Przedmowa

Biopolimery to zagadnienie mało znane i niewykładane dla studentów na technologii polimerów (syntetycznych), przedmiocie dominującym na większości uczelni. A jednak biopolimery wytwarzane w przyrodzie odgrywają ważniejszą rolę w funkcjonowaniu życia na Ziemi niż te produkowane przez człowieka.

W organizmach żywych, zarówno roślin, zwierząt, jak i ludzi występują miliardy białek, które są biopolimerami. Pełnią one funkcje związane z podtrzymywaniem i regulacją procesów życiowych oraz stanowią materiał budulcowy struktur komórkowych i tkanek. Wyspecjalizowane białka są składnikami komórek, mięśni, skóry i włosów. Struktury złożone z białek odgrywają podstawową rolę w reakcjach metabolicznych, jak np. przekazie i obiegu sygnałów nerwowych, oraz są odpowiedzialne za transport innych cząsteczek we wnętrzu komórek i przez błony komórkowe. Jeszcze inne białka pełnią funkcję hormonów, przeciwciał, toksyn, są odpowiedzialne za różnego rodzaju choroby. Tak więc białka są najważniejszymi biopolimerami, syntezowanymi na matrycach kwasów nukleinowych DNA i RNA, które są również biopolimerami. Są liniowymi makrocząsteczkami łańcuchów polimerowych, zbudowanych z kilkudziesięciu, kilkuset lub tysięcy fragmentów (reszt) 20 aminokwasów, wchodzącymi w skład wszystkich żyjących organizmów tak roślinnych, jak i zwierzęcych.

Białka, aby mogły pełnić określone funkcje biologiczne, muszą mieć wsparcie w postaci ściśle określonych dodatkowych substancji wchodzących z nimi w układy hybrydowe (hybryda). Stąd w opisie białek i innych biopolimerów w książce, przytaczane są te związki jako uboczne substancje towarzyszące funkcjonowaniu białek. Pojawia się szereg nowych nazw, wymagających wyjaśnień, które są podane na aplach.

Biopolimerem natywnym jest człowiek. Skąd wynika takie stwierdzenie? Czy musimy zaakceptować, że jesteśmy biopolimerami? Otóż kwasy nukleinowe DNA i RNA są biopolimerami, które tworzą miliardy genów decydujących o przebiegu naszych funkcji życiowych od narodzenia aż po zgon. Są kluczem do życia na naszej Ziemi.

Powstaje dylemat, w jaki sposób utworzyły się na Ziemi te miliardy genów, kto zaprojektował ich sekwencje, skąd się wzięły elementy strukturalne (związki chemiczne do ich budowy) w określonym miejscu, jakie katalizatory i skąd brały w tym udział.

Współczesna biochemia i biologia molekularna potrafiła odtworzyć przebieg rekcji syntezy setek tysięcy białek i struktur dodatkowych związków chemicznych (enzymów jako katalizatorów), określić ich rolę w reakcjach metabolicznych (życia na Ziemi). Ale nie jest w stanie zastąpić biolaboratorium nawet najmniejszej istoty, począwszy od bakterii, przez kolorowe insekty i owady, które potrafią wytwarzać niezwykle skomplikowane związki chemiczne. Jest zastanawiające, że te twory natury, będące biopolimerami, mają takie możliwości i zdolności syntezy, jak chociażby barwników skrzydeł motyla.

Nie wszystko da się wytłumaczyć teoriami ewolucji i wiarą w dogmaty o powstaniu życia na Ziemi. Pozostaje jak dotąd bez odpowiedzi dylemat stworzenia biopolimerów.

Wszystko, z czym spotykamy się codziennie przy stole, a więc mleko i jego przetwory, chleb, mięso - to biopolimery, dlatego że w ich składzie znajdują się białka, a te są biopolimerami.

To, że chorujemy, jest także "zasługą" biopolimerów. Tylko polimery syntetyczne są człowiekowi obojętne.

O tym wszystkim opowiada ten podręcznik, który może być pomocny nie tylko studentom, pracownikom naukowym chemii i technologii polimerów, ale też biologii, medycyny, farmacji i innych kierunków.

Książka prezentuje wybrane zagadnienia szczególnie ważne dla tematyki biopolimerów. Są one opracowane systematycznie w możliwie najprostszy sposób pisemnego przekazu. Rysunki i tabele uzupełniają treść i warto je dokładnie przeanalizować. Dużo znamiennych terminów, z różnych dziedzin chemii, biologii i medycyny ma objaśnienie (wytłumaczenie) znaczenia umieszczone na szarym tle. To wszystko ułatwia posługiwanie się podręcznikiem. Szczególną uwagę poświecono badaniom eksperymentalnym biopolimerów i wskazówkom do przeprowadzania ćwiczeń laboratoryjnych z tego zakresu.

Autor wyznawał filozofię pracy naukowej wielkiego japońskiego fizykochemika prof. K. Tazuki (himalaisty), że miejsce profesora jest w laboratorium studenckim, współpracując ze studentami przy syntezach, obsłudze aparatury i opracowywaniu wyników, a także przy pisaniu wspólnych publikacji. Tak minęło mu 30 lat pracy na Królewskiej Politechnice w Sztokholmie (w zespole prof. B. R?nby) i na Królewskiej Akademii Medycznej (w zespole prof. L.?. Lindena).

Oba tomy Biopolimerów mają charakter opracowań w formie review. Powstały one na podstawie wielu podręczników z zakresu biochemii, biologii, technologii żywności, a nawet medycyny. Gdzie było to możliwe, jest cytowana literatura, z której korzystano. Dotyczy to również rysunków i tabel. Niekiedy ustalenie źródeł nie było możliwe.

Składam serdeczne podziękowania tym, którzy przyczynili się do realizacji tego podręcznika:

- prof. Danucie Żuchowskiej, za recenzje naukowe;

- redaktorom PWN - Pani Katarzynie Włodarczyk-Gil i Pani Mieczysławie Kompanowskiej - za nieocenioną współpracę naukową i techniczną w doprowadzeniu manuskryptu do druku;

- prof. Halinie Kaczmarek z Uniwersytetu w Toruniu, za materiały z zakresu biochemii,

- prof. Bronisławowi Marciniakowi, dyrektorowi Centrum Zaawansowanych Technologii UAM w Poznaniu, za materiały TOF-MALDI;

- osobom, które dostarczyły zdjęć fotograficznych, w kolejności alfabetycznej: dr Edycie Hebdzie (Politechnika Krakowska), dr Annie Kicińskiej-Jakubowskiej (Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Naturalnych w Poznaniu), dr. Pawłowi Kikowi (firma KikGel), prof. Małgorzacie Łochyńskiej (Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Naturalnych w Poznaniu), prof. Krzysztofowi Pielichowskiemu (Politechnika Krakowska), dr. Konstantinosowi Raftopoulosowi (Politechnika Krakowska), prof. Pawłowi Ruśkowskiemu (Politechnika Warszawska) oraz Kolegom - T. Prisnerowi (Toruń) i M. Sikorskiemu (Bazylea);

- prof. Dagmarze Jacewicz z Redakcji Wiadomości Chemicznych, za dostarczanie archiwalnych kopii czasopisma;

- pani Małgorzacie Choroś z Redakcji Polimerów, za dostarczanie archiwalnych kopii czasopisma;

- pani Iwonie Matuszewskiej-Fobce z Uniwersytetu Techniczno-Przyrodniczego w Bydgoszczy za pomoc w korzystaniu ze zbiorów bibliotecznych uczelni;

- dr. Markowi Pietrzakowi z Uniwersytetu Techniczno-Przyrodniczego w Bydgoszczy za pomoc techniczną w obsłudze programów komputerowych;

- mojej córce Dominice Rabek za opiekę w czasie pisania książki.

Pamięć mojej zmarłej żony Eweliny była stałym wsparciem w czasie pisania.

1Kwasy nukleinowe DNA i RNA - klucze do syntezy białek

Kwasy nukleinowe DNA i RNA są to biopolimery mające największe makrocząsteczki wśród związków naturalnych. W szczególności makrocząsteczki DNA mają kluczowe znaczenie w zachowaniu ciągłości życia. W DNA zawarte są plany budowy i instrukcje dla organizmu. Kwasy nukleinowe przechowują informację genetyczną organizmu i pośredniczą w produkcji białek zgodnie z zasadami kodu genetycznego. DNA jest materiałem genetycznym wszystkich organizmów - od jednokomórkowych bakterii po wielokomórkowe organizmy ssaków, w tym człowieka. Przepływ informacji genetycznej następuje zawsze od DNA przez RNA do białka. Przepływ informacji pomiędzy białkami lub od białka do kwasu nukleinowego nie jest możliwy.

1.1. Krótka historia DNA i RNA i ich roli w dziedziczeniu

W 1869 roku szwajcarski lekarz z J.F. Miescher, badając białe krwinki pobrane z bandaży nasiąkniętych ropą, wydzielił substancję znajdującą się w jądrach komórek, którą nazwał nukleiną. W 1889 roku niemiecki patolog R. Altman nazwał ją kwasem deoksyrybonukleinowym (DNA).

Pojęcie genu zostało wprowadzone w 1909 r. przez duńskiego botanika W. Johannsena dla określenia cech dziedziczenia przez organizmy występujące w przyrodzie.

Wielu naukowców zostało uhonorowanych przyznaniem Nagrody Nobla za badania w dziedzinie genetyki:

1933 - T.H. Morgan, za odkrycia dotyczące roli chromosomu w dziedziczeniu;

1958 - E.L. Tatum oraz G.W. Beadle, za odkrycie, że geny działają poprzez regulowanie określonych wydarzeń chemicznych;

1958 - J. Lederberg, za odkrycia dotyczące rekombinacji genetycznej i organizacji materiału genetycznego bakterii;

1959 - A. Kornberg i S. Ochoa, za odkrycie mechanizmów biologicznej syntezy kwasów rybonukleinowych i kwasów deoksyrybonukleinowych;

1962 - amerykański biolog J. Watson i brytyjscy fizycy F. Crick i M. Wilkins, za rozwiązanie struktury DNA [1.20-1.24] na podstawie zdjęć dyfrakcyjnych DNA (rys. 1.1) zrobionych przez brytyjską fizyczkę R. Franklin (zmarła na cztery lata przed przyznaniem Nagrody Nobla) [1.29] - okazało się, że łańcuchy w makrocząsteczce DNA układają się razem, tworząc spiralę (helisę);

Rys. 1.1. Kopia rysunkowa zdjęcia dyfrakcyjnego DNA zrobionego przez R. Goslinga w 1952 r. w zespole brytyjskiej fizyczki R. Franklin

1968 - R.W. Holley, H.G. Khorana i M.W. Nirenberg, za interpretację kodu genetycznego i jego znaczenia w procesie syntezy białek;

1980 - P. Berg, za biochemię kwasów nukleinowych DNA, W. Gilbert i F. Sanger, za opracowanie metody sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie;

1982 - A. Klug, za określenie struktury biologicznej ważnych kompleksów białek z kwasami nukleinowymi;

1989 - S. Altman, T.R. Cech, za odkrycie katalitycznych właściwości RNA;

2006 - R. Kronberg, za dokładne opisanie kolejnych etapów transkrypcji, w zespole z A. Fire i C. Mello, którzy dokonali tzw. wyciszania genów za pomocą RNA;

2015 - T. Lindahl, P. Modrich, A. Sancar, za badania mechanistyczne nad naprawą DNA;

2020 - J. Doudna i E. Charpentier, za rozwój metod edycji genomu.

