Przedmowa

Chemia wśród nauk ścisłych i przyrodniczych zajmuje centralne miejsce i ma swój niepodważalny udział w postępie cywilizacyjnym. Wynika to z jej wyjątkowego wkładu w interpretację przemian i procesów, jak też zjawisk zachodzących w otaczającym nas świecie, zwłaszcza rozpatrując układy biologiczne i naturalne. Jej interdyscyplinarność umożliwia wyjaśnienie przemian i zjawisk zachodzących na poziomie molekularnym i komórkowym. Odnosi się to również do oznaczeń szerokiej gamy analitów o zróżnicowanej budowie i właściwościach - substancji biologicznie aktywnych. Zakres ten jest przedmiotem bioanalityki, związanej zarówno z analizą medyczną, farmaceutyczną, produktów spożywczych, jak i środowiskową, nie różnicując matrycy.

Rosnące potrzeby wczesnej diagnostyki schorzeń oraz skuteczniejszych, spersonalizowanych metod terapii wymagają coraz czulszych i bardziej selektywnych metodologii w obrębie analityki. Zdefiniowanie problemu jest kluczowym zagadnieniem w wyborze i opracowaniu metody analitycznej do identyfikacji biomarkerów schorzeń, w diagnostyce multiparametralnej, w badaniach w obrębie proteomiki, metabolomiki i innych "-omic", w monitorowaniu leków w płynach ustrojowych oraz w identyfikacji metabolitów, wpisanych w zmiany biochemiczne w trakcie choroby.

Zastosowanie procedur analitycznych w odniesieniu do próbek środowiska przyrodniczego to badania aktywności biologicznych substancji roślinnych, jak również wyzwania analityczne w biomonitoringu. Wymagane są w tym zakresie działania interdyscyplinarne: analityków-chemików, lekarzy-klinicystów, farmaceutów, specjalistów z obszaru ekologii, a także tych, którzy zajmują się analityką dla potrzeb przemysłu.

Umiejętność doboru odpowiednich metod i narzędzi, w zależności od rodzaju podejmowanego problemu, jest niezwykle ważne i często decyduje o powodzeniu zarówno kolejnych etapów, jak i całości badań. Należy podkreślić, że bioanalityka, w różnych obszarach swoich działań, jest ukierunkowana na oznaczanie śladowych ilości związków biologicznie aktywnych w próbkach o wyjątkowo skomplikowanej matrycy.

Duże zainteresowanie bioanalityką, w tym kształcenie na poziomie przedmiotów podstawowych i specjalnościowych, jak również funkcjonowanie specjalności "bioanalityka" na wielu uczelniach, potrzeby laboratoriów klinicznych czy medycyny sądowej, a także konieczność kontroli jakości produktów spożywczych i żywności skłoniły redaktorów naukowych do przygotowania niniejszej książki. Spodziewamy się również, że zagadnienia przedstawione w tym opracowaniu będą przydatne studentom i pracownikom naukowym, pracownikom laboratoriów badawczych z pokrewnych dziedzin.

Publikacja ta jest opracowaniem zbiorowym, w którym znakomici specjaliści z różnych ośrodków naukowych i badawczych w Polsce przedstawili potencjał, aplikacje kliniczne i środowiskowe oraz perspektywy dalszego rozwoju bioanalityki. Redaktorzy pragną gorąco im podziękować za wielki wkład pracy, który składa się na jakość tej książki.

Wyrażamy głęboką wdzięczność Panu Profesorowi Waldemarowi Wardenckiemu, recenzentowi tej pracy, którego cenne uwagi i sugestie pomogły w ostatecznym zredagowaniu książki. Dziękujemy także Pani Sylwii Bajkacz, prof. Politechniki Śląskiej, za pomoc techniczną przy komponowaniu całości tekstu.

Irena BARANOWSKA i Bogusław BUSZEWSKI

Autorzy

Hossam Hussein AL-SUOD, dr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Małgorzata ARTYMOWICZ, mgr, Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki

Sylwia BAJKACZ, dr hab. inż., prof. Politechniki Śląskiej, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii

Edward BALD, prof. dr hab., Uniwersytet Łódzki, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska

Danuta BARAŁKIEWICZ, prof. dr hab., Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, Wydział Chemii, Zakład Analizy Śladowej

Irena BARANOWSKA, prof. dr hab., Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii

Marta BICKA, mgr, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Katarzyna BIELAWSKA, dr n. farm., Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

Michał BIERNACKI, dr n. farm., Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

Ewa BULSKA, prof. dr hab., Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Magdalena BUSZEWSKA-FORAJTA, dr n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki, Zakład Biofarmacji i Farmakokinetyki

Bogusław BUSZEWSKI, prof. dr hab., czł. koresp. PAN, dr h.c. mult., Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Grażyna CHWATKO, dr hab., prof. Uniwersytetu Łódzkiego, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska

Renata GADZAŁA-KOPCIUCH, dr hab., prof. Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Andrzej GAWOR, mgr, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Paulina GĄTAREK, mgr inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Rafał GŁOWACKI, prof. dr hab., Uniwersytet Łódzki, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska

Marek GOŁĘBIOWSKI, dr hab., prof. Uniwersytetu Gdańskiego, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska, Zespół Analizy Związków Naturalnych

Łukasz P. HALIŃSKI, dr hab., Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska

Anetta HANĆ, dr hab., prof. Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza, Wydział Chemii, Zakład Analizy Śladowej

Anna HAWRYŁ, dr hab. n. farm., Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Chemii Nieorganicznej

Mirosław HAWRYŁ, dr hab. n. farm., Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Chemii Nieorganicznej

Weronika HEWELT-BELKA, dr inż., Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Analitycznej

Beata JANOSZKA, dr hab., Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Nauk Medycznych w Zabrzu, Katedra i Zakład Chemii

Iwona JAROCKA-KARPOWICZ, dr n. farm., Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

Maciej JAROSZ, prof. dr hab. inż., Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny

Grzegorz JÓŹWIAK, dr n. farm., Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Chemii Nieorganicznej

Roman KALISZAN, prof. dr hab. n. farm., czł. rzecz. PAN, czł. czynny PAU, dr h.c., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki, Zakład Biofarmacji i Farmakokinetyki

Joanna KAŁUŻNA-CZAPLIŃSKA, prof. dr hab. inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Adam KARPIŃSKI, mgr, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Anna KIEŁBASA, dr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Anna KILANOWSKA, mgr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Anna KONOPKA, dr, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Agata KOT-WASIK, prof. dr hab. inż., Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Analitycznej

Aneta KRAKOWSKA-SIEPRAWSKA, mgr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Judyta KRUK, dr inż., Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii

Joanna KRUSZEWSKA, dr inż., Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny

Eliza KUREK, dr, Uniwersytet Warszawski, Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych

Dorota KWIATKOWSKA, dr hab., Polskie Laboratorium Antydopingowe

Magdalena LIGOR, dr hab., prof. Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Tomasz LIGOR, dr hab., prof. Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Wojciech ŁUCZAJ, dr hab. n. med., Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

Szymon MACIOSZEK, mgr, Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki

Michał J. MARKUSZEWSKI, prof. dr hab. n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki, Zakład Biofarmacji i Farmakokinetyki

Magdalena MATCZUK, dr inż., Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny

Alicja MENŻYK, mgr, Uniwersytet Śląski, Wydział Nauk Ścisłych i Technicznych, Instytut Chemii, Zespół Chemii Sądowej

Magdalena MICHALSKA-KACYMIROW, dr, Uniwersytet Warszawski, Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych

Adriana MIKA, dr hab., Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska; Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biochemii Farmaceutycznej

Maciej MILANOWSKI, dr inż., Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Ewa MINIATORSKA, mgr inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Fernanda MONEDEIRO, dr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Edyta NALEWAJKO-SIELIWONIUK, dr hab., Uniwersytet w Białymstoku, Wydział Chemii, Katedra Chemii Analitycznej i Nieorganicznej, Zakład Chemii Analitycznej

Łukasz NUCKOWSKI, mgr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Martyna PAJEWSKA-SZMYT, mgr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Alicja PAKIET, mgr inż., Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska

Katarzyna PAUTER, mgr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Aleksandra PAWLACZYK, dr inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Anna PETRUCZYNIK, dr hab. n. farm., Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Chemii Nieorganicznej

Justyna PIECHOCKA, dr, Uniwersytet Łódzki, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska

Joanna RACZAK-GUTKNECHT, dr n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki, Zakład Farmakodynamiki

Anna RAJSKA (STEFANIAK), mgr, Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki, Zakład Biofarmacji i Farmakokinetyki

Ileana-Andreea RATIU, dr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii; Babeş-Bolyai University, Faculty of Chemistry and Chemical Engineering

Angelina ROSIAK, dr inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Joanna RUDNICKA, dr, Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Anna RUSZCZYŃSKA, dr, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Centrum Nauk Biologiczno­-Chemicznych

Lena RUZIK, dr hab. inż., Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny

Adam SAJNÓG, dr, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, Wydział Chemii, Zakład Analizy Śladowej

Danuta SILUK, dr hab. n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki

Elżbieta SKRZYDLEWSKA, prof. dr hab. n. farm., Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej

Piotr STEPNOWSKI, prof. dr hab., Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska, Zespół Chemicznych Zagrożeń Środowiska

Wiktoria STRUCK-LEWICKA, dr n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki

Sylwia STUDZIŃSKA, dr hab., prof. Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Małgorzata SZULTKA-MŁYŃSKA, dr hab., prof. Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki

Magdalena SZUMSKA, dr n. med., Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Nauk Medycznych w Zabrzu, Katedra i Zakład Chemii

Małgorzata Iwona SZYNKOWSKA, prof. dr hab. inż., Politechnika Łódzka, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej

Anna TOPOLEWSKA, mgr, Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska

Krystyna TYRPIEŃ-GOLDER, dr hab. n. med., prof. Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, Wydział Nauk Medycznych w Zabrzu, Katedra i Zakład Chemii

Monika WAKSMUNDZKA-HAJNOS, prof. dr hab. n. farm., Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Chemii Nieorganicznej

Justyna WALCZAK-SKIERSKA, dr, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Chemii, Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki; Interdyscyplinarne Centrum Nowoczesnych Technologii

Sławomir WALIGÓRA, mgr inż., Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Nauk Medycznych w Zabrzu, Katedra i Zakład Chemii

Małgorzata WASZCZUK-JANKOWSKA, dr n. farm., Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Biofarmacji i Farmakodynamiki

Aleksandra WESEŁUCHA-BIRCZYŃSKA, dr hab., prof. Uniwersytetu Jagiellońskiego, Wydział Chemii

Justyna WOJCIESZEK, mgr inż., Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny

Grzegorz ZADORA, prof. dr hab., Uniwersytet Śląski, Wydział Nauk Ścisłych i Technicznych, Instytut Chemii, Zespół Chemii Sądowej; Instytut Ekspertyz Sądowych im. Prof. dra Jana Sehna

Janina ZIĘBA-PALUS, prof. dr hab., Instytut Ekspertyz Sądowych im. Prof. dra Jana Sehna

Wykaz podstawowych skrótów

AAS (ang. atomic absorption spectrometry) - atomowa spektrometria absorpcyjna

AFS (ang. atomic fluorescence spectrometry) - atomowa spektrometria fluorescencyjna

APCI (ang. atmospheric pressure chemical ionization) - jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym

API (ang. atmospheric pressure ionization) - jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym

ASE (ang. accelerated solvent extraction) - przyspieszona ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika

CE (ang. capillary electrophoresis) - elektro­foreza kapilarna

CI (ang. chemical ionization) - jonizacja chemiczna

CL (ang. chemiluminescence detector) - detektor chemiluminescencyjny

CRM (ang. certified reference materials) - certyfikowane materiały odniesienia

CZE (ang. capillary zone electrophoresis) - elektro­foreza stref kapilarnych

DAD (ang. diode array detector) - detektor z matrycą diodową

DLLME (ang. dispersive liquid-liquid microextraction) - dyspersyjna mikroekstrakcja ciecz-ciecz

dSPE (ang. dispersive solid-phase extraction) - dyspersyjna ekstrakcja do fazy stałej

ECD (ang. electrochemical detector/electron capture detector) - detektor elektrochemiczny/detektor wychwytu elektronów

EDCs (ang. endocrine disrupting compounds) - związki endokrynnie czynne

EI (ang. electron ionization) - jonizacja elektro­nami

ESI (ang. electrospray ionization) - jonizacja typu elektrorozpylanie

FID (ang. flame ionization detector) - detektor płomieniowo-jonizacyjny

FLD (ang. fluorescence detector) - detektor fluorescencyjny

FT ICR (ang. Fourier transform ion cyclotron resonance) - analizator rezonansu cyklotronowego z transformacją Fouriera

FTIR (ang. Fourier transform infrared spectroscopy) - spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera

GC (ang. gas chromatography) - chromatografia gazowa

HILIC (ang. hydrophilic interaction liquid chromatography) - chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych

HPLC (ang. high performance liquid chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa

IC (ang. ion chromatography) - chromatografia jonowa

ICP (ang. inductively coupled plasma) - plazma wzbudzona indukcyjnie

IEC (ang. ion exchange chromatography) - chromatografia jonowymienna

IPC (ang. ion pair chromatography) - chromato­grafia par jonowych

IT (ang. ion trap) - pułapka jonowa

LA (ang. laser ablation) - ablacja laserowa

LC (ang. liquid chromatography) - chromatografia cieczowa

LIF (ang. laser-induced fluorescence) - fluorescencja wzbudzona laserowo

LLE (ang. liquid-liquid extraction) - ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz

