielczość tkankową. Interpretacja zmian była utrudniona z powodu słabego kontrastu pomiędzy poszczególnymi mięśniami, pomiędzy mięśniami z cechami infiltracji tłuszczowej a tkanką tłuszczową podskórną oraz pomiędzy mięśniami a tkanką tłuszczową z cechami obrzęku. Ze względu na artefakty utwardzania wiązki trudna była również ocena mięśni przylegających do kości.

Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości stanowi obecnie istotną część złożonej oceny w diagnostyce chorób pierwotnie mięśniowych, zwłaszcza u dzieci. Metoda ta pozwala na wykrycie w mięśniach zmian, które mogą być nieme klinicznie lub niedostępne ocenie w badaniu elektrofizjologicznym, takim jak EMG.

Coraz większe zastosowanie USG u pacjentów z chorobami nerwowo-mięśniowymi wynika z ogólnych cech tej techniki, jak brak przeciwwskazań, dobra tolerancja i powtarzalność badania, wysoka dostępność i mobilność sprzętu. Obserwowany wzrost liczby badań przesiewowych i diagnostycznych u dzieci jest związany nie tylko z brakiem promieniowania jonizującego, lecz wynika także z lepszej tolerancji badania w porównaniu z badaniami elekrofizjologicznymi czy rezonansem magnetycznym. Badanie takie jak EMG, pomimo wysokiej czułości w wykrywaniu chorób nerwowo-mięśniowych, może wywoływać u dzieci ból i nie być w pełni diagnostyczne. Podobnie pozostawanie w bezruchu przez dłuższy czas podczas badania w rezonansie magnetycznym może być trudne do spełnienia dla niektórych pacjentów, a u dzieci wiązać się z koniecznością zastosowania sedacji.

Preferowanie stosowania USG w obrazowaniu patologii w mięśniach wynika z dobrej rozdzielczości tkankowej tej techniki, większej niż w rezonansie magnetycznym, oraz możliwości badania dynamicznego - obrazowania skurczu mięśnia. Dzięki temu ultrasonografia pozwala na wykrywanie i dokładną ocenę zmian w mięśniach. Może być wykorzystywana podczas monitorowania leczenia i oceny jego skuteczności, jak ma to miejsce w dystrofii mięśniowej Duchenne'a, gdzie USG jest bardziej czułym narzędziem do wykrycia nasilenia zmian w mięśniach niż ocena kliniczna. Zdarza się, że jest jedynym narzędziem diagnostycznym, np. w przypadku dysfagii u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a - ze względu na niedostępność oceny mięśni twarzy oraz mięśni ustno-gardłowych w EMG. Poza tym USG jest niezwykle użytecznym narzędziem służącym do określenia miejsca biopsji oraz uniknięcia uszkodzenia naczyń i nerwów. Może również służyć do określenia położenia anatomicznego elektrody igłowej w poszczególnych mięśniach w trakcie badania EMG, choć ten aspekt badania USG nie jest wykorzystywany w celu wykonania rutynowych diagnostycznych badań EMG.

USG ma oczywiście swoje ograniczenia i dlatego do obrazowania mięśni całego ciała oraz mięśni położonych głęboko preferowany jest rezonans magnetyczny. Poza tym ocena w USG jest zależna od doświadczenia operatora oraz od jakości sprzętu, skąd może wynikać słaba powtarzalność wyników pomiędzy badaczami, a nawet pomiędzy badaniami tego samego badacza.

Ze względu na rozległość oceny mięśni szkieletowych najlepiej jest postępować według ustalonego schematu badania. W 15-minutowym protokole badania przesiewowego mięśni według Pillena ocena obejmuje grubość i echogeniczność mięśnia dwugłowego ramienia, zginacza promieniowego nadgarstka, prostego uda, piszczelowego przedniego. W przypadku podejrzenia miopatii protokół można rozszerzyć o badanie obustronne: mięśnia czworobocznego, naramiennego, dwugłowego ramienia, zginacza promieniowego nadgarstka, obszernego bocznego uda, piszczelowego przedniego, głowy przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki.

W obrazie USG mięśnie szkieletowe mają echostrukturę heterogeniczną, a tkanka tłuszczowa jest hiperechogeniczna. Omięsna, namięsna są hiperechogenicznymi pasmami znajdującymi się na hipoechogenicznym tle utworzonym przez pęczki włókien mięśniowych. Poprzez ocenę echogeniczności mięśnia możemy pośrednio stwierdzić jego tłuszczową degenerację i obrzęk. U zdrowych dzieci wiek nie wpływa na grubość i echogeniczność mięśni, natomiast u dorosłych echogeniczność jest związana z wiekiem i aktywnością fizyczną. Czułość badania USG jest niższa u dzieci poniżej 3. r.ż., w miopatiach metabolicznych oraz u pacjentów z miopatiami na wczesnym etapie choroby, ze względu na brak znacznych zmian strukturalnych w ocenianych mięśniach.

Typowo w zmianach miopatycznych widoczny jest obraz mięśni o jednorodnie podwyższonej echogeniczności - o tzw. wyglądzie matowej szyby, a w przypadku zmian wtórnie neurogennych obraz USG mięśni jest bardziej niejednorodny, plamisty - o tzw. wyglądzie wygryzienia przez mole - ze względu na występujące obszary bez cech odnerwienia.

Podczas oceny mięśni możemy określić ich wielkość, echogeniczność, morfologię i podać dokładną lokalizację. Na przekrojach poprzecznych możemy stwierdzić zanik mięśnia z utratą prawidłowego wypukłego zarysu brzuśca mięśniowego lub jego przerost. Grubość mięśni zazwyczaj jest zmniejszona we wrodzonych miopatiach, w przewlekłej fazie miopatii zapalnych, może być zmniejszona w dystrofiach mięśniowych, natomiast w miopatiach metabolicznych jest zazwyczaj prawidłowa. W chorobach, takich jak dystrofie mięśniowe, miopatie wrodzone, miopatie zapalne, za zwiększenie echogeniczności mięśnia może odpowiadać zwiększenie ilości tkanki tłuszczowej, włóknienie lub proces zapalny. W wyniku wzrostu echogeniczności mięśnia zwiększa się pochłanianie wiązki ultradźwiękowej i zmniejsza się głębokość jej penetracji w głąb tkanek, przez co widzimy zatarcie zarysu warstwy korowej i brak typowego cienia akustycznego za kością. Ocena echogeniczności mięśnia może być wzrokowa, półilościowa, jak ma to miejsce w skali Heckmatta, lub ilościowa z użyciem specjalnego oprogramowania do analizy skali szarości z użyciem wartości referencyjnych.

Według skali Heckmatta:

Stopień 1 - prawidłowy obraz mięśnia.

Stopień 2 - wzrost echogeniczności mięśnia z prawidłowym echem kości.

Stopień 3 - umiarkowany wzrost echogeniczności mięśnia ze zmniejszeniem echa kości.

Stopień 4 - znaczny wzrost echogeniczności mięśnia z cieniem zasłaniającym echo kości.

