1Bakteryjny metabolizm w procesie oczyszczania ścieków w warunkach beztlenowych
1.1. Wprowadzenie
Biologiczne procesy oczyszczania ścieków są oparte na naturalnej zdolności procesu samooczyszczania występującego w zbiornikach wodnych, prowadzonego przez mikroorganizmy, w tym głównie przez mikroorganizmy heterotroficzne (bakterie i grzyby). Procesy te różnią się od naturalnych procesów zachodzących w środowiskach wodnych, ze względu na pewne charakterystyczne cechy, takie jak:
- duża zawartość biomasy mikroorganizmów;
- powszechne występowanie organizmów heterotroficznych, tworzących łańcuch pokarmowy spasania;
- wymuszony przepływ ładunku substancji organicznych w systemie jako zanieczyszczeń;
- wzmożone procesy rozkładu i mineralizacji materii organicznej.
Ze względu na te cechy biologiczne procesy oczyszczania ścieków można uznać za ekologiczne ekosystemy prowadzone w ekstremalnych warunkach, w których wszystkie organizmy heterotroficzne mają krótsze cykle życia niż czas wymiany osadów (SRT). Organizmami najbardziej bezpośrednio zaangażowanymi w oczyszczanie ścieków są bakterie heterotroficzne. Dominują one wśród wszystkich innych grup liczebnie i w biomasie oraz wpływają na proces mineralizacji i eliminacji organicznych i nieorganicznych składników odżywczych. We wszystkich systemach oczyszczania ścieków występują także pierwotniaki, takie jak: orzęski, wiciowce i ameby, oraz małe zwierzęta zaliczane do Metazoa. Odżywiają się one organicznymi cząstkami stałymi, głównie bakteriami, przyczyniając się do klarowania wody w procesie oczyszczania ścieków.
Systemy oczyszczania ścieków z zastosowaniem mikroorganizmów należą do największych na świecie procesów biotechnologicznych. W ciągu ostatniego stulecia systemy te przeżywały ciągłe modyfikacje w zakresie projektowania i eksploatacji biologicznych oczyszczalni ścieków w celu poprawy efektywności procesów. W centrum uwagi są konsorcja mikroorganizmów heterotroficznych obecne w ściekach, które część związków organicznych i mineralnych przekształcają w biomasę mikroorganizmów, a część w celu pozyskania energii spalają do ditlenku węgla i wody lub ditlenku węgla i metanu, wykorzystując różne szlaki metaboliczne. Wszystkie modyfikacje systemów oczyszczania ścieków oraz wpływu kluczowych czynników abiotycznych zmierzają do kontroli i sterowania procesami prowadzonymi przez wspólnoty mikroorganizmów. Natomiast badania są ukierunkowane na ilościowe i jakościowe określenie wpływu zmiennych czynników środowiskowych na skład i strukturę wspólnot mikroorganizmów występujących w systemach oczyszczania ścieków. Parametry technologiczne oczyszczania ścieków wpływają na tworzenie się złożonych struktur mikroorganizmów i ich składu gatunkowego. Struktura gatunkowa powstałej biomasy w procesie oczyszczania ścieków określa szlaki metaboliczne, które występują w układzie technologicznym i ostatecznie wpływają na jakość oczyszczanych ścieków. Skład wspólnot mikroorganizmów oraz wydajności procesów biologicznych oczyszczania ścieków zależy od:
- składu chemicznego ścieków;
- kształtu bioreaktora stosowanego do hodowli mikroorganizmów;
- temperatury;
- czasu zatrzymania ścieków (HRT) oczyszczanych w bioreaktorach.
Mikroorganizmy w osadzie czynnym mogą:
(1) mieć substrat w nadmiarze,
(2) mieć substrat w ograniczonych ilościach,
(3) spalać substrat w warunkach tlenowych lub beztlenowych.
W warunkach tlenowych, gdy substrat jest w nadmiarze, bakterie jedną jednostkę węgla organicznego spalają w połowie do ditlenku węgla i wody, w połowie węgiel ten wykorzystują na przyrost biomasy. W warunkach ograniczonego dostępu substratu bakterie spalają w ? substrat do ditlenku węgla i wody, a ? substratu wykorzystują na procesy anaboliczne i przyrost biomasy. W warunkach beztlenowych węgiel zawarty w materii organicznej jest w 95% spalany w procesach katabolicznych, a tylko 5% węgla organicznego jest włączane w procesy anaboliczne i reprodukcję biomasy.
Usuwanie materii organicznej w procesie biologicznego utleniania, na przykład za pomocą osadu czynnego, zależy od aktywności mieszanych populacji mikroorganizmów heterotroficznych, które mogą wykorzystać tlen lub nieorganiczny akceptor elektronów w reakcjach metabolicznych. Zanieczyszczenia, które mają zostać usunięte, muszą zostać pobrane przez mikroorganizmy i włączone do procesów metabolicznych, w postaci monomerów i oligomerów (masy cząsteczkowe < 1000 Da), które mogą być przeniesione przez membrany komórkowe bakterii aktywnym transportem. Bakterie osadu czynnego rozkładają substancje organiczne, takie jak białka, lipidy i węglowodany, na związki pośrednie o małej masie cząsteczkowej za pośrednictwem działania hydrolaz pozakomórkowych. Związki o małej masie cząsteczkowej są z kolei asymilowane przez komórki i wykorzystywane jako źródło energii i węgla. Stopniowa depolimeryzacja (hydroliza) substratów polimerycznych jest najczęściej pierwszym i całkowitym etapem ograniczania szybkości mineralizacji materii organicznej w osadzie czynnym i beztlenowych systemach oczyszczania ścieków przez osady mikroorganizmów beztlenowych. Wszystkie opracowane modele oczyszczania ścieków wykorzystują parametry kinetyczne oparte na początkowej szybkości rozkładu ścieków poprzez hydrolizę prowadzoną przez enzymy pozakomórkowe. Takim przykładem jest szeroko stosowany model osadu czynnego. Kolejne modele oczyszczania ścieków włączały usuwanie fosforu i azotu.
1.2. Ektoenzymy i egzoenzymy zewnątrzkomórkowe
Egzoenzymy, takie jak lipazy, glikozydazy, proteazy, fosfatazy i inne, mogą pochodzić z jednego z trzech kluczowych źródeł, a mianowicie: 1) z dopływających ścieków, 2) z autolizy komórek osadu czynnego i/lub 3) jako enzymy aktywnie wydzielane przez komórki mikroorganizmów (Burgess i Pletschke 2008). Ponadto, egzoenzymy są albo związane z powierzchnią komórki (ektoenzymy), w postaci wolnej (egzoenzymy) w ściekach lub adsorbowane w pozakomórkowych substancjach polimerycznych (EPS) matriks osadu. W beztlenowych osadach ściekowych wyróżniono dwie klasy enzymów pozakomórkowych: wolne od komórki enzymy rozproszone w ściekach oraz enzymy komórkowe związane z powierzchnią komórek mikroorganizmów. Na przykład ?-amylaza związana z komórkami jest odpowiedzialna za hydrolizę osadu. Uważa się, że ilość egzoenzymów rozpuszczonych w ściekach jest nieistotna. Hydrolazy w osadach są głównie związane z komórkami bakteryjnymi lub związane z kłaczkami osadu osadzonymi w matriks EPS. Aktywność proteolityczna w kłaczkach osadu czynnego jest stwierdzana głównie w EPS, natomiast aktywność glikolityczna jest związana z organiczną frakcją koloidalną ścieków. Aktywność enzymów proteaz i fosfataz jest związana głównie z cząstkami organicznej materii osadów.