LOD (ang. limit of detection) - granica wykrywalności

LOQ (ang. limit of quantification) - granica oznaczalności

m/z  stosunek masy do ładunku

MAE (ang. microwave-assisted extraction) - ekstrakcja wspomagana mikrofalami

MALDI (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization) - jonizacja/desorpcja laserowa wspomagana matrycą

MIPs (ang. molecularly imprinted polymers) - polimery z odciskiem molekularnym

MS (ang. mass spectrometry) - spektrometria mas

NMR (ang. nuclear magnetic resonance) - jądrowy rezonans magnetyczny

NP/RP (ang. normal/reversed phase) - normalny/odwrócony układ faz

NPD (ang. nitrogen phosphorus detector) - detektor azotowo-fosforowy

PCA (ang. principal component analysis) - analiza głównych składowych

PCR (ang. polymerase chain reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy

PDA (ang. photodiode array detector) - detektor z matrycą fotodiodową

PP (ang. protein precipitation) - wytrącanie białek

QuEChERs (ang. quick, easy, cheap, effective, rugged, safe) - (metoda) szybka, prosta, tania, efektywna, elastyczna i bezpieczna

SFC (ang. supercritical fluid chromatography) - chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym

SFE (ang. supercritical fluid extraction) - ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym

SLE (ang. solid-liquid extraction) - ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz

SPE (ang. solid-phase extraction) - ekstrakcja do fazy stałej

SPME (ang. solid-phase microextraction) - mikroekstrakcja do fazy stałej

TLC (ang. thin-layer chromatography) - chromato­grafia cienkowarstwowa

TOF (ang. time of flight) - analizator czasu przelotu

UAE (ang. ultrasound-assisted extraction) - ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami

UHPLC (ang. ultra-high performance liquid chromatography) - ultrawysokosprawna chromatografia cieczowa

UV-Vis (ang. ultraviolet-visible) - zakres nadfioletu i światła widzialnego

1Bioanalityka w transformacji in vitro i in vivo związków biologicznie aktywnych dla potrzeb diagnostyki biomedycznej

Małgorzata SZULTKA-MŁYŃSKA,Katarzyna PAUTER, Justyna WALCZAK-SKIERSKA,Bogusław BUSZEWSKI

1.1Wprowadzenie

Związek aktywny (czynny) to substancja bądź mieszanina substancji, która ma zostać wykorzystana do wytworzenia produktu leczniczego oraz wywołać działanie farmakologiczne, immunologiczne lub metaboliczne celem przywrócenia, poprawy lub zmiany funkcji fizjologicznych, albo do poprawienia rozpoznania medycznego.

Z uwagi na zróżnicowaną budowę strukturalną związki biologicznie aktywne, a zwłaszcza leki, mają różne właściwości fizykochemiczne (rozpuszczalność, stopień jonizacji, różne wartości stałej dysocjacji pKa). Aktywność biologiczna oraz toksyczność związków mogą być oceniane za pomocą testów in vitro oraz in vivo. Badania in vivo dotyczą doświadczeń na organizmach żywych, przede wszystkim zwierzętach, takich jak gryzonie lub małpy, natomiast w testach in vitro stosowane są zazwyczaj wyizolowane enzymy frakcji mikrosomalnej, rekombinowane systemy enzymatyczne, pojedyncze frakcje cytoplazmatyczne, komórki, tkanki oraz całe narządy zwierząt lub materiał biologiczny pobrany od pacjenta (mocz, krew żylna, osocze, ślina, tkanka ukrwiona, wymaz z rany). Oba podejścia farmakologiczne mają swoje zalety, jak również wady. Badania in vitro są szybsze i tańsze od badań in vivo, ale często dają odmienne efekty, a uzyskane wyniki nie zawsze w pełni znajdują swoje odzwierciedlenie w procesach zachodzących w organizmach żywych. Z kolei testy in vivo mają wielu przeciwników, którzy bronią praw zwierząt i etyki. Z tego powodu w świecie nauki zaczęto poszukiwać innych metod badawczych, które pozwoliłyby na symulacje metabolizmu leków bez wykorzystywania zwierząt i ich narządów.

1.2Metabolizm związków biologicznie aktywnych

Metabolizm jest procesem biotransformacji, w którym lek ulega przemianom w organizmie żywym. Prowadzi on głównie do przekształcenia związków rozpuszczalnych w lipidach i apolarnych do związków rozpuszczalnych w wodzie i polarnych, tak aby były wydalane wraz z moczem. Metabolizm na ogół zwiększa hydrofilowość, zmniejsza toksyczność lub też aktywuje większość leków. Niekiedy jednak w reakcji biotransformacji lek ulega przekształceniu w równie czynny metabolit i w rezultacie może być on bardziej toksyczny lub bardziej aktywny niż macierzysty preparat. Coraz więcej leków podaje się w formie nieczynnej, tzw. proleków, w celu bioaktywacji do czynnych metabolitów [1-5]. Skutkuje to lepszą biodostępnością niż w przypadku podania aktywnych postaci leków. Z powodu tak rozmaitych rozwiązań biotransformacji należy przyjrzeć się bliżej temu mechanizmowi. Dzięki reakcjom enzymatycznym transformacja leków zachodzi głównie w wątrobie pod wpływem enzymów mikrosomalnych. W niewielkim stopniu leki są przekształcane także w krwiobiegu, jelitach, śledzionie i skórze. Wyróżnia się dwa szlaki ich metabolizmu, określane jako faza I oraz faza II. Faza I to reakcje niesyntetyczne, które polegają na utlenianiu, redukcji oraz hydrolizie związku wejściowego. Procesy te mają za zadanie przekształcić substrat w bardziej hydrofilowe i reaktywne pochodne, tak by mogły uczestniczyć w procesach biotransformacji II fazy, tzw. reakcjach sprzęgania - polegają one na łączeniu przekształconego w fazie I metabolitu ze związkiem naturalnie występującym w organizmie, co z reguły prowadzi do utworzenia mniej toksycznych produktów [1-5].

1.3Terapeutyczne monitorowanie leków

Polega ono na kontrolowaniu stężenia leków we krwi i innych płynach ustrojowych w celu optymalizacji dawkowania preparatu u indywidualnego chorego zgodnie ze wskazaniami stanu klinicznego. Chodzi o to, aby uzyskane stężenia charakteryzowały się dla danego leku dużym stopniem skuteczności działania, jak również małym stopniem wystąpienia objawów niepożądanych. Istnieje wiele kryteriów spełnianych przez leki, które uzasadniają wprowadzenie monitorowania stężenia u pacjenta (np. wąski wskaźnik terapeutyczny, czyli niewielka różnica między stężeniem terapeutycznym a toksycznym), a także klinicznych wskazań (np. zapobieganie nawrotom chorób w leczeniu długoterminowym, profilaktyce) [6-8]. Kluczowym czynnikiem przedanalitycznym jest moment pobierania krwi po uwzględnieniu schematu dawkowania leku oraz jego drogi podania. Odpowiednim czasem badania jest tzw. stan stacjonarny, w którym szybkość wchłaniania leku staje się równa szybkości jego eliminacji, a tym samym stężenie w tkankach i we krwi powinno być sobie równe. Tego typu podejście wymaga stosowania wyjątkowo czułych i selektywnych metod oznaczania bardzo niskich stężeń leków (?g/l do mg/l) w próbkach płynów fizjologicznych o małej objętości z odpowiednią dokładnością oraz precyzją [6-8].

Pierwsze metody laboratoryjne polegały na zastosowaniu metod immunochemicznych, jak radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne (ELISA) oraz immuno­fluorescencyjne. Metody immunochemiczne różnią się między sobą rodzajem stosowanych przeciwciał, sposobem znakowania, techniką pomiaru przebiegu reakcji, co skutkuje rozbieżnością wyników, a w konsekwencji brakiem swoistości analiz. Alternatywą do metod immunochemicznych było zastosowanie technik chromatograficznych, głównie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) w połączeniu z różnymi detektorami (spektrofotometrycznym, fluorescencyjnym, elektrochemicznym). Wadą tej metody był zazwyczaj zbyt długi czas analizy (40-60 min na próbkę). Obecnie metodą referencyjną w terapii monitorowanej stężeniem leku we krwi jest chromatografia cieczowa w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) (ryc. 1.1) [6-9].

Monitorowanie stężenia leków w płynach ustrojowych jest szeroko stosowane w wielu specjalnościach klinicznych, dla przykładu w neurologii, kardiologii, psychiatrii. Najczęściej monitoruje się stężenia takich leków, jak: antybiotyki, leki przeciwpadaczkowe, antyarytmiczne, przeciwbólowe, związki immunosupresyjne, leki przeciwnowotworowe czy trójcykliczne leki antydepresyjne [10-12].

Terapia celowana polega na doborze odpowiedniego leku. Na przykład w antybiotykoterapii jest to możliwe na podstawie wyniku badania mikrobiologicznego (posiew z pobranego materiału od pacjenta - moczu, krwi, wydzieliny przyrannej). Komfortową sytuacją jest, gdy wskazania kliniczne są potwierdzone badaniem bakteriologicznym, co nie zawsze jest możliwe w praktyce. Dodatkowym utrudnieniem jest oporność na antybiotyki, czyli zjawisko ograniczające ich skuteczność [10, 13].

LC-MS - chromatografia cieczowa-spektrometria mas

RYC. 1.1. Bioanalityczne podejście w terapeutycznym monitorowaniu leków

[Źródło: na podstawie 6-9]

1.4Metody analityczne w oznaczaniu i identyfikacji leków w próbkach biologicznych

Techniki analityczne stosowane do wielowymiarowej analizy metabolitów w układach biologicznych muszą cechować się wysoką dokładnością, specyficznością i selektywnością w celu monitorowania wielu znanych i nieznanych cząsteczek o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych i masach cząsteczkowych. Jak dotąd, nie wybrano jednej dokładnej metody analitycznej, która pozwoliłaby na identyfikację wszystkich obecnych metabolitów. Spośród metod analitycznych wykorzystywanych w metabolomice powszechnie stosuje się technikę magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), spektroskopii Ramana oraz spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR, ang. Fourier transform infrared spectroscopy) w połączeniu z technikami chromatograficznymi i elektromigracyjnymi. Każda z wymienionych posiada zarówno zalety, jak i ograniczenia, dlatego wybór zastosowanej techniki jest zależny od celów eksperymentalnych, które mogą obejmować zakres czysto jakościowy, a także ilościowy. Jednak od pewnego czasu stosowanie spektrometrii mas (MS) w połączeniu z technikami chromatograficznymi (GC-MS i LC-MS) dominuje w badaniach metabolomicznych, o czym świadczą liczne publikacje naukowe. Techniki te charakteryzuje wysoka czułość i selektywność względem badanych analitów [10-16].

Spektrometria mas jest obecnie najważniejszą metodą identyfikacji substancji wykorzystywaną w metabolomice. Jej zalety to przede wszystkim bardzo wysoka czułość oraz niewielka ilości próbki (?l) potrzebna do analizy. Należy jednak pamiętać, że wybór źródła jonów, analizatora mas, trybu akwizycji i parametrów instrumentalnych dla danej analizy zależą od właściwości fizykochemicznych badanych analitów oraz celów eksperymentalnych (jakościowych lub ilościowych). W celu kompleksowego badania metabolomu stosuje się równolegle kilka technik łączonych, a do najpopularniejszych połączeń należą chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrem mas (GC-MS) oraz chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrem mas (LC-MS). Obie te techniki są urozmaicone poprzez zastosowanie różnych źródeł jonów, analizatorów mas, trybu akwizycji i parametrów instrumentalnych [10-16].

1. GC-MS dotyczy analizy niepolarnych i lotnych związków, takich jak syntetyczne związki organiczne (pestycydy, dioksyny, kwasy organiczne), hydrofobowe produkty naturalne (alkohole) i inne (cukry, narkotyki). Jeśli badane związki są nielotne lub termolabilne, konieczna jest derywatyzacja. Proces ten wykonuje się tuż po przygotowaniu próbki i polega na reakcji chemicznej analitu z odpowiednim odczynnikiem derywatyzacyjnym, który ma za zadanie zablokować grupy polarne. Zwykle zwiększa to lotność i stabilność badanych analitów. Większość z nich wymaga długotrwałej derywatyzacji (do kilku godzin), co znacznie wydłuża czas pojedynczej analizy. Ponadto nowo wprowadzone grupy funkcyjne mogą utrudnić identyfikację substancji. W GC-MS powszechnie stosuje się dwie techniki jonizacji - jonizację elektronami (EI, ang. electron ionization) oraz jonizację chemiczną (CI, ang. chemical ionization). Stosunkowo nową techniką jonizacji stosowaną w metabolomice jest jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP, ang. inductively coupled plasma), którą wykorzystuje się do śladowej analizy pierwiastków (np. siarka, rtęć) lub związków metaloorganicznych. W technice tej można wykorzystywać różne analizatory mas, jednak w badaniu metabolitów najczęściej zastosowanie znajdują analizatory czasu przelotu (TOF, ang. time of flight) oraz analizatory rezonansu cyklotronowego z transformacją Fouriera (FT ICR, ang. Fourier transform ion cyclotron resonance). Wymienione analizatory zapewniają wysoką rozdzielczość, co skutkuje niezawodną identyfikacją metabolitów. W celu ulepszenia identyfikacji związków często wykorzystuje się też połączenie dwuwymiarowej separacji GC × GC ze spektrometrią mas. W wyniku analizy otrzymujemy widma mas, które można porównać, korzystając z bibliotek widm mas, bez konieczności rejestrowania widm dla związków wzorcowych. Skutkuje to skróceniem czasu identyfikacji metabolitów [10-16].