1.2. Podstawowe pojęcia terminologiczne dotyczące budowy kwasów nukleinowych

Rozróżnia się dwa podstawowe rodzaje kwasów nukleinowych, będących biopolimerami nukleotydów [1.30-1.48]:

- kwas deoksyrybonukleinowy DNA (DeoxyriboNucleic Acid), znajdujący się wyłącznie w jądrze komórkowym w chromosomach, gdzie pełni funkcję nośnika informacji genetycznej organizmów; zdolność DNA do pełnienia funkcji nośnika informacji genetycznej niezbędnej do reprodukcji komórki jest ściśle związana ze strukturą cząsteczek DNA;

- kwas rybonukleinowy RNA (RiboNucleic Acid), znajdujący się w cytoplazmie i jądrze komórkowym; pełni funkcję przekaźnika informacji genetycznej od DNA do białka.

Kwasy nukleinowe DNA i RNA zbudowane są z podstawowych elementów strukturalnych zwanych nukleotydami. Nukleotydy są estrami fosforanowymi N-glikozydowych pochodnych heterocyklicznych zasad azotowych (oligodeoksyrybonukleotydów). Zasady te dzieli się na:

- cytozyna (C),

- azotowe piramidowe:

- tymina (T),

- uracyl (U)

- azotowe purynowe:

- adenina (A),

- guanina (G).

cytozyna uracyl tymina

guanina adenina

Łączą się one z pięciowęglowymi cukrami D-deoksyrybozą w DNA lub D-rybozą w RNA, tworząc nukleozydy (nucleosides).

?-D-deoksyryboza w DNA ?-D-ryboza w RNA

(nukleozyd pirymidynowy) (nukleozyd purynowy)

Nukleozydy mają pojedynczą grupę fosforanową lub łańcuch trzech grup fosforanowych.

W komórce nukleotyd który ma być dołączony do łańcucha polinukleotydowego posiada trzy grupy fosforanowe:

grupa trifosforanowa

Nukleotyd łączący się z wydłużającym się łańcuchem DNA lub RNA, traci swoje dwie lub trzy grupy fosforanowe. Zatem w łańcuch DAN lub RNA, każdy nukleotyd ma tylko jedną grupę fosforanową (PO42-) (rys. 1.2).

Rys. 1.2. Wzory pojedynczych łańcuchów (nici): a) DNA i b) RNA, gdzie: A - adenina, C - cytozyna, G - guanina, T - tymina, U - uracyl.

Nukleozydy łączą się ze sobą za pomocą wiązań kowalentnych między pierścieniami cukrowymi. W związku z tym na każdej nici wyróżnia się dwa kierunki: C-3' - C-5' oraz C-5' - C-3'.

Miliony nukleotydów łączą się w łańcuchy polinukleotydów, tworząc cząsteczki DNA o masach cząsteczkowych (molowych) rzędu 106-109 g - mol-1. Cząsteczki RNA mają znacznie mniejsze wymiary i masy cząsteczkowe 2,5 - 104 g - mol-1.

Masy cząsteczkowe DNA zależą od budowy organizmu, w którym występują:

- w wirusie SV40 3,2 - 106 g - mol-1,

- w bakterii E. coli mają wymiar 2,5 - 109 g - mol-1.

Rzeczywiste oznaczenie mas cząsteczkowych jest bardzo trudne dla maksymalnie długich DNA i RNA bez konsekwencji ich uszkadzania. Dane na ten temat uzyskuje się z pomiarów sedymentacyjnych (patrz tom II, rozdz. 4.1).

1.2.1. Komplementarność par zasad

Każdemu nukleotydowi na jednej nici odpowiada łączący się z nimi komplementarny nukleotyd na drugiej nici (komplementarność pad zasad) (base pair). Adenina (A) łączy się z tyminą (T), a guanina (G) - z cytozyną (C), a zawartość cytozyny (C) jest równa dokładnie zawartości guaniny (G). Zależność tę można wyrazić w następujący sposób:

A = T i C = G

lub

A/T = 1 i C/G = 1

lub inaczej

(A + G) : (T + C) = 1.

Znaczy to, ze suma zasad purynowych w DNA jakiegokolwiek pochodzenia równa się sumie zasad pirymidynowych. Prawidłowość tę nazwano regułą Chargaffa. Reguła ta mówi, że w cząsteczce DNA obserwuje się ściśle dopasowanie zasad: na każdą resztę adeniny (A) w sposób obowiązujący przypada reszta tyminay (T), a na resztę cytozyny (C) - reszta guaniny (G). Pomiędzy adeniną (A) a tyminą (T) tworzą się dwa wiązania wodorowe, a pomiędzy cytozyną (C) a guaniną (G) - trzy.

W warunkach fizjologicznych struktury DNA powstają dzięki komplementarności (łac. complementum - uzupełnienie) par zasad, występujących w sąsiednich łańcuchach (1) i (2). Niciach (1) i (2) lub DNA i RNA:

Polinukleotydy mogą być niezwykle długie, bez jakichkolwiek ograniczeń co do liczby nukleotydów i kolejności ich ułożenia (fot. 1.1). Maksymalna liczba możliwych sekwencji jakiegoś polinukleotydu wynosi 4n, gdzie n równa się liczbie tworzących go nukleozydów, np. polinukleotydy zawierające sześć zasad mogą utworzyć w postaci 4n = 4096 różnych sekwencji.

Fot. 1.1. Zdjęcie mikroskopowe cząsteczki łańcucha DNA

Liczba par zasad (pz) jest liczbą nukleozydów składających się na oba łańcuchy kwasu nukleinowego. Jest używana do określenia długości cząsteczek DNA:

- kilo par zasad (kbp) = tysiąc pz,

- mega par zasad (Mbp) = milion pz,

- giga par zasad (Gbp) = miliard pz.

Dla przykładu długość helisy DNA chromozomu X człowieka wynosi 152,6 Mpz, podczas gdy chromozomu Y - 51,0 Mpz. Długość całego ludzkiego genomu to 3200 Mpz. Najdłuższy łańcuch DNA - 150 Gbp - został znaleziony w krzewie rośliny pierisa japońskiego (pieris japonica).

Większość makrocząsteczek DNA zawiera dwa długie łańcuchy polinukleotydów skręcone wokoło siebie. RNA występuje jako makrocząsteczka jednołańcuchowa. Znane są jednak przypadki wirusów, które mają DNA jednołańcuchowe, a RNA - dwułańcuchowe.

Sekwencja nukleotydów w jednej nici DNA determinuje kolejność nukleotydów w drugiej nici dimeru, zgodnie z zasadami komplementarności. Oba łańcuchy DNA cechuje przeciwna polaryzacja, czyli koniec C-3' jednej nici sąsiaduje z końcem C-5' drugiej (określane jako antyrównoległosć, ważne dla powielania DNA) (rys. 1.3):

Rys. 1.3. Sekwencja nukleotydów w jenej nici DNA determinuje kolejność nukleotydów w drugiej części dimeru

Jeżeli sekwencją jednej nici jest 5'-AATTGGCC-3 to komplementarna nić musi mieć sekwencję 31-TTAACCGG-5.

Komplementarność zasad w analogicznym łańcuchu RNA, w którym tymina (T) jest zastąpiona uracylem (U), jest następująca:

- łańcuch 1: AUCGAUGAUC (10 pz),

- łańcuch 2: UAGCUACUAG (10 pz).

1.2.2. Budowa helisy DNA

Dwie nici DNA tworzą dwułańcuchową helisę DNA. Tak helisa jest prawoskrętna (rys. 1.4). Wymiary podwójnej helisy ?-helisy DNA:

- średnica - 2 nm;

- odległość między zasadami mierzona wzdłuż osi helisy - 0,34 nm;

- zasady są skręcone względem siebie pod kątem 36°;

- na pełen skręt helisy przypada 10 nukleotydów (3,4 nm) 10 par zasad (pz):

- łańcuch 1: ATCGATGATC (10 pz),

- łańcuch 2: TAGCTACTAG (10 pz).

Rys. 1.4. Model podwójnej helisy DNA zaproponowany przez Watsona i Cricka

Do wnętrza helisy skierowane są reszty pirymidynowe i purynowe, natomiast jej powierzchnia zewnętrzna utworzona jest przez fragmenty fosfosacharydowe. Istnienie struktury heliakalnej determinowane jest przez oddziaływania między cząsteczkami zasad azotowych wchodzących w skład jednej nici, o tworzeniu struktury dwuniciowej (dimerycznej) decydują wzajemne oddziaływania między zasadami dwu łańcuchów. Pierścienie pirymidynowe i purynowe jednej pary komplementarnej zasad nie leżą dokładnie w jednej płaszczyźnie, lecz są skręcone względem siebie jak łopaty śmigła (rys. 1.5). Taką formę DNA określa się mianem B-DNA.

Rys. 1.5. Skręcenie śmigłowe

Badania rentgenograficzne potwierdziły istnienie trzech zasadniczych form, jakie może przyjmować cząsteczka DNA (rys. 1.6).

Rys. 1.6. Trzy zasadnicze formy A-, B-, i Z-DNA

1. A-DNA - forma prawoskrętnej helisy; w odróżnieniu od B-DNA jest to szersza i krótsza helisa.

2. B-DNA - forma prawoskrętnej helisy, składającej się z dwóch owiniętych wokół siebie nici. Na powierzchni helisy występują dwa naprzemienne zagłębienia o różnej szerokości: mały rowek i duży rowek. Powstają one dlatego, że wiązania N-glikozydowe komplementarnych par zasad nie leżą dokładnie naprzeciwko siebie. Rowki są wypełnione grupami funkcyjnymi, będącymi donorami lub akceptorami protonów, uczestniczących w tworzeniu wiązań wodorowych. Na dnie rowka białka wiążące rozpoznają sekwencję nukleotydową, gdyż tam występują grupy funkcyjne.