Należy pamiętać, że obraz mięśnia może wynikać z głębokości jego położenia oraz kąta padania wiązki ultradźwiękowej podczas badania. Ze względu na zjawisko anizotropii mięśnie należy badać pod kątem prostym względem wiązki ultradźwiękowej, gdyż pod innym kątem zmniejsza się echogeniczność badanego mięśnia.

W miopatiach zapalnych idiopatycznych za pomocą technik dopplerowskich możemy ocenić przekrwienie mięśni, powięzi mięśniowych i tkanki tłuszczowej podskórnej.

Rozwój technik USG w zakresie elastografii, badania tekstury tkanek miękkich, wzrostu rozdzielczości aparatów i możliwości obrazowania 3D stwarza ogromne pole w diagnostyce i monitorowaniu chorób pierwotnie mięśniowych. Wzrost czułości i swoistości USG postępuje wraz z rozwojem pomiarów ilościowych i jakościowych.

Aktualnie obrazowanie mięśni w rezonansie magnetycznym odgrywa kluczową rolę w diagnostyce chorób pierwotnie mięśniowych dzięki wykrywaniu zmian w mięśniach całego ciała, określaniu rozległości i ciężkości zajęcia poszczególnych mięśni oraz ocenianiu aktywności procesu chorobowego. Pomaga określić miejsce biopsji mięśnia oraz monitorować przebieg choroby i efekty zastosowanego leczenia.

Ze względu na wysoki kontrast pomiędzy tkankami miękkimi i możliwość obrazowania wielopłaszczyznowego MR pozwala dokładnie ocenić położenie, wielkość, morfologię i skład mięśni szkieletowych. Jego przewaga nad USG wynika z wiarygodnej oceny mięśni położonych zarówno powierzchownie, jak i głęboko. Określenie zajęcia poszczególnych mięśni jest o wiele dokładniejsze niż w badaniu fizykalnym. Ze względu na brak promieniowania jonizującego MR może być bezpiecznie stosowany u dzieci, a jego przeciwwskazania wynikają z istoty metody rezonansu magnetycznego, która wiąże się z zastosowaniem silnego pola magnetycznego statycznego, impulsu generującego zmienne w czasie pole magnetyczne, gradientów pola magnetycznego. Do przeciwwskazań należą: stymulatory serca, metaliczne ciała obce w obrębie ciała, w oku, neurostymulatory, wszczepione implanty słuchowe, pompy infuzyjne (insulinowe), klipsy metalowe wewnątrzczaszkowe. Bezpieczeństwo danego urządzenia lub implantu w ciele zależy od mocy użytego urządzenia, czy jest to aparat o indukcji pola magnetycznego 1,5 T czy 3 T.

Początkowo obrazowanie w miopatiach dotyczyło głównie mięśni na poziomie miednicy i kończyn dolnych. Obecnie dąży się do obrazowania całego ciała w rezonansie magnetycznym (Whole-Body MRI), dzięki czemu można zobaczyć zarówno duży, całościowy obraz mięśni szkieletowych, jak i ocenić zmiany w każdym najmniejszym obszarze - pod kątem morfologii, tłuszczowej degeneracji lub obrzęku. Możemy dokonać zarówno pomiarów ilościowych, jak i jakościowych, co zależy od zastosowanych protokołów badań i oprogramowania postprocesingowego.

W konwencjonalnym rezonansie magnetycznym protokół badania optymalnie zawiera sekwencje echa spinowego T1-, T2-zależne, służące do oceny anatomii, wielkości mięśni, morfologii i składu mięśni pod kątem tłuszczowej infiltracji lub tłuszczowej degeneracji, w przypadku chorób dystroficznych mięśni (ryc. 4.1), oraz sekwencję odwróconej inwersji typu STIR (short tau inversion recovery) lub sekwencję T2-zależną z saturacją tłuszczu, które służą do oceny obrzęku mięśni (ryc. 4.2).

W obrazach T1-zależnych mięśnie są izointensywne, natomiast tkanka tłuszczowa, przegrody międzymięśniowe i powięzi mięśniowe są hiperintensywne. Skale: Mercuriego (2002 rok) i Fishera (2008 rok) są oparte na wzrokowej ocenie ilości degeneracji tłuszczowej mięśnia w obrazach T1-zależnych.

Według skali modyfikowanej przez Fishera:

Stopień 0 - obraz prawidłowy.

Stopień 1 - niewielki, ślad podwyższenia sygnału w obrazach T1-zależnych.

Stopień 2 - umiarkowany, podwyższenie sygnału w obrazach T1-zależnych z tendencją do zlewania i zajęciem mniej niż 50% mięśnia.

Stopień 3 - znaczny, podwyższenie sygnału w obrazach T1-zależnych z tendencją do zlewania i zajęciem więcej niż 50% mięśnia.

Stopień 4 - końcowe stadium, cały mięsień o podwyższonym sygnale, całkowicie zastąpiony przez tkankę łączną lub tłuszczową.

Ta złożona interpretacja może być w przyszłości przyśpieszona przez algorytmy sztucznej inteligencji oraz półautomatyczną segmentację mięśni.

Natomiast w obrazach T2-zależnych z saturacją tłuszczu lub STIR możemy wykryć cechy obrzęku w postaci podwyższenia sygnału w mięśniach, co pośrednio świadczy o aktywności procesu w miopatiach dystroficznych, metabolicznych i zapalnych. Niekiedy obrzęk może być jedyną oznaką choroby w jej wczesnej fazie, przed pojawieniem się tkanki tłuszczowej czy włóknistej w mięśniach. Należy pamiętać, że podwyższenie sygnału w obrazach T2-zależnych nie jest specyficzne i może wynikać m.in. ze zmian zapalnych, ostrego odnerwienia czy też martwicy komórek.

Rycina 4.1.

Obrazy T1-zależne w przekrojach poprzecznych. Na poziomie ud: A. Prawidłowy obraz mięśni. B. Mięśnie z cechami znacznej infiltracji tłuszczowej u dziecka z miopatią Bethlema. Na poziomie podudzi u dziecka z dystrofią obręczowo-kończynową 2D (LGMD 2D): C. Cechy obustronnej, umiarkowanej degeneracji tłuszczowej w mięśniu piszczelowym przednim i głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki. D. Cechy progresji degeneracji tłuszczowej w mięśniach w badaniu kontrolnym po roku.

Rycina 4.2.

Obrazy STIR w przekrojach poprzecznych na poziomie ud. A. Mięśnie bez cech obrzęku. B. Obustronnie cechy obrzęku w mięśniu czworogłowym uda, mięśniu przywodzicielu wielkim, dwugłowym uda u pacjenta z wtrętowym zapaleniem mięśni (IBM). Dziecko z dystrofią obręczowo--kończynową 2I (LGMD 2I): C. Obustronnie cechy obrzęku w mięśniu krawieckim. D. Zmniejszenie cech obrzęku w mięśniach w badaniu kontrolnym po 10 miesiącach leczenia.

Do oceny ilościowej infiltracji lub degeneracji tłuszczowej w mięśniach służą sekwencje Dixon (3-point Dixon) oparte na metodzie przesunięcia chemicznego, które pozwalają na dokładne obliczenie frakcji tłuszczowej w mięśniach. Dzięki temu odgrywają znaczącą rolę w monitorowaniu postępu choroby i ocenie efektów leczenia w dystrofiach mięśniowych.