Aktywność egzoenzymów w warunkach beztlenowych ogranicza się do hydrolaz, głównie lipaz, fosfataz, glikozydaz i proteaz. Stężenie tych hydrolaz oraz ich kontakt z hydrolizowanymi substratami posłużyły do rozwiązań modelowych dotyczących substratów drobnoziarnistych w czasie "trawienia" tlenowego i beztlenowego. Spadek aktywności glikozydaz jest związany z gromadzeniem materiału polisacharydowego w EPS. Dodawanie enzymów do hydrolizowanych substancji w ściekach znacznie poprawia efektywność procesu, głównie lipaz. Jednakże, w ogólnym bilansie ze względu na skład ścieków, bogatych w białka i węglowodany, proteazy i glikozydazy odgrywają zasadniczą rolę w procesie oczyszczania ścieków.
1.3. Fermentacje węglowodanów
Organizmy fermentacyjne są substratowo bardzo wszechstronne i stanowią pierwszą część beztlenowego łańcucha pokarmowego. Polimery, takie jak polisacharydy (celuloza, sacharoza, skrobia, chityna, mannany, ksylany, chitozan, mureina, dekstran, laminaryna), białka, DNA i lipidy są atakowane przez enzymy zewnątrzkomórkowe i rozbijane na mniejsze jednostki, które są pobierane przez liczne mikroorganizmy fermentacyjne. Monomery poddawane fermentacjom obejmują cukry (heksozy, pentozy), poliole, kwasy organiczne, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, aminokwasy, puryny i pirymidyny. Oprócz tych klasycznych substratów, są również fermentowane takie substraty, jak cytrynian, glioksalan, bursztynian, szczawian i malonian. Nawet związki aromatyczne resorcynol i floroglucynol są fermentowane przez pojedyncze szczepy. W ostatnich latach stwierdzono możliwości fermentacji węglowodorów aromatycznych w hodowlach czystych szczepów, ale efektywniej zachodzi ona z zastosowaniem konsorcjów wielu mikroorganizmów. W ściekach pochodzących z bioprzemysłu (szeroko pojęty przemysł spożywczy) znajdują się znaczące ilości węglowodanów, głównie skrobia, sacharoza oraz cukry proste (heksozy i pentozy). Pewne ilości tych węglowodanów znajdują się w ściekach komunalnych.
Pierwszy etap fermentacji glikolitycznych to powstawanie pirogronianu, u większości bakterii przebiega według szlaku EMP (szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa), szlaku HMP (szlak heksozomonofosforanowy), szlaku PP (szlak pentozofosforanowy, szlak Warburga-Dickensa-Horeckera), a niektóre bakterie degradują szlakiem ED (Endnera-Doudoroffa). Kluczowy metabolit, jakim jest kwas pirogronowy, ulega kolejnym przemianom w procesie różnych fermentacji z udziałem różnych bakterii (Rys. 1.1).
Rys. 1.1. Schemat mikrobiologicznej degradacji węglowodanów w warunkach beztlenowych do metanu i ditlenku węgla
Wyróżnia się następujące typy fermentacji glikolitycznych, nazywanych od głównych produktów oraz dwie fermentacje nieglikolityczne:
1) fermentacja alkoholowa, prowadzona przez drożdże Sacharomyces cerevisiae lub bakterie Zymomonas mobilis, przebiega zgodnie ze schematem reakcji:
glukoza ? etanol + CO2
2) fermentacja homomlekowa, prowadzona przez liczne gatunki bakterii z rodzaju Lactobacillus, gdzie kwas pirogronowy zostaje zredukowany do kwasu mlekowego, zgodnie ze schematem reakcji:
glukoza ? 2 cz. mleczanu
3) fermentacja heteromlekowa, prowadzona głównie przez Leuconostoc mesenteroides oraz liczne bakterie z Lactobacillus, gdzie kwas pirogronowy jest fermentowany do kwasu mlekowego, etanolu i CO2, zgodnie ze schemtem reakcji:
glukoza ? mleczan + etanol + CO2
4) fermentacja kwasów mieszanych, prowadzona przez gatunki z rodzaju Salmonella, Escherichia, Citrobacter, Shigella i Proteus
glukoza ? etanol + mleczan + octan + bursztynian + mrówczan + CO2 + H2
5) fermentacja butanodiolowa, prowadzona przez gatunki z rodzaju Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Erwinia i Hafnia
glukoza ? etanol + butanodiol + mleczan + mrówczan + CO2 + H2
6) fermentacja masłowa, prowadzona przez niektóre gatunki bakterii jak Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium pectinovorum, Butyrivibrio fibrisolvens, Eubacterium limosum, Bacteroides melaninogenicus, Treponema phagedenis, Sarcina sp., Butyribacterium sp., Fusobacterium sp., Megasphaera sp., gdzie glukoza jest fermentowana do kwasu masłowego, ditlenku węgla i wodoru, zgodnie ze schematem reakcji:
glukoza ? kwas masłowy + 2 CO2 + 2 H2
7) fermentacja aceto-butanolowa, prowadzona przez Clostridium acetobutylicum, zgodnie ze schematem reakcji:
2 cz. glukozy ? C4H9OH + (CH3)2CO + H2 + CO2
8) fermentacja homooctowa, prowadzona przez kilka gatunków bakterii, w tym Moorella thermoacetica i Acetobacterium woodii, zgodnie ze schematem reakcji:
glukoza ? 3 cz. octanu
Dwie cząsteczki octanu powstają w procesie fermentacji glukozy, trzecia cząsteczka octanu jest syntetyzowana w procesie redukcji ditlenku węgla do acetylo-CoA lub szlakiem Wood-Ljungdahla.
9) nieglikolityczna fermentacja propionowa, prowadzona przez gatunki należące do rodzaju Propionibacterium freundreichii, P. jansenii, P. shermanii, P. acnes, P. acidi-propionici, Prevotella ruminicola, Clostridium propionicum, Veilonella alcalescens, V. parvula, Selenomonas ruminantium, S. sputigena, Bacteroides ruminicola, B. fragilis, Megasphaera elsdenii, Micromonospora sp., Propionigenum modestum, Salmonella enterica subsp. typhimurium, Roseburia inulinivorans
3 cz. mleczanu ? 2 cz. propionianu + octan + CO2 + H2O
10) nieglikolityczna fermentacja metanowa prowadzona przez wyspecjalizowaną grupę archeonów metanogennych, z produkcją metanu i ditlenku węgla z takich substratów, jak octan (acetotroficzne) lub w procesie redukcji ditlenku węgla wodorem (hydrogenotroficzne).
1.4. Fermentacja białek
Białka są biologicznymi makromolekułami rozpuszczalnymi albo nierozpuszczalnymi w wodzie (sierść, włosy, paznokcie, kopyta). Są naturalnymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym. W środowisku kwaśnym lub w obecności enzymów białka rozpuszczalne w wodzie są strącane. Białka są hydrolizowane przez pozakomórkowe enzymy zwane proteazami do takich składników, jak: polipeptydy, oligopeptydy, dipeptydy i aminokwasy. W przeciwieństwie do hydrolizy węglowodanów, zachodzącej w środowisku słabo kwaśnym, optymalna hydroliza białek zachodzi przy pH słabo zasadowym. Aminokwasy różnią się znacząco wielkością i strukturą i są fermentowane różnymi szlakami metabolicznymi do różnych produktów w zależności od rodzaju i stężenia aminokwasów obecnych w ściekach. Produkty te obejmują różne związki organiczne, głównie kwasy organiczne krótkołańcuchowe i rozgałęzione, amoniak, ditlenek węgla oraz niewielkie ilości wodoru i związków zawierających siarkę. Fermentacja aminokwasów nie zmienia pH środowiska, a jest to związane z wydzielaniem amoniaku. Dezaminacja aminokwasów w procesie acetogenezy zachodzi przy niskim ciśnieniu parcjalnym wodoru, podobnie jak degradacja węglowodanów. Jest to związane z faktem, że Clostridia prowadzą reakcję utleniania i redukcji via reakcja Sticklanda.