3. Z-DNA - dwuniciowa helisa lewoskrętna zawierająca tylko jeden głęboki rowek.

Tabela 1.1. Porównanie form A, B i Z DNA

Parametr

Typ helisy

A

B

CZ

Kształt

najszersza

pośrednia

najwęższa

Przyrost długości helisy na parę zasad

0,23 nm

0,34 nm

0,38 nm

Średnica helisy

2,55 nm

2,37 nm

1,84 nm

Kierunek skręcenia

prawoskrętna

prawoskrętna

lewoskrętna

Wiązanie glikozydowe

anti

anti

anti dla C i T syn dla G

Konformacja pierścienia cukrowego

C3'-endo

C2'-endo

C3'-endo

Liczba par zasad na skręt helisy

11

10,4

12

Skok helisy

2,53 nm

3,54 nm

4,56 nm

Odchylenbie pary zasad od położenia prostopadłego do osi helisy

19°

1°

9°

Duży rowek

wąski i bardzo głęboki

szeroki i dość głęboki

płaski

Mały rowek

bardzo szeroki i płytki

szeroki i dość głęboki

bardzo wąski i głęboki

1.2.3. Kwas rybonukleinowy (RNA)

Makrocząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA) w przeciwieństwie do DNA zbudowane są tylko z jednej nici [1.25]. RNA zawiera trzy takie same zasady jak DNA: adeninę (A), cytozynę (C) i guaninę (G), a zamiast tyminy (T) w RNA występuje uracyl (U). Struktura przestrzenna RNA jest różna i zależy od funkcji danej jego formy [1.49, 1.50].

Często dochodzi do parowania się odcinków komplementarnych znajdujących się w obrębie jednej nici. Jeżeli parowaniu ulegają fragmenty tej samej nici, a w miejscu jej zagięcia znajdują się niesparowane nukleotydy, powstaje w tym miejscu pętla. Taka struktura składająca się z podwójnego odcinka RNA i pętli określana jest mianem spinki do włosów. RNA występuje w niżej opisanych trzech postaciach.

1. Informacyjne RNA (messenger RNA) mRNA zawiera od 75 do 3000 jednostek nukleotydowych, dających masy cząsteczkowe od 2,5 - 104 do 1 - 106 g - mol-1. Informacyjne mRNA stanowi tylko ok. 2-10% ogólnej zawartości RNA w komórce. Powstaje w procesie transkrypcji (zsyntezowany na podstawie sekwencji nukleotydów w DNA) [1.51]. Pełni funkcję matrycy w procesie translacji informacji z DNA do rybosomów (tj. w procesie syntezy białka na podstawie cząsteczki mRNA). Cechą charakterystyczną mRNA jest obecność:

- na końcu łańcucha C-5' reszty nukleozydowej 2'-orto-metylowanej reszty nukleotydowej, połączonej poprzez resztę C-5'(-OH) z trifosforanem 7-metyloguanozyny;

- na końcu łańcucha C-3' fragmentu zawierającego 200-250 reszt nukleozydu adenozyny.

Struktura ta jest konieczna do rozpoczęcia translacji do jądra komórkowego.

2. Rybosomalne RNA (ribosomal RNA) rRNA zawiera zróżnicowane struktury od:

- 120 jednostek nukleotydowych (masy cząsteczkowe 3,5 - 104 g - mol-1),

- 1550 jednostek nukleotydowych (masy cząsteczkowe 5,5 - 105 g - mol-1),

- 2900 jednostek nukleotydowych (masy cząsteczkowe 1,1 - 106 g - mol-1)

wchodzące w skład rybosomów [1.52].

3. Transferowe RNA (transfer RNA), transportujące RNA, przenoszące RNA, tRNA, zawiera 73-94 jednostek nukleotydowych, dających masy cząsteczkowe od 2,3 - 104 do 3 - 104 g - mol-1. Sekwencji pierwszych cząstek tRNA dokonał R. Holley w 1965 r. Każda cząsteczka tRNA różni się od innych sekwencją nukleotydową [1.53]. Transferowe tRNA przenosi aminokwasy do rybosomów, w których na matrycy informacyjnego mRNA następuje synteza polipeptydów związana z wydłużaniem łańcucha peptydowego:

tRNA + aminokwas ? aminoacylo-tRNA

Transferowe tRNA stanowi 75-90% ogólnej zawartości RNA w komórce. Jest głównym składnikiem rybosomów i pełni funkcje katalityczne w syntezie białek. Cząsteczki tRNA są najkrótszymi funkcjonalnymi cząsteczkami RNA. Zawierają dodatkowo od 5 do 10 zmodyfikowanych nukleotydów, metylowe bądź dimetylowe pochodne zasad azotowych, w tym:

- 1-metylo-adenozynę (A),

- 2-metylo-cytydynę (C),

- 2-metylo-guanozynę (G)

oraz nukleozydy purynowe:

- inozynę (I),

- 5,6-dihydrourydynę,

- pseudourydynę (?).

inozyna urydyna pseudourydyna

Stanowią one 10 do 20% wszystkich nukleotydów i prawie zawsze występują w tych samych pozycjach.

Struktura pierwszorzędowa wszystkich cząsteczek transferowego kwasu rybonukleinowego pozwala na jego sfałdowanie.

Cząsteczki tRNA tworzą bardzo charakterystyczną postać. Ich struktura drugorzędowa określana jest jako tzw. liście koniczyny (rys. 1.7), a trzeciorzędowa - jako forma L [1.54, 1.55].

Rys. 1.7. Struktura drugorzędowa cząsteczki tRNA

Struktura drugorzędowa tRNA liścia koniczyny obejmuje kilka domen:

- domenę akceptorową (tzw. minihelisy), w skład której wchodzą:

- ramię akceptorowe, do którego, z charakterystyczną sekwencją C-5'-CCA-C-3', przyłączany jest na drodze syntezy aminoacylo-tRNA fibroblastów (tRNA + aminokwas), będący substratem do syntezy łańcucha polipeptydowego,

- ramię dodatkowe (zmienne), tzw. pętlę dodatkową (zmienną), zbudowane z różnej liczby nukleotydów;

- domenę antykodonową (ramię i pętla antykodonu), na której znajduje sekwencja trzech nukleotydów tworzących antykodon; w trakcie procesu translacji antykodon łączy się z odpowiadającą mu sekwencją trzech nukleotydów (kodonem) w mRNA na drodze parowania zasad azotowych (zasada komplementarności zasad);

- domenę dihydrourydyny, zawierającą pętlę DHU - zmodyfikowany nukleotyd, którym jest dihydrourydyna (DHU);

- domenę T?C, zawierającą pętlę T?C - sekwencję składającą się z: tyminy (rybotymidyny) (T), pseudourydyny (?) i cytozyny (C);

- ramię zmienne, znajdujące się pomiędzy domeną antykodonowi a domeną T?C, które zawiera różną liczbę nukleotydów.

Transkrypton jest sumą cząsteczek RNA organizmu (komórki). Struktura trzeciorzędowa tRNA obejmuje domeny:

- akceptorową,

- antykodonową,

z których każda oddziałuje z innymi częściami rRNA.

Kwasy nukleinowe należą do grupy polielektrolitów. W roztworach wodnych o pH zbliżonym do 7 (roztwór fizjologiczny), grupa fosfodiestrowa jest w znacznym stopniu zjonizowana.

Kwasy nukleinowe spełniają wiele kluczowych funkcji w organizmach żywych, jak:

- przekazywanie bieżącej informacji niezbędnej do syntezy białek, charakterystycznych dla danej komórki, za pomocą tRNA;

- przekazywanie informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie (DNA) - za każdym razem potomstwo otrzymuje połowę DNA od rodziców.

Kształt, podatność na zginanie i skręcanie makrocząsteczek DNA i dynamika molekularna decydują o przebiegu ważnych bioreakcji w organizmach.

1.3. Metody oczyszczania kwasów nukleinowych

Do oczyszczania kwasów nukleinowych DNA i RNA zazwyczaj stosuje się kombinację dwu lub więcej następujących technik [1.59, 1.60]:

- izolacja/wytrącanie;

- wirowanie (w gradiencie chlorku cezu);

- separacja chromatograficzna (patrz tom II, rozdz. 2):

- filtracja w żelu,

- wymiana jonowa,

- selektywna adsorpcja (chromatografia wykluczania),

- rozdział oparty na powinowactwie (affinity separation).

Izolację najczęściej przeprowadza się za pomocą mieszaniny chloroformu i fenolu w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych. Jeżeli stężenie kwasów nukleinowych jest małe, dodaje się glikogen w celu zwiększenia efektywności wytrącania.

Innymi stosowanymi metodami oczyszczania są:

- selektywne wytrącanie kwasów nukleinowych w wysokich stężeniach soli (wysalanie - salting out);

- zmiana pH roztworu;

- użycie detergentu jonowego bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), który tworzy nierozpuszczalny kompleks z kwasami nukleinowymi w środowisku o niskim zasoleniu; w tych warunkach zanieczyszczenia pozostają w roztworze; kompleks DNA-CTAB jest rozpuszczalny w roztworze o zwiększonym stężeniu soli i wytrącany 70-proc. etanolem lub izopropanolem.

CTAB

1.3.1. Denaturacja termiczna DNA

Denaturacja DNA (przejście helis w kłębek) polega na zniszczeniu struktury dwuniciowej (helisy) DNA.W wyniku tego procesu następuje rozplątanie podwójnej helisy wskutek zerwania wiązań wodorowych między łańcuchami polinukleotydami bez zmniejszania stopnia polimeryzacji (rys. 1.8). Jest to proces bardzo szybki. DNA o masie rzędu 108 Da ulega denaturacji cząsteczkowej w ciągu ok. 1 min.

Rozdzielone nici polinukleotydowe przyjmują konformację kłębkową, w której łańcuchy mają dużą giętkość i swobodne położenie względem siebie.

Rozplątane nici są kopiowane przez enzym polimerazę DNA-Tag. Denaturację można przeprowadzić, ogrzewając roztwór DNA powyżej 90°C. Po ponownym ochłodzeniu roztworu rozdzielone łańcuchy DNA ulegają renaturacji (reasocjacji), odtwarzając strukturę dwuniciową. Jest to przejście konformacyjne kłębek-helisa, zachodzące w sposób kooperatywny.

Renaturacja DNA uwarunkowana jest procesem dyfuzji, który określa prawdopodobieństwo spotkania się dwu komplementarnych nici DNA. Prawdopodobieństwo to będzie zależało od stężenia DNA i czasu denaturacji. Im większe jest stężenie DNA, tym mniejsza jest średnia przebyta droga konieczna do spotkania innej cząsteczki DNA. Im dłuższy jest czas trwania dyfuzji, tym dłuższa jest średnia przebyta droga.

Na stopień denaturacji ma wpływ sekwencja DNA.