2. W przeciwieństwie do poprzedniej metody, LC-MS zajmuje się oznaczaniem polarnych i niepolarnych związków. Lotność i termolabilność nie mają tu znaczenia, można więc pominąć proces derywatyzacji. Istnieje wiele technik chromatografii cieczowej, lecz obecnie w połączeniach ze spektrometrami mas zastosowanie znajdują dwie techniki chromatograficzne: wysokosprawna (HPLC) i ultrawysokosprawna (UHPLC) chromatografia cieczowa. UHPLC to lepsza i bardziej zawansowana technika chromatografii cieczowej niż HPLC. Poprzez zastosowanie bardzo małych wymiarów ziaren w kolumnie (1,7 ?m) oraz wysokiego ciśnienia (60 MPa) można uzyskać większą sprawność kolumny, większą czułość, skrócenie czasu analizy oraz mniejsze zużycie odczynników. Mimo różnic obie te techniki są szeroko wykorzystywane w badaniu metabolitów [10-16].Najczęściej stosowaną fazą stacjonarną do tego typu badań jest kolumna z fazą odwróconą (RP, ang. reversed phase), w której do żelu krzemionkowego przyłączone są łańcuchy alkilowe C8 lub C18. Przy rozdzieleniu bardzo polarnych związków (np. oligosacharydy) stosuje się kolumny z wypełnieniem hydrofilowym (HILIC, ang. hydrophilic interaction liquid chromatography) oraz kolumny chromatograficzne wypełnione niemodyfikowanym żelem krzemionkowym (NP, ang. normal phase). Faza ruchoma powinna zawierać lotne rozpuszczalniki, które nie będą się osadzać we wnętrzu spektrometru mas. W tym celu stosuje się lotne dodatki, takie jak kwas mrówkowy lub octowy (0,1%), albo ich sole - octan amonu/mrówczan amonu (2-10 mmol/l). Źródło jonów LC-MS ma za zadanie wyeliminować rozpuszczalnik z eluentu LC oraz wytworzyć jony fazy gazowej z analitu. Nowe sposoby jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (API, ang. atmospheric pressure ionization) zapewniły rozwiązanie tego zadania i doprowadziły do przełomu w systemach LC-MS w zakresie technik analitycznych. Techniki API są najszerzej stosowane do wykrywania i identyfikacji metabolitów. Główne ich zalety to działanie pod ciśnieniem atmosferycznym i wytwarzanie jonów molekularnych o minimalnej fragmentacji. Do najpopularniejszych technik API należą: jonizacja typu elektrorozpylanie (ESI, ang. electrospray ionization), jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI, ang. atmospheric pressure chemical ionization) i jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod ciśnieniem atmosferycznym (API-MALDI, ang. atmospheric pressure ionization-matrix-assisted laser desorption/ionization). W technice tej można wykorzystywać różne analizatory mas, takie jak analizator czasu przelotu (TOF), wysokorozdzielczy analizator mas typu Orbitrap oraz pułapkę jonów (IT, ang. ion trap), lecz coraz częściej zastosowanie znajdują układy analizatorów w tandemowych spektrometrach mas (MS/MS), gdzie występują dwa analizatory i komora zderzeń. Do najpopularniejszych układów MS/MS należą: potrójny kwadrupol (QQQ) i analizator czasu przelotu w połączeniu z kwadrupolem (Q-TOF) (tab. 1.1) [10-16].

Techniką ściśle związaną z chromatografią jest również elektroforeza kapilarna (CE, ang. capillary electrophoresis). To stosunkowo nowa technika stosowana do oznaczania identyfikacji różnych leków, w tym antybiotyków. Elektroforeza opiera się na zjawiskach elektrokinetycznych: elektromigracji jonów, naładowanych cząstek i elektroosmozie. Zjawiska te występują w roztworach, gdy naładowane cząstki są umieszczane w polu elektrycznym, głównie o wysokim napięciu. W zależności od mechanizmu separacji wyróżnić można elektro­forezę stref kapilarnych (CZE, ang. capillary zone electrophoresis), micelarną elektrokinetyczną chromatografię kapilarną (MEKC, ang. micellar electrokinetic chromatography), elektroforezę kapilarną w układzie niewodnym (NACK, ang. non-aqueous capillary electrophoresis) oraz izotachoforezę kapilarną (CITP, ang. capillary isotachophoresis). Istotną zaletą CE jest jej dostępność i prostota wyposażenia, a także zastosowanie niewielkich stężeń rozpuszczalników organicznych w buforze oraz przede wszystkim krótki czas trwania analizy i wysoka skuteczność separacji analitów [17-19].

Większość proponowanych metod elektroforetycznego rozdzielenia antybiotyków w różnych matrycach opiera się na wykorzystaniu różnych sposobów detekcji, w tym spektrofotometrii (UV) w połączeniu z matrycą diodową (DAD), fluorescencji (FLD), detekcji elektrochemicznej (ECD) oraz fluorescencji wzbudzonej laserem (LIF) [17, 18]. Ponadto ostatnio stosowane są również inne, bardziej nowatorskie metody detekcji, takie jak bezkontaktowe wykrywanie przewodności (C4D, ang. capacitively coupled contactless conductivity detection) czy wykrywanie potencjalnego gradientu (PGD, ang. procedure design gradient) [19]. W tabeli 1.2 przedstawiono przykładowe warunki oznaczania antybiotyków z zastosowaniem technik elektromigracyjnych [20-24].

TABELA 1.1. Porównanie parametrów różnych analizatorów mas

Parametr

Kwadrupol (Q)

Pułapka jonowa (IT)

Analizator czasu przelotu (TOF)

Orbitrap

Szybkość zbierania danych [Hz]

2-10

2-10

10-100

1-18

Dokładność pomiaru masy [ppm]

Niska

Niska

1-10

1-5

Zakres pomiaru masy, m/z

< 3000

< 6000

< 100 000 bez ograniczeń

< 6000

Rozdzielczość

Jednostka

Jednostka

< 50 000

< 500 000

Zalety

Łatwa aplikacja różnych źródeł jonizacji

Szeroki zakres dynamiczny

Łatwa aplikacja różnych źródeł jonizacji

Szeroki zakres dynamiczny

MSn

Duża szybkość skanowania

Szeroki zakres mas

Duża dokładność pomiaru masy

Duża dokładność pomiaru masy

Możliwość analizy w dwóch polaryzacjach jednocześnie

Wady

Niska rozdzielczość

Mała dokładność pomiaru masy

Wąski zakres mas

Mała szybkość skanowania

MS/MS wymaga kilku analizatorów

Niska rozdzielczość

Mała dokładność pomiaru masy

Wąski zakres mas

Mała szybkość skanowania

Węższy zakres dynamiczny w porównaniu z Q

Mniejsza szybkość skanowania w porównaniu z Q-TOF

Węższy zakres dynamiczny w porównaniu z Q

MS - spektrometria mas, m/z - stosunek masy do ładunku, n - wielokrotna fragmentacja

[Źródło: na podstawie 10-16]

TABELA 1.2. Zastosowanie technik elektromigracyjnych w analizie leków

Antybiotyk

Matryca

Metoda przygotowania próbki

Technika identyfikacji

Elektrolit wiodący

Warunki detekcji

LOQ

Piśmiennictwo

Daunorubicyna

Osocze

SPE

(Sep-Pak C18, metanol)

CE/LIF

100 mmol/l wodoro­fosforan sodu, 100 mmol/l wodoro­tlenek sodu, pH 5,0

Kolumna kapilarna: 40 cm × 50 ?m, 25 kV

1 ?g/1

[20]

Cefazolina, cefamandol, cefuroksym, ceftazydym, ceftriakson, cefepim

Wydzielina oskrzeli

Liofilizacja

(-18°C, 12 godz., metanol-woda [1 : 1])

CZE/UV

25 mM tetraboran sodu, pH 9,0, dodecylosiarczan sodu (SDS)

Kolumna kapilarna: 48 cm × 50 ?m, 20 kV, 270 nm

0,42-0,84 ?g/ml

[21]

Kanamycyna

Krew

SPE

(bufor boranowy pH 10,0, metanol)

CZE/UV

30 mmol/l tetraboran sodu, pH 10,0, 16% (v/v) metanol

Kolumna kapilarna: 34 cm × 50 ?m, 23,5 kV, 355 nm

0,1 ?g/ml

[22]

Sulfametoksazol, N4-acetylosulfametoksazol

Serum

Strącanie białka

(acetonitryl)

MEKC/UV

20 mmol/l tetra­boran sodu, pH 9,3, 25 mmol/l dodecylosiarczan sodu (SDS), 5% (v/v) acetonitryl

Kolumna kapilarna: 60,2 cm × 75 ?m, 30 kV, 355 nm

0,13-0,24 ?g/ml

[23]

Sulfadiazyna, sulfatiazol, sylfadimidyna, sulfametoksazol, sulfakwinoksalina, sulfadimetoksyna

Wątroba

SPE

(acetonitryl)

MEKC/LIF

20 mmol/l (pH 5-7,5), 140 mmol/l dodecylosiarczan sodu (SDS)

Kolumna kapilarna: 54 cm × 50 mm, 20 kV, 518 nm

25 ng/g

[24]

CE/LIF - elektroforeza kapilarna z detekcją fluorescencyjną indukowaną laserem, CZE/UV - kapilarna elektroforeza strefowa z detekcją spektrofotometryczną, LOQ - granica oznaczalności, MECK/LIF - micelarna elektroforeza kapilarna z detekcją fluorescencyjną indukowaną laserem, MEKC/UV - micelarna elektroforeza kapilarna z detekcją spektrofotometryczną, SPE - ekstrakcja do fazy stałej

[Źródło: na podstawie 20-24]

1.5Dwuwymiarowa chromatografia cieczowa w analizie leków

Innowacje w syntezie chemicznej i produkcji farmaceutycznej przesuwają granice stosowania nowoczesnej chromatografii cieczowej. Coraz bardziej złożone drogi syntezy i procesy biofarmaceutyczne wymagają poprawy szybkości, selektywności i zdolności rozdzielczej sepa­racji chromatograficznych. Te procesy produkcyjne rutynowo generują próbki o różnej złożoności, które można podzielić na dwie oddzielne grupy (ryc. 1.2). W przypadku separacji skomplikowanych mieszanin związków chemicznych lub grup substancji o podobnych właściwościach fizykochemicznych (np. regio- i stereoizomery, produkty syntezy/degradacji), czy strukturalnie podobnych związków jednowymiarowe układy chromatograficzne są niewystarczające do rozdzielenia tego typu analitów. Powodem jest ograniczona tzw. pojemność pikowa (ang. peak capacity), czyli liczba pików chromatograficznych, które mogą być całkowicie rozdzielone przy użyciu danej kolumny chromatograficznej [26]. Ograniczenia tego nie da się wyeliminować poprzez modyfikację parametrów chromatograficznych. W celu osiągnięcia wyższej rozdzielczości i wydajności badanego układu chromatograficznego wykorzystuje się techniki wielowymiarowe, które polegają na łączeniu niezależnych metod/technik chromatograficznych [27].

RYC. 1.2. Rodzaje próbek w analizie ważnych związków biologicznych przy użyciu jednowymiarowych technik chromatograficznych

[Źródło: na podstawie 25]

W ciągu ostatnich kilku lat wielowymiarowe układy separacyjne okazały się bardzo obiecujące jako narzędzia do rozwiązywania problemów w analizie złożonych mieszanin [28]. Ostatnie postępy w komercyjnie dostępnym oprzyrządowaniu do dwuwymiarowej chromatografii cieczowej (2D-LC, LC × LC) zwiększyło tempo wykorzystania metodologii 2D-LC w szerokim zakresie zastosowań w przemyśle farmaceutycznym i biofarmaceutycznym [29].

Dwuwymiarowa chromatografia cieczowa jest najpowszechniej stosowaną konfiguracją chromatografii wielowymiarowej wykorzystującą dwie kolumny stanowiące odpowiednio pierwszy (1D) i drugi (2D) wymiar (ryc. 1.3). W zależności od sposobu przeniesienia próbki z pierwszego wymiaru na drugi, metoda LC × LC może pracować w układzie off-line i on-line. W trybie off-line frakcje z pierwszego wymiaru zbierane są ręcznie lub za pomocą kolektora frakcji i następnie dozowane na drugi wymiar. Zaletą jest prostota, elastyczność i efektywność separacji, dodatkowo tryb nie wymaga interfejsu - łącznika między kolumnami. Wady systemu to praco- i czasochłonność. W przypadku trybu on-line, który jest całkowicie zautomatyzowany, anality są rozdzielane w sposób ciągły poprzez zastosowanie zaworu (łącznika) służącego do przełączania kolumn. Tryb on-line oferuje zalety związane z automatyzacją systemu, wyższą precyzję, powtarzalność i stanowi bardziej odpowiednie narzędzie do analizy ilościowej. Ponadto układ on-line może pracować w systemie heart-cutting (wybrane substancje z pierwszej kolumny są wprowadzane do drugiego wymiaru) lub comprehensive (wszystkie składniki badanej próbki są poddawane separacji w obu wymiarach) [26, 30]. Tryb stop and go polega na zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej w pierwszym wymiarze do czasu zakończenia elucji analitów w drugim wymiarze [26, 31]. Na rycinie 1.4 został przedstawiony schemat pracy w układzie 2D-LC. Głównym celem w tej analizie jest znalezienie najwyższego stopnia ortogonalności między dwoma wymiarami. Najczęściej stosowanymi systemami w 2D-LC są układy faz odwróconych, które stanowią ponad 80% zastosowań [29].