Istnieje główna różnica między degradacją białek w żołądku krowy a degradacją w beztlenowym fermentorze. Na przykład w żołądku głównym substratem są węglowodany fermentowane do prostych lotnych kwasów tłuszczowych, białka degradowane do aminokwasów nie są źródłem energii koniecznej do wzrostu. W beztlenowych bioreaktorach dominuje aktywność bakterii proteolitycznych z powodu wysokiej zawartości białek w ściekach, związanej z tworzeniem energii. Są to głównie beztlenowe Gram-dodatnie bakterie należące do rodzaju Clostridium, które odgrywają dominującą rolę w hydrolizie białek i fermentacji aminokwasów.
Istnieją zasadniczo dwie drogi, w których aminokwasy w warunkach beztlenowych mogą ulec degradacji:
1) pary aminokwasów mogą być degradowane przez bakterie w reakcji Sticklanda;
2) pojedyncze aminokwasy mogą być fermentowane w procesie wymagającym obecności bakterii wykorzystujących wodór jako źródło energii.
Reakcja Sticklanda jest wspólna dla rozkładu pewnych aminokwasów. Zwykle w reakcji biorą udział dwa aminokwasy - jeden działa jak donor elektronów (cząsteczka produktu zawiera o jeden atom węgla mniej niż cząsteczka oryginalnego aminokwasu, ulega także dezaminacji), a drugi działa jako akceptor elektronów (cząsteczka produktu ma taką samą liczbę atomów węgla jak cząsteczka pierwotnego aminokwasu, też ulega dezaminacji). Niektóre aminokwasy mogą służyć jako zarówno donor elektronów, jak i akceptor elektronów (na przykład leucyna). Reakcja Sticklanda jest najprostszym sposobem fermentacji aminokwasów i dostarcza komórkom około 0,5 mola ATP na mol transformowanego aminokwasu. Rozkład aminokwasów w parach w reakcjach Sticklanda zachodzi szybko w porównaniu z rozkładem aminokwasowym poza reakcją Sticklanda. Niektóre z tych obligatoryjnych beztlenowców nie wykorzystują glukozy jako źródła węgla, ale fermentują aminokwasy (Rys. 1.2).
Rys. 1.2. Schemat mikrobiologicznej degradacji białek w warunkach beztlenowych
Na podstawie udziału w reakcjach Sticklanda lub nie, na podstawie prac Mead (1971) i McInerney (1988) bakterie degradujące białka zostały podzielone na pięć grup (I-V). Bakterie grupy I są organizmami prowadzącymi fermentacje aminokwasów via reakcje Sticklanda. Wszystkie te organizmy wykorzystują prolinę i wytwarzają ?-aminowalerianian, ?-aminomaślan lub ?-aminomaślan jako związki pośrednie w procesie fermentacji. Aminokwasy, które powszechnie wchodzą w reakcje Sticklanda, obejmują prolinę, serynę, argininę, ornitynę, glicynę, leucynę, izoleucynę, walinę, serynę, lizynę, alaninę, cysteinę, metioninę, asparaginian, treoninę, fenyloalaninę, tyrozynę i tryptofan (Tabela 1.1). Wśród bakterii należących do rodzaju Clostridium, reakcje Sticklanda prowadzą następujące gatunki bakterii (grupa I): C. bifermentans, C. sordellii, C. botulinum typ A, B, F, C. caloritolerans, C. sporogenes, C. cochlearium - 1 szczep, C. dif?cile, C. putri?cum, C. sticklandii, C. ghoni, C. mangenotii, C. scatologenes, C. lituseburense, C. aerofoetidum, C. butyricum, C. caproicum, C. carnofoetidum, C. indolicum, C. mitelmanii, C. saprotoxicum, C. valerianicum (De Vladar 2012).
Tabela 1.1. Aminokwasy włączone w fermentacje Sticklanda u Clostridium spp.
Donor elektronów
(reduktor)
Akceptor elektronów
(utleniacz)
Donor lub akceptor w zależności od partnera
Alanina
Walina
Seryna
Izoleucyna
Treonina
Kwas glutaminowy
Histydyna
Cysteina
Metionina
Lizyna
Glicyna
Kwas asparaginowy
Prolina
Leucyna
Fenyloalanina
Tyrozyna
Tryptofan
Arginina
Fermentacja aminokwasów prowadzona przez Clostridium jest dwuetapowa (McInerney 1988) (Rys. 1.3). (A) Donorem elektronów jest aminokwas o wyższym stopniu utlenienia ulegający oksydatywnej dezaminacji prowadzącej do powstania ?-ketokwasu, jonu amonowego oraz dwóch protonów i dwóch elektronów. Na przykład, jeśli R1 oznacza grupę metylową (-CH3), to aminokwasem będącym donorem elektronów jest alanina, a produktem utleniania dezaminacyjnego jest pirogronian, centralny związek w metabolizmie, który może ulec dekarboksylacji i jednoczesnej fosforylacji, w efekcie powstaje acetylofosforan. (B) Akceptorem elektronów jest aminokwas, który po dezaminacji i redukcji staje się kwasem karboksylowym. Jeśli R2 jest atomem wodoru, to aminokwasem akceptorowym jest glicyna, produktem octan. (C) Nieorganiczny fosforan może być przyczepiony na końcu karboksylowym, tworząc acetylofosforan, który jest substratem do produkcji ATP, obydwa związki ufosforyzowane (A i B) są substratami do syntezy ATP z ADP. Naturalnie u Clostridium spp. wszystkie te reakcje zachodzą przy pomocy odpowiednich enzymów: hydrogenaz (donory elektronów) i reduktaz (akceptory elektronów). Synteza ATP jest katalizowana przez kinazy. Jednak w systemach bakterii chemolitoautroficznych, acetylofosforan jest realnym nośnikiem energii. Aminokwasy o najwyższej wydajności energetycznej (głównie alanina, glicyna, kwas asparaginowy i walina) mogą tworzyć cztery pary w reakcji Sticklanda: alanina + glicyna, alanina + kwas asparaginowy, walina + glicyna i walina + kwas asparaginowy.
Pozostałe bakterie nieprowadzące reakcji Sticklanda, ale uczestniczące w procesie fermentacji aminokwasów, są zebrane w grupie II, III, IV i V. Należą do nich głównie obligatoryjnie tworzące spory gatunki Clostridium i niektóre niesporujące obligatoryjne beztlenowce, jak Peptostreptococcus spp. Inne organizmy, które również degradują aminokwasy, obejmują gatunki Campylobacter sp., Acidaminococcus fermentans, Acidaminobacter hydrogenoformans,
Rys. 1.3. Przemiany metaboliczne aminokwasów
Megasphaera elsdenii, Eubacterium acidaminophilum i niektóre bakterie redukujące siarczany(VI). Bakterie grupy II stanowią C. botulinum typu C, C. histolyticum, C. cochlearium - jeden szczep, C. subterminale, które wykorzystują glicynę, a niektóre gatunki również wykorzystują argininę, histydynę i lizynę. Wśród bakterii grupy III wszystkie cztery gatunki: C. tetani, C. limosum, C. malenomenatum, C. perfringens wykorzystują histydynę, serynę i glutaminian, a niektóre gatunki również wykorzystują argininę, asparaginian, treoninę, tyrozynę i tryptofan. Bakterie grupy IV obejmują tylko szczepy gatunku C. putrefaciens, który fermentuje serynę i treoninę. Bakterie grupy V obejmują tylko gatunek C. propionicum, który fermentuje alaninę, serynę, treoninę i cysteinę. Żadna z tych bakterii, które występują w reakcji Sticklanda, nie produkuje ?-aminowaleranianu. W warunkach mieszanej hodowli różnych gatunków bakterii, gdzie występuje mieszanina aminokwasów, niesprzężona degradacja aminokwasów (brak reakcji Sticklanda) występuje tylko wtedy, gdy występuje niedobór aminokwasów, które mogą odgrywać rolę akceptora elektronów. W przypadku białek, takich jak kazeina, albumina i żelatyna, stanowią one mniej niż 10% wszystkich aminokwasów fermentowanych. To wskazuje, że aminokwasy są fermentowane preferencyjnie przez reakcje Sticklanda podczas beztlenowego "trawienia" białka, zawartego w ściekach. Reakcje stechiometryczne do fermentacji różnych aminokwasów przedstawiono poniżej.