Do oceny ilościowej obrzęku mięśni służą mapy czasu relaksacji T2, spektroskopia MR, które mogą wykryć bardzo wczesne zmiany w mięśniach, pojawiające się przed degeneracją tłuszczową. Są kluczowe w ocenie aktywności procesu chorobowego.

W trakcie badań znajdują się techniki takie jak elastografia MR i spektroskopia MR służące do wykrycia włóknienia w mięśniach dystroficznych. Badania z kontrastem nie są rutynowo zalecane w chorobach pierwotnie mięśniowych i specjalne środki kontrastowe oparte na gadolinie są obecnie w fazie badań, również w celu wczesnego wykrycia włóknienia mięśni.

W konwencjonalnym rezonansie nie są obserwowane zmiany w mięśniach u pacjentów z miopatiami kanałowymi i metabolicznymi. Obecnie trwają badania nad wykorzystaniem takich metod, jak 23Na-MRI i 1H-MRI, w celu wykrycia zachodzących zmian w trakcie epizodów osłabienia mięśni.

Obrazowanie w rezonansie magnetycznym w niektórych dziedzicznych i nabytych chorobach mięśniowych

Choroba Pompego

U pacjentów z chorobą Pompego o późnym początku dominuje infiltracja tłuszczowa w mięśniach języka, podłopatkowych, przykręgosłupowych, ściany jamy brzusznej, biodrowo-lędźwiowych, pośladkowych, przywodzicielach wielkich, z względnym zaoszczędzeniem głowy krótkiej mięśnia dwugłowego uda, smukłego, krawieckiego, prostego uda, na tle zróżnicowanego zajęcia mięśni przedniego i tylnego przedziału ud oraz z zaoszczędzeniem mięśni goleni. Spośród mięśni obszernych uda stosunkowo największe zmiany dotyczą mięśnia obszernego pośredniego. U pacjentów bezobjawowych może być obecna niewielka infiltracja tłuszczowa w mięśniach języka, przykręgosłupowych, ściany jamy brzusznej, przywodzicielu wielkim. W fazie badań znajduje się obrazowanie mięśni metodą tensora dyfuzji DTI oraz transferu magnetyzacji MT w celu wykrycia bardzo wczesnych uszkodzeń w mięśniach w chorobie Pompego, przed pojawieniem się infiltracji tłuszczowej.

Dystrofie mięśniowe obręczowo-kończynowe (LGMD, limb-girdle muscular dystrophies)

U pacjentów z LGMD 2A (kalpainopatią) cechy degeneracji tłuszczowej widoczne są w mięśniach stabilizujących łopatkę. Poza tym typowe jest wczesne i przeważające zajęcie mięśnia pośladkowego wielkiego, półbłoniastego, dwugłowego uda, przywodziciela wielkiego, obszernego pośredniego, z zaoszczędzeniem mięśnia obszernego bocznego, smukłego i krawieckiego. Na poziomie goleni dominuje zajęcie głowy przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki i mięśnia płaszczkowatego.

U pacjentów z LGMD 2I (FKRP-zależną miopatią), podobnie jak w LGMD 2A, cechy degeneracji tłuszczowej dominują w mięśniu pośladkowym wielkim, przywodzicielach uda, głowie długiej mięśnia dwugłowego uda, obszernym pośrednim, z względnym zaoszczędzeniem mięśnia smukłego i krawieckiego. W odróżnieniu od LGMD 2A zmiany w mięśniach podudzi są bardziej rozlane i obserwowany jest rzekomy przerost mięśni. Na poziomie miednicy bardziej zajęty jest mięsień zasłaniacz zewnętrzny i wewnętrzny.

W badaniu MR mięśni pacjentów z LGMD 2B (dysferlinopatią) dominuje zajęcie mięśni przykręgosłupowych odcinka lędźwiowego (prostowników), przedziału przedniego i tylnego ud, z zaoszczędzeniem mięśnia krawieckiego i smukłego, oraz zajęcie tylnego przedziału mięśni goleni. Na poziomie miednicy obserwuje się zmiany w mięśniu pośladkowym małym i zasłaniaczu zewnętrznym, a w późniejszym stadium choroby w pozostałych mięśniach pośladkowych. Cechy degeneracji tłuszczowej są obecne również w mięśniu podłopatkowym i najszerszym grzbietu. Na wczesnym etapie choroby jedynym objawem może być podwyższenie sygnału w STIR w mięśniach przywodzicielach uda i głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki.

Chorzy z LGMD 2L (anoktaminopatią) prezentują dość podobną do LGMD 2B lokalizację zmian w mięśniach, z zajęciem mięśni przywodzicieli uda, kulszowo-goleniowych, trójgłowego łydki. Cechą wyróżniającą jest asymetria zmian w mięśniach, cechy degeneracji tłuszczowej bardziej nasilone w mięśniach dystalnych niż na poziomie miednicy oraz zajęcie mięśnia smukłego i krawieckiego. W obrazach STIR zazwyczaj widoczne są cechy obrzęku mięśni.

W przebiegu sarkoglikanopatii (LGMD2C, D, E, F) i dystrofinopatii (DMD, Duchenne muscular dystrophy, BMD, Becker muscular dystrophy) jest stwierdzany rzekomy przerost łydek, dochodzi do rozwoju kardiomiopatii, zajęcia mięśni oddechowych. W dystrofinopatiach dominuje degeneracja tłuszczowa w mięśniach obręczy kończyny górnej oraz dolnej. W DMD charakterystyczne są wczesne zmiany w mięśniu brzuchatym łydki - w postaci degeneracji tłuszczowej i rzekomego przerostu, wczesne zmiany w mięśniach stożka rotatorów oraz znaczne zajęcie mięśnia pośladkowego małego, średniego, przywodziciela wielkiego, z nieco mniejszym zajęciem mięśnia pośladkowego wielkiego, czworogłowego uda. Typowo obserwuje się na poziomie uda tzw. obraz trzech listków z pojedynczym owocem - z powodu względnego zaoszczędzenia mięśnia krawieckiego, smukłego, przywodziciela długiego oraz półścięgnistego. W odróżnieniu od DMD, w BMD i sarkoglikanopatiach zajęcie mięśnia półbłoniastego zachodzi zazwyczaj przed zmianami w mięśniu czworogłowym uda. Natomiast w przypadku sarkoglikanopatii aż do późnego stadium choroby mięśnie podudzi pozostają bez cech degeneracji tłuszczowej.