RYC. 1.3. Schemat układu pomiarowego 2D-LC

[Źródło: na podstawie 26-29]

RYC. 1.4. Klasyfikacja metod w 2D-LC

[Źródło: na podstawie 30, 31]

Zainteresowanie metodą 2D-LC do celów farmaceutycznych, biofarmaceutycznych i biomedycznych znacznie wzrosło w ciągu ostatniej dekady [29]. Technologia LC × LC jest wykorzystywana do oznaczania czystości farmaceutyków, produktów degradacji i zanieczyszczeń, do rozdzielania złożonych mieszanin zawierających związki chiralne i achiralne (regio- i stereoizomery), do charakterystyki biofarmaceutyków, antybiotyków oraz ich metabolitów. Analiza biologicznie ważnych związków skupiała się głównie na wykorzystaniu trybu heart-cutting LC × LC [25, 29]. Ostatnie doniesienia literatury pokazują, że połączenie chromatografii w stanie nadkrytycznym (SFC, ang. supercritical fluid chromatography) jako drugi wymiar jest obiecującą techniką do jednoczesnego oznaczenia chiralno-achiralnych związków, antybiotyków i ich metabolitów w badaniach in vivo oraz oceny nadmiaru enancjomerycznego [32, 33]. Tabela 1.3 zawiera przegląd zastosowań 2D-LC dotyczący analizy biologicznie ważnych związków w diagnostyce medycznej.

TABELA 1.3. Zastosowanie 2D-LC w analizie leków

Analit

Matryca

Tryb 2D-LC

1D

2D

Detekcja

?-blokery

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

SEC

RP

FLD

Wankomycyna

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

RP

RP

UV

Ampicylina

Mocz

On-line (heart-cutting)

IPC

RP

FLD

Propranolol

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

IPC

RP

UV

Efletyryzyna

Tkanka

On-line (heart-cutting)

IPC

IPC

UV

Propafenon

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

IEC

RP

UV

Atenolol

Mocz

On-line (heart-cutting)

HILIC

HILIC

UV

Pimobendan, metabolity

Osocze ludzkie

Off-line

NP

NP

UV

Meflochina

Krew

On-line (heart-cutting)

NP

NP

UV

Samerydyna

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

RP

IEC

UV

Ketoprofen

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

RP

RP

MS

Sulfonamidy

Mieszanina wzorcowa

On-line (comprehensive)

RP

RP

UV

Terbutalina

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

RP

RP

EC

Ramelteon

Osocze ludzkie

On-line (heart-cutting)

RP

RP

UV

EC - detekcja elektrochemiczna, FLD - detekcja fluorescencyjna, HILIC - chromatografia oddziaływań hydrofilowych, IEC - chromatografia jonowymienna, IPC - chromatografia par jonowych, MS - spektrometria mas, NP - chromatografia w układzie faz normalnych, RP - chromatografia w układzie faz odwróconych, SEC - chromatografia wykluczania, UV - detekcja UV

[Źródło: na podstawie 29, 30]

1.6Zastosowanie elektrochemii oraz spektrometrii mas w naukach "-omicznych"

W ostatnim czasie w badaniach nad biotransformacją metaboliczną związków biologicznie aktywnych wyodrębniło się zupełnie nowe podejście, które łączy elektro­chemię (EC) i spektrometrię mas (MS). Technika ta pozwala na naśladowanie wielu typowych reakcji przebiegu fazy I i II metabolizmu, a także umożliwia identyfikację produktów elektrochemicznych, które mogą być potencjalnymi metabolitami. EC-MS stosowana jest najczęściej w badaniu metabolizmu leków [34-38].

Wiele związków w organizmie ulega utlenieniu lub redukcji, gdyż mają właściwości redoks (ponad 90% z nich). Dlatego wyjaśnienie reakcji redoks metabolizmu stanowi kluczowy punkt w dziedzinie farmakologii leków. Elektrochemia od lat stosowana jest w chemii biomedycznej do badania właściwości utleniająco-redukujących farmaceutyków. Z kolei połączenie elektrochemii ze spektrometrią mas (EC-MS) zapewnia możliwość generowania i identyfikacji produktów elektrochemicznych dla związków biologicznie aktywnych o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych. Dodatkowo wprowadzenie różnych modyfikacji, m.in. połączenia EC-MS z metodami separacyjnymi (chromatografią cieczową [LC] oraz elektroforezą kapilarną [CE]) w trybie on-line lub off-line, powoduje zwiększenie wydajności procesu degradacji, skrócenie czasu między wytworzeniem a detekcją danego metabolitu, co wiąże się z identyfikacją związków reaktywnych o krótkim czasie "życia". Metodę tę zalicza się do technik instrumentalnych, w których nie stosuje się układów biologicznych. Pozwala ona na identyfikację produktów końcowych oraz pośrednich reakcji elektrochemicznych badanych związków. Jej zaletą jest identyfikacja produktów utlenienia natychmiast po ich utworzeniu. Może być skutecznie stosowana w celu przewidywania procesu utleniania, który zapoczątkowany zostaje utlenieniem jednoelektronowym, takim jak N-dealkilacja, S-oksydacja, P-oksydacja, utlenienie alkoholi, hydroksylacja układów aromatycznych oraz dehydrogenacja. Elektrochemia nie jest korzystna w przypadku reakcji zapoczątkowanych przez bezpośrednie pozyskiwanie atomu wodoru, jak np. O-dealkilacja czy alifatyczna hydroksylacja niepodstawionych pierścieni aromatycznych, z powodu zbyt wysokiego potencjału utleniającego wymaganego dla reakcji utlenienia elektrochemicznego [34-38].

Aparatura stosowana do symulacji przemian fazy I składa się z pompy strzykawkowej, która w strzykawce zawiera tzw. fazę ruchomą (ryc. 1.5). Faza ta to ciecz, która zawiera analizowany związek (np. lek), bufor i rozpuszczalnik organiczny (w odpowiednim stosunku objętościowym bufor/rozpuszczalnik). Detekcja poprzez spektrometrię mas narzuca stosowanie odpowiednich buforów, takich jak octan amonu czy mrówczan amonu. Ustalenie wartości pH dla danego buforu i jego stosunek do rozpuszczalnika organicznego determinuje stopień przemiany elektrochemicznej, który jest indywidualny dla każdego pojedynczego związku. Pompa strzykawkowa tłoczy fazę ruchomą w określonym przepływie bezpośrednio do celki elektrochemicznej wewnątrz reaktora elektrochemicznego. W reaktorze utrzymuje się stałą określoną temperaturę oraz ustala odpowiedni potencjał dla celki elektrochemicznej. W celce zachodzą wszystkie przemiany redoks. Wykorzystuje się dwa typy celek elektrochemicznych: kulometryczną i amperometryczną - oba typy są wyposażone w zestaw trzech elektrod, składający się z elektrody pracującej, elektrody odniesienia i przeciwelektrody. Potencjał utleniania jest ustalany między przeciwelektrodą a elektrodą pracującą. Główną zaletą celki amperometrycznej jest zastosowanie różnych materiałów elektrody pracującej, m.in. elektrod złotych (Au), platynowych (Pt), węgla szklistego (GC) oraz mających ultracienką warstwę krystalicznego diamentu naniesionego na krzemie (MD) [34-38].

RYC. 1.5. Schemat układu pomiarowego (off-line/on-line EC/LC-MS/MS)

[Źródło: na podstawie 34-37]

W dziedzinie lipidomiki wykorzystano tę metodę do badania utleniania endogennego związku, jakim jest cholesterol. Produktami tego utlenienia w organizmie są różnego rodzaju oksysterole. We współczesnej medycynie oksysterolom przypisuje się negatywny wpływ na organizm (m.in. powstawanie miażdżycy, modyfikacja białek), dlatego ważne jest lepsze zbadanie ich właściwości. Podczas badań wprowadzono próbkę cholesterolu do reak­tora elektrochemicznego (EC), z kolei wytworzone produkty elektrochemiczne scharakteryzowano za pomocą LC-MS/MS. Faza ruchoma składała się z cholesterolu rozpuszczonego w buforze mrówczanu amonu (20 mmol/l) w odpowiednim stosunku do rozpuszczalnika organicznego, jakim był metanol. Pompa strzykawkowa kierowała fazę ruchomą do celki elektrochemicznej wyposażonej w elektrodę pracującą wykonaną z diamentu (MD). Produkty elektrochemiczne zostały zbadane przez bezpośrednie połączenie EC/LC-MS/MS (tryb on-line) oraz pośrednie poprzez zbieranie 6 frakcji (3 z użyciem przeciwutleniacza BHT [butylowany hydroksytoluen] oraz 3 bez niego) i w następnej kolejności wprowadzenie ich do LC-MS/MS (tryb off-line). Podczas identyfikacji uzyskanych produktów zastosowano połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) ze spektrometrem mas wyposażonym w analizator jonów QTRAP i źródłem jonów typu ESI. Zidentyfikowano dziewięć różnych form oksysteroli przez porównanie widm MS z danymi uzyskanymi dla związków wzorcowych.

W widmie masowym stwierdzono obecność 10 dodatkowych niezidentyfikowanych produktów utleniania. Może to sugerować, że dalsze badania związków generowanych elektrochemicznie pozwolą na identyfikację i charakterystykę nowych odmian dla oksysteroli [36-38].

W badaniach proteomicznych technikę EC-MS można wykorzystać do: oksydacyjnego cięcia peptydów i białek, redukcji mostków disulfidowych, znakowania określonych reszt aminokwasowych (głównie cysteiny) z elektrogenerowanymi, reaktywnymi związkami. Dużą zaletą tej metody jest to, że można uzyskać modyfikacje biomolekuł, omijając pracochłonną obróbkę enzymatyczną, długie czasy inkubacji lub etapy oczyszczania i ekstrakcji. Bezpośrednie monitorowanie utleniania peptydów i białek jest bardzo ważne ze względu na rolę oraz mechanizm uszkodzeń oksydacyjnych, które często prowadzą do różnych schorzeń. Mostki disulfidowe zwiększają złożoność wyjaśniania struktury białek przez MS. Wykazano, że redukcja elektrochemiczna stanowi szybką i skuteczną alternatywę dla cięcia wiązań disulfidowych z zastosowaniem w proteomice. Celem badania była elektrochemiczna redukcja wiązań disulfidowych dostępnego komercyjnie przeciwciała monoklonalnego (mAb) i monitorowanie badania poprzez połączenie on-line do spektrometru mas wyposażonego w źródło jonów typu ESI oraz w analizator rezonansu cyklotronowego z transformacją Fouriera (ESI-FT ICR-MS). W ten sposób mostki disulfidowe zostały zredukowane, na co wskazuje utworzenie się łańcuchów lekkich i ciężkich, które z większą selektywnością można zbadać za pomocą spektroskopii mas. Poza redukcją czterech międzyłańcuchowych wiązań disulfidowych możliwe było również zmniejszenie większej liczby wewnątrzłańcuchowych wiązań disulfidowych [36-38].

Zastosowanie EC-MS w genomice ma związek z utlenianiem kwasów nukleinowych oraz tworzeniem potencjalnych produktów przyczyniających się do powstawania stresu oksydacyjnego, a także z formowaniem się adduktów DNA. Przeprowadzone badania dotyczyły sieciowania guaniny za pomocą tyrozyny i glutationu przy zastosowaniu reaktora elektrochemicznego w połączeniu ze spektrometrem mas w trybie on-line (EC-ESI-MS) z jonizacją ESI w trybie jonów dodatnich za pomocą analizatora FT ICR o wysokiej rozdzielczości [36-38].

Jednak to w metabolomice technika ta jest obecnie najszerzej wykorzystywana. Metoda EC-MS jest szczególnie przydatna do naśladowania reakcji biotransformacji oraz badania właściwości redoks małych cząsteczek bioorganicznych. Liczne publikacje wskazują, że najczęściej stosuje się ją w celu symulacji metabolizmu leków. Ze względu na mnogość wykorzystywania tej techniki, przykładowe zastosowania zamieszczono w tabeli 1.4 [38-46].