Reakcje kataboliczne w procesie fermentacji aminokwasów głównie przez gatunki Clostridium (Ramsay i Pullammanappallil 2001, za zgodą Springer Nature i CCC):
1. C6H13NO2 (Leu) + 2 H2O ? C5H10O2 (3-metylomaślan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
2. C6H13NO2 (Leu) + H2 ? C6H12O2 (4-metylowalerianian) + NH3
(S/R)
3. C6H13NO2 (Ile) + 2 H2O ? C5H10O2 (2-metylomaślan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
4. C5H11NO2 (Val) + 2 H2O ? C4H8O2 (2-metylopropionian) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
5. C9H11NO2 (Phe) + 2 H2O ? C8H8O2 (fenylooctan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
6. C9H11NO2 (Phe) + H2 ? C9H10O2 (fenylopropionian) + NH3
(S/R)
7. C9H11NO2 (Phe) + 2 H2O ? C6H6 (benzen) + C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2 + ATP
(N/S)
8. C9H11NO3 (Tyr) + 2 H2O ? C8H8O3 (hydroksyfenylooctan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
9. C9H11NO3 (Tyr) + H2 ? C9H10O3 (hydroksyfenylopropionian) + NH3
(S/R)
10. C9H11O3N (Tyr) + 2 H2O ? C6H6O (krezol) + C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2 + ATP
(S/O)
11. C11H12N2O2 (Trp) + 2 H2O ? C10H9NO2 (indolooctan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
12. C11H12N2O2 (Trp) + H2 ? C11H11NO2 (indolopropionian) + NH3
(S/R)
13. C11H12N2O2 (Trp) + 2 H2O ? C8H7N (indol) + C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2 + ATP
(N/S)
14. C2H5NO2 (Gly) + H2 ? C2H4O2 (octan) + NH3
(S/R)
15. C2H5NO2 (Gly) + ? H2O ? ? C2H4O2 (octan) + NH3 + ? CO2 + ? ATP
(N/S)
16. C3H7NO2 (Ala) + 2 H2O ? C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + 2 H2 + ATP
(S/O)
17. C3H7NO2S (Cys) + 2 H2O ? C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2S + H2 + ATP
(S/O)
18. C5H11NO2S (Met) + 2 H2O ? C3H6O2 (propionian) + CO2 + NH3 + CH4S + H2 + ATP
(S/O)
19. C3H7NO3 (Ser) + H2O ? C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2 + ATP
(inne)
20. C4H9NO3 (Thr) + H2O ? C3H6O2 (propionian) + NH3 + CO2 + H2 + ATP
(N/S)
21. C4H9NO3 (Thr) + H2 ? C2H4O2 (octan) + ? C4H8O2 (maślan) + NH3 + ATP
(S/R)
22. C4H7NO4 (Asp) + 2 H2O ? C2H4O2 (octan) + NH3 + 2 CO2 + 2 H2 + 2 ATP
(inne)
23. C5H9NO4 (Glu) + H2O ? C2H4O2 (octan) + ? C4H8O2 (maślan) + NH3 + CO2 + 2 ATP
(S/O)
24. C5H9NO4 (Glu) + 2 H2O ? 2 C2H4O2 (octan) + NH3 + CO2 + H2 + 2 ATP
(N/S)
25. C6H9N3O2 (His) + 4 H2O ? CH3NO (formamid) + C2H4O2 (octan) + ? C4H8O2 (maślan) + 2 NH3 + CO2 + 2 ATP
(S/O)
26. C6H9N3O2 (His) + 5 H2O ? CH3NO (formamid) + 2 C2H4O2 (octan) + 2 NH3 + CO2 + H2 + 2 ATP
(N/S)
27. C6H14N4O2 (Arg) + 6 H2O ? 2 C2H4O2 (octan) + 4 NH3 + 2 CO2 + 3 H2 + 2 ATP
(S/O*)
28. C6H14N4O2 (Arg) + 3 H2O + H2 ? ? C2H4O2 (octan) + ? C3H6O2 (propionian) + ? C5H10O2 (walerianian) + 4 NH3 + CO2 + ATP
(S/R*)
29. C5H9NO2 (Pro) + H2O + H2 ? ? C2H4O2 (octan) + ? C3H6O2 (propionian) + ? C5H10O2 (walerianian) + NH3
(S/O)
30. C6H14N2O2 (Lys) + 2 H2O ? C2H4O2 (octan) + C4H8O2 (maślan) + 2 NH3 + ATP
(inne)
*ornityna jest związkiem pośrednim, redukowanym lub utlenionym w procesie fermentacji argininy; S/O - utlenianie w reakcji Sticklanda; S/R - redukcja w reakcji Sticklanda; N/S - reakcja nie-Sticklanda.
Reakcje te obejmują najczęściej opisane w literaturze szlaki degradacji, ale nie obejmują szlaków niektórych specjalistycznych bakterii, takich jak C. propionicum. W wielu przypadkach, aminokwasy ulegają rozkładowi w więcej niż jednym szlaku. Wszystkie podane reakcje zostały wcześniej opisane jako reakcje Sticklanda lub reakcje nie-Sticklanda. Pięć aminokwasów uczestniczących w reakcjach Sticklanda może odgrywać rolę zarówno donora, jak i akceptora elektronów. Dla tych aminokwasów, reakcje zostały opisane jako reakcje utleniania i redukcji.
1.5. Beztlenowa degradacja tłuszczów i lipidów
Lipidy można podzielić na (He i wsp. 2016):
I Lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z różnymi alkoholami.
1. Tłuszcze właściwe: estry kwasów tłuszczowych z glicerolem.
2. Woski: estry kwasów tłuszczowych z alkoholami wyższymi od glicerolu.
II Lipidy złożone: estry zawierające dodatkowe grupy.
1. Fosfolipidy: estry lub amidy zawierające resztę ortofosforanu, często również zasadę azotową lub inne składniki.
2. Glikolipidy: amidy wyższych kwasów tłuszczowych z alkoholem, zawierające węglowodany, w których obecny jest azot, lecz brak ortofosforanu:
a) cerebrozydy,
b) gangliozydy.
Tłuszcze i lipidy to grupa biopolimerów, która w sposób istotny zwiększa ChZT (chemiczne zapotrzebowanie tlenu) w ściekach, odchodach krów i świń, a także w wielu procesach bioprzemysłu, np. w ubojniach czy w zakładach produkcji chipsów ziemniaczanych. Do hydrolizy stałych tłuszczów, lipidów lub olejów są konieczne lipazy lub fosfolipazy. W procesie hydrolizy tłuszczów neutralnych powstaje glicerol oraz nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe (palmitynowy, linolowy, linolenowy, stearynowy i inne). Hydroliza fosfolipidów (cholina, inozytol) prowadzi do tworzenia kwasów tłuszczowych, glicerolu i alkoholi oraz fosforanów. Hydroliza glikolipidów prowadzi do produkcji kwasów tłuszczowych, aminoalkoholi oraz cukrów (glukoza i galaktoza). Wreszcie hydroliza sfingolipidów (sfingozyna) prowadzi do wydzielania kwasów tłuszczowych i aminoalkoholi. Wszystkie proste związki, takie jak glicerol i cukry, są degradowane do metanu i ditlenku węgla przy udziale bakterii fermentacyjnych i archeonów metanogennych lub w procesach syntroficznych z udziałem bakterii fermentujących, octogennych i metanogennych. Kwasy tłuszczowe długołańcuchowe są degradowane przez bakterie octogenne w procesie zwanym ?-oksydacją do octanu i wodoru cząsteczkowego. Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla są degradowane do octanu, propionianu, wodoru, natomiast kwasy o parzystej liczbie atomów węgla do octanu i wodoru. Metanol, etanol i amoniak są tworzone w procesie hydrolizy choliny. Po hydrolizie, fermentacji i acetogenezie produkty degradacji, takie jak octan, wodór i CO2, w procesach metabolicznych archeonów metanogennych są konwertowane do metanu. Wszystkie następcze reakcje są prowadzone w przestrzeniach komórkowych, z wyjątkiem początkowych reakcji hydrolizy z udziałem lipaz (Rys. 1.4).