Rys. 1.8. Procesy denaturacji i reasocjacji helis DNA

1.3.2. Hydroliza chemiczna kwasów nukleinowych

Degradacja (hydroliza chemiczna) zachodzi pod wpływem stężonych kwasów (DNA i RNA):

- mrówkowego (HCOOH) w temp. 175°C, przez 30 min,

- chlorowego(V) (HClO3),

- chlorowego(VII) (HClO4) w temp. 100°C przez 1 godz.

w temperaturze 100°C przez godzinę hydrolizie ulega wiązanie N-glikozydowe między puryną a pentozą. Uwalniane są wolne puryny i kwas apurynowy. Dalsza hydroliza prowadzi do rozpadu wiązania estrowego między pentozą a resztą kwasu fosforowego, w efekcie czego uwalniany jest cukier i fosforan. Następnie hydrolizie ulegają wiązania fosfodiestrowe między nukleotydami zawierającymi zasady pirymidynowe. Pełna hydroliza prowadzi do rozpadu wiązań N-glikozydowych między zasadami pirymidynowymi a pentozą i wiązań estrowych między tym cukrem a fosforanem.

- zasad (RNA), hydrolizie ulegają jedynie wiązania C-3',5'-fosfodiestrowe między fosforanem a grupą hydroksylową (-OH) w RNA.

Poszczególne składniki hydrolizy DNA można oznaczyć przez zastosowanie typowych dla nich reakcji barwiących, opisanych w chemii organicznej:

- wykrywanie rybozy (reakcja Biala) - w wyniku ogrzewania pentoz z kwasem solnym powstaje furan, który następnie reaguje z orcyną w obecności chlorku żelaza(II) i tworzy kompleks o zielonej barwie; w tych warunkach deoksyryboza reaguje około 10 razy słabiej od rybozy

furfural orcyna barwny kompleks

- wykrywanie deoksyrybozy (reakcja Dischego) - deoksyryboza daje niebieskie zabarwienie z difenyloaminą [1.61], co jest wynikiem powstawania aldehydu ?-hydroksylewulinowego z deoksyrybozy w wyniku działania kwasu siarkowego(VI) (H2SO4) i octowego (CH3COOH), który następnie ulega kondensacji z difenyloalaniną, w wyniku czego powstaje niebieski produkt

- wykrywanie grup ortofosforanowych - kwas fosforowy(V) z molibdenianem amonu (NH4)3MoO w obecności kwasu azotowego(V) HNO3 daje nierozpuszczalny kompleks o żółtej barwie zwany fosfomolibdenianem amonu:

H2PO4 + 12 (NH4)3 + 21 HNO3 ? (NH4)3PO4 - MOO3 - 2 H2O + 21 NH3NO3 + 10 H2O

1.3.3. Degradacja enzymatyczna

Degradacja enzymatyczna zachodzi pod wpływem enzymów [1.62, 1.63]:

- nukleazy, która hydrolizuje wiązanie C-3',5'-fosfodiestrowe, uwalniając pojedyncze nukleotydy;

- glikozydaz, hydrolizujących wiązania N-glikozydowe, prowadząc do odłączenia zasad azotowych od szkieletu cukrowo-fosforanowego;

- fosfataz, hydrolizujących wiązania estrowe.

Wspólne działanie wszystkich tych enzymów prowadzi do otrzymania mieszaniny wolnych zasad azotowych (purynowych i pirymidynowych), fosforanu i cukru (D-rybozy lub D-deoksyrybozy).

1.4. Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie (oznaczanie budowy i położenia - sekwencji fragmentów) DNA jest techniką odczytywania kolejności par nukleotydowych w makrocząsteczce DNA [1.64-1.71]. Makrocząsteczka DNA jest bardzo duża. W celu określenia jej budowy trzeba ją podzielić na mniejsze fragmenty. Celem sekwencjonowania DNA jest ustalenie rodzaju i kolejności nukleotydów składających się na zapis informacji genetycznej w badanej cząsteczce DNA.

Sekwencjonowanie można przeprowadzić różnymi metodami, np. metodą Sangera, metodą Gilberta-Maxama, termicznego pirosekwencjonowania, bezpośredniego odczytu czy elektroforezy kapilarnej.

Przebieg reakcji sekwencjonowania metodą Sangera [1.70, 1.71] (patrz podrozdz. 1.4.1) jest oparty na pozakomórkowej replikacji DNA, rozdziale i oznaczeniu przerwanych fragmentów DNA za pomocą:

- cienkowarstwowej chromatografii żelowej (patrz tom II, podrozdz. 2.1.2);

- wysokorozdzielczej elektroforezy kapilarnej (elektroforogram) (patrz tom II, podrozdz. 3.1.6) [1.72, 1.73];

- detekcji spektroskopii fluorescencyjnej (patrz tom II, podrozdz. 4.6.4), znakowanych fluorescencyjnie przerwanych fragmentów [1.74, 1.75] - każdemu nukleozydowi odpowiada inny kolor.

Metoda ta umożliwia sekwencjonowanie automatyczne. Nie wymaga dużo materiału genetycznego. W. Gilbert oraz F. Sanger otrzymali w 1980 r. Nagrodę Nobla za opracowanie metod sekwencjonowania DNA.

Metoda Gilberta-Maxama polega na znakowaniu próbki DNA na końcu C-5' radioizotopem fosforu 32P [1.75].

Metoda termicznego pirosekwencjonowania - metoda sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym, która wykorzystuje analizę błysków chemiluminescencji emitowanych podczas przyłączania kolejno czterech nukleotydów enzymów do matrycy DNA:

- polimerazy DNA-Taq;

- sulfurylazy ATP;

- lucyferazy;

- apirazy.

Metoda bezpośredniego odczytu (nanosekwencjonowania), w której makrocząsteczka DNA przesuwająca się przez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio.

Metoda elektroforezy kapilarnej [1.71, 1.72] - odczyt sekwencji w metodzie Sangera zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów, pozwalający na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary.

Obecnie sekwencjonowanie DNA przeprowadza się za pomocą zautomatyzowanych aparatów. Nowoczesne aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad dziennie.

1.4.1. Metoda Sangera terminacji wydłużania łańcucha

Metoda Sangera terminacji wydłużania (elongation) łańcucha [1.69, 1.70, 1.45] polega na wstępnym przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej składającej się z:

- materiału przygotowanego do powielenia (sekwencjonowania) (DNA matrycowy) (template);

- pary starterów (primers), stanowiących fragmenty DNA, które są komplementarne do sekwencji poszukiwanych odcinków DNA; primer jest krótkim fragmentem pojedynczego DNA wiążącego się z matrycowym DNA (template) i działającym jako starter polimerazy; aby zaprojektować starter, konieczna jest znajomość sekwencji amplifikowanej;

- enzymu termostabilnej polimerazy DNA-Taq;

- buforu.

Startery najczęściej dobiera się na podstawie danych zamieszczonych w literaturze przedmiotu lub konstruuje się na podstawie sekwencji dostępnych w banku genów:

- czterech nukleotydów - dATP, dDTP, dTTP, dCTP (patrz podrozdz. 1.2);

- czterech terminujących dideoksynukleotydów DNA - trifosforanów dideoksynukleozydów ddNTP - ddATP, ddGTP, ddTTP, ddDCTP - wyznakowanych różnymi barwnikami B1 (dd-ATP-B1), B2 (dd-DTP-B2), B3 (dd-TTP-B3), B4 (dd-DCTP-B4), ale w mniejszych ilościach niż nukleotydy.

Starter syntezuje enzym prymaza, podczas gdy enzym egzonukleaza usuwa startery z nici DNA.

W przypadku nieznajomości amplifikowanej sekwencji stosuje się 10-15-nukleotydowe startery o losowych sekwencjach. Nadają się do analiz:

- populacyjnych,

- ewolucyjnych,

- epidemiologicznych,

- mapowania genomów.

Dideoksynukleotydy DNA są podobne do zwykłych nukleotydów DNA, ale brakuje im grupy hydroksylowej (-OH) na atomie węgla C-3' pierścieni cukrowych, której obecność umożliwiała dodanie nowego nukleotydu do istniejącego łańcucha. Po dodaniu do łańcucha DNA dideoksynukleotydu nie ma dostępnej grupy hydroksylowej (-OH) i nie mogą być dodawane kolejne nukleotydy. Łańcuch kończy się dideoksynukleotydem (ddNTP), który jest wyznakowany określonym barwnikiem (B) fluorescencyjnym w zależności od zasady (A-B1, T-B2, C-B3 lub G-B4).

Mieszanina reakcyjna jest następnie w kolejności:

- ogrzewana w celu denaturacji matrycowego DNA (rozdzielenia podwójnej nici) (denaturation);

- schładzana, aby starter mógł związać się z jednolicową matrycą (annealing);

- ponownie ogrzewana po związaniu startera, aby umożliwić polimerazie DNA syntezę nowego DNA, zaczynając od startera; polimeraza DNA będzie kontynuować dodawanie do łańcucha DNA nukleotydów (dATP, dDTP, dTTP, DTP) wyznakowanych różnymi barwnikami: B1 (dd-ATP-B1), B2 (dd-DTP-B2, dd-TTP-B3, dd-DCTP-B4 zamiast nukleotydu (dATP, dDTP, dTTP, dCTP) (elongation), aż do chwili, gdy zostanie dodany dideoksynukleotyd (ddNTP); w tym momencie nie jest już możliwe dodawanie żadnych nukleotydów, więc nić zakończy się dideoksynukleotydem (ddNTP) [1.76, 1.77].

Polimeraza DNA odbudowuje na każdej z nici brakujący, komplementarny odcinek DNA, zaczynając od miejsc C-3'. Podczas pierwszego cyklu z każdego jednoniciowego odcinka DNA powstaje kolejny fragment - liczba fragmentów ulega podwojeniu. Metoda ta pozwala na otrzymanie wielu fragmentów genów z niewielkiej ilości materiału genetycznego.

1.4.2. Metoda Gilberta-Maxama

Metoda Gilberta-Maxama polega na znakowaniu próbki DNA na końcu C-5' radioizotopem fosforu 32P, a następnie ich degradacji w czterech odrębnych reakcjach wykorzystujących odmienne zestawy związków chemicznych [1.78]. Na pierwszym etapie procesu następuje modyfikacja zasad azotowych nukleotydów i oderwanie ich od reszt cukrowych deoksyrybozy łańcucha polinukleotydu.

Na drugim etapie w miejscach oderwania zasad nić DNA ulega cięciu. W tym celu stosuje się reakcje w wymienionej kolejności:

- miejsce cięcia G: siarczan dimetylu (DMS) (CH3O)2SO2 + piperydyna C5H11N (metylacja przez DMS);

- miejsce cięcia A + G: siarczan dimetylu + piperydyna + kwas mrówkowy HCOOH (depurynacja przez HCOOH);

- miejsce cięcia C: hydrazyna (H2N-NH2)/chlorek sodu (NaCl), piperydyna (hydroliza przez hydrazynę w 1,5-molowym NaCl);

- miejsce cięcia C + T: hydrazyna + piperydyna (hydroliza przez hydrazynę); warunki rekcji dobrane są w ten sposób, aby jedna nić DNA uległa przecięciu na 2-3 fragmeny, z których jeden zawiera znacznik izotopowy.

