Przypisy

[1] Istnieje także pojęcie agonistów i antagonistów allosterycznych. Są to związki, które oddziałując z allosterycznym miejscem wiązania, same z siebie, niezależnie od naturalnego neuroprzekaźnika, pobudzają lub hamują receptor.

[2] Często stosuje się termin "kompleks ligand-receptor", chociaż nie zawsze kompleksy te dotyczą receptorów, lecz np. enzymów i transporterów białkowych.

[3] Grupy OH mogą pełnić rolę zarówno donorów (poprzez atom wodoru), jak i akceptorów wiązań wodorowych (poprzez atom tlenu). Aminowe grupy NH i NH2 mogą pełnić zarówno rolę donorów (poprzez atom wodoru), jak i akceptorów wiązań wodorowych, a także ulegać protonowaniu na wolnej parze elektronowej azotu (grupy pozytywnie jonizowalne).

[4] Neuroprzekaźniki, a w szczególności ich prekursory, podlegają głównie transportowi czynnemu.

[5] Należy zwrócić uwagę na precyzję w nazewnictwie: od słowa "glutaminian" pochodzi przymiotnik "glutaminianergiczny", a nie "glutaminergiczny", który sugerowałby pochodzenie od glutaminy, innego aminokwasu, amidowej pochodnej kwasu glutaminowego. Ze względu na angielskie brzmienie słowa "glutaminian" (glutamate) niekiedy spotyka się niepoprawne w języku polskim terminy "glutamat" lub "receptor glutamatergiczny", stanowiące kalkę z języka angielskiego.

[6] Niektóre dane wskazują, że synapsy GABA-ergiczne stanowią nawet 30% synaps w OUN. Glutaminian i GABA są najbardziej rozpowszechnionymi neuroprzekaźnikami w OUN.

[7] Dawniej stosowano terminy "receptor benzodiazepinowy"/"receptor BZ", "kompleks receptorowy GABA/BZ" lub "receptor GABA sprzężony z receptorem BZ". Ze względu na to, że miejsce działania benzodiazepin nie stanowi odrębnego tworu białkowego, kodowanego osobnym genem, a na mitochondriach istnieją tzw. obwodowe receptory benzodiazepinowe (PBR - periferal benzodiazepine receptors), niezwiązane z receptorami GABA-A, IUPHAR zalecił w 1999 roku, aby terminy "receptor BZ", "receptor GABA/BZ" i "receptor omega" nie były już stosowane, a termin "receptor benzodiazepinowy" zastąpiono terminem "miejsce benzodiazepinowe".

[8] Innym znanym związkiem stosowanym jako DRD jest pochodna benzodiazepiny - flunitrazepam. Niezależnie od określenia "pigułka/tabletka" obie substancje mogą być dosypywane do drinków w postaci proszku lub dolewane w postaci płynnej. GHB ma pod tym względem szczególnie "korzystne" właściwości, gdyż jest bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie, pozbawiony smaku i zapachu oraz występuje naturalnie w organizmie, wobec czego jest trudno wykrywalny w płynach ustrojowych i tkankach.

[9] Cholina jest uwalniana z fosfatydylocholiny, produkowanej z fosfatydyloetanolaminy przez trzykrotne N-metylowanie przy udziale S-adenozylometioniny. Fosfatydyloetanolamina powstaje w efekcie dekarboksylacji fosfatydyloseryny. Procesy te zachodzą powszechnie w ramach metabolizmu fosfolipidów.

Autorzy

Dr hab. Marek Bajda prof. UJ

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Fizykochemicznej Analizy Leku,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr Hanna Byrtus

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr hab. Grażyna Chłoń-Rzepa

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr hab. Krzysztof Kamiński prof. UJ

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Prof. dr hab. Marcin Kołaczkowski

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr hab. Katarzyna Kulig prof. UJ

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Fizykochemicznej Analizy Leku,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Prof. dr hab. Barbara Malawska

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Fizykochemicznej Analizy Leku,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Prof. dr hab. Jolanta Obniska

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Prof. dr hab. Maciej Pawłowski

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr hab. Anna Więckowska

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Fizykochemicznej Analizy Leku,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Prof. dr hab. Paweł Zajdel

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr hab. Agnieszka Zagórska

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Dr Paweł Żmudzki

Katedra Chemii Farmaceutycznej,

Zakład Chemii Leków,

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

Przedmowa

Medicinal chemistry concerns the discovery, the development, the identification and the interpretation of the mode of action of biologically active compounds at the molecular level.

"Chemia leków zajmuje się odkrywaniem nowych substancji biologicznie aktywnych, badaniami nad ich rozwojem oraz identyfikacją i wyjaśnieniem ich mechanizmu działania biologicznego na poziomie komórkowym".

"Raport techniczny" IUPAC, 1974

W ciągu dwunastu lat, które upłynęły od ukazania się ostatniego wydania podręcznika "Chemia leków" pod redakcją naukową A. Zejca i M. Gorczycy (Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008), wprowadzono do terapii wiele leków nowych generacji i dla większości z nich opisano molekularne mechanizmy działania na poziomie receptorowym, subreceptorowym i enzymatycznym. Ogromny postęp w wielu dziedzinach związanych bezpośrednio z chemią leków, będący rezultatem zintegrowanych badań, m.in. z zakresu chemii ogólnej, biochemii, farmakologii, elektrofizjologii, biologii molekularnej czy farmakokinetyki, wymagał odniesienia do badań nad nowymi lekami. Dotyczy to również praktycznego wykorzystania nowych metod otrzymywania leków na drodze biotechnologii i biotransformacji, w tym z udziałem metod inżynierii genetycznej.

Przywołane powyżej fakty stały się przesłanką do podjęcia, na wniosek PZWL Wydawnictwa Lekarskiego, decyzji o napisaniu nowego podręcznika chemii leków. Opracowanie kolejnego, czwartego już wydania "Chemii leków" wydawało się nieracjonalne ze względu na zakres koniecznych uzupełnień i korekt w treści ostatniego wydania książki, uwzględniających osiągnięcia wielu dziedzin nauki rzutujące na postęp w badaniach nad lekiem. Dotyczy to szczególnie grup leków o nowych, nieznanych wcześniej strukturach, właściwościach lub mechanizmach działania.

Ze względu na to, że chemia leków jest także przedmiotem realizowanym w ramach studiów farmaceutycznych, Autorzy rozdziałów starali się opisać budowę chemiczną poszczególnych preparatów leczniczych, zwracając szczególną uwagę na jej elementy determinujące szeroko rozumiane właściwości lecznicze, w tym głównie właściwości fizykochemiczne, warunkujące wchłanianie, dostępność biologiczną i przenikanie do tkanek docelowych, a także działania niepożądane, będące składową oceny wartości terapeutycznej i zastosowania leków.

W książce w dość szerokim zakresie przedstawiono metody projektowania i otrzymywania leków, głównie reprezentatywnych przedstawicieli poszczególnych kategorii terapeutycznych. Omówienie chemicznych aspektów oddziaływania leków na organizm uwzględnia istniejące współzależności między strukturą a działaniem oraz przemianami w warunkach in vitro oraz in vivo.

Zaletą nowego wydania "Chemii leków" jest oryginalny sposób ujęcia treści, zrywający z encyklopedyczną formą, która może być dla Czytelnika mało atrakcyjna, zwłaszcza przy przekazywaniu nowych elementów wiedzy. Poszczególne grupy leków zostały omówione w sposób problemowy, a celowo wybrane przykłady preparatów leczniczych mają stanowić ilustrację przedstawionych zagadnień związanych z ich zastosowaniem.

W rozdziale zawierającym wiadomości ogólne dość obszernie omówiono procesy chemiczne leżące u podstaw oddziaływania leków z endogennymi układami organizmu, także na poziomie molekularnym. W większości rozdziałów szczegółowych, mechanizmy działania leków zostały przedstawione na konkretnych przykładach. Zagadnienia związane z oceną jakościową i ilościową substancji leczniczych są tematem rozdziału dotyczącego analitycznej kontroli jakości leków.

Materiał zawarty w podręczniku usystematyzowano według układu farmakologiczno-chemicznego, co jest zgodne z powszechnie przyjętym sposobem klasyfikacji stosowanym zarówno w podręcznikach krajowych, jak i obcojęzycznych. Każdy z rozdziałów zawiera zwięzłą charakterystykę farmakologiczno-chemiczną określonej grupy leków, usystematyzowanych według budowy chemicznej. Taki układ daje możliwość śledzenia wpływu określonych elementów strukturalnych, różniących poszczególne preparaty lecznicze, na ich właściwości fizykochemiczne, farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, rzutujące na cechy farmakologiczne i wartość terapeutyczną. Tylko w kilku rozdziałach sklasyfikowano omawiane leki według innych kryteriów, np. mechanizmów działania. W osobnym rozdziale przedstawiono preparaty wykorzystywane w radiofarmacji i diagnostyce obrazowej.

Jest wiele możliwych sposobów ujmowania nazewnictwa leków - w niniejszej publikacji przyjęto zasadę kolejnego zamieszczania: nazwy polskiej, nawiązującej do oryginalnej nazwy według WHO, niezastrzeżonej nazwy międzynarodowej (INN) oraz nazwy chemicznej według IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry, Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej). Kierując się względami dydaktycznymi, w każdym rozdziale szczegółowym zastosowano nazwy opisowe, uwzględniające podstawowe fragmenty struktury oraz istotne dla właściwości związków grupy funkcyjne. Dotyczy to zwłaszcza struktury leków o skomplikowanej, złożonej budowie chemicznej. Strukturę większości związków omówionych w podręczniku zilustrowano w formie tradycyjnych wzorów rzutowych. Wzory konformacyjne zastosowano jedynie w przypadkach wymagających tego rodzaju ilustracji w celu pokazania zależności związanych z budową przestrzenną, bezpośrednio rzutujących na istotne cechy poszczególnych preparatów. Ułatwia to zrozumienie sposobu oddziaływania leków z odpowiednimi strukturami w organizmie.

Sporo uwagi poświęcono przemianom chemicznym, jakim leki ulegają w organizmie. Dotyczy to przede wszystkim preparatów o charakterze proleków, metabolitów farmakologicznie aktywnych oraz produktów biotransformacji, które wywołują działania niepożądane.

Oddając do rąk Czytelników nowe wydanie podręcznika "Chemia leków", mamy nadzieję, że obecna edycja będzie dobrze służyć zarówno studentom farmacji, jak i studentom kierunków chemiczno-biologicznych, m.in. chemii, biotechnologii i medycyny, pragnącym pogłębić wiedzę o właściwościach związków biologicznie aktywnych, a magistrom i technikom farmacji pomoże w ich codziennej pracy oraz w rozwoju kompetencji w ramach kształcenia ciągłego i uzyskiwania specjalizacji. Równocześnie zdajemy sobie sprawę z możliwych braków i niedociągnięć, jakie mogły się pojawić podczas opracowywania tak obszernego materiału. Będziemy wdzięczni Czytelnikom za wszelkie uwagi krytyczne i wskazówki, które uwzględnimy przy redagowaniu kolejnego wydania podręcznika.

Maciej Pawłowski

1Wiadomości ogólnePaweł Zajdel, Katarzyna Kulig

1.1.Rys historyczny rozwoju chemii leków

Obszarem zainteresowania chemii leków są związki biologicznie aktywne, czyli substancje chemiczne o właściwościach leczniczych, które niezależnie od pochodzenia (naturalnego, syntetycznego) są podawane w określonej postaci farmaceutycznej, najczęściej, aby osiągnąć pożądany efekt terapeutyczny. Leki nie powinny być stosowane w celu zapobiegania chorobom. Zastosowanie leków powinno być poprzedzone określeniem czynników ryzyka rozwoju danego schorzenia, które skutecznie zapobiegnie stosowaniu leków u ludzi zdrowych. "Profilaktyczne" stosowanie leków, ze względu na częste występowanie efektów niepożądanych, może przynieść zgubne skutki i wpłynąć na pogorszenie stanu zdrowia zamiast przyczynić się do jego poprawy.

Europejska Federacja Chemii Medycznej (EFMC - European Federation for Medicinal Chemistry) oraz Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne (ACS - American Chemical Society) zgodnie określają w skrócie domenę chemii leków jako "projektowanie i syntezę związków biologicznie aktywnych w celu rozwiązywania aktualnych problemów medycznych". Chemia leków zajmuje się ustalaniem struktury związków biologicznie aktywnych - potencjalnych leków, określaniem ich właściwości fizykochemicznych, optymalizacją sposobów ich otrzymywania, jakościową i ilościową oceną chemiczną, poznaniem i interpretacją mechanizmów ich działania oraz określaniem przemian, jakim leki podlegają w organizmie oraz poza nim.

Chemia leków ma charakter interdyscyplinarny, integrując wiedzę zarówno z zakresu podstawowych nauk chemicznych (chemia ogólna, chemia nieorganiczna, chemia organiczna, chemia analityczna, biochemia, chemia kwantowa), jak i nauk biologicznych (biologia molekularna, mikrobiologia, farmakokinetyka, farmakodynamika, toksykologia). Wiedza z dziedziny medycyny translacyjnej wnosi znaczący wkład w postęp nauk farmaceutycznych, a w praktycznym ujęciu dostarcza rozwiązań pozwalających na podniesienie jakości farmakoterapii i rozwiązywanie problemów zdrowia publicznego. Odkrywanie i opracowywanie nowych leków jest realizowane przez udoskonalanie dotychczas stosowanych substancji bądź wprowadzanie substancji oddziałujących na znane lub nowe cele biologiczne i zwalczających choroby, wobec których medycyna była dotąd bezradna.

Aktualne kierunki rozwoju chemii leków są wynikiem ciągłego (ewolucyjnego) rozszerzania się na przestrzeni wieków zainteresowań badaczy, uwarunkowanego stanem wiedzy i poziomem technologii.

Pierwsze doniesienia na temat zastosowania fragmentów roślin, narządów zwierzęcych czy minerałów pochodzą z czasów starożytnych. Zastosowanie otaczających człowieka substancji jako leków wynikało z doświadczeń poprzednich pokoleń oraz obserwacji efektów, jakie produkty pochodzenia naturalnego wywoływały u zwierząt. Przetwarzanie produktów pochodzenia naturalnego rozpoczęło się w II wieku n.e., kiedy to Galen, rzymski lekarz i farmaceuta, opisał sposoby sporządzania niektórych postaci leków: odwarów, nalewek, maści i proszków. Galen zapoczątkował rozwój tzw. farmacji galenowej, która funkcjonuje po dziś dzień. Postrzeganie substancji leczniczej zmienił dopiero twórca jatrochemii - Paracelsus (1493-1541). Jako pierwszy wprowadził on do leczenia rtęć, siarkę i sól kuchenną - substancje wykazujące silne działanie farmakologiczne. Paracelsus wysunął hipotezę, że rośliny zawdzięczają swoje właściwości lecznicze zawartym w nich związkom chemicznym. W konsekwencji uwaga badaczy została przekierowana z identyfikacji leków, rozumianych jako zbiór ziół, na odkrywanie składników aktywnych odpowiedzialnych za właściwości farmakologiczne.

Wyodrębnienie morfiny z opium przez niemieckiego aptekarza Serturnera w 1806 roku było pierwszym zakończonym sukcesem przykładem wyizolowania jednorodnego związku chemicznego z surowca roślinnego. Przyjmuje się, że od tego przełomowego odkrycia zaczął się dynamiczny rozwój chemii leków. Było to również znaczące wydarzenie dla przemysłu farmaceutycznego, który oparł swój dalszy rozwój na substancjach leczniczych o udokumentowanej tożsamości i czystości.

W XIX wieku równolegle z rozwojem metod izolowania substancji czynnych z surowca roślinnego nastąpił duży postęp w zakresie opracowywania metod syntezy związków organicznych. Zostały wówczas wprowadzone do lecznictwa substancje o działaniu przeciwbólowym. Nie bez znaczenia była sytuacja w Europie w tym okresie - liczne konflikty wojenne i konieczność zwalczania bólu pourazowego uzasadniały rozwój badań nad możliwościami jego skutecznego uśmierzania. Warto wspomnieć, że kwas acetylosalicylowy (aspiryna) został wprowadzony jako lek o działaniu przeciwbólowym i przeciwgorączkowym w 1899 roku.

Na przełomie XIX i XX wieku niemiecki chemik Paul Ehrlich wskazał na możliwość leczenia zakażeń wywołanych przez drobnoustroje chorobotwórcze za pomocą substancji chemicznych. Opracowana przez Ehrlicha zasada chemioterapii, oparta na koncepcie tzw. magicznego strzału (magic bullet) zakładała, że substancja chemiczna powinna zapobiegać rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów w stężeniu tolerowanym przez makroorganizm. Owocem prac Ehrlicha było wprowadzenie salwarsanu do leczenia kiły. Były to odkrycia przełomowe dla rozwoju chemioterapii przeciwinfekcyjnej. Rezultatem prac niezależnie prowadzonych przez Domagka było wprowadzenie do lecznictwa sulfonamidów - pierwszych leków o działaniu bakteriostatycznym (syntetycznych substancji hamujących rozmnażanie bakterii chorobotwórczych). Jeszcze większe znaczenie miało odkrycie penicyliny przez Aleksandra Fleminga w 1929 roku i wyjaśnienie mechanizmu jej działania przez Floreya i Chaina w 1941 roku. Zidentyfikowanie substancji, której aktywność przeciwbakteryjna była większa, a toksyczność mniejsza niż w przypadku sulfonamidów, przyczyniło się do dynamicznego rozwoju antybiotykoterapii - druga połowa XX wieku została określona mianem złotej ery badań nad antybiotykami. Wśród nich najbardziej znaczącą rolę odegrały antybiotyki ?-laktamowe, których pierwowzorem była odkryta przez Fleminga penicylina. Dzisiaj dysponujemy penicylinami półsyntetycznymi (stosowanymi od 1962 roku) i cefalosporynami (stosowanymi od 1974 roku).

Obserwacje naukowców wskazujące na możliwość modyfikacji aktywności farmakologicznej w wyniku "manipulowania" elementami strukturalnymi cząsteczki pozwoliły na określenie, które z tych elementów są kluczowe dla zachowania aktywności biologicznej. Analiza zależności między strukturą a aktywnością biologiczną (farmakologiczną) stała się podstawą racjonalnego projektowania leków, pozwalającego na zminimalizowanie niekorzystnych działań niepożądanych i optymalizację efektów terapeutycznych.

W latach 50. i 60. XX wieku zintensyfikowano prace nad rozwojem leków wpływających na psychikę ludzką (leki psychotropowe). Przełomem w leczeniu psychozy było wprowadzenie w 1952 roku chlorpromazyny. W kolejnych latach pojawiło się wiele neuroleptyków z grupy fenotiazyn i pochodne butyrofenonu. Ustalenie roli niedoboru neurotransmiterów monoaminergicznych w patogenezie depresji doprowadziło do opracowania trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych (m.in. imipraminy) i nieco później inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny (m.in. fluoksetyny).

Na szczególne wyróżnienie zasługują osiągnięcia Leona Sternbacha, absolwenta Oddziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Jagiellońskiego, zatrudnionego w firmie Hoffmann-La Roche. Jego największym odkryciem było opracowanie chlordiazepoksydu (Elenium), pochodnej o strukturze benzo-1,4-diazepiny. Lek ten stał się pierwowzorem dla licznej grupy pochodnych benzodiazepinowych o działaniu przeciwlękowym, przeciwpadaczkowym i nasennym, które znalazły zastosowanie w leczeniu padaczki oraz zaburzeń nastroju i snu.

Znaczący postęp w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego dokonał się dzięki wprowadzeniu na przełomie lat 70. i 80. ubiegłego wieku leków blokujących receptory ?-adrenergiczne, nazywanych ?-adrenolitykami lub ?-blokerami. Wprowadzony w 1964 roku propranolol, pierwszy lek tej grupy, jest do dziś stosowany w leczeniu nadciśnienia tętniczego, zaburzeń rytmu serca i choroby niedokrwiennej serca. Kolejne lata przyniosły dalszy postęp w leczeniu chorób serca i naczyń dzięki opracowaniu: grupy inhibitorów konwertazy angiotensyny (kaptopryl, enalapryl), antagonistów receptora angiotensynowego, czyli tzw. sartanów (np. losartan), inhibitorów reduktazy hydroksymetylo-glutarylo-koenzymu A, czyli tzw. statyn (np. lowastatyna, atorwastatyna), o działaniu przeciwmiażdżycowym, oraz leków o działaniu antyagregacyjnym (abcyksymab, klopidogrel).

Zapoczątkowane przez Bantinga i Besta w latach 20. XX wieku badania endogennych peptydów, szczególnie insuliny, doprowadziły do wyizolowania insuliny. Kilkadziesiąt lat później, w wyniku rozwoju metod inżynierii genetycznej i opracowania techniki rekombinowanego DNA, stała się możliwa produkcja ludzkich białek w komórkach zwierzęcych i bakteryjnych. Po siedemdziesięciu latach od odkrycia insuliny stworzono pierwszą rekombinowaną insulinę ludzką, co stanowiło znaczący postęp w leczeniu pacjentów z cukrzycą. Dalszy rozwój metod inżynierii genetycznej doprowadził do opracowania grupy "leków biologicznych", z których najszersze zastosowanie znalazły przeciwciała monoklonalne. Dzisiaj trudno sobie wyobrazić leczenie nowotworów czy chorób o podłożu autoimmunologicznym bez użycia tych substancji białkowych.

Dzięki postępowi w rozwoju chemii analitycznej i opracowaniu nowych technik analitycznych było możliwe poznanie losów leków w organizmie (wchłanianie, dystrybucja, metabolizm), natomiast dzięki rozwojowi wysokowydajnych metod syntezy związków organicznych, nawet o bardzo złożonej strukturze - otrzymywanie nowych klas strukturalnych oraz daleko idąca modyfikacja chemiczna znanych związków biologicznie aktywnych, w tym także pochodzenia naturalnego (antybiotyki, hormony). Ocena aktywności biologicznej nowych związków i zastosowanie komputerowo wspomaganych metod projektowania ich struktury pozwala na poszerzenie katalogów dostępnych "kandydatów na leki".

Na przestrzeni ostatnich 30 lat notuje się ogromny postęp w optymalizacji terapii celowanej w zwalczaniu nowotworów, która dokonała się w wyniku zastosowania leków dezaktywujących onkogeny lub ukierunkowanych na ścieżki przekaźnictwa sygnału w komórce nowotworowej aktywowane przez onkogeny. Dużym osiągnięciem było opracowanie imatynibu, pierwszego małocząsteczkowego inhibitora receptora błonowego o charakterze kinazy tyrozynowej stosowanego w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej. Aktualnie dostępnych jest ponad 40 inhibitorów białek o charakterze kinaz błonowych i wewnątrzkomórkowych.

Wprowadzenie radiofarmaceutyków, czyli związków znakowanych radioizotopami, pozwoliło na bardziej precyzyjną diagnostykę, a także poprawiło skuteczność terapii przeciwnowotworowej oraz leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego.

Kamieniem milowym w leczeniu onkologicznym było wprowadzenie trastuzumabu, pierwszego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego, który wykazał wysoką skuteczność w raku piersi u kobiet z nadekspresją genu HER2. Przełomowe badania ostatnich lat nad "negatywnymi punktami kontroli" komórek nowotworowych doprowadziły do opracowania przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na zmienione nowotworowo limfocyty, a tym samym do stworzenia podwalin pod nowoczesną immunoonkologię.

W ostatnich latach dokonał się istotny postęp w leczeniu chorób infekcyjnych powodowanych przez wirusy. Dużym osiągnięciem było wprowadzenie związków organicznych o cechach inhibitorów proteazy serynowej NS3/4A (np. symeprewir, parytaprewir) oraz inhibitorów białka NS3A (daklataswir, ombitaswir) wirusa HCV, które znalazły zastosowanie w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby. Dużym postępem było opracowanie programów antyretrowirusowych, które spowodowały skuteczną eradykację wirusa HIV u nosicieli, zmniejszając liczbę zgonów z powodu AIDS.

Nadal mimo wielu spektakularnych osiągnięć farmakoterapii w przypadku niektórych schorzeń obserwuje się lekooporność, a działania niepożądane dostępnych leków stanowią duże wyzwanie, zmuszając do poszukiwania nowych, bardziej skutecznych metod farmakoterapii i leków gwarantujących maksymalne bezpieczeństwo w walce z chorobami. Należy mieć nadzieję, że wraz z rozwojem biologii molekularnej, genomiki, transkryptomiki i proteomiki oraz metod inżynierii genetycznej, a także naszej wiedzy o nowych celach biologicznych i nowych mechanizmach działania leków, ze szczególnym uwzględnieniem preferencji miejsca i wpływu na skomplikowane systemy transdukcji sygnału w komórkach, nie tylko nastąpi daleko idąca indywidualizacja farmakoterapii, lecz także jej charakter będzie bardziej celowany, co pozwoli na zminimalizowanie działań niepożądanych leków. W perspektywie rozwój medycyny spersonalizowanej pozwoli na znalezienie optymalnych rozwiązań, zapewniających skuteczną i bezpieczną farmako­terapię konkretnego pacjenta.

Rozwój automatyzacji metod otrzymywania i oczyszczania substancji biologicznie aktywnych, np. z zastosowaniem metod chemii przepływowej i mechanochemii, może w nieodległej przyszłości poprawić jakość prowadzonych w ramach chemii leków badań nad lekiem, a także zmienić obraz przemysłu farmaceutycznego.

1.2.Klasyfikacja i nazewnictwo substancji leczniczych

Według danych opublikowanych przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA - Food and Drug Administration) liczba substancji leczniczych zarejestrowanych na świecie w 2016 roku wynosiła 1591, w tym 1348 unikalnych związków małocząsteczkowych oraz 243 leki biologiczne. Ogromne zróżnicowanie substancji stosowanych do celów terapeutycznych stwarza konieczność przejrzystego usystematyzowania wiedzy na ich temat. Podstawą klasyfikacji substancji leczniczych nie mogą być tylko budowa chemiczna i profil działania farmakologicznego. Zróżnicowanie strukturalne rejestrowanych leków, w tym leków biologicznych, utrudnia klasyfikację według kryteriów chemicznych. Ponadto obecność w strukturze leków kilku grup funkcyjnych i różnych układów heterocyklicznych uniemożliwia zaklasyfikowanie leków zgodnie z podziałem stosowanym w chemii organicznej, np. na alkohole, aldehydy, kwasy, fenole i estry. Oparcie klasyfikacji leków tylko na podziale chemicznym doprowadziłoby do nadmiernego "rozczłonkowania" niektórych grup leków, np. przeciwnowotworowych i antybiotyków, i zaliczenia ich do wielu grup chemicznych. Obecnie za najbardziej uniwersalną uznaje się klasyfikację anatomiczno-terapeutyczno-chemiczną (ATC). Opiera się ona na kryterium zastosowania chemicznej grupy leków o zdefiniowanym mechanizmie działania w wybranej jednostce chorobowej. W konsekwencji każdy lek jest zakodowany jako ciąg siedmiu liter i cyfr. W ten sposób leki oraz inne środki wykorzystywane w terapii zostały uporządkowane w zależności od miejsca działania (np. układ sercowo-naczyniowy, ośrodkowy układ nerwowy), podgrupy terapeutycznej (np. leki przeciwbólowo-przeciwzapalne, przeciwnadciśnieniowe), mechanizmu działania (np. ligandy receptorowe, blokery kanałów jonowych) oraz grupy chemicznej, zwykle określającej tzw. klasę leków (np. pochodne benzodiazepiny, pochodne kwasu salicylowego), aby wreszcie precyzyjnie opisać (np. nazwą międzynarodową, nazwą chemiczną) cząsteczkę aktywną. Według najnowszych danych spośród wspomnianych 1591 leków kody ATC zostały przypisane 1462 lekom.

Zasadę tę można prześledzić na przykładzie leku o nazwie ibuprofen, który ma w systemie ATC kod M01AE01.

Zastosowanie podziału farmakologicznego w niniejszym opracowaniu umożliwia analizę zależności między budową a działaniem leku, opisanie charakteru oddziaływania leku w miejscu wiążącym celu biologicznego oraz powiązanie wchłaniania, trwałości, dystrybucji i biotransformacji leku z jego właściwościami fizykochemicznymi.

Warto podkreślić, że podział farmakologiczny pozwala na przegląd aktualnie stosowanych leków z danej klasy związków i danej grupy terapeutycznej oraz porównanie ich aktywności i bezpieczeństwa. Dzięki temu możliwe jest śledzenie postępów farmakoterapii.

Ważną kwestią jest wyjaśnienie zasad nazewnictwa związanego z lekiem, ponieważ na rynku jest dostępnych wiele leków zawierających tę samą substancję aktywną. Wśród nich występują leki oryginalne i leki generyczne. Lek oryginalny zawiera nową cząsteczkę chemiczną (NCE - new chemical entity), która wcześniej nie była stosowana w farmakoterapii. Leki generyczne są wprowadzane na rynek farmaceutyczny po upływie okresu ochrony patentowej leku oryginalnego. Sytuacja rynkowa sprawia, że każdy z producentów nadaje preparatom zastrzeżone nazwy handlowe dla tej samej substancji leczniczej. W ten sposób dany lek może mieć nawet setki różnych nazw generycznych. W Polsce obecnie (maj 2020 roku) znajduje się 21 720 rejestrów dopuszczonych substancji leczniczych, uwzględniających zróżnicowanie stosowanych dawek i wielkość opakowań.

Ujednolicenie nazewnictwa leków zostało zaproponowane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO - World Health Organization) ponad 50 lat temu. Stosowanie tzw. nazw rodzajowych lub międzynarodowych, w postaci niezastrzeżonej nazwy międzynarodowej (INN - international nonproprietary name), ma istotne znaczenie dla jednoznacznej identyfikacji leków zawierających tę samą substancję leczniczą. Nazwy INN są powszechnie stosowane w lekospisach, bazach danych oraz publikacjach naukowych. Lek przedstawiony wzorem:

RYCINA 1.1. Ibuprofen.

nosi według INN międzynarodową nazwę ibuprofen, a jego nazwy handlowe to m.in. Ibum, Ifenil i Ibuprom. Stosuje się również nazwę łacińską - ibuprophenum, która jest nazwą farmakopealną. Pełna nazwa chemiczna leku przedstawionego powyższym wzorem według bazy Chemical Abstract Service (CAS) to: kwas (RS)-2-[4-(2-metylopropylo)fenylo]propionowy. Kolejnym przykładem może być lek stosowany w terapii schorzeń układu sercowo-naczyniowego - simwastatyna. W rejestrze INN występuje on pod nazwą międzynarodową simvastatin, a nazwa oryginalnego preparatu zawierającego tę substancję leczniczą to Zocor (Merck & Co.). W przypadku tej substancji leczniczej liczba leków generycznych zarejestrowanych w Polsce wynosi obecnie (maj 2020 roku) ponad 25.

Ostatnio wprowadzono tzw. zmodyfikowane nazwy INN, które definiują postać, w jakiej jest stosowana substancja lecznicza. Pozwala to na przykład na doprecyzowanie rodzaju soli lub estru, w których postaci mogą występować związki biologicznie aktywne zawarte w lekach.

W niniejszym opracowaniu przy omawianiu poszczególnych leków podano niezastrzeżoną międzynarodową nazwę (INN) w języku polskim, nazwę oryginalnego preparatu, nazwy najczęściej stosowanych leków generycznych oraz nazwę chemiczną.

1.3.Wpływ czynników fizykochemicznych na trwałość leków

Trwałość leku określa się na podstawie kryteriów: tożsamości, zawartości substancji leczniczej i czystości, które są gwarantowane przez producenta w zdefiniowanej jednostce czasu. Trwałość może zatem być definiowana jako odporność na działanie czynników fizycznych, chemicznych i biologicznych, tj. światła, temperatury, wilgoci i pH środowiska (tab. 1.1). Każda zmiana w budowie substancji leczniczej (API - active pharmaceutical ingredient) i właściwościach postaci leku, wywołana którymkolwiek z powyższych czynników, przekłada się na skuteczność stosowania produktu leczniczego (obniżenie lub utrata aktywności) i na bezpieczeństwo jego stosowania (możliwy efekt toksyczny). Na trwałość substancji leczniczej może ponadto wpływać rodzaj formulacji, zastosowanej do opracowania postaci farmaceutycznej. Ogólnie substancje lecznicze wykazują większą trwałość w stałych postaciach leku niż w płynnych. Zwykle trwałość substancji leczniczych w roztworach niewodnych jest wyższa niż w roztworach wodnych.

TABELA 1.1. Chemiczne i fizyczne czynniki wpływające na trwałość leku oraz przykłady reakcji prowadzących do utraty aktywności leku

Kategoria czynnika

Opis procesu

Przykłady reakcji

Chemiczny

Rozerwanie lub powstanie wiązań kowalencyjnych, prowadzące do utraty aktywności

Hydroliza estrów, amidów, laktamów

Utlenianie i redukcja

Fizyczny

Rozerwanie lub powstanie wiązań kowalencyjnych

Fotodegradacja

Zmiany w rozpuszczalności i wyglądzie leku (bez wpływu na istniejące wiązania kowalencyjne)

Zmiana postaci (zmiany w strukturze krystalicznej, krystalizacja postaci amorficznych, utrata wody krystalizacyjnej)

Badanie trwałości leku ma na celu weryfikację jego składu jakościowego, czyli deklarowanej zawartości substancji leczniczej i substancji pomocniczych, wykorzystanych w produkcji postaci leku (np. iniekcja, tabletka, maść). Badanie stabilności produktu leczniczego służy również weryfikacji ewentualnych kierunków rozkładu (degradacja składników, zmiany rozpuszczalności substancji, obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych). Badania te są realizowane przez poddanie leku działaniu różnych czynników chemicznych i fizycznych, np. zmiennej temperaturze, różnym warunkom wilgotności, pH czy naświetlaniu promieniowaniem UV. Równocześnie tego typu badania dostarczają informacji o wpływie opakowania oraz substancji pomocniczych na jakość produktu. Badanie trwałości produktu leczniczego jest realizowane według ścisłych norm, m.in. farmakopealnych (Farmakopei Polskiej i Europejskiej).

Podstawowe modyfikacje substancji leczniczej zachodzące pod wpływem czynników chemicznych i fizycznych zaprezentowano na kilku przykładach. Do najczęściej zachodzących procesów chemicznych wpływających na trwałość leku zalicza się: hydrolizę, utlenianie, redukcję i dekarboksylację. Procesy te polegają na rozerwaniu istniejących lub utworzeniu nowych wiązań kowalencyjnych. Ponadto należy uwzględnić procesy specyficzne dla poszczególnych leków, które są uzależnione od obecności w ich strukturze poszczególnych grup funkcyjnych oraz od budowy przestrzennej leków (konfiguracja, konformacja).

Reakcje hydrolizy są najczęstszą przyczyną rozkładu leków. Oprócz soli hydrolizie ulegają najczęściej estry, amidy kwasowe, cykliczne imidy oraz etery. Na szybkość procesu hydrolizy wpływają środowisko wodne, jego pH (kwasowe, zasadowe), siła jonowa roztworu, obecność dodatkowych rozpuszczalników i podwyższona temperatura.

W sprzyjających warunkach leki o budowie estrowej stosunkowo szybko ulegają rozkładowi hydrolitycznemu. Kwas acetylosalicylowy jest chemicznie nietrwały w roztworze wodnym oraz w stanie stałym w obecności wilgoci (również tzw. wody krystalizacyjnej, zawartej w postaci leku). Produktami hydrolizy są kwas salicylowy i kwas octowy (ryc. 1.2).

RYCINA 1.2. Hydroliza kwasu acetylosalicylowego.

Najwyższą trwałość kwas acetylosalicylowy wykazuje przy pH około 2,5. Ogólnie estry wykazują relatywnie najwyższą trwałość w środowisku kwasowym, szybko rozkładając się w środowisku zasadowym. Związkami mniej podatnymi na procesy hydrolizy, a tym samym bardziej trwałymi, są amidy oraz cykliczne imidy. Można to prześledzić, porównując trwałość dwóch leków - prokainy i prokainamidu, w których wiązanie estrowe zastąpiono amidowym. Leki te ulegają hydrolizie do kwasu p-aminobenzoesowego i odpowiednio: dietyloamino-etanolu oraz dietyloamino-etyloaminy (ryc. 1.3).