W dystrofii miotonicznej typu 1 (myotonic dystrophy 1, DM1) zazwyczaj obserwujemy w mięśniach zarówno cechy tłuszczowej degeneracji, jak i obrzęku. Dominuje zajęcie mięśni przykręgosłupowych, trójgłowego ramienia, zginacza głębokiego palców oraz na poziomie ud mięśni obszernych, z względnym zaoszczędzeniem mięśnia prostego uda oraz charakterystycznym, tzw. półksiężycowatym, okołoudowym zajęciem mięśni obszernych. Charakterystyczne jest wczesne zajęcie głowy przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki. MRI całego ciała daje możliwość oceny pod kątem poszerzenia przełyku. Większość pacjentów z DM2 nie wykazuje cech degeneracji tłuszczowej ani obrzęku w mięśniach. Ewentualnie mogą być obecne zmiany w mięśniach przykręgosłupowych i pośladkowych, większe zajęcie przedniego przedziału mięśni ud z zaoszczędzeniem mięśnia prostego uda i smukłego oraz zajęcie głowy przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki.

W dystrofii twarzowo-łopatkowo-ramieniowej (fascio-scapulo-humeral muscular dystrophy, FSHD) cechą charakterystyczną jest asymetryczne zajęcie mięśni, z wczesnym zanikiem w mięśniach twarzy i mięśni stabilizujących łopatkę, zazwyczaj z zajęciem mięśnia czworobocznego, obłego większego i zębatego przedniego. Zmiany dotyczą nie tylko mięśni obręczy kończyny górnej, lecz także mięśni przykręgosłupowych i ściany jamy brzusznej. W kończynie dolnej asymetryczne zmiany dotyczą głównie głowy przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki, piszczelowego przedniego, płaszczkowatego. W obrębie ud dominuje zajęcie mięśni kulszowo-goleniowych (w największym stopniu półbłoniastego) oraz mięśni przywodzicieli uda.

Spośród miopatii wrodzonych na uwagę zasługuje choroba typu central core (CCD) spowodowana mutacją w genie RYR1. W CCD dominuje zajęcie mięśnia pośladkowego wielkiego, przedniego przedziału ud (w największym stopniu mięśnia obszernego bocznego i pośredniego), przywodziciela wielkiego, z zaoszczędzeniem mięśnia przywodziciela długiego, smukłego, krawieckiego, płaszczkowatego i głowy bocznej mięśnia brzuchatego łydki. Charakterystyczne jest wybiórcze zajęcie mięśni żwaczy.

U pacjentów z miopatią Ullricha lub Bethlema, związanych z mutacjami genów kodujących kolagen VI, obserwuje się wczesne zajęcie centralnej części mięśnia prostego uda i obszernego bocznego, a na podudziach pogranicza mięśnia płaszczkowatego i brzuchatego łydki.

Natomiast w pozostałych wrodzonych miopatiach dominuje zajęcie przedziału tylnego ud. U pacjentów z miopatią selenoproteinową (SEPN1) obserwuje się zajęcie mięśni części twarzowej czaszki: skroniowego, żwacza, skrzydłowego bocznego oraz mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego. Ponadto zmiany typowo zlokalizowane są w mięśniu krawieckim, tylnym przedziale mięśniowym uda, w głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki.

Chorzy z miopatią nemalinową związaną z mutacją genu ACTA-1 zazwyczaj prezentują zmiany w mięśniach języka, mostkowo-obojczykowo-sutkowym, krawieckim. W odróżnieniu od selenoproteinopatii zajęte są mięśnie przedniego przedziału podudzi. W przypadku miopatii nemalinowej związanej z mutacją genu nebuliny dominuje zajęcie mięśnia płaszczkowatego i piszczelowego przedniego.

Miopatie zapalne idiopatyczne

We wtrętowym zapaleniu mięśni (sporadic inclusion body myositis, sIBM) cechy infiltracji tłuszczowej są obecne typowo w mięśniu zginaczu głębokim palców, obszernym bocznym, w mniejszym stopniu w pozostałych mięśniach obszernych, prostym uda i krawieckim oraz na poziomie goleni w głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki. W tych mięśniach mogą też być widoczne cechy obrzęku, a zajęcie mięśni może być asymetryczne. Cechy zaniku najczęściej są widoczne w mięśniu czworogłowym uda oraz głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki. W mięśniu obszernym bocznym obserwuje się falisty przebieg rdzenia ścięgnistego.

W zapaleniu wielomięśniowym (polymyositis, PM) występują obustronnie symetryczne zmiany w mięśniach, z przewagą cech obrzęku nad ciężkością infiltracji tłuszczowej. Obrzęk w mięśniach proksymalnych kończyn górnych i dolnych jest zazwyczaj rozlany w odróżnieniu od obwodowego lub siateczkowatego obrzęku mięśni obserwowanego w przebiegu zapalenia skórno-mięśniowego (dermatomyositis, DM), gdzie dodatkowo występuje obrzęk tkanki tłuszczowej podskórnej i obrzęk wzdłuż powięzi mięśniowych. W odróżnieniu od PM, w DM dominuje obrzęk na poziomie ud, z wyjątkiem mięśni kulszowo-goleniowych - zajętych podobnie w obu grupach pacjentów. W fazie przewlekłej PM widoczne są cechy infiltracji tłuszczowej w mięśniach.

W toksycznym i polekowym uszkodzeniu mięśni zmiany nie są specyficzne, głównie dotyczą mięśni obręczy kończyny górnej i dolnej oraz tylnych przedziałów mięśniowych ud i podudzi. U pacjentów z autoimmunologicznym martwiczym zapaleniem mięśni (immune-mediated necrotizing myopathy, IMNM) dominują cechy obrzęku w mięśniu trójgłowym ramienia, naramiennym, podłopatkowym, podgrzebieniowym, pośladkowym wielkim, mięśniach zasłaniaczach, przywodzicielach uda (przywodzicielu krótkim), kulszowo-goleniowych, głowie przyśrodkowej mięśnia brzuchatego łydki. Obrzęk może rozszerzać się na powięzi mięśniowe i tkankę tłuszczową podskórną. Towarzyszą temu niewielkie cechy infiltracji tłuszczowej w mięśniach. Mniej nasilone zmiany obrzękowe występują w miopatii postatynowej.

Piśmiennictwo

1. Swash M., Brown M.M. i Thakkar C.: CT muscle imaging and the clinical assessment of neuromuscular disease. Muscle Nerve. 1995, 18(7): 708-714.

2. Hellmann M., von Kleist-Retzow J.C., Haupt W.F., Herkenrath P. i Schauseil-Zipf U.: Diagnostic value of electromyography in children and adolescents. J Clin Neurophysiol. 2005, 22(1): 43-48.

3. Pillen S., Scholten R.R., Zwarts M.J. i Verrips A.: Quantitative skeletal muscle ultrasonography in children with suspected neuromuscular disease. Muscle Nerve. 2003, 27(6): 699-705.

4. Burakiewicz J., Sinclair C.D.J., Fischer D., Walter G.A., Kan H.E. i Hollingsworth K.G.: Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. J Neurol. 2017, 264(10): 2053-2067.

5. Paoletti M., Pichiecchio A., Cotti Piccinelli S., Tasca G., Berardinelli A.L., Padovani A. i Filosto M.: Advances in quantitative imaging of genetic and acquired myopathies: Clinical applications and perspectives. Front Neurol. 2019, 10: 78.