Rys. 1.4. Schemat mikrobiologicznej degradacji tłuszczów i lipidów w warunkach beztlenowych
1.6. Metagenomy bakterii fermentujących ścieki
Analizowano 38 próbek pobranych z 29 beztlenowych fermentorów ścieków, pracujących w skali przemysłowej i produkujących biogaz (De Vrieze i wsp. 2015). Skład ścieków był następujący: całkowite stężenie jonów amonowych wynosiło od 128 do 6427 mg N/l, wolny amoniak od 2 do 1460 mg N/l, całkowita ilość lotnych kwasów tłuszczowych od 0 do 36,8 g ChZT/l i pH od 7,1 do 8,52. Dominowały bakterie należące do trzech typów: Firmicutes, Bacteroidetes i Proteobacteria. W typie Firmicutes bakterie należące do Bacillales, Clostridiales i Lactobacillales stanowiły 92,2?7,2 % wszystkich sekwencji. W typie Bacteroidetes dominowały bakterie należące do rzędu Bacteroidales (96,0?12,7%). Bakterie z Clostridiales i Bacteroidales są wykrywane w każdej próbie. Brak jest dominacji jakiejkolwiek grupy bakterii w randze rzędu należących do Proteobacteria, z pewną częstością w większości prób stwierdzano bakterie należące do Pseudomonadales. Pozostałe bakterie należące do następujących rzędów: Acidimicrobiales, Actinomycetales, Flavobacteriales, Ignavibacteriales, Anaerolineales, Natranaerobiales, Erysipelotrichales, Nitrospirales, Burkholderiales, Desulfuromonadales, Syntrophobacterales, Alteromonadales, Xanthomonadales, Synergistales, Acholeplasmatales, Thermotogales, Pedosphaerales, Cloacimonadales pojawiają się z pewną częstością i nie we wszystkich próbach.
1.7. Produkcja metanu
W procesie beztlenowego rozkładu materii organicznej prowadzonego w fermentorach beztlenowych przez populacje mikroorganizmów można wyróżnić cztery fazy: hydrolizy, acidogenezy, syntroficznej acetogenezy i metanogenezy (Venkiteshwaran i wsp. 2015). Każdy z tych kolejnych procesów prowadzi odmienna grupa mikroorganizmów, przy czym ważne jest utrzymanie równowagi między szybkością reakcji w czterech kolejnych fazach w celu zapewnienia stabilnego procesu beztlenowego rozkładu substancji organicznych (Rys. 1.5).
Rys. 1.5. Schemat beztlenowej mikrobiologicznej degradacji polimerycznej materii organicznej do metanu i ditlenku węgla
(1) W fazie hydrolizy substancje polimeryczne, które nie mogą być bezpośrednio transportowane przez błonę komórkową mikroorganizmów, takie jak polisacharydy, lipidy i białka, są hydrolizowane przez hydrolazy wydzielane przez bakterie zwane hydrolitycznymi. Pozakomórkowe enzymy hydrolityczne bakterii obejmują celulazy, ksylanazy, pektynazy, amylazy, lipazy i proteazy. Etap hydrolizy "rozpuszcza" polimery do monomerów lub oligomerów, takich jak glukoza i celobioza z celulozy, ksyloza z hemicelulozy, aminokwasy z białek, kwasy tłuszczowe i gliceryna z lipidów. Bakterie hydrolityczne jako grupa mikroorganizmów są różnorodne filogenetycznie, ale dwa typy, Firmicutes i Bacteroidetes, zawierają największą liczbę gatunków bakterii hydrolitycznych. W hodowlach beztlenowych znaleziono wiele gatunków bakterii hydrolitycznych, należących do rodzaju: Acetivibrio, Clostridium, Bacteroides i Thermotoga (w grupie Thermotogae) i wiele innych. Bakterie hydrolityczne wykazują szybki wzrost i są mniej wrażliwe na zmiany warunków środowiskowych, takich jak pH i temperatura. Z wyjątkiem trudno degradowalnych substratów, takich jak lignoceluloza, faza hydrolizy nie jest ograniczeniem szybkości "trawienia" materii organicznej. Wszystkie bakterie hydrolityczne w fermentacji beztlenowej mogą wykorzystywać produkty hydrolizy jako substraty do wzrostu, głównie drogą fermentacji, do wytwarzania lotnych kwasów tłuszczowych (VFA).
(2) Acidogeneza jest zasadniczą fazą fermentacji, w której produkty hydrolizy są fermentowane do lotnych kwasów tłuszczowych (VFA) a octan, propionian, maślan, walerianian i izomaślan jako główne VFA. W czasie acidogenezy są także produkowane ditlenek węgla, wodór i amoniak. Acidogeny obejmują bakterie hydrolizujące i bakterie fermentacyjne, które nie wytwarzają pozakomórkowych hydrolaz. Do grupy acidogenów są zaliczane różne gatunki bakterii należące do typu Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria i OP9. Niehydrolityczne acidogeny należą do Bifidobacterium (typ Actinobacteria), Lactobacillus (rodzina Lactobacillaceae z Firmicutes), Anaerolinaceae (rodzina z Chloroflexi) i kilka termofilnych bakterii z typu Thermotogae. Acidogeneza przebiega na ogół szybko i może powodować kumulację lotnych kwasów tłuszczowych i ostry spadek pH, gdy do fermentorów są podawane łatwo degradowalne związki organiczne, takie jak ścieki mleczarskie (serwatka). Kumulacja lotnych kwasów tłuszczowych może powodować hamowanie dalszych etapów "trawienia" substancji organicznych, dlatego pożądane są systemy wczesnego ostrzegania o gromadzeniu się lotnych kwasów tłuszczowych lub prowadzenie kolejnych dwóch etapów w drugim bioreaktorze po neutralizacji kwaśnych odpływów z pierwszego reaktora. Chociaż niektóre produkty końcowe z hydrolizy i acidogenezy, takie jak octan, H2 i CO2, mogą być bezpośrednio wykorzystywane przez metanogeny do produkcji biogazu, inne związki pośrednie, takie jak lotne kwasy tłuszczowe, propionian, maślan, izomaślan, walerianian, izowalerianian, pentanian, etanol, aminokwasy, oraz rozgałęzione łańcuchy kwasów tłuszczowych i długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, nie mogą być wykorzystywane przez metanogeny i muszą być dalej degradowane i przekształcane do substratów następnego etapu, metanogenezy (Detman i wsp. 2017, 2018; Bucha i wsp. 2018). Kwas propionowy i masłowy są kluczowymi produktami pośrednimi w mineralizacji kompleksowej materii organicznej. Kompletne utlenienie propionianu i maślanu dostarcza od 20 do 43% wytworzonego metanu, w zależności od typu fermentora oraz składu organicznego ścieków.