RYCINA 1.3. Hydroliza prokainy i prokainamidu.

Antybiotyki z grupy ?-laktamów, np. penicyliny i cefalosporyny, są przykładem leków bardzo szybko ulegających wielokierunkowemu rozkładowi hydrolitycznemu pod wpływem kwasów, zasad i enzymów. Powstające produkty są pozbawione aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Kierunki hydrolizy katalizowanej kwasami, zasadami i odpowiednimi enzymami zaprezentowano na przykładzie penicyliny benzylowej (ryc. 1.4).

RYCINA 1.4. Miejsce hydrolizy kwaśnej, zasadowej i enzymatycznej na przykładzie penicyliny benzylowej.

Ekstremalnie nietrwałym fragmentem cząsteczki jest wiązanie laktamowe (endocykliczny amid), reagujące zarówno na czynniki kwasowo-zasadowe, jak i enzymatyczne. Wiązanie amidowe w podstawniku (egzocykliczny amid) wykazuje znacząco większą trwałość.

Gwarantem jakości produktu leczniczego i sposobem na zabezpieczenie przed rozkładem hydrolitycznym jest odpowiednia temperatura przechowywania i eliminacja dostępu wilgoci, a w przypadku postaci płynnych utrzymanie optymalnego odczynu roztworu.

Równie częstą przyczyną rozkładu leków i utraty aktywności biologicznej są procesy utleniania. Wrażliwe na utlenianie są przede wszystkim cząsteczki zawierające w strukturze ugrupowania aldehydowe, grupy fenolowe, podstawniki oraz układy heterocykliczne, w których skład wchodzi siarka sulfanowa (np. leki z grupy fenotiazyn). Podatne na reakcje utlenienia są również układy chemiczne występujące w alkaloidach (np. pilokarpina, morfina). Czynnikami przyspieszającymi procesy utleniania są: podwyższona temperatura, środowisko kwasowe i obecność metali (Cu2+, Fe3+). Jako przykład procesu utlenienia może posłużyć utlenienie adrenaliny pod wpływem światła i powietrza, z wytworzeniem barwnego produktu o budowie cyklicznej - adrenochromu (2,3-dihydro-3-hydroksy-1-metylo-1H-indol-5,6-dion) (ryc. 1.5).

RYCINA 1.5. Utlenianie adrenaliny.

Związki zawierające w strukturze ugrupowania o charakterze amin drugo- i trzeciorzędowych podlegają utlenieniu z utworzeniem odpowiednich N-tlenków.

Działania zabezpieczające leki przed procesami utleniania polegają na eliminacji czynników przyspieszających ten proces oraz na wprowadzaniu substancji o właściwościach przeciwutleniających, czyli tzw. przeciwutleniaczy, najczęściej na etapie opracowywania formulacji postaci leku. Rzadko w przypadku leków zachodzą procesy rozkładu cząsteczek na drodze redukcji. Zwykle procesy te dotyczą jonów srebra i rtęci w niektórych postaciach leków.

Procesom dekarboksylacji podlegają przede wszyst­-kim leki należące do grupy pochodnych kwasów aromatycznych. Powstające produkty są najczęściej pozbawione aktywności farmakologicznej. Przykładem takiego leku może być kwas 4-aminosalicylowy (PAS). Lek ten już w temperaturze 20°C może ulegać dekarboksylacji do 3-aminofenolu, który jest produktem toksycznym (ryc. 1.6).

RYCINA 1.6. Rozkład termiczny kwasu 4-aminosalicylowego.

Wśród przemian chemicznych, które dotyczą zmian w budowie przestrzennej cząsteczki, należy wyróżnić izomeryzację w grupie związków optycznie czynnych. Izomeryzacja, w przebiegu której dochodzi do zmiany konfiguracji przy centrum stereogenicznym (na węglu chiralnym), nie powoduje rozkładu leku. Czynnikami przyspieszającymi izomeryzację mogą być: podwyższona temperatura, światło i odczyn środowiska (roztworu). Zjawisko utraty aktywności nie dotyczy leków występujących w postaci izomerów geometrycznych i konformacyjnych. Związki te są stabilne w normalnych warunkach przechowywania, natomiast ich wzajemne przemiany możliwe są tylko po dostarczeniu znacznej ilości energii.

Klasycznym przykładem wewnątrzcząsteczkowego przegrupowania przy centrum stereogenicznym jest racemizacja lewoskrętnego enancjomeru adrenaliny (ryc. 1.7). Obserwowane obniżenie aktywności farmakologicznej (niemal o połowę) wynika z faktu, że enancjomer prawoskrętny jest prawie 20-krotnie mniej aktywny niż forma lewoskrętna. Proces racemizacji jest w tym przypadku warunkowany obecnością jonów H+ lub OH-.

RYCINA 1.7. Mieszanina racemiczna - równomolowa mieszanina lewoskrętnego i prawoskrętnego enancjomeru.

W wyniku epimeryzacji, tj. przestrzennego przemieszczenia podstawnika w pozycji C4 zachodzącego w środowisku kwasowym, obserwuje się obniżenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej antybiotyków z grupy tetracyklin (w przypadku chlorotetracykliny blisko 20-krotne; ryc. 1.8).

RYCINA 1.8. Epimeryzacja chlorotetracykliny.

Wiele leków podlega przemianom lub degradacji pod wpływem czynników fizycznych, takich jak temperatura i promieniowanie UV. Na przykład glukoza w roztworach wodnych w trakcie wyjaławiania na gorąco oraz podczas przechowywania ulega epimeryzacji i rozkładowi (ryc. 1.9). Powstający w wyniku tych przemian 5-hydroksymetylofurfural jest produktem o właściwościach drażniących.

RYCINA 1.9. Rozkład glukozy.

Procesy fotodegradacji polegają głównie na skomplikowanych reakcjach rodnikowych, w wyniku których powstają reaktywne produkty o działaniu toksycznym. Procesy fotodegradacji mogą dotyczyć zarówno substancji leczniczej, jak i składników formulacji postaci leku i prowadzić do utraty aktywności farmakologicznej, a w niektórych przypadkach do pojawienia się efektów toksycznych. Za niestabilne uważa się substancje, które pochłaniają światło o długości fali w zakresie promieniowania ultrafioletowego. Przykładami substancji ulegających przemianom pod wpływem promieniowania UV-A mogą być: nifedypina (aromatyzacja pierścienia dihydropirydyny), niesteroidowe leki przeciwzapalne - ibuprofen, naproksen (dekarboksylacja) i kwas meklofenamowy (cyklizacja).

Na stabilność leku mogą wpływać reakcje fotodegradacji substancji leczniczych, przebiegające in vivo po podaniu preparatu do organizmu. W takich przypadkach zakazane jest eksponowanie organizmu na działanie promieniowania UV. Lekami ulegającymi przemianom pod wpływem promieniowania UV są m.in. pochodne z grupy fenotiazyn i fluorochinolonów. Przemiany te można prześledzić na przykładzie lomefloksacyny (ryc. 1.10).

RYCINA 1.10. Rozkład lomefloksacyny pod wpływem promieniowania UV.

Degradacja struktury lomefloksacyny przebiega z otwarciem pierścienia piperazyny oraz dehalogenacją (odszczepienie fluoru) w pozycji C8 układu chinolin-4-onu. Powstałe produkty fotodegradacji lomefloksacyny są przyczyną reakcji fotouczuleniowych, np. zaczerwienienia skóry pod wpływem ekspozycji na światło UV w czasie kuracji lekiem. W wyniku fotokatalitycznego rozkładu sparfloksacyny powstają liczne toksyczne produkty o działaniu fotouczulającym. Były one jedną z przyczyn wycofania sparfloksacyny z lecznictwa.

Problem trwałości i stabilności substancji leczniczej należy rozpatrywać w szerszym kontekście. Na uwagę zasługują procesy fizyczne prowadzące do zmiany postaci krystalicznej substancji leczniczej lub desolwatacji, tj. usunięcia rozpuszczalników wykorzystywanych w procesie krystalizacji substancji czynnej stałej postaci leku (np. wody krystalizacyjnej). Pod wpływem czynników fizycznych może dochodzić do przekształcenia niestabilnych odmian polimorficznych lub postaci amorficznych w bardziej stabilną postać krystaliczną, tj. postać o wyższej temperaturze topnienia i gorszej rozpuszczalności w wodzie. Wiadomo, że tylko formy rozpuszczone w płynach ustrojowych mają zdolność przenikania przez błony biologiczne.

Zaprezentowane powyżej przykłady rozkładu leków w różnych warunkach nie wyczerpują wszystkich możliwości ich przemian chemicznych i fizycznych. W przypadku związków o skomplikowanej budowie procesy fizyczne i chemiczne mogą przebiegać wielokierunkowo, z wytworzeniem produktów pozbawionych aktywności biologicznej. Na szczególną uwagę zasługuje zagadnienie trwałości preparatów o budowie peptydowej: peptydów, białek i leków biologicznych o innej, zróżnicowanej strukturze. W przypadku tego typu leków wymagane jest zapewnienie właściwych warunków na etapie otrzymywania substancji biologicznie aktywnej, produkcji i przechowywania postaci leku - ma to na celu zagwarantowanie uzyskania produktu odpowiedniej jakości, spełniającego najwyższe standardy.

1.4.Ogólna charakterystyka działania leków

1.4.1.Zasady funkcjonowania organizmu

Warunkiem funkcjonowania organizmów wielokomórkowych jest właściwe działanie sygnalizacji międzykomórkowej oraz wyspecjalizowanego systemu selekcji i kontroli sygnałów odbieranych ze środowiska zewnętrznego. Każdy aspekt złożonej organizacji komórek w obrębie organizmu (w tym regulacja metabolizmu, różnicowanie i śmierć komórek) zależy od prawidłowo funkcjonującej sygnalizacji komórkowej. Komórki komunikują się za pomocą mediatorów, a informacje są przekazywane przez system wyspecjalizowanych struktur białkowych, określanych mianem receptorów. Receptorami mogą być białka błonowe, kanały jonowe i enzymy. Białka receptorowe mają zdolność odbioru sygnału, "tłumaczenia" informacji i przekazywania jej do wewnątrzkomórkowych systemów efektorowych. Procesy komunikacji międzykomórkowej mogą polegać na przekazywaniu sygnału, a także jego wzmacnianiu lub wyciszaniu. Dzięki zróżnicowaniu białek możliwe są odbiór informacji o charakterze bodźców fizycznych lub promieniowania elektromagnetycznego oraz przekazywanie informacji za pomocą związków chemicznych (np. neurotransmiterów, hormonów, cytokin). Efektem aktywacji białek receptorowych może być otwarcie lub zamknięcie kanałów jonowych, podział komórek, biosynteza białek, fosforylacja białek lub hydroliza endogennych mediatorów.

Z analizy celów biologicznych dla leków dostępnych w bazie ChEMBL wynika, że do chwili obecnej poznano 667 unikalnych ludzkich białek receptorowych oraz 189 białek receptorowych związanych z patogenami. Wśród celów biologicznych związanych z ludzkimi białkami największą grupę stanowią receptory sprzężone z białkiem G (GPCR - G protein-coupled receptors), kanały jonowe, kinazy białkowe oraz receptory jądrowe, stanowiące 44% wszystkich celów dla dostępnych leków (ryc. 1.11).

RYCINA 1.11. Cele biologiczne działania leków. GPCR - receptory sprzężone z białkiem G.

Przedstawione na rycinie 1.11 uprzywilejowane rodziny celów biologicznych są odpowiedzialne za efekt terapeutyczny blisko 70% małocząsteczkowych leków. Warto podkreślić, że innym ważnym trendem jest wzrost liczby leków biologicznych, głównie przeciwciał monoklonalnych.

1.4.2.Mechanizmy działania leków

Nadrzędnym celem stosowania leków jest odwrócenie patologicznych procesów biochemicznych na poziomie komórki, a w konsekwencji przywrócenie prawidłowego funkcjonowania poszczególnych tkanek i całego organizmu. Działanie leku jest procesem bardzo złożonym, wynikającym nie tylko z jego budowy i właściwości fizykochemicznych, lecz także z wielu zmiennych czynników, np. masy ciała, wieku i płci chorego, zmienności genetycznej, stanu czynnościowego narządów oraz współistnienia różnych chorób. Równocześnie efekt farmakologiczny (biologiczny) działania leku jest ściśle uzależniony od szybkości uwalniania leku z jego postaci farmaceutycznej (formulacji), a także od jego wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji z organizmu.

Na poziomie molekularnym warunkiem oddziaływania leku jest komplementarność jego struktury z celem biologicznym. Zrozumienie wysoce specyficznego sposobu oddziaływania dwóch "partnerów" - leku i celu biologicznego (np. receptora, enzymu) - wymaga pogłębionej znajomości właściwości fizykochemicznych, budowy chemicznej i przestrzennej leków oraz trójwymiarowej struktury celu biologicznego. Receptor należy rozpatrywać jako biopolimer o strukturze białkowej, w której skład wchodzą elementy rozpoznające i umożliwiające związanie specyficznego liganda. Ligandami mogą być zarówno związki endogenne, np. neuroprzekaźniki, jak i substancje egzogenne, np. leki.

Rozpatrując właściwości fizykochemiczne leku, należy brać pod uwagę: rozpuszczalność leku w wodzie i płynach ustrojowych, współczynnik podziału n-oktanol/woda, stopień jonizacji, powierzchnię polarną oraz aktywność powierzchniową; są to parametry definiujące zdolność przenikania leków przez błony biologiczne. Analizując budowę chemiczną, należy uwzględnić: główny rdzeń cząsteczki (układ podstawowy), typy wiązań chemicznych, rodzaje podstawników i grup funkcyjnych wpływających na rozkład gęstości ładunku w obrębie cząsteczki, zjawisko rezonansu, efekty indukcyjne oraz potencjał oksydacyjno-redukcyjny. Rozpatrując charakter oddziaływań leku z białkami receptorowymi, należy dodatkowo uwzględnić budowę przestrzenną cząsteczki, konfigurację podstawników i konformację, a także odległości między poszczególnymi atomami, związane z długością wiązań.

Oddziaływanie leku z celem biologicznym ma charakter wysoce specyficzny i jest wynikiem łączenia cząsteczek leku z białkowymi mikrostrukturami komórkowymi. Próby wyjaśnienia przebiegu procesów biochemicznych i opisania zasad oddziaływania pomiędzy cząsteczką leku i celem biologicznym, prowadzącego do powstania efektu farmakologicznego, pozwoliły na określenie mechanizmów działania leków, m.in. jednego z najbardziej eksponowanych, jakim jest działanie receptorowe, a następnie na stworzenie receptorowej teorii działania leków. W myśl tej teorii, określanej także jako teoria molekularna, warunkiem wystąpienia efektu farmakologicznego jest połączenie cząsteczki określonego leku we właściwym miejscu wiążącym, znajdującym się w odpowiednim receptorze. Jest to hipoteza najbardziej uniwersalna, odnosząca się do wielu grup leków, w tym do leków przeciwbólowych (np. morfiny), oddziałujących ze zlokalizowanymi w błonie komórkowej receptorami opioidowymi, czy glikokortykosteroidów, oddziałujących z receptorami zlokalizowanymi wewnątrzkomórkowo (w jądrze komórkowym). Rolę receptorów mogą odgrywać centra aktywne poszczególnych enzymów. Na przykład niesteroidowe leki przeciwzapalne (kwas acetylosalicylowy [aspiryna], ibuprofen) oddziałują z enzymem cyklooksygenazą (kluczowym enzymem kaskady kwasu arachidonowego), inhibitory konwertazy angiotensyny - z konwertazą angiotensyny I, a ?-blokery - z receptorem ?-adrenergicznym. Leki mogą wpływać na białka zaangażowane w procesy metabolizmu endogennych przekaźników, m.in. mogą interferować na poziomie transportu jonów jako aktywatory (chociaż częściej jako inhibitory) kanałów jonowych. Kanały jonowe, jako struktury zlokalizowane w błonach komórkowych, umożliwiają przesunięcia jonów pomiędzy wnętrzem komórki i środowiskiem pozakomórkowym. Dodatkowo niektóre kanały jonowe mogą być "bramkowane" odpowiednim receptorem (np. receptorem 5-HT3, receptorem nikotynowym).

Kolejnym mechanizmem działania leków jest ich zdolność do upośledzania procesów metabolizmu komórkowego przez wbudowywanie się na różnych etapach metabolizmu komórki jako fałszywy metabolit (antymetabolit), w miejsce metabolitu właściwego, produkowanego przez komórkę. Antymetabolity są izosterycznymi i izoelektronowymi analogami endogennych substancji niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania komórki, które po włączeniu w miejsce właściwych metabolitów powodują powstanie fałszywych struktur przekaźnikowych lub budulcowych. Przykładami leków o tym mechanizmie działania są leki przeciwnowotworowe, m.in. 5-fluorouracyl, antymetabolit zasad pirymidynowych, uniemożliwiający budowę prawidłowego DNA i w konsekwencji biosyntezę białka, oraz metotreksat, który wiążąc się z reduktazą dihydrofolianową, uniemożliwia powstanie kwasu tetrahydrofoliowego - witaminy wzrostowej niezbędnej dla rozwoju komórki.

Wśród leków występują ponadto substancje, których działanie wynika bezpośrednio z reakcji chemicznych, np. reakcji zobojętniania lub tworzenia związków kompleksowych.

1.4.2.1.Ogólne zasady rozpoznawania molekularnego

Powstanie kompleksu aktywnego lek-receptor jest efektem złożonych procesów chemicznych, w których decydującą rolę odgrywają czynniki stereochemiczne leku i receptora, umożliwiające zbliżenie się liganda do miejsca wiążącego. W kolejnym etapie duże znaczenie mają oddziaływania niekowalencyjne (tj. wiązania wodorowe, halogenowe oraz siły van der Waalsa). Komplementarność struktur wymagana w przypadku oddziaływania leku z receptorem jest często porównywana do "dopasowania klucza do zamka". Zasada oddziaływania leku z receptorem opiera się na wysokiej specyfice budowy i analogii strukturalnej do endogennie występujących substancji przekaźnikowych. Koncepcja klucz-zamek tylko w umowny, uproszczony sposób odzwierciedla zasadę oddziaływania leku z celem biologicznym (dopasowanie sztywnych struktur). Białka, a także cząsteczki leków, nie są konstruktami sztywnymi. Wiązanie leku z receptorem należy rozumieć jako efekt dopasowania komplementarnych struktur chemicznych przez oddziaływania chemiczne i fizyczne. Zmiany konformacyjne w obrębie cząsteczki leku i receptora, będące wynikiem wzajemnego oddziaływania, umożliwiają powstanie stanu dynamicznego. Zjawisko wzajemnego dopasowania celu biologicznego pod wpływem liganda nosi nazwę dopasowania indukowanego (induced fit). Konsekwencją zespolenia dwóch struktur i dalszych złożonych procesów chemicznych oraz zmian strukturalnych i biologicznych jest obserwowany efekt farmakologiczny.

W przypadku cząsteczek leków, które dzięki odpowiedniej strukturze farmakoforowej, uwarunkowanej przede wszystkim ich konformacją, konfiguracją i rozmieszczeniem elektronów w cząsteczce, dopasowują się do miejsca wiążącego tylko jednego typu receptora, mamy do czynienia z lekami o selektywnym mechanizmie działania. Przekładając to na koncepcję klucz-zamek, można stwierdzić, że "jeden klucz pasuje tylko do jednego zamka". Przy całej złożoności oddziaływań leku z fragmentami aminokwasowymi miejsca wiążącego receptora bardzo małe często różnice w budowie chemicznej leków skutkują zmianą siły i selektywności oddziaływania z celem biologicznym. W przypadku leków spełniających wymagania farmakoforowe względem kilku celów biologicznych mówi się o wieloreceptorowym mechanizmie działania.

Powstanie kompleksu aktywnego ligand-receptor (L-R) bardzo rzadko skutkuje rozerwaniem istniejących lub powstaniem nowych wiązań kowalencyjnych. Zjawiska te są obserwowane w przypadku niektórych środków alkilujących oraz leków o cechach nieodwracalnych inhibitorów enzymatycznych. W większości przypadków dochodzi do specyficznych oddziaływań między grupami funkcyjnymi i elementami strukturalnymi występującymi w cząsteczce leku z łańcuchami lateralnymi aminokwasów lub głównym łańcuchem peptydowym białka. Oddziaływania te mają charakter wiązań niekowalencyjnych, wśród których ważną pozycję zajmują wiązania jonowe i wodorowe oraz oddziaływania: dipol-dipol, ?-elektronowe i hydrofobowe (tab. 1.2).

TABELA 1.2. Typy wiązań uczestniczących w stabilizacji kompleksów aktywnych lek-receptor

Rodzaj oddziaływań

Opis

Energia wiązania

Wiązanie van der Waalsa

Słabe oddziaływanie o niewielkim zasięgu (wiązanie apolarne)

0,5-2 kcal/mol

Wiązanie wodorowe

Słabe polarne wiązanie między donorami wodoru (-OH, -COOH, NH, NH2) a akceptorami wodoru (-O, =N-, =CO)

2-5 kcal/mol

Wiązanie halogenowe

Słabe wiązanie kierunkowe między kwasem Lewisa (halogen, X: Cl, Br, J) i zasadą Lewisa (Y: głównie =CO, -OH)

0,2-7 kcal/mol

Wiązanie jonowe

Wiązanie elektrostatyczne między grupami anionowymi a kationowymi

5-10 kcal/mol

Wiązanie kowalencyjne

Bogato energetyczne i silne wiązanie przez wspólne pary elektronów

40-110 kcal/mol

Wiązanie chelatowe

Szczególna forma wiązania kowalencyjnego - atom metalu zostaje związany między kilkoma grupami atomów uformowanych w kształt pierścienia

Zasadniczą rolę w oddziaływaniu między cząsteczką leku a receptorem odgrywają wiązania typu jonowego. Wiązania te powstają między przeciwnie naładowanymi jonami znajdującymi się w cząsteczce leku i w receptorze. Wiązania jonowe są wynikiem działania siły Coulomba i najczęściej powstają w wyniku wzajemnego przyciągania przeciwnie naładowanych cząstek, zapewniając w ten sposób właściwą orientację cząsteczki leku w miejscu wiążącym celu biologicznego oraz kontakt dwóch komplementarnych struktur. Na przykład wiązanie jonowe może zostać utworzone w wyniku przyjęcia protonu z łańcucha bocznego aminokwasu, zawierającego grupę karboksylową (np. kwas asparaginowy w strukturze receptora), przez grupę aminową liganda. Wiązania jonowe mogą brać udział w tworzeniu kompleksu L-R podczas oddziaływania leków z kwasami nukleinowymi zawierającymi reszty (ugrupowania) fosforanowe i/lub siarczanowe.

Utworzony w ten sposób kompleks ligand-receptor jest stabilizowany przez dodatkowe oddziaływania chemiczne, umożliwiające dokładne dopasowanie się cząsteczki leku do miejsca wiążącego receptora. Tego typu oddziaływania mają często charakter oddziaływań jon-dipol i/lub dipol-dipol. Ważną rolę w interakcji leku z receptorem odgrywają oddziaływania typu mostków wodorowych, oddziaływania ?-elektronowe (siły van der Waalsa) oraz wiązania halogenowe. Oddziaływania te mają charakter lokalny. Wiązanie wodorowe jest silnym oddziaływaniem typu dipol-dipol, które powstaje między atomem wodoru przyłączonym do elektroujemnego atomu (zwykle grupa OH, NH) i atomami o cechach elektroujemnych (tlen, azot, fluor). Wiązania wodorowe mogą mieć charakter wewnątrz- i międzycząsteczkowy. Energia tego oddziaływania (2-5 kcal/mol) jest wyższa niż energia oddziaływań typu van der Waalsa. Pod względem geometrii i topologii wiązanie halogenowe jest bliskim analogiem wiązania wodorowego. Donorem wiązania halogenowego jest elektroujemny atom halogenu, a efekt ten wynika z asymetrii rozkładu gęstości elektronowej na atomie halogenu (efekt ?-hole).

Rolę i charakter oddziaływań zaangażowanych w tworzenie i stabilizację kompleksu aktywnego lek-receptor najlepiej prześledzić na przykładzie interakcji cząsteczki adrenaliny z receptorem adrenergicznym (ryc. 1.12). Komplementarność cząsteczki adrenaliny oraz miejsca wiążącego receptora ?-adrenergicznego umożliwia powstanie kompleksu aktywnego. W jego stabilizację zaangażowane są wiązania jonowe między resztą kwasu asparaginowego, znajdującego się w III domenie transbłonowej (centrum elektroujemne receptora), a kationem amoniowym cząsteczki leku oraz wiązania typu mostków wodorowych z udziałem grup fenolowych leku i fragmentów aminokwasów polarnych (np. seryny). Elementami dodatkowo stabilizującymi cząsteczkę aminy katecholowej w receptorze są siły van der Waalsa, przyłożone do płaskiego pierścienia aromatycznego i stabilizowane przez aminokwasy aromatyczne (np. fenyloalanina) VI domeny transmembranowej. "Wielostykowy" kontakt leku z receptorem jest gwarantem wywołania efektu biologicznego. Trwałość powstałego kompleksu aktywnego lek-receptor zależy od stopnia wzajemnego dopasowania się leku i receptora.

RYCINA 1.12. Oddziaływania adrenaliny w miejscu wiążącym receptora adrenergicznego. TMH - domena transmembranowa.

Wprawdzie wysokoenergetyczne i dość trwałe wiązania kowalencyjne znacznie rzadziej uczestniczą w stabilizacji oddziaływań lek-receptor, to jednak mają niemałe znaczenie w mechanizmie działania leków przeciwnowotworowych z grupy środków alkilujących oraz nieodwracalnych inhibitorów enzymatycznych. Tworzenie wiązań kowalencyjnych polega na uwspólnianiu elektronów z atomów pochodzących od leku oraz celu biologicznego. Ze względu na wysoką energię wiązań kowalencyjnych (tab. 1.2) oddziaływania tego typu zwykle prowadzą do nieodwracalnego unieczynnienia funkcji enzymu. Przywrócenie aktywności fizjologicznej enzymu jest możliwe dopiero po odtworzeniu, na drodze biosyntezy, nowej partii białka. Przykładami tworzenia wiązań kowalencyjnych mogą być: reakcja cyklofosfamidu z grupami sulfhydrylowymi lub atomami azotu i tlenu oraz acylowanie grup aminowych transpeptydazy, enzymu odpowiedzialnego za budowę ściany bakteryjnej, przez ugrupowania ?-laktamowe penicylin i cefalosporyn. Wiązania kowalencyjne powstają również w reakcjach inhibitorów kinaz o działaniu przeciwnowotworowym, np. ibrutynibu i afatynibu, zawierających fragmenty o charakterze wiązań nienasyconych. Ugrupowania te tworzą wiązania kowalencyjne z resztami cysteiny w miejscu katalitycznym enzymu, co prowadzi do trwałego zablokowania funkcji enzymatycznych.

1.4.2.2.Teorie receptorowego działania leku

Opracowanie uniwersalnego modelu opisującego sposób oddziaływania leku z celem biologicznym i prowadzącego do powstania efektu farmakologicznego nie jest możliwe. Jest to bowiem skomplikowany proces dopasowania dwóch komplementarnych struktur, po zespoleniu których powstały stan dynamiczny aktywuje zmiany konformacji leku i receptora, powoduje przesunięcia elektronowe, a w konsekwencji wywołuje efekt farmakologiczny. Stabilizacja stanu dynamicznego lek-receptor odbywa się za pomocą rożnych oddziaływań międzycząsteczkowych (niewalencyjnych i kowalencyjnych).

Aby wywołać efekt farmakologiczny, lek musi cechować się:

- powinowactwem - definiowanym jako zdolność do oddziaływania z określonym celem biologicznym; jego miarą jest stała hamowania Ki;

- aktywnością wewnętrzną (intrinsic activity) - definiowaną jako zdolność do aktywacji ścieżek sygnalizacyjnych zależnych od receptora.

W celu opisania sposobu oddziaływania leku (związku biologicznie aktywnego) z receptorem wykorzystuje się modele matematyczne, uwzględniające m.in. stężenie leku, maksymalną liczbę miejsc wiążących zajętych przez lek (Bmax) i maksymalny możliwy do osiągnięcia efekt biologiczny. Aktywność leku można wyznaczyć na podstawie efektu wywieranego bezpośrednio w receptorze lub na podstawie modyfikacji aktywności innego referencyjnego liganda o znanej aktywności w tym samym modelu. Dane eksperymentalne pozwalają określić parametry definiujące aktywność biologiczną oraz przypisać odpowiedni mechanizm działania. Miarą powinowactwa, jak już wspomniano, jest stała hamowania Ki, którą można wyznaczyć, znając wartość IC50, za pomocą równania Chenga-Prusoffa:

gdzie: IC50 - stężenie leku wypierające 50% radioliganda z miejsc wiążących, A - stężenie molowe leku, KD - stała powinowactwa.

Niska wartość stałej hamowania Ki wskazuje na wysokie powinowactwo leku do receptora. Zdolność do tworzenia kompleksów aktywnych lek-receptor, której miarą jest powinowactwo, występuje niezależnie od aktywności wewnętrznej ligandów. W wielu przypadkach wiązanie liganda, opisane wartością stałej hamowania Ki, nie koreluje z obserwowanym efektem farmakologicznym, lecz zależy m.in. od rodzaju ścieżek sygnalizacyjnych sprzężonych z białkiem receptorowym oraz od elementów dotyczących samego receptora, takich jak internalizacja (przesunięcie białka receptorowego z błony komórkowej do endosomów) oraz konieczność homo- lub heterodimeryzacji (łączenie białek monomerycznych).

Jedną z teorii tłumaczących mechanizm powstawania efektu biologicznego jest teoria okupacyjna, sformułowana przez Clarka, Ariensa i Stephensona, zgodnie z którą efekt działania leku jest wprost proporcjonalny do liczby zajętych receptorów, będących w stanie równowagi z cząsteczką leku (target occupancy). Powstanie kompleksu aktywnego lek-receptor jest najważniejszym momentem zapoczątkowującym działanie farmakologiczne. Jego efekt utrzymuje się tak długo, jak długo cząsteczki leku pozostają zespolone z receptorem. Zgodnie z tym założeniem maksymalny efekt biologiczny powstaje po całkowitym zajęciu receptorów, czyli po osiągnięciu stanu równowagi w reakcji lek-receptor.

Inna teoria zakłada, że efekt biologiczny jest wprost proporcjonalny do całkowitej liczby spotkań leku z receptorem w jednostce czasu. Aktywność farmakologiczna jest zatem wprost proporcjonalna do szybkości dysocjacji i asocjacji, a nie do liczby zajętych receptorów.

Dzięki pojawieniu się odpowiednich technik badawczych zostały określone nowe mechanizmy działania leków oraz opracowane nowe teorie, próbujące przedstawić za pomocą modeli matematycznych skomplikowany proces interakcji lek-receptor. Dokładna analiza tych zagadnień wykracza poza zakres niniejszego podręcznika, jednak być może warto zaprezentować niektóre przykłady takich modeli. Jednym z nich jest model dwóch stanów celu biologicznego, opisany przez Castillo, Katza i Monoda. Opiera się on na założeniu, że receptor pozostaje w stanie dynamicznej równowagi, zmieniając odwracalnie konformację ze stanu nieaktywnego w stan aktywny. To właśnie wiązanie cząsteczki leku z receptorem powoduje zmianę konformacji receptora ze stanu nieaktywnego w stan aktywny. Tylko receptor w stanie aktywnym może wywołać odpowiedź biologiczną.

Jednym z prostszych modeli jest opracowany przez Blacka i Leffa tzw. operacyjny model procesu oddziaływania lek-receptor, który można przedstawić równaniem:

gdzie: L - lek, R - receptor, k1 - stała szybkości (stała szybkości tworzenia kompleksu lek-receptor), k2 - stała dysocjacji kompleksu. Lek wiąże się z receptorem ze stałą szybkości k1.

Miarą skuteczności leku o cechach agonisty jest odpowiedź biologiczna (E), będąca częścią maksymalnej odpowiedzi biologicznej. Oryginalny model nie uwzględniał zjawiska aktywności konstytutywnej receptora (aktywności własnej receptora).

Rozwiązanie tego zagadnienia zostało zaproponowane przez Slacka i Halla w 2012 roku. Polegało ono na rozszerzeniu formuły o parametr określający zdolność receptorów do generowania spontanicznej aktywności. Skomplikowany w zapisie matematycznym wzór uwzględnia parametr ?, który charakteryzuje sygnał kompleksu aktywnego lek-receptor. Dla leków o charakterze agonistów wartość ? wynosi > 1, natomiast wartość ? = 1 definiuje neutralnych antagonistów, a wartość ? < 1 - leki o cechach odwrotnych agonistów.

Lek, który wykazuje zdolność do wiązania się z receptorem (czyli powinowactwo) oraz wywołuje odpowiedź funkcjonalną, wyzwalając efekt farmakologiczny, jest definiowany jako agonista. Związki o tych cechach naśladują zatem efekt endogennego agonisty i powodują aktywację ścieżek sygnałowych. Agonista, który wywołuje maksymalny efekt biologiczny, jest określany jako pełny agonista. Substancje wywołujące mniejszy efekt (maksymalna odpowiedź 30-40%) są określane mianem częściowych agonistów (ryc. 1.13). Przez antagonistów rozumie się substancje odwracające efekt działania agonisty. Większość leków konkuruje o miejsce wiązania w receptorze z endogennymi ligandami, co pozwala określić tego typu związki mianem antagonistów kompetycyjnych (np. nalokson jest antagonistą kompetycyjnym względem receptorów opioidowych).

RYCINA 1.13. Rodzaj i siła odpowiedzi biologicznej, uzależniona od poziomu aktywacji receptora, wynikającego z rodzaju liganda i jego stężenia molowego.

Przyjęto, że w przypadku braku endogennego agonisty białka receptorowe znajdują się w stanie "wyciszonym". Jednak część białek receptorowych jest zdolna do odpowiedzi biologicznej mimo braku endogennego liganda. Zjawisko to określa się mianem aktywności konstytutywnej. Aktywność ta powstaje w wyniku mutacji lub nadmiernej ekspresji. Mutacje receptorów, które powodują zwiększenie aktywności konstytutywnej, leżą u podłoża niektórych chorób dziedzicznych (m.in. przedwczesnego dojrzewania, nadczynności tarczycy). W przypadku gdy dochodzi do pogorszenia funkcji endogennego liganda, mamy do czynienia z odwrotnym agonistą. Leki o cechach odwrotnych agonistów obniżają aktywność konstytutywną receptora, wywołując efekt przeciwny do agonisty.

Z kolei związki o cechach neutralnych antagonistów znoszą działanie agonistów i odwrotnych agonistów, stabilizując aktywność własną i funkcję biologiczną receptora. Z klinicznego punktu widzenia mechanizmy działania odwrotnego agonisty i neutralnego antagonisty wymagają dalszych badań.

Lek rimonabant jest odwrotnym agonistą receptorów kanabinoidowych CB1 i w ten sposób zmniejsza łaknienie. Mechanizm ten jest równocześnie odpowiedzialny za niepożądane - prodepresyjne i prolękowe - działanie rimonabantu, co było przyczyną wycofania tego leku z obrotu.

1.5.Podział i budowa chemiczna receptorów

Mechanizm przekazywania informacji przez substancje sygnałowe jest złożony i wymaga udziału różnych receptorów i przekaźników. Receptory są wyspecjalizowanymi białkami odbierającymi sygnał ze środowiska zewnątrzkomórkowego i przekazującymi je do odpowiednich komórek efektorowych. Inaczej przebiega proces przekazania sygnału przy udziale receptorów błonowych, inaczej przy udziale kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Pod wpływem liganda dochodzi do zmian konformacyjnych białek receptorowych, np. przesunięcia ?-helis, co skutkuje przekazaniem sygnału do wnętrza komórki. Białka receptorowe można podzielić na związane z błoną komórkową oraz występujące wewnątrz komórki: w cytoplazmie oraz w jądrze komórkowym. Konsekwencją podziału białek receptorowych jest klasyfikacja odpowiadających im receptorów.