TABELA 1.4. Przykładowe zastosowanie EC-MS w symulacji metabolizmu leków

Związek

Technika analityczna

Warunki elektrochemiczne

Elektroda pracująca

Zidentyfikowane produkty elektrochemiczne

Piśmiennictwo

Metimazol

EC-ESI-MS

Lek w 20% metanolu oraz 80% 20 mmol/l buforu mrówkowego (pH 2,75); w 20% metanolu oraz 80% 50 mmol/l buforu fosforanowego (pH 7,4); w 20% metanolu oraz 80% 20 mmol/l buforu amonowego (pH 10,2); szybkość przepływu 10 ?l/min

GC

Metimazolowy kwas sulfenowy, metimazolowy kwas sulfinowy i metimazolowy kwas sulfonowy

[38]

Lidokaina

LC-(APCI)-MS/MS

10 mmol/l lidokainy rozpuszczone w ACN lub ACN/H2O, 99/1 (v/v); szybkość przepływu 10 ?l/min

Au

Po procesie N-dealkilacji, N-oksydacji, hydroksylacji aromatycznej oraz produktów benzylowej hydroksylacji

[39]

Klozapina

EC-LC-ESI-MS

20 mmol/l roztwory w różnych zakresach pH, stosując mrówczan amonu/kwas mrówkowy (pH 3), octan amonu/kwas octowy (pH 5) i octan amonu/wodorotlenek amonu (pH 7) z różną zawartością ACN

GC

N-tlenek klozapiny, hydroksyklozapina, klozapina + zredukowany glutation

[40]

Tetrazepam

EC-LC-ESI-MS

100 ?M roztwór tetrazepamu w 10 mmol/l roztworze kwasu mrówkowego; szybkość przepływu 10 ?l/min

GC, Pt, Au

Diazepam

[41]

Tyroksyna

EC-LC-ESI-MS

1 : 1 MeOH i 0,1% roztwór kwasu mrówkowego; szybkość przepływu 10 ?l/min

MD

[C16H13O5NI3]+, [C7H5OI2]+, [C7H5O2I2]+

[42]

Fezoterodyna

EC-UHPLC-MS

Mieszanina buforu o pH 4 lub 7 i metanolu (1 : 1, v/v); szybkość przepływu 10 ?l/min

GC

N-desizopropylowana fezoterodyna, 5-formylofezoterodyna

[43]

Metoprolol, propranolol, propafenon, meksyletyna, oksprenolol, pirbuterol, pindolol, acebutolol, atenolol

EC-UHPLC-ESI-MS/MS

Roztwory w różnych zakresach pH oraz stężeniu, stosując mrówczan amonu/kwas mrówkowy (pH 3,5), octan amonu/kwas octowy (pH 6) i octan amonu/wodorotlenek amonu (pH 10) z różną zawartością ACN

MD

Po procesie N-dealkilacji, N-oksydacji oraz hydroksylacji aromatycznej

[44]

Rywaroksaban, aliskiren, prasugrel

EC-UHPLC-ESI-MS/MS

10 mmol/l mrówczan amonu (pH 7,4) : ACN (50 : 50)

MD

Po procesie N-de­alkilacji, N-oksydacji oraz hydroksylacji aromatycznej

[45]

Amoksycylina, cefotaksym, flukonazol, linezolid, metronidazol, moksyfloksacyna

HPLC-ESI-MS/MS

Roztwory w różnych zakresach pH oraz stężeniu, stosując mrówczan amonu/kwas mrówkowy (pH 3,5), octan amonu/kwas octowy (pH 7,4) i octan amonu/wodorotlenek amonu (pH 10,2) z różną zawartością ACN

Au, GC, MD, Pt

Po procesie N-dealkilacji, N-oksydacji oraz hydroksylacji aromatycznej

[46]

ACN - acetonitryl, Au - złota elektroda pracująca, EC-ESI-MS - połączenie elektrochemii i spektrometrii mas z jonizacją typu elektrorozpylanie, EC-LC-ESI-MS - połączenie elektrochemii, chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z jonizacją typu elektrorozpylanie, EC-UHPLC-ESI-MS/MS - połączenie elektrochemii, ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas z jonizacją typu elektrorozpylanie, EC-UHPLC-MS - połączenie elektrochemii, ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, GC - elektroda pracująca wykonana z węgla szklistego, HPLC-ESI-MS/MS - połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas, LC-(APCI)-MS/MS - połączenie chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z jonizacją chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym, MD - elektroda pracująca mająca ultracienką warstwę krystalicznego diamentu naniesionego na krzemie, Pt - platynowa elektroda pracująca

[Źródło: na podstawie 38-46]

1.7Biologiczne systemy in vitro do badania metabolizmu leków

Podstawowym pytaniem dotyczącym badań nad przemianami metabolicznymi związków biologicznie aktywnych w ludzkim organizmie jest to, w jaki sposób skorelować ze sobą wyniki eksperymentów in vitro z badaniami in vivo w praktyce klinicznej. W metabolizmie leków zastosowanie znajdują liczne modele in vitro, jak hepatocyty, enzymy wątrobowe frakcji mikrosomalnej, pojedyncze frakcje cytoplazmatyczne czy rekombinowane systemy enzymatyczne. Stąd cały czas trwają poszukiwania nowych, alternatywnych metod w celu poznania nowych metabolitów związków biologicznie aktywnych. Opracowano różne układy modelowe, które in vitro naśladują procesy metaboliczne. Ustalone metody symulacji metabolizmu oksydacyjnego polegają na wykorzystaniu narządów ludzkich lub zwierzęcych, które mają enzymy z grupy cytochromu P450 [47-50].

W praktyce stosuje się mikrosomy wyizolowane z ludzkiej wątroby, frakcję cytosolową oraz frakcję S9 ludzkiej wątroby, a także hepatocyty, głównie pierwotne ludzkie hepatocyty. Każdy z tych systemów ma jednak swoje wady. Najlepsze wyniki osiąga się, wykorzystując pierwotne hepatocyty, które w pełni pozwalają odtworzyć szlaki biotransformacji, jakim podlega lek. Jednak krótki czas życia oraz genetyczna niestabilność pierwotnych hepatocytów uniemożliwia prowadzenie badań w szerszym zakresie. Z kolei w wyizolowanych komórkach wątroby lub mikrosomach nie zawsze dochodzi do ekspresji wszystkich enzymów metabolizujących lub ich poziom jest zbyt niski, aby efektywnie badać ich rolę [48, 49].

Do badania metabolizmu leków wygodnym modelem są systemy ekspresyjne, do których należą: bakterie, drożdże, komórki owadów i ssaków. Pierwszymi modelami komórkowymi, które posłużyły do otrzymania rekombinowanych enzymów cytochromu P450, były komórki bakteryjne. Później zastosowano również komórki drożdżowe i owadzie. Wadą tych systemów jest to, że w nieco inny sposób niż w komórkach ludzkich przebiegają w nich procesy transkrypcji, translacji oraz potranslacyjna modyfikacja białka [48, 49]. Ponadto poziom pozostałych enzymów metabolizujących leki jest inny bądź zmieniony. Powszechnym stało się zatem zastosowanie stabilnych linii komórek nowotworowych. Najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi otrzymanymi z ludzkich nowotworów są: linia HepG2 (wyprowadzona z nowotworu wątroby) oraz Caco-2 (z nowotworu okrężnicy) [50], która ze względu na obecność enzymów metabolizujących I i II fazy jest powszechnie stosowana w badaniach przemian metabolicznych wielu leków i ksenobiotyków. Badania te wymagają początkowo określenia odpowiednich warunków prowadzenia reakcji poprzez dobór: liczby komórek, stężenia badanego związku oraz czasu jego inkubacji z komórkami [50]. Badania wpływu ekspozycji w czasie kultury Caco-2 na testowane związki dowodzą, iż komórki nabłonka jelitowego mogą uaktywniać procesy prowadzące do biotransformacji leku. W badaniach stosuje się specjalne naczynie hodowlane zbudowane w formie zamkniętego, dwukomorowego pojemnika. Między górną a dolną komorą jest umieszczona poziomo porowata membrana, na której rozwija się kultura komórek nabłonkowych. Zarówno górna (apikalna) komora, jak i dolna (podstawna) wypełnione są pożywką hodowlaną. Pożywka po stronie apikalnej ma pH 6,5, a po stronie podstawnej 7,4, co lepiej symuluje warunki in vivo.

Komórki Caco-2 produkują enzymy: disacharydazy, peptydazy, izoenzymy CYP450, transferazę-S-glutationową, sulfotransferazę i glukuronidazę, a także białka transportowe, wytwarzane przez komórki absorbujące nabłonka, biorące udział w transporcie cukrów, aminokwasów, peptydów i witamin, oraz P-glikoproteinę i białka oporności wielolekowej związane z transportem i metabolizmem leków. Ponadto komórki tej linii produkują na swojej powierzchni od strony apikalnej niewielkie ilości śluzu jelitowego [50]. Hodowle komórek nabłonkowych przeprowadza się w temperaturze 37°C w specjalnych inkubatorach z regulowaną atmosferą gazów, aby zawierały one 5% CO2, co imituje stężenie tego gazu we krwi. Odpowiednia wilgotność zabezpiecza kulturę przed wysychaniem [50].

1.8Podsumowanie

Leczenie spersonalizowane to jedno z najważniejszych osiągnięć współczesnej medycyny. Aby dziedzina ta mogła się rozwijać, niezbędna jest współpraca specjalistów z obszaru biologii, genetyki, biotechnologii, bioinformatyki, farmakologii ze środowiskiem lekarskim. Prowadzi to do innowacyjnego podejścia w profilaktyce i leczeniu poprzez polepszenie bądź dostosowanie terapii farmakologicznej do indywidualnych potrzeb pacjentów, tzw. celowana terapia farmakologiczna, "terapia szyta na miarę".

Rozwój technik chromatograficznych i połączenie ich z czułymi metodami detekcji umożliwia oznaczanie i identyfikację związków biologicznie aktywnych w próbkach biologicznych celem klinicznego diagnozowania schorzeń oraz stanów chorobowych. Ponadto metoda ta jest wykorzystywana w przedklinicznych badaniach toksyczności potencjalnych substancji leczniczych. Obecnie najbardziej popularną techniką w analizie leków i ich metabolitów jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC lub UHPLC) sprzężona ze spektrometrią mas (QQQ, TOF-MS, MALDI). Połączenie to jest najczęściej stosowane ze względu na możliwość uzyskania bardzo niskiej granicy wykrywalności, dobrej selektywności, dokładności oraz precyzji oznaczeń.

Nacisk na rozwój procedur analitycznych umożliwiających analizę niskocząsteczkowych substancji organicznych jest coraz większy. Dlatego ważnym celem jest opracowanie nowych metod oznaczania i identyfikacji dużej liczby związków biologicznie aktywnych, będących użytecznym narzędziem dla potrzeb rutynowej terapii monitorowanej i badań farmakokinetycznych. Uwzględniając powyższe przesłanki, prowadzone badania były ukierunkowane na opracowanie nowych metod wykrywania i oznaczania leków oraz ich metabolitów w materiale biologicznym.

Rozwój farmakokinetyki, ze szczególnym naciskiem na metabolizm farmaceutyków, zmienia podejście lekarzy do problemu dawkowania leku. Coraz częściej przy jego ustalaniu bierze się pod uwagę zdolność organizmu pacjenta do metabolizowania i wydalania leków. Stąd konieczność opracowywania nowych metod analitycznych mających ułatwić monitorowanie płynów ustrojowych na zawartość leków i ich metabolitów.

Podziękowanie

Podziękowania dla projektu badawczego Narodowego Centrum Nauki (Kraków, Polska) w ramach grantu Sonata 12, nr 2016/23/D/ST4/00305 (2017-2020).

Piśmiennictwo

1. Riedmaier I., Becker Ch., Pfaffl M.W., Meyer H.H.D., The use of omic technologies for biomarker development to trace functions of anabolic agents. J Chromatogr A, 1216: 8192-8199, 2009

2. Kell D.B., Goodacre R., Metabolomics and systems pharmacology: why and how to model the human metabolic network for drug discovery. Drug Discovery Today, 19: 171-182, 2014

3. Pinero J., Furlong L.I., Sanz F., In silico models in drug development: where we are. Curr Opin Pharm, 42: 111-121, 2018

4. Wicha S.G., Kloft Ch., Quantitative systems pharmacology in model-informed drug development and therapeutic use. Curr Opin Sys Biol, 10: 19-25, 2018

5. Dingemanse J., Krause A., Impact of pharmacokinetic-pharmacodynamic modelling in early clinical drug development. Eur J Pharm Sci, 109S: S53-S58, 2017

6. Nowak P.M., Woźniakiewicz Ł., Kościelniak P., Simulation of drug metabolism. TrAC Trends Anal Chem, 59: 42-49, 2014

7. Aucella F., Lauriola V., Vecchione G. i wsp., Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method as the golden standard for therapeutic drug monitoring in renal transplant. J Pharm Biomed Anal, 86: 123-126, 2013

8. Kang J.S., Lee M.H., Overview of therapeutic drug monitoring. Korean J Intern Med, 24: 1-10, 2009

9. Szultka M., Papaj K., Rusin A. i wsp., Determination of flavonoids and their metabolites by chromatographic techniques. TrAC Trends Anal Chem, 47: 4-6, 2013

10. Szultka-Młyńska M., Pomastowski P., Buszewski B., Application of solid phase microextraction followed by liquid chromatography-mass spectrometry in the determination of antibiotic drugs and their metabolites in human whole blood and tissue samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1086: 153-165, 2018

11. Dias E., Hachey B., McNaughton C. i wsp., An LC-MS assay for the screening of cardiovascular medications in human samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 937: 44-53, 2013

12. Tszyrsznic W., Borowiec A., Pawlowska E. i wsp., Two rapid ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC/MS/MS) methods with common sample pretreatment for therapeutic drug monitoring of immunosuppressants compared to immunoassay. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 928: 9-15, 2013

13. Sahi J., Grepper S., Smith C., Hepatocytes as a tool in drug metabolism, transport, and safety evaluations in drug discovery. Curr Drug Discov Technol, 7: 188-198, 2010

14. Mullett W.M., Determination of drugs in biological fluids by direct injection of samples for liquid-chromatographic analysis. J Biochem Biophys Methods, 70: 263-273, 2007

15. Gowda D.A.N., Djukovic D., Overview of mass spectrometry-based metabolomics: opportunities and challenges. Methods Mol Biol, 1198: 3-12, 2014