5Badania obrazowe w diagnostyce neuropatii i chorób neuronu ruchowegoEdyta Maj

Wprowadzenie

Tradycyjnie podstawą w rozpoznawaniu neuropatii są objawy kliniczne i badania elektrodiagnostyczne, takie jak elektromiografia i badanie przewodnictwa nerwowego. W wynikach tych badań brak jest jednak dokładnych informacji anatomicznych i strukturalnych, co jest głównym ograniczeniem tych metod.

Diagnostyka obrazowa, służąca do tej pory jako dodatkowe badanie wspomagające, zaczęła w ostatnich latach odgrywać coraz większą rolę w rozpoznawaniu i monitorowaniu przebiegu neuropatii i chorób nerwowo-mięśniowych.

Jest to związane z dynamicznym rozwojem technik obrazowych (aparaty USG o wysokiej rozdzielczości, wprowadzenie do powszechnej diagnostyki aparatów wysokopolowych MR, w tym 3T z zaawansowanymi sekwencjami), szerszym dostępem do badań oraz coraz większą wiedzą na temat obrazów anatomicznych i patologicznych z zakresu układu nerwowego i mięśniowego.

Głównym obszarem zainteresowania w diagnostyce neuropatii i chorób neuronu ruchowego są trzy obszary:

1) centralny układ nerwowy (mózgowie i rdzeń kręgowy);

2) obwodowy układ nerwowy (sploty nerwowe i nerwy obwodowe);

3) mięśnie.

Wśród technik obrazowych najważniejszą rolę odgrywają: ultrasonografia wysokiej rozdzielczości (high-resolution ultrasound, HRUS) i rezonans magnetyczny (MR), przy czym MR służy do obrazowania zarówno centralnego, jak i obwodowego układu nerwowego oraz mięśni, podczas gdy USG, po okresie zarośnięcia ciemiączek, umożliwia obrazowanie tylko obwodowego układu nerwowego i mięśni.

Technikę wizualizacji nerwów obwodowych nazywamy neurografią - może ona być wykonana zarówno przy użyciu HRUS, jak i MR. Te dwie metody uzupełniają się wzajemnie, oddając dokładne szczegóły anatomiczne dotkniętego nerwu. Przewagą MR jest lepsza rozdzielczość tkankowa i wizualizacja nerwów w obszarach trudnych do oceny w USG czy w badaniach elektrodiagnostycznych (odcinki proksymalne, zlokalizowane głęboko w tkankach), HRUS natomiast jest łatwiej dostępny, tańszy, umożliwia obrazowanie dynamiczne w czasie rzeczywistym oraz szybkie i wydajne skanowania całej kończyny.

Według Agarwal i wsp. badanie MR trwa średnio około pięć razy dłużej niż HRUS tego samego obszaru anatomicznego. HRUS można wykonać u pacjentów, u których występują przeciwwskazania do badania MR. Wadą badania ultrasonograficznego jest subiektywizm oceny, zależny od doświadczenia i przeszkolenia operatora. Obie techniki umożliwiają równoczesną ocenę stanu unerwionych mięśni, przy czym MR cechuje się wyższą czułością i swoistością w tym obszarze. O wyborze techniki badania w wielu sytuacjach decyduje wyposażenie ośrodka, w którym przebywa pacjent i doświadczenie dostępnego personelu.

Żeby uzyskać maksymalny efekt diagnostyczny wykonanych badań obrazowych, niezbędna jest ścisła współpraca zespołu składającego się z neurologa, radiologa obeznanego z aspektami klinicznymi i rozumiejącego wyzwania techniczne tego typu badań oraz dobrze wyszkolonego technika.

Radiologia konwencjonalna i tomografia komputerowa nie znajdują zastosowania w diagnostyce neuropatii i chorób neuronu ruchowego.

Diagnostyka obrazowa neuropatii - technika i symptomatologia

Rezonans magnetyczny - MRI

Neurografia MR jest trudnym technicznie badaniem i wymaga zastosowania aparatów wysokopolowych, najlepiej 3T, które zapewniają uzyskanie wyższego stosunku sygnału do szumu (signal-noise ratio, SNR), dzięki czemu możliwe jest wykonanie cieńszych warstw o lepszej rozdzielczości w płaszczyźnie przekroju i wyższym kontraście. Dla otrzymania dobrej jakości obrazów obszar badania (field of view, FOV) powinienem być możliwie jak najmniejszy.

Lekarz neurolog musi mieć świadomość, że im większy obszar anatomiczny jest objęty badaniem, tym trwa ono dłużej, a pacjenci, często dzieci lub osoby starsze, nie potrafią wytrwać w bezruchu przez cały czas badania, co skutkuje artefaktami i gorszą jakością obrazu, niekiedy uniemożliwiającą ocenę. Z drugiej strony badanie często jest wykonywane z powodu objawów klinicznych polineuropatii z wielu obszarów anatomicznych (kończyny górne, dolne). Wybór właściwego zakresu badania i protokołu badania jest zależny od postawionego pytania klinicznego.

Rezonans magnetyczny odgrywa ważną rolę w obrazowaniu korzeni nerwów rdzeniowych i proksymalnych odcinków nerwów, które są trudne do oceny w badaniu EMC/NCS. Już w podstawowym badaniu MR kręgosłupa, obejmującym obrazy 2D T1, T2 i T2 z saturacją tkanki tłuszczowej w projekcji strzałkowej oraz T1 i T2 w projekcji poprzecznej, możemy ocenić przebieg, grubość i sygnał korzeni nerwów rdzeniowych do poziomu otworów międzykręgowych, a także bliższych odcinków nerwów rdzeniowych, a po podaniu środka kontrastowego - ewentualny stopień wzmocnienia (ryc. 5.1).

W badaniu splotów nerwowych i nerwów obwodowych wciąż standardem pozostają sekwencje 2D wykonywane w wielu płaszczyznach, uzupełnione

Rycina 5.1.

Pogrubienie i wzmocnienie korzeni nerwów rdzeniowych w przebiegu CIDP. Obrazy T1 w projekcji poprzecznej: A. Przed kontrastem. B. Po kontraście. Obrazy T1-zależne w projekcji strzałkowej: C. Przed kontrastem. D. Po kontraście.

o wysokiej jakości obrazy 3D umożliwiające wykonanie rekonstrukcji, takich jak projekcja najwyższej intensywności sygnału (maximum-intensity projection, MIP) (ryc. 5.2), przydatnych często neurochirurgom przed planowanym zabiegiem.

Kluczowe sekwencje 2D to obrazy T1-zależne bez saturacji tkanki tłuszczowej i T2 z saturacją tkanki tłuszczowej (fat saturation, FS) wykonane w płaszczyznach strzałkowej, czołowej i poprzecznej do długiej osi kończyny lub nerwu (dotyczy stopy). Rutynowo, celem saturacji tkanki tłuszczowej, wykorzystuje się obrazowanie STIR (short tau inversion recover) lub SPAIR (spectral attenuated inversion recovery), coraz częściej w nowych aparatach zastosowanie znajduje także sekwencja Dixona. Grubość warstwy w proksymalnych odcinkach kończyn powinna wynosić nie więcej niż 4-5 mm, a dystalnych 2-3 mm. Niektóre ośrodki zamiast albo obok sekwencji T2 FS stosują sekwencje PD FS. Obrazowanie 3D wykorzystywane jest głównie do diagnostyki splotów nerwowych (splot ramienny, lędźwiowy) i pozwala na wielopłaszczyznową wizualizację struktur nerwowych.