Podział receptorów uwzględnia trzy rodziny receptorów błonowych oraz rodzinę receptorów wewnątrzkomórkowych (ryc. 1.14):

- Receptory jonotropowe są receptorami błonowymi, bezpośrednio związanymi z kanałem jonowym; oddziałują z nimi neuroprzekaźniki, które gwarantują bardzo szybką odpowiedź. Czas uzyskania odpowiedzi po aktywacji tych receptorów jest mierzony w mili­sekundach. Do receptorów jonotropowych zalicza się receptory: NMDA, GABA-ergiczne, nikotynowe, serotoninowe 5-HT3.

- Receptory sprzężone z białkiem regulatorowym G (GPCR - G protein-coupled receptor) są również zlokalizowane w błonie komórkowej. Impuls powstający na błonie komórkowej w wyniku połączenia receptora z odpowiednim ligandem jest przekazywany do wnętrza komórki efektorowej, wywołując reakcję metaboliczną, najczęściej uwolnienie związku wysokoenergetycznego, czyli tzw. drugiego przekaźnika (np. cAMP), którego nagromadzenie skutkuje odpowiednim efektem metabolicznym. Dlatego receptory te są nazywane metabotropowymi. Czas uzyskania odpowiedzi po pobudzeniu tych receptorów jest mierzony w sekundach. Do tej grupy - najliczniejszej - należą m.in.: receptory adrenergiczne, dopaminowe, histaminowe, opioidowe, serotoninowe i adenozynowe. Klasycznym przykładem receptorów tej grupy jest receptor dla rodopsyny, barwnika wzrokowego pręcików, odpowiedzialny za przekazywanie energii fotonów światła i w konsekwencji wywołanie odpowiedniego efektu metabolicznego. Receptor rodopsynowy został wykrystalizowany jako pierwszy, a jego struktura, jako referencyjna, jest stosowana w badaniach tej klasy receptorów.

- Receptory błonowe o właściwościach katalitycznych są związane z enzymami, np. kinazą tyrozynową lub cyklazą guanylową. Połączenie z ligandem powoduje uczynnienie enzymu, wzrost szybkości odpowiedniej reakcji katalizowanej przez ten enzym i w konsekwencji efekt metaboliczny. Czas odpowiedzi po pobudzeniu tych receptorów jest mierzony w minutach. Przykładami tego rodzaju receptorów są receptory dla cytokin i dla czynników wzrostu oraz receptor insulinowy.

- Receptory wewnątrzkomórkowe występują w jądrze komórkowym lub w cytoplazmie. Są określane jako czynniki transkrypcyjne sterowane ligandami. Do tej grupy zalicza się receptory dla hormonów steroidowych: glikokortykosteroidów, hormonów płciowych i witaminy D3 oraz dla kwasów tłuszczowych.

RYCINA 1.14. Schemat budowy głównych klas receptorów: a - błonowe receptory jonotropowe; b - błonowe receptory metabotropowe (sprzężone z białkiem G); c - błonowe receptory o właściwościach katalitycznych; d - receptory wewnątrzkomórkowe.

1.5.1.Receptory jonotropowe sterowane (bramkowane) ligandami

Ważną rolę w funkcjonowaniu organizmu odgrywają zależne od neuroprzekaźnika błonowe receptory bezpośrednio połączone z kanałem jonowym. W przeciwieństwie do receptorów metabotropowych receptory te nie są związane ze szlakami drugich przekaźników. Po przyłączeniu leku o cechach agonisty dochodzi do zmian konformacyjnych białka, czego efektem jest otwarcie kanału jonowego. Umożliwia to napływ jonów: kationów (Ca2+, Na+, K+) lub anionów (Cl-). Receptory jonotropowe są zlokalizowane głównie w synapsach, jako miejscach wiązania niektórych neuroprzekaźników (acetylocholina, serotonina, kwas ?-aminomasłowy, nukleotydy purynergiczne).

Można wyróżnić receptory o budowie:

- pentamerycznej (np. nikotynowy receptor cholinergiczny, receptor serotoninowy 5-HT3, receptor GABA-A);

- tetramerycznej (np. receptory dla kwasu glutaminowego - NMDA i AMPA oraz receptory dla kwasu kainowego);

- trimerycznej (np. receptory purynergiczne typu P2X dla ATP).

Przykładem receptora jonotropowego jest nikotynowy receptor cholinergiczny, występujący w miejscu połączenia zakończenia nerwowego z komórką efektorową (mięśnia, gruczołu wydzielniczego). Ma on budowę pentameru, składającego się z dwóch podjednostek ? oraz podjednostek ?, ? i ?; masa tak powstałego oligomeru wynosi około 250 tys. Da (ryc. 1.15). Każda z podjednostek składa się z domeny zewnątrzkomórkowej, transmembranowej i wewnątrzkomórkowej. Domeny mają budowę ?-helikalną. Receptor ma kształt cylindryczny, a jego centralnym elementem jest kanał sodowy. Większa część receptora jest położona w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. W tym obszarze znajduje się miejsce wiążące dla właściwego liganda - acetylocholiny. Warunkiem koniecznym do otwarcia kanału jonowego jest przyłączenie dwóch cząsteczek agonisty do symetrycznie położonych podjednostek ?.

RYCINA 1.15. Schemat budowy nikotynowego receptora cholinergicznego. ACh - acetylocholina.

Pobudzenie receptora nikotynowego przez acetylocholinę (agonistę) skutkuje otwarciem kanału dla jonów sodowych. Czas otwarcia kanału jest krótki i uzależniony od rodzaju agonisty. Stężenie agonisty nie wpływa na czas otwarcia kanału. Inaczej jest z zamknięciem kanału - w tym przypadku stężenie agonisty determinuje czas zamknięcia kanału. Im większe stężenie, tym krótszy czas zamknięcia kanału. Napływ jonów Na+ prowadzi do depolaryzacji błony i zapoczątkowania potencjału czynnościowego. W konsekwencji dochodzi do uwolnienia jonów Ca2+ z magazynów wewnątrz włókien mięśniowych i w efekcie do skurczu mięśnia. Leki blokujące receptor nikotynowy wpływają na przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, powodując zwiotczenie mięśni gładkich i szkieletowych.

1.5.2.Receptory sprzężone z białkiem regulatorowym G (GPCR)

Jedną z najliczniejszych grup receptorów są receptory sprzężone z białkiem G (GPCR - G protein-coupled receptors), czyli tzw. receptory metabotropowe. Są to biopolimery składające się z 300-600 jednostek aminokwasowych. Charakteryzują się one obecnością siedmiu domen transmembranowych, które zwykle są zbudowane z 20-30 aminokwasów i przyjmują konformację ?-helisy. Helikalne łańcuchy polipeptydowe kilkakrotnie przenikają podwójną warstwę lipidową błony komórkowej.

W budowie receptora błonowego sprzężonego z białkiem G wyróżnia się (ryc. 1.16):

- domenę zewnątrzkomórkową, zawierającą fragment N-terminalny oligopeptydu z wolną grupą aminową (NH2) oraz 3 pętle zewnątrzkomórkowe, łączące wewnątrzbłonowe ?-helisy 2-3, 4-5 i 6-7;

- domenę wewnątrzbłonową (transbłonową), którą tworzy 7 segmentów ?-helikalnych;

- domenę wewnątrzkomórkową, zawierającą fragment C-terminalny oligopeptydu z wolną grupą karboksylową (COOH); w jej skład wchodzą także trzy pętle łączące helisy 1-2, 3-4 i 5-6.

RYCINA 1.16. Schemat budowy receptora sprzężonego z białkiem G.

1.5.2.1.Podział receptorów GPCR

Białka receptorowe należące do nadrodziny GPCR wykazują największe zróżnicowanie strukturalne. Pomimo zbliżonej topologii w obrębie domeny transmembranowej występują duże różnice w sekwencji N-terminalnego fragmentu zewnątrzkomórkowego i C-terminalnego fragmentu wewnątrzkomórkowego oraz w pętlach łączących poszczególne ?-helisy. Pełna charakterystyka i szczegółowy opis budowy poszczególnych receptorów GPCR nie są możliwe. Ze względu na specyfikę lokalizacji tych białek w błonie komórkowej tylko niewielka ich część została wykrystalizowana. Pierwszym białkiem, dla którego wyznaczono strukturę z zastosowaniem metod rentgenostrukturalnych, była rodopsyna. Kolejne lata umożliwiły poznanie różnic w budowie tych niezwykle ważnych białek zaangażowanych w kontrolę funkcjonowania organizmu.

Badania nad budową receptorów GPCR umożliwiły wyróżnienie trzech ich rodzin:

- rodziny A, do której zalicza się receptory dla rodopsyny i amin biogennych (adrenaliny, dopaminy, serotoniny, histaminy), a ponadto dla acetylocholiny i opioidów;

- rodziny B, do której zalicza się receptory dla kalcytoniny, oreksyny, glukagonu i parathormonu;

- rodziny C, do której zalicza się metabotropowe receptory glutaminergiczne i receptor GABA-B; warunkiem koniecznym do utworzenia funkcjonalnego receptora jest odpowiednio jego homo- lub heterodimeryzacja.

1.5.2.2.Ligandy ortosteryczne i modulatory allosteryczne

Elementem różnicującym receptory GPCR jest lokalizacja miejsca wiązania endogennego liganda w warunkach fizjologicznych, czyli miejsca ortosterycznego. W przypadku receptorów rodziny A miejsce ortosteryczne znajduje się w hydrofobowej domenie transmembranowej, a w przypadku receptorów rodziny B (oddziałujących z krótkimi peptydami) - w dużej pętli zewnątrzkomórkowej (ryc. 1.17). Miejsce ortosteryczne dla receptorów rodziny C, np. GABA-B, jest zlokalizowane w domenie zewnątrzkomórkowej, w której znajdują się dwa globularne fragmenty tworzące strukturę "zawiasu" (hinge region). Cząsteczki współzawodniczące z endogennymi ligandami o miejsce ortosteryczne nazywa się ligandami ortosterycznymi. Leki o cechach ligandów ortosterycznych charakteryzują się budową chemiczną zbliżoną do struktury endogennego liganda.

RYCINA 1.17. Schemat budowy receptorów GPCR klasy A-C, z uwzględnieniem różnej lokalizacji miejsca ortosterycznego (OBD) dla endogennych ligandów.

Stwierdzono, że wiele białek receptorowych oprócz miejsc ortosterycznych receptorów GPCR posiada dodatkowe miejsca wiązania ligandów. Każda inna lokalizacja wiązania liganda niż miejsce ortosteryczne jest określana mianem miejsca allosterycznego. Leki o cechach modulatorów allosterycznych, wiążąc się z miejscem allosterycznym, nie konkurują bezpośrednio z endogennym ligandem. Przez odrębną lokalizację miejsca wiązania modulatory allosteryczne zmieniają konformację białka i pośrednio wpływają na aktywność liganda ortosterycznego. Modulatory allosteryczne samodzielnie nie wywołują aktywacji receptora, ujawniają swoją aktywność tylko w obecności agonisty ortosterycznego. W zależności od obserwowanego efektu wyróżnia się pozytywne modulatory allosteryczne - tzw. PAM-y (positive allosteric modulators), tj. cząsteczki zwiększające aktywność ortosterycznego agonisty, oraz negatywne modulatory allosteryczne - tzw. NAM-y (negative allosteric modulators).

Odkrycie receptorów sprzężonych z białkiem G stanowiło przełom w zrozumieniu zasad transdukcji sygnału zewnątrzkomórkowego do wewnątrzkomórkowych układów efektorowych, odpowiedzialnych za kontrolę podstawowych procesów życiowych komórki.

1.5.2.3.Receptory GPCR - transdukcja sygnału

Funkcja receptorów GPCR polega na przenoszeniu sygnału wysyłanego przez substancje sygnalizacyjne z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do wnętrza komórki. Receptory GPCR nie oddziałują bezpośrednio na określone efektory. Sygnał jest przenoszony za pośrednictwem kaskad sygnalizacyjnych sprzężonych z białkiem receptorowym. Najogólniej szlaki sygnalizacji można podzielić na zależne od białek G oraz niezależne od białek G. W wyniku przyłączenia specyficznego liganda o cechach agonisty lub antagonisty powstaje kompleks aktywny lek-receptor, który aktywuje zmiany konformacyjne białka receptorowego. W konsekwencji tych zmian następuje m.in. przyłączenie białka G do specyficznych domen wewnątrzkomórkowych receptora, co w kolejnym etapie przekazywania sygnału uruchamia system efektorowy - enzym syntetyzujący wtórny przekaźnik (np. cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa, fosfolipaza C) lub kanał jonowy (np. potasowy bądź wapniowy).

Białka G należą do białek homologicznych złożonych z trzech podjednostek funkcjonalnych: ?, ? i ?. Podjednostka ? jest odpowiedzialna za wiązanie GTP i GDP, natomiast podjednostki ? i ? zakotwiczają białko G w błonie komórkowej (ryc. 1.18). Białko G przyłącza się do receptora GPCR w trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej, łączącej helisę 5 i 6 z C-terminalnym łańcuchem peptydowym. Procesem biochemicznym warunkującym transdukcję sygnału do układów efektorowych jest fosfo­rylacja fragmentu terminalnego receptora.

RYCINA 1.18. Transdukcja sygnału na przykładzie receptorów GPCR sprzężonych z białkami Gs (a) i Gq (b).

Rodzaj układu efektorowego białek G pozwala na dodatkową klasyfikację receptorów GPCR. Wyróżnia się cztery grupy białek G o właściwościach stymulujących i hamujących: Gs, Gi/Go, Gq oraz G12 (tab. 1.3). Mechanizm przekazywania sygnału wykorzystujący białka regulatorowe G umożliwia wzmacnianie sygnału, ponieważ gdy jedna cząsteczka liganda jest związana z receptorem, równocześnie może nastąpić aktywacja kilku pod­jednostek ?.

TABELA 1.3. Mechanizmy transdukcji sygnału dla wybranych receptorów sprzężonych z białkami G

Grupa białek G

Przykładowe receptory

Wtórny przekaźnik

Białka efektorowe

Efekt

Gs

Receptory ?

Receptory D1, D5

Receptory H2

Receptory 5-HT4, 5, 6, 7

Cyklaza adenylanowa ?

? cAMP ?

Ca2+

Kinaza białkowa A ?

ERK ?

p38 ?

Kanały L-Ca2+ ?

Glikoliza, glikogenogeneza, lipoliza, dodatni efekt inotropowy i chronotropowy, rozluźnienie mięśni gładkich, aktywność wydzielnicza

Gi

Receptory ?2

Receptory D2, 3, 4

Receptory GABAB

Receptory 5-HT1

Receptory H3

Receptory opioidowe

Cyklaza adenylanowa ?

? cAMP ?

K+

Kinaza białkowa A ?

Kanały K+ ?

Zahamowanie aktywności wydzielniczej, ujemny efekt inotropowy i chronotropowy

Gq

Receptory ?1

Receptory AT1

Receptory H1

Receptory M1, 3, 5

Fosfolipaza C ?

? IP3

DAG ?

Ca2+ ?

Kinaza białkowa C ?

Fosfolipaza D ?

Wydzielanie, skurcze mięśni gładkich

G12

Receptory 5-HT7

Modulacja wymieniacza jonowego Na+/H+

Transdukcja sygnału na przykładzie receptorów sprzężonych z białkami Gs

Zasadę złożonego mechanizmu transdukcji sygnału z udziałem błonowych receptorów metabotropowych można zobrazować na przykładzie receptora ?-adrenergicznego. W wyniku pobudzenia tego receptora przez adrenalinę zwiększa się powinowactwo białek typu Gs do guanozynotrifosforanu (GTP). Wymiana reszty guanozynodifosforanowej (GDP) na GTP skutkuje odłączeniem podjednostki ? białka regulatorowego Gs, która w kolejnym etapie aktywuje jednostkę katalityczną cyklazy adenylanowej (ryc. 1.18). Zmiana konformacji cyklazy adenylanowej jako enzymu wykonawczego nasila proces hydrolizy ATP do cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP), w efekcie czego zwiększa się jego stężenie w komórce (ryc. 1.19). W konsekwencji cAMP, pełniąc rolę wtórnego przekaźnika (przekaźnika II rzędu), aktywuje kinazę białkową A (PKA - protein kinase A) oraz zwiększa fosforylację czynników transkrypcyjnych, np. CREB. Niezależnie cAMP może uruchamiać wewnątrzkomórkowe kinazy aktywowane mitogenami, czyli kinazy MAP, m.in. ERK1 i ERK2. Powstające w wyniku procesu transdukcji sygnału nowe białka powodują zmianę odpowiedzi komórki na wysyłany sygnał, np. w reakcji strachu i walki, co prowadzi do zwiększenia szybkości procesu glikolizy i w efekcie do skurczu mięśnia sercowego.

RYCINA 1.19. Przemiana ATP do cAMP przy udziale cyklazy adenylanowej.

Badania ostatnich lat wskazują, że przekaźnictwo sygnału zależne od receptorów GPCR może przebiegać szlakami niezależnymi od białek G. Przykładem może być szlak ?-arestynowy, do którego aktywacji dochodzi w przypadku nadmiernej fosforylacji białka G przez PKA (ryc. 1.20). Wiązanie ?-arestyny następuje w miejscu częściowo odpowiadającym przyłączaniu się białka G. ?-Arestyna jest zaangażowania w proces internalizacji, tj. przejściowego zmniejszania liczby receptorów na powierzchni błony komórkowej (ryc. 1.20), oraz aktywuje białka sygnałowe uczestniczące w wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału.

RYCINA 1.20. Niektóre ścieżki transdukcji sygnału z udziałem receptora GPCR.

Wyniki badań biochemicznych wskazują, że różne ligandy białek GPCR, stabilizując odmienne konformacje tego receptora, mogą w sposób preferencyjny rekrutować białko G lub szlaki sygnalizacyjne niezależne od białka G (np. ?-arestynę). Co ważne, efekt aktywacji różnych ścieżek transdukcji sygnału, zależnych od tego samego receptora, może wywołać odmienne efekty biologiczne. Opisane zjawisko zostało nazwane selektywnością funkcjonalną (functional selectivity). Występowanie różnych białek sygnałowych zależnych od receptorów GPCR daje możliwość zaprojektowania ligandów stabilizujących konformacje receptora, które preferencyjnie aktywują białka G, ?-arestynę lub inne białka sygnałowe, co otwiera możliwość projektowania leków aktywujących wybrane szlaki sygnałowe. Takie ligandy określa się mianem stronniczych agonistów (biased agonists).

Pod wpływem endogennych ligandów i leków receptory podlegają złożonym mechanizmom krótko- i długo­terminowej kontroli. Zmiany adaptacyjne polegają na uwrażliwieniu (tzw. up-regulacji, up-regulation) lub desensytyzacji (tzw. down-regulacji, down-regulation) tych białek w określonych strukturach organizmu. Na przykład w wyniku długotrwałego stosowania odwrotnych agonistów lub antagonistów dochodzi do up-regulacji, czyli wzrostu liczby receptorów. Na skuteczność działania leku wpływają ponadto procesy internalizacji w endo­somach (ryc. 1.20).

Transdukcja sygnału na przykładzie receptorów sprzężonych z białkami Gq

Interakcja liganda z receptorem sprzężonym z białkiem Gq prowadzi do stymulacji kompleksu fosfolipazy C (PLC - phospholipase C complex) (ryc. 1.18b). Ta z kolei umożliwia hydrolizę 4,5-difosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP2) do dwóch wtórnych przekaźników - 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3) i diacyloglicerolu (DAG). IP3 indukuje w cytoplazmie uwalnianie jonów Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych (siateczka sarkoplazmatyczna). Natomiast DAG pozostaje w błonie plazmatycznej, gdzie odpowiada za aktywację kinazy białkowej C (PKC - phosphokinase K complex). W ten pośredni sposób DAG stymuluje transport jonów Ca2+ do komórek. Ze względu na kluczową rolę jonów Ca2+ jako wewnątrzkomórkowego przekaźnika główną rolą białek Gq jest kontrola procesów związanych ze skurczem mięśni gładkich i mięśnia sercowego.

1.5.3.Receptory błonowe o aktywności kinaz

Występowanie wielu stanów patologicznych wynika m.in. z nieprawidłowego poziomu fosforylacji białek. Proces fosforylacji jest kontrolowany przez specyficzne białka o charakterze enzymów, odpowiedzialne za dołączanie grup fosforanowych do innych białek, które nazwano kinazami. Ze względu na lokalizację kinazy można podzielić na zlokalizowane w błonie komórkowej oraz w cytozolu. Spośród nich receptory błonowe o aktywności kinaz tyrozynowych są najważniejszymi białkami regulującymi wzrost komórek i procesy kontrolowanej śmierci komórek. Receptory te mają budowę glikoprotein składających się z trzech fragmentów (ryc. 1.21):

- domeny zewnątrzkomórkowej, odpowiedzialnej za rozpoznanie i wiązanie liganda;

- domeny transmembranowej, pełniącej funkcję elementu kotwiczącego w błonie komórkowej (fragment ten nie uczestniczy w przekazywaniu sygnału);

- domeny wewnątrzkomórkowej, w obrębie której znajduje się część katalityczna o aktywności kinazy tyrozynowej.

RYCINA 1.21. Schemat budowy receptora błonowego o aktywności kinazy tyrozynowej.

Każda domena katalityczna kinaz ma miejsce wiążące ATP, który jest donorem grup fosforanowych, oraz miejsce wiążące substrat - białko. Odwracalny proces fosforylacji substratu (po jego uprzednim połączeniu z domeną wewnątrzkomórkową) jest cechą charakterystyczną tej klasy receptorów. Reakcja ta polega na przeniesieniu reszty fosforanowej z cząsteczki ATP na resztę tyrozyny (receptory o aktywności kinaz tyrozynowych). Proces przeciwny do fosforylacji polega na odłączeniu grup fosforanowych i jest kontrolowany przez fosfatazy o aktywności enzymatycznej. Drugą grupę stanowią receptory o aktywności kinaz serynowo-treoninowych, w przypadku których grupa fosforanowa jest przenoszona na resztę seryny i treoniny.

Ligandami dla receptorów o charakterze kinaz związanych z receptorem błonowym są głównie hormony peptydowe, np. insulina, oraz czynniki wzrostu komórek, m.in. czynnik wzrostu fibroblastów (EGF - epidermal growth factor) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF - vascular endothelial growth factor). Przyłączenie liganda do domeny zewnątrzkomórkowej kinazy tyrozynowej inicjuje wiele procesów. Po pierwsze, w wyniku połączenia dwóch sąsiadujących receptorów dochodzi do homo- lub heterodimeryzacji, co pociąga za sobą zmiany konformacyjne i stabilizację struktury receptorów. Kolejnym etapem, po utworzeniu dimeru, jest autofosforylacja lub fosforylacja substratów w miejscu katalitycznym. Aktywowane w wyniku fosforylacji reszty tyrozynowej białko receptorowe uruchamia skomplikowaną kaskadę wewnątrzkomórkowych "przełączników" o charakterze kinaz, docelowo modyfikujących szlaki przekaźnictwa sygnału do jądra komórkowego (ryc. 1.22). Rezultatem tego skomplikowanego procesu jest zmiana ekspresji genów, modyfikująca funkcje komórek i prowadząca do syntezy nowych białek.

RYCINA 1.22. Mechanizmy transdukcji sygnału zależne od receptorów błonowych o charakterze kinaz tyrozynowych. Miejsca interwencji dla przeciwciał monoklonalnych oraz małocząsteczkowych inhibitorów kinaz.

W przekazywanie sygnału są zaangażowane cytoplazmatyczne białka sygnałowe, m.in. fosfotaza C? (PLC?), kinaza-3 fosfatydyloinozytolu (PI3K), kinazy szlaku Ras/Raf oraz zależna od tych ostatnich kaskada kinaz MAP. Kinazy MAP należą do enzymów o charakterze kinaz serynowo-treoninowych, a ich aktywacja w procesie fosforylacji białek niższego rzędu prowadzi do aktywacji kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK - extracellularly regulated kinases). Szlak kinaz ERK jest odpowiedzialny za aktywację czynników transkrypcyjnych w jądrze komórkowym. Niezależnie sprzężone z kinazami tyrozynowymi tzw. kinazy janusowe (JAK - Janus-activated kinases) uczestniczą w kontroli procesu zapalnego i różnicowania komórkowego.

Aktywacja kinaz tyrozynowych przez czynniki wzrostu może w sposób niezależny od szlaków kinaz Ras/Raf i MAP bezpośrednio regulować czynniki transkrypcyjne oraz wpływać na transkrypcję genów. Proces ten przebiega za pośrednictwem aktywatorów transkrypcji - czynników transkrypcyjnych STAT.

Z terapeutycznego punktu widzenia modyfikowanie mechanizmów inicjowanych przez czynniki wzrostu i modulowanych przez receptorowe kinazy tyrozynowe, w szczególności procesy fosforylacji, jest ważnym elementem regulacji transkrypcji genów i syntezy białek. W konsekwencji leki modyfikujące funkcję receptorów o aktywności kinaz tyrozynowych, tzn. przeciwciała monoklonalne i inhibitory małocząsteczkowe, są ważną grupą środków stosowanych w leczeniu chorób o podłożu zapalnym i nowotworowym.

1.5.4.Receptory jądrowe jako cele działania leków

Receptory jądrowe są białkami o zbliżonej budowie, które wpływając na proces transkrypcji genów, odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek organizmu - różnicowaniu, podziale i śmierci komórkowej. Sterowanie ekspresją genów następuje na drodze zróżnicowanych mechanizmów przekazywania sygnału z zewnątrz komórki, przy udziale receptorów zlokalizowanych w błonie komórkowej i cytoplazmatycznych szlaków transdukcji sygnału. Ponadto funkcja receptorów jądrowych może być bezpośrednio modyfikowana przez substancje o właściwościach hydrofobowych, oddziałujących w jądrze komórkowym.

Rozpoznanie ludzkiego genomu pozwoliło na opisanie około 50 receptorów jądrowych, a dla prawie połowy z nich znaleziono specyficzne ligandy. Do klasycznych ligandów receptorów jądrowych zalicza się glikokortykosteroidy, mineralokortykosteroidy, estrogeny oraz analogi witaminy D3. Ze względu na brak specyficznych ligandów pozostałe receptory jądrowe mają status receptorów "sierocych" (orphan receptors).

Receptory jądrowe są dużymi monomerycznymi makromolekułami zbudowanymi z 400-1000 reszt aminokwasowych. Analiza budowy receptorów jądrowych pozwala wyróżnić cztery niezmienne i niezależne funkcjonalnie fragmenty: domenę modulatorową (A/B), znajdującą się we fragmencie N-terminalnym, domenę wiążącą specyficzne sekwencje DNA (rejon C), region zawiasowy (D) oraz domenę wiążącą ligand (E/F), zlokalizowaną we fragmencie C-terminalnym (ryc. 1.23).

RYCINA 1.23. Schemat budowy i model aktywacji receptora jądrowego: a - ogólna struktura uwzględniająca domeny; b - ogólny mechanizm działania receptorów jądrowych. Ligandy wiążą się z DWL (domeną wiążącą ligand) w cytoplazmie i przemieszczają się do jądra. Następnie DWD (domena wiążąca DNA) receptora jądrowego wiąże się kompleksem dimerycznym i rekrutuje odpowiednie koaktywatory lub korepresory. W konsekwencji następuje transkrypcja genów docelowych.

Domena regulatorowa zawiera specyficzny motyw AF-1 (activating function 1), który jest odpowiedzialny za aktywację transkrypcji, niezależnie od przyłączonego liganda. W obrębie tego fragmentu znajdują się także elementy odpowiedzialne za specyfikę tkankową receptora oraz możliwość łączenia specyficznych kofaktorów i promotorów procesu translacji. Domenę wiążącą DNA (C) tworzą dwa elementy tzw. palca cynkowego. Jest to fragment najbardziej konserwatywny w budowie receptora. Domena C umożliwia dimeryzację receptora, prowadzącą do powstania homo- lub heterodimerów, oraz przyłączenie kompleksu ligand-receptor do domeny wiążącej DNA. Domena wiążąca ligand jest najmniej konserwatywna. Tworzy ją od 11 do 13 ?-helis, w których strukturze występuje charakterystyczny motyw AF-2, odpowiedzialny za aktywację transkrypcji zależnej od przyłączonego liganda.

Warunkiem prawidłowego działania receptorów jądrowych jest modyfikacja struktury białka, jaką jest chromatyna. W ten proces są zaangażowane enzymy odpowiedzialne za acetylację/deacetylację reszt lizyny w strukturze histonów, tj. acetylotransferaza i deacetylotransferaza histonów. Przyłączenie liganda do receptora skutkuje zmianami konformacyjnymi, które umożliwiają połączenie motywu AF-2 z koaktywatorami. To właśnie koaktywatory, zwiększając aktywność acetylazy histonowej, przyczyniają się do rozluźnienia chromatyny. W konsekwencji chromatyna staje się bardziej podatna na działanie czynników transkrypcyjnych i polimerazy DNA. Przeciwny efekt obserwuje się w przypadku braku liganda. Receptory pozbawione liganda, wiążąc się z korepresorami, aktywują deacetylazy histonowe, czego skutkiem jest zwiększenie upakowania chromatyny i wyciszenie procesów transkrypcji genów.

Ligandami receptorów jądrowych są związki o charakterze hydrofobowym wykazujące zdolność dyfuzji przez błony biologiczne i błony jądrowe. Do tej grupy ligandów receptorów jądrowych oprócz wymienionych hormonów steroidowych zalicza się także kwasy tłuszczowe, cholesterol i kwasy żółciowe. Substancje te oddziałują w sposób specyficzny z receptorami aktywowanymi przez proliferujące peroksysomy (PPAR - peroxisome proliferator-activated receptor) i wątrobowy receptor X (LXR - liver X receptor). Receptory te są zaangażowane w kontrolę biosyntezy i metabolizmu lipidów. Do substancji oddziałujących z innym typem receptorów jądrowych należy zaliczyć hormony tarczycy - trijodotyroninę i tyroksynę, retinoidy oraz niektóre ksenobiotyki z grupy pochodnych kwasu barbiturowego.

Zaprezentowane powyżej elementy teorii receptorowego działania leków dotyczą ogólnych zasad funkcjonowania receptorów i ich podstawowej funkcji, jaką jest udział w wywoływaniu efektów biologicznych (farmakologicznych). Klasyfikacja receptorów obejmuje ich podstawowe rodzaje. Mechanizmy działania leków przedstawione na przykładach poszczególnych receptorów nie uwzględniają wszystkich typów celów biologicznych o budowie receptorowej. Zostaną one omówione w poszczególnych rozdziałach podręcznika.

1.5.5.Kanały jonowe zależne od potencjału jako cele działania leków

Znaczącą rolę w funkcjonowaniu poszczególnych tkanek organizmu odgrywają kanały jonowe regulowane potencjałem błony komórkowej. Kanały zależne od potencjału pełnią bardzo istotną funkcję w komórkach nerwowych i mięśniowych.

W warunkach fizjologicznych, w stanie spoczynku, błona komórkowa jest spolaryzowana, jej powierzchnia zewnętrzna jest obdarzona ładunkiem dodatnim, a wewnętrzna ujemnym. Kanały jonowe regulują przepływ jonów przez błony biologiczne i wykazują wybiórczość względem określonego jonu. W stanie spoczynku kanały są zamknięte. Duża różnica w stężeniu jonów między środowiskiem zewnątrzkomórkowym a cytoplazmą sprawia, że będący następstwem otwarcia kanałów dla określonego jonu wzrost ich stężenia w cytoplazmie staje się impulsem do uruchomienia licznych procesów biochemicznych, m.in. skurczu mięśni gładkich.

Białka, jako podstawowy element budowy chemicznej kanałów jonowych, charakteryzują się zbliżoną budową. Składają się z kilku domen transbłonowych, których hydrofilowe reszty aminokwasowe tworzą kanał ułatwiający transport jonów przez hydrofobową błonę komórkową. Przepuszczalność kanału jest zwykle ograniczona do określonego rodzaju jonu - można mówić o kanałach selektywnych dla kationów sodu, potasu i wapnia oraz dla anionów chlorkowych. Dzięki obecności w strukturze kanału tzw. bramek, kanały mają zdolność regulacji szybkości przepływu jonów. Proces regulacji szybkości przepływu jonów nazywa się bramkowaniem.

Przykładem kanału jonowego mającego duże znaczenie terapeutyczne dzięki swojemu udziałowi w regulacji kurczliwości mięśnia sercowego i napięcia naczyń krwionośnych jest wapniowy kanał jonowy typu L. Jest on aktywowany wysokim potencjałem i charakteryzuje się dużym przewodnictwem. Kanał typu L jest integralnym białkiem błonowym, glikoproteiną składającą się z pięciu podjednostek: ?1 odpowiada za tworzenie kanału dla jonów, ?2, ? i ? - za stabilność konformacyjną, natomiast ?2 i ? - za funkcje regulacyjne (ryc. 1.24).

RYCINA 1.24. Schemat budowy kanału wapniowego. B - bramka regulująca przepływ jonów Ca2+.

Elementem centralnym jest podjednostka ?1, która składa się z czterech domen, a każda z tych domen - z sześciu segmentów transmembranowych. Ze względu na obecność protonowanej lizyny lub argininy w konserwatywnej pozycji czwartej domeny obszar ten jest tzw. bramką potencjału. Właściwy kanał jest uformowany przez cztery zewnątrzkomórkowe pętle między segmentem 5 i 6 każdej domeny. Na skutek zmiany potencjału błony komórkowej dochodzi do zwiększenia przepływu jonów Ca2+ przez kanał. Podjednostki ?1 i ? są substratami dla fosfokinazy aktywowanej cAMP. Zwiększenie napływu jonów Ca2+ następuje także w wyniku fosforylacji podjednostek ?1 i ? oraz zmiany konformacji kanału wapniowego.

Przykłady leków oddziałujących na transport jonów przez błony, z uwzględnieniem rodzaju kanału, podano w tabeli 1.4.

TABELA 1.4. Przykłady leków wpływających na transport jonów przez błony

Kanał jonowy

Leki

Napięciowozależne kanały sodowe

Miejscowo znieczulające (lidokaina, bupiwakaina), przeciwarytmiczne (chinidyna, prokainamid)

Napięciowozależne kanały potasowe

Amiodaron

Kanały potasowe zależne od ATP

Pochodne sulfonylomocznika

Kanały wapniowe

Nifedypina, werapamil

1.5.6.Enzymy jako cele działania leków

Enzymy, będące białkami o właściwościach biokatalizatorów, są zaangażowane w kontrolę wielu istotnych procesów biochemicznych komórek tkanek i narządów, stanowiąc ważny cel biologiczny dla leków. W odróżnieniu od białek receptorowych enzymy można stosunkowo łatwo wyizolować w postaci krystalicznej. W budowie enzymów można wyróżnić centrum katalityczne oraz zlokalizowane poza tą domeną fragmenty regulatorowe, stanowiące miejsca wiążące dla substratów i jonów regulujących aktywność enzymu. Badania nad funkcjonowaniem organizmu wykazały, że reakcje hydrolizy, utleniania, redukcji i fosforylacji mają ogromne znaczenie w kontroli funkcji poszczególnych komórek. Reakcje enzymatyczne są kluczowe dla biosyntezy i rozkładu substancji o budowie neuroprzekaźników, węglowodanów, lipidów i hormonów.

Z terapeutycznego punktu widzenia preferowane są reakcje katalizowane przez enzymy, zachodzące z określoną szybkością i wydajnością jako reakcje podlegające podstawowemu prawu dotyczącemu reakcji odwracalnych, czyli prawu działania mas. Kontrola aktywności enzymów przez leki, spowodowana połączeniem się leku w centrum aktywnym enzymu, jest najczęściej reakcją odwracalną. Trwała blokada centrum aktywnego enzymu powoduje czasową eliminację jego funkcji katalitycznej, dlatego w farmakoterapii z zastosowaniem inhibitorów enzymatycznych często wykorzystuje się strategię kontroli wiązań z definicji traktowanych jako nietrwałe, np. wiązania estrowego czy amidowego. Leki modyfikujące funkcję enzymów znalazły zastosowanie m.in. w leczeniu chorób: psychiatrycznych, nowotworowych, o podłożu zapalnym i układu sercowo-naczyniowego.