16. Martis E.A., Ahire D.C., Singh R.O., Drug Designing, Discovery and Development Techniques. Intern J Pharm Pharm Sci Res, 1: 67-74, 2011

17. Mallampati S., Pauwels J., Hoogmartens J., Van Schepdael A., 12 CE in impurity profiling of drugs. Sep Sci Technol, 9: 259-315, 2008

18. Kitagawa F., Otsuka K., Recent progress in capillary electrophoretic analysis of amino acid enantiomers. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 879: 3078-3095, 2011

19. Paul P., Sänger-van de Griend C., Adams E., Van Schepdael A., Recent advances in the capillary electrophoresis analysis of antibiotics with capacitively coupled contactless conductivity detection. J Pharm Biomed Anal, 158: 405-415, 2018

20. Griese N., Blaschke G., Boos J., Hempel G., Determination of free and liposome-associated daunorubicin and daunorubicinol in plasma by capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 979: 379-388, 2002

21. Andrási M., Gáspár A., Klekner Á., Analysis of cephalosporins in bronchial secretions by capillary electrophoresis after simple pretreatment. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 846: 355-358, 2007

22. Long Y.H., Hernandez M., Kaale E., Determination of kanamycin in serum by solid-phase extraction, pre-capillary derivatization and capillary electrophoresis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 784: 255-264, 2003

23. Berzas Nevado J.J., Casta?eda Pe?alvo G., Guzman Bernardo F.J., Micellar electrokinetic chromatography method for the determination of sulfamethoxazole, trimethoprim and their main metabolites in human serum. J Sep Sci, 28: 543-548, 2005

24. Barcellos-Hoff R., Barreto F., Ledur-Kist T.B., Use of capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection to screen and liquid chromatography-tandem mass spectrometry to confirm sulfonamide residues: Validation according to European Union 2002/657/EC. J Chromatogr A, 1216: 8254-8261, 2009

25. Zhang K., Wang J., Tsang M. i wsp., Two-dimensional HPLC in pharmaceutical analysis. Am Pharm Rev, 16: 39-44, 2013

26. Jandera P., Comprehensive two-dimensional liquid chromatography - practical impacts of theoretical considerations. A review. Cent Eur J Chem, 10: 844-875, 2012

27. Stoll D.R., Introduction to two-dimensional liquid chromatography - Theory and practice. Handbook of Advanced Chromatography/Mass Spectrometry Techniques. Academic Press, Beltsville, Maryland (United States): 227-286, 2017

28. Stoll D.R., Carr P.W., Two-dimensional liquid chromatography: A state of the art tutorial. Anal Chem, 89: 519-531, 2017

29. Iguiniz M., Heinisch S., Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications. J Pharm Biomed Anal, 145: 482-503, 2017

30. Pirok B.W.J., Stoll D.R., Schoenmakers P.J., Recent developments in two-dimensional liquid chromatography: Fundamental improvements for practical applications. Anal Chem, 91: 240-263, 2019

31. Dugo P., Fawzy N., Cichello F. i wsp., Stop-flow comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection for phospholipid analysis. J Chromatogr A, 1278: 46-53, 2013

32. D'Atri V., Fekete S., Clarke A. i wsp., Recent Advances in Chromatography for Pharmaceutical Analysis. Anal Chem, 91: 210-239, 2019

33. Goela M., Larsonb E., Venkatramania C.J., Al-Sayah M.A., Optimization of a two-dimensional liquid chromatography-supercritical fluid chromatography-mass spectrometry (2D-LC-SFC-MS) system to assess "in-vivo" inter-conversion of chiral drug molecules. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1084: 89-95, 2018

34. Bussy U., Boisseau R., Thobie-Gautier Ch., Boujtita M., Electrochemistry-mass spectrometry to study reactive drug metabolites and CYP450 simulations. TrAC Trends Anal Chem, 70: 67-73, 2015

35. Karst U., Electrochemistry/Mass Spectrometry (EC/MS)-A New Tool To Study Drug Metabolism and Reaction Mechanisms. Angew Chem, 43: 2476-2478, 2004

36. Lohmann W., Baumann A., Karst U., Electrochemistry and LC-MS for Metabolite Generation and Identification: Tools, Technologies and Trends. LC-GC Europe, 28(6): 470-478, 2010

37. Permentier H.P., Bruins A.P., Bischoff R., Electrochemistry-mass spectrometry in drug metabolism and protein research. Mini-Rev Med Chem, 8: 46-56, 2008

38. Chipiso K., Simoyi R.H., Electrochemistry-coupled to mass spectrometry in simulation of metabolic oxidation of methimazole: Identification and characterization of metabolites. J Electroanal Chem, 761: 131-140, 2016

39. Nouri-Nigjeh E., Permentier H.P., Bischoff R., Bruins A.P., Lidocaine Oxidation by Electrogenerated Reactive Oxygen Species in the Light of Oxidative Drug Metabolism. Anal Chem, 82: 7625-7633, 2010

40. van Leeuwen S.M., Blankert B., Kauffmann J.M., Karst U., Prediction of clozapine metabolism by on-line electrochemistry/liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 382: 742-750, 2005

41. Baumann A., Lohmann W., Schubert B. i wsp., Metabolic studies of tetrazepam based on electrochemical simulation in comparison to in vivo and in vitro methods. J Chromatogr A, 1216: 3192-3198, 2009

42. Kong C., Christoph M., Wehea A. i wsp., Identification and quantification of electrochemically generated metabolites of thyroxine by means of liquid chromatography/electrospray-mass spectrometry and counter gradient liquid chromatography/inductively coupled plasma-mass spectrometry. J Chromatogr A, 1419: 81-88, 2015

43. Kučerová P., Skopalová J., Kučera L. i wsp., Electrochemical oxidation of fesoterodine and identification of its oxidation products using liquid chromatography and mass spectrometry. Electrochim Acta, 159: 131-139, 2015

44. Szultka-Młyńska M., Bajkacz S., Baranowska I., Buszewski B., Structural characterization of electrochemically and in vivo generated potential metabolites of selected cardiovascular drugs by EC-UHPLC/ESI-MS using an experimental design approach. Talanta, 176: 262-276, 2018

45. Szultka-Młyńska M., Bajkacz S., Kaca M. i wsp., Electrochemical simulation of three novel cardiovascular drugs phase I metabolism and development of a new method for determination of them by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1093-1094: 100-112, 2018

46. Szultka-Mlynska M., Buszewski B., Electrochemistry-mass spectrometry for in-vitro determination of selected chemotherapeutics and their electrochemical products in comparison to in-vivo approach. Talanta, 160: 694-703, 2016

47. Wienkers L.C., Heath T.G., Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat Rev Drug Discov, 4: 825-833, 2005

48. Guengerich F.P., Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J, 8: 101-111, 2006

49. Asha S., Vidyavathi M., Role of human liver microsomes in in vitro metabolism of drugs-a review. Appl Biochem Biotechnol, 160: 1699-1722, 2010

50. Artursson P., Palm K., Luthman K., Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Adv Drug Deliv Rev, 46: 2-43, 2001

2Badania proteomiczne w diagnostyce chorób neurodegeneracyjnych

Ewa BULSKA, Marta BICKA, Andrzej GAWOR, Adam KARPIŃSKI, Anna KONOPKA

2.1Wprowadzenie

Złożoność ośrodkowego układu nerwowego (OUN) od dziesięcioleci utrudnia jego systematyczne badanie. Potężny rozwój technologii badawczych oraz badań z grupy "-omicznych", takich jak genomika, transkryptomika, proteomika i metabolomika, zwiększają możliwość pozyskiwania nowych informacji o ośrodkowym układzie nerwowym. Szczególną uwagę poświęca się analizie całego proteomu, czyli jakościowej i ilościowej charakterystyce wszystkich białek znajdujących się w danej komórce czy też tkance, interakcjom białek z innymi biomolekułami, roli jaką odgrywają w stanach fizjologicznych i patologicznych, a także analizie modyfikacji posttranslacyjnych. W niniejszym rozdziale przedstawiono przegląd postępów w badaniach proteomicznych z wykorzystaniem technik spektrometrii mas (MS) w kontekście analizy białek zaangażowanych w rozwój chorób neurodegeneracyjnych.

2.2Podstawy biologiczne chorób neurodegeneracyjnych

Rozwój chorób neurodegeneracyjnych może być spowodowany dużą liczbą różnorodnych czynników - zmianami genetycznymi, nieprawidłowym funkcjonowaniem białek, w tym neuroreceptorów i kanałów jonowych, akumulacją białek w cytoplazmie, ale i sam fakt starzenia się organizmu może wpływać na potencjalny rozwój tych schorzeń. Badania prowadzone z udziałem gryzoni, małp oraz ludzi konsekwentnie pokazują, że istnieje zależność między wiekiem a spadkiem zdolności poznawczych (ang. cognitive decline/impairment), który jest spowodowany zmianami wielu procesów zaangażowanych w prawidłowe funkcjonowanie mózgu. Badania skupiające się na katalogowaniu zmian zachodzących w systemach połączeń komórkowych opisują i wyszczególniają konkretne defekty występujące w starzejącym się mózgu, do których zalicza się spadek mechanizmów kontroli jakości wielu białek, a także w wydajności działania mitochondriów i w ścieżkach naprawy uszkodzeń DNA. Co istotne, zmiany te w dużym stopniu przyczyniają się do powstania środowiska komórkowego podatnego na neurodegenerację. Warto podkreślić, że istnieją zasadnicze różnice między zmianami związanymi ze spadkiem zdolności poznawczych w zdrowym, starzejącym się mózgu a w mózgu dotkniętym neurodegeneracją. Mózg, w którym zachodzą zmiany zwyrodnieniowe, wykazuje znaczące poziomy śmierci neuronów w porównaniu ze zdrowym, lecz starzejącym się mózgiem - sugeruje to, że u podstaw spadku zdolności poznawczych w przypadku chorób neurodegeneracyjnych leżą dodatkowe mechanizmy i zmiany, które nie są obserwowane w zdrowych, starzejących się mózgach. Warto również zauważyć, że u większości starszych osób spadek zdolności poznawczych nie jest znaczący. Kluczowe czynniki różnicujące prawidłowo funkcjonujące, lecz starzejące się mózgi od tych ze znacznym spadkiem zdolności poznawczych, ale niezwiązanym z neurodegeneracją, pozostają nieznane.

Wspólną cechą większości chorób neurodegeneracyjnych jest nagromadzanie agregatów białek w mózgu. Dużą liczbę tych schorzeń zalicza się do grupy proteinopatii - chorób związanych z akumulacją toksycznych agregatów białek w wyniku zmian konformacyjnych w ich strukturze. Inny mechanizm jest zaangażowany w rozwój choroby Creutzfeldta-Jakoba, gdzie obserwuje się wzrost poziomu nieprawidłowo sfałdowanych prionów [1]; choroby Huntingtona - nagromadzenie zmutowanego białka, nazwanego huntingtyna (od nazwiska Huntingtona) [2]; choroby Parkinsona - depozyty ?-synukleiny [3]; choroby Alzheimera - akumulacja zewnątrzkomórkowych płytek polimerów ?-amyloidu oraz wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych (ang. neurofibrillary tangles) białka Tau [4]; stwardnienia zanikowego bocznego oraz otępienia czołowo-skroniowego - akumulacja białka TDP-43 w postaci ubikwitynylowanych inkluzji [5]. Powstawanie tych białkowych agregatów jest procesem powolnym, trwającym często dekady, który wiąże się z systematycznym uszkadzaniem "maszynerii" do składania białek, ścieżkami degradacji ubikwityna-proteasom i autofagii - biologicznego procesu polegającego na kontrolowanym rozkładzie przez komórkę cząsteczek chemicznych, fragmentów komórki i organelli komórkowych. Powstawanie białkowych agregatów zajmuje wiele lat, ich odkładanie w starzejącym się mózgu jest prawdopodobnie przyspieszone z powodu spadku wydajności wyżej przedstawionych ścieżek, która wraz z wiekiem organizmu staje się coraz niższa. Powstałe agregaty białkowe są toksyczne dla lokalnych neuronów, a ich obecność powoduje rozpowszechnienie zaburzenia prawidłowego działania synaps, ich utratę i w konsekwencji śmierć komórek nerwowych. Bezpośrednie mechanizmy toksyczności zostały szeroko zbadane i obejmują nieprawidłową aktywację neuro­receptorów dla glutaminianu, reaktywną mikroglejozę - nienowotworowy przerost i rozrost gleju gwiaździstego, wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species). Toksyczne agregaty białkowe wywierają również szkodliwy wpływ na neurony poprzez mechanizmy pośrednie, takie jak jednoczesne hamowanie degradacji proteasomalnej uszkodzonych białek i indukowanie odpowiedzi na białko niesfałdowane (UPR, ang. unfolded protein response). Te zaburzenia powodują stres siateczki śródplazmatycznej (ER, ang. endoplasmic reticulum), wpływają na nieprawidłowe funkcjonowanie mitochondrium i ostatecznie obniżają biosyntezę białek do poziomu, który uniemożliwia wsparcie prawidłowego funkcjonowania synaps [6].