W większości neuropatii istnieją wskazania do podania środka kontrastowego. W takich przypadkach dodatkowo konieczne jest wykonanie obrazów T1 FS przed i po podaniu środka kontrastowego (2D lub 3D) i ewentualnie zastosowanie subtrakcji obrazów. Prawidłowe nerwy nie ulegają wzmocnieniu kontrastowemu, ponieważ perineurium tworzy barierę krew-nerw. Podanie kontrastu pozwala również na wykluczenie guzów takich jak: nerwiaki, nerwiakowłókniaki czy osłoniaki.

W analizie neurografii MR niezbędna jest znajomość szczegółowej budowy nerwu, przebiegu anatomicznego, podziałów, zakresu unerwianych mięśni, anatomii otaczających tkanek, obrazów prawidłowych i patologicznych oraz diagnostyki różnicowej.

Rycina 5.2.

Sploty barkowe - obraz 3D T2 z saturacją tkanki tłuszczowej w rekonstrukcji MIP.

Prawidłowy nerw ma średnicę przebiegającej w pobliżu tętnicy i stopniowo zmniejsza się ku obwodowi. Strukturze anatomicznej nerwów odpowiada ich obraz MR: na przekrojach poprzecznych widzimy wiązkę pęczków zbudowaną z cienkich włókien, a na przekrojach strzałkowych i czołowych podłużne struktury tubularne. Sygnał nerwów w obrazach T1- i T2-zależnych jest zbliżony do sygnału mięśni, a w obrazach T2 FS i T2 3D nieco wyższy. Odcinkowe lub rozlane pogrubienie nerwu, podwyższenie sygnału T2, zaburzenie architektury pęczków, pogrubienie perineurium lub endoneurium, wzmocnienie kontrastowe oraz zmiany w otaczającej nerw tkance tłuszczowej to symptomy zmian patologicznych w przebiegu neuropatii (ryc. 5.3). Nie wszystkie objawy muszą wystąpić równocześnie. Mogą one dotyczyć jednego, kilku lub wielu korzeni nerwów i/lub nerwów rdzeniowych.

Rycina 5.3.

Neuropatia lewego nerwu kulszowego. A. Obrazy T1-zależne w projekcji poprzecznej. B. Obrazy T2-zależne w projekcji poprzecznej. C. Rekonstrukcja VR. Pogrubienie lewego nerwu kulszowego z zaburzeniem architektury pęczków i podwyższeniem sygnału T2 (zakreślony kolorem czerwonym), dla porównania prawidłowy obraz prawego nerwu kulszowego (otoczony kolo-rem czarnym).

Ważnym elementem oceny w neuropatiach są również mięśnie unerwiane przez odpowiednie nerwy. W ostrej fazie odnerwienia dochodzi do obrzęku mięśni dobrze widocznego w rezonansie w postaci podwyższenia sygnału w obrazach T2-zależnych z saturacją tkanki tłuszczowej. W fazie przewlekłej mięsień ulega atrofii, co przejawia się zanikiem włókien i przerostem tkanki tłuszczowej obserwowanym w obrazach T1-zależnych bez saturacji. Zakres zmian w mięśniach wskazuje kierunek poszukiwań uszkodzenia w nerwach, które mają komponentę ruchową. Dużym wyzwaniem technicznym jest obrazowanie czuciowych nerwów obwodowych małego kalibru (średnica 1 mm), dodatkowo utrudnione przez brak objawów ze strony mięśni.

Tabela 5.1.

Kryteria oceny neurografii MR w neuropatiach

Nerw

Obraz prawidłowy

Obraz w neuropatii

Przebieg

anatomiczny, bez odchyleń

może być prawidłowy lub zaburzony

Rozmiar

adekwatny do przylegającej tętnicy

stopniowa redukcja średnicy obwodowo

nerw grubszy niż przylegająca tętnica

ogniskowe lub rozlane pogrubienie

Sygnał

w obrazach T1- i T2-zależnych zbliżony do sygnału mięśni, nieco wyższy w obrazach T2 FS

hiperintensywny w obrazach T2 i T2 FS, hipointensywny w obrazach T1

Struktura

wiązka pęczków otoczonych cienką warstwą epineurium i perineurium

zaburzona architektura pęczków z zatarciem prawidłowej struktury, pogrubieniem pojedynczych pęczków lub całej wiązki

pogrubienie epineurum, perineurum

Wzmocnienie kontrastowe

bez wzmocnienia kontrastowego

różnego stopnia ogniskowe lub rozlane wzmocnienie kontrastowe jednego lub wielu korzeni lub nerwów rdzeniowych

Tkanki wokół nerwu

bez zmian sygnału, bez nacieku

prawidłowe lub z drobnymi pasmami nacieku hiperintensywnymi w obrazach T2-zależnych

Mięśnie

jednorodny sygnał

zachowana struktura

w obrazach T2 FS podwyższony sygnał w fazie ostrej (obrzęk)

w obrazach T1 atrofia mięśnia i przerost tkanki tłuszczowej w fazie przewlekłej

Jak wspomniano powyżej, rozpoznanie neuropatii, zwłaszcza w przypadku objawów symetrycznych, zostaje postawione na podstawie objawów klinicznych i badań elektrodiagnostycznych. Obrazowanie stosowane jest w przypadkach niejasnego obrazu klinicznego, dominujących objawów jednostronnych lub ograniczonych do jednego nerwu, gwałtownie narastających objawów klinicznych, a także w celu ewaluacji strukturalnej stanu nerwów i mięśni w trakcie przebiegu i leczenia neuropatii. Potwierdzenie zmian w badaniach obrazowych nerwów pozwala też na wybór miejsca biopsji.

Rolą badań obrazowych jest też wykluczenie innych zmian mogących powodować podobne objawy kliniczne, np. guzów czy patologii spoza układu nerwowego, takich jak: dodatkowe mięśnie, żylaki, krwiaki, gangliony, ostrogi kostne czy pogrubiałe powięzie, mogące byś przyczyną zespołów uwięźnięcia.

Należy pamiętać, że obraz wielu neuropatii w badaniu rezonansu magnetycznego może być morfologicznie podobny (np. rozlane pogrubienie nerwów w chorobie Charcot-Marie-Tooth i neuropatii amyloidowej) i dopiero ocena EMG/NCS może pomóc w postawieniu właściwej diagnozy.

W większości neuropatii w fazie ostrej i fazie podostrej nerw wykazuje podwyższony sygnał w obrazach T2 FS z wydatnym wzorem pęczków, co odpowiada gromadzeniu się i wnikaniu płynu pomiędzy pęczki. Dochodzi do różnego stopnia rozlanego bądź ogniskowego pogrubienia nerwu, podobnego jak w zespołach uwięźnięcia. W przeciwieństwie do neuropatii w zespołach uwięzienia, poza uwidocznieniem przyczyny ucisku, zmiany w nerwie zajmują odcinek proksymalny do poziomu przeszkody i występują jednostronnie.