Leki ograniczające możliwość wiązania się substratu do centrum aktywnego enzymu są określane mianem inhibitorów enzymatycznych. Substancje konkurujące w centrum aktywnym (katalitycznym) z endogennie występującym ligandem określane są jako inhibitory kompetycyjne. Mechanizm działania inhibitorów niekompetycyjnych polega na wiązaniu się w alternatywnym miejscu aktywnym enzymu (niekatalitycznym) i zmianie konformacji białka. Inhibitory niekompetycyjne, zmieniając strukturę enzymu, uniemożliwiają przyłączenie się endogennego substratu (ryc. 1.25).

RYCINA 1.25. Zasada działania inhibitorów enzymatycznych - inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.

Sposób oddziaływania leków w centrum wiążącym enzymu jest opisywany za pomocą wiązań chemicznych zaprezentowanych wcześniej, na przykładzie receptorów GPCR, tzn. wiązań typu mostków solnych (oddziaływań jonowych), mostków wodorowych, oddziaływań van der Waalsa oraz oddziaływań ?-elektronowych. W przypadku interakcji z białkami enzymatycznymi ważnym typem oddziaływań są wiązania kowalencyjne. Tworzenie tych wiązań jest cechą charakterystyczną inhibitorów nieodwracalnych. W przeciwieństwie do inhibitorów odwracalnych reaktywacja funkcji enzymatycznych następuje dopiero po odtworzeniu nowej puli enzymu. Porównując skuteczność inhibitorów enzymatycznych, należy uwzględnić nie tylko wartość stałej inhibicji IC50 (inhibition constance), tj. stężenie inhibitora, przy którym dochodzi do 50-procentowego zahamowania aktywności enzymu, lecz także czas dysocjacji liganda od enzymu.

Przykłady leków mających cechy inhibitorów enzymatycznych i oddziałujących z białkami enzymatycznymi podano w tabeli 1.5.

TABELA 1.5. Przykłady leków mających cechy inhibitorów enzymatycznych

Enzym

Lek

Typ inhibicji

Acetylocholinoesteraza

Donepezyl

Odwracalny

Kinaza Bcr-Abl

Imatynib

Odwracalny

Kinaza naskórkowego czynnika wzrostu

Afatynib

Nieodwracalny

Kinaza tyrozynowa Brutona

Ibrutynib

Nieodwracalny

1.6.Losy leku w organizmie (ADME)

Budowa chemiczna leku nie tylko wpływa na właściwości farmakodynamiczne, czyli sposób oddziaływania leku z celem biologicznym (efekt farmakologiczny), lecz także determinuje wiele procesów farmakokinetycznych (losy leku w organizmie), ściśle związanych z działaniem leku i jego wartością terapeutyczną, w tym wchłanianie, rozmieszczenie, metabolizm i wydalanie (ADME - absorption, distribution, metabolism, excretion). Powyższe procesy są powiązane z właściwościami fizykochemicznymi leku i odzwierciedlają zakres przemian chemicznych, jakim leki podlegają w organizmie (tab. 1.6).

TABELA 1.6. Procesy opisujące losy leku w organizmie

Wchłanianie

Transfer leku z miejsca podania do płynów krążących w organizmie (kompartment centralny). W wyniku absorpcji po podaniu doustnym lek przenika przez nabłonek odcinka żołądkowo-jelitowego przewodu pokarmowego do krwiobiegu

Dystrybucja

Transport leku z płynów krążących organizmu do tkanek i narządów (kompartmenty obwodowe)

Metabolizm

Biotransformacja leku do postaci nieaktywnej lub aktywnego metabolitu zachodzi w wyniku modyfikacji cząsteczki pod wpływem endogennych układów enzymatycznych, obejmujących reakcje I fazy (utlenianie, redukcja, hydroliza, dealkilowanie) oraz reakcje II fazy (sprzęganie z aktywnymi kwasami: octowym, glukuronowym, siarkowym, aminokwasem). Jeżeli lek jest metabolizowany przed osiągnięciem krążenia ogólnoustrojowego, uznaje się, że podlega on intensywnemu efektowi pierwszego przejścia

Wydalanie

Usunięcie leku z organizmu odbywa się głównie z moczem, kałem, żółcią, potem lub z wydychanym powietrzem. Procesy metabolizmu i wydalania są określane łącznie jako eliminacja. Lek może być wydalany również w stanie niezmienionym

Podczas a­nalizy losów leku przyjmowanego drogą doustną wymienione wyżej procesy należy rozszerzyć o etap uwolnienia (liberation) substancji czynnej z postaci farmaceutycznej (np. tabletki, kapsułki). Stosowany powszechnie akronim ADME zmienia się wówczas w LADME. W zależności od właściwości fizykochemicznych po podaniu doustnym lek wchłania się z błony śluzowej jamy ustnej, w żołądku lub w jelicie, aby po przejściu przez naczynia włosowate osiągnąć krążenie ogólnoustrojowe (kompartment centralny). Na tym etapie może nastąpić wiązanie leku z białkami osocza, a frakcja wolna jest dystrybuowana do tkanek (kompartmentów obwodowych).

Leki działające w obrębie ośrodkowego układu nerwowego wykazują dodatkowo zdolność do przenikania przez barierę krew-mózg. Proces dystrybucji można śledzić na podstawie kilku podstawowych parametrów farmakokinetycznych. Czas maksymalny (Tmax) to czas konieczny do osiągnięcia przez lek maksymalnego stężenia w osoczu, a okres półtrwania (t1/2) to czas, w którym stężenie leku w osoczu zmniejsza się do połowy wartości maksymalnej. Proces wydalania leku można opisać za pomocą klirensu ogólnoustrojowego, definiowanego jako objętość osocza, z której lek jest eliminowany w jednostce czasu. Pole powierzchni pod krzywą (AUC - area under the curve), opisujące zależność stężenia leku w organizmie w funkcji czasu, jest miarą ekspozycji organizmu na działanie leku. Biodostępność, wyrażoną jako %F, czyli procent dawki, jaka ulega wchłonięciu po podaniu doustnym, wyznacza się na podstawie proporcji AUC uzyskanego po podaniu doustnym i po podaniu dożylnym.

Na podstawie tzw. hipotezy wolnego leku (dawka leku niezwiązana z białkami lub lipidami) można założyć, że stężenie wolnego leku jest takie samo we wszystkich kompartmentach: w osoczu i w tkankach (docelowym miejscu działania). Jednak to założenie nie uwzględnia bariery przepuszczalności błon biologicznych i transportu aktywnego - mechanizmu uniemożliwiającego uzyskanie równowagi po dwóch stronach błony biologicznej. Do wyjątków od reguły definiującej zależność efektu farmakodynamicznego leku od jego frakcji wolnej, oddziałującej z celem biologicznym, należą m.in. leki w sposób nieodwracalny blokujące aktywność celu biologicznego (bardzo silnie wiążące się z celem biologicznym i ulegające bardzo powolnej dysocjacji z tego połączenia). Z innym wyjątkiem mamy do czynienia w przypadku gromadzenia się leku w dodatkowych kompartmentach tkankowych, np. w tkance tłuszczowej.

1.6.1.Wchłanianie i transport leków przez błony biologiczne

Budowa chemiczna i właściwości fizykochemiczne substancji determinują ich wchłanianie oraz transport przez błony biologiczne. Transport leku przez błony na ogół jest uzależniony od jego rozpuszczalności w lipidach i płynach ustrojowych, wielkości cząsteczek związku i stopnia jego jonizacji. Na wchłanianie leku wpływają droga jego podania, pH środowiska oraz struktura i właściwości błon biologicznych, które lek ma pokonać. Odpowiednie właściwości hydro- i lipofilowe są warunkiem koniecznym, umożliwiającym osiągnięcie celu biologicznego, zarówno zlokalizowanego w błonie biologicznej, jak i w jądrze komórkowym (np. receptory jądrowe), oraz przenikanie leków do ośrodkowego układu nerwowego. Wchłanianie cząsteczek o niskiej masie molowej zależy od stopnia ich polarności. Leki o właściwościach polarnych słabo wchłaniają się z przewodu pokarmowego. Z kolei leki o budowie peptydowej (np. insulina, hormon wzrostu), ulegając rozkładowi w przewodzie pokarmowym pod wpływem peptydaz, wymagają alternatywnych dróg podania (dożylnej, wziewnej).

Większość leków jest transportowana w organizmie przez błony biologiczne na zasadzie dyfuzji biernej. Proces ten polega na przenikaniu niezjonizowanych cząsteczek leku, rozpuszczonego w warstwie wodnej, przez półprzepuszczalną podwójną błonę lipidową do fazy wodnej przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Cząsteczki przenikają zgodnie z gradientem stężeń, a o szybkości tego procesu decyduje rozpuszczalność leku w lipidach. Zwykle cząsteczki o małej masie dyfundują łatwiej niż te o dużej masie molowej. Proces ten zachodzi bez wydatku energetycznego. Budowa błon biologicznych determinuje zatem wymagania stawiane cząsteczkom o właściwościach lekopodobnych. Podstawowym parametrem określającym preferencję leku do fazy lipidowej, czyli hydrofobowość, jest współczynnik podziału P. Jest on definiowany jako iloraz stężenia substancji w 1-oktanolu i jej stężenia w wodzie. Im wyższy ten współczynnik, tym większe powinowactwo leku do błon biologicznych. O właściwościach hydrofobowych (lipofilowych) cząsteczek decyduje podstawowy szkielet strukturalny, rodzaj podstawników oraz rozkład ładunków elektrycznych w cząsteczce. Rozpuszczalność leków w płynach ustrojowych jest ponadto uzależniona od stopnia dysocjacji. Ładunek elektryczny powstających jonów sprawia, że rozpuszczalność w wodzie tych cząsteczek jest znacznie lepsza w porównaniu z cząsteczkami pozbawionymi ładunku (obojętnymi).

Większość leków ma charakter słabych elektrolitów, ulegających w roztworach wodnych częściowej dysocjacji. Wielkość frakcji leku występującej w formie niezjonizowanej w roztworze zależy od stałej dysocjacji leku oraz od odczynu (pH) środowiska, z którego lek jest wchłaniany. Stała dysocjacji dla słabych kwasów i słabych zasad jest często wyrażana jako pKa (ujemny logarytm ze stałej dysocjacji Ka). Jonizację słabych kwasów (HA) opisuje równanie Hendersona-Hasselbalcha:

pH - pKa = log [zdysocjowany]/[niezdysocjowany]

Zgodnie z powyższymi założeniami większość leków o właściwościach słabych kwasów (pKa > 3) występuje w formie niezjonizowanej przy niskich wartościach pH. Leki te są wchłaniane z kwasowego środowiska żołądka. Z kolei leki o właściwościach słabych zasad nie wchłaniają się w żołądku, gdyż przy pH 1-2 występują w formie zjonizowanej. Leki o właściwościach słabych zasad (pKa ? 8) zwykle wchłaniają się przy pH panującym w jelitach. W jelicie cienkim (pH 6-7) leki te występują w postaci niezjonizowanej. Leki o właściwościach silnych zasad pKa > 11 są zjonizowane w całym przewodzie pokarmowym i zwykle wchłaniane w małym stopniu.

Związki o właściwościach hydrofilowych trudno przenikają przez błony biologiczne, dlatego ich transport przez błony odbywa się na zasadzie transportu wspomaganego przez specyficzne nośniki (transport aktywny), tj. przy wykorzystaniu energii pochodzącej z rozkładu ATP. Transport aktywny przebiega wbrew gradientowi stężeń leku po obu stronach błony.

Leki o charakterze silnych elektrolitów, np. IV-rzędowe sole amoniowe, na ogół trudno wchłaniają się z przewodu pokarmowego. Ich transport w organizmie odbywa się na zasadzie transportu przez pary jonowe. Jest to wyjątkowy rodzaj dyfuzji biernej, występujący po uprzednim połączniu fragmentu kationowego leku z dużym anionem organicznym i wytworzeniu cząsteczki pozbawionej ładunku.

Spośród pozostałych parametrów fizykochemicznych warunkujących przenikanie leku przez błony biologiczne na uwagę zasługuje powierzchnia polarna. W przypadku leków działających w obrębie ośrodkowego układu nerwowego powierzchnia polarna cząsteczki nie powinna przekraczać 90 ?. Nie bez znaczenia jest liczba pierścieni aromatycznych występujących w cząsteczce. Im większa ich liczba, tym bardziej wzrasta prawdopodobieństwo niskiej rozpuszczalności związku.

1.6.2.Dystrybucja i wiązanie leku z białkami osocza krwi i tkanek

Po osiągnięciu krążenia ogólnoustrojowego lek jest transportowany do narządów i tkanek. Jednym z czynników wpływających na dystrybucję leku do narządów i tkanek jest jego wiązanie z białkami osocza. Proces ten ma charakter odwracalny i jest determinowany parametrami fizykochemicznymi leku. Stopień wiązania z białkami osocza wpływa nie tylko na dystrybucję, lecz także na szybkość wystąpienia i czas trwania efektu farmakologicznego oraz metabolizm i eliminację leku. Tylko wolna frakcja leku jest transportowana przez błony biologiczne, przenika do tkanek i oddziałuje z celem biologicznym, podlegając jednocześnie przemianom metabolicznym. Leki wiążące się w dużym stopniu z białkami osocza zwykle działają dłużej. Wysoki stopień wiązania leku z białkami obniża przy tym ryzyko intensywnej biotransformacji.

Szczególne znaczenie w wiązaniu leków odgrywają albuminy. Białka te stanowią blisko 60% wszystkich białek osocza. Leki o charakterze kwasowym (np. fenylobutazon) wiążą się z albuminami, natomiast w wiązaniu leków o charakterze zasadowym (np. propranololu) ważną rolę odgrywają ?1-glikoproteina i lipoproteiny. Stopień wiązania z białkami zależy nie tylko od właściwości fizykochemicznych leku, lecz także od zdolności białka do tworzenia kompleksów. Oddziaływanie z białkami osocza odbywa się zwykle przy udziale wiązań o charakterze mostków solnych, sił van der Waalsa i wiązań wodorowych. Stopień wiązania z białkami jest właściwością charakterystyczną każdego leku. Analizując sposób wiązania leków z białkami, należy zwrócić uwagę na różnice wiązania odmian enancjomerycznych leków. Stereoselektywność wiązania dotyczy leków zarówno wiążących się z albuminami, jak i ?1-glikoproteiną.

1.6.3.Biotransformacja leków

Większość leków ulega biotransformacji w wyniku przemian zachodzących w organizmie. Zasadniczo proces ten polega na przeprowadzeniu leków w bardziej hydrofilne metabolity, co ułatwia ich wydalanie z organizmu (z moczem lub żółcią). Produkty metabolizmu są zwykle mniej aktywne niż macierzyste leki i mogą być zupełnie pozbawione aktywności. Wykazano, że niektóre leki są metabolizowane do reaktywnych produktów pośrednich, wykazujących toksyczne działanie względem różnych narządów. W szerszym ujęciu należy podkreślić, że te same procesy enzymatyczne zaangażowane są w biotransformację leków i endogennie występujących związków biologicznie aktywnych - neuromediatorów, hormonów i witamin.

Reakcje metaboliczne są katalizowane przez enzymy produkowane w komórkach miąższowych wątroby i płuc, w osoczu, nerkach oraz w przewodzie pokarmowym. Parametrem charakteryzującym stabilność metaboliczną leku jest jego okres półtrwania w osoczu. Metabolizm leku ściśle warunkuje czas jego działania. Kierunek zmian zachodzących pod wpływem enzymów jest ściśle powiązany ze strukturą, drogą podania i dystrybucją leku do narządów oraz tkanek. Bardzo ważnymi czynnikami determinującymi przemiany są uwarunkowania fizjologiczne (wiek, płeć, stan czynnościowy narządów) oraz czynniki genetyczne. Niektóre leki mogą podlegać przemianom do nieaktywnych metabolitów przed osiągnięciem krążenia ogólnoustrojowego. Przyczyną tego zjawiska jest intensywny metabolizm leku już na etapie wchłaniania w jelicie lub podczas pierwszego przejścia przez wątrobę. Proces ten nazywa się efektem pierwszego przejścia (first-pass effect). Pozwala określić ilość leku niedostępną dla organizmu po podaniu drogą doustną. Jest on bardzo charakterystyczny dla leków z grupy estrogenów i nitratów. Można go uniknąć, podając "kłopotliwe" leki w postaci podjęzykowej lub pozajelitowo.

Część leku, która nie została wchłonięta do krążenia systemowego, pozostaje w przewodzie pokarmowym i podlega przemianom pod wpływem mikroflory, głównie bakteryjnej. Drobnoustroje mogą modyfikować cząsteczki leku, produkując aktywne metabolity, a także związki o właściwościach toksycznych, które nie są wytwarzane w komórkach organizmu w stanie fizjologicznym, w warunkach wystarczającej podaży tlenu. Leki niepodlegające wchłanianiu z przewodu pokarmowego, tj. trudno rozpuszczalne w płynach ustrojowych, oraz elektrolity (np. IV-rzędowe sole amoniowe) są wydalane, głównie w postaci niezmienionej.

Szczególnym przypadkiem są substancje, które w wyniku przemian z udziałem systemów enzymatycznych przekształcane są w aktywne metabolity. Związki o takim charakterze nazywa się prolekami. Projektowanie proleków ma na celu wyeliminowanie "niedoskonałości" farmakokinetycznych i farmaceutycznych w praktyce klinicznej i dotyczy m.in. niskiej biodostępności leku, zwiększenia dystrybucji do docelowego miejsca działania leku, zwiększenia stabilności chemicznej, zmniejszenia toksyczności czy maskowania nieprzyjemnego zapachu/smaku substancji leczniczej. W celu poprawy rozpuszczalności leku często wprowadza się do cząsteczki łącznik alkilenowy, zawierający ugrupowanie fosforanowe lub siarczanowe. Uzyskuje się w ten sposób możliwość zwiększenia jonizacji w środowisku biologicznym. Otrzymywanie proleków najczęściej polega na modyfikowaniu grup funkcyjnych cząsteczek leków, głównie grupy alkoholowej, tiolowej i karboksylowej, które po przekształceniu do odpowiednich estrów i tioestrów zawierają wiązania kowalencyjne, względnie nietrwałe w warunkach reakcji katalizowanych przez specyficzne enzymy w procesach metabolicznych organizmu.

W tabeli 1.7 podano przykłady proleków stosowanych w farmakoterapii.

TABELA 1.7. Przykłady proleków stosowanych w farmakoterapii

Prolek

Aktywny metabolit

Typ wiązania w proleku

Zastosowanie

Loratadyna

Desloratadyna

Uretan (ester kwasu karbaminowego)

Choroby alergiczne

Molsydomina

Linsidomina

Sydnonimina

Choroby układu sercowo-naczyniowego

Enalapryl

Enalaprylat

Ester

Choroby układu sercowo-naczyniowego

Fosforan tedyzolidu

Tedyzolid

Ester

Choroby infekcyjne

Hemibursztynian metyloprednizolonu

Metyloprednizolon

Ester

Stany zapalne

Reakcje chemiczne zachodzące podczas biotransformacji umownie dzieli się na dwie fazy. Do reakcji I fazy zaliczane są m.in. reakcje utleniania, redukcji i hydrolizy. W wyniku tego typu przemian powstają metabolity zawierające grupy o charakterze polarnym - hydroksylowe, tiolowe, aminowe i karboksylowe. Leki o tak zmodyfikowanej strukturze są bardziej podatne na reakcje II fazy.

Do reakcji II fazy zalicza się procesy obejmujące reakcje sprzęgania (koniugacji) produktów powstałych w wyniku reakcji I fazy ze związkami występującymi endogennie, głównie z aktywnymi kwasami: octowym, glukuronowym i siarkowym oraz aminokwasami. Do reakcji II fazy zalicza się również przeniesienie metylu przez aktywną metioninę (S-adenozylometioninę), która po reakcji, np. z grupą aminową czy fenolową, przechodzi w S-adenozylohomocysteinę.

Produkty powstałe w wyniku przemian II fazy są zwykle rozpuszczalne w wodzie i mają charakter kwasowy, co jest gwarantem łatwości ich eliminacji przez nerki. Leki i ich metabolity dość często w procesie II fazy sprzęgają się z kwasem glukuronowym, produktem utlenienia glukozy na pierwszorzędowej grupie alkoholowej, z zachowaniem grupy aldehydowej w położeniu 1 cukru. Kwas glukuronowy posiada aktywną chemicznie grupę aldehydową, co determinuje przebieg wielu reakcji o charakterze kondensacji i addycji, charakterystycznych dla aldehydów. Cztery drugorzędowe grupy alkoholowe obecne w produkcie sprzęgania gwarantują jego bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie, a grupa karboksylowa w położeniu 6 glukuronidu warunkuje jego charakter kwasowy i efektywne wydalanie przez nerki z moczem. Niektóre metabolity fazy I wykazują aktywność farmakologiczną związku macierzystego, natomiast produkty przemian fazy II są najczęściej nieaktywne.

Zahamowanie procesów biotransformacji w wyniku upośledzenia funkcji enzymatycznych może prowadzić do wydłużenia procesu biotransformacji leku. Efektem tego może być wydłużenie czasu działania leku, powodujące pojawienie się lub nasilenie działań niepożądanych i efektów toksycznych. Stymulacja enzymów mikrosomalnych przez niektóre jednocześnie podane leki, zwane induktorami enzymatycznymi (np. fenobarbital), może zwiększać szybkość metabolizmu niektórych leków.

1.6.3.1.Przemiany metaboliczne I fazy

Enzymy metabolizujące - rodzina izoenzymów cytochromu P450

Najważniejszymi enzymami zaangażowanymi w reakcje utlenienia-redukcji I fazy są izoenzymy cytochromu P450. Enzymy te mają charakter monooksygenaz i są zlokalizowane w różnych komórkach. Cytochromy P450 należą do białek hemowych. Hem, stanowiący grupę prostetyczną cytochromu (CYP), zawiera w centrum aktywnym atom żelaza, który jest związany za pomocą wiązań koordynacyjnych z czterema atomami azotu pierścienia porfiryny i dwoma ligandami. Jednym z ligandów jest reszta cysteiny. Podstawową funkcją enzymów z rodziny CYP P450 jest kataliza reakcji utleniania związków. W tym procesie jeden z atomów cząsteczki tlenu jest wbudowywany w substrat (lek), a drugi ulega redukcji do cząsteczki wody. W skład układu katalitycznego wchodzą hemoproteina P450 i zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), jako donor elektronów:

Transfer elektronów z NADPH na cytochrom P450 zachodzi z udziałem flawoproteiny, reduktazy NADPH: cyto­chrom P450. Enzym ten zawiera dwie główne grupy prostetyczne: dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) i mononukleotyd flawinoadeninowy (FMN) (ryc. 1.26).

RYCINA 1.26. Schemat transportu elektronów z NADPH na cząsteczkę tlenu z udziałem nośników elektronów FAD i FMN, NADPH reduktazy cytochromu P450 oraz fragmentu porfirynowego cytochromu P450.

Izoenzymy cytochromu P450 biorą udział głównie w reakcjach I fazy metabolizmu leków, katalizując m.in.: utlenianie alkanów i związków aromatycznych, odpowiednio do alkoholi i fenoli, epoksydację alkanów, N-dealkilację amin drugo- i trzeciorzędowych, oksydatywną deaminację amin pierwszorzędowych, O-dealkilację, S-oksydację, N-oksydację oraz utlenianie (konwersję) amin do hydroksyloamin i nitrozoamin.

U ludzi występuje ponad 50 enzymów zależnych od cytochromu P450, które podzielono na podstawie homologii budowy strukturalnej na 51 rodzin. Enzymy te różnią się rozmieszczeniem w organizmie (ekspresją w tkankach) oraz aktywnością i specyfiką względem substratów. Enzymy rodzin 1-3 są zaangażowane w metabolizm leków i ksenobiotyków, pozostałe zaś uczestniczą w przemianach substancji endogennych (np. steroidów, kwasów tłuszczowych, prostaglandyn). W metabolizm leków są zaangażowane przede wszystkim izoenzymy CYP1A2, 2D6, 2C9, 2C19 i 3A4 (ryc. 1.27), ale najważniejszy jest izoenzym CYP3A4, uczestniczący w metabolizmie blisko 36% wszystkich leków. Największą zawartość izoenzymu CYP3A4 stwierdzono w komórkach wątroby i jelita cienkiego człowieka. Reakcje katalizowane przy udziale izoenzymów cytochromu P450 odgrywają ważną rolę w procesie nowotworzenia.

RYCINA 1.27. Izoenzymy cytochromu P450 w metabolizmie leków.

Jak już wspomniano, leki, ze względu na lokalizację enzymów metabolizujących w ścianie jelita, mogą być także metabolizowane przed osiągnięciem wątroby. Na szybkość metabolizmu leków wpływa zróżnicowanie genetyczne. Niemałe znaczenie w tzw. farmakokinetyce populacyjnej ma również wspomniane wyżej zjawisko indukcji enzymatycznej. Okazuje się, że niektóre leki i ksenobiotyki mogą zwiększać ekspresję izoenzymów metabolizujących. W konsekwencji leki indukujące ekspresję określonych izoenzymów przyspieszają metabolizm innych leków, obniżają ich stężenie i uniemożliwiają wywołanie oczekiwanego efektu farmakologicznego. Z przeciwnym zjawiskiem mamy do czynienia w przypadku inhibitorów enzymatycznych. Leki te, blokując aktywność określonego izoenzymu, zmniejszają lub hamują metabolizm innego leku, co może skutkować nasileniem efektu farmakologicznego, a w niektórych przypadkach także pojawieniem się efektu toksycznego.

Niezależnie od enzymów mikrosomalnych w biotransformacji leków, a w szczególności w utlenianiu, mogą uczestniczyć specyficzne enzymy, np. dehydrogenazy alkoholowe i aldehydowe, oksydaza ksantynowa oraz monoaminooksydaza (MAO) i diaminooksydaza.

Poniżej omówiono podstawowe przemiany, jakim ulegają leki w organizmie.

Hydroksylacja leków z podstawnikami alifatycznymi lub aromatycznymi

Przykładem produktu hydroksylacji jest 9-hydroksyrysperydon, będący metabolitem rysperydonu; wykazuje on profil aktywności macierzystego leku (ryc. 1.28).

RYCINA 1.28. Hydroksylacja rysperydonu.

Również diazepam, lek o działaniu przeciwlękowym, ulega hydroksylacji w położeniu 3, tworząc aktywny metabolit, który podobnie jak związek macierzysty znajduje zastosowanie w leczeniu zaburzeń lękowych (ryc. 1.29).

RYCINA 1.29. Hydroksylacja diazepamu.

Oksydatywna deaminacja

Procesy utlenienia leków zawierających I-rzędową grupę aminową przebiegają z jednoczesną deaminacją, prowadzącą do powstania odpowiednich aldehydów i ketonów (oksydatywna deaminacja), w zależności od rzędowości atomu węgla, z którym jest połączona grupa aminowa (ryc. 1.30).

RYCINA 1.30. Oksydatywna deaminacja na przykładzie alifatycznych amin I-rzędowych.

Przykładem tego procesu może być utlenianie noradrenaliny, które jest katalizowane przez monoaminooksydazy (MAO), enzymy niewystępujące w mikrosomach, katalizujące reakcje zachodzące w synapsach układu nerwowego (ryc. 1.31).

RYCINA 1.31. Utlenianie noradrenaliny przy udziale MAO.

Oksydatywne N- i O-demetylowanie

Procesy oksydatywnego demetylowania przebiegają z utworzeniem odpowiednich pochodnych hydroksymetylowych - produktów przejściowych, z których po eliminacji metanalu (aldehydu mrówkowego) powstają finalne produkty pozbawione grupy metylowej. W ten sposób II-rzędowe pochodne metyloaminy są transformowane do odpowiednich amin I-rzędowych, a pochodne metyloeterowe do odpowiednich alkoholi (ryc. 1.32).

RYCINA 1.32. Oksydatywne demetylowanie.

Przykładem procesu N-demetylowania może być utlenianie fluoksetyny, leku o aktywności przeciwdepresyjnej, do aktywnego metabolitu norfluoksetyny (ryc. 1.33).

W efekcie O-demetylowania wenlafaksyny również powstaje aktywny metabolit (demetylowenlafaksyna, deswenlafaksyna). Procesy te przebiegają przy udziale izoenzymów cytochromu P450. Wymienione leki znajdują zastosowanie w leczeniu zaburzeń depresyjnych (ryc. 1.34).

RYCINA 1.33. Oksydatywne N-demetylowanie fluoksetyny.

RYCINA 1.34. Oksydatywne O-demetylowanie wenlafaksyny.

N- i S-oksydacja

Związki zawierające w strukturze III-rzędowy atom azotu lub atom siarki sulfanowej podlegają procesowi utleniania do odpowiednich N-tlenków i sulfotlenków. Sulfotlenki mogą podlegać dalszemu utlenieniu do odpowiednich sulfonów. Niektóre produkty tego rodzaju utlenienia wykazują aktywność związków macierzystych i ze względu na korzystne właściwości (często niższą toksyczność) mogą być stosowane jako alternatywne w stosunku do ich prekursorów. Chlorpromazyna, jeden z najstarszych leków o działaniu antypsychotycznym, ulega utlenieniu w podstawniku dimetyloaminopropylowym oraz w układzie podstawowym (ryc. 1.35).

RYCINA 1.35. N- i S-oksydacja chlorpromazyny.

Utlenianie alkoholi i aldehydów

Utlenianie alkoholi przebiega z udziałem dehydrogenazy alkoholowej, enzymu katalizującego reakcję odwodorowania (dehydrogenacji). Na ogół alkohole I-rzędowe ulegają dehydrogenacji szybciej niż alkohole II-rzędowe. Kolejny etap utlenienia aldehydów do kwasów karboksylowych jest katalizowany przez dehydrogenazy aldehydowe:

Reakcje redukcji

Mikrosomy wątrobowe zawierają układy enzymatyczne nie tylko utleniające, lecz także zdolne do redukcji aza- i nitropochodnych do odpowiednich analogów o strukturze amin pierwszorzędowych. Procesy te przebiegają z udziałem enzymów flawoproteinowych, np. dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Pod wpływem NADPH dinukleotyd FAD ulega redukcji do FADH2, który pełni rolę nośnika elektronów. Reakcję można przedstawić ogólnym równaniem:

NADPH + H+ + FAD ? FADH2 + NADP+

R-NO2 + 3 FADH2 ? R-NH2 + 2 H2O + 3 FAD

Związki o budowie azowej, np. sulfasalazyna, ulegają metabolizmowi pod wpływem azoreduktaz (ryc. 1.36).

RYCINA 1.36. Redukcja sulfasalazyny pod wpływem azoreduktaz.

Przykładem redukcji nitrozwiązków może być redukcja chloramfenikolu do pochodnej zawierającej aromatyczną grupę aminową (ryc. 1.37).

RYCINA 1.37. Redukcja grupy nitrowej chloramfenikolu.

Reakcje hydrolizy

Reakcje hydrolizy odgrywają ważną rolę w procesach metabolizmu leków. Ugrupowania estrowe, amidowe, hydrazydowe i glikozydowe, często obecne w strukturach leków, mogą ulegać hydrolizie enzymatycznej. Procesy hydrolizy są katalizowane przez specyficzne hydrolazy o właściwościach esteraz i amidaz, które występują w wątrobie, osoczu i innych narządach, np. w płucach. Leki o budowie amidowej charakteryzują się większą trwałością w porównaniu z ich analogami estrowymi. Przykładem może być hydroliza estru dietyloaminoetylowego kwasu p-aminobenzoesowego (prokaina, lek o działaniu miejscowo znieczulającym) i dietyloaminoetyloamidu kwasu p-aminobenzenowego (prokainamid, lek przeciwarytmiczny), które hydrolizują z różną szybkością do kwasu p-aminobenzoesowego i odpowiednio do dietyloaminoetanolu i dietyloaminoetyloaminy (ryc. 1.38).

RYCINA 1.38. Hydroliza prokainy i prokainamidu.

Prokaina jest szybciej eliminowana z organizmu, natomiast prokainamid (pochodna amidowa), dzięki zwiększonej trwałości, jest wydalany z organizmu w około 60% w formie niezmienionej.

Hydroliza enzymatyczna loratadyny, leku przeciw­alergicznego, jest przykładem szczególnym, zachodzi bowiem równocześnie we fragmencie estrowym i amidowym leku, prowadząc do powstania jego aktywnego metabolitu - desloratadyny, o działaniu i zastosowaniu analogicznym do leku macierzystego (ryc. 1.39).

RYCINA 1.39. Hydroliza enzymatyczna loratadyny.

Podstawnik w układzie trójcyklicznym zawiera fragment, który jest jednocześnie estrem i amidem. Tego rodzaju struktura jest reprezentatywna dla estrów kwasu karbaminowego (uretanów). Kwas karbaminowy to monoamid kwasu węglowego, którego wolna grupa OH w reakcji z alkoholem tworzy ester. Obecność elektronodonorowego atomu azotu tego amidu stabilizuje wiązanie estrowe, które w uretanach jest znacznie trwalsze niż w typowych estrach kwasów alkilokarboksylowych i alkoholach alifatycznych. Powolne uwalnianie metabolitu powoduje przedłużone działanie loratadyny.

1.6.3.2.Przemiany metaboliczne II fazy

Leki lub ich metabolity powstałe w wyniku reakcji I fazy podlegają reakcjom sprzęgania (koniugacji) z substancjami endogennymi, tworząc odpowiednie koniugaty leków. Powstałe w reakcjach II fazy produkty mają charakter polarny, dzięki czemu są łatwo wydalane z organizmu. Procesy te przebiegają z udziałem odpowiednich transferaz - enzymów zlokalizowanych w mikrosomach lub cytozolu. Energia niezbędna do tworzenia form aktywnych pochodzi z rozpadu ATP. Reakcje II fazy przebiegają szybciej niż procesy metabolizmu z udziałem cyto­chromu P450.

Sprzęganie z kwasem glukuronowym

Koniugacja z kwasem glukuronowym jest najczęstszym procesem II fazy. Reakcji tej podlegają głównie związki o charakterze alkoholi II- i III-rzędowych, które utleniają się wolniej niż alkohole I-rzędowe, a także fenole, kwasy alifatyczne i aromatyczne, sulfonamidy, karbaminiany oraz tiole. Proces bezpośredniej koniugacji z kwasem glukuronowym jest katalizowany przez aktywną postać glukuronianu - kwas urydyno-difosfo-?-d-glukuronowy (UDPGA), który jest przenoszony przez transferazy na grupy funkcyjne leku (ksenobiotyku) (ryc. 1.40).

RYCINA 1.40. Sprzęganie z kwasem glukuronowym.

Procesy sprzęgania z kwasem glukuronowym przebiegają głównie w mikrosomach wątrobowych. Powstałe produkty mają charakter glukuronidów, w których wiązanie z kwasem glukuronowym następuje przez atom tlenu, siarki lub azotu. Paracetamol w reakcji koniugacji z kwasem glukuronowym tworzy pochodną o charakterze O-glukuronidu (ryc. 1.41).

RYCINA 1.41. Sprzęganie paracetamolu z kwasem glukuronowym.

Sprzęganie z kwasem siarkowym

Procesowi koniugacji z kwasem siarkowym podlegają fenole oraz w mniejszym stopniu alkohole i aminy. Właściwy proces koniugacji jest poprzedzony utworzeniem "aktywnego siarczanu", tj. siarczanu 3?-fosfoadenozyno-5?-fosforowego (PAPS), który powstaje z udziałem ATP i jonów siarczanowych, pod wpływem sulfurylazy ATP (ryc. 1.42).

RYCINA 1.42. Sprzęganie paracetamolu z kwasem siarkowym.

Proces koniugacji katalizowany jest przez sulfotransferazy występujące w wątrobie i w nerkach. W wyniku koniugacji z kwasem siarkowym powstają produkty typu estrów (R-O-SO2OH) oraz kwasów sulfaminowych (R-NH-SO2OH). Sprzęganie z kwasem siarkowym zachodzi znacznie rzadziej niż koniugacja z kwasem glukuronowym.

Sprzęganie z aminokwasami

Koniugacja z aminokwasami jest ważnym szlakiem biotransformacji leków oraz ksenobiotyków o strukturze kwasów karboksylowych. Proces ten przebiega przy udziale ATP i koenzymu A. Powstająca aktywna forma metabolitu jest następnie sprzęgana z glicyną, rzadziej z glutaminą, cysteiną lub tauryną. Reakcje te przebiegają przy udziale enzymów należących do klasy transacylaz (ryc. 1.43).