(3) Synergistyczna acetogeneza jest trzecim etapem, w którym wyżej wymienione produkty pośrednie są dalej rozkładane/utleniane do octanu, H2 i CO2. Syntroficzne utlenianie propionianu jest szczególnie ważne, ponieważ prawie 30% elektronów wytwarzanych z substratów polimerycznych przepływa przez propionian podczas "trawienia" beztlenowego.
propionian + 3 H2O ? octan + HCO3- + H+ + 3 H2
G? = + 76 kJ
propionian + 2 HCO3- ? octan + H+ + mrówczan
G? = + 72 kJ
maślan + 2 H2O ? 2 cz. octanu + H+ + 2 H2
G? = + 48 kJ
maślan + 2 HCO3- ? 2 cz. octanu + H+ + 2 cz. mrówczanu + 3 H2O
G? = + 46 kJ
Większość średnio- i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych powstała w wyniku hydrolizy lipidów także utlenia się do octanu, H2 i CO2 poprzez syntroficzną acetogenezę. Syntroficzna acetogeneza jest niekorzystna termodynamicznie, chyba że ciśnienie parcjalne H2 utrzymuje się poniżej 10-4 atmosfery.
W fermentorach beztlenowych metanogeny hydrogenotroficzne żyją w pewnej bliskości syntroficznych acetogenów wydzielających wodór (Tabela 1.2). Ten związek syntroficzny sprawia, że syntroficzna acetogeneza jest termodynamicznie wykonalna (Stams i wsp. 2012). Syntrofia, która opiera się na przeniesieniu wodoru z mikroorganizmów wytwarzających wodór na mikroorganizmy konsumujące wodór, jest nazywana międzygatunkowym transferem wodoru. Syntroficzne acetogeny izolowane w fermentorach obejmują gatunki z rodzajów Smithllela, Syntrophobacter i Pelotomaculum do utleniania propionianu oraz w rodzajach Syntrophus i Syntrophomonas do utleniania maślanu i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Bakterie, takie jak Methanobacterium suboxydans, uczestniczą w transformacji pentanianu do propionianu. Także dwa termofilne gatunki syntroficzne, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermobenzoicum i Desulfovibrio sp., w warunkach beztlenowych utlenia propionian i wykorzystuje siarczany jako akceptory elektronów, redukując je do siarkowodoru. W wyniku acetogenezy uwalnia się wodór, który wywiera działanie toksyczne na mikroorganizmy, które przeprowadzają ten proces. Dlatego konieczna jest symbioza między bakteriami acetogennymi i autotroficznymi bakteriami metanowymi przy wykorzystywaniu wyprodukowanego wodoru, określanego tutaj jako syntrofia. Acetogeneza to faza, która warunkuje efektywność produkcji biogazu, ponieważ w procesie redukcji octanu powstaje około 70% metanu. W rezultacie octan jest kluczowym produktem pośrednim w procesie tworzenia metanu. W fazie acetogenezy w procesie rozkładu substancji powstaje około 25% octanu i około 11% wodoru. Syntroficzna acetogeneza jest bardzo ważnym etapem w utrzymaniu stabilnej i silnej operacji beztlenowego "trawienia" materii organicznej, ponieważ niektóre z wyżej wymienionych lotnych kwasów tłuszczowych (VFA), a zwłaszcza propionian, jest silnym inhibitorem aktywności metabolicznej archeonów metanogennych, nawet przy pH neutralnym. Badania nad acetogenami syntroficznymi są trudne, ponieważ nie można ich hodować samodzielnie. Genomika i metagenomika dostarczyły nowych możliwości dalszej analizy tej ważnej grupy bakterii w fermentach beztlenowych i innych siedliskach metanogennych (Tabela 1.3).
Tabela 1.2. Lista syntrofów izolowanych z bioreaktorów (skale laboratoryjne i/lub techniczne) w procesie oczyszczania różnych ścieków
Syntroficzna bakteria
Syntroficzny partner
Substraty w kokulturze
Źródło
Literatura
Syntrophobacter fumaroxidans
Methanospirillum hungatei
C3
Osad granularny UASB
Harmsen i wsp. 1998
Syntrophobacter pfennigii
Methanospirillum hungatei
C3
Beztlenowy osad oczyszczalnia
Wallrabenstein i wsp. 1995
Syntrophobacter sulfatireducens
Methanospirillum hungatei
C3
Osad granularny UASB
Chen i wsp. 2005
Syntrophobacter wolinii
Methanospirillum hungatei
C3
Beztlenowy osad z fermentora
Boone i Bryant 1980
Syntrophomonas erecta
Methanospirillum hungatei
C4-C8
Osad granularny UASB
Zhang et al. 2005
Syntrophomonas palmitatica
Methanospirillum hungatei
C4-C18
Osad granularny UASB
Hatamoto i wsp. 2007
Syntrophomonas sapovorans
Methanospirillum hungatei
C4-C18, C16:1, C18:1, C18:2
Osad beztlenowy
Roy et al. 1986
Zhang et al. 2005
Syntrophomonas saponavida
Methanospirillum hungatei
Desulfovibrio sp.
C4-C18
Osad beztlenowy
Lorowitz i wsp. 1989
Wu i wsp. 2007
Syntrophomonas wolfei
Methanospirillum hungatei
Desulfovibrio sp.
C4-C8
Osad z fermentora
McInerney et al.
Zhang et al.
Syntrophomonas curvata
Methanobacterium formicicum
C4-C18, C18:1
Osad granularny UASB
Zhang i wsp. 2005
Syntrophomonas zehnderi
Methanobacterium formicicum
C4-C18, C16:1, C18:1, C18:2
Osad beztlenowy EGSB
Sousa i wsp. 2007
Syntrophus aciditrophicus
Methanospirillum hungatei
Desulfovibrio sp.
C4-C8, C16, C18
Osad czynny ścieków
Jackson i wsp. 1999
Pelotomaculum schinkii
Methanospirillum hungatei
C3
Osad granularny UASB
de Bok i wsp. 2008
Pelotomaculum propionicicum
Methanospirillum hungatei
C3
Osad granularny mezofilny UASB
Imachi i wsp. 2007
Pelotomaculum thermopropionicum
Methanothermobacter thermautotrophicus
C3
Osad granularny termofilny UASB
Imachi i wsp. 2002
Smithella propionica
Methanospirillum hungatei
C3, C4
Osad granularny UASB
Liu i wsp. 1999
Desulfotomaculum thermobenzoicum thermosyntrophicum
Methanothermobacter thermautotrophicus
C3, C4
Osad granularny termofilny UASB
Plugge i wsp. 2002
Tabela 1.3. Lista bakterii octogennych występujących w środowiskach beztlenowych
Typ
Rodzaj
Gatunek/szczep
Acidobacteria
Holophaga
H. foetida
Firmicutes
Acetoanaerobium
A. ruminis, A. noterae, A. romashkovii
Acetobacterium
A. baloi, A. carbinolicum, A. dehalogenans, A. bakii, A. fimentarium, A. malicum, A. paludosum, A. psammolithicum, A. tundrae, A. wieringae, A. woodii, Acetobacterium sp. AmMan1, Acetobacterium sp. B10, Acetobacterium sp. HA1, Acetobacterium sp. HP4, Acetobacterium sp. KoB58, Acetobacterium sp. LuPhet1, Acetobacterium sp. Lu Tria3, Acetobacterium sp. MrTael, Acetobacterium sp. OyTael, Acetobacterium sp. RMMac1, Acetobacterium sp. 69, Acetobacterium sp.