Ponieważ dana zasada występuje w łańcuchu DNA wielokrotnie, w mieszaninie poreakcyjnej znajduje się zbiór wielu fragmentów DNA o różnej długości, zależnej od miejsca cięcia. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji rozdziela się elektroforetycznie, po czym poddaje autoradiografii uwidaczniającej łańcuchy DNA wyznakowane izotopowo. Uzyskane prążki odpowiadają fragmentom DNA mającym na końcu C-3' określoną zasadę. Wadą tej metody jest duża toksyczność używanych odczynników.

Syntezę prowadzi się z wykorzystaniem trifosforanów dideoksynukleozydów (ddNTP, np. adenozynotrifosforanu dATP) i enzymu polimerazy Taq, uzyskując w ten sposób przerwane fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem (chain-termination nucleotyde). ATP przyłącza się, tworząc wiązanie estrowe, do wolnego końca grupy C-3'(-OH) do ostatniej deoksyrybozy w nowo utworzonej nici DNA. Wytworzenie jednego wiązania estrowego między kwasem fosforowym a deoksyrybozą w wydłużającej się nici DNA jest sprzężone z rozerwaniem dwóch wysokoenergetycznych wiązań w cząsteczce trifosforanu nukleozydowego (dATP) i utworzeniem monofosforanu nukleozydowego (AMP). Produktem tej reakcji oprócz nowej nici DNA jest także cząsteczka uwolnionego pirofosforanu nieorganicznego (P2O74-) na każdą cząsteczkę wbudowanego deoksyrybonukleotydu (dATP) (patrz podrozdz. 2.13.1):

ATP ? AMP + P2O74- + energia (33,47 kJ - mol-1),

adenozyno-5-trifosforan (ATP)

adenozyno-5-monosforan

Proces ten powtarza się w kilku cyklach. Do czasu zakończenia cykli jest praktycznie gwarantowane, że dideoksynukleotyd (ddNTP) zostanie włączony w każdą pozycję docelowego DNA w co najmniej jednej reakcji. Oznacza to, że za pomocą tej metody można uzyskać miliony kopii fragmentów DNA z pojedynczej cząsteczki DNA.

1.4.3. Oznaczanie ilości DNA metodą spektrofotometryczną

Ilości DNA i RNA, oligonukleotydów, a nawet mononukleotydów, mogą być mierzone bezpośrednio w roztworze wodnym w formie nierozcieńczonej lub rozcieńczonej. Wyznacza się je przez pomiar absorpcji (absorbancji) A w świetle ultrafioletowym [1.35]. Pomiar jest prosty i dokładny (patrz tom II, podrozdz. 4.5).

Zasady wchodzące w skład DNA i RNA nie absorbują światła widzialnego, dzięki czemu kwasy polinukleinowe są odporne na fotodegradację pod wpływem części widzialnej światła słonecznego (400-800 nm). Zdolność kwasów nukleinowych DNA i RNA do absorpcji promieniowania UV (200-400 nm) (rys. 1.9 a, b) można wykorzystać do ich:

- wykrycia;

- oznaczenia ilościowego;

- określenia stopnia czystości - stosunek A260/A280 jest oceną stopnia czystości, dla czystego DNA wynosi on 1,8, a dla RNA 2,0.

Absorbancja kwasów nukleinowych DNA i RNA zależy od:

- składu zasad i struktury drugorzędowej;

- środowiska - absorbancja izolowanych zasad jest większa niż absorbancja RNA i jednoniciowego DNA, która z kolei jest większa niż dwuniciowego DNA, który jest hipochroniczny (mniej barwny) w porównaniu z jednoniciowym DNA.

Rys. 1.9. Widma absorpcyjne zasad pirymidynowych DNA

1.5. Replikacja DNA

Replikacja DNA jest procesem podwojenia materiału genetycznego. DNA jest jedyną makrocząsteczką, występującą wewnątrz organizmów, która może się replikować (kopiować), czyli powielać samą siebie [1.83-1.86]. Replikacja jest podstawą dziedziczenia, przekazywania cech potomstwu oraz podstawą rozwoju i wzrostu organizmów.

Replikacja (kopiowanie) DNA jest procesem złożonym, który dzieli się na fazy:

- inicjacji,

- elongacji (wydłużania),

- terminacji.

W trakcie replikacji następuje synteza nowej nici DNA na podstawie starej (matrycowej) nici DNA. Dzieje się to tuż przed podziałem komórki przez mitozę (podział jądra). Oznacza to, że dwie nowe komórki, które powstają w wyniku podziału, otrzymują kopie identycznego zestawu genów starej matrycy DNA.

Replikacja następuje w wyniku rozdzielenia się dwóch nici podwójnej helisy (rys. 1.10) [1.83-1.86]. Powstałe jednołańcuchowe fragmenty są dokładnymi kopiami cząsteczki macierzystej DNA. Stara nić macierzysta (matrycowa) DNA i nowe nici potomne DNA nie skręcają się ze sobą. Zapobiega temu enzym opoizomeraza. Proces rozdzielania i powielania się jest kontynuowany przez całą długość łańcucha DNA, aż powstaną dwie nowe nici podwójnej helisy (rys. 1.20).

Proces replikacji (rys. 1.11) przebiega według następującej kolejności:

- przyłączenie tzw. startera do miejsca rozpoczęcia replikacji na łańcuchu DNA; starter składa się zazwyczaj z 8 nukleotydów kwasu nukleinowego RNA, komplementarnych z matrycą DNA, syntezowanych przez enzym prymazę; przyłączenie startera jest warunkiem do rozpoczęcia replikacji;

- rozcięcie i rozplecenie podwójnej helisy DNA pod wpływem enzymu helikazy (enzymu restrykcyjnego), który tnie wiązania wodorowe między nićmi DNA na dwa pojedyncze łańcuchy;

- rozpoznanie określonych sekwencji nukleotydów przez enzym polimerazę DNA, tak zwanych miejsc inicjacji replikacji (ok. 200-300 par nukleotydów) na nici DNA; brak jonów metalu (M2+) uniemożliwia elongację DNA; jony magnezu lub manganu są niezbędne do działania polimeraz DNA; jon metalu (M2+) współdziała z wolną grupą -OH na końcu C-3' startera;

- do każdej z pojedynczych nici DNA zostaje dobudowana nowa nić DNA przy zachowaniu zasady komplementarności zasad;

- tworzenie wiązania fosfodiestrowego determinuje enzym polimerazę DNA do dobudowywania kolejnych nukleotydów wyłącznie w kierunku C-5' ?C-3', co powoduje, że jedna z nici (nić wiodąca) jest kopiowana w sposób ciągły, a druga (nić opóźniona) kopiowana jest w krótkich odcinkach 1000-2000 nukleotydów DNA, zwanych fragmentami Okazaki;

- do pojedynczych rozplecionych łańcuchów przyłączają się białka, tzw. SSB białka, które stabilizują jednoniciowe fragmenty DNA;

- enzymy topoizomerazy wprowadzają lub usuwają superskręty z DNA;

- enzym ligaza DNA (grupa syntetazy) katalizuje syntezę wiązań fosfodiestrowych w szkielecie nowo zsyntezowanej nici DNA, zużywając do tego energię pochodzącą z hydrolizy ATP (patrz podrozdz. 2.13.1).

Rys. 1.10. Schemat replikacji DNA

Proces replikacji u organizmów eukariotycznych zachodzi równocześnie w kilku miejscach z szybkością ok. 50 nukleotydów na sekundę. W przypadku bakterii replikacja rozpoczyna się tylko w jednym, ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko - ok. 1000 nukleotydów na sekundę.

Rys. 1.11. Schemat replikacji DNA

Replikacja jest procesem endoergicznym, wymagającym dopływu energii niezbędnej do wytworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą kwasu fosforowego a grupą (-OH) cukru deoksyrybozy.

Zastosowanie izotopu 15N pozwoliło eksperymentalnie udowodnić mechanizm replikacji DNA. Powtarzalność replikacji jest bardzo duża. Błędnie wstawiony nukleotyd pojawia się w nowej nici średnio raz na miliard nukleotydów.

Pozakomórkowa replikacja DNA (łańcuchowa reakcja polimerazy) (Polymeraze Chain Reaction - PCR) to metoda powielania określonych fragmentów DNA przez jego syntezę na jednołańcuchowych fragmentach rozwiniętej helisy DNA.

Reakcja PCR pozwala powielić określony, unikalny fragment genomu pod warunkiem znajomości jego sekwencji.

Składniki niezbędne do przebiegu PCR [1.78]:

- DNA, które jest matrycą do replikacji, wyizolowaną z organizmu (10-100 ng);

- startery: krótkie jednoniciowe fragmenty DNA (10-25 bp), które inicjują reakcję; startery projektuje się na podstawie sekwencji, która będzie amplifikowana, powinny zawierać > 50% zasad z GC; stężenie starterów wynosi 0,3-1 ?M;

- nukleotydy: ATP, GTP, CTP, TTP (stężenie każdego 200 ?M), które stanowią budulec dla nowo powstałego łańcucha DNA;

- enzym polimeraza DNA-Taq: 0,75-1 U TAQ (Thermus aquaticus) lub Tfl (Thermus flavus) - termostabilna polimeraza DNA prowadząca replikację;

- bufor polimerazy: 20 mM siarczanu(VI) amonu (NH4)2SO4 i 5 mM kwasu solnego HCl, dostarczany z polimerazą jako roztwór 10- lub 20-krotnie stężony;

- kofaktor polimerazy: 1,5-2,0 mM chlorku magnezu (MgCl2);

- objętość: 10-50 ?l, uzupełnia się wodą do ostatecznej objętości.

Metoda ta polega na powtarzaniu cykli ogrzewania i oziębiania mieszaniny reakcyjnej w celu manipulowania procesami zależnymi od temperatury:

- denaturacja w temp. 94°C (30-60 s);

- przyłączenie starterów 30-70°C (w zależności od temperatury topnienia starterów) (30-60 s);

- elongacja i replikacja prowadzona przez enzym polimeraza DNA temp. 72°C (60-150 s w zależności od metody);

- końcowe wydłużanie, powalające dosyntezować końcowe fragmenty DNA, 72°C przez 5-10 min;

- pozostawienie próby po syntezie w temp. 4°C.

Obecnie do tego celu stosuje się komercyjne aparaty termocyklery.

Liczba kopii danej sekwencji DNA w reakcji PCR rośnie wykładniczo według wzoru 2n, gdzie n jest liczbą cykli (tabela 1.2).