RYCINA 1.43. Sprzęganie z aminokwasami.

Sprzęganie z kwasem octowym

Stosunkowo rzadko występującym procesem II fazy jest acetylacja leków i ich metabolitów zawierających wolne grupy aminowe. Proces ten przebiega przy udziale acetylokoenzymu A, który, jako aktywny octan, przenosi grupę acetylową na odpowiedni fragment struktury leku lub ksenobiotyku (ryc. 1.44).

RYCINA 1.44. Sprzęganie z kwasem octowym.

Niekorzystną cechą produktów acetylacji jest na ogół ich ograniczona rozpuszczalność w środowisku wodnym, zwłaszcza przy kwasowym pH, która może być przyczyną działań niepożądanych. Powstające pochodne acetylowe mogą krystalizować (np. w środowisku kwasowym moczu w nerkach, powodując zjawisko krystalurii).

Zastosowanie niektórych sulfonamidów o właściwościach przeciwbakteryjnych może doprowadzić do powikłań, objawiających się krwiomoczem, będącym wynikiem uszkodzenia nerek przez kryształy pochodnych acetylosulfonamidowych (ryc. 1.45).

RYCINA 1.45. N-acetylowanie sulfanilamidu.

Reakcje metylowania

Procesowi metylowania podlegają głównie endogenne regulatory procesów biologicznych, a w wyniku przemian nierzadko powstają metabolity o wyższej aktywności niż związki macierzyste. Reakcja metylowania przebiega z udziałem "aktywnej metioniny" (S-adenozylometioniny, SAM), powstającej z metioniny przy udziale ATP, i jest katalizowana przez metylotransferazy występujące w wątrobie i nerkach oraz w ośrodkowym układzie nerwowym.

Procesowi metylowania podlegają leki lub ich metabolity zawierające wolną parę elektronów na atomie tlenu, azotu lub siarki (ryc. 1.46). O-Metylowaniu ulegają głównie endo- i egzogenne aminy katecholowe, a proces ten jest katalizowany przez katecholo-O-metylotransferazę (COMT). Procesy N-metylowania dotyczą pochodnych fenetyloamin i pochodnych pirydyny. Związki zawierające wolną grupę tiolową ulegają S-metylowaniu. Połączenia z IV-rzędowym atomem azotu są hydrofilne i stosunkowo łatwo wydalane z organizmu.

RYCINA 1.46. Reakcje O- i N-metylowania.

Procesy biotransformacji należą do kluczowych przemian, jakim podlegają leki w organizmie, z czego wynika konieczność ich wnikliwego analizowania przed rejestracją leku, zwłaszcza monitorowania na etapie IV fazy badań klinicznych (pharmacovigiliance). Brak danych dotyczących procesów biotransformacji leków prowadził niejednokrotnie w przeszłości do ujawniania się bardzo poważnych niepożądanych działań leków w czasie ich stosowania klinicznego, łącznie z zaburzeniami genetycznymi, a nawet zgonami pacjentów na skutek toksycznego działania leków lub produktów ich biotransformacji, co było przyczyną wycofania tych środków z farmakoterapii.

1.7.Współczesne metody projektowania i otrzymywania leków

1.7.1.Poszukiwanie nowych leków

Odkrywanie nowych leków stanowi ważny element postępu nauk farmaceutycznych. Początkowo większość leków powstawało w wyniku systematycznego przesiewu dużej liczby substancji pochodzenia naturalnego i syntetycznego w farmakologicznych testach in vivo i na izolowanych narządach ex vivo (skrining fenotypowy). Poprawę aktywności biologicznej i profilu farmakokinetycznego uzyskiwano metodą prób i błędów. Te tradycyjne metody poszukiwania substancji biologicznie aktywnych sukcesywnie uzupełniano dzięki rozwojowi metod biologii molekularnej i wprowadzeniu technik in vitro. Aktualnie poszukiwania nowych leków często opierają się na komputerowych metodach in silico i informacjach uzyskanych dzięki analizie genomu. W efekcie punktem wyjścia dla projektu badawczego nie jest lek, lecz molekularny cel w organizmie (drug target).

RYCINA 1.47. Współczesne narzędzia projektowania i poszukiwania nowych leków.

Szacuje się, że czas konieczny do wprowadzenia nowego leku na rynek wynosi 8-12 lat, a koszt - od 100 do 200 mln dolarów. Przyczyn tak wysokich nakładów finansowych można dopatrywać się w wysokim współczynniku niepowodzeń na etapie badań klinicznych, jak również w wymaganiach dotyczących skuteczności i bezpieczeństwa stawianych nowym substancjom leczniczym przez instytucje odpowiedzialne za ich dopuszczenie do stosowania w terapii.

W procesie poszukiwania nowych leków można wyróżnić dwie główne fazy (etapy): badań przedklinicznych i badań klinicznych. Faza badań przedklinicznych, mająca na celu identyfikację struktury wiodącej (lead compound), obejmuje: badania chemiczne, ocenę farmakologiczną, ocenę biodostępności i stabilności oraz ocenę toksykologiczną nowych związków chemicznych w testach in vitro i zwierzęcych modelach in vivo. Wiele z tych etapów przebiega równolegle i jest ze sobą ściśle powiązanych. Przełomem ostatnich lat było pojawienie się wysoce efektywnych narzędzi badawczych - chemii kombinatorycznej, chemii przepływowej i wysokowydajnych technik oceny aktywności biologicznej in vitro. Ważnym elementem jest stały rozwój komputerowych technik obliczeniowych i wizualizacyjnych in silico. Wiele koncepcji, które do niedawna trzeba było sprawdzać w czasie długotrwałych i kosztownych eksperymentów, teraz można weryfikować w modelach komputerowych.

Wynikiem badań fazy przedklinicznej jest wytypowanie najlepszego kandydata do fazy badań klinicznych. Potencjalne leki są w tej fazie testowane w pierwszej kolejności na zdrowych ochotnikach, a potem na pacjentach. Celem zasadniczym tej fazy badań jest potwierdzenie skuteczności oraz określenie efektów niepożądanych i ewentualnych zagrożeń.

Poszukiwanie nowych struktur wiodących i leków polega na identyfikacji nowych związków chemicznych oddziaływujących na dobrze zdefiniowane cele molekularne, np. na receptory czy enzymy, i najczęściej ma na celu: poprawę skuteczności, zwiększenie bezpieczeństwa terapii, modulowanie czasu i siły działania oraz wyeliminowanie skutków ubocznych związanych ze stosowaniem już dostępnych preparatów. Badania te są prowadzone w sposób tradycyjny, na podstawie substancji zidentyfikowanych w surowcach pochodzenia naturalnego i już istniejących leków (koncepcja me-too drug). Nie należy zapominać o dużej przypadkowości, która towarzyszy większości odkryć, w tym także z dziedziny farmakologii.

Drugie podejście polega na identyfikacji związków chemicznych zaangażowanych w mechanizmy mediowane przez nowe cele biologiczne.

1.7.1.1.Przypadkowość w odkrywaniu leków

Część leków, które wprowadzono na przełomie XIX i XX wieku, została odkryta w sposób przypadkowy. Zastosowanie podtlenku azotu i eteru jako środków znieczulenia ogólnego rozpoczęło erę rozwoju chirurgii. Odkrycie to wynikało z obserwacji, że osoby, które inhalowały wymienione gazy, nie odczuwały bólu. Przypadkowe było również odkrycie penicyliny i niektórych leków o działaniu alkilującym (analogi iperytu) oraz o aktywności przeciwnowotworowej. Również przypadek przyczynił się do wprowadzenia do terapii nadciśnienia klonidyny i warfaryny - leku zmniejszającego krzepliwość krwi.

1.7.1.2.Tworzenie nowych struktur na podstawie istniejących leków

Wiele leków zostało odkrytych dzięki założeniu, że małe modyfikacje struktury chemicznej dotychczas stosowanych leków mogą poprawić aktywność i zwiększyć biodostępność leku, a tym samym podwyższyć korzyści terapeutyczne. Zgodnie z tym założeniem wprowadzono wiele nowych pochodnych z grupy półsyntetycznych antybiotyków, ?-blokerów stosowanych w terapii układu sercowo-naczyniowego oraz inhibitorów konwertazy angiotensyny.

Optymalizacja struktury leków wykazujących groźne działania niepożądane, szczególnie w przypadku ich przewlekłego stosowania, może również być sposobem pozyskiwania nowych leków. Nadmierna diureza zaobserwowana podczas stosowania chemioterapeutyków przeciwinfekcyjnych z grupy sulfonamidów przyczyniła się do podjęcia prac nad optymalizacją struktury chemicznej w kierunku działania moczopędnego. W efekcie wprowadzono do terapii leki moczopędne o strukturze sulfonamidowej. Natomiast znaczący efekt hipoglikemiczny innego przedstawiciela przeciwbakteryjnych sulfonamidów stał się punktem wyjścia do prac nad lekami obniżającymi stężenie glukozy we krwi, które następnie wprowadzono do farmakoterapii cukrzycy.

Syldenafil (Viagra) stosowano w pierwotnym nadciśnieniu płucnym. Zaobserwowano, że u mężczyzn, którzy przyjmowali ten lek, wywiera on wyraźny pozytywny wpływ na erekcję. Rozpoczęto badania naukowe i ustalono, że efekt ten wynika z silnego, dość selektywnego hamowania fosfodiesterazy typu 5 (PDE5). W rezultacie syldenafil zaczęto podawać również jako lek w zaburzeniach erekcji. Był to znaczący postęp w leczeniu zaburzeń seksualnych.

Leki o strukturze powodującej wystąpienie aktywności optycznej, najczęściej spowodowanej obecnością centrum stereogenicznego, w zetknięciu z chiralnym środowiskiem endogennych struktur białkowych (transportery błonowe, enzymy, receptory), często znacząco się różnią, m.in. aktywnością farmakologiczną, profilem bezpieczeństwa (toksycznością) i biotransformacją. Jeden z enancjomerów (izomer optyczny) może wykazywać wysoką aktywność (eutomer), natomiast drugi może działać słabiej lub (w skrajnym przypadku) być nawet całkowicie pozbawiony aktywności farmakologicznej (distomer), stanowiąc zbędny, balastowy składnik leku. Dzięki postępowi w zakresie technik syntezy organicznej, a także dzięki opracowaniu metod rozdziału enancjomerów i diastereoizomerów współczesna farmakoterapia zyskała nowe leki, będące np. czystymi odmianami enancjomerycznymi leków, które uprzednio były stosowane w formie mieszanin racemicznych (chiral switch). W postaci czystych enancjomerów zostały wprowadzone m.in: (S)-izomer citalopramu o działaniu przeciwdepresyjnym, czyli escitalopram, (R)-izomer antagonisty receptorów H1 cetyryzyny, czyli lewocetyryzyna, oraz (S)-izomer inhibitora pompy protonowej omeprazolu, czyli esomeprazol.

1.7.1.3.Identyfikacja celu biologicznego

Pod koniec ubiegłego stulecia pojawiło się wiele nowych narzędzi badawczych, które przyczyniły się do bliższego poznania budowy białek funkcjonalnych oraz zrozumienia mechanizmów leżących u podłoża chorób na poziomie komórkowym. Precyzyjne określenie celów biologicznych dla leków, szczególnie miejsc ich wiązania ze strukturami endogennymi (białka), pozwoliło na bardziej precyzyjne korygowanie zaburzonych procesów biochemicznych, co w wielu przypadkach przyczyniło się do zwiększenia skuteczności farmakoterapii.

W realizacji tego zadania znaczącą rolę odegrał rozwój nowych dziedzin biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej. Ogólnoświatowe badania nad poznaniem genomu i proteomu człowieka dostarczyły informacji na temat budowy i ekspresji genów oraz występowania i sekwencji kodowanych przez nie białek. Sądzono, że przybliżenie informacji na temat zaangażowania genów w proces chorobowy oraz mechanizmów odpowiedzi na lek szybko doprowadzą do identyfikacji większej liczby nowych celów molekularnych. Przyjmuje się, że genom człowieka koduje około tysiąca receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) oraz około 500 kinaz białkowych. Ze względu na dużą liczbę genów (około 30 tys.) określenie ich roli okazało się niemałym wyzwaniem. Problemy wynikały również z faktu, że wiele kodowanych przez geny białek i struktur im pokrewnych powstaje w wyniku modyfikacji posttranslacyjnych. Opracowanie genomu pozwoliło na porównanie zmian genetycznych między komórkami prawidłowymi oraz zmienionymi chorobowo. W konsekwencji odkrycie chorób, w przebiegu których obserwuje się nadaktywność określonych genów, stało się podstawą rozwoju m.in. celowanej terapii przeciwnowotworowej.

Równie dużego znaczenia nabrała proteomika, dyscyplina zajmująca się analizą proteomu, czyli zestawu wszystkich białek występujących w komórkach. Jej celem jest identyfikacja oraz określenie budowy i funkcji jak największej liczby białek komórkowych, a także znalezienie różnic w profilu białkowym osób zdrowych i chorych. Co ważne, proteom danego osobnika - w przeciwieństwie do niezmiennego genomu - wciąż ulega zmianom.

Ustalenie zależności pomiędzy obecnością określonego białka a stanem fizjologicznym lub chorobowym organizmu stwarza możliwość opracowania nowych metod diagnostycznych (markerów stanu chorobowego). Zidentyfikowanie celu molekularnego dla substancji o strukturze pokrewnej (peptydowej) umożliwia podjęcie badań nad projektowaniem ligandów, czyli związków aktywnych rozpoznawanych przez receptory, co przyczynia się do bardziej racjonalnego, ukierunkowanego poszukiwania nowych leków.

1.7.1.4.Zasady projektowania nowych leków

Zdefiniowanie celu biologicznego powiązanego ze stanem patologicznym oraz określenie profilu funkcjonalnego projektowanych związków (agonista lub antagonista receptorowy) jest pierwszym etapem projektowania nowego leku. Kolejno projektuje się biblioteki skriningowe związków chemicznych, spośród których identyfikowane są interesujące struktury, wykazujące aktywność wobec określonego celu, czyli tzw. hity. Biblioteki skriningowe są tworzone w sposób zapewniający jak największe zróżnicowanie strukturalne. Zazwyczaj składają się one z 500-10000 związków chemicznych, a ich synteza może być prowadzona przy użyciu technik chemii kombinatorycznej i syntezy na fazie stałej. Następnie wokół hitów zidentyfikowanych w kampaniach skriningowych projektuje się biblioteki celowane (targeted library). Struktury składników tych bibliotek są planowane w sposób umożliwiający ustalenie zależności między strukturą związków a aktywnością biologiczną. Tego typu biblioteki są mniej liczne, zwykle zawierają od 40 do 500 związków. Wyselekcjonowane w wyniku badań in vitro struktury wiodące są następnie poddawane szczegółowym badaniom w modelach in vivo, określających profil farmakologiczny i farmakokinetyczny oraz toksyczność związków. Modyfikacje strukturalne mające na celu optymalizację struktury wiodącej na ogół ograniczają się do niewielkich zmian struktury cząsteczki. Wynikiem procesu optymalizacji jest wytypowanie kandydata na lek, który ma szansę na powodzenie w badaniach klinicznych.

Rozwój technik obliczeniowych umożliwił dokładne określenie parametrów chemicznych cząsteczek. Na podstawie dostępnych baz danych, zawierających informacje na temat struktury białek enzymatycznych i receptorowych, możliwe jest wspomagane komputerowo projektowanie budowy chemicznej nowych leków (CADD - computer-aided drug design), postrzegane jako niezbędne narzędzie w nowoczesnej chemii leków. W połączeniu z technikami wirtualnego skriningu CADD stało się podstawową metodą, w znaczącym zakresie zastępującą klasyczne sposoby, oparte na intuicji badacza i jego doświadczeniu, którymi kierowano się w przeszłości przy projektowaniu struktury związków biologicznie aktywnych.

Strategia projektowania nowych leków zależy od zakresu informacji dotyczących zarówno celu biologicznego, jak i oddziaływującego z nim związku (np. liganda receptorowego), który może modulować czynność celu biologicznego (np. receptora). Wyróżnia się kilka sposobów projektowania nowych leków. Strategia postępowania prowadzącego do zdefiniowania struktury leku może być realizowana na podstawie budowy chemicznej znanych ligandów (ligand based design) lub struktury enzymu bądź receptora (target based design).

Projektowanie na podstawie struktury znanych ligandów polega na porównywaniu budowy aktywnych i nieaktywnych ligandów, ocenie podobieństwa fragmentów strukturalnych oraz charakterystycznych układów o właściwościach donorowo-akceptorowych i hydrofobowych. Na bazie tak przeprowadzonej analizy konstruowane są modele farmakoforowe. Opisują one relacje przestrzenne między istotnymi elementami wspólnymi dla ligandów oddziałujących z danym celem molekularnym oraz przybliżają wnętrze receptora i geometrię jego miejsca wiążącego. Prawidłowe opracowanie modelu farmakoforowego wymaga przeprowadzenia analizy konformacyjnej testowanych związków, czyli zdefiniowania niskoenergetycznych konformacji cząsteczki liganda, uprzywilejowanych pod względem oddziaływania z celem biologicznym. Metodą wspomagającą projektowanie nowych związków biologicznie aktywnych jest również budowanie homologicznych modeli receptorowych. Jest to podejście często wykorzystywane w przypadku receptorów błonowych związanych z białkiem G. Ze względu na specyficzną lokalizację tych receptorów w błonie komórkowej nie można uzyskać informacji na temat ich budowy krystalicznej. W takich przypadkach na podstawie znanej pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej konstruuje się modele homologiczne z zastosowaniem technik modelowania cząsteczkowego. Szkielet nowego receptora jest oparty na strukturze białek referencyjnych.

Tworzenie modeli farmakoforowych (np. receptorowych) pozwala z pewnym przybliżeniem na opisanie miejsca wiążącego danego celu biologicznego, co może być następnie wykorzystywane w procesie wirtualnego skriningu dostępnych w bazach danych związków o komplementarnej strukturze. Sformułowanie na tej podstawie zależności struktura-aktywność powinno umożliwić dokonanie optymalizacji struktury wiodącej. Modele homologiczne znalazły również zastosowanie w metodzie wirtualnego dopasowywania (docking) struktur ligandów do miejsca aktywnego receptorów lub enzymów. Tego typu podejście ma na celu określenie ułożenia liganda w miejscu wiążącym oraz ocenę rodzaju i siły wiązania liganda w receptorze. Modele homologiczne służą również jako narzędzia w projektowaniu de novo związków chemicznych. Stosując technikę modelowania cząsteczkowego, rozmieszcza się odpowiednie grupy funkcyjne lub fragmenty strukturalne zgodnie z wymogami strukturalno-elektronowymi w miejscu wiążącym celu biologicznego. Na podstawie komplementarności fragmentów strukturalnych wobec odpowiednich obszarów miejsca wiążącego stopniowo budowany jest nowy ligand.

W przypadku gdy struktura przestrzenna celu molekularnego została scharakteryzowana za pomocą metod krystalograficznych lub technik protonowego rezonansu magnetycznego, a ostatnio mikroskopii krioelektronowej, projektowanie leków jest prostsze i jego podstawą są wówczas struktury receptora lub enzymu. Wykorzystując bazy danych strukturalnych, dopasowuje się potencjalne ligandy do przestrzeni miejsca wiążącego. Istotne jest, aby wyselekcjonowane struktury poza wymogami przestrzennymi spełniały również kryteria energetyczne. Jedne z pierwszych badań nad opracowywaniem leków na podstawie struktury celu biologicznego przeprowadzono w latach 70. XX wieku. Poznanie struktury enzymu konwertazy angiotensyny pozwoliło, po odkryciu składnika jadu węża południowoamerykańskiego, jakim jest teprotyd (związek o budowie peptydowej), na zoptymalizowanie struktury cząsteczek blokujących centra aktywne tego enzymu i w rezultacie uzyskanie pierwszego trwałego po podaniu doustnym inhibitora konwertazy angiotensyny - kaptoprylu. W badaniach tych wykorzystano m.in. informacje dotyczące trójwymiarowej struktury kompleksu aktywnego ligand-proteaza cynkowa. Kolejnym przykładem leku, którego struktura została zoptymalizowana na podstawie uprzednio rozpoznanej przestrzennej budowy enzymu neuramidazy, był lek przeciwwirusowy zanamiwir (ryc. 1.48). Badania wykazały, że zanamiwir jest nieaktywny po podaniu doustnym. Zastosowanie technik modelowania komputerowego wskazało kierunki modyfikacji cząsteczki, które zaowocowały wprowadzeniem do lecznictwa oseltamiwiru (Tamiflu), który charakteryzuje się dobrą biodostępnością po podaniu doustnym.

RYCINA 1.48. Zanamiwir i oseltamiwir.

1.7.1.5.Wirtualne badania przesiewowe

Przed przystąpieniem do syntezy bibliotek związków z przeznaczeniem do badań przesiewowych (skriningowych), w celu określenia ich aktywności biologicznej (farmakologicznej), w pierwszym etapie tworzy się wirtualne zbiory unikatowych związków chemicznych, będących kombinacją dostępnych fragmentów strukturalnych. Prawidłowe zdefiniowanie farmakoforu i opracowanie przestrzennej struktury miejsc wiążących celu biologicznego umożliwia przeszukiwanie tych zbiorów, często liczących miliony struktur, w celu identyfikacji potencjalnych ligandów receptorowych w procesie wirtualnych badań przesiewowych. Badania te obejmują m.in. analizę pod kątem obecności charakterystycznych ugrupowań oraz ocenę wartości energii oddziaływań ligand-receptor.

Optymalizacja struktury ligandów w sposób umożliwiający uzyskanie wysokiego powinowactwa nie jest jedynym parametrem gwarantującym korzystny efekt terapeutyczny. Istotne są również właściwości fizykochemiczne, które odzwierciedlają zachowanie się związku chemicznego w organizmie.

Substancje biologicznie aktywne stosowane do celów leczniczych można podzielić na dwie grupy. Pierwszą stanowią związki o budowie peptydowej, które ze względu na szybko zachodzące reakcje hydrolizy w środowisku kwaśnym przewodu pokarmowego wymagają alternatywnych dróg podania (np. dożylnie). Druga grupa, znacznie liczniejsza, obejmuje małocząsteczkowe związki organiczne o względnie wysokiej trwałości w środowisku kwaśnym, dobrze wchłaniające się z przewodu pokarmowego po podaniu doustnym, charakteryzujące się korzystnym okresem półtrwania, w niektórych przypadkach pokonujące barierę naczyniowo-mózgową i przenikające do ośrodkowego układu nerwowego.

Użyteczna w projektowaniu nowych leków jest "reguła pięciu" Lipińskiego (oznaczane wartości są wielokrotnością liczby 5), definiująca następujące optymalne parametry dla tzw. cząsteczek leko­podobnych:

- masa cząsteczkowa poniżej 500 Da;

- współczynnik lipofilowości (logP), jako logarytm współczynnika podziału n-oktanol/woda nie większy od 5;

- zawartość nie więcej niż 5 donorów wiązań wodorowych;

- zawartość nie więcej niż 10 akceptorów wiązań wodorowych.

"Reguła pięciu" jest często rozszerzana o jeszcze jeden parametr - powierzchnię polarną cząsteczki (PSA - polar surface area), definiowaną jako suma powierzchni polarnych poszczególnych atomów. Parametr PSA jest wykorzystywany do przewidywania zdolności związku chemicznego do penetracji przez błony biologiczne na drodze transportu biernego.

Zastosowanie wirtualnych badań przesiewowych eliminuje związki zawierające nieodpowiednie fragmenty strukturalne. Niespełnienie któregoś z wymogów określonych zgodnie z "regułą pięciu" nie eliminuje badanego związku, natomiast łączne potraktowanie wyników badań przesiewowych i parametrów zdefiniowanych przez tę regułę ogranicza liczbę związków typowanych do dalszych badań, tzn. opracowania metod syntezy chemicznej związków.

1.7.1.6.Wysokowydajne metody przesiewowe w badaniach farmakologicznych (HTS - high-throughput screening)

Rozwój wysokowydajnych technik syntezy na fazie stałej spowodował duży postęp w zakresie opracowania metod przesiewowych, które pozwalają na określenie aktywności biologicznej bardzo dużej liczby otrzymywanych związków. Metoda HTS umożliwia uzyskiwanie informacji dotyczących aktywnych ligandów dla de novo zidentyfikowanych celów biologicznych oraz szybką ocenę aktywności biologicznej, szczególnie licznych analogów strukturalnych, w danej bibliotece związków.

Badania są prowadzone z zastosowaniem testów fluorescencyjnych, metod opartych na wypieraniu znanych ligandów znakowanych czynnikiem radioaktywnym oraz testów określających np. zawartość drugich przekaźników (np. cAMP, Ca2+). Wybór odpowiedniego testu jest uwarunkowany rodzajem celu biologicznego oraz możliwościami interpretacji uzyskanych wyników. Na przykład badania powinowactwa do receptorów wykonuje się z zastosowaniem znakowanych radioizotopem wysokoaktywnych ligandów. Źródłem materiału biologicznego są izolowane natywne receptory i enzymy lub materiał uzyskany dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej. Pozyskiwanie na szeroką skalę izolowanych receptorów usprawniło prowadzenie testów metodą HTS, umożliwiając równocześnie prowadzenie testów dla niewielkich próbek (rzędu mikrogramów). Zastosowanie jako standardu 96-dołkowych płytek umożliwiło dostosowanie skali (miniaturyzacja) do formatu zgodnego ze skalą uzyskiwaną w zautomatyzowanych procesach syntezy organicznej. Obecnie oprócz płytek 96-dołkowych są również dostępne płytki z 384, a nawet z 1536 zagłębieniami, co przekłada się na możliwości oceny aktywności biologicznej kilku tysięcy, a nawet kilkunastu tysięcy związków w ciągu jednego dnia.

1.7.1.7.Wybór związków o cechach struktury wiodącej

Spośród otrzymanych związków, na podstawie wyników badań farmakologicznych, głównie dotyczących powinowactwa, profilu aktywności wewnętrznej, selektywności receptorowej i aktywności in vivo, wybiera się substancję o interesującej aktywności biologicznej jako strukturę wiodącą dla dalszych związków o optymalnej aktywności. Poprawność formułowanych na tej podstawie hipotez sprawdza się, przeprowadzając syntezę i badania aktywności najczęściej bliskich analogów strukturalnych i podejmując próbę określenia zależności struktura-aktywność dla badanych związków. Aktualnie wiele uwagi poświęca się badaniom mającym na celu określenie parametrów farmakokinetycznych cząsteczek, głównie możliwości ich wchłaniania, sposobu rozmieszczenia w organizmie, dróg metabolizmu i eliminacji oraz właściwości toksycznych (schemat ADME/Tox). Brak tego rodzaju danych, pozyskiwanych na etapie wstępnych i poszerzonych badań farmakologicznych, powodował, że wiele substancji aktywnych było wycofywanych z projektów badawczych dopiero na etapie zaawansowanych testów fazy przedklinicznej. Aktualnie już na wstępnych etapach optymalizacji struktury wiodącej badacze zwracają uwagę na parametry farmakokinetyczne, nierzadko wykonując dodatkowo badania interakcji z cytochromem P450 oraz poszerzone badania toksyczności i stabilności związków. W przeciwieństwie do hitów struktury wiodące powinny wykazywać stabilność chemiczną. Nie bez znaczenia jest również rachunek ekonomiczny: koszty syntezy, zwłaszcza w zwiększonej skali, powinny być racjonalne (ryc. 1.49).

RYCINA 1.49. Wieloparametrowa optymalizacja struktur wiodących z hitów zidentyfikowanych na podstawie badań przesiewowych.

1.7.1.8.Ilościowa analiza zależności struktura-aktywność (QSAR - quantitative structure-activity relationship)

Bardzo pomocne w racjonalnym projektowaniu struktury związków biologicznie aktywnych było wprowadzenie metod pozwalających w sposób ilościowy określić wpływ właściwości fizykochemicznych związków na ich aktywność biologiczną. Zależności te sformułowano w postaci równań matematycznych z zastosowaniem deskryptorów liczbowych określających m.in. właściwości strukturalne (masa molowa, liczba rotujących wiązań, parametry steryczne, takie jak stała Tafta), właściwości elektronowe (ładunek całkowity, moment dipolowy - stała Hammeta) oraz właściwości hydro- i lipofilowe (współczynnik podziału - logP). Najczęściej analizę w ramach QSAR przeprowadza się metodą Hanscha na podstawie równania określającego zależność między aktywnością biologiczną i parametrami fizykochemicznymi cząsteczki za pomocą wieloparametrowej regresji liniowej. Cennym rozwinięciem analizy QSAR metodą Hanscha jest zaproponowana przez Free i Wilsona oraz zmodyfikowana przez Fujitę i Bana matematyczna metoda oceny wpływu fragmentów strukturalnych na aktywność. W analizie tej uwzględnia się strukturalne właściwości związków zaszyfrowane w postaci matrycy sporządzonej w systemie zero-jedynkowym, które są bezpośrednio korelowane z aktywnością biologiczną. Wyniki tej analizy pozwoliły m.in. na wysunięcie hipotezy dotyczącej zjawiska bioizosterii. Według niej możliwe jest uzyskanie identycznego efektu biologicznego przy zastosowaniu różnych ugrupowań w strukturze liganda.

Metody oparte na analizie deskryptorów fizykochemicznych nie pozwalają na uwzględnienie pełnej informacji, jaką niesie ze sobą znajomość struktury przestrzennej cząsteczki, które mogą być opisane za pomocą analizy parametrów trójwymiarowych cząsteczki (3D-QSAR). Metody te traktują cząsteczkę jako całość i zakładają, że najważniejszymi cechami determinującymi aktywność są: jej wielkość, kształt i właściwości elektronowe. W metodzie tej nie bierze się pod uwagę oddziaływań ligand-receptor z utworzeniem wiązań kowalencyjnych. Najczęściej stosowana analiza 3D-QSAR opiera się na analizie porównawczej właściwości pól molekularnych (CoMFA - comparative molecular field analysis). Tego typu analiza wymaga określenia trójwymiarowej struktury związku po przeprowadzeniu analizy krystalograficznej, a następnie optymalizacji tej struktury metodami komputerowymi. Wynikiem analizy CoMFA jest graficzne przedstawienie cząsteczki w sposób identyfikujący regiony sprzyjające oddziaływaniom elektrostatycznym, tj. dodatnio i ujemnie naładowane, a także sprzyjające oddziaływaniom sterycznym.

Wyniki analizy QSAR pozwalają na: wyciągnięcie wniosków dotyczących mechanizmów interakcji ligandów z celem biologicznym, przewidywanie aktywności nowych związków oraz wybór odpowiednich modyfikacji chemicznych w celu projektowania nowych połączeń o optymalnych właściwościach farmakokinetyczno-farmakologicznych.

1.7.2.Metody otrzymywania leków

1.7.2.1.Naturalne źródła substancji biologicznie aktywnych

Podstawowym i jednym z najcenniejszych źródeł nowych substancji biologicznie aktywnych są surowce pochodzenia naturalnego. Prawie połowa stosowanych leków jest pochodzenia naturalnego lub stanowi syntetyczne analogi związków naturalnych. Na uwagę zasługują pochodne o strukturze alkaloidowej (morfina, chinina) i glikozydowej oraz związki wielocykliczne (antybiotyki, paklitaksel). Pozyskiwanie substancji biologicznie aktywnych z produktów roślinnych jest zadaniem czasochłonnym, bardzo trudnym i często obarczonym niską wydajnością. Klasyczne metody opierają się na identyfikacji substancji aktywnej z surowców naturalnych i ich izolowaniu, głównie na drodze ekstrakcji i destylacji, a niekiedy z zastosowaniem technik chromatograficznych. Produkty te są związkami o złożonej budowie chemicznej, charakteryzującej się trudną do odtworzenia za pomocą dostępnych metod syntezy organicznej strukturą przestrzenną. Aktualnie badania nad związkami biologicznie aktywnymi pochodzenia roślinnego koncentrują się na poszukiwaniu leków, które pozwoliłyby stawić czoło chorobom wciąż stanowiącym wyzwanie dla farmakoterapii, np. skutecznych w zwalczaniu nowotworów czy AIDS.

1.7.2.2.Metody otrzymywania leków - synteza metodami klasycznymi

Najczęściej stosowaną metodą otrzymywania leków jest synteza organiczna, polegająca na budowaniu cząsteczki przez łączenie odpowiednich elementów strukturalnych lub modyfikacje chemiczne substancji izolowanych z produktów pochodzenia naturalnego (półsynteza).

Klasyczna synteza leków polega na prowadzeniu często wieloetapowych reakcji w roztworze z zastosowaniem odpowiednich rozpuszczalników i katalizatorów. W niektórych przypadkach reakcje te są prowadzone w fazie stopionej, bez użycia rozpuszczalników; dotyczy to w szczególności reagentów i produktów o wysokiej trwałości w podwyższonej temperaturze. Metodami syntezy otrzymuje się najczęściej preparaty o stosunkowo prostej strukturze, aczkolwiek dostępne aktualnie metody syntezy związków organicznych umożliwiają otrzymywanie związków bardziej złożonych; inną kwestią jest opłacalność takiej syntezy, zwłaszcza na większą skalę.

1.7.2.3.Metody otrzymywania leków - chemia kombinatoryczna i synteza na fazie stałej

Chemia kombinatoryczna, która pojawiła się w latach 80. XX stulecia, stała się jednym z podstawowych narzędzi umożliwiających w relatywnie krótkim czasie przeprowadzenie syntezy tysięcy związków chemicznych. Jej wprowadzenie stworzyło również podwaliny dla nowoczesnej syntezy związków o potencjalnej aktywności farmakologicznej w naukach farmaceutycznych.

Cechą charakterystyczną chemii kombinatorycznej jest równoczesna synteza zróżnicowanych strukturalnie związków chemicznych w tych samych warunkach reakcji. Synteza jest prowadzona w sposób usystematyzowany, często z zastosowaniem syntezy półautomatycznej. W rezultacie powstaje kombinacja wszystkich fragmentów strukturalnych wykorzystanych na poszczególnych etapach (building blocks). W tradycyjnym podejściu zakłada się, że w przebiegu syntezy związków organicznych, prowadzonej najczęściej w roztworze, w wyniku reakcji dwóch substratów (A i B) zostanie utworzony jeden główny produkt (A-B). W syntezie kombinatorycznej zestaw reagentów grupy A (A1, A2, A3, ...An) poddany reakcji (reakcjom) z zestawem reagentów grupy B (B1, B2, B3, ...Bm) tworzy "bibliotekę" produktów finalnych o ogólnym wzorze AnBm. W zależności od zastosowanej strategii syntezy (podział i mieszanie, split-and-mix; synteza równoległa) biblioteki kombinatoryczne zawierają odpowiednio: wieloskładnikowe mieszaniny związków lub zestawy konkretnych związków. Ze względu na trudności w identyfikacji aktywnego składnika biblioteki oraz duże prawdopodobieństwo popełnienia błędu uznaniem cieszą się metody znakowania produktów znacznikami fizycznymi lub chemicznymi. Do budowania bibliotek związków często wykorzystywane są np. znaczniki fal radiowych i modularne podłoża stacjonarne. Obecnie szerzej stosuje się podejście opierające się na syntezie równoległej, która w połączeniu z automatyzacją dostarczyła wysokowydajnych platform do szybkiej syntezy związków chemicznych.

W celu zapewnienia wysokiej jakości próbek związków przekazywanych następnie do badań farmakologicznych duże laboratoria badawcze wykorzystują zautomatyzowany sprzęt analityczny, który jednocześnie identyfikuje składniki mieszaniny związków i izoluje pożądany produkt. Najczęściej stosuje się techniki spektrometrii masowej z równoczesnym rozdziałem na wysokosprawnym preparatywnym chromatografie cieczowym.