Acetohalobium
A. arabaticum
Acetonema
A. longum
Acetitomaculum
A. ruminis
Bryantella
B. formatexigens
Butyribacterium
B. methylotrophicum
Caloramator
C. fervidus
Clostridium
C. aceticum, C. autoethanogenum, C. coccoides, C. coccoides 1410, C. difficile AA1, C. formicoaceticum, C. glycolicum 22, C. glycolicum RD-1, C. ljundahlii, C. magnum, C. mayombei, C. methoxybenzovorans, C. scatologenes, C. scatologenes SL1, C. ultunense, Clostridium sp. CV-AA1, Clostridium sp. M5a3, Clostridium sp. F5a15, Clostridium sp. Ag412, Clostridium sp. TLN2
Eubacterium
E. aggregans, E. limosum
Moorella
M. glycerini, M. mulderi, M. thermoacetica, M. thermoautotrophica, Moorella sp. F21,
Natroniella
N. acetigena
Natronincola
N. histidinovorans
Oxobacter
O. pfennigii
Ruminococcus
R. hydrogenotrophicus, R. productus U1, R. productus Marburg, R. schinkii, Ruminococcus sp. TLF1,
Sporomusa
S. acidovorans, S. aerivorans, S. malonica, S. ovata, S. paucivorans, S. silvacetica, S. sphaeroides, S. termitida, Sporomusa sp. DR6, Sporomusa sp. DR1/8
Syntrophococcus
S. sucromutans
Thermoacetogenium
T. phaeum
Thermoanaerobacter
T. kivui
Spirochaetes
Treponema
Treponema sp. ZAS-1, Treponema sp. ZAS-2
Niesklasyfikowane szczepy
AG, AOR, CS1 Van, CS3Glu, CS7H, D, DMG58. EE121, HA, 152, S5a2, Ser8, SS1, TH-001, VK64, X-8, ZJ, 417/2, 417/5
(4) Ostatni etap procesu metanogenezy prowadzi wyspecjalizowana beztlenowa grupa archeonów metanogennych (Tabela 1.4). Na podstawie wykorzystywanych przez nich substratów, metanogeny można podzielić na trzy grupy (Venkiteshwaran i wsp. 2015):
1) metanogeny acetoklastyczne, które wykorzystują reakcję acetoklastyczną w celu wytworzenia metanu i ditlenku węgla z octanu;
2) metanogeny hydrogenotroficzne, które wykorzystują wodór do redukcji ditlenku węgla do metanu szlakiem hydrogenotroficznym;
3) metanotrofy metylotroficzne, które produkują metan ze związków C1, takich jak metanol, metyloaminy i siarczki metylu, poprzez metanogenezę metylotroficzną.
Tabela 1.4. Reakcje katalizowane przez metanogeny oraz standardowe zmiany wolnej energii
Reakcja
?G°?
kJ /mol metanu
Substraty (mol)
Produkty (mol)
CH3COOH
CH4 + CO2
-31,0
4 H2 + CO2
CH4 + 2 H2O
-135,6
4 HCOOH
CH4 + 3 CO2 + 2 H2O
-130,1
4 CO + 2 H2O
CH4 + 3 CO2
-211,0
4 CH3OH
3 CH4 + CO2 + 2 H2O
-104,9
CH3OH + H2
CH4 + H2O
-112,5
2 CH3CH2OH + CO2
CH4 + 2 CH3COOH
-116,3
4 2-propanol + CO2
CH4 + 4 aceton + 2 H2O
-36,5
4 metyloamina + 2 H2O
3 CH4 + CO2 + 4 NH3
-75,0
2 dimetyloamina + 2 H2O
3 CH4 + CO2 + 2 NH3
-73,3
4 trimetyloamina + 6 H2O
9 CH4 + 3 CO2 + 4 NH3
-74,3
2 dimetylosiarczek + 2 H2O
3 CH4 + CO2 + 2 H2S
-73,8
Metanogeny zostały podzielone na trzy klasy. Klasa I i Klasa II są klasyfikowane jako metanogeny hydrogenotroficzne, które wykorzystują mrówczan, H2 i CO2 i są bardzo istotne w procesie beztlenowego rozkładu związków organicznych, ze względu na zdolność wychwytywania H2 i utrzymywania parcjalnego ciśnienia wodoru na niskim poziomie (takie ciśnienie jest konieczne, aby syntroficzna acetogeneza była kontynuowana przy utlenianiu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych).
Typowe metanogeny hydrogenotroficzne znalezione w fermentorach beztlenowych obejmują gatunki należące do: Methanoculleus, Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanospirillum i Methanothermobacter (Venkiteshwaran i wsp. 2015; Sikora i wsp. 2017). Metanogeny klasy III mogą wykorzystywać substraty inne niż mrówczan, H2 i CO2 takie jak octan, metanol i inne związki C1. W fermentorach beztlenowych około dwóch trzecich metanu wytwarza się z octanu, a około jedna trzecia wytwarza się z H2 i CO2. W większości fermentorów beztlenowych jedynie minimalna ilość metanu jest wytwarzana z metanolu, metyloaminy lub siarczków metylowych. Metanogeny acetoklastyczne należą do rodzaju Methanosaeta, rodzaju acetoklastycznych metanogenów i Methanosarcina, rodzaju fakultatywnych acetoklastycznych metanogenów (Tabela 1.5).
Tabela 1.5. Charakterystyki kinetyczne wśród dwóch rodzajów metanogenów (Z: Shah F.A., Mahmood Q., Shah M.M., Pervez A., Asad S.A. 2014. Microbial ecology of anaerobic digesters: The key players of anaerobiosis. Scienti?c World J., ID 183752, 21 pages)
Parametry kinetyczne
Methanosaeta
Methanosarcina
Specyficzna szybkość wzrostu
0,20
0,60
Powinowactwo do substratu (mg ChZT/l)
10-50
200-280
NH4 (mg/l)
< 3,000
< 7,000
Na (mg/l)
< 10,000
< 18,000
Wzrost w zakresie pH
6,5-8,4
5-8,0
Zakres temperatury (°C)
10-70
1-70
Stężenie octanu (mg/l)
< 3,000
< 15,000
Bakterie rodzaju Methanosaeta mogą wykorzystywać tylko octan jako substrat i charakteryzują się niską specyficzną szybkością wzrostu (Umax = 0,20/doba) i wysokim powinowactwem do octanu (Ks = 10-50 mg ChZT/l), co sprawia, że rozprzestrzeniają się i dominują tam, gdzie stężenie octanu jest niskie. Methanosaeta mogą mieć formę nitkowatą i odgrywać ważną rolę w granulogenezie beztlenowych granul lub agregatów. Większość gatunków Methanosarcina może wykorzystywać H2 i CO2, metanol, metyloaminę i siarczki metylu, obok octanu. Oprócz szerokiej gamy substratów, Methanosarcina wykazują wyższą szybkość wzrostu (Umax = 0,60 /doba) i niższe powinowactwo do octanu (Ks = 200-280 mg ChZT/l), dzięki czemu Methanosarcina może zdominować Methanosaeta w fermentorach, w których stężenia octanu jest wysokie. W porównaniu z innymi bakteriami w beztlenowym rozkładzie, metanogeny rozwijają się najwolniej i są bardziej wrażliwe na zakłócenia środowiskowe, takie jak spadek pH, kumulacja lotnych kwasów tłuszczowych lub amoniaku. Pewnym wyjątkiem są szczepy Methanosarcina. Gatunki Methanosarcina są tolerancyjne wobec nagłych zmian pH około 0,8-1,0 jednostek spowodowanych obciążeniem substratem, w porównaniu do innych metanogenów, które mają tendencję do oddziaływania na wstrząsy o wartości pH wynoszącej 0,5 jednostki lub nawet mniej. Methanosarcina sp. mogą wykorzystać szlaki metanogenezy acetoklastycznej i hydrogenotroficznej, co czyni je bardziej tolerancyjnymi wobec specyficznych inhibitorów szlaku acetoklastycznego, takiego jak fluorooctan i fluorek metylu, w porównaniu z Methanosaeta sp. Tolerują wysokie stężenia całkowitego jonu amonowego do 7000 mg/l. Methanosarcina sp. mogą uzyskać stabilny wzrost przy niskim czasie zatrzymania (nawet 4 dni), wysokich obciążeniach organicznych i wysokim poziomie jonu amonowego. Gatunki Methanosaeta występują w różnych beztlenowych środowiskach, np. bioreaktorach beztlenowych, biofilmach, osadach, podmokłych polach ryżowych, zanieczyszczonych akwenach oraz granulach osadu w bioreaktorze typu UASB. Rodzaj Methanosaeta zawiera dwa gatunki: mezofilny z siedmioma szczepami Methanosaeta concilii oraz termofilny Methanosaeta thermophila z trzema szczepami. Analizy różnych osadów pobranych z różnych beztlenowych bioreaktorów wskazują, że procentowy udział Archaea w osadach wynosi od 28,1 do 78,9%, natomiast Bacteria od 26,1 do 73,5% w zależności od rodzaju oczyszczanych ścieków. Mezofilna grupa Methanosaeta jest dominantem, niezależnie od typu bioreaktora i składu oczyszczanych ścieków w warunkach beztlenowych i stanowi od 20 do 60% wśród populacji archeonów w reaktorach prowadzonych w warunkach mezofilnych.