W literaturze można znaleźć wiele przykładów zastosowania spektrometrii mas w analizie proteomicznej próbek klinicznych w odniesieniu do badań poświęconych chorobom neurodegeneracyjnym. W większości przypadków takie badania skupiają się na poszukiwaniu białek o zmienionej ekspresji w próbkach z grupy doświadczalnej (grupy pacjentów) w porównaniu z grupą kontrolną (osoby zdrowe). Stosowana jest przy tym analiza proteomiczna płynów ustrojowych, m.in. krwi [7] oraz płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF, ang. cerebrospinal fluid) [8, 9], pobranych od pacjentów cierpiących na różne choroby neurodegeneracyjne. Szczególnie istotna jest analiza płynu mózgowo-rdzeniowego, ponieważ znajduje się on w bezpośrednim kontakcie z ośrodkowym układem nerwowym, a w obecności bariery krew-mózg następuje wymiana cząsteczek między nim a krwią. Dzięki temu CSF może być potencjalnym źródłem biomarkerów chorób neurodegeneracyjnych, na podstawie których możliwe byłoby wcześniejsze rozpoznanie występowania stanu patologicznego, co wiązałoby się z wcześniejszym rozpoczęciem leczenia i możliwością zastosowania potencjalnie skuteczniejszej terapii. W przypadku analizy próbek tkanek mózgów pobranych post-mortem szczególną uwagę zwraca się na białka biorące udział w tym procesie biologicznym [10], z którym związana jest patogeneza czy rozwój choroby.

Istotne są również zaburzenia w prawidłowym funkcjonowaniu danego neuroreceptora [11], co może prowadzić do ekscytotoksyczności i śmierci komórki. Badania proteomiczne płynów ustrojowych osób cierpiących na choroby neurodegeneracyjne oraz tkanek mózgów pobranych od pacjentów post-mortem są istotne ze względu na możliwość identyfikacji nowych biomarkerów badanych schorzeń oraz - jak wspomniano już wcześniej - zrozumienia podstaw ich patogenezy, co może wspomóc wcześniejszą i skuteczniejszą terapię. Biorąc pod uwagę starzenie się społeczeństwa, liczba osób cierpiących na schorzenia neurodegeneracyjne stale rośnie.

2.3Spektrometria mas (MS) w analizie proteomicznej

Spektrometria mas to technika analityczna zaliczana do technik spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) dla danego jonu. Pierwszy spektrometr mas powstał w 1911 roku w laboratorium Josepha Johna Thomsona. Obecnie MS należy do najbardziej rozpowszechnionych i najprężniej rozwijających się technik analitycznych. Istnieje wiele jej odmian, z których każda posiada inne zastosowanie i wymaga spektrometrów o różnej budowie i charakterystyce. Spektrometria mas jest niezbędnym narzędziem w chemii, biochemii, analityce środowiska, farmacji i medycynie. Pozwala identyfikować strukturę i skład pierwiastkowy związków chemicznych w badanej próbce. Rozwój MS pozwolił również na precyzyjne ustalanie składu chemicznego związków o dużej masie molowej i poznawanie sekwencji aminokwasowych białek [12, 13].

Analiza proteomiczna złożonych próbek naturalnych przy zastosowaniu wysokorozdzielczej spektrometrii mas jest kilkuetapowym procesem obejmującym:

- przygotowanie próbki do pomiaru;

- rozdzielenie chromatograficzne mieszaniny białek lub peptydów;

- analizę poszczególnych składników próbki;

- interpretację otrzymanych wyników.

Początkowym etapem każdej analizy proteomicznej jest proces mający na celu izolację białek z lizatu komórkowego lub tkankowego. W przypadku ośrodkowego układu nerwowego funkcjonalna i morfologiczna heterogeniczność komórek stanowi ogromne wyzwanie dla poszczególnych etapów tej analizy, a zwłaszcza procesu przygotowania próbki do pomiaru analitycznego. Przygotowanie tego rodzaju próbki biologicznej wymaga starannej i czystej pracy laboratoryjnej w celu zminimalizowania zanieczyszczeń (zwłaszcza o charakterze białkowym) czy usunięcia czynników mających wpływ na ekspresję badanego białka. Wiele białek OUN bierze udział w procesach błonowych, takich jak sygnalizacja receptor-neuroprzekaźnik lub adhezja komórkowa. Uwzględniając niskie stężenia i specyficzne właściwości fizykochemiczne takich białek, konieczny jest odpowiedni dobór warunków lizy komórkowej i trawienia enzymatycznego, aby zapewnić ich efektywne rozpuszczenie [14].

2.3.1Strategie w identyfikacji białek

W przypadku analizy proteomicznej możemy mówić o dwóch głównych strategiach analizy białek - top-down oraz bottom-up, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia w zakresie identyfikacji oraz analizy ilościowej białek, a także analizy modyfikacji posttranslacyjnych [15].

Strategia top-down to analiza nienaruszonych białek o pełnej sekwencji aminokwasowej, tzw. białek nietkniętych (ang. intact proteins). W tym przypadku białka, bez uprzedniego trawienia, są frakcjonowane, a następnie wprowadzane do spektrometru mas, gdzie zostają poddane procesom jonizacji, fragmentacji oraz analizie na podstawie wartości ich stosunku masy do ładunku (m/z). Przeprowadzone w ten sposób badanie pozwala na pomiar masy całego, uprzednio zjonizowanego białka, jak i mas poszczególnych jonów fragmentacyjnych, na podstawie których przeprowadza się identyfikację. Dzięki zastosowaniu strategii top-down możliwa jest identyfikacja białek dotąd nieznanych, których sekwencji aminokwasowej nie ma w bazach białkowych (tzw. sequencing de novo). Dodatkowo, to podejście analityczne umożliwia także pełną charakterystykę proteoform - czyli wszystkich różnych form, w których może występować kodowane przez konkretny gen białko. Proteoform określa zmiany w strukturze białka spowodowane zmianami genetycznymi, a także zmianami, które zaszły z powodu alternatywnego składania RNA i posttranslacyjnej modyfikacji białek. Zaletą strategii top-down jest dostęp do pełnej sekwencji białka oraz możliwość identyfikacji i dokładnej charakterystyki jego wszystkich posttranslacyjnych modyfikacji oraz obecnych w próbce izoform. Mimo licznych zalet strategia ta ma też swoje ograniczenia, jednym z nich jest możliwość stosowania do analizy stosunkowo małych białek (poniżej 30 kDa). Ze względu na brak efektywnych metod rozdzielania złożonych mieszanin białkowych, strategia analizy proteomicznej top-down jest najczęściej wykorzystywana do analizy proteomicznej pojedynczych białek lub ich mało złożonych mieszanin.

Biorąc pod uwagę podane ograniczenia techniczne uniemożliwiające zastosowanie strategii top-down do analizy złożonych mieszanin białek, do globalnej analizy całego proteomu najczęściej stosuje się podejście analityczne bottom-up [16]. W tym przypadku przeprowadzana jest analiza peptydów powstałych w trakcie procesu trawienia białek enzymem proteolitycznym. Do identyfikacji białka nie jest konieczna znajomość sekwencji aminokwasowych wszystkich peptydów powstających w wyniku trawienia enzymatycznego tego białka - wystarczy zidentyfikować peptyd charakterystyczny (ang. unique peptide), czyli taki, który występuje jedynie w tym białku.

Proces przygotowania próbki do analizy proteomicznej przy wykorzystaniu strategii bottom-up jest bardziej złożony niż w przypadku strategii top-down. Przykładowo, często, gdy badane są białka pochodzące z lizatu tkanki mózgowej, niezbędne jest przeprowadzenie dodatkowej ekstrakcji białek w układzie ciecz-ciecz, np. z zastosowaniem mieszaniny chloroform-metanol-woda [17]. Tego typu ekstrakcja umożliwia usunięcie z próbki lipidów występujących w dużych ilościach w tkance mózgowej, których obecność w próbce utrudnia przeprowadzenie efektywnego rozdzielenia chromatograficznego peptydów otrzymanych po enzymatycznym trawieniu białek. Podczas ekstrakcji związki niepolarne, m.in. lipidy, przechodzą do fazy organicznej (chloroform), natomiast związki polarne, m.in. kwasy nukleinowe, sole - do fazy wodnej (metanol-woda). Z kolei białka, ze względu na właściwości amfifilowe, ustawiają się grupami hydrofilowymi w kierunku fazy wodnej, a grupami hydrofobowymi w kierunku fazy organicznej, dzięki czemu pozostają na granicy faz, co umożliwia ich oddzielenie od reszty składników lizatu tkanki mózgowej. Takie postępowanie upraszcza skład matrycy próbki i tym samym zmniejsza niekorzystny efekt supresji jonizacji w źródle jonów, co w konsekwencji zwiększa czułość pomiarów.

Przygotowanie mieszaniny białek do pomiaru z wykorzystaniem strategii bottom-up składa się z trzech następujących po sobie etapów:

- redukcji mostków disulfidowych obecnych w białkach;

- alkilacji powstałych grup sulfhydrylowych (-SH);

- trawieniu białek enzymem proteolitycznym.

Do redukcji wiązań disulfidowych najczęściej wykorzystywanym odczynnikiem jest ditiotreitol, który redukuje mostek disulfidowy do dwóch grup sulfhydrylowych. Inne stosowane czynniki redukujące to tris(2-karboksyetylo)fosfina i ?-merkaptoetanol. Powstałe w ten sposób grupy -SH muszą zostać zabezpieczone, aby uniemożliwić ponowne tworzenie się wiązania disulfidowego. W tym celu stosuje się odczynnik alkilujący, najczęściej jest nim 2-jodoacetamid, który, łącząc się z grupą -SH, uniemożliwia ponowne powstawanie mostków disulfidowych. Ze względu na występowanie różnorodnych reakcji ubocznych zaobserwowanych dla 2-jodoacetamidu [18], zaczęto stosować podobne strukturalnie związki alternatywne, takie jak kwas jodooctowy, chloroacetamid i akrylamid, a także odmienny strukturalnie N-etylomaleimid lub metanotiosulfonian metylu. Po redukcji mostków disulfidowych oraz zabezpieczeniu grup sulfhydrylowych następuje trawienie białek przy użyciu enzymu proteolitycznego, najczęściej trypsyny (stosunek wagowy białko : enzym od 100 : 1 do 25 : 1), która hydrolizuje specyficzne wiązania peptydowe znajdujące się po C-końcowej stronie lizyny i argininy. W proteomice często wykorzystywany jest specjalny rodzaj trypsyny (trypsyna modyfikowana). Wprowadzona modyfikacja zapobiega reakcji autolizy, która mogłaby przyczynić się do zmniejszenia efektywności trawienia. Na rycinie 2.1 przedstawiono schematyczne porównanie strategii top-down i bottom-up.

W strategii bottom-up trawienie enzymatyczne białka może być przeprowadzone dwoma sposobami, pierwszym jest trawienie w żelu poliakrylamidowym. W tym przypadku proces trawienia jest poprzedzony rozdzieleniem białek przy wykorzystywaniu techniki dwu- lub jednowymiarowej elektroforezy żelowej. Rozdzielone białka są trawione dalej w żelu poliakrylamidowym w celu uzyskania mieszaniny peptydów. Drugim sposobem trawienia białek wykorzystywanym w analizie proteomicznej jest trawienie w roztworze i taka realizacja strategii bottom-up nazywana jest analizą shotgun.

Ryc. 2.1. Strategie bottom-up i top-down w identyfikacji białek techniką tandemowej spektrometrii mas (MS/MS)

[Źródło: oprac. własne]

Ryc. 2.2. Schemat analizy proteomicznej z wykorzystaniem strategii bottom-up

[Źródło: oprac. własne]

Analiza proteomiczna shotgun

Analiza shotgun, przedstawiona schematycznie na rycinie 2.2, składa się z następujących po sobie etapów:

- przygotowania próbki, które obejmuje trawienie enzymatyczne białek w roztworze;

- rozdzielania peptydów z wykorzystaniem ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej;

- jonizacji, fragmentacji oraz analizy z wykorzystaniem spektrometrii mas;

- interpretacji otrzymanych wyników wspomaganej proteomicznymi bazami danych [19].