Metody syntezy na fazie stałej zostały opracowane w celu otrzymywania związków o strukturze peptydowej. Laureat Nagrody Nobla profesor Bruce Merrifield jako pierwszy zastosował w syntezie organicznej stałe nośniki polimerowe. Istotną zaletą tego rodzaju metod jest możliwość użycia dużego nadmiaru reagentów oraz prosty sposób usuwania produktów balastowych, towarzyszących produktowi głównemu, które powstają na każdym etapie syntezy. "Umieszczenie" na odpowiednio przygotowanym polimerze określonego związku daje możliwość jego wieloetapowej modyfikacji z zastosowaniem odpowiednich reagentów, bez konieczności wyodrębniania produktów pośrednich. Produkt finalny jest uwalniany od nośnika stałego, np. żywicy polistyrenowej (polimer), w odpowiednich warunkach, pod wpływem dedykowanych do tego celu reagentów.

1.7.2.4.Metody otrzymywania leków - chemia przepływowa i mechanochemia

Konieczność zapewnienia wysokiej jakości produktu leczniczego, przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności i bezpieczeństwa procesu otrzymywania leków, stała się motorem napędowym dla prac nad alternatywnymi metodami syntezy. Postęp w zakresie technik przepływowych przyczynił się do rozwoju metod chemii przepływowej (flow chemistry), nazywanej również syntezą w przepływie ciągłym, a wykorzystanie energii mechanicznej w celu prowadzenia reakcji chemicznych w warunkach bezrozpuszczalnikowych - do rozwoju metod mechanochemii. Te "przyjazne" środowisku procesy nazywa się metodami zielonej chemii (green chemistry). Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne uznało metody chemii przepływowej i mechanochemii za odkrycia przełomowe, które prawdopodobnie zrewolucjonizują metody otrzymywania leków w XXI stuleciu.

Cechą charakterystyczną chemii przepływowej jest prowadzenie reakcji w reaktorach przepływowych, czyli tzw. mikroreaktorach, zbudowanych z rurek o małej średnicy. Proces ten polega na wtłaczaniu reagentów rozpuszczonych w odpowiednich rozpuszczalnikach i mieszaniu ich w reaktorze przepływowym w ściśle kontrolowanych warunkach. Proces prowadzony w zamkniętych układach przepływowych charakteryzuje się większym, w porównaniu z procesami z zastosowaniem klasycznych reaktorów wsadowych, stosunkiem powierzchni reaktora do jego objętości. Sprzyja to bardziej wydajnemu transferowi ciepła i umożliwia niemal natychmiastowe ogrzewanie i schładzanie reaktora. Do korzyści wynikających ze stosowania chemii przepływowej należą krótszy czas prowadzenia reakcji oraz większa czystość produktów. Wyższa wydajność procesu chemicznego wynika ze sposobu mieszania reagentów w reaktorze (na zasadzie dyfuzji), co zwiększa selektywność reakcji, ograniczając tworzenie produktów balastowych. Istotną zaletą metod chemii przepływowej jest łatwe skalowanie procesu.

Mechanochemia jest od wielu lat stosowana w przemyśle farmaceutycznym w badaniach nad nowymi postaciami krystalicznymi. W procesie ucierania substancji leczniczych w wyniku zrywania i tworzenia nowych oddziaływań niekowalencyjnych (oddziaływania van der Waalsa, wiązania wodorowe) mogą powstać nowe struktury krystaliczne - odmiany polimorficzne, lub produkty w stanie metastabilnym (bezpostaciowym bądź szklistym).

Synteza substancji biologicznie aktywnych i leków z zastosowaniem metod mechanochemii polega na prowadzeniu reakcji chemicznych z udziałem reagentów w formie ciał stałych, bez stosowania rozpuszczalnika. Mechanochemia różni się od metod klasycznych pod względem kinetycznym i termodynamicznym. Do utworzenia nowych wiązań kowalencyjnych wykorzystuje ona energię mechaniczną powstającą podczas mielenia lub kruszenia reagentów. Procesy nie są prowadzone w reaktorach wsadowych, lecz w młynach kulowych lub orbitalnych.

1.7.2.5.Metody otrzymywania leków - biosynteza i biotransformacja

Dużą grupę leków uzyskuje się również metodami biosyntezy i biotransformacji z zastosowaniem mikroorganizmów. Współcześnie metody te koncentrują się m.in. na otrzymywaniu antybiotyków półsyntetycznych z grupy penicylin, cefalosporyn, tetracyklin i aminoglikozydów, które charakteryzują się korzystniejszymi właściwościami leczniczymi, w tym często rozszerzonym spektrum działania, wynikającym ze zwiększonej odporności antybiotyków półsyntetycznych na działanie enzymów katalizujących ich rozkład. Proces biosyntezy obejmuje następujące etapy produkcyjne: przygotowanie wyselekcjonowanych szczepów drobnoustrojów, wytworzenie właściwych antybiotyków i oczyszczenie ich za pomocą odpowiednio dobranych procesów fizykochemicznych.

Do ważnych leków otrzymywanych metodami biosyntezy z zastosowaniem mikroorganizmów należy cyklosporyna - lek o właściwościach immunosupresyjnych, oraz lowastatyna - lek regulujący profil lipidowy metabolizmu organizmów wyższych.

1.7.2.6.Metody otrzymywania leków - biotechnologia i inżynieria genetyczna

W ostatnich latach wzrosło znaczenie biotechnologii oraz metod inżynierii genetycznej, zarówno jeśli chodzi o metody otrzymywania leków, jak i badania naukowe nad nowymi lekami. Uzyskiwane tą drogą tzw. biofarmaceutyki (leki biologiczne) są wynikiem rekombinacji genetycznej, modyfikującej właściwości dziedziczne m.in. bakterii (Escherichia coli), drożdży (Saccharomyces cerevisie) i linii komórkowych ssaków (CHO - Chinese hamster ovary, BHK - baby hamster kidney). Technologia ta umożliwia uzyskiwanie substancji o strukturze peptydowej lub białkowej, których otrzymanie na drodze syntezy organicznej jest bardzo trudne lub niemożliwe. Proces ten polega na wyizolowaniu fragmentu DNA odpowiedzialnego za wytwarzanie interesującego białka u człowieka za pomocą enzymów restrykcyjnych, które są kolejno wprowadzane do hodowli komórkowej w obecności odpowiednich wektorów. W hodowli następuje namnażanie materiału genetycznego odpowiedzialnego za produkcję zaplanowanej substancji. Biofarmaceutyki są najczęściej produktami o strukturze białkowej. Ich działanie polega na naśladowaniu funkcji prawidłowych białek ludzkich, modyfikowaniu procesów transdukcji sygnału przez oddziaływanie z błonowymi białkami receptorowymi, a nawet na regulacji komunikacji między komórkami.

Pierwszym tego typu lekiem była insulina, odkryta w 1921 roku przez Bantinga i Besta. Początkowo pozyskiwano ją w wyniku ekstrakcji z trzustek zwierzęcych. W 1982 roku otrzymano pierwszy preparat insuliny, wyprodukowanej przy użyciu bakterii Escherichia coli. Podanie modyfikowanych zwierzęcych form insuliny, skutkowało jednak częstymi reakcjami alergicznymi u pacjentów. Dzięki postępowi metod "manipulacji genetycznych" otrzymywanie insuliny stało się procesem bardzo wydajnym i mniej kosztownym, który w ostatnich latach umożliwił uzyskanie produktu w pełni pochodzenia ludzkiego. Bardziej zaawansowana technika inżynierii białkowej, polegająca na modyfikacji sekwencji aminokwasowej, umożliwiła otrzymanie insuliny o zmodyfikowanym czasie działania (patrz rozdz. 9.6.2). Później w terapii wykorzystano: rekombinowane ludzkie postacie hormonu wzrostu, somatostatyny, preparaty stosowane w hematologii (erytropoetyna), czynniki płytkowe krwi oraz czynniki układu immunologicznego (interferony, interleukiny).

Przeciwciała monoklonalne to nowa grupa biofarmaceutyków o budowie białkowej, której znaczenie w farmakoterapii w ostatnich latach wzrosło. Zaletą stosowania przeciwciał monoklonalnych jest m.in. ich wysoka specyficzność w stosunku do białek regulujących procesy chorobowe. Z tego względu stosowanie przeciwciał monoklonalnych jest określane mianem terapii celowanej. Przeciwciała są zbudowane z 4 łańcuchów polipeptydowych: 2 lekkich i 2 ciężkich, które połączono mostkami dwusiarczkowymi (ryc. 1.50). W obrębie struktury przeciwciał można wyróżnić fragment Fab - wiążący antygen, oraz fragment Fc - odpowiedzialny za rozpoznanie białka ustrojowego i wiązanie dopełniacza. O swoistości przeciwciał decyduje głównie sekwencja aminokwasów, warunkująca konfigurację przestrzenną łańcuchów lekkich i ciężkich fragmentu Fab. Część zmienna składa się z trzech hiperzmiennych regionów, warunkujących komplementarność.

RYCINA 1.50. Budowa przeciwciał monoklonalnych klasy IgG.

Technikę otrzymywania przeciwciał monoklonalnych opracowano w latach 80. XX wieku. Jej podstawa jest zbieżna z zasadą działania układu immunologicznego organizmu, który w wyniku rozpoznania obcych białek (antygenów) przez limfocyty B i T wytwarza specyficzne, naturalne przeciwciała. Początkowo sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych polegał na wstrzyknięciu myszom antygenów, przeciwko którym uruchamiana była produkcja przeciwciał, izolowanych następnie jako produkt finalny z krwi gryzoni. Przeciwciała mysie wprowadzone do organizmu człowieka były w krótkim czasie rozpoznawane jako obce antygeny. Organizm ludzki wytwarzał odpowiednie mechanizmy ochronne, prowadzące do wywoływania odczynów nadwrażliwości (alergia). Zastąpienie fragmentów przeciwciał zwierzęcych (łańcuchów ciężkich i lekkich) materiałem pochodzenia ludzkiego pozwoliło na zmniejszenie stopnia immunizacji. W ten sposób opracowano przeciwciała chimeryczne, których część stałą lub efektorową stanowi fragment pochodzenia ludzkiego (65-90%), a regiony zmienne, odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu (Fab) - fragmenty pochodzenia mysiego. W przeciwciałach humanizowanych sekwencje mysie pozostawiono tylko we fragmentach hiperzmiennych, odpowiedzialnych za komplementarność i swoistość przeciwciał. Najbardziej zaawansowane technologicznie są przeciwciała ludzkie, które nie zawierają elementów mysich i są prawie całkowicie pozbawione immunogenności (tab. 1.8). Przeciwciała ludzkie są produkowane przez transgeniczne myszy, których odpowiedni fragment DNA został zastąpiony DNA kodującym ludzkie immunoglobuliny.

Niezależnie od bezpośredniego i specyficznego efektu biologicznego, charakterystycznego dla przeciwciał klas IgG1-IgG4, przeciwciała IgG1 i IgG3 wykazują zdolność uruchamiania cytotoksycznych mechanizmów immunologicznych (ADCC - antibody-dependent cellular cytotoxicity). W praktyce klinicznej najczęściej stosowane są przeciwciała IgG1, charakteryzujące się dłuższym okresem półtrwania (około 23 dni) niż przeciwciała IgG3 (około 7 dni).

Przeciwciała monoklonalne, dzięki specyficznym mechanizmom pozwalającym im wybiórczo wiązać się na powierzchni komórek, znalazły zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej, transplantologii, kardiologii i dermatologii oraz w leczeniu chorób o podłożu autoimmunologicznym, w tym osteoporozy. Mają również zastosowanie jako środki stosowane do celów diagnostycznych. W wyniku związania się przeciwciał ze specyficznymi antygenami, zlokalizowanymi np. na powierzchni komórek nowotworowych, uruchamiane są mechanizmy inicjujące proces niszczenia tych komórek. Zasady nomenklatury oraz przykłady przeciwciał monoklonalnych przedstawiono w tabeli 1.8.

TABELA 1.8. Nazewnictwo przeciwciał monoklonalnych

Przeciwciała

Zawartość białka ludzkiego

Nazewnictwo (końcówki nazw)

Przykłady

Mysie

-

-momab

Muromomab (Orthoclone), tositumomab (Bexxar)

Chimeryczne

50-90%

-ksymab

Bazyliksymab (Simulect)

Humanizowane

Około 95%

-zumab

Denozumab (Prolia)

Ludzkie

100%

-mumab

Adalimumab (Humira)

Niezależną grupę leków biologicznych stanowią białka fuzyjne, wytwarzane metodami inżynierii genetycznej przez połączenie dwóch genów odpowiedzialnych za produkcję dwóch niezależnych białek. W ten sposób skomponowane białko ma masę cząsteczkową powyżej 100 kDa. Białka fuzyjne charakteryzują się wysoką swoistością i skutecznością farmakologiczną.

Inżynieria genetyczna umożliwiła rozszerzenie badań nad nowymi celami biologicznymi, m.in. enzymami i receptorami. W testach przesiewowych in vitro wykorzystuje się receptory namnożone w kulturach bakteryjnych, co przyspiesza ocenę aktywności de novo syntetyzowanych połączeń chemicznych. Metody inżynierii genetycznej są wykorzystywane również do wytwarzania tzw. organizmów transgenicznych, tj. genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, u których indukuje się proces chorobowy. Tego typu modele zwierzęce umożliwiają weryfikację hipotez stawianych w procesie poszukiwania nowych leków.

1.7.3.Badania przedkliniczne nowych związków biologicznie aktywnych

Badania fazy przedklinicznej obejmują optymalizację struktury wiodącej metodami in silico i in vitro oraz badania związków w modelach zwierzęcych. Celem tych badań jest określenie aktywności farmakologicznej i wyznaczenie parametrów farmakokinetycznych. Ważnym etapem jest także ocena toksykologiczna, wskazująca m.in. na możliwość uszkodzenia niektórych narządów szczególnie narażonych na działanie nowej substancji. W przebiegu tych badań zwierzęta laboratoryjne są poddawane ocenie histologicznej i biochemicznej, potwierdzającej lub wykluczającej zmiany tkankowe i narządowe. Dodatkowo określa się również wpływ testowanych związków na procesy rozrodcze i możliwość zaburzania procesów genetycznych (genotoksyczność).

Kolejnym etapem badań przedklinicznych jest optymalizacja metod syntezy i oczyszczania związku uzyskanego w skali półtechnicznej oraz określenie jego stabilności chemicznej jako kandydata na lek w różnych warunkach środowiska. Efektem prac fazy przedklinicznej jest również opracowanie odpowiedniej postaci leku. W celu zapewnienia wiarygodności prowadzonych badań oraz wyeliminowania ludzkiego błędu, wszystkie eksperymenty prowadzone są zgodnie w wytycznymi dobrej praktyki laboratoryjnej (GLP - good laboratory practice).

Dla substancji, która pozytywnie przeszła ocenę przedkliniczną, przygotowywana jest dokumentacja, przekazywana następnie do akceptacji przez organy dopuszczające do kolejnej fazy badań, jakimi są testy wykonywane na ludziach (badania kliniczne). W Polsce jest to Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Substancji Biobójczych, w USA - Agencja Żywności i Leków (FDA - Food and Drug Administration).

1.7.4.Badania kliniczne nowych leków

Badania kliniczne (clinical trials) prowadzone na organizmach ludzkich mają na celu potwierdzenie skuteczności i bezpieczeństwa terapii oraz ocenę efektów wywieranych przez testowany związek w porównaniu z efektami wybranego leku referencyjnego. Badania kliniczne składają się zwykle z trzech obowiązkowych faz (I-III), niezbędnych do rejestracji związku jako leku. Dodatkowe badania (faza IV) polegają na monitorowaniu wszystkich efektów zgłoszonych po wprowadzeniu leku do terapii.

Badania I fazy są prowadzone na nielicznej grupie zdrowych ochotników (zwykle 20-80 osób). Jedynym wyjątkiem są pacjenci będący w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej oraz chorzy na AIDS. Celem I fazy badań klinicznych jest określenie bezpiecznych dawek dla ludzi oraz ocena biodostępności i tolerancji nowej substancji.

Kandydat na lek jest następnie poddawany badaniom fazy II, prowadzonym na większej grupie pacjentów i zdrowych ochotników (średnio 100-300 osób). Badania te realizuje się metodą prób randomizowanych. Substancje niespełniające kryteriów skuteczności i bezpieczeństwa są najczęściej odrzucane właśnie na tym etapie. W przypadku badania leku mającego działać na nowy cel biologiczny jest to pierwszy moment, w którym w sposób jednoznaczny weryfikacji podlega poprawność przyjętych wcześniej założeń (hipotez).

Badania III fazy mają również charakter randomizowany i są realizowane z zastosowaniem podwójnie ślepej próby. Testy są prowadzone na dużej liczbie pacjentów, często w wielu ośrodkach badawczych. Zasadniczym ich celem jest określenie w sposób jednoznaczny skuteczności danego kandydata na lek. Badania te zwykle trwają kilka lat. Właściwości terapeutyczne nowego leku powinny przewyższać dotychczas stosowane leki, nie bez znaczenia jest również efektywność kosztowa, co wymaga przeprowadzenia odpowiednich analiz farmakoekonomicznych. Pozytywna ocena wszystkich klinicznych aspektów działania leku umożliwia podjęcie starań przez firmę farmaceutyczną o wydanie zezwolenia na wprowadzenie leku do farmakoterapii (na "rynek leków").

Badania IV fazy są prowadzone po wprowadzeniu leku do terapii i mają na celu monitorowanie jego długoterminowej skuteczności oraz bezpieczeństwa stosowania, tzn. zapewnienie ochrony pacjentów przed rzadko występującymi efektami niepożądanymi działania leku, które pojawiają się po dłuższym okresie stosowania i mogą być podstawą do ograniczenia wskazań, a nawet wycofania leku. Na skutek badań IV fazy w ostatnich latach wycofano z obrotu m.in.: cerywastatynę (lek obniżający poziom cholesterolu), troglitazon (lek przeciwcukrzycowy) oraz rofekoksyb (niesteroidowy lek przeciwzapalny).

1.8.Wybrane zagadnienia z zakresu toksykologii leków i niektórych substancji chemicznych

1.8.1.Działania niepożądane leków

Większość obecnie stosowanych leków oprócz korzystnych efektów farmakologicznych może wywierać szkodliwe działania niepożądane. Przyczyn tego zjawiska należy dopatrywać się w głównym mechanizmie działania leku, np. hipotonia ortostatyczna może być efektem podania ?-metylodopy (?1-adrenolityk), a uszkodzenie wątroby - stosowania wysokich dawek paracetamolu (przewyższających dopuszczalne dawki terapeutyczne). Występowanie efektów niepożądanych może być spowodowane nadwrażliwością osobniczą na dany lek oraz takimi czynnikami, jak wiek i płeć. Pod względem klinicznym działania te mogą dotyczyć jednego narządu lub mieć charakter wielonarządowy; często ujawniają się z dużym opóźnieniem, niejednokrotnie już po zakończeniu terapii. Sprawia to, że wskazanie potencjalnych niebezpieczeństw wynikających ze stosowania leków nie jest łatwe i stanowi duże wyzwanie dla pracowników zajmujących się oceną bezpieczeństwa farmakoterapii.

Działania niepożądane leków mogą się również pojawić w wyniku interakcji z innymi lekami. Jedną z przyczyn tego zjawiska jest współzawodniczenie o układy enzymatyczne biorące udział w procesach biotransformacji (metabolizmie), w wyniku czego może dojść do nasilenia toksyczności powodowanej przez metabolit (metabolity) powstający w wyniku tych procesów. Opisane zjawisko może być związane z inhibicją izoenzymów cytochromu P450. Zaobserwowanie następstw tego typu działań niepożądanych leku, niekiedy nawet zgonów, może spowodować ograniczenie jego stosowania tylko do niektórych wskazań (np. cizapryd) lub wycofania go z farmakoterapii (m.in. astemizol i cerywastatyna).

Bezpieczeństwo i skuteczność farmakoterapii są uwarunkowane rzetelną i ugruntowaną wiedzą na temat korzystnych i niepożądanych efektów działania leków. W wielu przypadkach wymagane są indywidualna ocena i zestawienie możliwych korzyści z zastosowania leku (wynikających z jego terapeutycznego działania) z zagrożeniami (wynikającymi z jego działań niepożądanych, toksycznych). Ustalenie stopnia ryzyka pozwala na określenie przeciwwskazań - bezwzględnych i względnych.

Przeciwwskazania bezwzględne wykluczają zastosowanie danego leku w terapii określonych schorzeń (dyskwalifikują ten lek) lub wprowadzają zakaz łączenia go z niektórymi innymi lekami. Przeciwwskazania względne wprowadzają ograniczenia i przestrzegają przed wzrostem ryzyka pojawienia się działań niepożądanych lub toksycznych. Na przykład antybiotyki tetracyklinowe są względnie przeciwwskazane w okresie ciąży. Wraz z postępem wiedzy zachodzą istotne zmiany w formułowaniu przeciwwskazań do stosowania leków. Kilkanaście lat temu przeciwwskazaniem bezwzględnym do stosowania ?-adrenolityków była astma. Pojawienie się ?-adrenolityków kardioselektywnych sprawiło, że astma stanowi aktualnie tylko przeciwwskazanie względne.

Przyczyn zmian funkcjonalnych organizmu będących wynikiem toksycznego działania leków należy upatrywać we właściwościach fizykochemicznych leków. Specyficzne procesy, jakim podlegają związki biologicznie aktywne, prowadzą do upośledzenia funkcji komórek lub nawet ich śmierci (apoptozy). Za uszkodzenie komórek odpowiadają często wiązania kowalencyjne lub oddziaływania niekowalencyjne. Przykładem tych drugich jest tworzenie toksycznych wolnych rodników, które mogą powodować peroksydację lipidów błon komórkowych i reakcje prowadzące do wyczerpania zapasów glutationu lub mogą modyfikować grupy sulfhydrylowe enzymów.

Peroksydacja lipidów, głównie we fragmentach wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, może być wynikiem bezpośredniego działania aktywnych metabolitów leków lub reaktywnych wolnych rodników tlenowych generowanych przez te metabolity. Przyczyną uszkodzenia komórek lub ich śmierci bywa również zaburzenie przepuszczalności błon komórkowych. Przed tego typu zagrożeniami mogą chronić procesy zachodzące pod wpływem niektórych enzymów (np. peroksydazy glutationowej) lub witamin (np. witaminy E).

Tworzenie wolnych rodników tlenowych przez aktywne metabolity leków polega na redukcji tlenu cząsteczkowego do anionów ponadtlenkowych (O2- -), które po konwersji enzymatycznej tworzą nadtlenek wodoru lub wolne rodniki wodoronadtlenkowe (HOO-) i hydroksylowe (OH-). Reaktywne rodniki tlenowe działają cytotoksycznie, powodując uszkodzenia kwasów nukleinowych.

Elementem obrony komórkowej przed toksycznym działaniem wolnych rodników są także endogenne układy o właściwościach oksydoredukcyjnych, w których znaczącą rolę odgrywa glutation. W wyniku tzw. stresu oksydacyjnego dochodzi do przekształcenia glutationu (GSH) w jego formę zredukowaną - GSSG. Zmniejszenie ilości glutationu do 20-30% prawidłowej zawartości w zdrowych komórkach upośledza system obronny komórek, czyniąc go podatnym na szkodliwy wpływ leków.

W aktywności katalitycznej enzymów ważną rolę odgrywają ugrupowania sulfhydrylowe. Grupy te mogą ulegać zmianom odwracalnym lub nieodwracalnym pod wpływem czynników utleniających, jeśli dochodzi do utworzenia nowych wiązań kowalencyjnych, np. mostków disiarczkowych, w wyniku dehydrogenacji grup sulfhydrylowych. Szczególnie podatne na działanie reaktywnych metabolitów są grupy SH występujące w aktynie mięśni szkieletowych, reduktazie glutationowej oraz ATPazie, odpowiedzialnej m.in. za transport jonów Ca2+ przez błony komórkowe. Konsekwencją przedłużającej się ekspozycji enzymów na działanie czynników uszkadzających może być śmierć komórek.

Oddziaływania typu kowalencyjnego opierają się na tworzeniu połączeń trwale upośledzających funkcję biomolekuł, w tym kwasów nukleinowych i lipidów. Mechanizm ten odpowiada m.in. za kancerogenne i teratogenne działanie leków.

1.8.2.Działanie toksyczne leków

Biotransformacja leków, która zachodzi przy współudziale cytochromu P450, może być przyczyną uszkodzenia komórek wątrobowych - hepatocytów. Paracetamol, często stosowany lek przeciwbólowy, w przypadku znacznego przekroczenia dawek leczniczych może tworzyć metabolity o silnym działaniu hepatotoksycznym. Trwałe uszkodzenie wątroby często następuje, gdy wyczerpane zostaną zasoby glutationu wątrobowego, który jest niezbędny do unieszkodliwiania toksycznego metabolitu - N-acetylobenzochinoiminy (patrz rozdz. 2.7.5). Proces ten może ulec nasileniu w przypadku równoczesnego podania związków będących induktorami układów enzymatycznych wątroby.

Objawami klinicznymi uszkodzenia wątroby są: podwyższenie aktywności (poziomu) enzymów wątrobowych (AspAT i AlAT) oraz stan zapalny.

W wyniku metabolizmu anestetyków wziewnych tworzą się metabolity, które toksycznie działają na wątrobę. Halotan, ulegając utlenianiu, tworzy kwas trifluorooctowy, który łączy się w sposób kowalencyjny z białkami hepatocytów, co prowadzi do ich uszkodzenia. Ze względu na toksyczne działanie związków fluoru przedstawiciel halogenowanych pochodnych eterowych - metoksyfluran - został wycofany z lecznictwa.

1.8.2.1.Działanie nefrotoksyczne leków

Nerki, jako narząd odpowiedzialny za wydalanie leków oraz ich metabolitów, w szczególny sposób narażone są na ich uszkadzający wpływ. Potęguje on zagęszczanie moczu i zwiększenie stężenia leku w kanalikach nerkowych. Przyczyną uszkodzenia nerek może być również krystalizacja substancji leczniczych w wyniku zmiany pH moczu.

Liczną grupę leków o działaniu nefrotoksycznym stanowią antybiotyki aminoglikozydowe, niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) oraz diagnostyczne środki cieniujące. Należy podkreślić, że kontrolę funkcji nerek powinno się przeprowadzać w przypadku terapii lekami: przeciwnowotworowymi, przeciwwirusowymi, stosowanymi m.in. w terapii AIDS (acyklowir, foskarnet), oraz immunosupresyjnymi. Antybiotyki aminoglikozydowe, jako związki o silnym charakterze zasadowym, wiążą się z fosfoinozytolowymi fragmentami błon kanalika nerkowego, tworząc odpowiednie kompleksy. Biosynteza tych połączeń powoduje zaburzenie czynności komórek, prowadzące nawet do ich martwicy. Najczęściej jednak procesy te mają charakter zmian odwracalnych i po pewnym czasie dochodzi do regeneracji uszkodzonych komórek. W wyniku zagęszczania moczu może dojść do zwiększenia stężenia środków cieniujących stosowanych w diagnostyce, co pociąga za sobą ryzyko uszkodzenia kanalików nerkowych.

1.8.2.2.Działanie kardiotoksyczne leków

Główną przyczyną kardiotoksycznego działania leków jest wydłużenie odstępu QT w zapisie elektrokardiogramu, co jest ściśle skorelowane z wpływem tych leków na kanały potasowe zlokalizowane w mięśniu sercowym. W konsekwencji dochodzi do zaburzeń kurczliwości mięśnia sercowego, predysponujących do arytmii komorowych, migotania komór i nagłej śmierci sercowej. Tego typu działania niepożądane mogą wystąpić w przypadku stosowania leków z grupy fluorochinolonów (np. sparfloksacyny), antybiotyków makrolidowych (np. erytromycyny, klarytromycyny) oraz neuroleptyków (np. olanzapiny, rysperydonu). Działanie kardiotoksyczne było m.in. przyczyną wycofania z rynku leku antyhistaminowego terfenadyny.

Inny mechanizm powstawania powikłań sercowo-naczyniowych jest opisywany w przypadku antybiotyków antracyklinowych, stosowanych w terapii przeciwnowotworowej. Zdolność generowania wolnych rodników hydroksylowych w wyniku metabolicznej przemiany chinonów do hydrochinonów może być przyczyną peroksydacji lipidów i zmian czynnościowych błon komórkowych. Zaburzona wymiana jonów Na+-Ca2+ przyczynia się do wzrostu stężenia jonów wapnia wewnątrz komórek mięśnia sercowego, zaburzając jego kurczliwość i powodując arytmie sercowe.

1.8.2.3.Działanie ototoksyczne leków

Ototoksyczność (pojęcie wprowadzone w 1951 roku) jest to niepożądane działanie niektórych leków i substancji chemicznych polegające na degeneracji komórek ucha wewnętrznego i upośledzeniu czynności tego narządu (upośledzeniu słuchu).

Antybiotyki aminoglikozydowe (streptomycyna, gentamycyna, tobramycyna) stanowią podstawową grupę leków stosowanych w terapii ciężkich zakażeń wywołanych pałeczkami Gram-ujemnymi. Ich działanie toksyczne polega na stymulowaniu tworzenia się trwałych kompleksów białkowych, podlegających kumulacji w limfie ucha środkowego, których oddziaływanie na komórki ucha wewnętrznego powoduje zaburzenie funkcji komórek zmysłowych ślimaka. Efekty te mogą występować po kilku, a nawet kilkunastu dniach leczenia. Nasilenie efektu toksycznego zależy od całkowitej dawki antybiotyku.

Dużą grupę leków uszkadzających narząd słuchu stanowią cytostatyki. Najwyższą aktywność toksyczną wykazują związki platyny. Powikłania stwierdza się u nawet 30% osób poddanych terapii tymi lekami. Przejściowe zaburzenia słuchu, głównie szumy, obserwuje się również w trakcie terapii winkrystyną i metotreksatem.

1.8.2.4.Działanie teratogenne leków

Wpływ czynników zewnętrznych na rozwój płodu jest znany od lat 20. ubiegłego stulecia, kiedy to zaobserwowano, że działanie promieniowania X na kobiety ciężarne powoduje upośledzenie płodu, a nawet jego śmierć. Teratogenne działanie leków zostało po raz pierwszy opisane na początku lat 60. XX wieku. U dzieci matek, które w okresie ciąży stosowały lek nasenny talidomid, stwierdzano wówczas ciężkie mnogie wady wrodzone. Późniejsze badania wykazały, że za trwałe zmiany strukturalne zachodzące podczas rozwoju płodu odpowiada izomer S talidomidu [(S)-N-ftalimido-3-glutarimid]. Podstawą teratogennego działania talidomidu jest wywoływany przez ten lek stres oksydacyjny, który prowadzi do utleniania fragmentów kwasów nukleinowych oraz białek płodowych na etapie budowania organów dziecka.

Natomiast odmiana R talidomidu nie wykazuje tego rodzaju aktywności i mogłaby być stosowana jako lek ułatwiający zasypianie.

RYCINA 1.51. Talidomid.

Badania na zwierzętach czystego izomeru R wykazały, że w organizmie ssaków dochodzi do zmian konfiguracji, w wyniku których pojawia się izomer S, a następująca racemizacja daje mieszaninę dwóch stereoizomerów.

Mimo poważnych przeciwwskazań korzystne działanie terapeutyczne talidomidu w niektórych odmianach trądu stało się przyczyną powrotu do jego stosowania. Podjęto także próby leczenia tym środkiem opornych postaci wrzodziejącego zapalenia jelita grubego oraz zwalczania komórek nowotworowych szpiczaka mnogiego (patrz rozdz. 12.12.3).

Izotretynoina (kwas 13-cis-retinowy) to syntetyczny stereoizomer kwasu trans-retinowego, analog witaminy A stosowany zewnętrznie i doustnie w leczeniu trądziku oraz łuszczycy. Spontanicznie lub pod wpływem enzymów zawierających ugrupowania sulfhydrylowe izotretynoina izomeryzuje do kwasu trans-retinowego. Toksyczne działanie na ludzki płód wykazuje zarówno izotretynoina, jak i kwas trans-retinowy (patrz rozdz. 10.1). Efektem ich działania są poważne uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego, brak lub deformacja uszu, rozszczepienie podniebienia, nieprawidłowości dotyczące układu sercowo-naczyniowego, a także upośledzenie narządu wzroku. Izotretynoina jest lekiem silnie toksycznym, gdyż już jej pojedyncza dawka może być teratogenna.

Uszkadzający wpływ na płód wywierają leki przeciwnowotworowe z grupy środków alkilujących (m.in. chlorambucyl, cyklofosfamid) oraz antymetabolity (azatiopryna, merkaptopuryna), które często wywołują efekt poronny. Metotreksat, zaburzając syntezę kwasu foliowego, może powodować trwałe uszkodzenie układu nerwowego.

1.8.2.5.Działanie kancerogenne leków

Kancerogeneza jest procesem polegającym na przekształcaniu, w wyniku mutacji DNA, prawidłowych komórek organizmu w komórki nowotworowe. Przyjmuje się, że blisko 90% nowotworów u ludzi jest wynikiem działania czynników środowiskowych (fizycznych i chemicznych), często substancji przechodzących przez przewód pokarmowy i drogą wziewną (palenie tytoniu, ekspozycja na światło, substancje chemiczne i leki). Duże zróżnicowanie strukturalne chemicznych czynników kancerogennych (np. nieorganiczne sole arsenu, węglowodory aromatyczne, nitrozoaminy) uniemożliwia jednoznaczne określenie fragmentów predysponujących do tego typu niekorzystnego działania oraz wskazuje na występowanie wielu mechanizmów indukujących nowotwory.

Czynniki kancerogenne dzielą się na genetyczne i epigenetyczne. Czynniki genetyczne (tzw. kancerogeny pierwotne i wtórne) bezpośrednio uszkadzają łańcuchy kwasów nukleinowych, tworząc trwałe wiązania kowalencyjne. Głównymi kancerogenami są substancje o charakterze wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych i amin aromatycznych oraz związki alkilujące. Efekty ich rakotwórczego działania pojawiają się po długim, nawet dwudziestoletnim, okresie utajenia.

W przypadku czynników epigenetycznych nie udowodniono ich genotoksyczności. Do tej grupy zalicza się zarejestrowane leki - niektóre hormony z grupy estrogenów i gestagenów oraz substancje o działaniu immunosupresyjnym. Przez modulację funkcji komórek mogą one w sposób pośredni zwiększać prawdopodobieństwo kancerogenezy. Podobnie działają kokancerogeny i promotory kancerogenezy, które po zakończeniu ekspozycji na kancerogen zwiększają skutki jego działania (ryc. 1.52). Do grupy kokancerogenów zalicza się stosowane w syntezie organicznej węglowodory aromatyczne i alifatyczne.

RYCINA 1.52. Mechanizmy kancerogenezy chemicznej.

Stosowane w lecznictwie naczyniorozszerzające azotany organiczne cechują się niską toksycznością, zagrożenie mogą natomiast stwarzać azotany nieorganiczne (saletry) wykorzystywane w przemyśle spożywczym do peklowania mięsa. W wyniku ich redukcji, szczególnie w czasie procesu wędzenia na gorąco, powstają pewne ilości azotynów, odpowiedzialnych m.in. za przekształcenie hemoglobiny w methemoglobinę i zakłócanie bilansu tlenowego komórek. Nieorganiczne azotyny w środowisku kwaśnym ulegają rozkładowi z uwolnieniem wolnego kwasu azotawego (azotowego III), który może nitrozować II-rzędowe grupy aminowe niektórych czynników środowiskowych, leków i produktów ich rozkładu. Powstające N-nitrozoaminy (np. N-nitrozodimetyloamina) mają udowodnione właściwości kancerogenne. Było to przyczyną wycofania z farmakoterapii cennego leku o działaniu przeciwgorączkowym - aminofenazonu (patrz rozdz. 2.7.5.2). Rozkład tego leku w środowisku kwaśnym, z uwolnieniem i nitrozowaniem dimetyloaminy, na skutek kilkuetapowego procesu enzymatycznego może doprowadzić do wygenerowania aktywnych wolnych rodników metylowych, modyfikujących DNA przez ich wiązanie w zasadach purynowych i pirymidynowych, a w efekcie - do zaburzenia procesów biosyntezy białek ustrojowych i pojawienia się ryzyka chemicznej kancerogenezy.