Alternatywny szlak produkcji metanu z octanu stwierdzono także w niektórych fermentorach beztlenowych, gdy były eksploatowane w pewnych warunkach. Szlak ten łączy syntroficzne utlenianie octanu do H2 i CO2 przez bakterie syntroficzne utleniające octan i konwersję H2 i CO2 w metan za pomocą metanogenów hydrotroficznych. Szlak ten nie jest głównym szlakiem produkcji biogazu w większości fermentorów, ponieważ bakterie syntroficzne utleniające octan nie są tak konkurencyjne, jak metanogeny acetoklastyczne. Jednakże w warunkach hamujących metanogeny acetoklastyczne, takie jak wysokie stężenie amoniaku i wysoka temperatura w hodowli, szlak ten jest ważny w produkcji biogazu. Ponadto badania wykazały, że długi czas zatrzymania hydraulicznego (HRT) i brak Methanosaeta mogą również sprzyjać przesunięciu z metanogenezy acetoklastycznej na tę alternatywną drogę.
W sumie w procesie degradacji związków polimerycznych w warunkach beztlenowych powstaje metan a jego ilości zależą od rodzaju substratu fermentowanego (He i wsp. 2016):
Lipidy C50H90O6 + 24,5 H2O ? 34,75 CH4 + 15,25 CO2
Węglowodany C6H10O5 + H2O? 3 CH4 + 3 CO2
Białka C16H24O5N4 + 14,5 H2O ? 8,25 CH4 + 3,75 CO2 + 4 NH4+ + 4 HCO3-
W Tabeli 1.6 podano przykłady dominujących rodzajów archeonów metanogennych w fermentorach biogazowni pracujących w skali przemysłowej w procesie fermentacji różnych substratów organicznych.
Tabela 1.6. Przykłady dominujących archeonów metanogennych w fermentorach biogazowni w skali przemysłowej w procesie fermentacji różnych surowców i odpadów
Substrat fermentowany
Temp.
(°C)
Czas zatrzymania
(dni)
Dominujący archeon metanogenny w fermentorze
Nadmierny osad komunalny
35-43
51-53
10-30
Methanosaeta
Różne odpady rolnicze
39-43
> 30
Methanosaeta
Różne odpady rolnicze
35-45
52-53
20-140
Methanosarcina
Różne odpady rolnicze
35-45
50-62
3-110
Methanoculleus
Różne odpady rolnicze i frakcja organiczna stałych odpadów komunalnych
20-40
50-55
20-80
Methanobacterium
Różne odpady rolnicze
> 55
15-30
Methanothermobacter
Komunalne i przemysłowe osady
20-40
> 30
Methanomethylovorans
Literatura
Bucha M., Jędrysek M.-O., Kufka D., Pleśniak Ł., Marynowski L., Kubiak K., Błaszczyk M. 2018. Methanogenic fermentation of lignite with carbon-bearing additives, inferred from stable carbon and hydrogen isotopes. Intern. J. Coal Geology, 186: 65-79.
Burgess J.E., Pletschke B.I. 2008. Hydrolytic enzymes in sewage sludge treatment: A mini-review. Water SA, 34: 343-349.
Chojnacka A., Szczęsny P., Błaszczyk M.K., Zielenkiewicz U., Detman A., Salamon A., Sikora A. 2015. Noteworthy Facts about a Methane-Producing Microbial Community Processing Acidic Effluent from Sugar Beet Molasses Fermentation. PLoS ONE 10 (5): e0128008. doi:10.1371/journal.pone.0128008.
Detman A., Chojnacka A., Błaszczyk M., Kaźmierczak W., Piotrowski J., Sikora A. 2017. Biohydrogen and biomethane (Biogas) production on the consecutive stages of anaerobic digestion of molasses. Polish J. Environ. Studies, 26: 1-7.
Detman A., Mielecki D., Pleśniak Ł., Bucha M., Janiga M., Matyasik I., Chojnacka A., Jędrysek M.O., Błaszczyk M., Sikora A. 2018. Methane-yielding microbial communities processing lactate-rich substrates: a piece of the anaerobic digestion puzzle. Biotechnol. Biofuels, 11: 116.
De Vladar H.P. 2012. Amino acid fermentation at the origin of the genetic code. Biology Direct, 7:6, 20 pages. doi.org/10.1186/1745-6150-7-6.
De Vrieze J., Saunders A.M., He Y., Fang J., Nielsen P.H., Verstraete W., Boon N. 2015. Ammonia and temperature determine potential clustering in the anaerobic digestion microbiome. Water Res., 75: 312-323.
He J., Deng Y., Li X., Zhang Y., Zhu N., Yin X. 2016. A review of process limitations and microbial community in anaerobic digestion of fat, oil, and grease (Fog). Res. Rev.: J. Microbiol. Biotechnol., 5(4).
McInerney M.J. 1988. Anaerobic hydrolysis and fermentation of fats and proteins. In: Zehnder A.J.B. (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms (pp. 373-415). John Wiley & Sons. New York
Mead G.C. 1971. The amino acid fermenting clostridia. J. Gen. Microbiol., 67: 47-56.
Narihiro T., Terada T., Ohashi A., Wu J.H., Liu W.T., Araki N., Kamagata Y., Nakamura K., Sekiguchi Y. 2009. Quantitative detection of culturable methanogenic archaea abundance in anaerobic treatment systems using the sequence-specific rRNA cleavage method. The ISME Journal, 3: 522-535.
Ramsay I.R., Pullammanappallil P.C. 2001.Protein degradation during anaerobic wastewater treatment: derivation of stoichiometry. Biodegradation, 12: 247-257.
Schink B. 1997. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61: 262-80.
Shah F.A., Mahmood Q., Shah M.M., Pervez A., Asad S.A. 2014. Microbial ecology of anaerobic digesters: The key players of anaerobiosis. Scienti?c World J., ID 183752, 21 pages.
Sikora A., Detman A., Chojnacka A., Błaszczyk M. 2017. A common process ensuring energy flow and the circulation of matter in ecosystems. II. A tool for the production of gaseous biofuels. pp. 271-301. In: Fermentation processes. Angela Faustino Jozala (Ed.]. ISBN 978-953-51-2928-8, Print ISBN 978-953-51-2927-1, DOI: 10.5772/64645.
Stams A.J., Sousa D.Z., Kleerebezem R., Plugge C.M. 2012. Role of syntrophic microbial communities in high-rate methanogenic bioreactors. Water Sci. Technol., 66(2): 352-62.
Venkiteshwaran K., Bocher B., Maki J., Zitomer D. 2015. Anaerobic digestion microbial community and process function. Microbiology Insights, 20: 8(s2) 37-44.