W przypadku analizy proteomicznej shotgun mieszanina białek przed procesem trawienia nie jest poddawana wcześniejszemu frakcjonowaniu, co powoduje, że otrzymana mieszanina peptydów jest bardzo złożona. Dalsze przygotowanie próbki obejmuje, jak wcześniej opisano, redukcję mostków disulfidowych, alkilację powstałych grup -SH oraz trawienie enzymatyczne białek w roztworze. Otrzymane peptydy są oczyszczane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE, ang. solid-phase extraction), a następnie rozdzielane chromatograficznie w układzie faz odwróconych przy natężeniu przepływu fazy ruchomej rzędu kilkuset nanolitrów na minutę (nano-UHPLC). W przypadku rozdzielania tak złożonej mieszaniny stosowana może być również dwuwymiarowa chromatografia cieczowa umożliwiająca bardziej efektywne rozdzielenie peptydów. Najczęściej w pierwszym wymiarze peptydy są rozdzielane przy zastosowaniu techniki SCX (ang. strong cation exchange), która jest odmianą chromatografii jonowymiennej. Natężenie przepływu fazy ruchomej w pierwszym wymiarze wynosi od 20 ?l/min do 50 ?l/min. W chromatografii SCX stosuje się fazy ruchome o dużej mocy jonowej. Fazę stacjonarną w przypadku tej chromatografii stanowią reszty kwasu sulfonowego (grupy -(CH2)3SO3H), a rozdzielenie peptydów jest prowadzone przy pH 3. Mieszanina peptydów jest wprowadzana do kolumny chromatograficznej, gdzie każdy z peptydów oddziałuje elektrostatycznie z fazą stacjonarną. Rozdzielenia peptydów dokonuje się na podstawie ich ładunku wypadkowego - peptydy z najbardziej dodatnim ładunkiem zostają wymyte z kolumny jako ostatnie. Tak rozdzielone peptydy są zbierane w postaci frakcji, a następnie rozdzielanie jest kontynuowane na drugiej kolumnie chromatograficznej. W pierwszym wymiarze możliwe jest również zastosowanie chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych przy użyciu fazy ruchomej o odczynie zasadowym (pH w zakresie 8-9). W drugim wymiarze wykorzystuje się ultrawysokosprawną chromatografię cieczową z przepływem fazy ruchomej w zakresie od 150 nl/min do 300 nl/min (nano-UHPLC) w układzie faz odwróconych. Niskie natężenie przepływu pozwala na osiągnięcie lepszej rozdzielczości oraz niższej granicy wykrywalności. Rozdzielone peptydy są następnie jonizowane przy użyciu techniki nano-elektrorozpylanie (nano-ESI, ang. nano-electrospray ionization). Jonizacja typu ESI jest łagodnym sposobem jonizacji, który nie powoduje fragmentacji cząsteczek w źródle jonów, lecz jedynie przeniesienie zjonizowanych cząsteczek z fazy ciekłej do fazy gazowej. W przypadku analizy proteomicznej źródło jonów typu ESI pracuje w trybie jonów dodatnich, co powoduje przeniesienie do fazy gazowej jedynie dodatnio naładowanych jonów cząsteczkowych (pseudomolekularnych, prekursorowych) powstałych poprzez przyłączenie do łańcucha peptydu jednego lub większej liczby protonów. Zjonizowane peptydy są następnie wprowadzane do tandemowego spektrometru mas (MS/MS). Najczęściej stosowanymi układami tandemowymi są układy zawierające kwadrupolowy analizator mas i wysokorozdzielczy analizator mas typu Orbitrap. Umożliwiają one jednoczesne otrzymywanie widm pełnych - wszystkich zjonizowanych peptydów (ang. full scan) i widm fragmentacyjnych zarejestrowanych dla jonów prekursorowych (MS/MS). Ostatnim krokiem analizy proteomicznej shotgun jest ocena danych, której wynikiem jest "odczytanie" sekwencji aminokwasowych białek obecnych w badanej próbce oraz biologiczna interpretacja wyników, czyli analiza bioinformatyczna mająca na celu znalezienie ścieżek biochemicznych, w które zaangażowane są zidentyfikowane białka.

Analizę jakościową wykonuje się na podstawie zarejestrowanych widm fragmentacyjnych peptydów, natomiast ilościową - na podstawie chromatogramów zarejestrowanych dla jonów prekursorowych o danych wartościach m/z (XIC, ang. extracted ion chromatogram). W przypadku analizy jakościowej zarejestrowane w ramach przeprowadzonej analizy widma MS/MS są porównywane z teoretycznymi widmami fragmentacyjnymi wygenerowanymi dla sekwencji peptydowych zgromadzonych w białkowych bazach danych, np. Swiss-Prot. Z kolei analiza ilościowa w większości przypadków jest analizą porównawczą (ang. relative quantification) - porównana zostaje ilość danego białka w próbce pochodzącej z grupy eksperymentalnej z ilością tego białka w próbce z grupy kontrolnej. W przypadku analizy porównawczej stężenie danego peptydu, a w konsekwencji stężenie białka w próbce wyznaczane jest na podstawie pola powierzchni pod pikiem, które jest proporcjonalne do stężenia tego peptydu. Analiza tak dużego i złożonego zbioru informacji, jakim są dane otrzymane w ramach analizy proteomicznej, wymaga specjalistycznego oprogramowania, np. MaxQuant [20] oraz Perseus [21].

Możliwe jest również przeprowadzenie absolutnej analizy ilościowej (ang. absolute quantification) dla wybranych białek z zastosowaniem strategii białek wzorcowych RISQ (ang. recombinant isotope-labelled and selenium quantified) [22]. Rekombinowane białka RISQ wykorzystują znakowanie ciężkimi trwałymi izotopami węgla i azotu, 13C i 15N. Posiadają one w swojej strukturze znakowane aminokwasy (najczęściej lizynę i argininę), a także, co wyróżnia je spośród pozostałych wzorców, atomy selenu, które zostają wbudowywane w cząsteczkę białka w postaci selenometioniny (SeMet), zastępującej kanoniczną metioninę. Obecność selenu w cząsteczce umożliwia wykonanie dokładnego oznaczenia białka wzorcowego za pomocą spektrometrii mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-MS, ang. inductively coupled plasma-mass spectrometry), natomiast znakowanie 13C/15N poszczególnych aminokwasów pozwala na wykorzystanie białka RISQ jako wzorca wewnętrznego do oznaczeń badanego białka za pomocą metody nano-UHPLC-ESI-MS/MS.

Podejście bottom-up jest obecnie najczęściej wykorzystywaną strategią w jakościowej i ilościowej analizie proteomicznej. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych zapewnia efektywne rozdzielenie peptydów otrzymanych w trakcie enzymatycznego trawienia białek, a wysokorozdzielcza, tandemowa spektrometria mas pozwala na pomiar masy analizowanych peptydów z dokładnością poniżej 3 ppm, co umożliwia ich właściwą identyfikację. Strategia bottom-up okazała się być najbardziej skutecznym rozwiązaniem w przypadku identyfikacji białek pochodzących z bardzo złożonych mieszanin, takich jak lizaty komórkowe czy tkankowe. Jednak, mimo licznych zalet, strategia bottom-up ma także kilka ograniczeń. Największym jest identyfikacja jedynie ułamka z całkowitej populacji peptydów badanego białka, co uniemożliwia uzyskanie informacji na temat pełnej sekwencji białka. Konsekwencją tego jest utrata wielu danych na temat możliwych modyfikacji posttranslacyjnych, które są bardzo ważnym elementem w regulacji funkcji białka. Ponadto modyfikacje posttranslacyjne są bardzo często nietrwałe w szeroko stosowanym typie fragmentacji CID (ang. collision-induced dissociation). Jednym z problemów napotykanym podczas analizy bardzo złożonych mieszanin peptydów z wykorzystaniem strategii bottom-up jest też długi czas trwania pojedynczego pomiaru, nawet do kilkunastu godzin.

2.4Zastosowanie analizy proteomicznej w badaniach nad schorzeniami neurodegeneracyjnymi

Postępy w analizie proteomicznej wykorzystującej spektrometrię mas umożliwiły jej szerokie zastosowanie w kontekście badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Pozwoliły m.in. na obiektywną charakterystykę proteomu, czyli białek ulegających ekspresji w danej komórce lub tkance, obejmującą również izoformy białek w neuronach i innych komórkach powstające na etapie alternatywnego składania danego transkryptu [12, 23]. Takie globalne analizy proteomiczne, mające za zadanie identyfikację białek o zmienionej ekspresji w grupie eksperymentalnej (pacjenci cierpiący na badaną chorobę neurodegeneracyjną) w porównaniu z grupą kontrolną, mogą pomóc w identyfikacji procesów i ścieżek przekazywania sygnału, związanych z rozwojem czy patogenezą schorzeń neurodegeneracyjnych. Przykładowo, w badaniach proteomicznych i transkryptomicznych wykorzystano analizę wzajemnych korelacji ekspresji białek (ang. co-expression network analysis) w celu identyfikacji markerów korelujących z postępem choroby Alzheimera i choroby Huntingtona w modelach mysich oraz próbkach tkanek ludzkich [24]. Przeprowadzone zostały także badania, które umożliwiły identyfikację białek wykazujących zmienioną ekspresję w przypadku choroby Alzheimera w różnych częściach mózgu oraz ich korelację z postępem choroby [25, 26].

2.5Podsumowanie

Proteom, czyli zbiór wszystkich białek występujących w danym narządzie, tkance lub komórce, dostarcza informacji o typie, funkcjach oraz oddziaływaniu białek tworzących kompleksy o specyficznych właściwościach funkcjonalnych, np. ścieżkę przekazywania sygnału czy też kanał jonowy. Proteom zmienia się wraz z typem komórki, etapem rozwoju i warunkami środowiska. Poprzez jego badanie i tego w jaki sposób się zmienia można uzyskać informacje o tym, jak funkcjonuje dany organizm na poziomie molekularnym. Możliwe jest określenie zmian zachodzących pod wpływem zażywania leków lub po przebyciu danej choroby. Analiza proteomiczna wykorzystuje zaawansowane techniki instrumentalne - ultrawysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z wysokorozdzielczą, tandemową spektrometrią mas. W badaniach próbek klinicznych analiza proteomiczna pozwala na identyfikację białek o zmienionej ekspresji lub wykazujących zmianę w liczbie i rodzaju modyfikacji posttranslacyjnych, a co za tym idzie o zmienionej aktywności w próbkach płynów ustrojowych lub tkanek pobranych post-mortem od pacjentów, którzy przebyli różnego rodzaju choroby, np. neurodegeneracyjne. W szczególnym przypadku niektóre spośród białek wykazujących zmienioną ekspresję czy też liczbę i rodzaj modyfikacji posttranslacyjnych w grupie chorych w porównaniu z osobami zdrowymi mogą zostać uznane za potencjalne biomarkery - białka, które są zmienione w danym stanie chorobowym, będące charakterystyczne dla tej choroby i mogące pomóc w dokładniejszej diagnostyce badanych schorzeń, a w efekcie - w opracowaniu i wdrożeniu nowych, skuteczniejszych terapii.

Piśmiennictwo

1. Moda F., Gambetti P., Notari S. i wsp., Prions in the Urine of Patients with Variant Creutzfeldt-Jakob Disease. N Engl J Med, 371: 530-539, 2014

2. Arrasate M., Finkbeiner S., Protein aggregates in Huntington's disease. Exp Neurol, 238: 1-11, 2012

3. Stefanis L., Alpha-Synuclein in Parkinson's Disease. Cold Spring Harb Perspect Med, 2: a009399-a009399, 2012

4. Bloom G.S., Amyloid-? and Tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurol, 71: 505, 2014

5. Neumann M., Sampathu D.M., Kwong L.K. i wsp., Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science, 314: 130-133, 2006

6. Wolfe M.S. (red.), The Molecular and Cellular Basis of Neurodegenerative Diseases. Elsevier, United Kingdom, 2018

7. Schindler S.E., Bollinger J.G., Ovod V. i wsp., High-precision plasma ?-amyloid 42/40 predicts current and future brain amyloidosis. Neurology, 93(17): e1647-e1659, 2019

8. Dayon L., Hainard A., Licker V. i wsp., Relative Quantification of Proteins in Human Cerebrospinal Fluids by MS/MS Using 6-Plex Isobaric Tags. Anal Chem, 80: 2921-2931, 2008

9. Thompson A.G., Gray E., Thézénas M.-L. i wsp., Cerebrospinal fluid macrophage biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol, 83: 258-268, 2018

10. Inukai Y., Nonaka T., Arai T. i wsp., Abnormal phosphorylation of Ser409/410 of TDP-43 in FTLD-U and ALS. FEBS Lett, 582: 2899-2904, 2008

11. Koza P., Beroun A., Konopka A. i wsp., Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiol Dis, 130: 104499, 2019

12. Aebersold R., Mann M., Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature, 537: 347-355, 2016

13. Finehout E.J., Lee K.H., An introduction to mass spectrometry applications in biological research. Biochem Mol Biol Educ, 32: 93-100, 2004

14. Hosp F., Mann M., A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron, 96: 558-571, 2017

15. Catherman A.D., Skinner O.S., Kelleher N.L., Top Down proteomics: Facts and perspectives. Biochem Biophys Res Commun, 445: 683-693, 2014

16. Nägele E., Vollmer M., Hörth P., Vad C., 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures. Expert Rev Proteomics, 1: 37-46, 2004

17. Shevchenko G., Musunuri S., Wetterhall M., Bergquist J., Comparison of extraction methods for the comprehensive analysis of mouse brain proteome using shotgun-based mass spectrometry. J Proteome Res, 11: 2441-2451, 2012

18. Muller T., Winter D., Systematic Evaluation of Protein Reduction and Alkylation Reveals Massive Unspecific Side Effects by Iodine-containing Reagents. Mol Cell Proteo­mics, 16: 1173-1187, 2017

19. Delahunty C., Yates III J.R., Protein identification using 2D-LC-MS/MS. Methods, 35: 248-255, 2005

20. Cox J., Mann M., MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol, 26: 1367-1372, 2008

21. Tyanova S., Temu T., Sinitcyn P. i wsp., The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13: 731-740, 2016

22. Konopka A., Wild C., Boehm M.E., Lehmann W.D., Proteomics Standards with Controllable Trueness - Absolute Quantification of Peptides, Phosphopeptides and Proteins Using ICP- and ESI-MS. w: Quantitative Proteomics (red. C.E. Eyers, S.J. Gaskell). RSC Publishing, Cambridge: 110-128, 2014

23. Abascal F., Ezkurdia I., Rodriguez-Rivas J. i wsp., Alternatively Spliced Homologous Exons Have Ancient Origins and Are Highly Expressed at the Protein Level. PLOS Comput Biol, 11: e1004325, 2015

24. Seyfried N.T., Dammer E.B., Swarup V. i wsp., Multi-network Approach Identifies Protein-Specific Co-expression in Asymptomatic and Symptomatic Alzheimer's Disease. Cell Syst, 4: 60-72.e4, 2017

25. Choudhary C., Mann M., Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol, 11: 427-439, 2010

26. Hunter T., The Age of Crosstalk: Phosphorylation, Ubiqui­tination, and Beyond. Mol Cell 28: 730-738, 2007