1.8.3.Działanie toksyczne niektórych substancji chemicznych

Związki chemiczne o zróżnicowanej strukturze stanowią potencjalne źródło zagrożenia zdrowia jako substancje obce dla organizmu, często obdarzone wysoką reaktywnością, zdolne do modyfikacji grup funkcyjnych i układów, endogennych składników tkanek oraz narządów. Wchłaniając się do organizmu drogą oddechową, przez skórę i błony śluzowe oraz drogą pokarmową, mogą wywoływać niebezpieczne w skutkach zaburzenia, nierzadko prowadzące nawet do śmierci. Efekty działania chemicznych środków toksycznych mogą manifestować się w miejscu podania, np. na skórze, błonach śluzowych jam ciała lub w układzie oddechowym. Mogą także wykazywać aktywność ogólną, na większość narządów (podlegając biotransformacji w wątrobie lub kumulacji w tkankach), w tym narządów o szczególnej wrażliwości, takich jak układ nerwowy, krwiotwórczy i odpornościowy oraz gonady. Szczególnie groźny może być wpływ substancji chemicznych na materiał genetyczny.

Rosnące obawy dotyczące zdrowia oraz zwiększająca się świadomość groźnych skutków nieprzestrzegania zasad bezpiecznego gospodarowania substancjami chemicznymi skłania do zwrócenia uwagi na podstawowe mechanizmy toksycznego wpływu chemikaliów na organizm człowieka oraz na podstawowe zasady bezpieczeństwa pracy w laboratoriach badawczych, w których wykonuje się syntezę i kontrolę jakości leków.

1.8.3.1.Klasyfikacja substancji chemicznych według stopnia toksyczności

Rosnące obawy dotyczące niewłaściwego stosowania substancji chemicznych doprowadziły do opracowania przez Komisję Europejską regulacji prawnych, mających na celu zapewnienie maksymalnego bezpieczeństwa i racjonalizujących gospodarkę tymi substancjami. Wprowadzone dyrektywy uwzględniają system oznaczeń niebezpiecznych produktów chemicznych. Oprócz nazw międzynarodowych na opakowaniach znajdują się znaki ostrzegawcze - piktogramy. Tło opakowania jest w kolorze pomarańczowym, natomiast właściwa informacja - w kolorze czarnym lub żółtym. Tego rodzaju oznakowanie klasyfikuje związek chemiczny do odpowiedniej grupy, w zależności od rodzaju zagrożenia wyni­kającego z właściwości substancji (tab. 1.9).

TABELA 1.9. Klasyfikacja substancji chemicznych

Symbol produktu

Grupa związków

E

Produkty wybuchowe

O

Produkty utleniające

F; F+

Produkty wysoce łatwopalne; produkty skrajnie łatwopalne

T; T+

Produkty toksyczne; produkty bardzo toksyczne

C; Xn

Produkty żrące; produkty szkodliwe

Xi; N

Produkty drażniące; produkty niebezpieczne dla środowiska

Ponadto wprowadzono oznakowania, które określają rodzaj zagrożenia (symbol R) oraz warunki bezpiecznego stosowania (symbole S). Na przykład symbol R21 informuje, że substancja działa szkodliwie w kontakcie ze skórą, symbol S51 - że odczynnik powinien być przechowywany w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, natomiast symbol S60 - że produkt i opakowanie należy utylizować jako materiał niebezpieczny.

Nadzorowi muszą podlegać zarówno składowanie, jak i właściwa segregacja oraz utylizacja materiałów jako odpadów chemicznych. Większość chemikaliów nie ulega biodegradacji, co skutkuje skażeniem środowiska naturalnego.

1.8.3.2.Działanie toksyczne metali ciężkich

Objawy toksycznego działania metali ciężkich są wynikiem kontaktu z ich parami (rtęć) lub połączeniami, którymi najczęściej są tlenki i sole tych metali. Często efekty toksyczne związane z działaniem tych preparatów są potęgowane na skutek zdolności ich kumulacji w tkankach i w narządach, szczególnie w sercu, nerkach, wątrobie i w układzie nerwowym. Objawy zatrucia mogą ujawnić się nawet po wielu latach. U podstaw toksycznego działania metali ciężkich leży łatwość tworzenia dość trwałych połączeń kowalencyjnych, szczególnie z grupami sulfhydrylowymi białek, co powoduje blokowanie czynności enzymów. Metale ciężkie mogą stanowić bardzo poważny czynnik sprzyjający procesom kancerogenezy i teratogenezy, często są odpowiedzialne za zaburzenia rozwoju narządów i nieprawidłową realizację ich podstawowych funkcji fizjologicznych.

Na szczególną uwagę zasługują rtęć i jej preparaty. W średniowieczu metal ten był szeroko wykorzystywany jako środek przeciwbakteryjny do zwalczania kiły. Trujące pary rtęci skutecznie likwidowały owrzodzenia kiłowe, najczęściej jednak pacjent poddany ekspozycji na pary rtęci umierał na skutek przewlekłego zatrucia. Dzisiaj rtęć nie ma zastosowania leczniczego, a jej rola w różnego rodzaju urządzeniach jest znacząco ograniczana. Tam, gdzie to możliwe, rtęć jest zastępowana innymi materiałami (termometry). Większość zarówno organicznych, jak i nieorganicznych połączeń rtęci wykazuje wysoką toksyczność. W przeszłości najczęstszą przyczyną zatruć był rozpuszczalny w wodzie sublimat - chlorek rtęci na stopniu utlenienia (2+). Jego odpowiednik, praktycznie nierozpuszczalny w wodzie - kalomel, w którym rtęć występuje na niższym stopniu utlenienia (1+), nie wykazywał toksycznego działania i był stosowany jako środek przeczyszczający. Ze względu na możliwość omyłkowego podania sublimatu zamiast kalomelu oba preparaty wycofano z lecznictwa. Jako wysoce lipofilowe preparaty rtęci łatwo przenikają przez barierę naczyniowo-mózgową, powodując zmiany zwyrodnieniowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Toksyczne działanie preparatów rtęci skutkuje uszkodzeniami kanalików nerkowych, prowadzącymi do poważnego upośledzenia funkcji nerek. W przypadku zatrucia rtęcią w jamie ustnej pojawiają się zmiany martwicze, a na dziąsłach - charakterystyczny czarny "rąbek rtęciowy".

1.8.3.3.Działanie toksyczne substancji żrących

W codziennej praktyce laboratoryjnej dochodzi często do kontaktu ze stężonymi roztworami mocnych kwasów nieorganicznych i mocnych zasad (np. wodorotlenkami litowców). Związki te w krótkim czasie powodują martwicę żywych tkanek (skóry, błon śluzowych). Pod wpływem kwasów dochodzi do koagulacji białek, zmiany są często powierzchowne i mają odwracalny charakter. Zależy to od rodzaju kwasu, jego stężenia i czasu ekspozycji. Wysokie stężenia po dłuższym czasie powodują głębokie, nieodwracalne zmiany martwicze. W przypadku oddziaływania stężonego roztworu kwasu azotowego zachodzą procesy utlenienia wrażliwych ugrupowań związków endogennych, pierścienie aromatyczne i heteroaromatyczne ulegają reakcjom nitrowania, wywołując charakterystyczne żółte zabarwienie, np. na skórze (reakcja ksantoproteinowa białek). Stężone roztwory kwasu siarkowego wykazują silne działanie odwadniające - tkanka pod ich wpływem ulega odwodnieniu, a skóra "pomarszczeniu" na skutek związania przez kwas wody z głębszych jej warstw i z tkanki podskórnej. Mniej charakterystyczne objawy towarzyszą poparzeniom lotnym i trwałym kwasem solnym; mają one najczęściej charakter zmian martwiczych. Mniej nasilone zmiany obserwuje się w przypadku stężonych kwasów organicznych (octowy, mrówkowy). Mocne zasady (ług sodowy i potasowy) wykazują bardzo niebezpieczne i silne działanie żrące, powodując martwicę rozpływną na skutek utworzenia rozpuszczalnych w wodzie soli sodowych (potasowych) czynników kwaśnych obecnych w tkankach. Sole te rozpuszczają się w środowisku płynów tkankowych, podlegając wielu nieodwracalnym reakcjom, prowadzącym m.in. do denaturacji białek i trwałego uszkodzenia tkanek. Podobne zmiany wywołuje stężony roztwór amoniaku, nie są one jednak tak głębokie. Zatrucia ługami drogą doustną powodują perforację ścian przewodu pokarmowego, a ich dostanie się do gałki ocznej najczęściej skutkuje utratą wzroku.

W przypadku ekspozycji kwasów i zasad na powierzchnię skóry i błon śluzowych pierwsza pomoc powinna polegać na natychmiastowym przemyciu tych miejsc dużą ilością wody.

1.8.3.4.Działanie toksyczne niektórych gazów

Dużą grupę czynników działających drażniąco na powierzchnię skóry, błony śluzowe i układ oddechowy stanowią gazy. Kwas azotowy w wyniku reakcji z substancjami chemicznymi tworzy lotne tlenki azotu: NO, NO2 oraz N2O3. Objawy ekspozycji na działanie tlenków azotu występują po dłuższym okresie utajenia. Wynikiem tego działania jest obrzęk płuc oraz uszkodzenie mięśnia sercowego.

Poważne zagrożenie stanowią: cyjanowodór, o zapachu gorzkich migdałów, i siarkowodór, o zapachu zepsutych jaj. Ich działanie toksyczne polega głównie na blokowaniu oksydazy cytochromowej oraz powstawaniu soli i związków kompleksowych w reakcjach z jonami żelaza. Siarkowodór, powstający w wyniku działania mocnych kwasów na siarczki, jest rozpuszczalnym w wodzie, palnym, silnie toksycznym gazem.

Mechanizmy toksycznego działania cyjanowodoru i siarkowodoru nie zostały do końca poznane. Wiadomo, że gazy te powodują zaburzenia przemian komórkowych prowadzące do niedotlenienia tkankowego (hipoksji). Nawet w małych stężeniach mogą powodować mdłości, wymioty oraz utratę przytomności.

1.8.3.5. Działanie toksyczne niektórych rozpuszczalników organicznych

Rozpuszczalniki organiczne są powszechnie stosowane w laboratoriach i w przemyśle farmaceutycznym. Ciągle dość szeroko wykorzystywane są w badaniach syntetycznych, do sporządzania postaci leków oraz w testach analitycznych. Właściwości rozpuszczalników zależą od ich budowy chemicznej oraz obecności ugrupowań i grup funkcyjnych, które powodują, że jedne z nich mieszają się z wodą (np. niższe alkohole, aldehydy, ketony i kwasy), wykazując wysoką hydrofilowość, a inne z wodą się nie mieszają lub mieszają się w sposób bardzo ograniczony, wykazując właściwości hydrofobowe (np. węglowodory, fluorowcowęglowodory, etery, estry). Ze względu na hydrofobowy charakter i znaczącą lotność węglowodory oraz ich pochodne fluorowcowe stanowią duże zagrożenie dla osób narażonych na ich działanie. Łatwo wchłaniają się przez drogi oddechowe i skórę. Ich działanie miejscowe wywołuje podrażnienie skóry i błon śluzowych dróg oddechowych, prowadząc do zmian zapalnych. W przypadku rozpuszczalników lotnych może dojść do wywołania działania narkotycznego, któremu towarzyszą szumy w uszach, uczucie słodkawego smaku w ustach i pobudzenie psychoruchowe. Dłużej trwająca ekspozycja może spowodować sedację i w końcu sen narkotyczny. Wynikiem działania substancji toksycznych są groźne zmiany narządowe, dotyczące wątroby (żółtaczka) lub nerek (mocznica), mogą także wystąpić porażenia obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego, w tym nerwu wzrokowego (ślepota).

Niższe alkohole (metanol, etanol) mają szerokie zastosowanie jako rozpuszczalniki. Metanol, ze względu na swoją toksyczność, nie jest stosowany jako rozpuszczalnik do celów farmaceutycznych; wykorzystuje się go w przemyśle chemicznym i do konserwacji dzieł sztuki. Jego zastosowanie jest obwarowane odpowiednimi przepisami. Podanie doustrojowe metanolu (najczęściej omyłkowo, zamiast jego wyższego homologu - etanolu) wywołuje groźne dla życia zatrucie. Jego początkowymi objawami są zaburzenia widzenia, które często prowadzą do uszkodzenia nerwu wzrokowego i utraty wzroku. Działanie to jest związane z biotransformacją metanolu, który utlenia się, pod wpływem odpowiedniej dehydrogenazy, do formaldehydu, a następnie, pod wpływem oksydazy aldehydowej, do kwasu mrówkowego. Aldehyd wykazuje wysokie powinowactwo do nerwu wzrokowego i purpury wzrokowej, natomiast kwas mrówkowy, jako najmocniejszy kwas organiczny, może powodować kwasicę ustrojową.

Etanol jest jednym z najczęściej wykorzystywanych w farmacji rozpuszczalników. Jego biotransformacja prowadzi do powstania aldehydu octowego, a następnie kwasu octowego. W wyniku zatrucia etanolem dochodzi do zaburzenia funkcji ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, osłabienia sprawności umysłowej i mięśni, przyspieszenia akcji serca oraz zwiększenia diurezy. Nasilenie tych efektów zależy od dawki; wysokie stężenia etanolu mogą powodować porażenie układu nerwowego i zatrzymanie akcji serca.

Węglowodory aromatyczne, tzn. benzen i jego pochodne alifatyczne (toluen, ksylen), mogą łatwo przeniknąć do organizmu drogą oddechową. Ze względu na wysoką lipofilowość stanowią one zagrożenie dla ośrodkowego układu nerwowego, układu krwiotwórczego oraz narządów miąższowych, np. wątroby. Niebezpieczeństwo jest mniejsze w przypadku narażenia na działanie toluenu i ksylenu niż w przypadku narażenia na działanie benzenu. Benzen w procesach biotransformacji tworzy niezmiernie toksyczny metabolit - epoksyd benzenu, natomiast toluen i ksylen są metabolizowane odpowiednio do kwasu benzoesowego i jego metylowej pochodnej, produktów o niskiej toksyczności, a następnie wydalane w postaci pochodnych kwasu hipurowego.

Duże zagrożenie wiąże się także z fluorowcowymi pochodnymi węglowodorów alifatycznych stosowanymi jako rozpuszczalniki. Właściwości lipofilowe powodują ich łatwe przenikanie do tkanek o podobnych właściwościach (lipidy). Kumulacja w narządach o wysokiej zawartości związków lipidowych może doprowadzić do uszkodzenia tkanek (hepato- , kardiotoksyczność). Nie bez znaczenia jest również duża trwałość i odporność tych związków na działanie czynników chemicznych i enzymatycznych, ograniczająca możliwości ich eliminacji z organizmu. Przez długie lata szeroko stosowanym anestetykiem ogólnym i rozpuszczalnikiem był chloroform. Dzisiaj związek ten został zastąpiony przez pochodne fluorowcoeterowe, stosowane jako anestetyki do narkozy ogólnej, oraz przez chlorek metylenu, stosowany jako rozpuszczalnik. W obecności tlenu, wilgoci i światła chloroform łatwo ulega rozkładowi na bardzo toksyczne produkty - chlorowodór i fosgen. Działanie kardiotoksyczne fosgenu stało się przyczyną początkowo ograniczenia użycia chloroformu, a następnie - tam, gdzie to możliwe - wycofania go z użycia.

1.9.Analityczna kontrola jakości leków

Katarzyna Kulig

Szybki rozwój przemysłu farmaceutycznego spowodował pojawienie się dużej liczby nowych leków. Zrodziło to potrzebę przygotowania ujednoliconych norm dotyczących określania ich jakości.

Normy opracowane na Międzynarodowej Konferencji Harmonizacji Wymagań dla Leków (ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) są podstawowym dokumentem dotyczącym oceny jakości, skuteczności (badania kliniczne) i bezpieczeństwa (badania przedkliniczne) preparatów farmaceutycznych. Równocześnie, w celu ograniczenia ryzyka wprowadzenia leków o złej jakości, oprócz zasad dobrej praktyki wytwarzania (GMP - good manufacturing practices), które obejmują całokształt procesu organizacyjnego, jaki musi obowiązywać w wytwórni farmaceutycznej, przygotowano zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (GLP - good laboratory practice) oraz zasady dobrej praktyki klinicznej (GCP - good clinical practice), dotyczące zasad przeprowadzania badań klinicznych.

W przypadku kontroli jakości leków opracowane wytyczne dotyczą oceny tożsamości i czystości substancji leczniczych, określenia zawartości substancji czynnej w badanym produkcie, badania jej trwałości i uwalniania z preparatów farmaceutycznych.

Ocena tożsamości substancji leczniczej ma na celu potwierdzenie, że dana substancja odpowiada danej nazwie chemicznej. W celu określenia tożsamości substancji leczniczej nie wykonuje się pełnej identyfikacji związku, lecz sprawdza się, czy skład danego preparatu jest zgodny z deklaracją. W przypadku preparatów jednoskładnikowych badania te nie sprawiają większych problemów, natomiast w przypadku preparatów wieloskładnikowych bardzo często, jeśli brak reakcji selektywnych, konieczne jest opracowanie metod rozdziału mieszaniny na poszczególne jej składniki. Kolejnym problemem dotyczącym określania tożsamości substancji leczniczej jest analiza preparatów o nieustalonym składzie (np. leków roślinnych), która bardzo często opiera się na określeniu tylko ich właściwości fizycznych, takich jak czynność optyczna, gęstość, temperatura topnienia lub wrzenia, oraz przeprowadzeniu reakcji charakterystycznych dla głównego składnika. Najczęściej do badań tożsamości substancji leczniczych wykorzystuje się: reakcje chemiczne, określanie właściwości fizycznych oraz metody spektroskopowe (IR, UV, NMR, MS) i chromatograficzne (TLC, GC, HPLC).

Aby lek mógł być dopuszczony do farmakoterapii, niezbędne jest określenie jego czystości. Farmakopea europejska określa, że zanieczyszczeniami substancji leczniczej są wszystkie składniki substancji farmaceutycznej o budowie innej niż substancja właściwa.

Zgodnie z wytycznymi ICH zanieczyszczenia substancji leczniczych podzielono na następujące grupy:

- zanieczyszczenia organiczne, które mogą powstać w procesie syntezy lub w czasie przechowywania substancji; mogą to być również pozostałości reagentów;

- zanieczyszczenia nieorganiczne, które pochodzą z procesu technologicznego; mogą to być m.in. metale ciężkie, sole, reagenty, katalizatory i inne substancje nieorganiczne, stosowane np. w procesach oczyszczania;

- zanieczyszczenia rozpuszczalnikami, lotne lub nielotne ciecze organiczne o znanej toksyczności;

- zanieczyszczenia zewnętrzne, czyli zanieczyszczenia nieokreślone, które pochodzą z procesu produkcyjnego, z aparatury lub pomieszczeń; jeżeli producent stosuje zasady GMP, zanieczyszczenia te nie powinny pojawiać się w końcowym produkcie.

Monografie zawarte w farmakopei lub (w przypadku leków niefarmakopealnych) odpowiednie normy określają zasadnicze wymagania dla danego środka farmaceutycznego, które powinny być spełnione bezpośrednio po zakończeniu cyklu technologicznego, jak również pod koniec okresu ważności tego środka. Spełnienie tych wymagań zapewnia użytkownikowi gwarancję bezpieczeństwa i skuteczności stosowanego preparatu. Najczęściej badania te obejmują określenie: suchej pozostałości, strat po suszeniu, zanieczyszczeń substancjami łatwo zwęglającymi się, zawartości popiołów, jonów chlorkowych, azotanowych, siarczanowych, soli amonowych, jonów Ba2+, Mg2+, Ca2+, Fe2+, Fe3+, metali ciężkich w przeliczeniu na ołów oraz zawartości arsenu. Dodatkowo dla preparatów zawierających izotopy promieniotwórcze określa się ich czystość radioizotopową i radiochemiczną.

Określenie zawartości substancji czynnej w badanym produkcie jest kolejnym niezbędnym elementem oceny jakości substancji leczniczej. Wybrana metoda analityczna, zgodnie z zasadami GLP, musi gwarantować obiektywną, a zarazem jednoznaczną ocenę uzyskanych wyników w możliwie krótkim czasie i przy niskich kosztach badania.

Do oceny zawartości substancji leczniczej stosowane są przede wszystkim metody: chromatograficzne (HPLC, GC), spektrofotometryczne (UV, VIS) oraz mikrobiologiczne. W analizie zawartości substancji czynnych w preparatach farmaceutycznych najczęściej wykorzystuje się metody chromatograficzne sprzężone ze spektrometrią mas (HPLC-MS, GC-MS).

Kolejnym etapem analizy jakości preparatów farmaceutycznych jest badanie szybkości uwalniania substancji czynnej. Farmakopea zaleca wykonanie tego badania dla: tabletek niemodyfikowanych, tabletek powlekanych, tabletek o przedłużonym działaniu, tabletek dojelitowych, kapsułek, granulatów powlekanych, zawiesin oraz czopków. Oznaczenie szybkości uwalniania substancji czynnej polega na rozpuszczeniu substancji leczniczej z preparatu farmaceutycznego w wodzie, w określonym czasie i temperaturze, przy jednoczesnym mieszaniu lub wstrząsaniu. Wykonanie tego badania pozwala na odrzucenie leków o niewłaściwej biodostępności, wynikającej przede wszystkim z ich nieodpowiednich właściwości fizycznych, np. niewłaściwej wielkości cząstek substancji leczniczej, źle dobranych substancji pomocniczych czy wadliwego powlekania tabletek. Równocześnie należy pamiętać, że preparatów charakteryzujących się dobrą szybkością uwalniania substancji czynnej nie musi cechować dobra biodostępność. W warunkach in vitro niemożliwe jest uwzględnienie wszystkich parametrów fizjologicznych mających wpływ na biodostępność leku.

W celu uzyskania pewności, że dany preparat zachowa pełną skuteczność aż do końca okresu ważności, wykonuje się badania jego trwałości. Przyjmuje się, że w okresie ważności preparat farmaceutyczny nie powinien zmieniać postaci, zawartość substancji czynnej powinna wynosić co najmniej 90% deklarowanej zawartości, przy zachowaniu co najmniej 90% początkowej aktywności farmakologicznej, a toksyczność leku nie powinna się istotnie zwiększyć. Okres ważności może zostać ustalony na etapie produkcji szarży leku (np. postaci doustne), a czasem jest określony od momentu otwarcia pojemnika z lekiem (np. postacie oczne). W badaniach trwałości najczęściej wykorzystuje się metody organoleptyczne, fizykochemiczne i mikrobiologiczne, dające istotne informacje dotyczące stabilności produktu i pozwalające na zdefiniowanie tolerancji w okresie ważności. Uzyskane wyniki mają na celu zapewnienie jakości, skuteczności i bezpieczeństwa stosowania danego preparatu.

2.Leki działające na ośrodkowy układ nerwowyMarcin Kołaczkowski, Jolanta Obniska, Anna Więckowska

2.1.Chemiczne podstawy neurotransmisji

Marcin Kołaczkowski

Potencjał błonowy i przewodzenie impulsów w komórce nerwowej

Zmiany potencjału błonowego umożliwiają wytworzenie i przewodzenie impulsów w obrębie komórek nerwowych. Potencjał błonowy tworzy się dzięki istnieniu różnic w stężeniach jonów po obu stronach błony komórkowej (tzw. gradient stężeń) (ryc. 2.1). Jony potasu (K+) występują w wysokim stężeniu wewnątrz komórki, a w niskim na zewnątrz komórki, natomiast jony sodowe (Na+) i chlorkowe (Cl-) występują w wysokich stężeniach w środowisku zewnątrzkomórkowym, a w niskich wewnątrz komórki. Gradienty stężeń gwarantują dostarczanie energii potencjalnej do tworzenia potencjału błonowego. Typowe wartości potencjału błonowego mieszczą się w przybliżeniu w zakresie od -40 mV do -70 mV.

RYCINA 2.1. Tworzenie potencjału błonowego w wyniku gradientu stężeń jonów.

W najprostszym przypadku, jeśli błona komórkowa jest selektywnie przepuszczalna dla potasu, dodatnio naładowane jony mogą dyfundować zgodnie z gradientem stężeń na zewnątrz komórki, pozostawiając za sobą nieskompensowane ładunki ujemne. Aniony białkowe są bowiem zbyt duże, aby mogły migrować przez błonę. Prowadzi to do powstania nadmiaru ładunku ujemnego wewnątrz komórki. Należy przy tym zauważyć, że system jako całość jest elektrycznie neutralny. Nieskompensowane ładunki dodatnie na zewnątrz komórki, a nieskompensowane ładunki ujemne wewnątrz komórki ustawiają się na powierzchni membrany i przyciągają wzajemnie przez dwuwarstwę lipidową. Zatem potencjał błonowy jest fizycznie zlokalizowany tylko w bezpośrednim sąsiedztwie błony. To właśnie separacja ładunków przez błonę komórkową jest podstawą istnienia potencjału błonowego.

Jony sodowe nie biorą udziału w tworzeniu potencjału błonowego, gdyż błona w stanie spoczynku nie jest dla nich przepuszczalna. Pełnią one jednak istotną rolę w generowaniu pobudzenia neuronalnego. Aktywacja neuronu polega bowiem na przejściowym otwarciu kanałów sodowych, co skutkuje napływem jonów sodowych, zgodnie z gradientem stężeń, do wewnątrz komórki, powodującym jej depolaryzację przez przejściowe obniżenie potencjału błonowego (tzw. aktywacja sodowa). Otwarcie jednych kanałów sodowych prowadzi do zmiany potencjału (depolaryzacji), która powoduje otwarcie kolejnych kanałów - zależnych od napięcia (bramkowanych napięciem). Depolaryzacja rozprzestrzenia się wzdłuż błony neuronalnej. W ten sposób przewodzony jest sygnał w komórce nerwowej.

Potencjał błonowy może być również zwiększony (a pobudliwość neuronu obniżona) przez napływ jonów chlorkowych do komórki w wyniku otwarcia kanałów chlorkowych (tzw. hiperpolaryzacja).

Odpowiednie stężenia jonów po obu stronach błony są utrzymywane dzięki wymiennikom jonowym o charakterze ATPaz, które przywracają odpowiedni gradient stężeń jonów - zaburzony w wyniku depolaryzacji lub hiperpolaryzacji.

2.1.1.Neurotransmisja

Neurotransmisja (neuroprzekaźnictwo) jest podstawo­wym sposobem komunikacji pomiędzy dwoma neuronami lub pomiędzy neuronem i komórką docelową (mięśniową, gruczołową). W przeciwieństwie do komunikacji w obrębie neuronu, która opiera się na przewodzeniu impulsu elektrycznego, neurotransmisja polega na uwalnianiu z aksonu jednego neuronu substancji chemicznej, która łączy się z receptorami na dendrytach drugiego neuronu lub na komórce narządu docelowego, wywołując określony efekt - pobudzający lub hamujący. Zjawisko neurotransmisji zostało opisane w 1921 roku przez Ottona Loewiego. Odkrycie to było poprzedzone obserwacją Ramóna y Cajala, który stwierdził, że między neuronami występują szczeliny o rozmiarze 20-40 nm - zbyt duże do pokonania drogą przekaźnictwa elektrycznego. Opisano wtedy tzw. synapsę chemiczną, w której przekazywanie sygnału odbywa się za pośrednictwem substancji chemicznej, a nie prądu elektrycznego. Słowo "synapsa" pochodzi od greckiego terminu synaptein, które sir Charles Scott Sherrington i jego współpracownicy wyprowadzili ze słów syn (razem) i haptein (zapiąć). Synapsy chemiczne nie są jedynym rodzajem synaps biologicznych - istnieją również synapsy elektryczne i immunologiczne. Słowo "synapsa" bez dodatkowego przymiotnika zwykle oznacza synapsę chemiczną (ryc. 2.2). Neurotransmisja jest zjawiskiem bardzo powszechnym w organizmie, stanowiącym podstawę funkcjonowania układu nerwowego i szczegółowo opisanym w podręcznikach do fizjologii i farmakologii. Niniejszy rozdział jest poświęcony chemicznemu podłożu neurotransmisji, istotnemu zwłaszcza z punktu widzenia działania leków.

RYCINA 2.2. Schemat synapsy nerwowej.

Substancję chemiczną pośredniczącą w neurotransmisji nazywa się neuroprzekaźnikiem lub neurotransmiterem (ang. neurotransmitter).

Istnieją cztery główne kryteria identyfikacji substancji jako neuroprzekaźnika:

1. Substancja chemiczna musi być syntetyzowana w neuronie lub w inny sposób być w nim obecna (wchłonięta i zmagazynowana).

2. Gdy neuron jest aktywny, substancja chemiczna musi zostać uwolniona i wywołać reakcję w innym neuronie lub w komórce narządu docelowego.

3. Substancja chemiczna eksperymentalnie umieszczona na neuronie lub narządzie docelowym musi wywołać taką samą reakcję.

4. Musi istnieć mechanizm usuwania substancji chemicznej z miejsca jej działania po wywołaniu efektu biologicznego.

Substancje oddziałujące na neurony, które nie spełniają wszystkich wyżej wymienionych kryteriów, nazywa się neuromodulatorami. Neuromodulatory mogą być neuroprzekaźnikami działającymi poza swoją właściwą synapsą, które nie zostały zreabsorbowane przez neuron presynaptyczny lub rozłożone do metabolitów, ale uległy dyfuzji (wyciekowi) z przestrzeni synaptycznej (np. serotonina, acetylocholina). Mogą to również być substancje produkowane w neuronach lub poza nimi, które nie tworzą własnych układów synaptycznych (nie są magazynowane w pęcherzykach i uwalniane do specyficznej synapsy), ale mogą modulować działanie innych neuronów (np. adenozyna, aminy śladowe). Neuromodulatory dyfundują przez tkankę nerwową i mogą długo przebywać w płynie mózgowo-rdzeniowym, wpływając na aktywność wielu innych neuronów w mózgu.

Rozmiar cząsteczki większości neuroprzekaźników odpowiada wielkości pojedynczego aminokwasu, jednak niektóre neuroprzekaźniki mogą mieć większy rozmiar, odpowiadający wielkości peptydów lub nawet białek. Niektórzy badacze kwalifikują jako neuroprzekaźniki również pojedyncze jony (np. uwolniony w przestrzeni synaptycznej jon cynku) oraz niektóre cząsteczki gazowe (NO, CO, H2S).

Leki mogą wpływać na różne etapy transmisji synaptycznej, w tym na:

1. Procesy syntezy neuroprzekaźnika lub jego gromadzenia w pęcherzykach synaptycznych. Najczęściej dochodzi do utrudnienia tych procesów. Przykładem może być tetrabenazyna - lek stosowany w terapii choroby Huntingtona, który blokuje transportery pęcherzykowe monoamin (VMAT), prowadząc do wyczerpania puli monoamin w zakończeniach nerwowych i w konsekwencji do osłabienia transmisji.

2. Procesy uwalniania neuroprzekaźnika z neuronu presynaptycznego. Istotnym sposobem regulacji uwalniania neuroprzekaźnika jest modulacja receptorów presynaptycznych. Pobudzenie tych receptorów hamuje uwalnianie neuroprzekaźnika, a blokada nasila je. Na przykład mianseryna - lek przeciwdepresyjny - nasila transmisję serotoninergiczną i adrenergiczną przez blokadę presynaptycznych receptorów ?2.

   Innym przykładem leku modulującego uwalnianie neuroprzekaźników jest lewetyracetam, który wiąże się z glikoproteinami pęcherzyków synaptycznych (SV2A) oraz blokuje zależne od napięcia kanały wapniowe typu N w neuronie presynaptycznym, hamując napływ jonów wapnia koniecznych do uwolnienia neuroprzekaźnika z pęcherzyków neuronalnych.

3. Oddziaływanie z receptorami na neuronie lub narządzie docelowym przez ich pobudzanie bądź (częściej) blokadę. Jest to najczęstszy rodzaj regulacji neurotransmisji, który będzie szeroko opisywany w kolejnych rozdziałach. Przykładami mogą być leki przeciwpsychotyczne blokujące receptory dopaminowe oraz leki przeciwlękowe specyficznie pobudzające receptory GABA-ergiczne.

4. Procesy eliminacji neuroprzekaźnika. Neuroprzekaźniki są eliminowane trzema podstawowymi drogami: (1) dyfuzji z przestrzeni synaptycznej, (2) degradacji enzymatycznej oraz (3) wychwytu zwrotnego przez neuron presynaptyczny. Najczęściej za pomocą leków ingeruje się w procesy degradacji enzymatycznej i wychwytu zwrotnego, hamując te procesy, co prowadzi do wzrostu podaży neuroprzekaźnika w przestrzeni synaptycznej i nasila jego działanie na receptory. Przykładem mogą być inhibitory acetylocholinoesterazy (np. donepezyl), stosowane jako leki w chorobie Alzheimera, oraz selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (np. fluoksetyna), stanowiące podstawową grupę leków przeciwdepresyjnych.

Głównymi celami biologicznymi dla leków ośrodkowego układu nerwowego regulujących neurotransmisję mogą być receptory jonotropowe i metabotropowe - podstawowe cele oddziaływania neuroprzekaźników, kanały jonowe bramkowane napięciem (zależne od napięcia) (głównie sodowe i wapniowe, rzadziej potasowe) - odpowiedzialne za przewodnictwo w obrębie neuronu i bardzo istotne z punktu widzenia uwalniania neuroprzekaźników, enzymy - biorące udział w syntezie i rozkładzie neuroprzekaźników, a także transportery - odpowiedzialne za wychwyt zwrotny neuroprzekaźników ze szczeliny synaptycznej do neuronów oraz ich transport do pęcherzyków synaptycznych.

Oddziaływanie leków na receptory dla neuroprzekaźników może odbywać się przez bezpośrednią interakcję z miejscem wiązania neuroprzekaźnika (oddziaływanie ortosteryczne) lub przez interakcję z innym miejscem wiązania na receptorze, czego wynikiem jest modyfikacja wiązania naturalnego neuroprzekaźnika (oddziaływanie allosteryczne). Leki bezpośrednio pobudzające receptory przez oddziaływanie z miejscem ortosterycznym zwykle nazywa się agonistami danego receptora, a leki blokujące w ten sposób receptor - jego antagonistami. Leki nasilające aktywność danego receptora przez interakcję z miejscem allosterycznym nazywa się pozytywnymi modulatorami allosterycznymi (PAM - positive allosteric modulators) lub potencjatorami, a leki, które w ten sposób osłabiają działanie receptora - negatywnymi modulatorami allosterycznymi (NAM - negative allosteric modulators)[1].

Oddziaływanie ortosteryczne i modulacja allosteryczna mogą dotyczyć zarówno receptorów jonotropowych, jak i metabotropowych.

Z chemicznego punktu widzenia wszystkie wymienione cele biologiczne są strukturami białkowymi, głównie osadzonymi w błonie komórkowej (receptory, kanały jonowe, transportery) lub obecnymi w cytoplazmie bądź w przestrzeni pozaneuronalnej (enzymy). Lokalizacja celów biologicznych jest istotna ze względu na możliwość poznania ich szczegółowej budowy przestrzennej, a w szczególności miejsca wiązania neuroprzekaźnika. Pozwala to na zrozumienie oddziaływania naturalnych neuroprzekaźników i stosowanych leków, a także na opracowywanie nowych leków. Enzymy, będące w większości białkami otoczonymi wodą, stosunkowo łatwo poddają się krystalizacji, co umożliwia badanie ich struktury przestrzennej metodami rentgenostrukturalnymi. Odwrotnie, błonowe receptory, kanały jonowe i transportery, otoczone w części centralnej hydrofobową błoną komórkową natomiast od wewnątrz i od zewnątrz komórki wodą, krystalizują bardzo trudno, w związku z czym ich budowa przestrzenna jest zwykle słabiej poznana niż budowa enzymów. Struktury krystaliczne białek są deponowane w bazie PDB (Protein Data Bank).

Oddziaływania z celami biologicznymi naturalnych neuroprzekaźników i modyfikujących neurotransmisję leków opierają się głównie na tworzeniu kompleksów ligand-cel biologiczny[2], stabilizowanych relatywnie słabymi oddziaływaniami niekowalencyjnymi. Do tych oddziaływań zalicza się: wiązania wodorowe, pary jonowe (obejmujące także wiązania wodorowe stabilizowane ładunkiem), oddziaływania aromatyczne typu ?-? i CH-? oraz oddziaływania niespecyficzne typu van der Waalsa, szczególnie istotne w przypadku niepolarnych i niearomatycznych fragmentów cząsteczek. W przypadku enzymów zawierających w centrum aktywnym kationy metali istotne są również wiązania koordynacyjne (donorowo-akceptorowe). Powyższe oddziaływania stanowią podstawę działania naturalnych neuroprzekaźników oraz leków będących agonistami lub antagonistami (inhibitorami) odwracalnymi. Leki będące nieodwracalnymi inhibitorami enzymów muszą ponadto tworzyć silne i trwałe wiązania kowalencyjne (dotyczy to np. selegiliny - inhibitora monoaminooksydazy, która rozkłada monoaminy).