Tabela 1.2. Liczba kopii danej sekwencji DNA

Cykl

Liczba kopii

1

2

2

4

3

8

10

1024

20

1048 576

30

1 073 741824

Otrzymaną próbkę z pozakomórkowej replikacji DNA rozdziela się za pomocą chromatografii żelowej na żelu agarowym (patrz tom II, podrozdz. 2.1.9) i bada za pomocą metod spektrofotometrycznych (patrz tom II, podrozdz. 4.6.4).

Wyniki dokumentuje się przez fotografowanie próbki lub na komputerze.

Jest to metoda bardzo czuła i wydajna, a dzięki swojej prostocie uważana obecnie za najważniejsze narzędzie biologii molekularnej.

U każdego człowieka 3% DNA jest identyczne. Pozostałe 97% DNA zawiera fragmenty, które bardzo się różnią u poszczególnych osobników. Zawierają one sekwencje kodu genetycznego powtarzające się od 5 do 1000 razy. Liczba powtórzeń sekwencji, a tym samym długość każdego z tych fragmentów, są różne u różnych osób. Metodą fragmentacji DNA danej osoby można wybrać odcinki z powtarzającymi się sekwencjami i rozdzielić je ze względu na wielkość. Specjalna fotografia, która wygląda jak kod kreskowy, stanowi genetyczny odcisk palca, unikatowy dla danej osoby.

Metoda pozakomórkowej replikacji DNA znalazła zastosowanie [1.861.89] w:

- diagnostyce medycznej;

- kryminalistyce (identyfikacja osób na podstawie śladów krwi, śliny, pojedynczych włosów, spermy w przypadku gwałtu) [1.90];

- ustalaniu ojcostwa w sprawach prawnych;

- w diagnostyce chorób dziedzicznych spowodowanych przez mutacje (łac. mutatio - zmiana) wynikające z przypadkowych zmian w strukturze DNA, spowodowanych (indukowanych) przez czynniki mutagenne (mutageny) [1.91]:

- fizyczne, np. temperatura inaktywująca działanie enzymów,

- chemiczne, np. dym papierosowy, wyziewy z samochodów (benzopiren),

- lekarstwa, np. cytostatyki stosowane w chemioterapii,

- promieniowanie słoneczne (aktywujące rozwój nowotworu czerniaka),

- promieniowanie jonizujące, które przyczynia się do rozrywania cząsteczek DNA,

- promieniowanie rentgenowskie stosowane przy naświetlaniach,

- wirusy (np. różyczki),

- błędy w trakcie replikacji DNA niebędące wynikiem rekombinacji, np. wadliwy gen w chromosomie 7, który wywołuje dziedziczną chorobę mukowiscydozę.

Pozakomórkowa replikacja DNA znalazła również zastosowanie do:

- wykrywania raka i monitorowania przebiegu chemioterapii nowotworów (m.in. białaczki) [1.87];

- terapii genowej polegającej na oznaczaniu wadliwego genu;

- wykrywania bakterii i wirusów (HIV czy Ebola);

- oznaczania genów ze szczątków ludzkich;

- oznaczania genów w wykopaliskach archeologicznych (mumiach);

- oznaczania genów w znaleziskach geologicznych skamieniałych zwierząt, np. w resztkach mamutów lub dinozaurów, a także owadów w bursztynie).

1.6. Przekazywanie informacji genetycznej

Całość informacji zawartej w materiale genetycznym komórki lub organizmu nazywana jest informacją genetyczną [1.92-1.98]. Informacja genetyczna zapisana jest w każdej komórce organizmu za pomocą kodu genetycznego. Kod genetyczny określa sposób, w jaki sekwencja zasad kwasu nukleinowego DNA lub RNA zostaje przekształcona w sekwencję aminokwasów podczas biosyntezy białek (patrz rozdz. 2). Obecnie wiadomo, że kod genetyczny jest trójkowy, tzn. informacje o aminokwasie niesie konkretny układ trzech nukleotydów.

Kodon to sekwencja trzech nukleotydów (triplet) występujących w mRNA, kodująca określony aminokwas podczas syntezy białka. Istnieją 64 kodony, z czego 61 określa 20 podstawowych aminokwasów białkowych, a 3 pozostałe (UAA, UAG, UGA) odpowiadają za zakończenie translacji (kodony nonsensowne, kodony stop). Ponadto jeden z kodonów (AUG) (kodon inicjujący, kodon startowy) koduje aminokwas metioninę (patrz rozdz. 2, tabela 2.1), która określa miejsce rozpoczęcia procesu translacji (procesu syntezy białka na podstawie mRNA) (patrz podrozdz. 1.7).

metionina

Kodon metioniny jest pierwszym kodonem inicjującym odczytywanym przez rybosom.

Funkcje nośnika informacji genetycznej u większości organizmów pełni DNA. U niektórych wirusów roślinnych, jak wirusa mozaiki tytoniu i zarazy ziemniaczanej, informacja genetyczna zapisana jest w RNA.

Sekwencja kodonów tworzy gen (gr. genos - ród, pochodzenie). Gen [1.92-1.98] jest podstawową jednostką dziedziczności, która określa powstawanie kwasów nukleinowych mRNA, tRNA i rRNA i pośrednio koduje budowę białek w kolejności ułożenia aminokwasów. Informacje zakodowane w genach są niezbędne do powstawania i funkcjonowania komórek. Geny determinują wszystkie funkcje życiowe organizmu (między innymi metabolizm, rozmnażanie) i odpowiadają za jego strukturę.

Wielkość genów jest bardzo różna w granicach od 100 do kilku milionów par zasad. Całą informację genetyczną organizmu nazywa się genomem. Na genom składa się informacja genetyczna zawarta w [1.99, 1.100]:

- DNA jądrowym;

- DNA mitochondrialnym (genom mitochondrialny);

- u roślin w plastydach, między innymi w DNA chloroplastowym (genom chloroplastowy).

Genom (jądrowy) u eukariotów złożony jest z liniowych cząsteczek DNA, które są upakowane w chromosomach. Genomy u prokariotów mają formę kolistych cząsteczek DNA (zwanych plazmidami).

Genomy są zdolne do przemieszczania się w obrębie genomu, tzw. elementy transpozycyjne (transpozony). Charakterystyczną cechą genomów prokariotycznych jest obecność operonów (rodzin wielożennych), czyli genów zorganizowanych w zespoły genów. Większość genomów prokariotycznych zawiera kilkaset tysięcy par zasad (a czasem nawet więcej).

Dokładną analizą struktury i funkcji genomu zajmuje się genomika. Wpływem otoczenia na ekspresje genów zajmuje się epigenetyka. Proces ekspresji genów zachodzi na każdym etapie ludzkiego życia, bez względu na wiek.

Informację genetyczną właściwą dla jakiegoś konkretnego, indywidualnego organizmu określa się jako jego genotyp. Organizmy dzielą się na:

- eukariotyczne - organizmy jedno- lub wielokomórkowe zbudowane z komórek mających jądro komórkowe otoczone błoną komórkową; mRNA jest zwykle poddawany splicingowi (wycinaniu intronów); informacja genetyczna znajduje się w jądrze komórkowym w postaci mRNA;

- prokariotyczne - organizmy, których komórki nie mają jądra; procesy transkrypcji i translacji zachodzą w cytoplazmie komórki; informacja genetyczna mRNA znajduje się na obszarze cytoplazmy; u organizmów tych nie występuje proces splicingu, tak że mRNA są bezpośrednio przekazywane do cytoplazmy.

Przed podziałem komórki DNA może się podzielić, dzięki czemu komórki potomne dysponują tą samą informacją genetyczną co komórka macierzysta. Cały materiał genetyczny skupiony w jądrze komórki zawiera informacje dotyczące wszystkich białek budujących organizm. Życie danego organizmu zależy od prawidłowej budowy białek i ich fizjologicznego funkcjonowania. Ciało człowieka jest zbudowane z ok. 600 mld odmiennych komórek, a w każdej z nich sekwencja DNA jest identyczna. Róznice między typami komórek są wynikiem różnic we wzorze ekspresji ich genów. Niekiedy tylko dwie lub trzy makrocząsteczki DNA znajdują się w jądrze komórkowym. W komórkach niektórych bakterii może występować tylko jedna makrocząsteczka DNA o masie molowej 109 g - mol-1. Wewnątrz jądra każdej komórki 46 chromosomów zawiera łącznie DNA o długości 2 m.

Tylko ok. 1,5% genomu człowieka koduje sekwencje aminokwasów (niesie informacje o budowie białek). Po hipotetycznym całkowitym "rozpakowaniu" i połączeniu cząsteczek DNA w jedną nić, ludzkie DNA w przeciętnej komórce somatycznej (wszystkie komórki organizmu z wyjątkiem komórek płciowych) miałoby 2-2,4 m. Wynika to z rachunku: odległość między parami zasad w jądrze komórki diploidalnej (mającej podwójny zestaw chromosomów) wynosi w przybliżeniu średnio 0,34 nm (0,34 - 10-9 m), liczba par zasad w jądrze komórki diploidalnej wynosi w przybliżeniu 6-7 mld par zasad). Jest to podwojona liczba par zasad komórki haploidalnej (mającej pojedynczy zestaw chromosomów) wynosząca 3 - 109-3,5 - 109 par zasad). Przemnożenie tych dwóch wartości daje wynik ok. 2 m (fot. 1.1). Najdłuższa rzeczywista cząsteczka DNA (chromosom I) zawiera 2,49 - 108 par zasad, ma długość ok. 8 cm.

W latach 60. XX w. stwierdzono istnienie genomów mitochondrialnych i chloroplastowych. Genomy mitochondrialne mają prawie wszystkie organizmy eukariotyczne, a genomy chloroplastowe wszystkie eukarionty fotosyntezujące. Przeważnie są cząsteczkami DNA kolistymi.

Rys. 1.13. Mutacje genowe są wynikiem powstania defektów w materiale genetycznym DNA. Defekty te są wynikiem zmian w sekwencji zasad w kwasie DNA (A - adenina T - tymina, G - guanina, C - cytozyna)

W ludzkich komórkach znajduje się DNA mitochondrialne, mieszczące się w mitochondriach (gr. mitos - nić, chondrion - ziarno), które są specyficznymi tworami komórkowymi (organellami) [1.46, 1.47, 1.99, 1.100]. Pojedyncze mitochondrium zawiera 4-10 kolistych cząsteczek DNA o długości 16 569 par zasad, z których każda koduje 37 genów, 13 z nich to geny kodujące białko, 22 kodują transferowe RNA, a dwie ostatnie rybosomowe RNA.

Przekazywanie informacji genetycznej zawartej w sekwencji zasad DNA odbywa się w trakcie złożonego procesu (ekspresji), przebiegającego z udziałem wielu specyficznych enzymów, w którym można wyróżnić dwa podstawowe etapy:

- transkrypcję - przepisanie informacji genetycznej zawartej w DNA na mRNA;

- translację - syntezę białek).