Przerwanie barier krew-nerw prowadzi do wzmocnienia nerwu po podaniu paramagnetycznego środka kontrastowego.

W fazie przewlekłej, w wyniku zmian zwyrodnieniowych aksonów, dochodzi do atrofii pęczków, a wewnątrz epineurium gromadzi się tłuszcz, co jest widoczne w postaci wysokiego sygnału w obrazach T1-zależnych. Mimo atrofii pęczków nerw może być prawidłowej grubości lub nawet pogrubiały wskutek przerostu tkanki tłuszczowej. Podobny obraz atrofii pęczków z następową proliferacją tkanki tłuszczowej może wystąpić u pacjentów z przewlekłym urazem, z HIV czy długo leczonych steroidami. Należy pamiętać, że przerost tłuszczowy nerwów nie ma bezpośredniego wpływu na przewodnictwo nerwowe, ponieważ nie jest związany z demielinizacją czy zwyrodnieniem aksonów. Sygnał w obrazach T2-zależnych w przewlekłej fazie neuropatii jest na ogół prawidłowy.

W każdym przypadku zmiany w badaniach obrazowych muszą być rozpatrywane w korelacji z badaniami klinicznymi, elektrodiagnostycznymi i, jeśli to możliwe, z wynikami biopsji nerwu lub mięśnia.

Tabela 5.2.

Zmiany w neurografii MR w przebiegu wybranych neuropatii

Rodzaj neuropatii

Lokalizacja

MR

Zespół Guillaina-Barrégo, GBS

korzenie nerwów rdzeniowych (zwłaszcza przednie)

stożek rdzenia i nici ogona końskiego

nerw VII

konieczne podanie środka kontrastowego!!! - obraz bez kontrastu może być prawidłowy

pogrubienie i wzmocnienie kontrastowe powierzchni stożka rdzenia i nici ogona końskiego,

wzmocnienie kontrastowe nerwu VII

Różnicowanie:

CIDP, AIDS, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, przerzuty do opon mózgowo-rdzeniowych, neurosarkoidoza, chłoniak, neuroborelioza

Przewlekła zapalna polineuropatia demielinizacyjna, CIDP

korzenie nerwów rdzeniowych

splot ramienny i lędźwiowo-krzyżowy

nerwy obwodowe

nerwy czaszkowe

w ostrej fazie wzrost sygnału T2 i wzmocnienie kontrastowe

w fazie przewlekłej zanik tłuszczowy, pogrubienie nerwów, cechy odnerwienia mięśni

Różnicowanie:

GBS (w fazie ostrej obraz podobny, po 6-8 tygodniach poprawa)

Wieloogniskowa neuropatia ruchowa

zwykle kończyna górna (asymetryczne zajęcie jednego lub kilku mięśni)

łagodne pogrubienie nerwów

podwyższony sygnał T2

Neuropatie Charcot-Marie-Tooth

zwykle kończyna dolna

rzadko nerwy czaszkowe

w CMT1A znaczne pogrubienie nerwów wskutek cyklów de- i remielinizacji i rozrostu mieliny (tzw. onion bulb sign), bez proliferacji tkanki tłuszczowej w CMT2 minimalne pogrubienie nerwów, w obu typach podwyższenie sygnału, wyraźne zaniki mięśni kończyn dolnych

Polineuropatia cukrzycowa

kończyna dolna

w fazie ostrej i podostrej podwyższony sygnał T2 i pogrubienie nerwów

w fazie przewlekłej atrofia tłuszczowa

cechy odnerwienia mięśni

Neuropatie w przebiegu amyloidozy i paraproteinemii

nerwy obwodowe (zmiany wieloogniskowe)

podwyższony sygnał T2 i obniżony sygnał T1

różnego stopnia wzmocnienie kontrastowe - zachowanie architektury pęczkowej z wrzecionowatym pogrubieniem

odnerwienie mięśni

Neuropatie autonomiczne i cienkich włókien

rdzeń kręgowy

w fazie ostrej obraz prawidłowy

w fazie przewlekłej wysoki sygnał T2 sznurów tylnych rdzenia (głównie pęczka smukłego) w rdzeniu szyjnym i piersiowym

Obrazowanie tensora dyfuzji (diffusion tensor imaging, DTI) jest zaawansowaną techniką rezonansu magnetycznego, która umożliwia obrazowanie i ocenę integralności włókien nerwowych z wykorzystaniem zjawiska dyfuzji cząsteczek wody. W warunkach fizjologicznych izotropowa dyfuzja cząsteczek wody (taka sama w każdym kierunku) jest charakterystyczna dla istoty szarej i płynu mózgowo-rdzeniowego, natomiast w istocie białej dyfuzja ma charakter anizotropowy (inny w każdym kierunku) w wyniku barier spowodowanych różną orientacją włókien nerwowych. Miarą dyfuzji jest frakcjonowana anizotropia (FA), która przyjmuje wartości pomiędzy 0 a 1, gdzie 0 oznacza dyfuzję całkowicie izotropową, a 1 - całkowicie anizotropową. Wartości zbliżone do 1 świadczą o uporządkowanym, zwartym przebiegu włókien, wartości zbliżone do 0 przemawiają za dezintegracją, uszkodzeniem pęczków nerwowych.

Prowadzone są obecnie badania nad wykorzystaniem DTI w ocenie neuropatii. Przyjmuje się, że prawidłowe nerwy charakteryzują się wartościami FA > 0,4-0,5, natomiast wartości FA < 0,4-0,5 sugerują zmiany patologiczne.

Na podstawie map FA możliwa jest rekonstrukcja i wizualizacja przebiegu dróg istoty białej mózgu oraz nerwów obwodowych (traktografia) pomagająca neurochirurgom w planowaniu zabiegów operacyjnych np. w zespole cieśni nadgarstka czy guzów nerwów obwodowych.

Ultrasonografia wysokiej rozdzielczości - HRUS

Obrazowanie nerwów obwodowych wymaga aparatów USG o wysokiej rozdzielczości i użycia sondy liniowej najlepiej o częstotliwości 14 Hz. Badanie rozpoczynamy od lokalizacji nerwów w miejscach typowych (np. dół podkolanowy) i podążamy proksymalnie i dystalnie wzdłuż ich przebiegu. W badaniu HRUS nerwy obwodowe mają charakterystyczny przekrój przypominający plaster miodu, który odzwierciedla histologiczną budowę pęczkową włókien nerwowych. Prawidłowy nerw ma nieco wyższą echogeniczność w porównaniu z przylegającymi mięśniami i nieco niższą od ścięgien. W odcinkach patologicznie zmienionych echogeniczność nerwu ulega obniżeniu, a jego typowa struktura plastra miodu ulega zatarciu. Możliwe jest ogniskowe pogrubienie mięśnia oraz zmiany obrzękowe w otaczających tkankach, zwłaszcza w fazie ostrej neuropatii. W okresie przewlekłym echogeniczność nerwu wzrasta, co jest związane z infiltracją przez tkankę tłuszczową.