Należy zatem zwracać szczególną uwagę na te elementy strukturalne budowy neuroprzekaźników i leków ośrodkowego układu nerwowego, które mogą uczestniczyć w tworzeniu wyżej wymienionych oddziaływań z celami biologicznymi. Należą do nich:

- grupy jonizowalne - ulegające w wodzie dysocjacji kwasowej lub zasadowej (np. grupy COOH, aminy alifatyczne);

- donory wiązań wodorowych - tzw. polarne wodory, czyli atomy wodoru powiązane z elektroujemnymi atomami tlenu i azotu (grupy OH, NH i NH2);

- akceptory wiązań wodorowych - heteroatomy (głównie O i N) zawierające wolną parę elektronową (np. ugrupowania karbonylowe, eterowe, amidy III-rzędowe)[3];

- ugrupowania aromatyczne - karbo- lub heteromonocykliczne (np. benzen, furan, pirol, imidazol, pirydyna) oraz dicykliczne (np. naftalen, indol, chinolina).

Obecność w strukturze neuroprzekaźnika lub leku grup jonizowalnych oraz donorów wiązań wodorowych skutkuje jego dobrą rozpuszczalnością w wodzie dzięki możliwości tworzenia oddziaływań jon-dipol oraz wiązań wodorowych z polarnymi cząsteczkami wody. Jednocześnie obecność tych polarnych grup nie sprzyja penetracji na drodze dyfuzji biernej przez bariery biologiczne, w tym barierę jelito-krew i barierę krew-mózg[4]. Dla wchłaniania z przewodu pokarmowego niekorzystne są takie czynniki, jak liczba donorów wiązań wodorowych powyżej 5 i obecność silnej zasady (pKa > 8) (silne protonowanie w przewodzie pokarmowym). Dla penetracji przez barierę krew-mózg niekorzystna jest już liczba donorów wiązań wodorowych powyżej 2, a także obecność ugrupowań kwasowych o pKa < 6 (silne odprotonowanie w pH krwi). Co więcej, obecne w strukturze naturalnych neuroprzekaźników wolne grupy aminowe i hydroksylowe (np. dopamina, serotonina) są podatne na szybką biotransformację przez oksydatywną deaminację (monoaminooksydaza), transfer grupy metylowej na tlen (katecholo-O-metylotransferaza) lub sprzęganie z kwasem glukuronowym (UDP-glukuronylotransferaza). Ponadto niektóre układy, np. obecny w strukturze noradrenaliny i dopaminy układ katecholu (1,2-hydroksybenzenu), mogą ulegać utlenianiu już w warunkach atmosferycznych. Powyższe cechy fizykochemiczne neuroprzekaźników są korzystne z punktu widzenia ich roli fizjologicznej, powinny one bowiem: być dobrze rozpuszczalne w wodzie, działać przede wszystkim w miejscu, gdzie są bezpośrednio uwalniane (dyfuzja bierna przez błony biologiczne nie jest zasadniczo konieczna ani wskazana), a wreszcie zostać szybko unieczynnione (nie powinny więc być zbyt trwałe). Nie są to jednak cechy korzystne w przypadku leków.

W świetle powyższego niektóre modyfikacje w strukturze neuroprzekaźników, wprowadzane w toku opracowywania na ich podstawie leków, mogą polegać na poprawie penetracji przez bariery biologiczne poprzez zmniejszenie polarności cząsteczki, np. przez zmniejszenie liczby donorów wiązań wodorowych lub eliminację bądź zmniejszenie mocy grup jonizowalnych. Celowi temu może służyć także poprawienie stabilności metabolicznej i chemicznej przez odpowiednie modyfikacje chemiczne wrażliwych ugrupowań, w tym osłanianie steryczne lub zastąpienie bioizosteryczne. Dobrym przykładem jest modyfikacja struktury dopaminy polegająca na wprowadzeniu indolinonu w strukturze ropinirolu i zyprazydonu zamiast katecholu, obecnego w strukturze dopaminy. Modyfikacje te mają na celu zapewnienie właściwości farmakokinetycznych umożliwiających odpowiednią dystrybucję po podaniu obwodowym i wystarczający czas działania oraz trwałość preparatu leczniczego.

Aktualnie wyróżnia się ponad 100 różnych neuroprzekaźników i neuromodulatorów pełniących rozmaite funkcje. W niniejszym rozdziale skupiono się przede wszystkim na układach neuroprzekaźnikowych stanowiących cel działania leków stosowanych we współczesnej terapii.

2.1.2.Neuroprzekaźniki aminokwasowe

Wśród neuroprzekaźników aminokwasowych wyróżnia się neuroprzekaźniki pobudzające (kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, arginina) oraz hamujące (kwas ?-amino­masłowy, glicyna).

2.1.2.1.Kwas glutaminowy (glutaminian)

Kwas glutaminowy (oznaczany symbolami Glu lub E), czyli kwas ?-aminoglutarowy lub 2-aminopentanodiowy, jest endogennym ?-aminokwasem obecnym w większości białek. Związek ten odkrył w 1866 roku niemiecki chemik Karl Heinrich Ritthausen, który traktował kwasem siarkowym gluten pszeniczny (stąd jego nazwa). Kwas glutaminowy należy do aminokwasów o charakterze kwasowym ze względu na obecność w łańcuchu bocznym drugiej grupy karboksylowej. Podobnie jak inne ?-aminokwasy jest substancją chiralną występującą fizjologicznie w postaci enancjomeru l. W stanie stałym kwas glutaminowy ma formę obojętną, natomiast w roztworze jego forma zależy od pH. W organizmie kwas glutaminowy występuje głównie w formie pojedynczego anionu soli wewnętrznej, ponieważ pH krwi (około 7,4) mieści się w zakresie pKa 4,25-9,67 (ryc. 2.3). W związku z tym bardzo często w kontekście jego roli jako neuroprzekaźnika kwas glutaminowy jest określany mianem glutaminianu (anionu kwasu glutaminowego), a transmisja za pośrednictwem glutaminianu oraz jego receptory są konsekwentnie nazywane glutaminianergicznymi[5].

RYCINA 2.3. Kwas glutaminowy - jonizacja zależna od pH roztworu.

Glutaminian stanowi główny neuroprzekaźnik pobudzający w ośrodkowym układzie nerwowym. Jest w nim równomiernie rozmieszczony, osiągając tam znacznie wyższe stężenie niż w innych tkankach. Szacuje się, że glutaminian jest obecny w około 50% tkanki nerwowej i że ponad 90% wszystkich synaps stanowią synapsy glutaminianergiczne (!). Glutaminian jest aminokwasem endogennym nie niezbędnym (nonessential), który nie przekracza bariery krew-mózg i musi być syntetyzowany w neuronach z lokalnych prekursorów. Źródłem glutaminianu znajdującego się w neuronach ośrodkowego układu nerwowego jest albo glukoza (przez cykl Krebsa), albo glutamina, syntetyzowana przez komórki glejowe i wychwytywana przez neurony (ryc. 2.4).

RYCINA 2.4. Biosynteza i biotransformacja neuroprzekaźników aminokwasowych w mózgu. Na podstawie: H.P. Rang, M.M. Dale, J.M. Ritter: Pharmacology. Churchill Livingstone, New York 1999. GAD - dekarboksylaza kwasu glutaminowego; GABA-T - transaminaza GABA.

Podobnie jak inne ­neuroprzekaźniki glutaminian jest magazynowany w pęcherzykach synaptycznych i uwalniany z zakończeń neuronów glutaminianergicznych na drodze egzocytozy zależnej od jonów wapnia i eliminowany, głównie przez wychwyt za pomocą specyficznych transporterów (EAAT - excitatory amino acid transporters) do zakończeń nerwowych i sąsiadujących komórek glejowych (ryc. 2.5). Transport ten może także zadziałać w odwrotną stronę, stanowiąc źródło uwalniania glutaminianu w warunkach patologicznych, np. w niedotlenieniu mózgu.

RYCINA 2.5. Obrót glutaminianu w mózgu.

Ze względu na swoją rolę podstawowego neuroprzekaźnika pobudzającego, glutaminian jest zaangażowany praktycznie we wszystkie fizjologiczne funkcje mózgu, a w szczególności w takie procesy, jak uczenie się i pamięć, ruchy dowolne oraz przekazywanie impulsów aferentnych (od receptora do ośrodka nerwowego). Glutaminian zastosowany eksperymentalnie powoduje przejściową aktywację czynności elektrycznej neuronów, a następnie blok depolaryzacyjny i obumieranie neuronów. Zjawisko to nosi nazwę ekscytotoksyczności (toksyczności z pobudzenia) i jest spowodowane napływem zwiększonej ilości jonów wapnia do neuronów, co skutkuje aktywacją różnych enzymów (proteazy, endonukleazy, fosfolipazy), prowadzącą do uszkodzenia struktur komórkowych. Zjawisko to towarzyszy licznym patologicznym stanom ostrym, np. udarowi niedokrwiennemu mózgu, napadowi padaczki i silnej hipoglikemii, a także przewlekłym chorobom neurodegeneracyjnym ośrodkowego układu nerwowego, w tym chorobom Parkinsona, Alzheimera i Huntingtona, stwardnieniu rozsianemu czy stwardnieniu zanikowemu bocznemu. Pozamedycznie glutaminian jest stosowany w postaci soli sodowej (glutaminian sodu) jako dodatek do żywności wzmacniający odczuwanie smaku i zapachu. Jego działanie wiąże się z nasileniem transmisji z receptorów smaku i zapachu do ośrodkowego układu nerwowego. Spożycie większych ilości glutaminianu może prowadzić do zaburzeń neurologicznych.

Glutaminian działa przez kilka typów receptorów, m.in. przez receptory jonotropowe (AMPA, kainowe, NMDA) i metabotropowe (mGluR1-8). Nazwy receptorów jonotropowych pochodzą od syntetycznych agonistów (ryc. 2.6), specyficznych dla poszczególnych typów receptorów.

RYCINA 2.6. Neuroprzekaźniki układu glutaminianergicznego.

2.1.2.2.Jonotropowe receptory glutaminianergiczne

Receptory te należą do nieselektywnych kanałów kationowych bramkowanych ligandem, które umożliwiają przepływ jonów Na+, K+ i Ca2+ w odpowiedzi na wiązanie glutaminianu. Związanie glutaminianu z receptorem wywołuje tzw. pobudzający prąd postsynaptyczny (EPSC - excitatory post-synaptic current), powodujący depolaryzację. Jeśli aktywowana jest wystarczająca liczba receptorów glutaminianergicznych, prąd ten może wyzwalać potencjał czynnościowy w neuronie postsynaptycznym (EPSP - excitatory post-synaptic potential).

Wszystkie receptory jonotropowe pośredniczą w generowaniu pobudzającego prądu postsynaptycznego, ale prędkość i czas trwania prądu są różne dla poszczególnych typów receptorów.

Receptory AMPA są kanałami jonowymi przepuszczalnymi dla Na+ (do wnętrza komórki) i K+ (na zewnątrz). Są one wyspecjalizowane do generowania szybkiego postsynaptycznego potencjału pobudzającego (fast EPSP) ułamek milisekundy po stymulacji. Receptory AMPA są podstawowymi receptorami postsynaptycznymi, mediującymi aktywację synaptyczną i zarazem najbardziej rozpowszechnionymi receptorami w ośrodkowym układzie nerwowym.

Receptory kainianowe (lub receptory kwasu kainowego) wykazują wiele podobieństw do receptorów AMPA, ale są znacznie mniej rozpowszechnione; występują pre- i postsynaptycznie w ośrodkowym układzie nerwowym. Receptory AMPA i receptory kainianowe są klasycznymi kanałami bramkowanymi ligandem, a ich aktywacja zależy jedynie od pobudzenia przez glutaminian.

Nieselektywna negatywna modulacja allosteryczna receptora AMPA oraz podstawowa stymulacja układu GABA-ergicznego stanowią elementy mechanizmu działania barbituranów, anestetyków wziewnych i etanolu. Niekompetytywnym antagonistą receptora AMPA jest lek przeciwdrgawkowy, perampanel.

Pozytywna modulacja allosteryczna receptora AMPA jest postulowanym mechanizmem działania piracetamu, leku nootropowego. Według niektórych doniesień aktywacja receptora AMPA przez 6-hydroksynorketaminę, aktywny metabolit leku znieczulenia ogólnego - ketaminy, może być elementem mechanizmu jej działania przeciwdepresyjnego.

Receptory NMDA są zlokalizowane na neuronach postsynaptycznych oraz w komórkach glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym. Ich aktywacja generuje postsynaptyczny potencjał pobudzający o wolniejszej kinetyce (slow EPSP). Receptory NMDA (N-metylo-d-asparaginianowe) są kanałami jonowymi bramkowanymi zarówno ligandem, jak i napięciem. Mają one bowiem wewnętrzne miejsce wiązania dla jonów Mg2+ (lub Zn2+), tworzących blok zależny od napięcia. Jako że blok ten musi zostać usunięty przez zewnętrzny przepływ prądu dodatniego, aktywacja receptorów NMDA musi być poprzedzona pobudzającym prądem postsynaptycznym wytworzonym w wyniku pobudzenia receptorów AMPA. Bramkowanie ligandem wymaga z kolei koaktywacji przez 2 ligandy, glutaminian i glicynę lub d-serynę. Receptory NMDA są przepuszczalne nie tylko dla jonów Na+ i K+ (podobnie jak receptory AMPA), lecz także dla jonów Ca2+. Ze względu na to, że Ca2+ może pełnić rolę wtórnego przekaźnika, poza wpływem na potencjał czynnościowy może również inicjować szeroki zakres odpowiedzi wewnątrzkomórkowych. Uważa się, że przepływ jonów Ca2+ przez receptory NMDA powoduje zarówno długotrwałe wzmocnienie (LTP - long-term potentiation), jak i długotrwałą depresję aktywności synaps (LTD - long-term depression) przez następczą aktywację odpowiednich wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych i regulację ekspresji genów. Zjawiska te prowadzą do przetrwałych zmian w transmisji synaptycznej i są podstawą tzw. plastyczności synaptycznej, szczególnie ważnej dla procesów uczenia się i pamięci. Przepuszczalność dla jonów wapnia jest istotna również z punktu widzenia wspomnianej wyżej ekscytotoksyczności.

Istotną cechą receptorów NMDA jest ich występowanie zarówno w obrębie synaps glutaminianergicznych, jak i pozasynaptycznie. W przeciwieństwie do synaptycznych receptorów NMDA, które promują nabytą neuroprotekcję i plastyczność synaptyczną, pozasynaptyczne receptory NMDA są sprzężone z aktywacją tzw. szlaków sygnalizacji śmierci. Pozasynaptyczne receptory NMDA są odpowiedzialne za inicjowanie ekscytotoksyczności i biorą udział w etiologii chorób neurodegeneracyjnych, w tym udaru mózgu, choroby Huntingtona, choroby Alzheimera i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) (ryc. 2.7).

RYCINA 2.7. Schemat receptora glutaminianergicznego NMDA.

We współczesnej farmakoterapii znaczenie ma kilka leków będących niekompetytywnymi antagonistami receptora NMDA. Należy przy tym zauważyć, że oddziaływanie z receptorem NMDA zwykle nie jest ich jedynym mechanizmem działania. Do leków tych należą: ketamina, podtlenek azotu (leki znieczulenia ogólnego), amantadyna (lek przeciwparkinsonowski), memantyna (lek stosowany w chorobie Alzheimera) oraz dekstrometorfan (lek przeciwkaszlowy). Niekompetytywnymi antagonistami receptora NMDA są również fencyklidyna (PCP - phencyclidinum) i dizocylpina (MK-801), które nie są lekami, lecz narzędziami farmakologicznymi używanymi do wywoływania stanów psychozopodobnych oraz zaburzeń pamięci u zwierząt w toku badań nad nowymi lekami przeciwpsychotycznymi i prokognitywnymi (usprawniającymi procesy poznawcze). Fencyklidyna bywa również stosowana nielegalnie, jako substancja odurzająca.

2.1.2.3.Glutaminianergiczne receptory metabotropowe

Receptory metabotropowe (mGluR) działają przez systemy wtórnych przekaźników, wywołując powolne, długotrwałe oddziaływanie na sygnalizację wewnątrzkomórkową. Należą do klasy III receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) i dzielą się na trzy grupy na podstawie wpływu na sposób transdukcji sygnału wewnątrzkomórkowego. Receptory grupy I (mGluR1 i 5) aktywują fosfolipazę C i są zlokalizowane głównie postsynaptycznie. Mogą one zarówno nasilać, jak i hamować uwalnianie glutaminianu. Receptory grupy II (mGluR2 i 3) oraz receptory grupy III (mGluR4, 6, 7 i 8) hamują cyklazę adenylanową, są zlokalizowane przede wszystkim presynaptycznie (ryc. 2.8) i mają głównie działanie redukujące, zarówno potencjały pobudzające, jak i hamujące w korze mózgowej. Aktualnie żaden z zarejestrowanych leków nie oddziałuje przez te receptory, niemniej są one przedmiotem intensywnych badań, m.in. w poszukiwaniu leków przeciwpsychotycznych, przeciwdepresyjnych i przeciwparkinsonowskich.

RYCINA 2.8. Schemat synapsy glutaminianergicznej.

Modulowanie aktywności układu glutaminianergicznego, nieobejmujące interakcji z receptorami dla glutaminianu, jest istotnym elementem mechanizmu działania niektórych leków przeciwpadaczkowych (np. lamotryginy). Leki te blokują zależne od napięcia kanały sodowe i wapniowe (typu L, N i P), przez co hamują uwalnianie glutaminianu z zakończeń nerwowych, zapobiegając nadmiernym wyładowaniom i wywołując efekt neuroprotekcyjny.

Kwas asparaginowy (asparaginian) i arginina również pełnią rolę aminokwasowych neuroprzekaźników pobudzających, jednak ich działanie jest znacznie bardziej specyficzne i ograniczone w porównaniu z wszechobecnym glutaminianem.

2.1.2.4.Kwas ?-aminomasłowy (GABA)

Kwas ?-aminomasłowy (kwas gamma-aminomasłowy) (GABA - gamma-amino butyric acid) jest głównym neuroprzekaźnikiem hamującym w układzie nerwowym (ryc. 2.9). Został on po raz pierwszy otrzymany w 1883 roku i początkowo był uważany jedynie za metabolit roślin i mikroorganizmów. Jego obecność w mózgu ssaków została stwierdzona w 1950 roku przez Robertsa i Frankla. Chemicznie jest ?-aminokwasem powstającym w wyniku dekarboksylacji kwasu glutaminowego. Usunięta zostaje typowa dla aminokwasów wchodzących w skład białek grupa karboksylowa przy atomie węgla ?. Reakcję dekarboksylacji katalizuje dekarboksylaza kwasu glutaminowego (GAD) - enzym obecny jedynie w neuronach produkujących GABA (ryc. 2.4). Jako jedyny ze znanych neuroprzekaźników GABA występuje w fizjologicznym pH w formie jonu obojnaczego. Jego punkt izoelektryczny wynosi 7,3 (a więc praktycznie pokrywa się z pH osocza), a stałe dysocjacji pKa dla grupy aminowej (10,43) i karboksylowej (4,23) są na tyle odległe od neutralności, że fizjologiczne zmiany pH powodują jedynie nieznaczne zmiany wartości ładunku elektrostatycznego.

RYCINA 2.9. GABA - jonizacja w zależności od pH środowiska.

GABA jest substancją hydrofilową (logP = -3,17), dobrze rozpuszczalną w wodzie. Ze względu na obecność 4 wiązań pojedynczych pomiędzy grupami funkcyjnymi cechuje się relatywnie wysoką swobodą konformacyjną. W stanie gazowym GABA występuje w konformacji zgiętej w związku z nieekranowanym przyciąganiem elektrostatycznym terminalnych grup funkcyjnych. W stanie stałym przyjmuje natomiast konformację rozciągniętą, determinowaną sposobem upakowania cząsteczek w sieci krystalicznej. W roztworze wodnym, w środowisku fizjologicznym, GABA może występować w pięciu różnych konformacjach, stabilizowanych różną solwatacją cząsteczek. GABA wiąże się również z różnymi receptorami w różnych konformacjach, a syntetyczne analogi GABA mają struktury usztywnione, stabilizujące różne konformacje preferowane podczas wiązania z celem biologicznym (różne konformacje bioaktywne).

Podobnie jak glutaminian GABA jest bardzo rozpowszechniony w układzie nerwowym. Szacuje się, że około 90% synaps nieglutaminianergicznych to synapsy GABA-ergiczne[6]. Większość neuronów GABA-ergicznych to interneurony, czyli neurony pośredniczące. GABA jest produkowany w neuronie presynaptycznym, gromadzony w pęcherzykach synaptycznych przy udziale pęcherzykowego transportera GABA, a następnie wydzielany do przestrzeni synaptycznej (ryc. 2.10). Tam działa na dwa rodzaje receptorów - GABA-A i GABA-B, a następnie jest wychwytywany zwrotnie przez transportery GABA (GAT) i rozkładany do semialdehydu bursztynowego, przy udziale transaminazy GABA (GABA-T). Stosowanym klinicznie blokerem GAT jest tiagabina, a inhibitorem GABA-T - wigabatryna. Obie substancje są lekami przeciwpadaczkowymi. Poza ośrodkowym układem nerwowym GABA występuje jedynie w śladowych ilościach.

RYCINA 2.10. Synapsa GABA-ergiczna. Na podstawie: D. Steinhilber, M. Schubert-Zsilevecz, H.J. Roth: Chemia medyczna. MedPharm, Wrocław 2012.

2.1.2.5.Receptor GABA-A

GABA-A jest receptorem jonotropowym, czyli kanałem jonowym bramkowanym ligandem, zlokalizowanym głównie postsynaptycznie i występującym na większości neuronów. Ma klasyczny plan budowy, który dzieli z innymi receptorami jonotropowymi (AMPA, NMDA, nikotynowym, 5-HT3). Jest zbudowany z transmembranowych podjednostek białkowych otaczających kanał przepuszczalny dla jonów, w tym wypadku dla jonów Cl- (ryc. 2.11). Otwarcie tego kanału w wyniku pobudzenia receptora powoduje napływ jonów chlorkowych do komórki, czego skutkiem jest hiperpolaryzacja i obniżenie pobudliwości neuronu (IPSP - inhibitory post-synaptic potential).

RYCINA 2.11. Receptor GABA-A.

Najpowszechniejszą formą receptora GABA-A jest pentamer, zawierający 2 podjednostki ?, 2 podjednostki ? oraz 1 podjednostkę ?. Każda z podjednostek ma kilka podtypów (? 1-6, ? 1-3 oraz ? 1-3), a ich skład jest związany z rozmieszczeniem receptorów GABA-A i pełnioną przez nie rolą. Powinowactwo leków oddziałujących przez receptor GABA-A do form o różnym składzie podjednostkowym jest podstawą ich zróżnicowanej aktywności farmakologicznej. Najbardziej rozpowszechniona jest izoforma ?1?2?2.

W receptorze GABA-A, podobnie jak w innych receptorach, występują dwa rodzaje miejsc wiążących: miejsce ortosteryczne pomiędzy podjednostkami ? i ?, będące miejscem wiązania naturalnego agonisty - GABA, oraz miejsca wiążące dla innych agonistów (muscymol, gabodaksol) i antagonistów (bikukulina) (ryc. 2.12). Różne miejsca allosteryczne pośrednio modulujące odpowiedź na GABA stanowią punkt uchwytu, m.in. dla benzodiazepin, barbituranów, anestetyków ogólnych, neurosteroidów oraz etanolu. Szczególną rolę z farmakologicznego punktu widzenia pełni miejsce benzodiazepinowe[7], zlokalizowane pomiędzy podjednostkami ? i ?, będące celem biologicznym dla leków z grupy benzodiazepin (np. diazepam) oraz ich analogów o budowie niebenzodiazepinowej (np. zolpidem). Leki te są agonistami miejsca benzodiazepinowego, a przez to pozytywnymi modulatorami allosterycznymi (PAM) receptora GABA-A (patrz rozdz. 2.2.3).

RYCINA 2.12. Receptor GABA-A - miejsce wiązania ligandów.

Istotną rolę, głównie eksperymentalną i toksykologiczną, odgrywają tzw. niekompetytywni antagoniści receptora GABA-A. Wiążą się oni z centralnym porem kompleksu receptorowego lub w jego pobliżu, bezpośrednio blokując przewodnictwo jonów Cl- przez kanał jonowy (pikrotoksyna, pentetrazol).

Leki i związki w różny sposób nasilające aktywność receptora GABA-A mają zróżnicowany jakościowo, jednak ogólnie depresyjny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy. Podane łącznie wchodzą w silne interakcje, które mogą zagrażać życiu, głównie w następstwie porażenia ośrodka oddechowego. Z kolei substancje blokujące receptor GABA-A (ortosteryczni i niekompetytywni antagoniści) wykazują działanie drgawkotwórcze, co ogranicza ich zastosowanie terapeutyczne, ale umożliwia wykorzystanie np. w zwierzęcych modelach drgawek eksperymentalnych, stosowanych w poszukiwaniu nowych leków przeciwpadaczkowych.

2.1.2.6.Receptor GABA-B

GABA-B są transbłonowymi receptorami metabotropowymi, połączonymi przez białka G z kanałami potasowymi i wapniowymi. Stymulacja presynaptycznych receptorów GABA-B zamyka kanały wapniowe, a receptorów postsynaptycznych - otwiera kanały potasowe, odpowiednio, hamując uwalnianie GABA lub hiperpolaryzując neuron postsynaptyczny (IPSP). Receptory GABA-B znajdują się w ośrodkowym układzie nerwowym i autonomicznej części obwodowego układu nerwowego. Mają one podobną strukturę i należą do tej samej rodziny (III) receptorów GPCR co metabotropowe receptory glutaminianergiczne. Istnieją dwa podtypy receptora GABA-B: GABA-B1 i GABA-B2, które występują w błonach neuronalnych jako heterodimery połączone wewnątrzkomórkowymi C-końcami. Receptor GABA-B jest celem biologicznym dla baklofenu, leku stosowanego w celu rozluźnienia mięśni szkieletowych, który jest jego selektywnym agonistą.

2.1.2.7.Kwas ?-hydroksymasłowy (GHB)

Kwas ?-hydroksymasłowy, znany również jako kwas 4-hydroksybutanowy (GHB), jest naturalnie występującym neuroprzekaźnikiem oraz otrzymywaną syntetycznie substancją psychoaktywną (ryc. 2.13). Żywe komórki wytwarzają GHB przez redukcję semialdehydu bursztynowego z udziałem reduktazy bursztynowo-semialdehydowej (SSR). GHB powstaje również w wyniku fermentacji i występuje w niewielkich ilościach w niektórych piwach i winach, wołowinie oraz owocach cytrusowych.

RYCINA 2.13. GHB - forma niezjonizowana i anionowa.

GHB ma przynajmniej dwa odrębne miejsca wiązania w ośrodkowym układzie nerwowym. Jest agonistą opisanego w latach 2003-2007 receptora GHB, który jest pobudzający, a także słabym agonistą hamującego receptora GABA-B. Receptor GHB, podobnie jak receptor GABA-B, jest receptorem metabotropowym. Dokładna funkcja GHB w organizmie nie została w pełni wyjaśniona.

GHB był stosowany w medycynie jako środek znieczulający oraz wspomagający leczenie alkoholizmu. Aktualnie GHB, w postaci soli sodowej lub potasowej, jest wykorzystywany w leczeniu katapleksji związanej z narkolepsją (np. hydroksymaślan sodu, Xyrem). Jest również używany nielegalnie jako środek odurzający, wzmacniacz wydajności sportowej oraz tzw. pigułka gwałtu (DRD - date rape drug)[8], co wiąże się z wywoływaniem niepamięci następczej (w przypadku podania w wysokiej dawce).

2.1.2.8.Kwas aminooctowy (glicyna)

Aminokwas ten, oznaczany symbolem Gly lub G, jest jednym z podstawowych aminokwasów endogennych wchodzących w skład białek. Stałe dysocjacji (pKa) glicyny wynoszą 2,34 (grupa karboksylowa) i 9,6 (grupa aminowa), a punkt izoelektryczny 5,97. Z tego powodu glicyna występuje fizjologicznie w stanie równowagi pomiędzy formą jonu obojnaczego (w przewadze) a formą anionową (ryc. 2.14).

RYCINA 2.14. Glicyna - formy jonizacji w zależności od pH.

Jako neuroprzekaźnik w ośrodkowym układzie nerwowym glicyna pełni funkcje hamujące, głównie w rdzeniu kręgowym, pniu mózgu i siatkówce. Szczególną rolę aminokwas ten odgrywa w kontroli neuronów ruchowych rogów przednich rdzenia kręgowego przez tzw. interneurony Renshawa. Na skutek aktywacji receptorów glicynowych (GlyR), podobnych strukturalnie do receptorów GABA-A, jony Cl- napływają do neuronu, generując hamujący potencjał postsynaptyczny (IPSP). Poza glicyną receptory glicynowe mogą być pobudzane przez inne proste aminokwasy, np. ?-alaninę czy taurynę. Pozytywnym modulatorem allosterycznym GlyR jest etanol. Silnym antagonistą jonotropowych receptorów glicynowych jest strychnina. Blokada funkcji interneuronów Renshawa przez strychninę wywołuje drgawki, stymulowane przez bodźce zewnętrzne, np. przez dotyk. Słabszymi antagonistami GlyR są bikukulina, pikrotoksyna oraz kofeina. Toksyna tężcowa blokuje wydzielanie glicyny z interneuronów, co prowadzi do gwałtownych skurczów mięśni.

Glicyna jest również niezbędnym koagonistą glutaminianu dla receptorów NMDA (tzw. miejsce glicynowe na receptorze NMDA). W przeciwieństwie do swojej hamującej roli w rdzeniu kręgowym glicyna aktywuje receptory glutaminianergiczne NMDA.

2.1.3.Acetylocholina

Acetylocholina (Ach) jest jednym z najważniejszych neuroprzekaźników nieaminokwasowych (ryc. 2.15). Chemicznie jest ona IV-rzędowym kationem amoniowym występującym w równowadze z fizjologicznie obecnymi anionami. Komercyjnie jest otrzymywana i dystrybuowana głównie w postaci IV-rzędowej soli amoniowej (chlorku acetylocholiny).

RYCINA 2.15. Acetylocholina - biosynteza i metabolizm.

W organizmie acetylocholina jest produkowana w neuronach cholinergicznych z choliny i acetylokoenzymu A przy udziale specyficznego dla neuronów cholinergicznych enzymu - acetylotransferazy cholinowej (ChAT) (ryc. 2.16). Cholinę do neuronu przenosi transporter cholinowy (CHT1), który odgrywa rolę dostarczyciela substratu do syntezy, a nie eliminatora neuroprzekaźnika[9]. Acetylocholina jest magazynowana w pęcherzykach synaptycznych przy udziale pęcherzykowego transportera ACh i ulega uwolnieniu z neuronu pod wpływem jego depolaryzacji, skutkującej napływem jonów Ca2+. Jako trwały kation acetylocholina bardzo dobrze rozpuszcza się w wodzie i jest całkowicie pozbawiona możliwości biernej dyfuzji przez błony biologiczne. W jej rozkładaniu uczestniczą enzymy z grupy cholinoesteraz: acetylocholinoesteraza (AChE) i butyrylocholinoesteraza (BChE) (ryc. 2.16).

RYCINA 2.16. Acetylocholina - obrót neuroprzekaźnika w układzie nerwowym.

Acetylocholina została pierwotnie zidentyfikowana w obwodowym układzie nerwowym, gdzie jej aktywność jako neuroprzekaźnika odpowiada za transmisję bodźców nerwowych w:

- zwojach układu współczulnego i przywspółczulnego;

- zazwojowych zakończeniach układu przywspółczulnego;

- zakończeniach współczulnych na gruczołach potowych;

- płytce nerwowo-mięśniowej.

Rola acetylocholiny w obwodowym układzie wegetatywnym została opisana w rozdziale 3. Poniżej opisano aktywność acetylocholiny w ośrodkowym układzie nerwowym.

W ośrodkowym układzie nerwowym acetylocholina jest produkowana przede wszystkim w jądrze podstawnym Meynerta (nucleus basalis Meynerti), wysyłającym projekcje do kory mózgowej, a także w przegrodzie (septum), wysyłającej projekcje do hipokampa. Uszkodzenie tych struktur w przebiegu chorób neurodegeneracyjnych, np. choroby Alzheimera, jest jedną z głównych przyczyn zaburzeń poznawczych. Acetylocholina jest również wytwarzana w krótkich interneuronach prążkowia (striatum) i jądra półleżącego przegrody (nucleus accumbens septi) oraz w neuronach motorycznych rdzenia kręgowego (motoneuronach), odgrywając istotną rolę w regulacji funkcji motorycznych, co z kolei ma znaczenie np. w przypadku choroby Parkinsona.

Acetylocholina w ośrodkowym układzie nerwowym, podobnie jak w obwodowym układzie nerwowym, działa przez dwa typy receptorów: jonotropowe receptory nikotynowe i metabotropowe receptory muskarynowe (patrz rozdz. 3). Spośród receptorów muskarynowych najistotniejsze funkcje w ośrodkowym układzie nerwowym pełnią postsynaptyczne receptory M1, mediujące większość ośrodkowych efektów działania acetylocholiny. Receptory M2, podobnie jak w układzie obwodowym, odgrywają rolę presynaptycznych autoreceptorów, regulujących uwalnianie acetylocholiny, a receptory nikotynowe - głównie rolę heteroreceptorów zlokalizowanych na obcych neuronach presynaptycznych, kontrolujących uwalnianie neuroprzekaźników, np. dopaminy i glutaminianu.

Ośrodkowe funkcje acetylocholiny dotyczą przede wszystkim procesów uczenia się i pamięci. Z tymi funkcjami acetylocholiny wiążą się głównie efekty terapeutyczne leków (np. stosowanych w chorobie Alzheimera inhibitorów acetylocholinoesterazy) oraz niektóre działania niepożądane, m.in. efekty amnestyczne leków o aktywności cholinolitycznej (np. niektórych leków przeciwpsychotycznych i przeciwdepresyjnych). Acetylocholina wydzielana w prążkowiu odgrywa również istotną rolę w kontroli napięcia mięśniowego i ruchów mimowolnych. Jej uwalnianie jest kontrolowane przez dopaminę wydzielaną z istoty czarnej (substantia nigra). Zniszczenie istoty czarnej, np. w przebiegu choroby Parkinsona, prowadzi do odhamowania uwalniania acetylocholiny z prążkowia, co ma duże znaczenie w powstawaniu zaburzeń motorycznych. W związku ze swoim wpływem na uwalnianie glutaminianu i dopaminy acetylocholina moduluje poziom pobudzenia ośrodkowego układu nerwowego oraz reguluje aktywność układu nagrody. Aktywność ta jest głównie związana z efektami działania nikotyny, a szczególnie ze skutkami prób zaprzestania palenia wyrobów tytoniowych.

Lekami ośrodkowego układu nerwowego modulującymi transmisję cholinergiczną są inhibitory cholinoesteraz, stosowane w chorobie Alzheimera (np. donepezyl), oraz antagoniści receptorów muskarynowych (np. pridynol), stosowani w parkinsonizmie polekowym, wywołanym głównie lekami przeciwpsychotycznymi o działaniu blokującym receptory dopaminowe. Istotne znaczenie mają również leki wykorzystywane w kuracjach odwykowych od palenia tytoniu, takie jak wareniklina, częściowy agonista receptora nikotynowego ?4?2, cytyzyna, również częściowy agonista receptorów nikotynowych, alkaloid izolowany ze złotokapu (laburnum), oraz sama nikotyna, stosowana w terapii zastępczej (gumy, plastry) (ryc. 2.17).

RYCINA 2.17. Agoniści receptora nikotynowego.