Przepływ informacji odbywa się tylko w jednym kierunku, od DNA do białka (rys. 1.14):

Rys. 1.14. Przepływ informacji

Podczas ekspresji (przekazywania) genów:

- informacja zawarta w DNA na drodze transkrypcji zostaje z DNA przekazana na RNA, gdzie sekwencja zasad jest komplementarna do sekwencji zasad w matrycy DNA;

- RNA kieruje następnie syntezą białka, którego sekwencja aminokwasów jest określona przez sekwencję zasad w RNA.

Ekspresja genów jest regulowana przez odcinek sekwencji DNA, zwany promotorem, znajdujący się przed sekwencją kodującą (rys. 1.15):

Rys. 1.15. Układ sekwencji DNA

Kodująca sekwencja genu jest rozszczepiona na szereg segmentów zwanych egzonami, które są porozdzielane sekwencjami niekodującymi, tzw. intronami.

Egzony są to przerywające sekwencje kodujące aminokwasy. Introny to sekwencje DNA w obrębie genu niezawierające użytecznej informacji genetycznej.

Liczba i wielkość intronów jest różna i wynosi w różnych genach od 0 do ponad 50. Ich długość może być różna. Zwykle niekodujące introny są dłuższe od kodujących egzonów.

Aby móc wykorzystać informację genetyczną zawartą w genach, introny muszą być usunięte z transkryptu, a egzony połączone w ciągłą cząsteczkę RNA, co odbywa się w procesie nazwanym splicingiem.

Komórki organizmów mogą zawierać:

- pojedynczy kompletny zestaw informacji genetycznej (haploid);

- podwójny zestaw informacji genetycznej (diploid);

- więcej niż dwa zestawy (poliploid).

Wpływem otoczenia na ekspresję genów zajmuje się epigenetyka. Proces ekspresji genów zachodzi na każdym etapie ludzkiego życia, bez względu na wiek.

1.7. Transkrypcja i translacja tRNA

Biosynteza białka jest procesem zachodzącym we wszystkich żywych komórkach. Właściwości i funkcje białek są determinowane przez liniową kolejność aminokwasów w łańcuchach. Każde białko ma unikatową dla siebie sekwencję aminokwasów. O sekwencji tej decyduje informacja genetyczna zawarta w kwasie deoksyrybonukleinowym (DNA). Kwas DNA nie bierze jednak bezpośredniego udziału w procesie biosyntezy.

Na biosyntezę białek składają się dwa procesy [1.106-1.108] - transkrypcja i translacja.

Transkrypcja polega na przepisaniu informacji zapisanej w sekwencji pojedynczej nici DNA na cząsteczki tRNA (patrz rozdz. 1.6). Synteza tRNA odbywa się na jednej z dwóch nici DNA noszącej nazwę nici kodującej (druga to nić matrycowa) [1.109]. Polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż nici kodującej, powodując ich rozsuwanie. Następnie z jednej nici DNA zostaje przepisana informacja na zasadzie komplementarności na matrycę tRNA (nukleotydy uracylu w mRNA zajmują miejsce tyminy w DNA). Sygnałem do terminacji jest specyficzna sekwencja zasad (udział UUA, UAG, UGA - kodony terminacyjne).

Transkrypcji podlega odcinek DNA od promotora do terminatora. Matryca jest odczytywana w kierunku 3' ? 5', a nowa cząsteczka mRNA powstaje w kierunku 5' ? 3'. Proces ten odbywa się w obrębie jądra komórkowego. Aby proces transkrypcji mógł się rozpocząć, enzym polimeraza RNA musi przyłączyć się do odpowiedniego miejsca na DNA zwanego promotorem (zawiera 3 zasady, tzw. kodon startowy AUG.) (patrz rys. 1.11. podrozdz. 1.5).

Z 64 istniejących kodonów tylko 3 z nich: UUA, UAG, UGA nie oznaczają żadnego aminokwasu (są to tzw. kodony terminacyjne). Kodon AUG (oznaczający metioninę) rozpoczyna syntezę białka (a w niektórych przypadkach kodon GUG) po przyłączeniu do rybosomu.

Translacja (tRNA) polega na przekazaniu informacji o DNA do rybosomów w komórkach (patrz podrozdz. 1.6) [1.108]. Synteza białek jest przeprowadzana przez rybosomy, które syntezują łańcuch peptydowy z kolejnych aminokwasów dostarczanych przez cząsteczki nukleotydów tRNA (transportujący RNA).

Translacja jest procesem odpowiedzialnym w komórce za syntezę białek. W czasie translacji informacja zakodowana w mRNA zostaje wykorzystana do ustalenia kolejności aminokwasów w białku.

Reakcje wiązania aminokwasów zakodowanych w mRNA katalizują odpowiednie enzymy nazywane syntetazami aminoacylo-tRNA, a energia niezbędna do tego pochodzi z hydrolizy trifosforanu adenozyny (ATP) (patrz podrozdz. 2.13.1).

A zatem, do przebiegu translacji potrzebne są następujące elementy [1.103]:

- mRNA (matrycowy RNA) stanowi matryce do syntezy białek (translacji). Kolejność aminokwasów zapisana jest w sekwencji nukleotydów mRNA za pomocą kodu genetycznego; każdy aminokwas kodowany jest przez trójkę nukleotydów zwaną kodonem (patrz podrozdz. 1.6); w czasie translacji informacja zakodowana w mRNA zostaje wykorzystana do ustalenia kolejności aminokwasów w białku;

- tRNA (transportujący RNA) przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów. W wyniku translacji są dołączone cząsteczki aminokwasów zakodowanych przez DNA (rys. 1.16) [1.24]; aminokwasy, zostają połączone z tRNA za pomocą wiązań kowalencyjnych; w komórkach znajduje się zazwyczaj od 31 do 40 rodzajów tRNA, z których każdy jest odpowiedzialny za wiązanie jednego z 20 aminokwasów (rys. 1.16);

- Adenozyno-5'-trifosforan (patrz rozdz. 2.13) ATP, dostarczający energii - aby rozpoczął się proces translacji musi zostać uaktywniony tRNA z aminokwasem, za pomocą ATP; reakcja wytworzenia wiązania peptydowego jest reakcją endoergiczną.

Aminokwasy dołączone kowalencyjnie do tRNA rozpoznają kodony mRNA, umożliwiając włączenie ich we właściwej pozycji peptydu, wyznaczonej przez sekwencje mRNA.

W końcowym procesie terminacji odbywa się uwolnienie nowego zsyntezowanego łańcucha peptydowego (białka) do cytoplazmy. W zakończeniu biorą udział kodony (UUA, UAG lub UGA).

Po zakończeniu syntezy białko odłącza się od rybosomu. Nowo zsyntezowana cząsteczka białka podlega obróbce, polegającej m.in. na fałdowaniu białka w prawidłową strukturę trzeciorzędową (patrz podrozdz. 2.3.5), ewentualnych zmianach chemicznych i strukturalnych cząsteczki. Białko uzyskuje swą aktywność fizjologiczną.

Rys. 1.16. Rola tRNA w procesie translacji

Transferowe tRNA rozpoznające ten sam aminokwas mRNA nazywa się izoakceptorami. Przyłączenie aminokwasu do tRNA nazywa się aminoacylacją.

Enzymy, które równocześnie katalizują transkrypcję to:

- polimeraza RNA I - odpowiada m.in. za syntezę rybosomalnego RNA, czyli rRNA;

- polimeraza RNA II - transkrybuje geny kodujące białka;

- polimeraza RNA III - odpowiada za transkrypcję krótkich genów kodujących małe cząsteczki RNA, jak np. transportujący (transferowy) RNA, czyli tRNA.

Powstający pierwotnie transkrypt, nazywany tu heterogennym jądrowym RNA, czyli hnRNA zawiera zarówno sekwencje kodujące, czyli egzony, jak i sekwencje niekodujące - introny. Musi on zatem przejść tzw. obróbkę posttranskrypcyjną, czyli splicing polegający na wycinaniu intronów mRNA, przechodzi także inne modyfikacje, które przygotowują go do translacji.

Intensywność biosyntezy białek charakteryzuje średnia szybkość syntezy łańcuchów polipeptydowych, wynosząca reszt aminokwasowych w ciągu jednej sekundy.

1.8. Projekt poznania genomu ludzkiego

Genom jest to suma wszystkich genów oraz całość informacji genetycznej organizmu [1.110-1.112]. W obrębie genomu występują sekwencje zdolne do przemieszczania się w obrębie genomu, tzw. transpozony (transposable elements). Około 50% genomu człowieka zawdzięcza swoje pochodzenie transpozonom.

Celem Projektu Poznania Genomu Ludzkiego było przede wszystkim odkrycie dokładnej kolejności zasad A, C, G i T tworzących genom w cząsteczkach DNA, a następnie stworzenie mapy genów, czyli ustalenie dokładnych miejsc położenia genów.

Genom ludzki to całe DNA z kompletem chromosomów od 1 do 22 i dwoma chromosomami płciowymi X i Y, czyli razem 24. Genom jednej ludzkiej komórki ma długość jednego metra i tworzą go miliardy zasad. Projekt Poznania Genomu Ludzkiego (Human Genom Project) zaczął się w 1990 r. i brało w nim udział 16 laboratoriów z sześciu państw (USA, Wielkiej Brytanii, Niemiec, Francji, Chin i Japonii).

Na pierwszym etapie wykonano mapy chromosomów, aby precyzyjnie określić położenie pewnych genów. Mapy te pomogły dopasować kod (sekwencje zasad) do określonego genu. Aby opracować precyzyjną sekwencję zasad, koniecznym było pocięcie DNA na krótsze fragmenty o różnej długości (metodą shotgun sequencing, opracowaną przez firmę Celera Genomics, USA). Następnie fragmenty te były sekwencjonowane automatycznie i kolejność zasad odczytywana przez potężne komputery z szybkością 1000 pz w ciągu jednej sekundy (bioinformatyka).

Prace nad genomem ukończono w 2003 r. Okazało się, że genom zawiera 3,2 mld pz (Mpz)! oraz 30-40 tys. genów białkowych, które kodują białka (określają proteom). Analiza ludzkiego genomu dostarcza informacji jedynie o rodzaju kodowanych białek. Wciąż nieznane są wszystkie modyfikacje, jakim one ulegają, ich funkcje oraz oddziaływania między nimi i w konsekwencji mechanizmy działania komórek, tkanek, organów, układów i całego organizmu człowieka. W związku z tym w 2010 r. Wellcome Trust w Wielkiej Brytanii (organizacja wspierająca badania naukowe dotyczące zdrowia człowieka) zainicjował projekt (UK10K) sekwencjonowania 10 000 ludzkich genomów, rzadkich wariantów genetycznych, w przeciągu kolejnych 3 lat.