Diagnostyka obrazowa chorób neuronu ruchowego

Stwardnienie boczne zanikowe (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)

Strukturalne badanie MR mózgowia w stwardnieniu bocznym zanikowym ma na celu przede wszystkim wykluczenie innych chorób neurologicznych.

Pierwszym przejawem ALS w badaniu MR mózgowia może być podwyższony sygnał T2 na przebiegu dróg piramidowych. Początkowo objaw ten widoczny jest w torebkach wewnętrznych, a w okresie zaawansowania choroby cała droga korowo-rdzeniowa, począwszy od pola ruchowego aż do rdzenia kręgowego, cechuje się podwyższonym sygnałem w obrazach T2-zależnych i w sekwencji FLAIR oraz zmniejszeniem objętości. Depozyty żelaza w korze zakrętu przedśrodkowego, określane jako motor band sign, powodują utratę sygnału w sekwencjach echa gradientowego (gradient echo, GRE) i w sekwencji zależnej od podatności (susceptibility weighted imaging, SWI).

Swoistość objawu podwyższonego sygnału T2 w drogach korowo-rdzeniowych wynosi < 70%, czułość < 40%, podczas gdy motor band sign w SWI jest widoczny u 78% pacjentów z ALS. Co ważne, obie powyższe cechy, w różnym stopniu, mogą również występować u osób zdrowych.

Obecnie zaawansowane techniki neuroobrazowania zaczynają odgrywać coraz większą rolę w ocenie uszkodzeń górnego neuronu ruchowego u pacjentów z ALS - poprzez wgląd w mikrostrukturę, biochemię i metabolizm ośrodkowego układu nerwowego. Są to: morfometria objętościowa (volume-based morphometry, VBM), obrazowanie metodą transferu magnetyzacji (magnetic transfer imaging, MTI), ilościowe mapowanie podatności (quantitative susceptibility mapping, QSM), funkcjonalne obrazowanie rezonansu magnetycznego (functional magnetic resonance imaging, fMRI), spektroskopia rezonansu magnetycznego (magnetic resonance spectroscopy, MRS) i tomografia emisyjna pojedynczego fotonu (single-photon emission computed tomography, SPECT). Do tej pory metody te wykorzystywane są tylko w badaniach naukowych.

Obiecującym narzędziem w diagnostyce ALS wydaje się również obrazowanie tensora dyfuzji (diffusion tensor imaging, DTI), wykorzystywane dla oceny integralności dróg istoty białej w warunkach fizjologicznych oraz w wielu procesach patologicznych istoty białej. Pierwsze doniesienie na temat zastosowania DTI w ocenie uszkodzenia dróg korowo-rdzeniowych i korowo-opuszkowych zostało opublikowane już w roku 1999. Od tamtego czasu wielu badaczy próbowało wykorzystać DTI w diagnostyce zajęcia górnego neuronu ruchowego. Wyniki badań są bardzo niespójne. Niektórzy badacze wykazali rozległą degenerację dróg istoty białej całego mózgu, podczas gdy inni skupili się tylko na układzie korowo-rdzeniowym. Część autorów koncentrowala się głównie na parametrze FA, inni analizowali także pozostałe parametry DTI takie jak TRACE, MD. Również metodologia badań była bardzo zróżnicowana, począwszy od różnic skanera MR, natężenia pola, zmian parametrów sekwencji DTI aż do różnych metod analizy danych (VBA, TBSS), co prowadziło do rozbieżności w wynikach.

Pomimo wielu publikacji dotyczących różnic statystycznych parametrów DTI między pacjentami z ALS a osobami zdrowymi obrazowanie tensora dyfuzji wciąż nie znalazło zastosowania w codziennej praktyce klinicznej - ze względu na wysokie wymagania sprzętowe tej techniki, zaawansowane narzędzia analizy, zaangażowanie interdyscyplinarnego zespołu i długi czas opracowania badania.

Rdzeniowy zanik mięśni (spinal muscular atrophy, SMA)

Rezonans magnetyczny jest metodą z wyboru w ocenie rdzenia kręgowego u pacjentów z SMA. Zmiany mogą wystąpić w rogach przednich odcinka szyjnego, w mniejszym stopniu piersiowo-lędźwiowego, w postaci podwyższonego sygnału w obrazach T2-zależnych, co odpowiada histopatologicznie utracie neuronów ruchowych w tych obszarach. Obraz ten, nazywany często objawem oczu żmii czy oczu sowy (snake-eyes sign, owl-eyes sign), jest niespecyficzny i znacznie częściej pojawia się w innych patologiach rdzenia, takich jak: udar rdzenia, przewlekła mielopatia czy ALS.

Podstawową cechą zmian w mięśniach jest ich zanik, począwszy od łagodnego, widocznego w postaci infiltracji tkanki tłuszczowej pomiędzy pęczki nerwowe, poprzez stadium pośrednie, aż do postaci ciężkich, z przebudową tłuszczową niemal całego mięśnia.

W ocenie mięśni zastosowanie znajduje zarówno technika rezonansu magnetycznego, jak i ultrasonografia.

Piśmiennictwo

1. Agarwal A., Chandra A., Jaipal U., Bagarhatta M., Mendiratta K., Goyal A., Kumar R. i Mangalhara N.: Can imaging be the new yardstick for diagnosing peripheral neuropathy? - a comparison between high resolution ultrasound and MR neurography with an approach to diagnosis. Insights Imaging. 2019; 10(1): 104.

2. Thakkar R.S., Del Grande F., Thawait G.K., Andreisek G., Carrino J.A. i Chhabra A.: Spectrum of high-resolution MRI findings in diabetic neuropathy. Am J Roentgenol. 2012; 199(2): 407-412.

3. McKenzie G.A., Broski S.M., Howe B.M., Spinner R.J., Amrami K.K., Dispenzieri A. i Ringler M.D.: MRI of pathology-proven peripheral nerve amyloidosis. Skeletal Radiol. 2017; 46(1): 65-73.

4. Fukada Y., Wakutani Y., Kurihara S., Yasui K., Takeshima T. i Nakashima K.: Reversible MRI findings of posterior column of the spinal cord in a patient with acute autonomic and sensory neuropathy [oryg. w jęz. japońskim]. Rinsho Shinkeigaku. 2004; 44(2): 102-104.

5. Wu R.H. i Bruening R.: Comparison of diffusion-weighted MR imaging and T2-weighted MR imaging in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neuroradiol J. 2007; 19(6): 705-710.

6. Roeben B., Wilke C., Bender B., Ziemann U. i Synofzik M.: The motor band sign in ALS: Presentations and frequencies in a consecutive series of ALS patients. J Neurol Sci. 2019; 406: 116440.

7. Müller H.P., Turner M.R., Grosskreutz J., Abrahams S., Bede P., Govind V., Prudlo J., Ludolph A.C., Filippi M. i Kassubek J.; Neuroimaging Society in ALS (NiSALS) DTI Study Group: A large-scale multicentre cerebral diffusion tensor imaging study in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016; 87(6): 570-579.

8. Kolb S.J., Kissel J.T.: Spinal Muscular Atrophy. Neurol Clin. 2015; 33(4): 831-846.