Geny stanowią tylko 3% DNA. Najdłuższy gen u człowieka 2,4 - 106 pz. Dla ciekawości muszka owocowa (drosophilae) posiada 13 tys. genów, a robak obły (vermes) 19 000 genów. Nukleotydy mogą występować także w komórce w postaci pojedynczych cząsteczek jako trifosforany nukleozydów pełniących ważną rolę jako przenośniki energii wykorzystywanej do reakcji enzymatycznych (patrz podrozdz. 2.12). Pozostałe 97% DNA (zwane junk DNA, selfish DNA) nie koduje białek ani nie kontroluje innych genów [1.110]. Stanowi zapis tego, co się działo w ewolucji człowieka. Materiał genetyczny jest dziedziczny. Między genomami ludzi z Euroazji, Azji, Afryki i Ameryki nie ma żadnej różnicy, mają oni 99,99% wspólnych genów. Poznanie genomu ludzkiego przyczyniło się do gwałtownego rozwoju badań nukleotydów budujących DNA większości mikroorganizmów, a w szczególności tych chorobotwórczych.

1.9. Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna to zbiór różnego rodzaju technik, mających na celu trwałą zmianę właściwości dziedzicznych organizmu [1.111-1.118]. Polega ona na tworzeniu nowych organizmów roślinnych i zwierzęcych przez modyfikację lub wprowadzenie zmian do sekwencji DNA. Wszystkie zmiany dokonywane na materiale genetycznym rozpoczynają się od izolacji określonego fragmentu DNA, a następnie jego sekwencjonowaniu. Celem sekwencjonowania DNA jest ustalenie rodzaju i kolejności nukleotydów składających się na zapis informacji genetycznej w badanej cząsteczce DNA.

Najczęściej wprowadza się do organizmu nowy gen, pochodzący od innego, spokrewnionego daleko lub w ogóle niespokrewnionego gatunku. Nowe geny wprowadzane są do komórek przy użyciu wirusów lub bakterii (w taki sposób geny meduzy odpowiedzialne za świecenie wprowadzono do zarodków myszy).

Inną stosowaną metodą jest transformacja z użyciem wektora molekularnego, to jest krótkiego fragmentu DNA zdolnego do replikacji i integracji z obcym genomem. Jest on wykorzystywany do wprowadzania obcego DNA (konkretnego genu) do komórki docelowej biorcy.

Wektorami molekularnymi mogą być:

- plazmidy - liniowe lub koliste cząsteczki DNA zdolne do samodzielnej replikacji;

- transpozony - ruchome elementy genomu zdolne do przemieszczania się w obrębie jednej cząsteczki lub między różnymi cząstkami DNA;

- pochodne wirusów, z których usunięto czynnik chorobotwórczy, stosowane u zwierząt.

Zastosowanie inżynierii genetycznej umożliwia:

- modyfikację genów w określony sposób, dający możliwości syntezy nowych białek niewystępujących w przyrodzie;

- pozyskanie użytecznych mikroorganizmów, np. plazmidów, wykorzystywanych jako wektory do klonowania DNA (patrz podrozdz. 1.10);

- hodowanie nowych bakterii, grzybów zdolnych do:

- produkcji lekarstw (np. insuliny),

- likwidacji wycieków ropy z tankowców,

- produkcji nowych rodzajów polimerów i biopolimerów (patrz podrozdz. 7.5);

- uzyskanie nowych odmian roślin i zwierząt, w tym okazów transgenicznych w celu zwiększenia ich wydajności i oporności na szkodniki i choroby:

- rośliny otrzymują gen do wytwarzania specyficznej trucizny (Bacillus thuringiensis) wewnątrz ich organizmów, która wybiórczo zabija gąsienice ciem i motyli; stosowanie ich w praktyce ma negatywny wpływ na przyrodę, bowiem oprysk ma większy wpływ na świat dzikiej przyrody niż na uprawy, szczególnie na gatunki żywiące się chwastami, a nie roślinami uprawnymi,

- produkcja roślin odpornych na herbicydy,

- zmieniona genetycznie kukurydza produkuje kwas cytrynowy w korzeniach, który wiąże glin trujący dla korzeni; jednocześnie są uwalniane fosforany w glebie i wykorzystywane przez rośliny jako nawóz,

- zmieniając genom roślinny, otrzymuje się transgeniczne rośliny uprawne, odporne na wirusy, herbicydy i skrajne warunki klimatyczne (gen ryby arktycznej zabezpieczający jej krew przed zamarzaniem, wprowadzony do truskawek czyni je odporne na mróz); pierwsza transgeniczną rośliną, uzyskaną w 1984 r., był tytoń;

- wykorzystanie sztucznej rekombinacji DNA w celu pozyskania lekarstw, takich jak:

- hormon wzrostu u ludzi,

- białkowy czynnik krzepnięcia krwi; białko transgeniczne może być silnym alergenem;

- amplifikacje genów, dostarczających materiału biologicznego umożliwiającego sekwencjonowanie DNA pochodzenia roślinnego i zwierzęcego do:

- klonowania zagrożonych wyginięciem gatunków zwierząt,

- pozyskania transgenicznych roślin uprawnych,

- zmieniając genom u zwierząt wytwarza się transgeniczne odmiany zwierząt (jak np. u owcy, której mleko zawiera ludzki czynnik krzepnięcia krwi);

- hodowla organizmów transgenicznych jako dawców organów dla ludzi;

- przeprowadzanie doświadczeń nad zapłodnieniem in vitro (to jest poza organizmem) u szeregu roślin i zwierząt.

Największe kontrawersje badań i stosowania inżynierii genetycznej od strony etycznej, moralnej, religijnej i społecznej dotyczą:

- ingerencji w ludzki materiał genetyczny;

- przeszczepiania organów zwierzęcych do organizmu ludzkiego;

- klonowania człowieka.

1.10. Klonowanie DNA

Duże genomy ssaków, zawierają około 20 tys. genów. W DNA wyizolowanym z ludzkich komórek sekwencje poszczególnych genów występują w bardzo małych ilościach. Klonowanie DNA jest metodą namnażania uprzednio wyizolowanych fragmentów kwasów nukleinowych DNA [1.119-1.123]. Polega na wprowadzaniu tych fragmentów za pomocą odpowiednio przygotowanych wektorów (plazmidów) do komórki, a następnie ich ponownej izolacji po namnożeniu. Klonowanie DNA pozwala na uzyskanie wielu identycznych kopii fragmentu DNA, na przykład docelowego genu.

Proces klonowania zwierząt polega na (rys. 1.17):

- usunięciu z bakterii E. coli jądra komórkowego, tym samym informacji genetycznej w nim zawartej; przygotowane do tego zabiegu bakterie poddaje się szokowi cieplnemu w wysokiej temperaturze, co podnosi prawdopodobieństwo, że przyjmą docelowy gen;

- wklejeniu docelowego genu kodującego białka w kolistą cząsteczkę DNA zwaną plazmidem - w typowym klonowaniu (rys. 1.17).

Plazmid poddaje się działaniu bakteryjnych enzymów restrykcyjnych (endonukleazy restrykcyjnej), w wyniku czego następuje rozcięcie kulistego plazmidu w liniową formę z lepkimi końcami. Wklejenie do niego docelowego genu polega na:

- rozcięciu (hydrolizacji) nici DNA docelowego genu, na krótkie fragmenty z lepkimi końcami przy użyciu enzymów restrykcyjnych;

- po zmieszaniu rozciętego plazmidu z rozciętymi nićmi DNA, ich cząsteczki łączą się poprzez lepkie końce, a kowalencyjne ich związanie następuje po dodaniu enzymu ligazy, w wyniku czego powstają zrekombinowane koliste plazmidy, o rozmiarach ok. 3 kpz.

Rys. 1.17. Wklejanie genu w plazmid

- w miejsce usuniętego jądra komórkowego, plazmoid, zawierający wklejone fragmenty nici docelowego genu, jest wprowadzany do wnętrza bakterii w procesie zwanym transformacją za pomocą metody zwanej mikroiniekcją (mikrozastrzykiem);

- bakterie, które pobrały plazmid, poddaje się rozmnażaniu na szalce z agarem, otrzymując wiele kopii zawartego w nich materiału genetycznego; bakterie bez plazmidu giną;

- gdy bakterie wyprodukują odpowiednią ilość białka, rozcina się je i uwalnia zawiesinę z ich wnętrza do dalszych badań w zakresie:

- bioinformacji,

- terapii genowej,

- analizy genowej.

Klonowane geny wprowadza się do komórek zwierząt i roślin w procesie zwanym transfekcją, który przeprowadza się na drodze:

- mikroiniekcji, w której klonowany gen jest bezpośrednio wstrzykiwany do jądra komórki (wymaga to użycia specjalnej aparatury);

- związania DNA z fosforanem wapnia i DEAE-dekstranem:

- DNA reaguje z chlorkiem wapnia w obecności fosforanu; powstały osad dodany do tkanek komórek zwierzęcych łatwo przedostaje się do wnętrza przez błony komórkowe,

- DEAE-dekstran jest polimerem kationowym, który wiąże się z ujemnie naładowanymi cząsteczkami DNA, ułatwia on przenikanie DNA do wnętrza komórki,

- elektroporacji, polegającej na dodaniu DNA do kultury komórek i poddaniu ich krótkiemu działaniu prądu elektrycznego; powoduje to uszkodzenie ściany komórkowej, umożliwiając wniknięcie DNA do komórki; w procesie tym jednak większość komórek ginie;

- mikroiniekcji DNA z koloidalnymi cząsteczkami złota bezpośrednio do komórek.

Enzym ExoRI, który otrzymuje się z bakterii E. coli, rozcina każdą cząsteczkę DNA zawierającą sekwencję GAATTC na dwa fragmenty z lepkimi końcami. Cięcie dokonywane przez enzym restrykcyjny zwykle nie jest proste.

Pierwszym sklonowanym organizmem zwierzęcym, w 1997 r., była owca Dolly. Pozbawiona jądra komórka jajowa owcy i komórka donorowa DNA były łączone na zasadzie fuzji. Prowadziło to do powstania komórki jajowej zawierającej cytoplazmę pochodzącą od obu komórek. Przeniesienie jądra z komórki dawcy przeprowadzono z użyciem mikroiniekcji.

Klonowanie człowieka jest obecnie zabronione ze względów etycznych, moralnych, religijnych i społecznych [1.124]. Decyzje moralne w genetyce zależą od równowagi między postrzeganymi ich dobrymi i złymi aspektami. We wszystkich moralnych decyzjach związanych z genetyką problem polega na tym, gdzie nakreślić linię interwencji.

Sklonowane zarodki ludzkie mają znaczenie w terapii przy użyciu komórek macierzystych (medycyna regeneracyjna). Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych komórek macierzystych pozwala na wymianę uszkodzonych tkanek, takich jak mięsień sercowy lub tkanka nerwowa (organizmów transgenicznych) [1.125, 1.126].